EP1504110A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von xylit - Google Patents

Verfahren zur biotechnologischen herstellung von xylit

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Publication number
EP1504110A1
EP1504110A1 EP03735312A EP03735312A EP1504110A1 EP 1504110 A1 EP1504110 A1 EP 1504110A1 EP 03735312 A EP03735312 A EP 03735312A EP 03735312 A EP03735312 A EP 03735312A EP 1504110 A1 EP1504110 A1 EP 1504110A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
xylitol
microorganisms
xylose
nadh
dehydrogenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03735312A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Walther
Kai Ostermann
Hans-Frieder Listewnik
Thomas Bley
Gerhard RÖDEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Dresden filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP1504110A1 publication Critical patent/EP1504110A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the invention relates to a method for the biological production of xylitol using microorganisms which can metabolize xylose to xylitol.
  • Xylitol is a naturally occurring sugar alcohol and is mainly used as a sugar substitute in dietary foods, since its metabolism is insulin-independent. Xylitol is also used in the pharmaceutical industry, e.g. for toothpaste.
  • Xylitol is widely used in chewing gums, chewable tablets and similar products because xylitol has approximately the same sweetness but no cariogenic effects compared to sucrose.
  • xylitol is synthesized chemically by reducing xylose over nickel catalysts under high pressure and at high temperatures with an average yield of 50 to 60% of the xylose used.
  • Xylose is a main component of vegetable raw materials and is obtained from acidic hydrolysis or sulfite leaching from hemicellulose-rich plant residues.
  • yeasts of the genera Candida, Deharyomyces and Pichia are used as microorganisms, which are natural xylose utilizers which convert xylose into xylitol under oxygen limitation.
  • the reaction is catalyzed by the enzyme xylose reductase (XR) with the participation of the cofactor NADH.
  • XR xylose reductase
  • microorganisms are genetically modified in such a way that they can also form xylitol after manipulation using other carbon sources.
  • Methods are also known in the prior art according to which non-naturally xylose-reducing microorganisms are enabled by genetic engineering to produce xylose reductase enzymes and thus to be able to use xylose to produce xylitol.
  • the object of the invention is achieved by a process for the biotechnological production of xylitol, using microorganisms which can metabolize xylose to xylitol and the process comprises the following process steps:
  • Substrate containing liters of sulfite salt e.g. calcium bisulfite, sodium sulfite, potassium sulfite
  • sulfite salt e.g. calcium bisulfite, sodium sulfite, potassium sulfite
  • this reaction is catalyzed by the enzyme xylose reductase with the participation of the cofactor NADH.
  • an oversupply of the enzyme xylose reductase catalyzing the reaction by overexpression of the enzyme in modified microorganisms does not lead to a significant increase and thus does not lead to an economic improvement in xylitol production.
  • microorganisms are thus modified in such a way that other enzyme systems of the microorganisms which use NADH, such as, for example, mitochondrial NADH dehydrogenase, alcohol dehydrogenase and glycerol phosphate dehydrogenase, are switched off.
  • NADH oxidized glutathione
  • the effect of the modification of the microorganisms according to the invention is based on the fact that the enzymes mentioned have a higher affinity for this cofactor.
  • NADH is preferably oxidized to NAD (P) by the enzymes competing with the xylose reductase, the required cofactor is not available to the extent necessary for high productivity of xylitol.
  • renewable raw materials can be used as raw material sources, and, in contrast to conventional chemical processes, there are no environmentally harmful effects from the use of nickel catalysts.
  • Metabolic pathways oxidized The main ones are alcohol fermentation, glycerol production and oxidation by the external mitochondrial To name NADH dehydrogenases. These enzymes have a higher affinity for NADH compared to xylose reductase and the cofactor is thus preferentially oxidized by these enzymes.
  • the content of the NADH available in the cytoplasm and thus for the reaction with the xylose reductase is increased by inactivating one or more of the enzymes in the microorganisms or suppressing their expression, which leads to oxidation of the NADH.
