EP1404711A2 - Photoproteines mutees et leurs applications - Google Patents
Photoproteines mutees et leurs applicationsInfo
- Publication number
- EP1404711A2 EP1404711A2 EP02784875A EP02784875A EP1404711A2 EP 1404711 A2 EP1404711 A2 EP 1404711A2 EP 02784875 A EP02784875 A EP 02784875A EP 02784875 A EP02784875 A EP 02784875A EP 1404711 A2 EP1404711 A2 EP 1404711A2
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- photoproteins
- substitution
- amino acid
- motif
- replaced
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 179
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 179
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 92
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 92
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 90
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 claims description 88
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 75
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 59
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 46
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 44
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 42
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 38
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 36
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 34
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 34
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 30
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 30
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 30
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 30
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 29
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 28
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 22
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 22
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 15
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 13
- 150000002309 glutamines Chemical class 0.000 claims description 12
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 claims description 9
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 claims description 9
- 108010089402 phialidin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 claims description 8
- 150000003679 valine derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 claims 1
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 16
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 16
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 3
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- -1 alai-ine Chemical compound 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 1
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700043395 Chlamydia pneumoniae major outer membrane Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001126328 Clytia gregaria Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108700034637 EC 3.2.-.- Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001429712 Mitrocoma cellularia Species 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000010913 Type 1 Angiotensin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010062481 Type 1 Angiotensin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000003390 bioluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001275 ca(2+)-mobilization Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
Definitions
- the subject of the present invention is mutated photoproteins derived from photoproteins isolated from jellyfish, said mutated photoproteins being characterized by greater thermostability, and / or by a luminescence time greater than those of the photoproteins from which they derive, as well as the uses of these proteins.
- mutated photoproteins derived from photoproteins isolated from jellyfish, said mutated photoproteins being characterized by greater thermostability, and / or by a luminescence time greater than those of the photoproteins from which they derive, as well as the uses of these proteins.
- Aequorin is a photoprotein of the jellyfish Aequoria Victoria which consists of a protein part called apoequorine and a prosthetic group, coelententerazine. This photoprotein has the property of emitting light when it is in the presence of Calcium (Ca 2+ ) ions. This property makes it possible in particular to detect variations of Calcium in the cells. This photoprotein is also used as a marker to detect small amounts of organic products (up to less than a hundred molecules) due to an extremely high signal to background noise ratio. Thus, aequorin begins to be used in commercial systems for detecting molecules.
- the present invention stems from the discovery by the inventors of the fact that certain mutations in the peptide sequence of aequorin make it possible to obtain aequorin mutants which are much less sensitive to temperature (at 37 ° C., the mutant photoproteins lose their photoemitting properties in a few days instead of a few hours for the natural protein), as well as mutants with very slow kinetics of light emission (from ten seconds to one minute) which allow samples to be analyzed simultaneously (format multiwell microplate).
- the main object of the present invention is to provide new photoproteins which are less sensitive to temperature rises and whose transport and storage are found to be easier because of their better stability.
- the present invention also aims to provide new photoproteins resistant up to 50 ° C, which simplifies their use, in particular in nucleic acid detection experiments.
- the invention also aims to provide new photoproteins whose luminescence time is significantly greater than that of the photoproteins from which they are derived, which makes it possible to use them in the context of high throughput screening, in particular for the in vitro detection of trace organic molecules.
- the invention also aims to provide kits comprising these new photoproteins, for the implementation of measurement and detection methods as mentioned above.
- the invention mainly has the use of photoproteins isolated from jellyfish for the preparation of mutated photoproteins having a thermostability higher than that of the photoproteins from which they are derived, also called thermostable mutated photoproteins, and / or by a luminescence time greater than that of photoproteins from which they are derived, also called persistent mutated photoproteins, said mutated photoproteins being characterized in that their stability over time is increased at 37 ° C by a factor of at least about 10, and / or in that their luminescence time is increased by a factor of at least about 10, relative to the photoproteins from which they are derived.
- mutated photoprotein in the above and what follows, we mean any photoprotein consisting of a protein part derived by mutation from the protein part of the original jellyfish photoprotein, and of a prosthetic group, such as coelententerazine.
- the invention also relates to a process for the preparation of thermostable and / or persistent mutated photoproteins, said mutated photoproteins being characterized in that their stability over time is increased at 37 ° C by a factor of at least about 10 , and / or in that their luminescence time is increased by a factor of at least about 10, compared to the jellyfish photoproteins from which they derive, characterized in that it comprises the implementation of one or more mutations of said jellyfish photoproteins, said mutations being chosen from:
- the invention also relates to the use of mutable thermostable and / or persistent photoproteins for the implementation of:
- - methods for detecting compounds with enzymatic activity in a biological sample in particular within the framework of the screening of molecules activating or inhibiting a specific enzymatic activity
- - methods for detecting variations in intracellular calcium induced by various agents in particular within the framework of the screening of molecules acting on a nucleic or protein sequence fused with the mutated photoprotein, or coexpressed with the mutated photoprotein in the abovementioned host cells, in which the temperatures used can reach more than 50 ° C., and / or the reading time after activation of the photoprotein can be longer than 5 min, which considerably limits the reading noises.
- a subject of the invention is also the mutated photoproteins derived from photoproteins isolated from jellyfish, said mutated photoproteins being characterized by a thermostability greater than that of the photoproteins from which they derive, and are designated thermostable mutated photoproteins, and / or by a higher luminescence time. to that of the photoproteins from which they are derived, and are designated persistent mutated photoproteins.
- the mutated photoproteins according to the invention are such that the stability over time is increased at 37 ° C by a factor of at least about 10, and / or their luminescence time is increased by a factor of at least about 10, relative to the photoproteins from which they are derived.
- the mutated photoproteins according to the invention are characterized in that they are stable for at least approximately 30 minutes up to the temperature of approximately 50 ° C., and in that they can be stored for at least about 4 days at temperatures up to 37 ° C, and / or in that their luminescence time is between about 1 min and about 5 min.
- a more particular subject of the invention is the mutated photoproteins as defined above, characterized in that they comprise: * at least one of the three mutations increasing their thermostability, chosen from the following:
- the subject of the invention is more particularly the mutated photoproteins as defined above, characterized in that they derive from:
- mitrocomine extracted from the jellyfish Mitrocoma cellularia, said mitrocomine being as represented by the sequence SEQ ID NO: 34,
- the subject of the invention is particularly the mutable thermostable photoproteins derived from clytin as defined above, chosen from proteins comprising the following sequences:
- the peptide sequence SEQ ID NO: 42 corresponding to the sequence SEQ ED NO: 34 in which the lysine in position 25 is replaced by an arginine, and the glutamine in position 176 is replaced by an arginine
- the peptide sequence SEQ ED NO: 44 corresponding to the sequence SEQ ID NO: 34 in which the lysine in position 25 is replaced by an arginine
- the leucine in position 178 is replaced by an isoleucine
- the invention relates more particularly to mutable thermostable photoproteins derived from obelin as defined above, chosen from proteins comprising the following sequences:
- the invention relates more particularly to persistent mutated photoproteins derived from aequorin as defined above, and chosen from proteins comprising the following sequences:
- the subject of the invention is particularly the persistent mutated photoproteins derived from clytin as defined above, chosen from proteins comprising the following sequences:
- the invention relates more particularly to persistent mutated photoproteins derived from mitrocomine as defined above, chosen from proteins comprising the following sequences:
- the peptide sequence SEQ ED NO: 88 corresponding to the sequence SEQ DD NO: 34 in which the glutamate in position 43 is replaced by a glycine
- the peptide sequence SEQ DD NO: 90 corresponding to the sequence SEQ ID NO: 34 in which the aspartate in position 125 is replaced by a glycine
- the invention relates more particularly to the mutated persistent photoproteins derived from obelin as defined above, chosen from proteins comprising the following sequences:
- thermostable and persistent mutated photoproteins as defined above, chosen from:
- SEQ DD NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 in which E in position 44 is replaced by G, and / or D in position 126 is replaced by G, and / or E in position 137 is replaced by G, and / or F in position 158 is replaced by S, and / or D in position 162 is replaced by G, - the proteins of the mitrocomine of sequences SEQ DD NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, and corresponding to the following sequences>.
- the subject of the invention is more particularly the mutated photoproteins as defined above, characterized in that they are linked:
- the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the mutated photoproteins defined above.
- the subject of the invention is more particularly the nucleotide sequences mentioned above, coding for the mutated photoproteins as defined above, chosen from nucleic acids comprising the sequences SEQ ED NO: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 , 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 ,; 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, respectively coding for the sequences SEQ ED NO: 4, 6, 8, 10,
- the invention also relates to the vectors, in particular the plasmids, containing a recombinant sequence comprising a nucleotide sequence of the invention as defined above.
- a subject of the invention is also host cells, such as prokaryotic cells, in particular E. coli, or eukaryotes, in particular the HEK 293 lines. (American Type Culture Collection ATCC No. CRL-1573) or CHO (ATCC No. CCL-61), comprising a nucleotide sequence as defined above, said cells being as obtained by transformation using a the aforementioned vector.
- host cells such as prokaryotic cells, in particular E. coli, or eukaryotes, in particular the HEK 293 lines. (American Type Culture Collection ATCC No. CRL-1573) or CHO (ATCC No. CCL-61), comprising a nucleotide sequence as defined above, said cells being as obtained by transformation using a the aforementioned vector.
- the invention also relates to any process for the preparation of mutated photoproteins as defined above, characterized in that it comprises the transformation of appropriate host cells using a vector mentioned above, the cultivation of transformed host cells thus obtained in an appropriate medium, and the recovery, if necessary after purification, of the mutated photoproteins produced by these cells, followed where appropriate by a step of binding to the prosthetic group, such as coelententerazine.
- the subject of the invention is also the use of mutated photoproteins as defined above, or of aforementioned transformed host cells expressing said mutated photoproteins, in the context of the implementation:
- a more particular subject of the invention is methods for in vitro detection of proteins or antigens or nucleic acids in a biological sample, as defined above, characterized in that they mainly comprise the following steps:
- the subject of the invention is also the methods of in vitro detection of compounds with enzymatic activity in a biological sample as defined above, characterized in that they mainly comprise the following steps:
- a more particular subject of the invention is also the methods of in vitro detection of variations in intracellular calcium induced by various agents as defined above, characterized in that they comprise the cultivation of the above-mentioned transformed cells, with the sample containing the molecules to be detected, and the measurement of the variation in bioluminescence.
- the abovementioned methods according to the invention are characterized in that they can be carried out up to temperatures of approximately 50 ° C., using thermostable mutated photoproteins, and, where appropriate, persistent, such as defined above.
- the abovementioned methods according to the invention are characterized in that they can be carried out simultaneously on multiple samples, using persistent photoproteins, and, if necessary, thermostable, as defined above.
