EP1392836A2

EP1392836A2 - Gefässendothel-spezifischer promotor des humanen vascular endothelial cadherin-2 (hve-cad-2) gens und seine therapeutischen verwendungen

Info

Publication number: EP1392836A2
Application number: EP01996615A
Authority: EP
Inventors: Robert Zweigerdt; Manfred Rüdiger; Thomas G. Moll
Original assignee: Cardion AG
Current assignee: Cardion AG
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2004-03-03
Also published as: WO2002040692A3; WO2002040692A2; IL155907A0; AU2002220711A1; CA2429317A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Fragment, enthaltend die regulatorische Sequenz des VE-Cad-2-Gens, komplett oder eine funktionell aktive Variante davon; ein Nukleinsäure-Konstrukt enthaltend das Nukleinsäure-Fragment und eine funktionale Nukleinsäure-Sequenz oder ein heterologes Gen; einen Vektor oder ein Vektorsystem; eine Zelle oder Zellinie; ein transgenes nicht-menschliches Tier; ein Arzneimittel; ein Diagnostikum; ein Array; ein Verfahren zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen; ein Verfahren zur Identifizierung von funktionell aktiven Varianten; ein Verfahren zur Isolierung von Endothelzellen aus Stammzellen; ein Verfahren zur Behandlung; ein Verfahren zur Verabreichung eines Arzneimittels; die Verwendung des Nukleinsäure-Fragments, des Nukleinsäure-Konstrukts, der transformierte Zelle oder Zellinie des Tests und des Arrays.

Description

Gefäßendothel-spezifischer Promotor des humanen Vascular Endothelial Cadherin-2 (hVE-Cad-2) Gens und seine therapeutischen Verwendungen

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsaure-Fragment, enthaltend die regulatorische Sequenz des VE-Cad-2-Gens, komplett oder eine funktionell aktive Variante davon; ein Nukleinsäure-Konstrukt enthaltend das Nukleinsaure-Fragment und eine funktionale Nukleinsäure-Sequenz oder ein heterologes Gen; einen Nektor oder ein Vektorsystem; eine Zelle oder Zelllinie; ein transgenes nicht-menschliches Tier; ein Arzneimittel; ein Diagnostikum; ein Array; ein Verfahren zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen; ein Verfahren zur Identifizierung von funktionell aktiven Varianten; ein Verfahren zur Isolierung von Endothelzel- len aus Stammzellen; ein Verfahren zur Behandlung; ein Verfahren zur Verabrei- chung eines Arzneimittels; die Verwendung des Nukleinsäure-Fragments, des Nukleinsäure-Konstrukts, der transformierte Zelle oder Zelllinie des Tests und des Arrays.

Das Gefäßendothel ist ein einschichtiger Verband bestehend aus einer Vielzahl von teilweise überlappenden Einzelzellen, welches alle arteriellen und venösen Blutgefäße höherer Wirbeltiere auskleidet. Die Zellen des Gefäßendothels bilden eine Barriere, die die Interaktion von Blutzellen mit der Gefäßwand verhindern. Das Gefäßendothel spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Koagulation, der Adhäsion von Leukozyten, dem Wachstum von glatten Muskelzellen der Ge- fäße und der Kontrolle der transvaskulären Diffusion von Metaboliten. Die weite Verbreitung der Gefäßendothelien im Körper bietet daher bei spezifischer Expression von Genen in Gefäßendothelzellen die Möglichkeit, ein therapeutisch wirksames Gen entweder systemisch im ganzen Körper, oder, in Abhängigkeit vom Transfersystem, lokal in bestimmten Organen oder gezielt in Teilab- schnitten des Gefäßsystems zu exprimieren.

Beispielsweise können zur Transplantation entnommene Spender-Organe außerhalb des Körpers über das Gefäßsystem perfundiert werden. Durch die Verwendung geeigneter Vektoren wie Adenoviren oder Liposomen kann das Gefäßen- dothel effizient transfiziert und zur Expression von Genen genutzt werden, die das transplantierte Organ schützen und eine Abstoßung im Empfänger verhindern.

Zahlreiche experimentelle und klinische Studien haben gezeigt, dass die Versorgung eines Tumors durch Blutgefäße und Kapillaren für sein Wachstum aus- schlaggebend ist. Erneut bietet das Endothel, welches auch die kleinsten Kapillaren stark vaskularisierter Tumore auskleidet, eine Möglichkeit, wachstumshemmende oder zelltoxische Substanzen effektiv in das Innere von Tumoren zu bringen. Ziel ist das Wachstum der entarteten Zellen zu bremsen oder das entgültige Absterben der Krebszellen zu bewirken.

Vorraussetzung für die genannten gentherapeutischen Ansätze sind Promotoren, die eine effiziente und spezifische Expression therapeutisch relevanter Gene im Gefäßendothel steuern.

Eine Reihe von DNA-Sequenzen, die eine Expression in Gefäßendothelzellen bewirken, sind publiziert. Bei einigen dieser Sequenzen ist die Genaktivierung jedoch nicht auf das Gefäßendothel begrenzt, sondern führt auch zu Expressionen in anderen Zellen und Geweben. Hierzu zählen regulatorische DNA-Elemente der folgenden Gene: von Willebrand Faktor (Guan J. et al. (1999). Blood. 94(10):3405-12.), Blutplättchen/Endothel-Zell Adhäsions-Molekül- 1 (PECAM-1; Botella LM. et al. (2000) J Immunol. 164(3):1372-1378), Preproendothelin-1 (Aversa CR. et al. (1997). Am J Physiol 273(4 Pt l):L848-855, Tie-1 (Hewett PW. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 252(3):546-551) und P- Selectin (Pan J. et al. (1998). J Biol Chem. 273(16): 10058-10067). Aufgrund der genannten Limitierung sind diese regulatorischen Sequenzen für eine gentherapeutische Nutzung weitgehend ungeeignet.

Andere Gene wie die Receptor-Tyrosin-Kinase TIE-2 (Dube A. et al. (1999). Circ Res. 84(10):1177-1185), E-Selectin (Smith GM. et al. (1993). Biochem Biophys Res Commun. 194(1):215-221) und der „Vascular Endothelial Growth Faktor Receptor „-1 (Flt-1; Wakiya K. et al. (1996) J Biol Chem. 271(48):30823-30828) und-2 (Flk-1; Kappel A. et al. (1999) Blood. 93(12):4284-4292) sind zwar spezi- fisch im Gefäßendothel exprimiert, jedoch hauptsächlich nach einer Zellaktivierung durch inflammatorische Cytokine oder nur während der Proliferation von Gefäßen.

Demgegenüber zeigen andere gut charakterisierte Promotoren eine weitgehend uniforme Gefäßendothelzell-spezifische Genexpression in transgenen Mäusen. Hierzu zählt der Promotor des Vascular Endothelial-Cadherin-1 Gens (Gory S. et al. (1999). Blood. 93(1):184-192) sowie regulatorische Elemente des ICAM-2 Gens (Cowan PJ. et al. (1998). J Biol Chem. 273(19): 11737-11744).

Die uniforme Genexpression im Gefäßendothel aller Organe des Körpers kann für manche Anwendungen sicher ein Vorteil oder sogar die Vorraussetzung sein.

Für andere Gentherapien hingegen können daraus entscheidende Nachteile entstehen, wie im Folgenden näher erläutert wird. In letzter Zeit wurden zahlreiche gentherapeutische Ansätze zur Krebsbekämpfung entwickelt. Im Prinzip unterscheidet man hierbei zwei Strategien. Eine Möglichkeit ist die systemische Gabe von ungiftigen Vorläufersubstanzen, die erst im lokalen Tumormilieu in zytotoxische Produkte umgesetzt werden (Connors TA. (1995). Gene Ther. 2: 702-709; Chrystal RG. (1999). Cancer Che- mother Pharmacol 43 (Suppl): 90-99).

Hierzu wird in den Tumor ein Gen eingeschleust, dessen Proteinprodukt das Um- setzen des systemisch verabreichten chemotherapeutischen Agenz aus der Vorläuferform in die wirksame Form umsetzt. Die Expression dieses Transgens im Gefäßendothel stark vaskularisierter Krebs geschwüre führt zu einer hohen lokalen Konzentration des wirksamen Chemotherapeutikums im Inneren des Tumors. Gleichzeitig ist die systemische Belastung des Patienten mit dem gewebetoxi- sehen Agenz gering.

Beispiele für diese Pro rz.g-Therapie ist die Transfektion von Tumoren mit dem Gen für Thymidin Kinase (TK) aus dem Herpes Simplex Virus, welches Gancic- lovir in die aktive, Zell-abtötende Form umsetzt (Culver KW. et al. (1992). Science 256: 1550-1552 ; Link CJ. et al. (1995). Hybridoma 14: 143-147; Tanaka T. et al. (1996). Cancer Res. 56: 1341-1345), sowie die Verwendung des Gens für Cytosin Desaminase (CD) aus Pilzen oder Bakterien, welches die Umwandlung der Base 5-Fluorocytosin (5-FC) zu toxischem 5-Fluorouracil (5-FU) katalysiert und zur Behandung von Colorectal-Carcinomen eingesetzt wird (Topf N. et al. (1998). Gene Ther. 5: 507-513).

Die zweite Strategie basiert auf der Expression von Genen, deren Produkte die Einleitung des programmierten Zelltodes, die sogenannte Apoptose, verursachen und damit das Abtöten von Kebszellen bewirken können. Beispiele für die „pro-Apoptose"-Therapie sind die erfolgreiche Expression des Tumor Necrosis Faktor-alpha (TNF-α) in Gefäßendothelzellen von Tumoren (Jaggar RT. et al. (1997) Hum Gene Ther. 8 (18): 2239-2247) oder die Expression TRAIL („TNF-related apoptosis-inducing ligand"), einem Mitglied der TNF-α- Superfamilie.

Für beide Cytokine konnte gezeigt werden, dass ihre Expression erfolgreich zum Abtöten zahlreicher Tumore führen kann (Griffith TS. et al. (2000). J Immunol. 165 (5): 2886-2894; Jaggar RT. et al. (1997). Hum Gene Ther. 8 (18): 2239- 2247).

Ein anderes Paradigma bei der gentherapeutischen Krebsbekämpfung ist die Verwendung des Fas Liganden (FasL; CD95 ligand). Demnach ist die Expression von FasL, einem Transmembran-Protein, das ebenfalls zur TNF-α-Familie gezählt wird, geeignet, den programmierten Zelltod in entarteten Zellen in vivo einzuleiten (Shimizu M. et al. (1996). Biochem Biophys Res Commun. 228(2):375-379; Seino K. et al. (1997). Nat Med. 1997 3(2).T 65-170).

Die Induktion der Apoptose ist das Ergebnis der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem Liganden mit seinem Rezeptor, Apol/Fas (CD95).

Neben der Induktion des Zelltods in Krebszellen, die den Rezeptor Apol/Fas tragen, konnte durch die Expression von FasL lokal in der Gefäßwand auch die Ne- ointima-Bildung nach Ballondilation erfolgreich verhindert werden (Sata M. et al. (1998). Proc Natl Acad Sei U S A. 95(3): 1213-1217).

Eine andere Eigenschaft von FasL ist die Aufrechterhaltung eines Immunprivilegierten Status in einigen Organen wie dem Gehirn, der anterioren Augen- kammer und dem Hoden. In diesem Zusammenhang konnte die Expression von FasL in Endothelzellen transplantierter Organe die Abstoßung der Transplantate verhindern (Swenson KM. et al. (1998). Transplantation. 65(2): 155-160; Tran TH. et al. (1998). Transplantation. 66(9):1126-1131).

Alle genannten Therapieansätze - unabhängig vom verwendeten Gen - erfordern den effektiven Gentransfer in Endothelzellen von Gefäßen.

Neben Liposomalen-Formulierungen und Retroviren sind Adenovirale Vektoren (AdV) derzeit die wohl effizientesten und daher am häufigsten verwendeten Vehikel zum Einschleusen von Fremdgenen in Säugetierzellen in vitro und in vivo. Dabei macht man sich das breite Wirtsspektrum, das episomale Vorliegen des Vektors und die Infizierbarkeit mitotisch inaktiver Zellen zunutze. Aufgrund ihres Tropismus sind die Vektoren in besonderem Maße für die Transduktion von Ge- fäßendothelzellen geeignet, wobei eine hohe Expression des Transgens erreicht wird (Crystal RG. (1999). Cancer Chemother Pharmacol. 43 Suppl:S90-99; O'B- rien T, Simari RD. (2000). Mayo Clin Proc. Aug;75(8):831-834).

Trotz der zahlreichen Vorteile von AdV gibt es auch Limitierungen. Studien in Mäusen, bei denen Adenovirale Vektoren unter Verwendung von Reporter-Genen systematisch verabreicht wurden haben gezeigt, dass die Leber das am weitaus stärksten transduzierte Organ bei der intravenösen Gabe von AdV darstellt (Ku- rata H, et al. (1999). J Allergy Clin Immunol. 103(5 Pt 2):S471-84; Ye X. et al. (2000). Hum Gene Ther. Mar 1;11(4):621-7).

Dementsprechend wurde bei Tierexperimenten sowohl unter Verwendung der Vorläufersubstanz-Therapie als auch beim Einsatz pro apoptotischer Gene eine systemische Toxizität beobachtet, die hauptsächlich auf eine Vergiftung der Leber zurückzuführen war (Brand K. et al. (1997). Cancer Gene Ther. 4(1):9-16; Brand K. et al. (1998). Gene Ther. 5(10):1363-1371; Okuyama T. et al. (1998). Gene Ther. 5(8):1047-1053).

Diese Beobachtung erfolgte jedoch nicht nur als Folge einer systemischen Viren Gabe durch intravenöse Injektion. Die Perfusion von Organen zur Transplantation mit VasL exprimierende AdV führte im Empfängerorganismus ebenso zur Leberschäden, wie die lokale Injektion von Vektoren direkt in Tumore, da die verwendeten Viren letztlich die Blutbahn erreichen und in der Leber angereichert werden (Morelli AE. et al. (1999) J Gen Virol. 80 ( Pt 3):571-83; Putzer BM. et al. (2000). Gene Ther. 7(15):1317-25; Aoki K. et al. (2000). Mol Ther. (6):555-565).