  • the inner mitochondrial membrane of the yeast is impermeable to NADH, so the modification of the enzyme system is aimed at the cytoplasmic NADH dehydrogenases responsible for the oxidation.
  • the genes NDE1 and NDE2 encode the external NADH dehydrogenases, while GPD1 and GPD2 encode the glycerol phosphate dehydrogenases.
  • the repression of one or more of the genes mentioned thus leads, according to the invention, to a reduction in NADH consumption by the alternative metabolic routes and the NADH is available to a greater extent for the xylose reductase.
  • the breakdown of glucose to ethanol is also inhibited in Saccharomyces cerevisiae by the addition of sulfite salt (e.g. calcium bisulfite, sodium sulfite, potassium sulfite) in a concentration of 10 to 40 grams per liter of substrate.
  • sulfite salt e.g. calcium bisulfite, sodium sulfite, potassium sulfite
  • the formation of glycerol is counteracted by genetically suppressing the expression of the NADH-consuming enzyme glycerol phosphate dehydrogenase.
  • xylitol production increases because the cofactor NADH, which is additionally available through the suppression of glycerol phosphate dehydrogenase, can be used by xylose reductase to form xylitol from xylose.
  • modified microorganisms are made possible in particular according to one embodiment in that the genes of the microorganisms are changed by recombinant DNA technology.
  • the microorganisms can be modified by directed or random mutagenesis.
  • the microorganisms are changed in such a way that, in a first step, the sequences of the enzymes which use the NADH cofactor are destroyed or manipulated in such a way that they cannot be produced by the microorganism or are only synthesized with reduced activity.
  • microorganisms Such methods for the genetic engineering of microorganisms are state of the art.
  • the microorganisms genetically manipulated in this way increasingly produce xylitol and accumulate it in the growth medium, from which the xylitol can be enriched or obtained by crystallization or by chromatographic methods.
  • the following description of exemplary embodiments clarifies the procedure for the modification of the microorganisms and the extraction of xylitol.
  • yeast strains which express the heterologous xylose reductase.
  • the expression of heterologous xylose reductase in yeast is state of the art and was described, for example, in patent WO 91/15588.
  • ORF 956 bp intronless open reading frame
  • the plasmid was digested with the corresponding restriction endonucleases and, as described above, purified.
  • a vector for expression in S. cerevisiae p425GPD was used The vector is a multicopy plasmid and contains the LEU2 gene from S. cerevisiae as a selection marker (Mumberg et al. 1995) The vector was digested with the same restriction enzymes as the fragment and purified accordingly The gene was ligated into the vector and recombinant plasmids were identified by plasmid preparation and restriction analysis ..
  • Mitochondrially localized cytosolic NADH dehydrogenase competes with the XR for the cofactor NADH.
  • the genes NDE1 and NDE2 were inactivated by gene replacement with suitable DNA fragments.
  • a replacement fragment with 40 bp homology directly on the 5 'side of the start codon of NDE1 and 40 bp homology on the 3' side of the stop codon was amplified by PCR.
  • the fragment contains the his5 + gene from Schizosaccharomyces pombe and complements his3 mutations in S. cerevisiae (Wach et al. 1997). After amplification, the fragment was isolated and purified as described above. S.
  • KOY50 cerevisiae KOY50 was transformed with the replacement fragment using the method of Schiestl and Gietz (1989). Histidine prototrophic transformants were isolated. The correct integration of the fragment and the exchange of NDE1 was verified by diagnostic PCR. Such a strain (KOY50 ⁇ nde1) was transformed with p425GPD-PsXYLl as described in Example 1 and used for xylitol production.
  • the kanMX module served as a selection marker (Wach et al. 1994). This module makes transformants resistant to G418 (Geneticin). After the transformation, the KOY50 ⁇ nde1 cells were plated on medium containing G418. Resistant clones were checked by diagnostic PCR for the correct insertion of the replacement fragment and inactivation of NDE2. The resulting stem (KOY50 ⁇ nde1 ⁇ nde2) was transformed with p425GPD-PsXYL1 as described in Example 1 and used for xylitol production.