- kits or kits for the implementation of methods as defined above, characterized in that they comprise the above-mentioned mutated photoproteins, where appropriate in combination with reagents necessary for the implementation implementing said processes.
- kits as defined above, characterized in that they can be stored in ready-to-use solutions, in particular for at least approximately 4 days at ambient temperatures of approximately 20 °. C, and up to about 37 ° C, when they contain thermostable, and, where appropriate, persistent photoproteins, as defined above.
- the procedure used consisted in the creation of a bank of random mutants of aequorin generated by the technique of "DNA shuffl ng" (or DNA shuffling) (Stemmer, WPC, 1994). These mutants, inserted into a prokaryotic expression vector were transformed into E. coli and clones. The clones were screened individually for increased bioluminescence. The best mutants were then used for a second round of DNA shuffling followed by identical screening. This process was repeated a third time. Three mutations that increased the activity of aequorin have been identified. In subsequent tests, we were able to show that these mutations do not increase the light emission of aequorin but increase its stability.
- the “wild” aequorin cDNA (Aeqwt, -600 bp) was subcloned at the Kpnl (5 ′) and EcoRl (3 ′) sites of the vector pPD16 under the dependence of the promoter Plac. This clone was named pPD-Aeqwt.
- 3 ⁇ g of the purified product was digested with DNAsel (1 ng / ⁇ l) in 100 ⁇ l of DNAse I buffer at 25 ° C for 7 min.
- the digestion fragments of between 50 and 300 bp were purified by agarose gel electrophoresis.
- 1 ⁇ g of the digested Aeq fragments were subjected to a PCR without primers in 50 ⁇ l of PCR buffer containing 200 ⁇ M of each dNTP, 2.2 mM MgCl, 2.5 units of taq polymerase (Qiagen) by performing 35 cycles with 30 s at 94 ° C, 30s at 45 ° C and 30s at 72 ° C.
- 2.5 ⁇ l of the shuffling reaction product was amplified by 20 PCR cycles (30s at 94 ° C, 30s at 58 ° C and 40s at 72 ° C) in 100 ⁇ l of PCR buffer containing 20 pmol of each primer up-e-Aeq and lo-e-Aeq, 50 ⁇ M of each dNTP, 1.5 mM MgCh and 2.5 units of taq polymerase (Qiagen).
- Mutant library The PCR product with primers (mutated aequorins) was purified (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digested Kpnl I EcoRl and subcloned into the vector pPD16 under the control of the Plac promoter.
- the mutant Aequorin bank has been transformed into the strain of E. Coli XL1 blue (Stratagene), and spread on LB ampicillin boxes.
- the Aequorin clones mutated in 96-well plates were screened for their bioluminescence activity activated by Ca 2+ using an injector luminometer (PhL, Mediators, Austria). The light emitted during the 4 seconds following the injection of 100 ⁇ l of a solution containing CaC, 20 mM and triton XI 00, 1% was measured for each clone individually. The mutants were selected on the basis of an activity 15 times greater than the average of the clones of the 96-well plate and re-spread on the LB ampicillin dish for confirmation and comparison with the wild aequorin.
- the purified aequorins have been preserved at -20 ° C in a solution containing (final concentrations) imidazole, 175 mM; EDTA, 10 ⁇ M; BSA, 10 ⁇ g / ml and glycerol, 50%.
- HEK 293 a eukaryotic cell line
- the cDNAs of wild aequorin and mutant aequorins, excised by double cut Kpnl / Spel or HindIIIUSpel were subcloned at the KpnVNhel or HindIII / N el sites in a eukaryotic expression vector , pCMX, dependent on the CMV promoter.
- the resulting plasmids were co-transfected with a plasmid containing the LacZ gene ( ⁇ -galactosidase) dependent on the RSV promoter in the ⁇ EK 293 cells. 24 h after the transfection, the cells were collected and resuspended in PBS buffer.
- ⁇ -galactosidase activity (luminescent ⁇ -galactosidase detection kit D, Clontech) in a 96-well plate in order to normalize aequorin activities.
- the cell suspension was distributed in a 96-well plate at the rate of 50 ⁇ l per well and incubated for 3 h at 37 ° C. to reconstitute the aequorin.
- the measurement of aequorin activity was carried out using an injector luminometer (PhL, Mediators, Austria). The light emitted during the 4 seconds following the injection of 100 ⁇ l of a solution containing CaC . , 1.5 mM and triton XI 00, 0.75% was measured and normalized with respect to the ⁇ -galactosidase activity.
- a colony was amplified in 5 ml of LB ampicillin and after centrifugation the bacterial pellet was rinsed twice with 5 ml of a solution containing NaCl, 100 mM; Tris ⁇ C1, 50 mM, p ⁇ 8 and EGTA, 1 mM.
- the bacteria were resuspended in 500 ⁇ l of the same solution containing 10 ⁇ M of coelenterazine and incubated at 4 ° C overnight. After adding lysozyme (0.8 mg / ml final) and homogenization, aliquots of 50 ⁇ l were taken for the stability tests.
- the purified aequorins were reconstituted by dilution in a solution containing Tris HCl, 50 mM pH8; DTT, 10 mM, EDTA, 1 mM and coelenterazine, 2 ⁇ M and incubation lh at 4 ° C. Aliquots of 50 ⁇ l were then taken for the stability tests. The stability measurements were carried out as above, with the exception of the activation step carried out by injection of 100 ⁇ l of a solution containing CaCl 2 , 10 mM; Tris HCl pH 8, 50 mM and EDTA, 1 mM.
- the purified aequorins were reconstituted by dilution in a solution containing Tris HCl, 50 mM pH8; DTT, 10 mM, EDTA, 10 ⁇ M and coelenterazine, 2 ⁇ M and 1 h incubation at 4 ° C.
- the reconstituted aequorins were distributed in 96-well plates at a rate of 55 ⁇ l per well and activated with 100 ⁇ l of a solution containing Tris HCl pH 8, 50 mM; EDTA, 10 ⁇ M and variable free Ca 2+ concentrations (final free concentrations after injection: 10 "8 to 10 " 1 M).
- the luminescence measurements (PhL luminometer, Mediators) were carried out in kinetic mode (Fast kinetics, Interval 0.1 sec, kinetic points 60). The determination of the calcium sensitivity curves was based on the initial luminescence values of the light emission kinetics.
- the procedure used consisted in the creation of a bank of random aequorin mutants generated by the "DNA shuffling" technique (Stemmer, WPC, 1994). These mutants, inserted into a prokaryotic expression vector were transformed into E.Coli and clones. The clones were screened individually for an increase in the duration of bioluminescence emission. The best mutants were then sequenced. We have listed six mutations that prolong the biolurninescence of aequorin. In subsequent tests, we were able to show that these mutations do not increase the total light emission of aequorin but slow down its kinetics.
- the tests show an increase in the time of emission of the biolurninescence (of the order of a minute) of about a factor of ten in the prokaryotic or eukaryotic cell system and on purified protein, compared to wild aequorin. (in the order of a second).
- Preliminary data indicate that certain mutants would exhibit greater thermostability than that of wild-type aequorin (experiments carried out on purified protein). All but one of these mutants show a significant reduction in affinity for calcium compared to wild-type aequorin.
- the “wild” aequorin cDNA (Aeqwt, " 600 bp) was subcloned at the Kpril (5 ') and EcoRl (3') sites of the vector pPD16 under the control of the Plac promoter. This clone was named pPD- Aeqwt. 20 ng of the plasmid pPD-Aeqwt was digested with Pstl and Eagl (sites external to the aequorin insert in the polylinker of pPD16) and the insert Aeqwt amplified by PCR using the following primers: up-e-Aeq, 5 'CGG GTA
- PCR product was purified (Qiaquick extraction kit, Qiagen). 3 ⁇ g of the purified product was digested with DNAsel (1 ng / ⁇ l) in 100 ⁇ l of DNAse I buffer at 25 ° C for 7 min. The digestion fragments of between 50 and 300 bp were purified by agarose gel electrophoresis. PCR without primers (shuffling)
- 1 ⁇ g of the digested Aeq fragments were subjected to a PCR without primers in 50 ⁇ l of PCR buffer containing 200 ⁇ M of each dNTP, 2.2 mM MgCl 2 , 2.5 units of taq polymerase (Qiagen) by performing 35 cycles with 30 s to 94 ° C, 30s at 45 ° C and 30s at 72 ° C.
- 2.5 ⁇ l of the shuffling reaction product was amplified by 20 PCR cycles (30s at 94 ° C, 30s at 58 ° C and 40s at 72 ° C) in 100 ⁇ l of PCR buffer containing 20 pmol of each primer up-e-Aeq and lo-e-Aeq, 50 ⁇ M of each dNTP, 1.5 mM MgCl 2 and 2.5 units of taq polymerase (Qiagen).
- the PCR product with primers (mutated aequorins) was purified (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digested Kpnl I EcoRI and subcloned into the vector pPD16 under the dependence of the promoter Plac.
- the mutant aequorin library was transformed into the strain of E. Coli XL1 blue (Stratagene), and spread on LB ampicillin boxes.
- the mutants were sequenced (20 sequence mutants) on an ABI310 automatic sequencer (PE applied biosystems) with the primers up-e-Aeq and lo-e-Aeq (see DNA shuffling).
- the purified aequorins were stored at -20 ° C in a solution containing (final concentrations) imidazole, 175 mM; EDTA, 10 ⁇ M; BSA, 10 ⁇ g / ml and glycerol, 50%.
- the cDNAs of wild aequorin and mutant aequorins, excised by double cut Kp ⁇ l / Spel or Hindlll / Spel were subcloned at the Kpnl / Nhel or HindHI / Nhel sites in a eukaryotic expression vector, pCMX, dependent on the CMV promoter.
- the resulting plasmids were transfected into HEK 293 cells. 24 h after transfection the cells were collected and resuspended in PBS buffer.
- the cell suspension was distributed in a 96-well plate at the rate of 50 ⁇ l per well and incubated for 3 h at 37 ° C. to reconstitute the aequorin.
- the measurement of aequorin activity was carried out using an injector luminometer (PhL, Mediators, Austria).
- the emission kinetics of biolurninescence following the injection of 100 ⁇ l of a solution containing CaCl 2 , 1.5 mM and triton XI 00, 0.75% were determined in kinetic mode (Fast kinetics, Interval 0.1- 10 sec, kinetic points 60). Bioluminescence kinetics and calcium sensitivity tests for aequorins In bacteria
- a colony was amplified in 5 ml of LB ampicillin and after centrifugation the bacterial pellet was rinsed twice with 5 ml of a solution containing NaCl, 100 mM; Tris HCl, 50 mM, pH 8 and EGTA, 1 mM.