Zusammenfassend gibt es gentherapeutische Strategien, die geeignet sind, um Krebszellen in vivo abzutöten. Auch die Vermeidung der Transplantatabstoßung durch die Expression schützender Gene im Gefäßendothel transplantierter Organe konnte gezeigt werden. Die bisherigen Anwendungen sind jedoch dadurch limitiert, dass die verwendeten Vektoren in der Leber der behandelten Tiere angereichert und exprimiert wurden. Dadurch kommt es zu einer massiven Schädigung des Organs.

Es besteht somit ein dringender Bedarf an Promotoren, die eine effiziente Genexpression im Endothel von Blutgefäßen ermöglichen. Insbesondere ist es die Aufgabe der Erfindung Promotoren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen Gene effizient im Endothel von Blutgefäßen zu exprimieren, vorzugsweise gleichzeitig aber jegliche Aktivierung in der Leber, einschließlich des Gefäßen- dothels der Leber, ausschließen. Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäure-Fragmente für den gezielten in vivo Gentransfer bereitzustellen, welche vor allem in vivo eine möglichst spezifische Anschaltung von Genen in venösen und arteriellen Endothelzellen aller Organe und Gewebe vorzugsweise mit Ausnahme der Expression in der Leber ermöglichen.

Damit soll z. B. eine hohe Sicherheit bei der Expression von therapeutischen Genen zur Bekämpfung von Tumoren, bei der Toleranzinduktion für die Transplantation und anderen gentherapeutischen Verfahren erreicht werden, die aufgrund der zytotoxischen Natur der verwendeten Gene von größter Bedeutung ist. Die bisher zur Verfügung stehenden, Gefäßendothel-spezifischen Promotoren werden diesem Anspruch nicht gerecht.

Die Aufgabe der Erfindung wurde überraschend durch Bereitstellung eines Nuk- leinsäure-Fragments enthaltend eine sich vom Translationsstart nach 5' stromaufwärts erstreckende regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens oder eine funktionell aktive Variante davon, wobei das Nukleinsaure-Fragment Gefä- ßendothel-spezifische Expression ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ermöglicht das erfmdungsgemäße Nukleinsaure-Fragment Gefäßendothel-spezifische Expression ausgenommen Expression in der Leber.

Als Ergebnis der im Rahmen dieser Studie durchgeführten Experimente wurde eine regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens identifiziert, die in dem BAC Klon 50g21 (Zugangsnummer AC005740, W. Kimmerly et al., einge- reicht 1998 im Human Genome Center, DOE Joined Genome Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory, USA) enthalten ist. Das Nukleinsaure-Fragment nach der SEQ ID Nr. 1 erstreckt sich 5' stromaufwärts vom Translationsstart, der sich in Position 110948-110954 (atg atg) in dem BAC Klon 50g21 befindet. Dabei ist bemerkenswert, dass der genomische Datenbankeintrag AC005740 des National Center for Biotechnology Information zugänglich über die PubMedline enthält keinerlei Hinweise oder Informationen auf das humane VE-Cad-2-Gen oder auf die regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Nukleinsaure-Fragment enthaltend die Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 oder eine funktionell aktive Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ermöglicht das erfindungsgemäße Nukleinsaure-Fragment Gefäßendothel-spezifϊsche Expression, ausgenommen Expression in der Leber.

Vor Kurzem haben Ludwig et al. (Mammalian Genome 2000, 11, pp. 1030-1033) das humane VE-Cad-2-Gen und eine sich vom Translationsstart nach 5' stromaufwärts erstreckende Sequenz (Fig. 3B), die einen 1717 bp langen Teil des erfindungsgemäßen 5021 bp langen Nukleinsäure-Fragmentes nach der SEQ ID Nr. 1 darstellt und mit diesem 100 % sequenz-homolog ist, Moniert. Wenn gleich in Fig. 3B aus Ludwig et al. (2000, supra) mutmaßliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen abgebildet sind, die sich in der 500 bp langen Sequenz 5' stromaufwärts vom Transkriptionsstart (Fig. 3B) befinden und die mit Hilfe von Datenbankanalysen identifiziert wurden, liefert die Studie keine experimentellen Belege für die Funktion oder Aktivität dieser potentiell regulatorischen Sequenz, die ei- nen Fachmann in die Lage versetzen würden, eine regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens, die Gefäßendothel-spezifische Expression ermöglichen würde, zu entwerfen oder zu erhalten. Darüber hinaus zeigen die Expressionsdaten des VE-Cad-2-Gens eine solide Expression des Gens in der Leber. Der Fachmann würde daher keine Anzeichen sehen noch motiviert sein anzunehmen, dass die mutmaßlichen regulatorischen Sequenzen des VE-Cad-2-Gens nach Ludwig et al. (2000, supra) Gefäßendothel-spezifische Expression, ausgenommen Expression in der Leber, ermöglichen würden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wurde diese Aufgabe überraschenderweise durch Bereitstellung eines Nukleinsaure-Fragment gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es unter der Kontrolle einer 5 '-regulatorischen Sequenz des hu- manen VE-Cadherin-2 Gens (hVE-CAD-2) eine funktionale Nukleotidsequenz umfasst; sowie durch Bereitstellen von Vektorsystemen, welche ein solches Fragment, insbesondere als Teil einer Expressionskassette, umfassen, und trans- gene Tiere sowie Zelllinien, welche durch Einschleusen eines solchen Nuklein- säure-Fragments erhältlich sind.

Unter einem "Nukleinsaure-Fragment" versteht der Fachmann eine Nukleinsäure, insbesondere eine DNA- oder RNA-Sequenz, vorzugsweise eine einzel- oder doppelsträngige, vor allem eine doppelsträngige DNA-Sequenz.

Unter "regulatorische Sequenz" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man im allgemeinen eine stromaufwärts vom Translationsstart (+1) des humanen VE-Cad-2-Gens gelegene Nukleinsäure-Sequenz, die die Transkription einer mit dieser Sequenz in Richtung des 3 '-Ende verbundenen, stromabwärts liegenden Nukleinsäuresequenz insbesondere bezüglich des korrekten Transkriptionsstartes, der Transkriptionsrate, -kinetik und/oder der Gewebsspezifität für das vaskuläre Endothel kontrolliert oder die Kontrolle der Translation moduliert. Insbesondere hat die regulatorische Sequenz Enhancer- oder Promotoraktivität.

Unter einem "heterologen Gen" in Relation zu der regulatorischen Sequenz des VE-Cad-2-Gen versteht der Fachmann alle Gene, die nicht natürlicher weise mit dieser Sequenz in Richtung des 3 '-Ende verbundenen sind. Die Gene umfassen natürlich vorkommende Gene, mutierte Gene oder Gene die Fusionsproteine kodieren. Die Gene können Menschen, Tieren, Pflanzen, Algen oder Bakterien ent- stammen. Ein heterologes Gen kann auch zwei oder mehr Gene, die seriell angeordnet sind, umfassen; die Gene können zum Beispiel durch eine "internal ribo- some entry site" (IRES) (Vagner et al. 2001, EMBO Rep 2001 Oct; 2, (10):893-8) getrennt sein, die es ermöglicht, dass alle Gene eines solchen bi- oder multi- cistronischen Konstruktes unter Kontrolle des erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmentes transkribiert werden, wobei sich das erfindungsgemäße Nukleinsaure- Fragment bevorzugterweise 5' stromaufwärts von den Expressions-regulierten Genen befindet.

Unter einer "funktionell aktiven Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure-Sequenz verstanden, die aus der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 durch ein- oder mehrfache Nukleotidaddition, -insertion, -Substitution oder -deletion erhalten wurde und eine Sequenzhomologie von mindestens 25% zur Sequenz nach SEQ ID No. 1 hat und Gefäßendothel-spezifische Expression, vorzugsweise ausgenommen Expression in der Leber ermöglicht. Darüber hinaus versteht man unter einer funktionell aktiven Variante all jene DNA Sequenzen, die komplementär zu einer DNA Sequenz sind, die mit der Referenz Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren und eine ähnliche Aktivität wie das erfindungsgemäße Nukleinsaure-Fragment der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 haben. Eine funktionell aktive Variante kann außerdem Sequenzen enthalten, die stromaufwärts von der Position 105932 des BAC-Klons 50g21 (Zugangsnummer AC005740) lokalisiert sind, welche das erste Nukleotid des Nukleinsäure- Fragments nach der SEQ ID Nr. 1 darstellt.

Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Funktionell aktive Varianten im Sinne der Erfindung sind ferner Nukleinsäure- Fragmente, die vorzugsweise eine Sequenzhomologie von mindestens ungefähr 30%, 50%o, 65%) oder 80%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, besonders bevorzugt mindestens ungefähr 95% der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 haben. Beispiele für diese funktionell aktiven Varianten sind demzufolge Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente, die aus anderen Organismen als dem Menschen oder der Maus stammen, bevorzugterweise aus nichtmenschlichen Säugetieren wie zum Beispiel Affen, Schweine und Ratten.

Um festzustellen, ob es sich bei einem Nukleinsaure-Fragment um eine funktionell aktive Variante handelt, kann zum Beispiel die Aktivität des zu prüfenden Nukleinsäure-Fragmentes mit der Aktivität des Nukleinsäure-Fragmentes nach der SEQ ID Nr. 1 verglichen werden. Unter der Annahme, dass das zu prüfende Nukleinsaure-Fragment die Bedingungen der funktionell aktiven Variante auf der Ebene der Prozent Sequenzhomologie erfüllt, handelt es sich bei dem zu prüfenden Nukleinsaure-Fragment um eine funktionell aktive Variante, wenn die Aktivität in dem funktionalen Test ähnlich oder identisch ist mit der Aktivität, die das Nukleinsaure-Fragment nach der SEQ ID Nr. 1 zeigt.

Einen solchen funktionalen Test umfassen beispielsweise die in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Tests, in denen die Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente auf die Expression eines Reporter-Gens in verschiedenen mit Luciferase Reporter-Genkonstrukten transfizierten Zellen untersucht wird und die es ermöglichen, die Stärke der kontrollierten Expression und Zellspezifität der regulatorischen Aktivität der erfϊndungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente zu bewerten. Wird das erfindungs gemäße Nukleinsaure-Fragment durch ein zu prüfendes Nukleinsaure-Fragment ersetzt und die Expressionsstärke des Reporter-Gens unter Kontrolle des zu prüfenden Nukleinsäure-Fragmentes in verschiedenen Zellen gemessen, so ist es möglich, jene Nukleinsäure-Fragmente unter den ge- testeten Nukleinsäure-Fragmentes zu identifizieren, die eine ähnliche oder identische Aktivität wie die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente nach der SEQ ID Nr. 1 haben und somit eine funktionell aktiver Variante darstellen. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung enthält ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment einen funktionellen Teil der Sequenz nach SEQ ID Nr. 1. Besonders bevorzugt ist ein funktioneller Teil der 1-3804 bp, insbesondere bevorzugt ist ein funktioneller Teil der 2724-3804 bp der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1.

Untere einem "funktioneilen Teil" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäure-Sequenz verstanden, die aus der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 Nukleotiddeletion am 5'- oder 3 '-Ende erhalten wurde und die gleiche Funktion wie das nicht-modifizierte erfindungsgemäße Nukleinsaure-Fragment aufweist.

Unter "Sequenzhomologie" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Ähnlichkeit (% Positive) von zwei Sequenzen verstanden, die bei Polynukle- otiden beispielsweise mit Hilfe von BLASTN 2.0.14 bestimmt wird, wobei der Filter=off gesetzt ist und BLOSUM 62 ist (Altschul et al. 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402). Diese kann mit gängigen Sequenzhomologie-Programmen z. B. im Internet unter http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/ überprüft werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf erfindungsgemäße Nukleinsäure-Fragmente, die eine Sequenzhomologie von mindestens ungefähr 80%, vorzugsweise von mindestens ungefähr 90%, besonders bevorzugt von mindestens ungefähr 95 % mit der Sequenz nach SEQ ID Nr. 1 oder mit einem funktionellen Teil davon haben.

Unter "Gefäßendothel-spezifischer Expression" im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die Expression eines Gens oder eines funktionellen Teils davon oder eines Gens, das für ein Fusionsprotein kodiert auf Zellen des Gefäßendothels beschränkt ist. Das Gefäßendothel umfasst zum Beispiel Gefäßzellen, die die Gefäße (Arterien und Venen) und Kapillaren des Körpers eines Adulten oder eines Embryos auskleiden inklusive der Vorläufer dieser Zellen, als auch Endothelzellen, die das Herz-Kreislauf-System inklusive das Endokardiums, die Herzklappen und Venenklappen auskleiden. Weiterhin umfasst sind Zelllinien, die von Gefäß- endothel-Zellen stammen, wie zum Beispiel Rinder-Aorten Endothelzellen (bovi- ne aortic endothelial cells, BAEC) und humane Nabelschnurvenen Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC).

Unter "Gefäßendothel-spezifische Expression, ausgenommen Expression in der Leber" im Sinne der Erfindung versteht man, dass die Expression eines Gens oder eines funktionellen Teils davon oder eines Gens, das für einen Fusionsprotein kodiert, auf solche Zellen des Gefäßendothels oder Zelllinien wie gerade ausgeführt beschränkt ist. Ausgenommen von der Expression, d.h. das im wesentliche Fehlen von Expression oder die im wesentlichen unmöglich zu detektierende Expression, sind Zellen der Leber umfassend Endothel-Zellen der Leber. Vorzugsweise umfassend die Endothelzellen in der Leber, Gefäßendothelzellen, mesen- chymale Zellen und glatte Muskelzellen der Gefäße und Kapillaren in der Leber oder Zelllinien, die von Leberzellen stammen. Bevorzug ist weiterhin eine im we- sentlichen abwesende Expression in allen nicht-endothelzellen der Leber umfassend zum Besipiel, Hepatozyten, Kupffersche Sternzellen, und Epithelzellen.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment und ein heterologes Gen. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung kodiert das heterologe Gen für ein therapeutisch wirksames Genprodukt.

Unter einem Nukleinsäure-Konstrukt im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsaure-Fragment verstanden, das ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure- Fragment sowie funktionell damit verknüpft ein oder mehrere heterologe Gene enthält. Beispielsweise können dieses Gen ein Markergen oder ein Gen sein, daß für ein therapeutisch wirksames Genprodukt codiert. Ein Markergen könnte beispielsweise ein Fluoreszenzprotein wie zum Beispiel grünes fluoreszierendes Protein (GFP), Beta-Galaktosidase, Luciferase rotes fluoreszierendes Protein, gelbes fluoreszierendes Protein oder an ein heterologes Gen gebundenes His-, Myc-, oder Flag-Tag sein. Unter dem "heterologen Gen" wird ein wie weiter oben definiertes heterologes Gen verstanden.