  • the cytoplasmic glycerol phosphate dehydrogenases GPD1p and GPD2p use NADH as a cofactor. Their inactivation leads to a preferential oxidation of cytosolic NADH by the reduction of xylose to xylitol by means of XR.
  • the strains S. cerevisiae KOY50 ⁇ nde1 and KOY50 ⁇ nde1 ⁇ nde2 were used for gene replacement. Both strains carry the ura3 ⁇ 0 mutation. Fragments with homologies to GPD1 and GPD2, as described under Example 2 for NDE1, were used for the disruption. The fragments contained the URA3 gene from Candida albicans as a selection marker.
  • the selection marker was flanked by mutually identical DNA sections (Goldstein et al. 1999).
  • URA3 from C. albicans complements ura3 mutations in S. cerevisiae.
  • cells with an intact uracil metabolism are sensitive to 5-fluoro-orodic acid (5-FOA).
  • 5-FOA 5-fluoro-orodic acid
  • the DNA fragments described above were amplified by PCR and purified.
  • the fragment for the gene replacement of GPD7 was transformed according to the method of Schiestl and Gietz (1989) in S. cerevisiae KOY50 ⁇ nde1 and KOY50 ⁇ nde1 ⁇ nde2. Uracii prototrophic transformants were isolated on the appropriate selection medium.
  • the replacement of GPD1 was confirmed by diagnostic PCR. After that they became like this constructed strains selected for 5-FOA resistance. In 5-FOA-resistant strains, the loss of the URA3 markers was demonstrated by diagnostic PCR. In further work, GPD2 was finally inactivated, as already described above.
  • strains so constructed were transformed with p425GPD-PsXYL1 as set forth in Example 1 and used to produce xylitol.
  • the genes in question were first inactivated individually, as described in Example 2. After crossing the individual mutants and sporulation of the resulting diploid strains, tetrads were analyzed. Double mutants can be easily identified in the nonparental dityp (NPD).
  • the KOY50 strain was used to individually inactivate GPD1 and GPD2, as described for NDE1 in Example 2, by gene replacement. Transformants of opposite mating types were crossed and the resulting strains were sporulated on the appropriate medium. The tetrads were tested for histidine prototrophy.
  • the GPD1 / GPD2 double zero mutants were isolated as histidine-prototrophic single spore clones in NPD tetrads, transformed with p425GPD-PsXYL1 and used for xylitol production.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit, wobei Mikroorganismen zum Einsatz kommen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können. Das Verfahren umfasst folgende Verfahrensschritte: a) Modifizieren von Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist, b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro Liter Sulfitsalz (z.B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) enthaltenden Substrat, c) Kultivieren der Mikroorganismen' in einer aeroben Wachstumsphase und einer sauerstofflimitierten Xylit-Produktionsphase und, d) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.

Description

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Herstellung von Xylit unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können.
Xylit ist ein natürlich vorkommender Zuckeralkohol und findet Verwendung vor allem als Zuckeraustauschstoff bei diätetischen Lebensmitteln, da sein Abbau im Stoffwechsel insulinunabhängig verläuft. Auch in der pharmazeutischen Industrie, etwa für Zahncreme, findet Xylit Verwendung.
Ein großes Einsatzgebiet erfährt Xylit bei Kaugummis, Kautabletten und ähnlichen Produkten, weil Xylit in etwa die gleiche Süßkraft, aber keine kariogene Wirkung im Vergleich zu Saccharose, aufweist.
Nach dem Stand der Technik wird Xylit auf chemischem Wege durch die Reduktion von Xylose an Nickelkatalysatoren unter hohem Druck und bei hohen Temperaturen mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 50 bis 60 % der eingesetzten Xylose synthetisiert. Xylose ist ein Hauptbestandteil pflanzlicher Rohstoffe und wird durch saure Hydrolyse oder Sulfitlaugung aus hemicellulosereichen Pflanzenresten gewonnen.