- the bacteria were resuspended in 500 ⁇ l of the same solution containing 10 ⁇ M of coelenterazine and incubated at 4 ° C overnight. After addition of lysozyme (0.8 mg / ml final) and homogenization, aliquots of 50 ⁇ l were removed for the kinetics and / or calcium sensitivity tests as described below, l o On purified proteins
- the purified aequorins were reconstituted by dilution in a solution containing Tris HCl, 50 mM pH8; DTT, 10 mM, EDTA, 10 ⁇ M and coelenterazine, 2 ⁇ M and 1 h incubation at 4 ° C.
- the reconstituted aequorins were distributed in 96-well plates at a rate of 55 ⁇ l per puives and activated with 100 ⁇ l of a solution containing Tris 15 HCl pH 8, 50 mM; EDTA, 10 ⁇ M and variable free Ca 2+ concentrations
- the detection of nucleic acid sequences can be carried out either after an amplification step by PCR (DNA) or RT-PCR (RNA) or by any other nucleic acid amplification technique, or directly.
- DNA DNA
- RNA RT-PCR
- the molecules are detected by hybridization of a probe.
- Hybridization of the probe is then revealed by means of a photoprotein directly coupled to the probe or subsequently linked to the latter.
- the nucleic acid molecules or their amplification products are quantified by the intensity of the emitted biolurninescence.
- NASBA Nucleic acid sequence based amplification
- ompA Chlamydia pneumoniae major outer membrane protein
- the proteins and antigens are detected by specific association with a probe (association of the antigen-antibody or ligand-receptor type).
- Luminometry a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. J Immunol Methods. 1996 Apr 19; 190 (2): 189-97.
- Protein substrates partly composed of a photoprotein can make it possible to measure enzymatic activities in vitro or in cellular systems.
- the detectable enzymatic activities are, for example, of the “protein modification” type (proteases, kinases, glycosylases, etc.). This type of measurement can be used for the screening of molecules activating or inhibiting a specific enzymatic activity (for example in reference 1, detection of the activity of the protease of HEV-1).
- the protein substrate containing the photoprotein, or the sample to be assayed are immobilized.
- the enzymatic activity is then quantified by the intensity of the bioluminescence emitted.
- the same type of measurement can be carried out in cellular systems expressing the gene corresponding to the protein substrate containing the photoprotein.
- the cellular enzymatic activities are then quantified by activation of the photoprotein and measurement of the intensity of the emitted bioluminescence.
- prokaryotic or eukaryotic are used to detect variations in intracellular calcium induced by various agents. Changes in intracellular calcium are detected by the corresponding changes in the emitted bioluminescence.
- the most common application uses eukaryotic lines of the HEK 293 type co-expressing aequorin and a neurotransmitter receptor (receptor-channel or receptor coupled to a G protein) for screening pharmacological agents or natural ligands acting on the receptor.
- these systems can be used to screen DNA libraries for receptors activated by a pharmacological agent or a natural ligand. The screen is based on the variation of biolurninescence induced by the application of the pharmacological agent or the natural ligand.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
L'invention a pour objet des photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité superieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées persistantes. L'invention concerne également l'utilisation des photoprotéines mutées susmentionnées dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de détection in vitro de molécules dans un échantillon biologique, de procédés de detection de composes à activité enzymatique dans un échantillon biologique, ou de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire.
Description
PHOTOPROTEINES MUTEES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention a pour objet des photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure, et/ou par un temps de luminescence supérieur à ceux des photoprotéines dont elles dérivent, ainsi que les utilisations de ces protéines, notamment dans le cadre de la mise en œuvre de procédés de détection in vitro de molécules, de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, ou de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents.
L'aequorine est une photoprotéine de la méduse Aequoria Victoria qui est constituée d'une partie protéique appelée l'apoequorine et d'un groupement prosthétique, la coelententerazine. Cette photoprotéine a la propriété d'émettre de la lumière lorsqu'elle est en présence d'ions Calcium (Ca2+). Cette propriété permet notamment de détecter les variations de Calcium dans les cellules. Cette photoprotéine est également utilisée comme marqueur pour détecter de faibles quantités de produits organiques (jusqu'à moins d'une centaine de molécules) en raison d'un rapport signal sur bruit de fond extrêmement élevé. Ainsi, l'aequorine commence à être utilisée dans des systèmes commerciaux de détection de molécules. Son utilisation offre plusieurs avantages : une très grande gamme dynamique qui permet de détecter et de quantifier les molécules sur plusieurs ordres de grandeur, et un bruit de fond extrêmement faible qui permet de détecter la présence de seulement quelques dizaines de molécules dans un échantillon. Ceci permet d'éviter le recours aux techniques d'amplification, telles que la PCR pour la détection des acides nucléiques.
Cependant, les photoprotéines naturelles, et l'aequorine en particulier sont très sensibles aux variations de température qui peuvent dénaturer leur pouvoir d'émission de lumière. Par ailleurs, la cinétique d'émission de la photoprotéine naturelle est extrêmement rapide (de l'ordre de la seconde) et oblige à une analyse « échantillon par échantillon » dans un luminomètre à injection rapide. Ceci pose un problème pour
utiliser l'aequorine dans un système de criblage à haut débit qui nécessite l'analyse simultanée d'un grand nombre d'échantillon (HTS, High Throughput Screening).
La présente invention découle de la mise en évidence par les inventeurs du fait que certaines mutations dans la séquence peptidique de l'aequorine permettent d'obtenir des mutants d'aequorine beaucoup moins sensibles à la température (à 37°C, les photoprotéines mutantes perdent leurs propriétés photoémettrices en quelques jours au lieu de quelques heures pour la protéine naturelle), ainsi que des mutants ayant une cinétique d'émission lumineuse très ralentie (de la dizaine de secondes à la minute) qui permettent d'analyser simultanément les échantillons (format microplaque à multipuits).
Ainsi la présente invention a principalement pour but de fournir de nouvelles photoprotéines moins sensibles aux élévations de température, et dont le transport et le stockage se trouvent être facilités en raison de leur meilleure stabilité.
La présente invention a pour but également de fournir de nouvelles photoprotéines résistantes jusqu'à 50°C, ce qui simplifie leur utilisation, notamment dans les expériences de détection d'acides nucléiques.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles photoprotéines dont le temps de luminescence est nettement supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, ce qui permet de les utiliser dans le cadre du criblage à haut débit, notamment pour la détection in vitro de molécules organiques à l'état de trace.
L'invention a également pour but de fournir des kits comprenant ces nouvelles photoprotéines, pour la mise en œuvre de procédés de mesure et de détection tels que mentionnés ci-dessus.
L'invention a principalement l'utilisation de photoprotéines isolées de méduses pour la préparation de photoprotéines mutées ayant une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, encore désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, encore désignées photoprotéines mutées persistantes, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées en ce que leur stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou en ce que leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines dont elles dérivent.
Il convient de souligner que par l'expression photoprotéine mutée dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute photoprotéine constituée d'une partie protéique dérivée par mutation de la partie protéique de la photoprotéine de méduse d'origine, et d'un groupement prosthétique, telle que la coelententerazine. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de photoprotéines mutées thermostables, et/ou persistantes, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées en ce que leur stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou en ce que leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines de méduse dont elles dérivent, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre d'une ou plusieurs mutations desdites photoprotéines de méduse, lesdites mutations étant choisies parmi :
* au moins une des trois mutations augmentant la thermostabilité desdites photoprotéines, et choisie parmi les suivantes :
- suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKX]MFX2 dans lequel X]=H ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine,
- suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine,
- suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine, * et/ou au moins une des six mutations augmentant le temps de luminescence desdites photoprotéines, et choisie parmi les suivantes :
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DXιNX2X3GX4LX5LX E dans lequel X^V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, K ou Q, X5=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE dans lequel Xι=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, X^I
ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, - suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDX1X2GX X4XsLDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, - suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EX!TFX2X3 dans lequel Xι=E, K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une serine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, - suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif
DX1DX2X3GX LDVDE, dans lequel X]=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X^Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ LD NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine. L'invention concerne également l'utilisation des photoprotéines mutées thermostables et/ou persistantes pour la mise en œuvre de :
- de procédés de détection in vitro de molécules, tels que des protéines ou antigènes ou des acides nucléiques dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du dépistage in vitro de bactéries telles que les Listeria dans les aliments, ou dans le cadre du dépistage d'agents pathogènes tels que le virus VTH chez l'homme,
- de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique,
- de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents, notamment dans le cadre du criblage de molécules agissant sur une séquence nucléique ou protéique fusionnée à la photoprotéine mutée, ou coexprimée avec la photoprotéine mutée dans des cellules hôtes susmentionnées, dans lesquels les températures utilisées peuvent atteindre plus de 50°C, et/ou le temps de lecture après activation de la photoprotéine peut être supéreir à 5 min, ce qui limite considérablement les bruits de lecture.
L'invention a également pour objet les photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées par une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, et sont désignées photoprotéines mutées persistantes.
Avantageusement, les photoprotéines mutées selon l'invention, sont telles que la stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines dont elles dérivent.
Avantageusement encore, les photoprotéines mutées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles sont stables pendant au moins environ 30 minutes jusqu'à la température d'environ 50°C, et en ce qu'elles peuvent être conservées pendant au moins environ 4 jours à des températures pouvant atteindre jusqu'à 37°C, et/ou en ce que leur temps de luminescence est compris entre environ 1 min et environ 5 min.
L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent : * au moins une des trois mutations augmentant leur thermostabilité, choisie parmi les suivantes :
- suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKX1MFX2 dans lequel ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine,
- suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine,
- suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine,
* et/ou au moins une des six mutations augmentant leur temps de luminescence, choisie parmi les suivantes :
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DX1NX2X GX4IX5LX6E dans lequel Xι=V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, X^K ou Q, X5=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif
DKDX1X2GX3X4X5LDE dans lequel Xλ=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, l ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDX^GXsXtXsLDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EX!TFX2X3 dans lequel
K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif, peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une serine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alai-ine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DX1DX2X3GX4LDVDE, dans lequel Xj=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X»=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine. Des photoprotéines mutées thermostables particulièrement préférées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des deux mutations suivantes :
- suppression de la glutamine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine,
- suppression de la leucine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine. Des photoprotéines mutées persistantes particulièrement préférées selon l'invention, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des mutations suivantes : suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE dans lequel X^Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, X^I ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DXιDX2X3GX4LDVDE, dans lequel
K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine.
L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles dérivent de :
- l'aequorine extraite de la méduse Aequoria Victoria, ladite aequorine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, - la clytine extraite de la méduse Clytia gregaria, ladite clytine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 18,
- la mitrocomine extraite de la méduse Mitrocoma cellularia, ladite mitrocomine étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 34,
- ou de l'obéline extraite de la méduse Obelia longissima, ladite obéline étant telle que représentée par la séquence SEQ ID NO : 50.