Ein therapeutisch wirksames Genprodukt könnten zum Beispiel die Isoformen der Hämoxygenase, die Isoformen des MCP (Monocyte Chemoattractant Protein) z. B. MCP-1, GM-CSF, die Isoformen der Stickstoffmonoxid-Synthase (z. B. iNOS: induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase; eNOS: endotheliale Stickstoffmonoxid- Synthase; nNOS: neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase) oder der FasLigand darstellen. Besonders bevorzugt sind Hämoxygenase 1, MCP-1, iNOS.

Weitere Klassen von Genen, die von Interesse für die Verwendung als heterologe Gene in der Gentherapie sind, umfassen Tumorsuppressor-Gene wie zum Beispiel p53 (Takahashi et al, 1992, Cancer Res. 52, 2340-2343) und Retinoblastoma oder RB; Zell-Zyklus-Blocker wie z.B. GATA-6 (Suzuki et al., Genomics, 1996, 38, 283-290); Anti-Angiogenese Gene wie z.B. Endostatin und Angistatin (Folkman K., Nature Med. 1, 27-31, 1995); Antisense Gen-Sequenzen (Wang & Becker, Nature Med. 3, 887-893, 1997) und Gene kodierend für virale Untereinheiten Vakzine (Viral Subunit Vaccines, Donelly et al, Nature Med. 1, 583-587, 1995).

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Genexpression unter der Kontrolle eines 5'-hVE-CAD-2 Promotors insbesondere in vivo im Säugetier Gefä- ßendothel-spezifisch erfolgt. So wurde erstmals gezeigt, dass beispielsweise die Beta-Galaktosidase Expression unter Kontrolle der 5015 bp umfassenden VE- CAD-2 Promotorsequenz (Figur 1, -5015 bp stromaufwärts des Translationsstarts des hVE-CAD-2 Gens) des Menschen in transgenen Mäusen gewebespezifisch ist.

Überraschende Beobachtungen haben gezeigt, dass beispielsweise das Beta- Galaktosidase Reporter-Gen unter Kontrolle des 5'-hVE-CAD-2 Promotors in vielen, wenn nicht allen, Gefäßendothelzellen transgener Tiere exprimiert wurde. Eine signifikante Ausnahme dazu bildeten die Gefäße der Leber, in denen im wesentlichen keinerlei Anschaltung des Reporter-Gens, d.h. im wesentlichen keine Expression des Reporter-Gens, nachweisbar war.

Im Gegensatz zum Stand der Technik wird damit eine regulatorische Sequenz bereitgestellt, d.h. eine erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment, welche die Anschaltung therapeutischer Gene im Gefäßendothel ermöglicht, gleichzeitig aber die Expression toxischer Genprodukte in der Leber ausschließt. Hierdurch wird erstmalig beispielsweise die gentherapeutische Anwendung vieler Gene mit zytotoxischen Eigenschaften, wie sie beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren verwendet werden, erst ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsaure-Fragment, welches aus dem Promotor des menschlichen Vascular Endothelial Cadherin-2 (hVE-CAD2) Gens oder funktionellen Teilen davon besteht und beispielsweise zur Expression eines Transgens oder eines heterologen Gens in Gefäßendothelzellen verwendet wird. Vorzugsweise umfasst der hVE-Cad-2 Promotor oder die regulatorische Sequenz die unter Figur 1. angegebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz nach der SEQ ID Nr. 1 von 5015 bp, welche unmittelbar 5'-oberhalb des Translationsstarts des hVE-CAD2-Gens liegt oder ein funktionelles Äquivalent dieser Sequenz. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung rekombinanter Nukleinsäuremoleküle, die zu einer Genexpression in Gefäßendothelzellen geeignet sind und folgende funktionell verknüpfte Komponenten beinhalten:

- Promotor oder regulatorische Sequenz des hVE-CAD2 Gens wie oben beschrieben

- ein oder mehrere Gene, d.h. heterologe Gene oder aktive Teile davon

- ein Polyadenylierungssignal

Das oder die verwendeten Gene, d.h. heterologe Gene können jedes Gen umfassen, für welches eine Gefäßendothel-spezifische Expression benötigt wird.

Das Polyadenylierungssignal kann von jedem geeigneten Typ sein. Ein bevorzugte Ausführungsform umfasst in 3 '-Position zur funktionalen Sequenz vor- zugsweise ein SV40- Polyadenylierungssignal.

Die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle können weitere übliche regulative Nukleotidsequenzen umfassen, wie z.B. Leadersequenzen, IRES-Sequenzen, En- hancersequenzen, Polyadenylierungssignale und die Expressionsrate mengenmä- ßig oder in ihrem zeitlichen Verlauf steuernde Sequenzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Vektorsystemen, welche die zuvor genannten, rekombinanten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Unter Vektorsystemen im Sinne der Erfindung werden Vektoren verstanden, die einen erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment oder eine erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt enthalten. Ein besonders bevorzugter Vektor ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmiden, Shuttle-Vektoren, Phagemiden, Kosmiden, erste oder dritte Generation von adenoviralen Vektoren, Expressionsvektoren und gentherapeutisch wirksame Vektoren.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäure-Konstrukt oder der erfindungsgemäße Vek- tor kann auch andere regulatorische Sequenzen enthalten, die mit den erfmdungs- gemäßen regulatorischen Sequenzen funktionsfähig verknüpft sind. Die regulatorischen Sequenzen sind "funktionsfähig verknüpft", wenn sie in einer Weise verbunden sind, vorzugsweise kovalent verbunden sind, dass die Gene unter den Ein- fluss der Tranksriptionsregulation aller funktionsfähig verknüpften regulatori- sehen Sequenzen gestellt werden.

Die zusätzlichen regulatorischen Sequenzen umfassen zum Beispiel Tetrazyklin- induzierbare Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen, die durch Hinzufügen oder Entfernen eines Transkription-induzierenden Agens kontrolliert wer- den können. Weiterhin können Zellzyklus-abhängige regulatorische Sequenzen verwendet werden, wie z.B. der Promoter des E2F-1-Gens, welcher die Kontrolle der Expression während der S-Phase ermöglicht und es gestattet, die Expression von Transgenen spezifisch in aktiv sich teilenden Zellen wie Tumorzellen zu steuern (Parr et al. Nature Med., 1997, 3:1145-1149). Durch funktionsfähige Ver- knüpfung von verschiedenen regulatorischen Sequenzen ist es möglich, die Expression von heterologen Genen auf der Grundlage einer Kombination von Parametern zu kontrollieren, wie zum Beispiel Gewebs- oder Zellspezifϊtät (d.h. Gefäßendothel-spezifische Expression, ausgenommen Expression in der Leber), Zell- zyklus-Status-spezifische und Expression basierend auf dem Vorhandensein oder der Abwesenheit eines Transkriptions-induzierenden Agens wie z.B. Tetrazyklin, und dadurch die Expression von gentherapeutisch wirksamen Genen auf eine bestimmte Gruppe von Zellen beschränkt werden. Solche Systeme sind vielseitig und vorteilhaft, da sie an verschiedene Krankheiten und verschiedene Therapie- Erfordernisse angepasst werden können. "Expressionsvektoren" im Sinne der Erfindung umfassen mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment, mindestens ein Translations-Initiations- Signal, mindestens ein heterologes Gen, ein Translations-Terminations-Signal und oder ein Polyadenylisierungs-Signal zur Expression in Prokaryoten und oder Eukaryoten.

Geeignete Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiel für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevi- siae z.B. die Vektoren p426MET25 oder p426GALl (Mumberg et al. 1994, Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z.B. Bakulovi- rus-Vektoren, wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 beschrieben, und für die Expression in Säugerzellen zum Beispiel die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung eines erfmdungsgemä- ßen Nukleinsäure-Fragmentes oder eines erfmdungs gemäßen Vektors zur Expres- sion von mindestens einem heterologen Gen.

Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein knock-out Genkonstrukt, das ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment enthält. Knock-out Genkonstrukte sind dem Fachmann z.B. aus den US-Patenten US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt, einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungs- gemäßes knock-out Genkonstrukt enthält. Die erfindungsgemäße Zelle kann zur Expression eines heterologen Gens verwendet werden. Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Zelle ist eine Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aus embryonalen Stammzellen, embryonalen Keimzellen und aus adultem Gewe- be stammenden Stammzellen. Besonders bevorzugte Stammzellen, die aus adultem Gewebe stammen umfassen, aber sind nicht auf diese beschränkt, neuronalen Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymalen Stammzellen, hämatopoetischen Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Nerdauungstrakt und Duktus- Stammzellen. Unter "Duktus" im Sinne der Erfindung werden allen Dukten inklusive Ductus arteriosus Botalli verstanden.

Die erfindungsgemäßen Zellen können beispielsweise durch Transfektion von mindestens einer Zelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment, mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt, mit einem erfindungsge- mäßen Vektor oder mit einem erfindungsgemäßen knock-out Genkonstrukt, hergestellt werden. Um die Einführung des erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmentes in eine Zelle und damit die Expression eines heterologen Gens in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann das Nukleinsaure-Fragment in Form eines Plasmids, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eigenen sich besonders: Bakuloviren, Vakziniaviren, Adenoviren, Adeno- assoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eigenen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder Poly-Lysin konjugierte DNA.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Adenovirusvektoren, retrovirale Vektoren oder Vektoren, die auf Replikons von RNA Viren beruhen (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466- 76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther.; 2: 555-69). Eukaryotische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeutische Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation beispielsweise in Hautzellen eindringen kann. (Hengge et al., 1996, J.Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, dass man die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente mit Liposomen komplexiert. Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem sol- chen Verhältnis, dass eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100%» von den Liposomen komplexiert wird. Neben den Lipidmischungen DOTMA (l,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammoniumbromid) und DPOE (diole- oxylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulie- rungen synthetisiert und auf ihre Transfektionseffizienz bei verschiedenen Zellli- nien getestet. (Behr et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; Gao und Huang, 1991, Biochem. Biophys. Acta 1189, 195-203; Feigner et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[l-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl-ammoniumethyl-sulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; dioeta-decylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Treansport von Nukleinsäuren in die Zellen erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid- DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zeil ermöglichen, sein (Schwartz et al., 1999, Gene Therapy 6: 282; Branden et al. 1999, Nature Biotechs. 17: 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freiset- zung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al., 1997, Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544). Die erfindungsgemäßen Zellen können zu Expression eines heterologen Gens verwendet werden. Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Zelle, wobei die Zelle insbesondere eine Säugerzelle, inklusive menschliche Zellen, ist.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine erfindungsgemäße Zelle, wobei die Zelle einer Zelllinie entstammt. Bevorzugterweise ist die Zelllinie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus embryonalen Stammzellen, embryonalen Keimzellen und aus adultem Gewebe stammenden Stammzellen. Besonders bevorzugte Stammzellen, die aus adultem Gewebe stammen umfassen, aber sind nicht auf diese beschränkt, neuronale Stammmzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt und Duktusstammzellen.

Eine erfindungsgemäße Zelllinie kann hergestellt werden durch Transfektion, Transformation oder Infektion einer Zelllinie mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment oder einem erfindungsgemäßen Vektor mit Hilfe von Methoden, die weiter oben ausgeführt wurden.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Zelle, wobei es sich bei der Zelle um eine transgene nicht-menschliche Stammzelle handelt. Die Stammzelle enthält ein erfmdungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt, einen erfindungsgemäßen Vektor oder in erfindungsgemäßes knock-out Genkonstrukt. Transgene nicht-menschliche Stamzellen können durch Transfizieren der Stammzelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder mit einem erfindungsgemäßen knock-out Gen- konstrukt, hergestellt werden. Verfahren zur Transformation von Stammzellen sind dem Fachmann bekannt und umfassen z-B. Elektroporation oder Mikroinjek- tion. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer Methode zur Expression von einem oder mehreren Genen im Gefäßendothel von Tieren. Die Methode umfasst die Übertragung von ein oder mehreren Genen, d.h. heterologen Genen, in das genannte Tier, wobei jedes Nukleinsäure-Konstrukt das erfmdungs- gemäße Nukleinsaure-Fragment sowie funktionell damit verknüpft, d.h. funktionsfähig verknüpft, ein oder mehrere heterologe Gene enthält.

Das genannte Nukleinsäure-Konstrukt kann beispielsweise mittels viraler Vektoren oder Liposomaler Verabreichungssysteme übertragen werden, wie beispiels- weise bei Evans R. et al. (1994) Ann N Y Acad Sei. 716:257-264 beschrieben.

Alternativ kann das genannte Konstrukt in der Art in ein Tier übertragen werden, indem es durch Mikroinjektion in die fertilisierte Eizelle injiziert wird, aus der das genannte Tier hervorgeht. Hierbei handelt es sich um eine Standardtechnik, die von einem ausgebildeten Fachmann durchgeführt werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind somit transgene nicht-humane Tiere, vorzugsweise Säugetiere, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure- Konstrukt oder mindestens eine erfindungsgemäße Zelle, d.h. mindestens eine nicht-menschliche Stammzelle, enthält. Erfindungsgemäße transgene nichtmenschliche Tiere können z.B. durch regenerieren einer erfindungsgemäßen Zelle, d.h. einer transgenen nicht-menschlichen Stammzelle in ein transgenes nichtmenschliches Tier hergestellt werden. Das erfindungsgemäße transgene nichtmenschliche Tier kann z. B. für die Expression eines heterologen Gens im Sinne der Erfindung oder zur Analyse gentherapeutisch wirksamer Nukleinsäuren oder erfindungsgemäßer Vektoren verwendet werden. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Tieres, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Zelle, d.h. eine transgene nicht-menschliche Stammzelle zu einem transgenen nicht-menschlichen Tier regeneriert wird. Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen sind dem Fachmann aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise durch direkte Injektion von erfindungsgemäßen Expressionsvektoren in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert: DNA Mikroinjection and Transgenic Animal Production, Seite 15-68 in Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Aca- demic Press, London, UK; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stern Cells, Seite 115-146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, Seite 147-176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177-220 in Pinkert, 1994, supra).