Um den Nachteil der geringen Ausbeute an Xylit bei chemischen Verfahren zu überwinden, wurde beispielsweise in der EP 0 716 067 vorgeschlagen, Xylit, ausgehend von Gluconsäure, chemisch über mehrere Verfahrensschritte zu gewinnen, um Ausbeuten zwischen 60 und 70 % zu erhalten.
Den chemischen Verfahren ist gemeinsam, dass kostenintensive bzw. umweltunverträgliche Katalysatoren zum Einsatz kommen müssen, um das Xylit auf chemischem Wege zu erzeugen. Dabei werden überwiegend Nickelkatalysatoren eingesetzt, deren Verwendung aus Erwägungen des Umweltschutzes bedenklich ist.
Weiterhin wird bei diesen chemischen Verfahren bei zum Teil hohen Temperaturen zwischen 70 und 150°Celsius sowie hohen Drücken von bis zu 10 MPa gearbeitet. Es schließen sich weiterhin aufwändige Reinigungs- und Konzentrierungsschritte an, um das Xylit letztlich in reiner Form zu gewinnen.
Als eine Alternative zur chemischen Erzeugung von Xylit wurden im Stand der Technik biotechnologische Verfahren beschrieben, welche einen sehr hohen Ertrag beim Stoffurnsatz von Xylose zu Xylit aufweisen.
Als Mikroorganismen kommen einerseits Hefen der Gattungen Candida, Deharyomyces und Pichia zum Einsatz, welche natürliche Xyloseverwerter sind, die unter Sauerstofflimitation Xylose in Xylit umwandeln. Die Reaktion wird von dem Enzym Xylosereduktase (XR) unter Beteiligung des Kofaktors NADH katalysiert.
Alternativ zu den natürlichen Xylitbildnem werden nach der Lehre der EP 0 672 161 Mikroorganismen dahingehend gentechnisch modifiziert, dass diese nach der Manipulation Xylit auch unter Nutzung anderer Kohlenstoffquellen bilden können.
Eine andere Strategie zur Erhöhung der Xylitproduktion auf biotechnologischem Wege beschreibt die EP 0 604 429. Dort werden Xylit synthetisierende und metabolisierende Hefen derart gentechnisch modifiziert, dass die Enzyme, welche das erwünschte Endprodukt umbauen, ausgeschaltet werden. Nach der Lehre dieser Erfindung wird die Expression der Gene ausgeschaltet oder verringert, welche zu einem Umbau bzw. zu einem Abbau des gewünschten Endproduktes Xylit führen.
Ebenso sind im Stand der Technik Verfahren bekannt, nach denen nicht auf natürlichem Wege Xylose reduzierende Mikroorganismen durch gentechnische Manipulation in die Lage versetzt werden, Xylosereduktaseenzyme zu bilden und damit Xylose zur Produktion von Xylit verwerten zu können.
Gleichfalls ist bekannt, zur Verbesserung der Ausbeute, dieses Enzym Xylosereduktase stark zu überexprimieren.
Den erwähnten biotechnologischen Verfahren ist gemeinsam, dass selbst bei starker Überexpression von Xylosereduktase und auch bei der Ausschaltung der am natürlichen Metabolismus des Xylit beteiligten Enzyme die Produktivität an Xylit nicht wirksam genug erhöht werden kann, um kosteneffizient Xylit auf biotechnologischen Verfahrensweg zu produzieren.
Es ist somit Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches eine höhere Xylitproduktivität bei der biotechnologischen Herstellung von Xylit aus Xylose ermöglicht und damit eine wirtschaftlichere Verfahrensführung durchführbar ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit gelöst, wobei Mikroorganismen zum Einsatz kommen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können und das Verfahren folgende Verfahrensschritte umfasst:
a) Modifizieren von Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist, b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro
Liter Sulfitsalz (z.B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) enthaltenden Substrat,
c) Kultivieren der Mikroorganismen in einer aeroben Wachstumsphase und einer sauerstofflimitierten Xylit-Produktionsphase und
d) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.