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de l'aequorine telles que définies ci-dessus, et choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 4, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 6, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 8, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ED NO : 10, correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 12, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 14, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 2 dans laquelle la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 16, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la lysine en position 27 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 178 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 180 est remplacée par une isoleucine,
L'invention a particulièrement pour objet les photoprotéines mutées thermostables dérivées de la clytine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 20, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 22, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 24, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 18 dans laquelle la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 26, correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 28, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 30, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 32, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle la lysine en position 26 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 177 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 179 est remplacée par une isoleucine,
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de la mitrocomine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 36, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 38, correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, - la séquence peptidique SEQ ED NO : 40, correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 34 dans laquelle la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ID NO : 42, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 44 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 46, correspondant à la séquence SEQ ÏÏD NO : 34 dans laquelle la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 48, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 34 dans laquelle la lysine en position 25 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 176 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 178 est remplacée par une isoleucine.
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées thermostables dérivées de l'obéline telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 52, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 54, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 56, correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine, - la séquence peptidique SEQ ED NO : 58, correspondant à la séquence SEQ ED
NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, et la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 60, correspondant à la séquence SEQ DD NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 62 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 64, correspondant à la séquence SEQ DD NO : 50 dans laquelle la lysine en position 23 est remplacée par une arginine, la glutamine en position 174 est remplacée par une arginine, et la leucine en position 176 est remplacée par une isoleucine.
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de l'aequorine telles que définies ci-dessus, et choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 66 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle le glutamate en position 45 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 68 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 2 dans laquelle la valine en position 54 est remplacée par une alanine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 70 correspondant à la séquence SEQ DD NO : 2 dans laquelle l'aspartate en position 127 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ DD NO : 72 correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 2 dans laquelle le glutamate en position 138 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 74 correspondant à la séquence SEQ DD NO : 2 dans laquelle la phénylalanine en position 159 est remplacée par une serine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 76 correspondant à la séquence SEQ DD NO : 2 dans laquelle l'aspartate en position 163 est remplacé par une glycine.
L'invention a particulièrement pour objet les photoprotéines mutées persistantes dérivées de la clytine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 78 correspondant à la séquence SEQ DD NO : 18 dans laquelle le glutamate en position 44 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 80 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle l'aspartate en position 126 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 82 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle le glutamate en position 137 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ DD NO : 84 correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 18 dans laquelle la phénylalanine en position 158 est remplacée par une serine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 86 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 18 dans laquelle l'aspartate en position 162 est remplacé par une glycine.
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de la mitrocomine telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 88 correspondant à la séquence SEQ DD NO : 34 dans laquelle le glutamate en position 43 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 90 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle l'aspartate en position 125 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 92 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle le glutamate en position 136 est remplacé par une glycine, - la séquence peptidique SEQ ID NO : 94 correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 34 dans laquelle la phénylalanine en position 157 est remplacée par une serine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 96 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 34 dans laquelle l'aspartate en position 161 est remplacé par une glycine.
L'invention concerne plus particulièrement les photoprotéines mutées persistantes dérivées de l'obéline telles que définies ci-dessus, choisies parmi les protéines comprenant les séquences suivantes :
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 98 correspondant à la séquence SEQ ID NO : 50 dans laquelle le glutamate en position 41 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ DD NO : 100 correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle l'aspartate en position 123 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 102 correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle le glutamate en position 134 est remplacé par une glycine,
- la séquence peptidique SEQ ED NO : 104 correspondant à la séquence SEQ ED NO : 50 dans laquelle la phénylalanine en position 155 est remplacée par une serine, - la séquence peptidique SEQ ED NO : 106 correspondant à la séquence SEQ ED
NO : 50 dans laquelle l'aspartate en position 159 est remplacé par une glycine.
L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées thermostables et persistantes telles que définies ci-dessus, choisies parmi :
- les protéines dérivées de l'aequorine de séquences SEQ ED NO : 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, et correspondant aux séquences SEQ ED NO : 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, dans lesquelles E en position 45 est remplacé par G, et/ou V en position 54 est remplacé par A, et/ou D en position 127 est remplacé par G, et/ou E en position 138 est remplacé par G, et/ou F en position 159 est remplacé par S, et/ou D en position 163 est remplacé par G, - les protéines dérivées de la clytine de séquences SEQ ED NO : 114, 115, 116,
117, 118, 119, 120, et correspondant aux séquences suivantes : SEQ DD NO : 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, dans lesquelles E en position 44 est remplacé par G, et/ou D en position 126 est remplacé par G, et/ou E en position 137 est remplacé par G, et/ou F en position 158 est remplacé par S, et/ou D en position 162 est remplacé par G,
- les protéines de la mitrocomine de séquences SEQ DD NO : 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, et correspondant aux séquences suivantes >. SEQ DD NO : 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, dans lesquelles E en position 43 est remplacé par G, et/ou D en position 125 est remplacé par G, et/ou E en position 136 est remplacé par G, et/ou F en position 157 est remplacé par S, et/ou D en position 161 est remplacé par G,
- les protéines dérivées de l'obéline de séquences SEQ ID NO : 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, et correspondant aux séquences suivantes : SEQ ED NO : 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, dans lesquelles E en position 41 est remplacé par G, et/ou D en position 123 est remplacé par G, et/ou E en position 134 est remplacé par G, et/ou F en position 155 est remplacé par S, et/ou D en position 159 est remplacé par G.
L'invention a plus particulièrement pour objet les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont liées :
- à une sonde protéique ou nucléique susceptible de reconnaître des antigènes ou protéines ou acides nucléiques déterminés, - ou à un substrat spécifique d'une activité enzymatique déterminée,
- ou à une molécule susceptible de former un complexe avec une autre molécule, tel que le complexe avidine-biotine.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les photoprotéines mutées définies ci-dessus. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques susmentionnées, codant pour les photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, choisies parmi les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ED NO : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, ;85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, codant respectivement pour les séquences SEQ ED NO : 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, ou toute séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences susmentionnées et codant pour les photoprotéines mutées susmentionnées. L'invention concerne également les vecteurs, notamment les plasmides, contenant une séquence recombinante comprenant une séquence nucléotidique de l'invention telle que définie ci-dessus.
L'invention a également pour objet les cellules hôtes, telles que cellules procaryotes, notamment E. coli, ou eucaryotes, notamment les lignées HEK 293
(American Type Culture Collection ATCC n° CRL-1573) ou CHO (ATCC n° CCL-61), comprenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, lesdites cellules étant telles qu'obtenues par transformation à l'aide d'un vecteur susmentionné.
L'invention concerne également tout procédé de préparation de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de cellules hôtes appropriées à l'aide d'un vecteur susmentionné, la mise en culture de cellules hôtes transformées ainsi obtenues dans un milieu approprié, et la récupération, le cas échéant après purification, des photoprotéines mutées produites par ces cellules, suivie le cas échéant d'une étape de liaison au groupement prosthétique, telle que la coelententerazine.
L'invention a également pour objet l'utilisation de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, ou de cellules hôtes transformées susmentionnées exprimant lesdites photoprotéines mutées, dans le cadre de la mise en œuvre :
- de procédés de détection in vitro de molécules, tels que des protéines ou antigènes ou des acides nucléiques dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du dépistage in vitro de bactéries telles que les Listeria dans les aliments, ou dans le cadre du dépistage d'agents pathogènes tels que le virus VTH chez l'homme,
- de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique,
- de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents, notamment dans le cadre du criblage de molécules agissant sur une séquence nucléique ou protéique fusionnée à la photoprotéine mutée, ou coexprimée avec la photoprotéine mutée dans des cellules hôtes susmentionnées. L'invention a plus particulièrement pour objet des procédés de détection in vitro de protéines ou antigènes ou d'acides nucléiques dans un échantillon biologique, tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes :
- le cas échéant, une étape d'amplification du nombre d'acides nucléiques présents dans l'échantillon biologique,
- immobilisation des protéines ou antigènes ou acides nucléiques sur un support approprié, puis addition d'une sonde spécifique desdits protéines ou antigènes ou acides nucléiques et rinçage, ladite sonde étant liée à une photoprotéine mutée telle que définie
ci-dessus, ou ladite photoprotéine étant additionnée sur le support avec les réactifs appropriés pour sa liaison à ladite sonde,
- mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage. L'invention a également pour objet les procédés de détection in vitro de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes :
- immobilisation sur un support approprié d'un substrat protéique spécifique de l'activité enzymatique à détecter, ce substrat étant lié à une photoprotéine mutée telle que définie ci-dessus, addition de l'échantillon biologique, puis rinçage, - ou immobilisation sur un support approprié des composés de l'échantillon biologique, addition du substrat protéique lié à une photoprotéine mutée telle que définie ci-dessus, puis rinçage,
- mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage. L'invention a plus particulièrement pour objet encore, les procédés de détection in vitro des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent la mise en culture de cellules transformées susmentionnées, avec l'échantillon contenant les molécules à détecter, et la mesure de la variation de bioluminescence.
Avantageusement, les procédés susmentionnés selon l'invention, sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués jusqu'à des températures d'environ 50 °C, à l'aide de photoprotéines mutées thermostables, et, le cas échéant, persistantes, telles que définies ci-dessus.
Avantageusement encore, les procédés susmentionnés selon l'invention, sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués en simultanés sur échantillons multiples, à l'aide de photoprotéines persistantes, et, le cas échéant, thermostables, telles que définies ci-dessus.
L'invention a également pour objet les kits ou trousses, pour la mise en œuvre de procédés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils comprennent des photoprotéines mutées susmentionnées, le cas échéant en association avec des réactifs nécessaires à la mise en œuvre desdits procédés.
L'invention a plus particulièrement pour objet les kits tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils peuvent être conservés en solutions prêtes à l'emploi, notamment pendant au moins environ 4 jours à des températures ambiantes d'environ 20°C, et pouvant atteindre jusqu'à environ 37°C, lorsqu'ils contiennent des
photoprotéines mutées thermostables, et, le cas échéant, persistantes, telles que définies ci-dessus.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit d'obtention de photoprotéines mutées telles que définies ci-dessus, et des conditions d'utilisation de ces photoprotéines dans le cadre des applications susmentionnées de ces dernières.