Werden die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren in sogenannte "Targeting Vektoren" oder "knock-out" Genkonstrukte integriert (Pinkert, 1994, supra), können nach Transfektion von embryonalen Stammzellen und homologer Rekombination beispielsweise knock-out Mäuse generiert werden, die im allgemeinen als heterozygote Mäuse verringerte Expression der Nukleinsäure zeigen, während homozygote Mäuse keine Expression der Nukleinsäure mehr aufweisen. Auch die so erzeugten Tiere können zur Analyse beispielsweise zur Rasteruntersuchung (Screening) und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten interagieren, verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Test zur Identifizierung von pharmakolo- gisch aktiven Substanzen, die die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmente modulieren, wobei der Test mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor, und/oder min- destens eine erfindungemäße Zelle enthält, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen. Der erfindungsgemäße Test kann zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente modulieren, verwendet werden.

Unter dem Begriff "pharmakologisch aktive Substanz" im Sinne der Erfindung versteht man all jene Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Substanzgemische, die unter geeigneten Bedingungen mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten interagieren können, gegebenenfalls zusammen oder kombiniert mit geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoffen. Mögliche pharmakologisch aktive Substanzen sind einfache chemische (organische oder anorganische) Moleküle oder Verbindungen, weiterhin können umfasst sein Peptide, Proteine oder Komplexe davon. Beispiele für pharmakologisch aktive Substanzen sind organische Moleküle, die aus Verbindungs-Bibliotheken stammen und die auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht worden sind. Auf Grund ihrer Interaktion können die pharmakologisch aktiven Substanzen die Funktion(en) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente in vivo oder in vitro beeinflussen oder alternativ lediglich an die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente binden oder mit ihnen andere Interaktionen in kovalenter oder nicht-kovalenter Wei- se eingehen.

Im Sinne der Erfindung ist unter dem Begriff "Funktion" der erfindungsgemäßen

Nukleinsäure-Fragmente die regulatorische Aktivität der erfindungsgemäßen

Nukleinsäure-Fragmente auf die Transkription von Genen, heterologen Genen oder Nukleinsäuresequenzen, die in mRNA transkribiert werden können und funktionsfahig mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten verknüpft sind, zu verstehen. Vorzugsweise sind die Nukleinsäuresequenzen, deren Transkription durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente kontrolliert oder moduliert wird, 3' stromabwärts von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmenten lokalisiert. Die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsaure- Fragment umfasst Initiation der Transkription, Modulation der Transkription d.h. Aktivierung oder Inhibierung der Transkription der Transkriptions-kontrollierten Nukleinsäuresequenzen. Im Falle der Aktivierung der Transkription können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente eine Erhöhung der Transkriptions- rate bewirken, was zu einer schnelleren Produktion der Transkripte führt oder eine Verlängerung der Transkriptionsdauer bewirken, wodurch eine größere Zahl von Transkripten erzeugt wird im Vergleich zu Kontrollwerten. Im Falle der Inhibition der Transkription können die erfindungsgemäßen Nuleinsäurefragmente eine Reduktion der Transkriptionsrate bewirken, wodurch eine langsamere Synthese der Transkripte verursacht wird oder eine Verkürzung der Dauer der Transkription bewirken, wodurch eine reduzierte Zahl von Transkripten hergestellt wird im Vergleich zu Kontrollwerten.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Tests beeinflussen die pharmakolo- gisch aktiven Substanzen die Funktion eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmentes in einer aktivierenden oder inhibierenden Weise. Im Falle von aktivierenden pharmakologisch aktiven Substanzen sollte die durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kontrollierte oder modulierte Transkription verstärkt werden wodurch eine Erhöhung der Menge des Genexpressions-Produktes vergli- chen mit der Expression bestimmt in Abwesenheit der pharmakologisch aktiven Substanz erzielt wird. Im Falle einer inhibierenden pharmakologisch aktiven Substanz sollte die durch erfindungsgemäße Nukleinsäure-Fragmente kontrollierte oder modulierte Transkription inhibiert werden, wodurch eine Abnahme in der Menge des Genexpressionsproduktes verglichen mit der Stärke der Expression, bestimmt in Abwesenheit der pharmakologisch aktiven Substanz, bewirkt werden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Tests wird durch Modifikation des in Beispiel 2 oder 3 beschriebenen Tests bereitgestellt. Z.B. ist es möglich den hVE-2-5.0-Vektor zu verwenden. Alternativ kann für den Test während der Klo- nierung des Luciferase-Reporter-Gen-Konstruktes das klonierte PCR-Fragment hVE-PCRl, das in Beispiel 2 verwendet wird, ersetzt werden durch ein beliebiges erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment. Nach erfolgter Transfektion der verschiedenen Zellen z.B. HUVEC Zellen, BAEC-Zellen, HeLa-Zellen, NIH-3T3- Zellen, mit dem Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukt kann die zu testende phar- makologisch aktive Substanz zu einer Gruppe der transfizierten Zellen hinzugefügt werden und die Zellen z.B. für 48 Stunden kuliviert werden. Zu einer Kontrollgruppe von transfizierten Zellen wird die zu testende pharmakologisch aktive Substanz nicht zugeführt und die Zellen werden in der gleichen Weise wie die andere Gruppe von Zellen kultiviert. Daraufhin wird die Expression des Reporter- Gens in den verschiedenen Zellen gemessen und die Wirkung der zu testenden pharmakologisch aktiven Substanz auf die Transkriptionskontrolle der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente bestimmt. Pharmakologisch aktive Substanzen im Sinne der Erfindung sind jene Substanzen, die einen modulatorischen Einfluss d.h. inhibierend oder aktivierend, auf die Transkription, die durch erfin- dungsgemäße Nukleinsäure-Fragmente kontrolliert und/oder moduliert wird, haben. Dieser wird bestimmt durch die Rate und die Kinetik der Expression des Reporter-Gens. Der Test ist nicht auf die Verwendung der Vektoren und Reporter- Gene, die in den Beispielen 2 und 3 verwendet werden, beschränkt. Auch andere Expressionsvektoren und andere Reporter-Gene, die weiter oben angeführt wur- den, können verwendet werden.

Solche erfindungsgemäße Tests können durch Kombinieren von mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor und/oder mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle mit geeig- neten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen, hergestellt werden. Die identifizierten pharmakologisch aktiven Substanzen können gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen zur Herstellung eines Diagnostikums oder eines Arzneimittels zur Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen, eingesetzt werden. Die pharmakologisch aktiven Substanzen können z.B. anorganische oder organische Moleküle z.B. Nukleinsäuren oder Analoga von Nukleinsäuren, anti-sense Sequenzen von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten, Peptide, Proteine oder Antikörper sein. Beispiele für pharmakologisch aktive Substanzen sind weiterhin organische Moleküle, enthalten in Substanzbibliotheken, die auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht worden sind.

Die Erfindung bezieht sich ferner ein auf ein Trägermaterial gebundenes Array, das mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment und/oder mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle umfasst. Solche Arrays können z.B. zur Iden- tifizierung von Substanzen, die an erfmdungsgemäße Nukleinsäure-Fragmente binden, verwendet werden, die ihrerseits wieder als potentielle pharmakologisch aktive Substanzen in dem weiter oben beschriebenen Test verwendet werden können. Alternativ kann das Array auch zur Analyse in Verbindung mit Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodelatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen verwendet werden. Ein erfindungsgemäßes Array kann durch Fixierung von mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment und/oder mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle auf einem Trägermaterial hergestellt werden. Unter "Trägermaterial" im Sinne der Erfindung werden wie z.B. in WO 98/18961beschrieben z.B. poröse Materialien wie z.B. Nitrocellulose aber auch nicht-poröse Materialien wie z.B. Glas, chemisch sensitiviertes Glas verstanden

Verfahren zur Herstellung und Vorbereitung solcher Arrays mit Hilfe von "Spot- ting", Drucken oder Festphasenchemie in Verbindung mit photolabilen Schutzgruppen, sind zum Beispiel aus US 5,744,305 bekannt. Erfindungsgemäße Arrays können mit Substanzen oder Substanzbibliotheken in Kontakt gebracht und auf Interaktionen hin, z.B. auf Bindung oder Konfirmationsänderungen, untersucht werden. Weiterhin ist es möglich, dass zu testende Substanzen eine detektierbaren Marker enthalten, z.B. kann die Substanz radioaktiv marktiert, fluoreszenzmarkiert oder lumineszenz-markiert sein oder einen Marker enthalten, der indirekte Detektion erlaubt, wie z.B. Biotin.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Diagnostikum bereitgestellt, wobei das Diagnostikum mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment, mindestens ein erfmdungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder mindestens eine erfindungsgemäße Zelle, gegebenenfalls zusammen oder kombiniert mit geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffen, enthält. Ein solches Diagnostikum kann zum Beispiel für die Diagnose von Erkrankungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodelatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immuno- genen Erkrankungen verwendet werden.

Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum kann durch Kombinieren von mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment, mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor und/oder mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen hergestellt werden.

Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßes Diagnostikum ein erfindungsgemä- ßes Nukleinsaure-Fragment, wobei das Nukleinsaure-Fragment eine DNA-Sonde ist.

Geeignete Sonden sind z.B. DNA oder RNA-Fragmente mit einer Länge von ungefähr 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ungefähr 200- 500 Nukleotiden, besonders bevorzugt mit einer Länge von ungefähr 300-400 Nukleotiden, wobei die Sequenz dem Nukleinsaure-Fragment nach der SEQ ID Nr. 1 entstammen kann oder einer funktionell aktiven Variante davon.

Alternativ ist es möglich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmente Oligonukleotide zu synthetisieren, die als Primer für die Polymerase Kettenreaktion geeignet sind. Dadurch können die weiter oben beschriebenen Nukleinsäure-Fragmente oder Teile davon vervielfältigt werden oder aus genomischer DNA isoliert werden. Geeignete Primer sind z.B. DNA-Fragmente mit einer Länge von ungefähr 10-100, vorzugsweise mit einer Länge von ungefähr 15-50 Nukleotiden, besonders bevorzugt mit einer Länge von ungefähr 20-30 Nukleotiden, deren Sequenz aus dem Nukleinsaure-Fragment nach der SEQ ID Nr. 1 erhalten werden kann. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, Mutation der regulatorischen Sequenz des VE-Cad-2-Gens zu identifizieren, die Erkrankungen auslösen könnten, vor allem genetisch bedingte Krankheiten des Gefäß-Epithels. Sol- ehe Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Arzneimittel, wobei das Arzneimittel mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment, mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor, und/oder mindestens eine erfindungsgemäße Zelle, gegebenenfalls zusammen oder kombiniert mit geeigneten Zusatz- und oder Hilfsstoffen, umfasst. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Arzneimittels zur somatischen Gentherapie.

Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel kann durch Kombinieren von mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsaure-Fragment, mindestens einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor und/oder mindestens einer erfindungs gemäßen Zelle mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen hergestellt werden.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Methode zur Behandlung von Säugetieren oder Menschen, wobei dem Säugetier oder Menschen eine pharmazeu- tisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Arzneimittels verabreicht wird. Vorzugsweise wird das Arzneimittel durch eine Methode, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus systemischer Injektion, lokaler Injektion, Perfusion oder Katheter-basierter Verabreichung, verabreicht.

Das Arzneimittel kann in den Organismus eingebracht werden entweder mit Hilfe des ex vivo Ansatzes, bei dem die Zellen aus dem Patienten entfernt, genetisch modifiziert durch DNA-Transfektion und daraufhin erneut in den Patienten eingeführt werden oder mit Hilfe des in vivo Ansatzes, bei dem die gentherapeutischen wirksamen Vektoren in den Körper des Patienten eingebracht werden, als nackte DNA oder unter Verwendung von viralen oder nicht-viralen erfindungsgemäßen Vektoren oder Zellen. Ein geeignetes Arzneimittel ist z.B. eines, das ein erfindungsgemäßes Nukleinsaure-Fragment in nackter Form oder in Form von einem gentherapeutisch wirksamen Vektor wie oben ausgeführt oder in komplexierter Form mit Liposomen oder Goldpartikeln enthält. Geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe umfassen z.B. eine phy- siologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ungefähr 6.0-8.0, vorzugsweise von ungefähr 6.8-7.8, besonders bevorzugt von ungefähr 7.4 und/oder einer Osmolarität von ungefähr 200-400 milliosmol/1, vorzugsweise von ungefähr 290-310 milliosmol I . Zusätzlich können in die Zusatz- oder Hilfsstoffe geeignete Stabilisatoren wie z.B. Nuklease-Inhibitor, vorzugsweise komplexierende Agen- zien wie EDTA und/oder andere Hilfsstoffe, die dem Fachmann bekannt sind, enthalten sein. Das beschriebenen Nukleinsaure-Fragment kann gegebenenfalls in Form eines viralen Vektors wie oben beschrieben oder als Liposomenkomplex oder Goldpartikelkomplex mit Hilfe von Perfusion, systemischer Injektion oder lokaler Injektion oder Katheter-basierter Verabreichung, verabreicht werden.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann ferner in Oral-Dosierungsformen wie z.B. Tabletten oder Kapseln über die Mucous-Membran z.B. die Nase oder die Mundhöhle in Form von Sprays in die Lunge oder in Form von Dispositorien unter die Haut implantiert, verabreicht werden. Trans-dermal-therapeutische Syste- me (TTS) sind z.B. aus EP 0 944 398-A1, EP 0 916 336-A1, EP 0 889 723-A1 oder EP 0 852 493-A1 bekannt.

Eine Behandlung basierend auf der Verwendung von erfindungsgemäßen Zellen, die mindestens ein heterologes Gen wie oben beschrieben exprimieren, kann da- durch erreicht werden, dass erfindungsgemäße Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Epithelzellen, Gefäßzellen, Leberzellen, embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, aus adultem Gewebe stammende Stammzellen. Bevorzugte, aus adultem Gewebe stammende Stammzellen umfassen, aber sind nicht auf diese beschränkt, neuronale Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochen- mark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt und Duktus Stammzellen verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Arzneimittel für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen, verwendet werden.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung von erfmdungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten enthaltend die Schritte:

(1) Kombinieren von mindestens einem Nukleinsaure-Fragment enthal- tend eine sich vom Translationsstart nach 5' stromaufwärts erstreckende regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens oder eine Variante davon mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Expressionsvektors;

(2) Einfügen des Reporter-Gen-Expressionsvektors in mindestens zwei verschiedene Zellen;

(3) Messen der Stärke der Expression des Reporter-Gens;

(4) Vergleichen der Stärke der Expression des Reporter-Gens in den verschiedenen verwendeten Zellen; und

(5) Identifizieren der Nukleinsäure-Fragmente, die eine Gefäßendothel- spezifische Expression, vorzugsweise ausgenommen Expression in der Leber ermöglichen. Für den Zweck der Erfindung wird unter einer "Variante" eine Nukleinsäuresequenz verstanden, welche aus der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 durch Addition, Insertion, Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden erhalten wird.