Die Umwandlung von Xylose in Xylit verläuft auf folgendem Weg:
Xylose + NADH* —^→ Xylit + NAD+
Diese Reaktion wird, wie bereits beschrieben, von dem Enzym Xylosereduktase unter Beteiligung des Kofaktors NADH katalysiert. Wie bereits bei der Erörterung des Standes der Technik auf diesem Gebiet beschrieben, führt ein Überangebot des die Reaktion katalysierenden Enzyms Xylosereduktase durch eine Überexpression des Enzyms bei modifizierten Mikroorganismen nicht zu einer deutlichen Erhöhung und damit nicht zu einer wirtschaftlichen Verbesserung der Xylitproduktion.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Reaktion von Xylose zu Xylit sehr stark von der Verfügbarkeit des Kofaktors NADH abhängt und von dieser limitiert wird.
Nach der Konzeption der Erfindung werden somit Mikroorganismen derart modifiziert, dass andere NADH verbrauchende Enzymsysteme der Mikroorganismen, wie beispielsweise die mitochondriale NADH- Dehydrogenase, die Alkoholdehydrogenase und die Glycerolphosphat- dehydrogenase, ausgeschaltet werden. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Modifizierung der Mikroorganismen beruht darauf, dass die genannten Enzyme eine höhere Affinität zu diesem Kofaktor aufweisen.
Wird das NADH vorzugsweise durch die mit der Xylosereduktase konkurrierenden Enzyme zu NAD(P) oxidiert, steht der benötigte Kofaktor nicht in dem für eine hohe Produktivität an Xylit erforderlichem Maße zur Verfügung.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung genetisch modifizierter Mikroorganismen können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren deutliche Xylitertragssteigerungen erreicht werden. Damit ist dieses Verfahren eine attraktive Alternative zu den bisherigen chemischen Verfahren, in dem es die beschriebenen Nachteile anderer biotechnologischer Verfahren aufgabengemäß überwindet.
Zudem können als besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens als Rohstoffquellen nachwachsende Rohstoffe eingesetzt werden, und es entstehen, im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Verfahren, keine umweltschädlichen Wirkungen durch die Verwendung von Nickelkatalysatoren.
Ebenso ist den biotechnologischen Verfahren immanent, dass diese bei vergleichsweise milden Reaktionsbedingungen arbeiten und somit generell häufig umweltverträglicher sind als chemische Verfahren. Die Beschreibung von Ausführungsbeispielen zeigt, wie einzelne Mikroorganismen, insbesondere Hefen, zunächst modifiziert werden und anschließend zur Xylitproduktion eingesetzt werden.
Eine große Bedeutung für biotechnologische Verfahren besitzen Hefen der
Gattung Saccharomyces. Bei diesen Hefen wird das NADH auf verschiedenen
Stoffwechselwegen oxidiert. Hauptsächlich sind die Alkoholfermentation, die Glycerolproduktion und die Oxidation durch die externen mitochondrialen NADH-Dehydrogenasen zu nennen. Diese Enzyme besitzen eine höhere Affinität zu NADH im Vergleich zur Xylosereduktase und der Kofaktor wird somit bevorzugt durch diese Enzyme oxidiert.
Als Ergebnis des NADH-Verbrauches durch die skizzierten Abbauwege ist das NADH-Angebot für die Xylosereduktion limitiert, und Xylit kann nicht in erhöhtem Maße produziert werden.
Erfindungsgemäß wird der Gehalt des im Zytoplasma und somit für die Reaktion mit der Xylosereduktase zur Verfügung stehenden NADH erhöht, indem bei den Mikroorganismen eines oder mehrere der Enzyme inaktiviert bzw. deren Expression unterdrückt werden, welche zu einer Oxidation des NADH führen.