A) Obtention de mutants thermostables de la photoprotéine aequorine
Protocoles
La procédure employée a consisté en la réalisation d'une banque de mutants aléatoires d'aequorine générés par la technique de "DNA shuffl ng" (ou brassage de l'ADN) (Stemmer, WPC, 1994). Ces mutants, insérés dans un vecteur d'expression procaryotique ont été transformés dans E. coli et clones. Les clones ont été criblés individuellement pour une augmentation de bioluminescence. Les meilleurs mutants ont alors été utilisés pour un deuxième tour de DNA shuffling suivi d'un criblage identique. Ce processus a été répété une troisième fois. Trois mutations qui augmentaient l'activité de l'aequorine ont été répertoriées. Lors des test subséquents, nous avons pu montrer que ces mutations n'augmentent pas l'émission de lumière de l'aequorine mais augmentent sa stabilité. Ceci explique que ces mutants aient été sélectionnés dans notre système cellulaire procaryotique (E. coli). Pour l'un de ces mutants, les tests montrent une augmentation du temps de demi-vie à 37°C d'un facteur 12.5 en système cellulaire procaryotique et d'un facteur 7.5 pour la protéine purifiée, par rapport à l'aequorine sauvage. De même, la température de demi-inactivation de ce mutant lors d'un choc thermique de 30 minutes est supérieure de 10 degrés Celsius à celle de l'aequorine sauvage (expérience réalisée en système cellulaire et sur protéine purifiée). Ce même mutant montre une légère réduction d'affinité pour le calcium par rapport à l'aequorine sauvage, ce qui est un avantage pour une utilisation de l'aequorine in vitro.
DNA shuffling
Le cDNA de l'aequorine « sauvage » (Aeqwt, -600 bp) a été sous-cloné aux sites Kpnl (5') et EcoRl (3') du vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. Ce clone a été nommé pPD- Aeqwt. 20 ng du plasmide pPD-Aeqwt a été digéré par Pstï et Eagl (sites externes à l'insert aequorine dans le polylinker de pPD16) et l'insert Aeqwt
amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes : up-e-Aeq, 5' CGG GTA CCG ATG CTTTATGATGTTCCTGAT 3' et lo-e-Aeq, 5' TGGAATTC TTA GGGGACAGCTCCAC 3'. Le produit de PCR résultant a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen). 3 μg du produit purifié a été digéré par la DNAsel (1 ng/μl) dans 100 μl de tampon DNAse I à 25°C pendant 7 min. Les fragments de digestion compris entre 50 et 300 bp ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.
PCR sans amorces (shuffling)
1 μg des fragments Aeq digérés ont été soumis à une PCR sans amorces dans 50 μl de tampon PCR contenant 200 μM de chaque dNTP, 2,2 mM MgCl , 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen) en effectuant 35 cycles avec 30s à 94°C, 30s à 45°C et 30s à 72°C.
PCR avec amorces
2,5 μl du produit de la réaction de shuffling a été amplifié par 20 cycles de PCR (30s à 94°C, 30s à 58°C et 40s à 72°C) dans 100 μl de tampon de PCR contenant 20 pmole de chaque amorce up-e-Aeq et lo-e-Aeq, 50 μM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCh et 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen).
Banque de mutants Le produit de la PCR avec amorces (aequorines mutées) a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digéré Kpnl I EcoRl et sous-cloné dans le vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. La banque d'aequorines mutantes a été transformée dans la souche d'E. Coli XL1 blue (Stratagene), et étalée sur boites LB ampicilline.
Au 1er tour de shuffling-criblage, 15840 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits (Costar) dans 50 μl de LB ampicilline par puits et incubées 4 h à 37°C avec agitation en vue du criblage de leur activité.
Aux 2e et 3e tour de shuffling-criblage, respectivement 19200 et 17952 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits dans 200 μl de milieu de congélation (composition en g/1, Bacto tryptone, 16, Bacto yeast extract, 10, NaCl, 5, K2HPO4, 0,27, KH2PO4, 7,16, Na citrate, 2, MgSO4-7H2O, 0,1, (NH4)2SO4,
0,9, glycérol, 50 et 100 μg/ml d' ampicilline) et après incubation sur la nuit à 37°C sans agitation, stockées à -80°C. Ces plaques de stockage ont été répliquées (96 pin replicator long, Genetix) en plaques 96 puits (Costar) dans 50 μl de LB ampicilline par puits. Ces répliques pour criblage ont été incubées 4 h à 37°C avec agitation.
Après ajout de 50 μl par puits d'une solution contenant Tris pH8, 100 mM, NaCl, 90 mM, coelenterazin, 5 mM, les plaques à cribler ont été incubées à 4°C durant la nuit pour la reconstitution de l'aequorine (volume final par puits 100 μl). Criblage Après 15 minutes à température ambiante, les clones d'aequorines mutées en plaques 96 puits ont été criblées pour leur activité de bioluminescence activée par le Ca2+ à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives à l'injection de 100 μl d'une solution contenant CaC , 20 mM et triton XI 00, 1% a été mesurée pour chaque clone individuellement. Les mutants ont été sélectionnés sur la base d'une activité 15 fois supérieure à la moyenne des clones de la plaque 96 puits et ré-étalés sur boite LB ampicilline pour confirmation et comparaison avec l'aequorine sauvage. A l'issue du 1er tour de criblage, 40 clones dont l'activité était supérieure à celle de l'aequorine sauvage ont été sélectionnés pour le 2e tour de shuffling-criblage. 37 clones ont été sélectionnés au second tour pour le troisième tour de criblage. L'insert de chacun de ces clones a été amplifié individuellement par PCR en utilisant les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir ci-dessus, DNA shuffling). Les produits de PCR de chaque clone ont été combinés (200 ng par clone) et soumis au protocole de DNA shuffling précédent pour générer la banque de mutants du tour suivant.
Séquençage des mutants
Le séquençage des mutants (7 mutants sélectionnés au 2e tour et 7 mutants sélectionnés au 3e tour) a été réalisé sur un séquenceur automatique ABI310 (PE applied biosystems) avec les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir DNA shuffling).
Purification des aequorines
Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure KprillEcoRl ont été sous-clonés dans pRSETC (Invitrogen, Xpress protein expression System). Les plasmides résultants ont été transformés dans la souche d'E.Coli BL21(DE3) pLysS (Invitrogen) pour expression des aequorines. Les aequorines ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne de nickel- agarose (Invitrogen, Xpress protein expression system), selon les instructions du fabriquant (élution par 350 mM imidazole). Les aequorines purifiées ont été conservées
à -20°C dans une solution contenant (concentrations finales) imidazole, 175 mM ; EDTA, 10 μM ; BSA, 10 μg/ml et glycérol, 50%.
Expression en lignée cellulaire eucaryote (HEK 293) Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure Kpnl/Spel ou HindlïUSpel ont été sous-clonés aux sites KpnVNhel ou HindUÏ/N el dans un vecteur d'expression eucaryote, pCMX, sous dépendance du promoteur CMV. Les plasmides résultants ont été co-transfectés avec un plasmide contenant le gène LacZ (β-galactosidase) sous dépendance du promoteur RSV dans les cellules ΗEK 293. 24 h après la transfection les cellules ont été collectées et resuspendues en tampon PBS.
Test d 'activité β-galactosidase.
Un aliquote de la suspension cellulaire a été utilisé pour la mesure de l'activité β-galactosidase (luminescent β-galactosidase détection kit D, Clontech) en plaque 96 puits afin de normaliser les activités aequorine.
Bioluminescence aequorine.
Après ajout de coelenterazine (10 μM final) la suspension cellulaire a été distribuée en plaque 96 puits à raison de 50 μl par puits et incubée 3h à 37°C pour reconstituer l'aequorine. La mesure de l'activité aequorine a été réalisée à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives à l'injection de 100 μl d'une solution contenant CaC ., 1,5 mM et triton XI 00, 0,75% a été mesurée et normalisée par rapport à l'activité β-galactosidase.
Tests de stabilité des aequorines
En bactéries
Pour chaque clone d'aequorine à tester, une colonie a été amplifiée dans 5 ml de LB ampicilline et après centrifugation le culot bactérien a été rincé deux fois par 5 ml d'une solution contenant NaCl, 100 mM ; Tris ΗC1, 50 mM, pΗ 8 et EGTA, 1 mM. Les bactéries ont été resuspendues dans 500 μl de la même solution contenant 10 μM de coelenterazine et incubées à 4°C durant la nuit. Après ajout de lysozyme (0,8 mg/ml final) et homogénéisation, des aliquotes de 50 μl ont été prélevés pour les test de stabilité.
Stabilité à 37°C au cours du temps : les aliquotes ont été incubés à 37°C et à différents temps (jusqu'à 72 h), puis ont été distribués en- plaque 96 puits à raison de 10 μl par puits. La luminescence activée par injection de 200 μl d'une solution contenant
CaCl2, 2 mM ; NaCl, 100 mM ; Tris HCl pH 8, 50 mM et EGTA, 1 mM (Ca2+ libre, ~1 mM) a été mesurée et normalisée par rapport à la valeur obtenue à to.
Stabilité à différentes températures : les aliquotes ont été incubés à des températures comprises entre 25 et 55°C durant 30 min puis distribués en plaque 96 puits à raison de 10 μl par puits. La luminescence, mesurée comme ci-dessus, a été normalisée par rapport à la valeur obtenue à 25°C. Sur protéines purifiées
Les aequorines purifiées ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HCl, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 1 mM et coelenterazine, 2 μM et incubation lh à 4°C. Des aliquotes de 50 μl ont ensuite été prélevés pour les test de stabilité. Les mesures de stabilité ont été effectuées comme précédemment, à l'exception de l'étape d'activation réalisée par injection de 100 μl d'une solution contenant CaCl2, 10 mM ; Tris HCl pH 8, 50 mM et EDTA, 1 mM.
Tests de sensibilité calcique des aequorines
Les aequorines purifiés ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HCl, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 10 μM et coelenterazine, 2 μM et incubation lh à 4°C. Les aequorines reconstituées ont été distribuées en plaque 96 puits à raison de 55 μl par puits et activées par 100 μl d'une solution contenant Tris HCl pH 8, 50 mM ; EDTA, 10 μM et des concentrations de Ca2+ libres variables (concentrations libres finales après injection : 10"8 à 10"1 M). Les mesures de luminescence (luminomètre PhL, Mediators) ont été réalisées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1 sec, kinetic points 60). La détermination des courbes de sensibilité calcique a été basée sur les valeurs initiales de luminescence des cinétiques d'émission lumineuse.
B) Obtention de mutants persistants de la photoprotéine aequorine à luminescence prolongée
Protocoles
La procédure employée a consisté en la réalisation d'une banque de mutants aléatoires d' aequorine générés par la technique de "DNA shuffling" (Stemmer, WPC, 1994). Ces mutants, insérés dans un vecteur d'expression procaryotique ont été transformés dans E.Coli et clones. Les clones ont été criblés individuellement pour une augmentation de la durée d'émission de la bioluminescence. Les meilleurs mutants ont alors été séquences. Nous avons répertorié six mutations qui prolongent la biolurninescence de l'aequorine. Lors des test subséquents, nous avons pu montrer que ces mutations n'augmentent pas l'émission totale de lumière de l'aequorine mais ralentissent sa cinétique. Pour ces mutants, les tests montrent une augmentation du temps d'émission de la biolurninescence (de l'ordre de la minute) d'environ un facteur dix en système cellulaire procaryotique ou eucaryotique et sur protéine purifiée, par rapport à l'aequorine sauvage (de l'ordre de la seconde). Des données préliminaires indiquent que certains mutants présenteraient une thermostabilité supérieure à celle de l'aequorine sauvage (expériences réalisées sur protéine purifiée). Tous ces mutants sauf un montrent une importante réduction d'affinité pour le calcium par rapport à l'aequorine sauvage.