Methoden zur Kombinierung von Nukleinsäure-Fragmenten mit einem Reporter- Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Expressionsvektors sind z.B. in Beispiel 2 beschrieben und sind im allgemeinen dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das in dem Verfahren zur Identifizierung von erfindungs gemäßen Nukleinsäure-Fragmenten verwendete Reporter-Gen ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Beta-Gallactosidase, Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), rotes fluoreszierendes Protein, gelbes fluoreszierendes Protein, und an ein heterologes Gen gebundenes His-, Myc-, oder Flag-Tag. Unter einem "heterologen Gen" wird ein wie weiter oben definiertes heterologes Gen verstanden.

Das Einfuhren eines Reporter-Gen-Expressionsvektors in Zellen oder Zelllinien ist nicht beschränkt auf Transfektion, sondern kann ferner durch Transformation, Injektion, durch "Gene-Gun" Beschuss oder durch andere Methoden zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, erreicht werden. Für den Zweck des Verfahrens zur Identifizierung von Nukleinsäure-Fragmenten können die weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen und Zelllinien verwendet werden. Für den Fall, dass es sich bei dem Re- porter-Gen um Luciferase handelt, kann die Messung der Expressionsstärke des Reporter-Gens z.B. durch Verwendung des Luciferase-Assay-Systems oder des BCA-Protein-Assay-Systems wie in Beispiel 3 beschrieben, erzielt werden. Für andere Reporter-Gene können andere Assays zur Quantifizierung der Reporter- Gen-Expressionsprodukte erforderlich sein, die dem Fachmann im allgemeinen bekannt sind. In diesen Experimenten kann durch Verwendung von verschiedenen Zellen oder Zelllinien enthaltend das Reporter-Genkonstrukt die Zellspezifität der Transkriptionskontrolleigenschaften der zu testenden Nukleinsäure-Fragmente mit den Transkriptionskontrolleigenschaften der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Fragmente, vorzugsweise Nukleinsäure-Fragmente der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1, verglichen werden und zur Identifizierung von Nukleinsäure-Fragmenten führen, die ähnliche oder verschiedene Transkriptionskontrolleigenschaften wie die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente zeigen und die Gefäßendothel- spezifische Expression, vorzugsweise ausgenommen Expression in der Leber er- möglichen. Die identifizierten Nukleinsäure-Fragmente könnten im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmenten, vorzugsweise nach der Sequenz der SEQ ID Nr. 1, zum Beispiel eine noch anhaltendere und/oder noch stärkere Expression des Reporter-Gens induzieren. Solche identifizierten Nukleinsäure-Fragmente könnten noch besser geeignet sein für die Verwendung zur Gentherapie, da die gentherapeutisch wirksamen Genprodukte somit über eine längere Zeit in größeren Mengen hergestellt werden könnten.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines gentherapeutisch wirksamen Vektors, Arzneimittels oder Diagnostikums, wobei ein mit Hilfe des eben beschriebenen Verfahrens identifiziertes Nukleinsaure- Fragment in einen Vektor enthaltend mindestens ein heterologes Gen eingebracht wird und Gefäßendothel-spezifische Expression, bevorzugterweise ausgenommen Expression in der Leber ermöglicht. Methoden zur Herstellung von gentherapeutisch wirksamen Vektoren, Arzneimittel oder Diagnostika wurden weiter oben beschrieben.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung eines nach dem gerade beschriebenen Verfahren hergestellten gentherapeutisch wirksamen Vektors, Arzneimittels, oder Diagnostikums zur Diagnose, Prävention und/oder Therapie von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, ge- netisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodelatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Selektion und/oder Immor- talisierung von Gefäßendothelzellen aus Stammzellen, in die mittels Standardmethoden ein erfindungsgemäßes Konstrukt übertragen wurde oder die mittels gut charakterisierter Methoden von einem Fachmann aus transgenen Tieren oder de- ren Embryonen isoliert werden können, die ein erfindungs gemäßes Konstrukt enthalten.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Selektion von Endothelzellen aus Stammzellen enthaltend folgende Schritte: (1) Kombinieren mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-

Fragments mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter- Gen-Expressionsvektors;

(2) Einführen des Reporter-Gen-Expressionsvektors in mindestens eine

Stammzelle;

(3) Kultivieren der Stammzelle(n);

(4) Initiieren der Differenzierung der kultivierten Stammzelle(n); und

(5) Isolieren der Endothelzelle(n) aus der (den) kultivierten Zelle(n).

Die in dem Verfahren zur Selektion verwendete(n) Stammzelle(n) umfasst (en) embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, und aus adultem Gewebe stammende Stammzellen. Bevorzugterweise umfassen die aus adultem Gewebe stammenden Stammzellen aber sind nicht auf diese beschränkt, neuronale Stamm- zellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt und Duktus Stammzellen.

Die Differenzierung der kultivierten Stammzellen, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Selektion verwendet werden, kann z.B. durch "Embroid Body Formation", vorzugsweise durch Kultivieren der Stammzellen in Lösungen, durch Kultivieren der Stammzellen in hoher Dichte, durch Hinzufügen von Cyto- kinen, Wachstumsfaktoren, Retinsäure oder DMSO zu den kultivierten Zellen oder durch Hinzufügen anderer Substanzen von denen bekannt ist, dass sie Differenzierung iniziieren, eingeleitet werden. Verfahren zur Selektion von Zellen aus differenzierten embryonalen Stammzellen sind beschrieben in Klug et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul 1; 98 (l):216-24) und Sorie et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157-62).

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Selektion, wobei das Reporter-Gen ein Antibiotikum Resistenzgen ist und die Endothelzelle(n) isoliert wird (werden), in dem die differenzierte(n) Endothelzel- le(n) nach hinzufügen eines geeigneten Antibiotikums in Schritt (3) oder (4) ge- sammelt wird (werden).

Unter einem erfindungsgemäßen Antibiotikum wird ein Antibiotikum verstanden, gegen das das in dem Reporter-Gen-Expressionsvektor verwendete Antibiotikum- Resistenzgen Resistenz erzeugt. Nach Hinzufügen des Antibiotikums zu den kul- tivierten Stammzellen überleben und differenzieren im wesentlichen nur solche Stammzellen, die den Reporter-Gen-Expressionsvektor enthalten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Selektion bereitgestellt, wobei das Antibiotikum-Resistenzgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hygromycin-Resistenzgen (hph), Zeocin- Resistenzgen (Sh ble), Puromycin-Resistenzgen (pacA) und Gentamycin oder G418 -Resistenzgen (aph).

In einer weiteren besonders bevorzugen Ausführungsform der Erfindung bezieht sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion auf ein Selektionsverfahren, wobei das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein, rotes fluoreszierendes Protein, und gelbes fluoreszierendes Protein, und die Endothelzelle(n) wird (werden) von der (den) kultivierten Zelle(n) mittels Fluoreszenz-aktivierter Zeil-Sortierung (FACS) isoliert.

Ferner wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Selektion bereitgestellt, wobei das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Beta- Galaktosidase, Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein, rotes fluoreszierendes Protein, gelbes fluoreszierendes Protein, oder an ein heterologes Gen gebundenes His-, Myc-, oder Flag-Tag, und die Endothelzelle(n) von den kultivierten Zellen mittels Affinitätsreinigung isoliert wird (werden). Unter einem "heterologen Gen" wird ein wie weiter oben definiertes heterologes Gen verstanden.

Die selektierten und/oder immortalisierten Gefäßendothelzellen können zur zell- vermittelten Transplantation, zum Generieren von künstlichen Gefäßen in vitro zur Herstellung von künstlichen Herz- oder Venenklappen und für den somati- schen Gentransfer in vivo eingesetzt werden.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs enthaltend mindestens eine Endothelzelle, wobei mindestens eine durch das weiter oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion erhaltene Endothelzelle mit mindestens einer geeigneten Zelle und/oder einem Träger kombiniert und kultiviert wird, um das künstliche Gewebe oder Organ zu erzeugen. Vorzugsweise ist das künstliche Gewebe aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßen, Herklappen und Venenklappen. Unter einer "geeigneten Zelle" im Sinne der Erfindung wird eine Nährzelle (Feeder cell) oder eine andere Zelle als die nach dem Selektionsverfahren erhaltene Endothelzelle verstanden, die für die Bildung des künstlichen Organs oder Gewe- bes erforderlich ist oder die Teil des künstlichen Gewebes oder Organs ist. Solche geeigneten Zellen sind dem Fachmann bekannt.

Unter einem "Träger" im Sinne der Erfindung versteht man eine Substanz, Molekül oder Material oder Matrix, die (das) als chemische, physiologische oder me- chanische Unterstützung für das herzustellende Gewebe oder Organ dient. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Testen der pharma- kologischen Aktivität einer pharmakologischen Substanz, wobei mindestens eine durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion erhaltene Endothelzelle der pharmakologischen Substanz ausgesetzt wird und die pharmakologische Aktivität der pharmakologischen Substanz bestimmt wird. Unter einer "pharmakologischen Substanz" im Sinne der Erfindung versteht jegliche Substanzen, Verbindungen, Mixturen oder Zusammensetzungen. Mögliche pharmakologische Substanzen sind einfache chemische (organische oder anorganische) Moleküle oder Verbindungen, aber sie können auch Peptide, Proteine oder Komplexe davon beinhalten. Beispiele von pharmakologischen Substanzen sind toxische Substanzen, Verbindungen, Mixturen oder Zusammensetzungen; oder organische Moleküle, die aus Verbindungs-Bibliotheken entstammen und die auf ihre pharmakologische Akti- vität hin untersucht worden sind.

Unter "pharmakologischer Aktivität" im Sinne der Erfindung wird jede Antwort einer pharmakologischen Substanz ausgesetzten getesteten Zelle verstanden, auf der Ebene der Morphologie, des Stoffwechsels, der Physiologie oder der genetischen Aktivität.

Die pharmakologische Aktivität der getesteten Zelle kann zum Beispiel auf der Ebene der Vitalität oder Apoptose untersucht werden, d.h. die ausgewählten Endothelzelle wird der toxischen Substanz, Verbindung, Mixtur oder Zusammensetzung ausgesetzt und die Vitalität der Zelle wird bestimmt. Dies ermöglicht z.B. Endothelzellen zu identifizieren, die gegenüber einer getesteten toxischen Substanz resistent sind oder es ermöglichen, toxische Substanzen, Verbindungen, Mixturen oder Zusammensetzungen zu identifizieren, die nützlich für die Induktion von Apoptose sind. Vitalitäts- und Apoptose-Tests sind dem Fachmann allgemein bekannt.

Erfindungsgemäße Verfahren zum Testen der pharmakologischen Aktivität kön- nen ferner für "High-Throughput" Rasteruntersuchungen (Screening) von pharmakologischen Substanzen verwendet werden, die in einem ausgewählten Zelltyp interessante diagnostische oder therapeutische Eigenschaften zeigen. In gleicher Weise kann die Empfänglichkeit oder Empfindlichkeit von einer pharmakologischen Substanz ausgesetzten selektierten Endothelzelle gegenüber der pharmako- logischen Substanz ermittelt werden, wodurch pharmakologische Substanzen mit interessanten Empfänglichkeits- oder Empfindlichkeitseigenschaften identifiziert werden können.

Weiterhin können diese Zellen zur Etablierung eines in vitro Gefäßendothelzell- Modells genutzt werden. Ein solches in vitro Modell ist erfindungsgemäß zur Untersuchung potentiell therapeutisch wirksamer Substanzen insbesondere für pharmakologische Untersuchungen geeignet. In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher beschrieben. Dabei wird auf die beiliegenden Beispiele und Figuren Bezug genommen. Hierbei muss berücksichtigt werden, dass es sich bei der folgenden Beschreibungen nur um eine Veranschaulichung handelt. Die generelle Gültigkeit der Erfin- düng wie oben beschrieben wird durch die Beispiele nicht eingeschränkt.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz eines 5015 Basenpaare-langen 5'- stromaufwärts vom Translationsstartpunkt (ATGATG; Position 5016-

5021) gelegenen Promotors des humanen VE-CAD2 Gens Der Transkriptionsstart befindet sich an der Position 3805 (+1). Die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease EcoRV befindet sich an Position 513-518, für Sacl an Position 2725-2730, für Hindlll an der Po- sition 3704-3709 und für Smal an der Position 4385-4390.

Fig. 2 zeigt den Aufbau von Luciferase-Reporter-Genkonstrukten für die Untersuchung der Promotoraktivität in Zellkultur. Das oberste Schema (A) zeigt die genomische Struktur des humanen VE-CAD2 Promotors. Das erste Exon wurde ab dem Translationsstart durch eine Box gekennzeichnet. Der Pfeil innerhalb der Box gibt die Leserichtung des VE-CAD2 Gens an. Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen, die für die Klo- nierung verwendet wurden, wurden gekennzeichnet (EcoRV, Sacl, Hindill, Smal).

Zum Klonieren der Konstrukte wurde ein PCR-Fragment verwendet, das 5015 bp des humanen VE-CAD2 Promotors enthielt und als hVE-PCRl (B) bezeichnet wird (vgl. Beispiel 1). hVE-PCRl enthält am 5 '-Ende ei- ne Schnittstelle für das Restriktionsenzym Kpnl und am 3 '-Ende eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Seal.