Die innere Mitochondrienmembran der Hefen ist für NADH undurchlässig, deshalb richtet sich die Modifizierung des Enzymsystemes auf die für die Oxidation verantwortlichen zytoplasmatischen NADH-Dehydrogenasen.
In Saccharomyces cerevisiae kodieren die Gene NDE1 und NDE2 die externen NADH-Deydrogenasen während GPD1 und GPD2 die Glycerolphosphat- dehydrogenasen kodieren. Die Repression einer oder mehrerer der genannten Gene führt damit erfindungsgemäß zu einer Verminderung des NADH- Verbrauches durch die alternativen Stoffwechselrouten und das NADH steht für die Xylosereduktase in höherem Maße zur Verfügung.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gleichfalls bei Saccharomyces cerevisiae durch die Zugabe von Sulfitsalz (z.B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) in einer Konzentration von 10 bis 40 Gramm pro Litern Substrat der Abbau von Glukose zu Ethanol inhibiert. Folglich steigt die Produktion von Glycerol an.
Erfindungsgemäß wird der Bildung von Glycerol entgegengewirkt, indem die Expression des NADH verbrauchenden Enzyms Glycerolphosphat- dehydrogenase gentechnisch unterdrückt wird. Unter diesen Bedingungen steigt die Xylitproduktion, indem der durch die Unterdrückung der Glycerolphosphatdehydrogenase zusätzlich zur Verfügung stehende Kofaktor NADH von der Xylosereduktase zur Bildung von Xylit aus Xylose genutzt werden kann.
Die erfindungsgemäße Wirkung des Verfahrens mit modifizierten Mikroorganismen wird insbesondere nach einer Ausführungsform dadurch ermöglicht, dass die Gene der Mikroorganismen durch rekombinante DNA- Technologie verändert werden. Alternativ ist die Modifizierung der Mikroorganismen durch gerichtete oder zufällige Mutagenese möglich.
Die Veränderung der Mikroorganismen erfolgt in der Weise, dass in einem ersten Schritt die Sequenzen der Enzyme, welche den NADH-Kofaktor nutzen, zerstört bzw. so manipuliert werden, dass diese nicht von dem Mikroorganismus erzeugt werden können oder nur mit verringerter Aktivität synthetisiert werden.
Derartige Methoden zur gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen sind Stand der Technik. Die auf diese Weise genetisch manipulierten Mikroorganismen produzieren vermehrt Xylit und akkumulieren es im Wachstumsmedium, aus welchem das Xylit durch Kristallisation oder durch chromatographische Methoden angereichert bzw. gewonnen werden kann. Die folgende Beschreibung von Ausführungsbeispielen verdeutlicht die Vorgehensweise der Modifikation der Mikroorganismen und der Gewinnung von Xylit.
Beispiel 1
Zunächst wird die Herstellung von Hefestämmen beschrieben, die die heterologe Xylosereduktase exprimieren. Die Expression heterologer Xylosereduktase in Hefe ist Stand der Technik und wurde beispielsweise im Patent WO 91/15588 beschrieben.