DNA shuffling
Le cDNA de l'aequorine « sauvage » (Aeqwt, "600 bp) a été sous-cloné aux sites Kpril (5') et EcoRl (3') du vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. Ce clone a été nommé pPD-Aeqwt. 20 ng du plasmide pPD-Aeqwt a été digéré par Pstl et Eagl (sites externes à l'insert aequorine dans le polylinker de pPD16) et l'insert Aeqwt amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes : up-e-Aeq, 5' CGG GTA
CCG ATG CTTTATGATGTTCCTGAT 3' et lo-e-Aeq, 5' TGGAATTC TTA GGGGACAGCTCCAC 3' . Le produit de PCR résultant a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen). 3 μg du produit purifié a été digéré par la DNAsel (1 ng/μl) dans 100 μl de tampon DNAse I à 25 °C pendant 7 min. Les fragments de digestion compris entre 50 et 300 bp ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.
PCR sans amorces (shuffling)
1 μg des fragments Aeq digérés ont été soumis à une PCR sans amorces dans 50 μl de tampon PCR contenant 200 μM de chaque dNTP, 2,2 mM MgCl2, 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen) en effectuant 35 cycles avec 30s à 94°C, 30s à 45 °C et 30s à 72°C.
PCR avec amorces
2,5 μl du produit de la réaction de shuffling a été amplifié par 20 cycles de PCR (30s à 94°C, 30s à 58°C et 40s à 72°C) dans 100 μl de tampon de PCR contenant 20 pmole de chaque amorce up-e-Aeq et lo-e-Aeq, 50 μM de chaque dNTP, 1,5 mM MgCl2 et 2.5 unités de taq polymérase (Qiagen).
Banque de mutants
Le produit de la PCR avec amorces (aequorines mutées) a été purifié (Qiaquick extraction kit, Qiagen), digéré Kpnl I EcoRI et sous-cloné dans le vecteur pPD16 sous dépendance du promoteur Plac. La banque d' aequorines mutantes a été transformée dans la souche d'E. Coli XL1 blue (Stratagene), et étalée sur boites LB ampicilline.
15840 colonies ont été repiquées individuellement, transférées en plaques 96 puits (Costar) dans 50 μl de LB ampicilline par puits et incubées 4 h à 37 °C avec agitation en vue du criblage de leur activité. Après ajout de 50 μl par puits d'une solution contenant Tris pH8, 100 mM,
NaCl, 90 mM, coelenterazin, 5 mM, les plaques à cribler ont été incubées à 4°C durant la nuit pour la reconstitution de l'aequorine (volume final par puits 100 μl). Criblage
Après 15 minutes à température ambiante, les clones d' aequorines mutées en plaques 96 puits ont été criblées pour leur activité de biolurninescence activée par le
Ca2+ à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). La lumière émise durant les 4 secondes consécutives (t0-4) à l'injection de 100 μl d'une solution contenant CaCl2, 20 mM et triton X100, 1%, et durant les 4 secondes suivantes (t4-8) a été mesurée pour chaque clone individuellement. Les mutants ayant un rapport tO- 4/t4-8 inférieur à 1.5 ont été sélectionnés et réétalés sur boite LB ampicilline pour confirmation et détermination des meilleurs mutants.
Séquençage des mutants
Le séquençage des mutants (20 mutants séquences) a été réalisé sur un séquenceur automatique ABI310 (PE applied biosystems) avec les amorces up-e-Aeq et lo-e-Aeq (voir DNA shuffling).
Purification des aequorines
Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure Kpnl/EcoRl ont été sous-clonés dans pRSETC (Invitrogen, Xpress protein expression System). Les plasmides résultants ont été transformés dans la souche d'E.Coli BL21(DE3) pLysS (Invitrogen) pour expression des aequorines. Les aequorines ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur colonne de nickel- agarose (Invitrogen, Xpress protein expression System), selon les instructions du fabriquant (élution par 350 mM imidazole). Les aequorines purifiées ont été conservées à -20 °C dans une solution contenant (concentrations finales) imidazole, 175 mM ; EDTA, 10 μM ; BSA, 10 μg/ml et glycérol, 50% .
Expression en lignée cellulaire eucaryote (HEK 293)
Les cDNA de l'aequorine sauvage et des aequorines mutantes, excisés par double coupure Kpήl/Spel ou Hindlll/Spel ont été sous-clonés aux sites Kpnl/Nhel ou HindHI/Nhel dans un vecteur d'expression eucaryote, pCMX, sous dépendance du promoteur CMV. Les plasmides résultants ont été transfectés dans les cellules HEK 293. 24 h après la transfection les cellules ont été collectées et resuspendues en tampon PBS.
Après ajout de coelenterazine (10 μM final) la suspension cellulaire a été distribuée en plaque 96 puits à raison de 50 μl par puits et incubée 3h à 37°C pour reconstituer l'aequorine. La mesure de l'activité aequorine a été réalisée à l'aide d'un luminomètre à injecteur (PhL, Mediators, Austria). Les cinétiques d'émission de la biolurninescence consécutives à l'injection de 100 μl d'une solution contenant CaCl2, 1,5 mM et triton XI 00, 0,75% ont été déterminées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1-10 sec, kinetic points 60).
Tests de cinétique de bioluminescence et de sensibilité calcique des aequorines En bactéries
Pour chaque clone d' aequorine à tester, une colonie a été amplifiée dans 5 ml de LB ampicilline et après centrifugation le culot bactérien a été rincé deux fois par 5 ml 5 d'une solution contenant NaCl, 100 mM ; Tris HCl, 50 mM, pH 8 et EGTA, 1 mM.
Les bactéries ont été resuspendues dans 500 μl de la même solution contenant 10 μM de coelenterazine et incubées à 4°C durant la nuit. Après ajout de lysozyme (0,8 mg/ml final) et homogénéisation, des aliquotes de 50 μl ont été prélevés pour les test de cinétique et/ou de sensibilité calcique comme décrit ci-dessous, l o Sur protéines purifiées
Les aequorines purifiées ont été reconstituées par dilution 10 dans une solution contenant Tris HCl, 50 mM pH8 ; DTT, 10 mM, EDTA, 10 μM et coelenterazine, 2 μM et incubation lh à 4°C. Les aequorines reconstituées ont été distribuées en plaque 96 puits à raison de 55 μl par puifs et activées par 100 μl d'une solution contenant Tris 15 HCl pH 8, 50 mM ; EDTA, 10 μM et des concentrations de Ca2+ libres variables
(concentrations libres finales après injection : 10"8 à 10"1 M). Les mesures de luminescence (luminomètre PhL, Mediators) ont été réalisées en mode cinétique (Fast kinetics, Interval 0.1-10 sec, kinetic points 60). La détermination des courbes de sensibilité calcique a été basée sur les valeurs initiales de luminescence des cinétiques 0 d'émission lumineuse.
C) Applications industrielles des mutants de la photoprotéine aequorine
1) Détection in vitro de molécules organiques (acides nucléiques, protéines, 5 antigènes etc.)
Ces tests de détection sont basés sur l'immobilisation de la molécule à détecter et sur la fixation spécifique de la photoprotéine à cette molécule. L'immobilisation et la fixation spécifique sont réalisées par des moyens très divers en fonction du type de 0 molécule à détecter et du type d'échantillon à analyser. La quantité de la molécule à détecter dans l'échantillon est ensuite déterminée par activation de la photoprotéine fixée et mesure de la bioluminescence émise.
a) Détection d'acides nucléiques
La détection de séquences d'acides nucléiques peut être réalisée, soit après une étape d'amplification par PCR (ADN) ou RT-PCR (ARN) ou par toute autre technique d'amplification d'acides nucléiques, soit directement. Après immobilisation des molécules d'acides nucléiques ou de leurs produits d'amplification, les molécules sont détectées par hybridation d'une sonde. L'hybridation de la sonde est ensuite révélée grâce à une photoprotéine couplée directement à la sonde ou liée de façon subséquente à celle-ci. Les molécules d'acides nucléiques ou de leurs produits d'amplification sont quantifiées par l'intensité de la biolurninescence émise. Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1- Lewis JC, Daunert S. Photoproteins as luminescent labels in binding assays. Fresenius J Anal Chem. 2000 Mar-Apr;366(6-7):760-8
2- Coombes BK, Mahony JB. Nucleic acid séquence based amplification (NASBA) of Chlamydia pneumoniae major outer membrane protein (ompA) mRNA with bioluminescent détection. Comb Chem High Throughput Screen. 2000 Aug;3(4):315-27.
3- Laios E, Ioannou PC, Christopoulos TK. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays. Anal Chem. 2001 Feb l;73(3):689-92. 4- Actor JK. Bioluminescent quantitation and détection of gène expression during infectious disease. Comb Chem High Throughput Screen. 2000 Aug;3(4):273-88.
5- White SR, Christopoulos TK. Signal amplification System for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin.
Nucleic Acids Res. 1999 Oct l;27(19):e25. 6- Guenthner PC, Hart CE. Quantitative, compétitive PCR assay for HTV-1 using a microplate-based détection System. Biotechniques. 1998 May;24(5):810-6.
b) Détection de protéines ou d'antigènes
Après immobilisation, les protéines et antigènes sont détectés par association spécifique avec une sonde (association du type antigène-anticorps ou ligand-récepteur).
La fixation de la sonde est ensuite révélée grâce à une photoprotéine couplée directement à la sonde ou liée de façon subséquente à celle-ci. Les molécules de protéines ou d'antigènes sont quantifiées par l'intensité de la bioluminescence émise.
Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1 -Jackson RJ, Fujihashi K, Kiyono H, McGhee JR. Luminometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. J Immunol Methods. 1996 Apr 19;190(2):189-97.
2-Mattox S, Walrath K, Ceiler D, Smith DF, Cummings RD. A solid-phase assay for the activity of CMPNeuAc:Gal beta l-4GlcNAc-R alpha-2,6-sialyltransferase. Anal Biochem. 1992 Nov l;206(2):430-6.