Die weiteren Schemata dieser Figur (C-G) zeigen den Aufbau von Re- porter-Genkonstrukten, die durch das Klonieren von Promotorfragmenten in das Plasmid pGL3-basic (Promega) erhalten wurden. pGL3-basic enthält die kodierende Sequenz des Markers Luciferase. Das Luciferase (Luc) Gen wurde als Box (Luc) gekennzeichnet. Die bakteriellen Anteile der zirkulären Plasmide wurden nicht dargestellt. Die Länge der klonier- ten Promotorfragmente wurde in Basenpaaren (bp) angegeben und beträgt 5015 bp für hVE-5,0 (C), 4500 bp für hVE2-4,5 (D), 2289 bp für hVE2-2,3 (E), 1310 bp für hVE2-l,3 (F) und 627 bp für hVE2-0,6 (G). Restriktionsschnittstellen, die für die Klonierung der Konstrukte verwendet und dabei zerstört wurden, sind in Klammern dargestellt. (bp = Basenpaare; kb = Kilobasen)

Fig. 3 zeigt die Luciferase-Aktivität in verschiedenen Zellen nach Transfektion mit den verschiedenen Reporter-Genkonstrukten aus Fig. 2 in Zellkultur. Angegeben wurden die Mittelwerte und die Standardabweichung (SEM) für die gemessenen Lichteinheiten relativ zu dem Promotorlosen Plasmid pGL3-basic, das als Kontrollplasmid verwendet wurde. Folgende Zellen wurden transfiziert: primäre Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC), primäre Endothelzellen aus der Aorta des Rinds (bovine aortic endothelial cells, BAEC), humane Tumor Zelllinie (HeLa), Fibroblasten Zelllinie aus Nagern (NIH-3T3). Jede Transfektion wurde 6 mal wiederholt.

Fig. 4 zeigt den schematischen Aufbau von Konstrukten zum Generieren trans- gener Mäuse. Unter (A) ist der genomische Aufbau des hVE-CAD2 Promotors gezeigt, der bereits unter Figur 1 (A) beschrieben ist. Das Konstrukt pRZ-hVE-Zl (B) enthält 5015 bp des VE-CAD2 Promotors gekoppelt an das Reporter-Gen Beta-Galaktosidase (LacZ-Gen; als weißer Kasten dargestellt). Die Grafik zeigt den Anteil des Konstrukts, der durch Schneiden mit den Enzymen Sall und Notl erhalten und für die

Injektion in befruchtete Eizellen der Maus isoliert wurde. Zum Identifizieren transgener Founder-Tiere wurde eine Southern-Blot Analyse mit der Probe Z2 durchgeführt. Es handelte sich um ein 1938 bp EcoRI- EcoRV Fragment aus dem LacZ-Gen. Eingezeichnete Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI, EcoRV, Sacl, Hindlll, Smal, Sall und

Notl wurden für die Klonierung der Konstrukte und für die Analyse transgener Tiere verwendet.

Fig. 5 zeigt die X-Gal Färbung in transgenen pRZ-hVE-Zl Mäusen der beiden etablierten transgenen Stämme (die Stämme wurden pRZ-hVE-Zl-#10 und pRZ-hVE-Zl-#54 genannt). Die Muster und Intensität der Färbung waren über alle untersuchten Entwicklungsstadien in beiden Stämmen gleich. Unter (A) ist ein Embryo am Tag 10,5 der Entwicklung gezeigt, während der Embryo unter (B) 12,5 Tage alt war (Embryos des transge- nen Stammes pRZ-hVE-Zl-#10 werden gezeigt). In diesem Embryos wird das lacZ Reporter-Gen in sich entwickelnde Gefäßstrukturen, wie z.B. Kapillaren in der Kopfregion, zwischen den Somiten liegende Gefäße, den Kopfanlagen und den sich entwickelnden Anlagen der Glieder (Limb buds) (Embryonaltag 12.5; Fig. 5B). In Schnitten dieser Embryos wurde bestätigt, dass das Beta-Galaktosidase Protein auf das Gefäßendothel beschränkt war (Daten der Schnitte nicht gezeigt). Der Embryo unter (C) wurde am Embryonaltag 15,5 gefärbt. Hierzu wurde zunächst die Haut entfernt und der Embryo anschließend der Länge nach geteilt, um ein Eindringen des Farbstoffs zu ermöglichen. In diesem Stadium war das Reporter-Gen intensiv in allen Blutgefäßen der sich entwickelnden Skelettmuskulatur des ganzen Embryos exprimiert. Wegen der intensiven Färbung erscheinen alle Blutgefäße schwarz oder dunkelgrau in dem schwarz-weiß Bild in Figur 5 (C). Organe dieses Stadiums wurden ferner mittels Beta-Galaktosidase-Färbung analysiert (Daten nicht gezeigt). Die Färbung war beschränkt auf das Gefäßendothel der Niere, im Herzen auf

Gefäße aller Größe und in der Lunge. Im Gegensatz dazu konnte keine Färbung in Blutgefäßen der Leber inklusive der Zentralvene beobachtete werden. Aus Embryonen am Entwicklungstag 18,5 wurden einzelne Organe auf die Expression von -5eta-Galaktosidase hin untersucht. In allen untersuchten Organen inklusive der Skelettmuskulatur, Lunge, Milz,

Niere, Herz und Bauchspeicheldrüse wurde Reporter-Gen-Expression beschränkt auf das monozelluläre Gefäßendothel der Blutgefäße und Kapillaren detektiert. Beispielhaft ist unter (D) die Ventral-Ansicht und unter (E) die Dorsal-Ansicht eines Herzens gezeigt. (F) zeigt eine vergrö- ßerte Teilansicht der Abbildung (E), wobei die X-Gal Färbung in allen

Venen und Arterien, die in das Herz münden, verdeutlicht wurde. In den Original-Farbabbildungen erscheinen ausschließlich die Gefäßzellen, die die sich entwickelnden Arterien und Venen auskleiden, schimmernd blau (positive X-Gal-Färbung). In (G)-(I) sind Querschnitte des unter (D)-(F) gezeigten Herzens dargestellt. (G) zeigt die Färbung im Gefäßendothel der Aorta, während unter (H) Beta-Galaktosidase positive Gefäßendothelzellen in einem Herzkranzgefäß dargestellt wurden. (I) zeigt einen Querschnitt, in dem ein Herzkranzgefäß der Länge nach getroffen ist. Es ist in diesen Bildern offenkundig (G, H), dass die X-Gal positiven Zellen (die in den schwarz-weiß Bildern schwarz oder dunkelgrau erscheinen) gänzlich auf die Gefäßendothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden beschränkt sind wie dies auch durch eine Analyse der Farbbilder bestätigt wird (Daten nicht gezeigt). Fig. 6 Northern Blot Analyse der VE-Cad-2 Expression in adultem Maus und humanem Gewebe. (A) mRNA des murinen VE-Cad-2 befindet sich an der Position von ungefähr 7 kb. Hochvaskularisierte Organe, wie die Lunge, Herz, Milz, Leber und Niere, zeigen eine ausgeprägte Expression von VE-Cad-2. (B) mRNA des humanen VE-Cad-2 befindet sich ungefähr an Postion 4.4 kb. Mit Ausnahme des Gehirns ist die Expression des humanen VE-Cad-2 in allen untersuchten Organen detektierbar mit ausgeprägt hohen Expressionsstärken im Herz, der Plazenta, Lunge und Leber.

Fig. 7 RT-PCR Analyse der VE-Cad-2 und Beta-Galaktosidase-Expression in Gewebe von adulten transgenen pRZ-hVE-Zl#10 (linke Spalte), pRZ- hVE-Zl (mittlere Spalte) und Wild-Typ CD 1 -Mäusen (rechte Spalte). Die PCR-Produkte der mittleren und rechten Spalte (geteilt durch eine unterbrochene Linie) sind auf dem selben Gel lokalisiert und es gibt daher nur eine Molekulargewicht-Markerspur (M) für diese beiden Spalten, während die PCR-Produkte der linken Spalte auf einem getrennten Gel laufen gelassen wurden. Ubiquitär exprimierte Gene - "housekeeping" Gen GAPDH und das ribosomale Gen L7- wurden in vergleichbaren Stärken in der cDNA aus allen untersuchten Geweben in beiden, transgenen und Wild-Typ Mäusen, delektiert. VE-Cad-2-Expression konnte ferner in sich geringfügig unterscheidenden Stärken in allen Mäusen und allen untersuchten Geweben inklusive Lunge, Leber, Herz, Milz und Niere detektiert werden. Beta-Galaktosidase-Expression wurde nur in trans- genen Tieren des etablierten Stammes pRZ-hVE-Zl#10 und pRZ-hVE-

Zl#54 beobachtet, nicht aber in den Wild-Typ Mäusen CD1. In den transgenen Tieren wurde ein Beta-Galaktosidase-spezifisches PCR- Produkt von 400 bp in der cDNA, die aus Lunge, Herz, Milz und Niere stammt, detektiert werden, überraschenderweise war das PCR-Produkt vollständig abwesend in der Leber. Beispiele

Beispiel 1 : Klonierung des humanen VE-CAD2 Promotors

Die publizierte cDNA für das VE-CAD2 Gen der Maus (P. Telo et al., JBC 1998; accession number Y08715) wurde für eine Genbank-Recherche (NCBI, basic BLAST) verwendet. Dabei wurden Sequenzabschnitte auf einem humanen BAC (Bakterielles Artifizielles Chromosom) gefunden, die eine Sequenzhomologie von 81-96% zur cDNA der Maus aufweisen. Das BAC ist wie folgt beschrieben: Homo sapiens chromosome 5p, BAC clone 50g21 (LBNL H154), complete sequence. Die Bezugsnummer ist AC005740. Die publizierte Sequenz umfasst 186780 Basenbaare. Das BAC wurde als E. coli Stichkultur vom Human Genome Center, DOE Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA erhalten. Der Bakterienklon wurde kultiviert und die BAC-DNA mit Hilfe eines DNA-Reinigungskits (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Aufgrund der Homologie zur cDNA des murinen VE-CAD2 Gens konnte der Translationsstart des humanen Gens identifiziert werden, der sich an Position 110948 der publizierten BAC Sequenz befindet. Der Promotor wurde mit Hilfe der PCR- Technik (Polymerase Chain Reaction) isoliert. Die Primer wurden anhand der BAC-Sequenz definiert. Der 5 "-Primer hVE2-chrF2 (Forward Primer) liegt zwischen Position 105933 und 105956 der BAC-Sequenz. Am 5 '-Ende enthält der Primer eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Kpnl und 6 zufällige Basen (n). Dadurch wird das Schneiden des erhaltenen PCR-Produkts ermöglicht. Die Primersequenz lautet: 5'- nnn nnn ggt acc cag aag tag tgc cct tcc tct cga - 3' (SEQ ID Nr. 2). Die Orientierung des S'-Primers hVE2-UP-ATG (Reverse Primer) ist entgegen der Leserichtung des VE-CAD2-Gens definiert. Der Primer liegt zwischen Position 110947 und 110924 der BAC-Sequenz und ist so gelegt, dass der Translationsstart des humanen VE-CAD2 Gens (Adenosin an Position 110948) .nicht enthalten ist. hVE2-UP-ATG enthält am 5 '-Ende eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Seal sowie 6 zufällig gewählte Nukleotide und hat folgende Sequenz: 5^Λ- nnn nnn agt act get tac ege aac gtg ggc tag att - 3' (SEQ ID Nr. 3). Zum Amplifizieren des Promotors werden in einem 50μl PCR-Ansatz 50ng auf gereinigter BAC-DNA verwendet. Das erhaltene Fragment, das als hVE- PCR1 bezeichnet wird, enthält 5015 bp des hVE-CAD2 Promotors und wird zum Klonieren von Reporter-Genkonstrukten mit Kpnl und Seal geschnitten (vgl. Bsp. 2 und Bsp 4). Das Fragment wurde durch Sequenzierung überprüft.

Beispiel 2: Klonieren von Luciferase-Reporter-Genkonstrukten

Zum Klonieren der Konstrukte wird das PCR-Fragment hVE-PCRl verwendet (vgl. Beispiel 1). hVE-PCRl enthält am 5 '-Ende eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Kpnl und am 3 '-Ende eine Schnittstelle für das Restriktionsen- zym Seal. Das Konstrukt hVE2-5,0 kb (vgl. Fig. 1 C) wird hergestellt, indem hVE-PCRlmit Kpnl und Seal geschnitten und in die Kpnl und Smal Schnittstellen des Plasmids pGL3-Basic kloniert wird (Seal und Smal Schnittstellen sind kompatibel). Alle weiteren Konstrukte sind Verkürzungen des Konstrukts hVE-2 5,0 kb am 5 '-Ende des Promotors. Das 3 '-Ende des Promotors am Übergang zum Luciferase Gen ist bei allen Konstrukten identisch. Um hVE2-4,5 kb (vgl. Fig. 1 D) zu erhalten, wird hVE-PCRl mit EcoRV und Seal geschnitten und das 4,5 kb Fragment wird in die Smal Schnittstelle von pGL3-basic kloniert. Alle Schnittstellen sind kompatibel. hVE2-2,3 kb (vgl. Fig. 1 E) wird durch Schneiden von hVE-PCRl mit Sacl und Seal erhalten. Das 2,3 kb Fragment wird in das Sacl und Smal geschnittene Plamid pGL3-Basic kloniert. Zum Klonieren von hVE2-l,3 kb (vgl. Fig. 1 F) wird hVE-PCRl mit Hindill und Seal geschnitten und in den Kpnl und Smal geschnittenen Vektor pGL3-basic kloniert. Die Enden werden zuvor durch Behandlung mit T4-DNA Polymerase geglättet. Das Konstrukt hVE2-0,6 (vgl. Fig. 1 G) entsteht auf die gleiche Weise, wobei hVE-PCRl mit Smal und Scal geschnitten und das erhaltene 0,6 kb Fragment in den Smal geschnittenen pGL3 -Basic kloniert wird.