Pichia stipitis wurde in 100 ml YPD (1 I Medium enthält 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glukose, pH = 6,5) über Nacht bei 30 °C kultiviert. Zellen aus 10 ml Kultivierungsmedium wurden durch Zentrifugation pelletiert und die chromosomale DNA nach dem Protokoll von Kaiser et al. (1994) isoliert. Diese DNA diente als Template zur PCR Amplifizierung des 956 bp großen intronlosen offenen Leserahmens (ORF) des XYL1-Gens (Amore et al. 1993). Das resultierende Fragment wurde in einem 1 % Agarosegel separiert und mit dem „JETQUiCK Gel Extraction Spin Kit" der Firma Genomed aufgereinigt. Das Plasmid wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut und, wie oben beschrieben, aufgereinigt. Als Vektor für die Expression in S. cerevisiae wurde p425GPD benutzt. Der Vektor ist ein Multicopy-Plasmid und enthält das LEU2-Gen von S. cerevisiae als Selektionsmarker (Mumberg et al. 1995). Der Vektor wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wie das Fragment und entsprechend aufgereinigt. Der ORF des XYL1 Gens wurde in den Vektor ligiert und rekombinante Plasmide wurden durch Plasmidpräparation und Restriktionsanalysen identifiziert. In dem so hergestellten Plasmid (p425GPD-PsXYL1) ist die Transkription von XYL 7 unter Kontrolle des starken GPD-Promotors und stellt eine hohe Expression exogener XR in S. cerevisiae sicher. Der Stamm S. cerevisiae KOY50 (MATa; his3Δ1; leu2Δ0;ura3A0) wurde mit p425GPD-PsXYL1 nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) transformiert. Leucin-prototrophe Transformanden wurden isoliert und analysiert. Beispiel 2
Inaktivierung der NADH-Dehydrogenasen durch Gen-Replacement der Gene NDE1 und NDE2
Die mitochondrial lokalisierte zytosolische NADH-Dehydrogenase konkurriert mit der XR um den Kofaktor NADH. Um den Verbrauch an zytosolischem NADH zu verringern, wurden die Gene NDE1 und NDE2 durch Gen- Replacement mit geeigneten DNA-Fragmenten inaktiviert. Ein Replacementfragment mit 40 bp Homologie direkt 5'-seitig des Startkodons von NDE1 und 40 bp Homologie 3'-seitig des Stopkodons wurde durch PCR amplifiziert. Das Fragment enthält das his5+-Gen von Schizosaccharomyces pombe und komplementiert his3 Mutationen in S. cerevisiae (Wach et al. 1997). Nach der Amplifizierung wurde das Fragment, wie oben beschrieben, isoliert und aufgereinigt. S. cerevisiae KOY50 wurde nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) mit dem Replacementfragment transformiert. Histidin-prototrophe Transformanden wurden isoliert. Die korrekte Integration des Fragments und der Austausch von NDE1 wurde durch diagnostische PCR nachgewiesen. Ein solcher Stamm (KOY50Δnde1) wurde mit p425GPD- PsXYLl , wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert und zur Xylitproduktion eingesetzt.
Für die Herstellung der Doppelmutante nde1/nde2 wurde ein Replacementfragment mit Homologien zu NDE2, wie oben beschrieben, konstruiert. Als Selektionsmarker diente hierbei das kanMX Modul (Wach et al. 1994). Dieses Modul macht Transformanden resistent gegen G418 (Geneticin). Nach der Transformation wurden die KOY50Δnde1 Zellen auf G418 enthaltendem Medium ausplattiert. Resistente Klone wurden durch diagnostische PCR auf den korrekten Einbau des Replacementfragments und Inaktivierung von NDE2 geprüft. Der resultierende Stamm (KOY50Δnde1Δnde2) wurde mit p425GPD-PsXYL1 , wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
Beispiel 3
Gen-Replacement der für Glycerolphosphatdehydrogenase kodierenden Gene GPD1 und GPD2