2) Détections d'activités enzymatiques
Des substrats protéiques composés en partie d'une photoprotéine (type protéine de fusion) peuvent permettre de mesurer des activités enzymatiques in vitro ou en systèmes cellulaires. Les activités enzymatiques détectables sont, par exemple, du type « modification de protéines » (protéases, kinases, glycosylases, etc.). Ce type de mesure peut servir au criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique (par exemple en référence 1, détection de l'activité de la protéase d'HEV-1).
Pour les mesures in vitro, le substrat protéique contenant la photoprotéine, ou l'échantillon à doser, sont immobilisés. L'activité enzymatique est ensuite quantifiée par l'intensité de la bioluminescence émise. Le même type de mesure peut être réalisé en systèmes cellulaires exprimant le gène correspondant au substrat protéique contenant la photoprotéine. Les activités enzymatiques cellulaires sont alors quantifiées par activation de la photoprotéine et mesure de l'intensité de la bioluminescence émise.
Un tel procédé est décrit notamment dans Deo SK, Lewis JC, Daunert S. Bioluminescence détection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin.
Anal Biochem. 2000 May 15;281(l):87-94.
3) Détection des variations de calcium intracellulaire en systèmes cellulaires.
Les photoprotéines de type aequorine exprimées en lignées cellulaires
(procaryotiques ou eucaryotiques) permettent de détecter les variations de calcium intracellulaire induites par divers agents. Les variations de calcium intracellulaire sont détectées par les variations correspondantes de la bioluminescence émise. L'application la plus courante utilise des lignées eucaryotes du type HEK 293 co-exprimant
l'aequorine et un récepteur de neurotransmetteur (récepteur-canal ou récepteur couplé à une protéine G) pour cribler des agents pharmacologiques ou des ligands naturels agissant sur le récepteur. Inversement, ces systèmes peuvent être utilisés pour cribler des banques d'ADN à la recherche des récepteurs activés par un agent pharmacologique ou un ligand naturel. Le crible est basé sur la variation de biolurninescence induite par l'application de l'agent pharmacologique ou du ligand naturel.
Les principales références bibliographiques décrivant de tels procédés sont les suivantes :
1- Button D, Brownstein M. Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca2+ mobilization. Cell Calcium. 1993 Oct;14(9):663-71.
2- Ungrin MD, Singh LM, Stocco R, Sas DE, Abramovitz M. An automated aequorin luminescence-based functional calcium assay for G-protein-coupled receptors. Anal Biochem. 1999 Jul 15;272(l):34-42.
3- Schaeffer MT, Cully D, Chou M, Liu J, Van der Ploeg LH, Fong TM. Use of bioluminescent aequorin for the pharmacological characterization of 5HT receptors. J
Recept Signal Transduct Res. 1999 Nov;19(6):927-38.
4- George SE, Schaeffer MT, Cully D, Béer MS, McAllister G. A high- throughput glow-type aequorin assay for measuring receptor-mediated changes in intracellular calcium levels. Anal Biochem. 2000 Nov 15;286(2):231-7. 5- Parnot C, Bardin S, Miserey-Lenkei S, Guedin D, Corvol P, Clauser E.
Systematic identification of mutations that constitutively activate the angiotensin II type 1A receptor by screening a randomly mutated cDNA library with an original pharmacological bioassay. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7615-20.
6- Kotani M, Mollereau C, Detheux M, Le Poul E, Brezillon S, Vakili J, Mazarguil H, Vassart G, Zajac JM, Parmentier M. Functional characterization of a human receptor for neuropeptide FF and related peptides. Br J Pharmacol. 2001 May 1;133(1):138-144.
Claims
1. Utilisation de photoprotéines isolées de méduses pour la préparation de photoprotéines mutées ayant une thermostabilité supérieure à celle des photoprotéines dont elles dérivent, encore désignées photoprotéines mutées thermostables, et/ou par un temps de luminescence supérieur à celui des photoprotéines dont elles dérivent, encore désignées photoprotéines mutées persistantes, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées en ce que leur stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou en ce que leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines dont elles dérivent
2. Procédé de préparation de photoprotéines mutées thermostables, et/ou persistantes, lesdites photoprotéines mutées étant caractérisées en ce que leur stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou en ce que leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines de méduse dont elles dérivent, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre d'une ou plusieurs mutations desdites photoprotéines de méduse, lesdites mutations étant choisies parmi : * au moins une des trois mutations augmentant la thermostabilité desdites photoprotéines, et choisie parmi les suivantes :
- suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKX1MFX dans lequel Xι=H ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine,
- suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine,
* et/ou au moins une des six mutations augmentant le temps de luminescence desdites photoprotéines, et choisie parmi les suivantes : - suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DX1NX2X3GX4IX5LX6E dans lequel X^V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, X,=Kou Q, X5=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE dans lequel Xj=Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, l ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EX!TFX2X3 dans lequel Xι=E, K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une serine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DX1DX2X3GX4LDVDE, dans lequel Xι=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et X,=Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ ED NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine.
3. Photoprotéines mutées dérivées des photoprotéines isolées de méduses, caractérisées en ce que leur stabilité dans le temps est augmentée à 37°C d'un facteur d'au moins environ 10, et/ou en ce que leur temps de luminescence est augmenté d'un facteur d'au moins environ 10, par rapport aux photoprotéines dont elles dérivent.
4. Photoprotéines mutées selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'elles sont stables pendant au moins environ 30 minutes jusqu'à la température d'environ 50°C, et en ce qu'elles peuvent être conservées pendant au moins environ 4 jours à des températures pouvant atteindre jusqu'à 37°C, et/ou en ce que leur temps de luminescence est compris entre environ 1 min et environ 5 min.
5. Photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent
* au moins une des trois mutations augmentant leur thermostabilité, choisie parmi les suivantes :
- suppression de la lysine (K) contenue dans le motif RHKX1MFX2 dans lequel Xι=H ou F, et X2= N ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette lysine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette lysine par une arginine, - suppression de la glutamine (Q) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine,
- suppression de la leucine (L) contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine,
* et/ou au moins une des six mutations augmentant leur temps de luminescence, choisie parmi les suivantes :
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DX1NX2X3GX4EX5LX6E dans lequel Xι=V ou I, X2=H, G ou S, X3=N ou D, X,=K ou Q, X5=S, T ou N, et X6=D ou N, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE dans lequel X^Q, G ou R, Xz=N ou S, X3=A, S ou T, Xpl ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDX1X2GX3X4X5LDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéinej ou la thréonine,
- suppression de la phénylalanine (F) contenue dans le motif EX!TFX2X3 dans lequel Xι=E, K ou A, X2=R, K ou A, et X3=V ou H, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette phénylalanine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette phénylalanine par une serine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DX1DX2X3GX4LDVDE, dans lequel Xι=I ou L, X2=E, N ou G, X3=S ou D, et ^Q, K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression de la valine en position 54 de la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 de l'aequorine, ou substitution de cette valine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette valine par une alanine, ou par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine.
6. Photoprotéines mutées thermostables selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des deux mutations suivantes : - suppression de la glutamine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cette glutamine par un acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette glutamine par une arginine, - suppression de la leucine contenue dans le motif DEMTRQHLGFWY susmentionné, ou substitution de cette leucine par un- acide aminé naturel ou non, notamment substitution de cette leucine par une isoleucine.
7. Photoprotéines mutées persistantes selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une des mutations suivantes : suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DKDXιX2GX3X4X5LDE dans lequel X^Q, G ou R, X2=N ou S, X3=A, S ou T, XH ou V, et X5=T ou S, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine,
- suppression du glutamate (E) contenu dans le motif DKDXιX2GX3X4X5LDE susmentionné, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de ce glutamate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de ce glutamate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine, suppression du premier aspartate (D) contenu dans le motif DXιDX2X3GX LDVDE, dans lequel K ou D, ce motif peptidique étant conservé chez lesdites photoprotéines, ou substitution de cet aspartate par un acide aminé naturel ou non, à l'exclusion de la serine, notamment substitution de cet aspartate par un acide aminé de petite taille tel que la glycine, l'alanine, la cystéine, ou la thréonine.
8. Photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisées en ce qu'elles dérivent de l'aequorine (SEQ ED NO : 2), de la clytine (SEQ ED NO : 18), de la mitrocomine (SEQ DD NO : 34), et de l'obéline (SEQ DD NO : 50).
9. Photoprotéines mutées thermostables selon la revendication 8, choisies parmi : - les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ
ED NO : 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
- les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ ED NO : 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, - les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48,
- les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ DD NO : 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64.
10. Photoprotéines mutées persistantes selon la revendication 8, choisies parmi :
- les protéines dérivées de l'aequorine comprenant les séquences suivantes : SEQ DD NO : 66, 68, 70, 72, 74, 76,
- les protéines dérivées de la clytine comprenant les séquences suivantes : SEQ DD NO : 78, 80, 82, 84, et 86,
- les protéines de la mitrocomine comprenant les séquences suivantes : SEQ ID NO : 88, 90, 92, 94, et 96,
- les protéines dérivées de l'obéline comprenant les séquences suivantes : SEQ ED NO : 98, 100, 102, 104, et 106.
11. Photoprotéines mutées thermostables et persistantes selon la revendication 8, choisies parmi :
- les protéines dérivées de l'aequorine de séquences SEQ ED NO : 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, et correspondant aux séquences SEQ ED NO : 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, dans lesquelles E en position 45 est remplacé par G, et/ou V en position 54 est remplacé par A, et/ou D en position 127 est remplacé par G, et/ou E en position 138 est remplacé par G, et/ou F en position 159 est remplacé par S, et/ou D en position 163 est remplacé par G,
- les protéines dérivées de la clytine de séquences SEQ ED NO : 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, et correspondant aux séquences suivantes : SEQ ED NO : 20, 22, 24,
26, 28, 30, 32, dans lesquelles E en position 44 est remplacé par G, et/ou D en position 126 est remplacé par G, et/ou E en position 137 est remplacé par G, et/ou F en position 158 est remplacé par S, et/ou D en position 162 est remplacé par G,
- les protéines de la mitrocomine de séquences SEQ ED NO : 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, et correspondant aux séquences suivantes : SEQ ID NO : 36, 38, 40, 42,
44, 46, 48, dans lesquelles E en position 43 est remplacé par G, et/ou D en position 125 est remplacé par G, et/ou E en position 136 est remplacé par G, et/ou F en position 157 est remplacé par S, et/ou D en position 161 est remplacé par G, - les protéines dérivées de l'obéline de séquences SEQ DD NO : 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, et correspondant aux séquences suivantes : SEQ DD NO : 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, dans lesquelles E en position 41 est remplacé par G, et/ou D en position 123 est remplacé par G, et/ou E en position 134 est remplacé par G, et/ou F en position 155 est remplacé par S, et/ou D en position 159 est remplacé par G.