Beispiel 3 : Transfektionsexperimente in Zellkultur

Luciferase Reporter-Genkonstrukte (vgl. Beispiel 2) wurden zum Transfizieren folgender Zellen verwendet: primäre Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC), primäre Endothelzellen aus der Aorta des Rinds (bovine aortic endothelial cells, BAEC), humane Tumor Zelllinie (HeLa), Fibroblasten Zelllinie aus Nagern (NIH-3T3). Auf einer 6-Loch Zellkultur-Platte werden 2-3x10⁵ Zellen in DMEM mit 10% FCS ausgesät. Die Transfektion wird 12 Stunden nach dem Aussäen der Zellen durchgeführt. 1,5 μg der jeweiligen Plasmid-DNA werden mit 3,25 μl ExGen Lösung (MBI Fermentas) und einer 150 mM Natriumchlorid-Lösung in einem 100 μl Ansatz gemischt. Die Transfektionlösung wird mit 1 ml serumfreien Medium gemischt und für eine Stunde auf die Zellen gegeben. Danach werden die Zellen in serum- haltigem Medium für 48 Stunden kultiviert. Für die Luciferasebestimung (Luciferase Assay System, Promega, Cat. No. E4030) und die Proteinmessung (BCA- Protein Assay, Pierce, Cat. No. 23223) werden die Zellen mit PBS-Puffer gewa- sehen und in 200 μl Lysis-Puffer gelöst. Je 20 μl des Lysats werden für jeden Assay verwendet. Die Durchführung erfolgt nach Herstellerangaben. Die Luciferase Messung erfolgte in einem Luminometer der Fa. Packard. Jede Probe wird zwei mal vermessen. Die Luciferase- Werte wurden über die Proteinbestimmung abgeglichen. Neben den in Beispiel 2 genannten Luciferase-Konstrukten wurde das Promotor-lose Plasmid pGL3-basic transfiziert. Die Werte von 6 unabhängigen Transfektionsexperimenten wurden ausgewertet und gemittelt. Diese Werte wurden durch die Mittelwerte nach Transfektion mit pGL3-basic geteilt und damit auf dieses Kontrollplasmid bezogen. Die Ergebnisse sind in Figur wiedergegeben. 1. Expression von Luciferase Reporter-Genkonstrukten in Zellkultur

Die in Figur 3. dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der hVE-CAD-2 Promotor in kultivierten Endothelzellen spezifisch angeschaltet wird. Reporter-Genkonstrukte, die 5,0 kb, 4,5 kb bzw. 2,3 kb umfassende Promotor-Fragmente enthalten, steuern eine Genexpression, die in venösen (HUVEC) und arteriellen (BAEC) Endothelzellen 35-57-fach über dem promotorlosen Kontrollplasmid liegt. Gleichzeitig wird in Kontrollzellen nur eine Hintergrundaktivität beobachtet. Anhand dieser Daten lässt sich kein Unterschied in der Spezifität und der Expressionshöhe zwischen den drei Konstrukten hVE2-5,0, hNE2-4,5 und hVE2-2,3 erkennen.

Im Vergleich dazu bewirkt das Konstrukt hVE2-l,3 nur in arteriellen Endothelzellen eine deutliche Anschaltung des Luciferase-Gens, während in venösen Zellen nur eine Hintergrundaktivität zu beobachten ist, die sich nicht von der Expression in Kontrollzelllinien unterscheidet.

In der ΝCBI Datenbank ist unter der Zugangs-Νummer AF240635 die c-DΝA für das hVE-CAD-2 Gen publiziert. Demzufolge befindet sich der Transkriptionsstart des Gens 1211 bp oberhalb des Translationsstarts (vergleiche Figur 1). Das Konstrukt hVE2-l,3 enthält 1310 bp oberhalb des Translationsstartpunkts und damit offensichtlich nur 99 bp des Promotors 5 '-oberhalb des Transkriptionsstarts. Dieses kurze Promotorfragment führt dennoch zu einer begrenzten Endothelzell- spezifischen Expression.

Im Gegensatz dazu zeigt das Konstrukt hVE2-0,6, welches ausschließlich transk- ribierte Sequenz enthält, wie erwartet keinerlei Promotoraktivität unabhängig von der verwendeten Zelllinie. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass der hVE-CAD-2 Promotor eine spezifische Genexpression in Gefäßendothelzellen in vitro vermittelt. Hierbei wird kein eindeutiger Unterschied zwischen Konstrukten, die 5,0 kb, 4,5 kb bzw. 2,3 kb große Promotorfragmente enthalten, erkennbar. Demzufolge ist bereits eine 2,3 kb umfassende Sequenz ausreichend, um eine hohe und Gefäßendothelzell- spezifische Genexpression in Zellkultur zu bewirken. Diese Beobachtung lässt jedoch keine verlässliche Aussage über mögliche Unterschiede der genannten Promotorfragmente bei der Genexpression in vivo zu.

Bespiel 4: Herstellung transgener Mäuse durch die Mikroiniektion von Beta- Galaktosidase Konstrukten.

Für die Klonierung von pRZ-hVE-Zl wird das PCR-Produkt hVE-PCRl (vgl. Beispiel 1 und Figur 1), welches den humanen VE-CAD2 Promotor enthält, mit Kpnl und Seal geschnitten und in das mit Sall und Smal geschnittene Plasmid pPD 46.21 (A. Fire et al., Gene, 1990) kloniert. Dazu werden die Enden der DNA- Fragmente durch Behandlung mit T4- DNA Polymerase geglättet. Das Plasmid pPD 46.21 enthält die kodierende Sequenz für das Reporter-Gen Beta- Galaktosidase (lacZ) aus E.coli gekoppelt an ein Kernlokalisationssignal, das den Transport des Proteins in den Zellkern bewirkt. Das Konstrukt pRZ-hVE-Zl hat eine Gesamtgröße von 11,1 kb. Zur Mikroinjektion in Eizellen der Maus wird das Konstrukt mit Sall und Notl geschnitten und man erhält das unter Fig. 4 (B) dargestellte 8,5 kb große Fragment, welches den 5015 bp VE-CAD2 Promotor und das LacZ Gen (mit einem SV-40 Polyadenylierungssignal; nicht dargestellt) bein- haltet.

Nach elektrophoretischer Aufreinigung des Fragmentes erfolgt die Erzeugung transgener Mäuse wie von Hogan B. (Hogan B. et al. Manipulating the Mouse Embryo; a laboratory manual; Second Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Injektion der DNA-Lösung erfolgt in den Vorkern fertili- sierter Oozyten des Mausstamms CDl. Für die Analyse wird DNA aus kupierten Schwanzstückchen von Founder Tieren isoliert. Hierfür werden die Stückchen über Nacht in 500μl lysis buffer (50 μM tris/HCI, pH 8,0, 100 mM EDTA 100 mM NaCl, 1%.SDS addition of 35 μM Proteinase K (10 mg/ml)) bei 55°C über Nacht inkubiert und die DNA wird durch Isopropanol-Fällung gewonnen. Zum Nachweis einer 6,4 kb Transgen-Bande wird die Maus-DNA mit EcoRI verdaut. Als Sonde für die Southern-Blot Hybridisierung wird das 1,9 kb EcoV-EcoRI Fragment (Z2) verwendet (vgl. Fig. 4). Für die weitere Untersuchung werden po- sitive Tiere mit weiblichen bzw. männlichen CDl Wildtyp-Partnern verkreuzt. Die Nachkommen zeigten eine Mendelsche Verteilung des Transgens. Dadurch konnte die Integration des Konstrukts in die Keimbahn bestätigt werden.

Beispiel 5: X-Gal Färbung transgener Mäuse

Embryonen wurden am gewünschten Embryonaltag präpariert und in Fixierlösung (2% Paraformaldehyd; 0,1 M PIPES pH 6,9; 2 mM MgCl₂; 2 Mm EGTA) bei Raumtemperatur für 10-20 min inkubiert. Embryonen, die älter als 14,5 Embryonaltage waren, wurden median halbiert und für weitere 20 min fixiert. Nach drei- maligem Waschen in PBS/0,01% Natriumdesoxycholat/0,02% NP-40 wurden die Embryonen für 12-16 h bei 30°C in Färbelösung inkubiert (6 mM K₃Fe (CN)₆; 6 mM 0,02 % NP-40; 0,25 mM Natriumdesoxycholat; 1 x PBS; 0,01 % X-Gal/DMSO). Anschließend wurden sie dreimal mit PBS gewaschen.

Für weitere Analysen erfolgte eine Inkubation in 15 % Sucrose/PBS über Nacht. Anschließend wurden ganze Embryonen oder Organe in OCT Einfriermedium (Miles) überführt, auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C gelagert. Zur Analyse wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 10-40 μM angefertigt. 2. Erzeugung transgener Maus-Linien mit dem Konstrukt pRZ-hVE-Zl

Durch Southern-Hybridisierung wurde ermittelt, dass von 62 Nachkommen die nach Mikroinjektion des Konstrukts erhalten wurden, insgesamt 5 Tiere das Transgen in ihrem Genom enthielten. Zwei dieser sieben Tiere übertrugen das Konstrukt an die Nachkommen. In beiden Linien wurde eine vergleichbare Beta- Galaktosidase Expression beobachtet.

3. Gefäßendothel-spezifische Aktivität des 5,0 kb hVE-Cad-2 Promotors in transgenen Mäusen Die Analyse der Beta-Galaktosidase Färbung in transgenen Tieren zeigt bereits während der frühen Embryonalentwicklung am Tag 11,5 eine Promotoraktivität, in den meisten wenn nicht allen Gefäßen transgener Tiere. Eine detaillierte Analyse ganzer Embryonen sowie der entsprechenden Schnitte zeigte die Reporter- Genaktivierung im Gefäßendothel der Nabelschnur, des Gehirns, der Muskeln und der sich bildenden Organe. Hierbei wurde auch eine Expression in feinen Kapillaren beobachtet. Die Promotoraktivität war hierbei absolut spezifisch, so dass keinerlei ektopische Reporter-Genexpression in nicht Endothel-Zellen nachweisbar war. Das Expressionsmuster in den beiden erhaltenen Linien war weitgehend i- dentisch. Offensichtlich enthält das verwendete Promotorfragment alle regulatori- sehen Elemente um eine Insertions-Ort unabhängige Genexpression in transgenen Mäusen zu bewirken.

Die weitere Analyse fand an älteren Stadien (am Embryonaltag 15,5 und zum Zeitpunkt der Geburt am Embryonaltag 18,5) statt. Auch in diesen Stadien wurde eine Beta-Galaktosidase Färbung in den meisten wenn nicht in allen Gefäßen der untersuchten Organe einschließlich der Muskulatur detektiert. Während die Gefäße in Organen wie Herz, Lunge, Niere, Magen und Darm eine intensive Beta- Galaktosidase Aktivität zeigten, konnte im Gegensatz dazu in der Leber keinerlei Färbung detektiert werden. Diese Beobachtung ist absolut überraschend, da in Nothern-Blot Analysen eine Expression sowohl des humanen als auch des muri- nen VE-CAD-2 Gens in allen vaskularisierten Organen einschließlich der Leber gezeigt werden konnte (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich besteht der hVE- CAD-2 Promotor aus zahlreichen regulatorischen Elementen, von denen einige spezifisch die Anschaltung des Gens im Gefäßendothel der Lebergefäße bewerk- stelligen. Demnach enthält die hier verwendete humane 5015 bp umfassende Promotorsequenz alle regulatorischen Elemente zur Genexpression in gesamten Gefäßendothel mit Ausnahme der Gefäßendothelzellen in der Leber. Alternativ könnten diese Leber-spezifischen Elemente enthalten sein, führen jedoch aufgrund spezifischer inhibierender Elemente, die in dem Promotorfragment vorhanden sind, nicht zur Genexpression in diesem Organ.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass der erfmdungsgemäß bevorzugt verwendete 5,015 kb Promotor des VE-CAD-2 Gens aus dem Menschen überraschender Weise alle regulatorischen Ellemente für eine Gefäßendothel-Zell spezifische Ex- pression in den Blutgefäßen enthält, gleichzeitig aber eine Genanschaltug in den Blutgefäßen der Leber ausschließt. Damit ist der Promotor für zahlreiche gentherapeutische Ansätze geeignet, die eine Genexpression im Gefäßendothel erfordern, bei denen jedoch aufgrund des verwendeten therapeutischen Gens die Gefahr von systemischen Nebenwirkungen durch Leberschäden zu erwarten sind.

Beispiel 6: Northern Blot Analyse von adultem Gewebe

1. Herstellung der Sonden für die Northern Blot Analyse

Maus VE-Cad-2 Sonden: Unter Verwendung der publizierten Sequenz der Maus VE-Cad-2 cDNA (Telo et al. 1998, J. Jol. Chem. 273, 17565-17572) wurden Primer zur Amplifizierung eines 437 bp Fragmentes hergestellt. Das Fragment wurde mVE-Northern genannt. Die Primer-Sequenzen sind: mVE-2F2(Forward Primer): TAG TTC TGC CAT TCC TGC TAG G (SEQ ID Nr. 4) und mVE-2R2 (Revers Primer): GAC CTT TAG AGT CTC TCA CGG A (SEQ ID Nr. 5). Eine aus Maus Herzgewebe generierte cDNA wurde als Matrize zur Amplifikation der Sonde verwendet. Die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen wurden verwendet: 2,0 μl (50 ng) cDNA, 0,5 μl (5 pM) Primer mVE-2F2, 0,5 μl (5 pM) Primer mVE-2R2, 1,5 mM MgCl, und 9,5 μl H₂O wurden unter Bildung eines 12,5 μl Mastermixes gemischt. Der Mastermix wurde mit Taq-Polymerase und H₂O zu einem Gesamtvolumen von 25 μl ergänzt. Das Reaktionsgefäß wurde in einen "Thermocycler" transferiert und das folgende PCR-Programm benutzt: 15 Min bei 95°C, gefolgt von 30 Zyklen von: 30 sec bei 95°C, 30 sec bei 55°C, 60 sec bei 72°C, gefolgt von 7 Min bei 72°C und 5 Min bei 95°C.

Humane VE-Cad-2 Sonden: Unter Verwendung der murinen VE-Cad-2- Gensequenz (Telo et al., 1998, supra) wurde der mutmaßliche offene Leserahmen des humanen VE-Cad-2-Gens in einer Genbank Datenbankanalyse identifiziert. Auf der Grundlage der zur Deckung gebrachten Maus VE-Cad-2-Gensequenz und der BAC-Klon 50G21 Sequenz (Zugangsnummer AC005740) wurden Primer entworfen, die den Translationsstart des humanen VE-CAd-2-Gens erkennen und ferner ein anderer Primer entworfen, der eine 3' stromabwärts vom Translationsstart lokalisierte Sequenz erkennt, wobei beide Primer ein 432 bp langes humanes VE-Cad-2-Fragment abdecken. Die folgenden Primersequenzen wurden zur Amplifikation eines 432 bp humanen NE-Cad-2-Fragmentes per PCR verwendet: hVE-2S2 (Forward Primer): GTA AGC ATG ATG CAA CTT CTG (SEQ ID Νr. 6) und ein hVE-2Al (Reverse Primer): AAG GGT TTC TGC TCG TCC TTG (SEQ ID Νr. 7). Als Matrize für die PCR wurde eine cDΝA, die aus HUVEC-Zellen stammt verwendet. Die verwendeten PCR-Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie die zur Generierung der Maus VE-Cad-2-Sonden verwendet wurden. Das isolierte humane Fragment wurde als hVE-Νorthern bezeichnet.