Die zytoplasmatischen Glycerolphosphatdehydrogenasen GPD1p und GPD2p nutzen NADH als Kofaktor. Ihre Inaktivierung führt zu einer vorzugsweisen Oxidation von zytosolischem NADH durch die Reduktion von Xylose zu Xylitol mittels XR. Für das Gen-Replacement wurden die Stämme S. cerevisiae KOY50Δnde1 beziehungsweise KOY50Δnde1Δnde2 genutzt. Beide Stämme tragen die ura3Δ0 Mutation. Für die Disruption wurden Fragmente mit Homologien zu GPD1 und GPD2, wie unter Beispiel 2 für NDE1 beschrieben, genutzt. Die Fragmente enthielten das URA3-Gen von Candida albicans als Selektionsmarker. Der Selektionsmarker wurde durch zueinander identische DNA Abschnitte flankiert (Goldstein et al. 1999). URA3 aus C. albicans komplementiert ura3 Mutationen in S. cerevisiae. Zellen mit einem intakten Uracil-Metabolismus sind im Gegensatz zu Zellen mit einer ura3 Mutation sensitiv gegen 5-Fluor-Orod-Säure (5-FOA). Nach der Integration der Disruptionskassette ins Genom kommt es an den sich wiederholenden DNA- Abschnitten zu spontaner homologer Rekombination und somit zum Verlust des L/P>43-Markers. Klone, in denen eine solche Rekombination stattgefunden hat, sind leicht durch ihre Resistenz gegen 5-FOA zu isolieren. Die oben beschriebenen DNA Fragmente wurden durch PCR amplifiziert und gereinigt. Das Fragment für das Gen-Replacement von GPD7 wurde nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) in S. cerevisiae KOY50Δnde1 bzw. KOY50Δnde1Δnde2 transformiert. Uracii-prototrophe Transformanden wurden auf dem entsprechenden Selektionsmedium isoliert. Das Replacement von GPD1 wurde durch diagnostische PCR bestätigt. Danach wurden die so konstruierten Stämme auf eine 5-FOA Resistenz selektiert. In 5-FOA- resistenten Stämmen wurde der Verlust der URA3 Marker durch diagnostische PCR nachgewiesen. In weiteren Arbeiten wurde schließlich GPD2, wie bereits oben beschrieben, inaktiviert.
Die so konstruierten Stämme wurden mit p425GPD-PsXYL1 , wie in Beispiel 1 ausgeführt, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
Beispiel 4
Herstellung von Stämmen mit inaktivierten Dehydrogenasen durch Tetradenanalyse
Um Stämme mit mehreren inaktivierten Dehydrogenasen herzustellen, wurden zunächst die betreffenden Gene einzeln, wie in Beispiel 2 beschrieben, inaktiviert. Nach der Kreuzung der Einzelmutanten und Sporulation der entstandenen diploiden Stämme wurden Tetraden analysiert. Doppelmutanten können einfach im nichtparentalen Dityp (NPD) identifiziert werden. Der Stamm KOY50 wurde genutzt, um GPD1 und GPD2, wie für NDE1 in Beispiel 2 beschrieben, durch Gen-Replacement einzeln zu inaktivieren. Transformanden entgegengesetzten Paarungstyps wurden gekreuzt und die resultierenden Stämme auf dem entsprechenden Medium zur Sporulation gebracht. Die Tetraden wurden auf Histidin-Prototrophie getestet. Die GPD1/GPD2 Doppelnullmutanten wurden als histidin-prototrophe Einsporklone in NPD- Tetraden isoliert, mit p425GPD-PsXYL1 transformiert und zur Xylitproduktion eingesetzt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst, a) Modifizieren der Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist;
b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40
Gramm pro Liter Sulfitsalz (z.B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) enthaltenden Substrat,
c) Kultivieren der Mikroorganismen in einer aeroben Wachstumsphase und einer Sauerstoff limitierten Xylit- Produktionsphase,
d) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Mikroorganismen eine verringerte oder keine Aktivität mindestens eines der Enzyme Glycerolphosphatdehydrogenase, externe mitochondriale NADH-Dehydrogenase oder Alkoholdehydrogenase aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei den Mikroorganismen die Expression der Gene, die die Glycerolphosphatdehydrogenase, externe mitochondriale NADH- Dehydrogenase oder Alkoholdehydrogenase kodieren, ausgesc u oder verringert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadu gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen Hefen der Gattun Candida, Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Schizosacch myces und Debaryomyces eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass
Saccharomyces cerevisiae mindestens eines der Gene NDE1, NL GPD1 und GPD2 entfernt oder inaktiviert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadi gekennzeichnet, dass im Substrat als eine weitere Kohlenstoffqi
Galaktose, Mannose, Glukose oder Arabinose eingesetzt wird.
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