12. Photoprotéines mutées selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisées en ce qu'elles sont liées :
- à une sonde protéique ou nucléique susceptible de reconnaître des antigènes ou protéines ou acides nucléiques déterminés,
- ou à un substrat spécifique d'une activité enzymatique déterminée,
- ou à une molécule susceptible de former un complexe avec une autre molécule, tel que le complexe avidine-biotine.
13. Séquences nucléotidiques codant pour les photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 à 12.
14. Séquences nucléotidiques selon la revendication 13, codant pour les photoprotéines mutées selon les revendications 9 à 11, choisies parmi les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25,
27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, ou toute séquence nucléotidique dérivée par dégénérescence du code génétique des séquences susmentionnées et codant pour les photoprotéines mutées selon les revendications 9 à 11.
15. Vecteur, tel qu'un plasmide, contenant une séquence recombinante comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 13 ou 14.
16. Cellules hôtes, telles que cellules procaryotes, notamment E. coli, ou eucaryotes, notamment les lignées HEK 293, ou CHO, transformées par un vecteur selon la revendication 15.
17. Procédé de préparation de photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'un vecteur selon la revendication 15 capable de produire lesdites photoprotéines, ou la transformation de cellules hôtes appropriées à l'aide d'un vecteur susmentionné, la mise en culture de cellules hôtes transformées selon la revendication 16 ainsi obtenues dans un milieu approprié, et la récupération, le cas échéant après purification, des photoprotéines mutées produites par ces cellules.
18. Utilisation de photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 à 12, ou de cellules hôtes transformées selon la revendication 16 exprimant lesdites photoprotéines mutées, dans le cadre de la mise en œuvre :
- de procédés de détection in vitro de molécules, tels que des protéines ou antigènes ou des acides nucléiques dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du dépistage in vitro de bactéries telles que les Listeria dans les aliments, ou dans le cadre du dépistage d'agents pathogènes tels que le virus VIH chez l'homme,
- de procédés de détection de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique, notamment dans le cadre du criblage de molécules activant ou inhibant une activité enzymatique spécifique,
- de procédés de détection des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents, notamment dans le cadre du criblage de molécules agissant sur une séquence nucléique ou protéique fusionnée à la photoprotéine mutée, ou coexprimée avec la photoprotéine mutée dans des cellules hôtes susmentionnées.
19. Procédés de détection in vitro de protéines ou antigènes ou d'acides nucléiques dans un échantillon biologique, tels que définis dans la revendication 18, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes :
- le cas échéant, une étape d'amplification du nombre d'acides nucléiques présents dans l'échantillon biologique,
- immobilisation des protéines ou antigènes ou acides nucléiques sur un support approprié, puis addition d'une sonde spécifique desdits protéines ou antigènes ou acides nucléiques et rinçage, ladite sonde étant liée à une photoprotéine selon la revendication 12, ou ladite photoprotéine étant additionnée sur le support avec les réactifs appropriés pour sa liaison à ladite sonde,
- mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.
20. Procédés de détection in vitro de composés à activité enzymatique dans un échantillon biologique tels que définis dans la revendication 18, caractérisés en ce qu'ils comprennent principalement les étapes suivantes : - immobilisation sur un support approprié d'un substrat protéique spécifique de l'activité enzymatique à détecter, ce substrat étant lié à une photoprotéine selon la revendication 12, addition de l'échantillon biologique, puis rinçage,
- ou immobilisation sur un support approprié des composés de l'échantillon biologique, addition du substrat protéique lié à une photoprotéine selon la revendication 12, puis rinçage,
- mesure de l'intensité de la bioluminescence émise après l'étape de rinçage.
21. Procédés de détection in vitro des variations de calcium intracellulaire induites par divers agents tels que définis dans la revendication 18, caractérisés en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules transformées selon la revendication 16, avec l'échantillon contenant les molécules à détecter, et la mesure de la variation de biolurninescence.
22. Procédés selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués jusqu'à des températures d'environ 50 °C, à l'aide de photoprotéines thermostables, et, le cas échéant, persistantes, selon l'une des revendications 3 à 12.
23. Procédés selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisés en ce qu'ils peuvent être effectués en simultanés sur échantillons multiples, à l'aide de photoprotéines persistantes, et, le cas échéant, thermostables, selon l'une des revendications 3 à 12.
24. Kits pour la mise en œuvre de procédés selon l'une des revendications 19 à 23, caractérisés en ce qu'ils comprennent des photoprotéines mutées selon l'une des revendications 3 à 12, le cas échéant en association avec des réactifs nécessaires à la mise en œuvre desdits procédés.
25. Kits selon la revendication 24, caractérisés en ce qu'ils peuvent être conservés en solutions prêtes à l'emploi, notamment pendant au moins 4 jours à des températures ambiantes d'environ 20°C et pouvant atteindre jusqu'à environ 37°C, lorsqu'ils contiennent des photoprotéines thermostables, et, le cas échéant, persistantes, selon l'une des revendications 3 à 12.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0109293 | 2001-07-12 | ||
| FR0109293A FR2827292B1 (fr) | 2001-07-12 | 2001-07-12 | Photoproteines mutees et leurs applications |
| PCT/FR2002/002492 WO2003006497A2 (fr) | 2001-07-12 | 2002-07-12 | Photoprotéines mutees et leurs applications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP1404711A2 true EP1404711A2 (fr) | 2004-04-07 |
Family
ID=8865426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP02784875A Withdrawn EP1404711A2 (fr) | 2001-07-12 | 2002-07-12 | Photoproteines mutees et leurs applications |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050130262A1 (fr) |
| EP (1) | EP1404711A2 (fr) |
| AU (1) | AU2002333989A1 (fr) |
| CA (1) | CA2455542A1 (fr) |
| FR (1) | FR2827292B1 (fr) |
| WO (1) | WO2003006497A2 (fr) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10328067A1 (de) * | 2003-06-23 | 2005-01-27 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein Bolinopsin, sowie dessen Verwendung |
| DE10342670A1 (de) * | 2003-09-16 | 2005-04-21 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein mtClytin, sowie dessen Verwendung |
| EP1700865A1 (fr) * | 2005-03-11 | 2006-09-13 | AXXAM S.r.l. | Photoprotéines ayant une bioluminescence améliorée et leur utilisation comme indicateurs de calcium intracellulaire |
| DE102005022146A1 (de) * | 2005-05-13 | 2006-11-23 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein AQdecay sowie dessen Verwendung |
| JP5374840B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2013-12-25 | Ｊｎｃ株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
| DE102007011241A1 (de) | 2007-03-08 | 2008-09-11 | Bayer Healthcare Ag | Isoliertes Photoprotein mtClytinDecay, sowie dessen Verwendung |
| JP2010143860A (ja) * | 2008-12-19 | 2010-07-01 | Chisso Corp | タンパク質の安定化剤 |
| JP5549113B2 (ja) * | 2009-05-14 | 2014-07-16 | Ｊｎｃ株式会社 | カルシウム結合発光蛋白質、それをコードする遺伝子およびその用途 |
| JP2012533298A (ja) * | 2009-07-14 | 2012-12-27 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | カルシウム親和性の増加と生物発光の増強を示す改変型発光蛋白質及びその使用 |
| CN116143893B (zh) * | 2022-08-09 | 2023-11-10 | 无锡佰翱得生物科学股份有限公司 | 一种增强型单体StayGold蛋白及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5360728A (en) * | 1992-12-01 | 1994-11-01 | Woods Hole Oceanographic Institution (W.H.O.I.) | Modified apoaequorin having increased bioluminescent activity |
| JPH09278796A (ja) * | 1996-04-16 | 1997-10-28 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 熱安定性が増強したエクオリン改変体 |
| JP4501211B2 (ja) * | 2000-03-24 | 2010-07-14 | チッソ株式会社 | 発光量標準物質 |
| US7345160B2 (en) * | 2004-03-29 | 2008-03-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Aequorin and obelin mutants with differing wavelengths and bioluminescence |
-
2001
- 2001-07-12 FR FR0109293A patent/FR2827292B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-12 CA CA002455542A patent/CA2455542A1/fr not_active Abandoned
- 2002-07-12 WO PCT/FR2002/002492 patent/WO2003006497A2/fr not_active Ceased
- 2002-07-12 AU AU2002333989A patent/AU2002333989A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-12 US US10/484,380 patent/US20050130262A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-12 EP EP02784875A patent/EP1404711A2/fr not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See references of WO03006497A2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2827292B1 (fr) | 2004-06-18 |
| WO2003006497A2 (fr) | 2003-01-23 |
| WO2003006497A3 (fr) | 2004-01-22 |
| CA2455542A1 (fr) | 2003-01-23 |
| FR2827292A1 (fr) | 2003-01-17 |
| US20050130262A1 (en) | 2005-06-16 |
| AU2002333989A1 (en) | 2003-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11667950B2 (en) | Synthetic Oplophorus luciferases with enhanced light output | |
| JP6275635B2 (ja) | ｃＡＭＰのためのルシフェラーゼバイオセンサー | |
| JP2003527833A (ja) | 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法 | |
| CN110234758A (zh) | 新型荧光素酶及其使用方法 | |
| EP1404711A2 (fr) | Photoproteines mutees et leurs applications | |
| JP5188771B2 (ja) | 変異型ホタルルシフェラーゼ | |
| CN102597231A (zh) | 萤火虫荧光素酶、其基因和萤火虫荧光素酶的制造法 | |
| EP1945761B1 (fr) | Luciferases arachnocampa | |
| KR102018248B1 (ko) | 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제 | |
| US20120258486A1 (en) | Calcium-binding photoprotein, gene encoding the same, and use thereof | |
| CN101755047A (zh) | 荧光蛋白及其应用方法 | |
| JP5224100B2 (ja) | 変異型ルシフェラーゼ | |
| CN102080068A (zh) | 荧光素酶活性片段及其应用 | |
| US12613237B2 (en) | Biosensors for detecting arrestin signaling | |
| JP6535483B2 (ja) | 幼若ホルモンセンサー | |
| JP2006500013A (ja) | アセチルＣｏＡカルボキシラーゼインヒビターの同定のための組換えビオチンカルボキシラーゼドメイン | |
| JP5040438B2 (ja) | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 | |
| JP5589369B2 (ja) | 変異ガウシアルシフェラーゼ | |
| JP6424101B2 (ja) | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 | |
| WO2019193205A1 (fr) | Protéine chimérique présentant une activité recombinase photoactivable | |
| JP2018012721A (ja) | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 | |
| Cevheroğlu | More than Just a Dimer: Detection of G Protein-Coupled Receptor Oligomers Using Fluorescent Protein Reassembly of Ste2p, a Yeast Pheromone Receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 20040108 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A2 Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE SK TR |
|
| AX | Request for extension of the european patent |
Extension state: AL LT LV MK RO SI |
|
| 17Q | First examination report despatched |
Effective date: 20050729 |
|
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20071016 |