2. Northern Blot Hybridisierung: Multiple Gewebe Northern Blots (Multiple Tissue Northern Blots (MTN), Clone- tech wurden verwendet. Maus: (MTN) Blot Cat. No.: 7762-1 Lot. No: 9030523 und human: (MTN) Blot Cat. No.: 7760-1 Lot. No: 9010567: Alle Puffer und Lösungen wurden vom Hersteller zur Verfügung gestellt und nach den Instruktionen des Herstellers verwendet. 50 ng der oben beschriebenen Northern Sonden wurden mit alpha-P³²dCTP (ICN) unter Verwendung des "Prime IT kit" (Stratagene) nach den Angaben des Herstellers verwendet. Nach einem abschließenden Waschschritt wurden ein Kodak Röntgenfilms unter Verwendung der hybridisierten Blots für 96 h belichtet.

3. Ergebnisse

Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. Die mRNA des murinen VE-Cad-2 befindet sich in einer Position von ungefähr 7 kb. Hochvaskularisierte Organe wie die Lunge, Herz, Milz, Leber und Niere zeigen eine ausgeprägte Expression des VE- Cad-2 in der Maus (Fig. 6 (A)). Die mRNA des humanen VE-Cad-2 befindet sich an einer Position von ungefähr 4.4 kb. Mit Ausnahme des Gehirns ist die Expression des humanen VE-Cad-2 in allen untersuchten Organen detektierbar bei ausgeprägt hoher Stärke im Herz, Plazenta, Lunge und Leber.

Beispiel 7: RT-PCR-Analyse von adulten transgenen Mäusen

RNA wurde aus gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellten adultend transgenen Mäusen isoliert. Organe eines ein Jahr alten pRZ-hVE-Zl#10 Weibchens, eines ein Jahr alten pRZ-hVE-Zl#54 Weibchens und eines ein Jahr alten CDl-Wild-Typ- Weibchens (Kontrolle) wurde vorsichtig isoliert und zur RNA-Präparation mit Hilfe der Trizol-Methode (Live Technologies, Cat. No. 15596-026 Lot. No: 1011120) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Gewebe wurde mit einem ultra-Turrax homogenisiert. Die folgenden Organe wurden getestet: Lunge, Leber, Herz, Milz und Niere. 500 ng RNA eines jeden Organs wurden als Matrize für die reverse Transkriptions (RT) unter Verwendung des "Expand Reverse Transcriptase Kit", das einen DNase Verdau-Schritt enthält (Röche Cat. No: 1785- 834 Lot. No: 92035623). Die resultierende cDNA wurde in einem Gesamtvolumen von 20 μl verdünnt. 2 μl der cDNA-Präparation wurden für die PCR verwen- det, wobei das "Hot Star Tag TM Master Mix Kit" verwendet wurde (Qiagen 1000 units Cat. No: 203445 Lot. No: 10921919). Die folgenden Primerpaare wurden verwendet:

1. GAPDH R3 (Forward Primer): CAC CAC CTT CTT GAT GTC ATC A (SEQ ID Nr. 8) und F2 (Reverse Primer): GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT G (SEQ ID Nr. 9). Das amplifizierte PCR-Fragment ist 693 bp lang.

2. L7 up (Forward Primer): GGT AGT GGT CAA ATG GCG ATT (SEQ ID Nr. 10) und L7 down (Reverse Primer): GCC ACC AAT CCC CAT ATG GAA (SEQ ID Nr. 11). Das amplifizierte PCR-Fragment ist 206 bp lang.

3. mVE FI (Forward Primer): GTC CGG TCC TCA TCA GAT TCT (SEQ ID Nr. 12) und R2 (Reverse Primer): GTG TGC TGC CCC AAC AAC ATT

(SEQ ID Nr. 13). Das amplifizierte PCR-Fragment ist 612 bp lang.

4. LacZ FI (Forward Primer): GGT AGT GGT CAA ATG GCG ATT (SEQ ID Nr. 14) und R3 (Reverse Primer): GCC ACC AAT CCC CAT ATG GAA (SEQ ID Nr. 15). Das amplifizierte PCR-Fragment ist 400 bp lang.

Die folgenden PCR Reaktionsbedingungen wurden verwendet: In getrennten Reaktionsgefäßen wurden gemischt: 2,0 μl cDNA, 0,5 μl (5pM) Primer (Reverse Primer), 0,5 μl (5pM) Primer (Forward Primer), 1,5 mM MgCl und 9,5 μl H₂O unter Bildung eines 12,5 μl Mastermixes. Danach wurde jedes Reaktionsgefäß mit Taq-Polymerase und H₂O zu einem Gesamtvolumen von 25 μl aufgefüllt. Die Reaktionsgefäße wurden in einen "Thermocycler" transferiert und das folgende PCR-Programm benutzt: 15 Min bei 95°C, gefolgt von 30 Zyklen von: 30 sec bei 95°C, 30 sec bei 55°C und 60 sec bei 72°C gefolgt von 7 Min bei 72°C und 5 Min bei 95°C. Danach wurden 15 μl von jeder PCR-Reaktion elektrophoretisch auf einem 1,5% Agarosegel mit EtBr aufgetrennt und danach analysiert.

Wie in Figur 7 gezeigt, konnten die isolierten cDNAs erfolgreich amplifiziert werden und in allen getesteten Geweben die ubiquitär expremierten Gene GAPDH Gen ("housekeeping gene") und L7 Gen (ribosomales Gen) beobachtet werden. Alle verwendeten cDNAs waren daher von geeigneter Qualität. Ebenso wurde die Expression des Maus VE-Cad-2-Gens in allen getesteten Organen beobachtet. Diese Beobachtung stimmt mit der Northern Blot Analyse der adulten Mäuse und des menschlichen Gewebes wie in Beispiel 6 beschrieben und in Figur 6 gezeigt überein. Wie zu erwarten zeigte sich bei der RT-PCR Analyse von Beta- Galaktosidase-Gen-Expression kein detektierbares PCR-Produkt in der transgenen CDl -Wild-Typ-Maus (negative Kontrolle, Fig. 7, rechte Spalte, Bild unten). Im Gegensatz dazu konnte in beiden transgenen Stämmen pRZ-hVE-Zl#10 (Fig. 7, linke Spalte, Bild unten) und pRZ-hVE-Zl#54 (Fig. 7, mittlere Spalte, Bild unten) ein 400 bp langes Beta-Galaktosidase-Produkt in Geweben erhalten werden, die adulter Lunge, Herz, Milz und Niere entstammen (Fig. 7, linke und mittlere Spalte, Bilder unten, Bahnen 2, 4, 5 und 6). Der 5015 bp lange hVE-Promotor ist daher nützlich, um die Reporter-Gen-Expression in all diesen Organen unabhängig von der Integrationsstelle des Transgens in dem Genom zu steuern. Überraschenderweise konnte im wesentlichen keine Beta-Galaktosidase Gen-Expression in adulter Leber von beiden unabhängig erzeugten transgenen Stämme detektiert werden (Fig. 7, linke und mittlere Spalte, Bilder unten, Bahn 3). Angesichts der Northern Blot Daten in Figur 6 und den RT-PCR-Expressionsmustern des endo- genen Maus VE-Cad-2 Gens wie weiter oben diskutiert, ist dies absolut unerwartet und beide Methoden zeigen, dass das VE-Cad-2-Gen eindeutig in der adulten Leber der Maus und des Menschen exprimiert ist. Die im wesentlichen abwesende Transgene Expression in der adulten Leber beider transgener Stämme ist offensichtlich ein charakteristisches Merkmal des 5015 bp hVE-Promotors. Die RT- PCR Daten stimmen überein mit den in den transgenen Embryos beobachteten Beta-Galaktosidase-Expressionsmustern, dargestellt in Fig. 5. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass der 5015 bp hVE-Cad-Promotor nützlich für die Expression eines jeden von Interesse seienden Trans gens in Gefäßendothelzellen eines jeden Organs in Embryonen oder adulten Tieren ist, wobei die Expression im wesentlichen abwesend ist in der Leber. Diese Merkmale sind außerdem nützlich und voteilhaft für viele Anwendungen in der Medizin, Gentherapie und verwandten Gebieten.

Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass die erfindungsgemäßen Zu- sammensetzungen und Verfahren mannigfaltig modifiziert werden können. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auch solche Veränderungen und Variationen abdeckt, die in den Schutzbereich der Ansprüche und ihrer Äquivalente fallen.

Die Prioritätsanmeldung US 60/249,390 wurde am 16. November 2001 angemeldet. Alle hier zitierten Publikationen werden in ihrer Vollständigkeit durch Referenz inkorporiert.

Claims

Patentansprüche

1. Nukleinsaure-Fragment, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäure- Fragment eine sich vom Translationsstart nach 5' stromaufwärts erstreckende regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens oder eine funktionell aktive Variante davon, enthält, dadurch gekennzeichnet dass das Nukleinsaure-Fragment Gefäßendothel-spezifische Expression ermöglicht.

2. Nukleinsaure-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsaure-Fragment die Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 oder eine funktionell aktive Variante davon, enthält.

3. Nukleinsaure-Fragment nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsaure-Fragment Gefäßendothel-spezifische Expression ausgenommen Expression in der Leber ermöglicht.

4. Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsaure-Fragment eine Sequenzhomologie von mindestens 80 % zu der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 oder einem funktionellen Teil davon aufweist.

5. Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, da- durch gekennzeichnet dass das Nukleinsaure-Fragment eine Sequenzhomologie von mindestens 90 %> zu der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 oder einem funktionellen Teil davon aufweist.

6. Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass das Nukleinsaure-Fragment eine Sequenz- homologie von mindestens 95 % zu der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 o- der einem funktionellen Teil davon aufweist.

7. Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet dass das Nukleinsaure-Fragment einen funktionellen Teil der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 enthält.

8. Nukleinsaure-Fragment nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass ein bevorzugter funktioneller Teil 1-3804 bp von der Sequenz nach der SEQ ID Nr. 1 ist.

9. Nukleinsaure-Fragment nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass ein bevorzugter funktioneller Teil 2724-3804 bp von der Sequenz nach der SEQ

ID Nr. 1 ist.

10. Nukleinsäure-Konstrukt enthaltend ein Nukleinsaure-Fragment gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-9 und ein heterologes Gen.

11. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Gen für ein therapeutisch wirksames Genprodukt codiert.

12. Nukleinsäure-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass-das therapeutisch wirksame Genprodukt die Hämoxygenase, das MCP-1, das GM-CSF, die iNOS, eNOS oder der Fas Ligand ist.

13. Vektor umfassend ein Nukleinsaure-Fragment gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein Nukleinsäure-Konstrukt gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12.

14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet dass der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmiden, Shuttle Vektoren, Pha- gemiden, Cosmiden, erste und dritte Generation von adenoviralen Vektoren, Expressionsvektoren und gentherapeutisch wirksamen Vektoren.

15. Knock-out Genkonstrukt, dadurch gekennzeichnet, dass das knock-out Genkonstrukt ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält.

16. Zelle, die ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, ein Nukleinsäure-Konstrukt gemäß mindestens einem der

Ansprüche 10 bis 12, einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14, oder ein knock-out Genkonstrukt nach Anspruch 15, umfaßt.

17. Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus embryonalen Stammzellen, embryonalen Keimbahnzellen und Stammzellen, die adultem Gewebe entstammen.

18. Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die aus adultem Gewebe entstammende Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neuronalen Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt und Duktus Stammzellen.

19. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Säuger Zelle, einschließlich menschliche Zelle ist.

20. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 18, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Zelle eine transgene nicht-menschliche Stammzelle ist.

21. Transgenes nicht-menschliches Tier dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Zelle nach Anspruch 20 enthält.

22. Test zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Funktion der Nukleinsäure-Fragmente nach mindestens einem der Ansprü- ehe 1 bis 9 modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass der Test mindestens ein Nukleinsäure-Fragmente nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens ein Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder min- destens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, enthält, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen.

23. Test nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmakologisch aktive Substanz die Funktion der Nukleinsäure-Fragmente in aktivierender

Weise moduliert.

24. Test nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmakologisch aktive Substanz die Funktion der Nukleinsäure-Fragmente in inhibierender Weise moduliert.

25. Auf ein Trägermaterial gebundenes Array, dadurch gekennzeichnet, dass das Array mindestens ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, enthält.

26. Diagnostikum, dadurch gekennzeichnet, dass das Diagnostikum mindestens ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens ein Nukleinsäure-Konstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, enthält, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigne- ten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen.

27. Diagnostikum nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsaure-Fragment eine DNA-Sonde ist.

28. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel mindestens ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, min- destens ein Nukleinsäure-Konstrukt nach mindestens einem der Ansprüche

10 bis 12, mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 13 und 14 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, enthält, gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen.

29. Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäure-Fragmenten gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 9, enthaltend die Schritte:

(1) Kombinieren von mindestens einem Nukleinsaure-Fragment enthaltend eine sich vom Translationsstart nach 5' stromaufwärts erstreckende regulatorische Sequenz des humanen VE-Cad-2-Gens oder eine Variante davon mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Expressionsvektors;

(3) Messen der Stärke der Expression des Reporter-Gens;

(5) Identifizieren der Nukleinsäure-Fragmente, die eine Gefäßendothel-spezifische Expression, ausgenommen Expression in der Leber ermöglicht.

30. Verfahren zur Identifizierung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Beta- Galaktosidase, Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), rotes fluoreszierendes Protein, gelbes fluoreszierendes Protein, oder ein an ein heterologes Gen gebundenes His-, Myc-, oder Flag-Tag.

31. Verfahren zur Herstellung eines gentherapeutisch wirksamen Vektors, Arzneimittels und/oder Diagnostikums, dadurch gekennzeichnet, dass ein ge- maß einem der Ansprüche 29 oder 30 identifiziertes Nukleinsaure-Fragment in einen Vektor eingebracht wird, der mindestens ein heterologes Gen ent- hält und Gefäßendothel-spezifische Expression ausgenommen Expression in der Leber ermöglicht.

32. Verfahren zur Selektion von Endothelzellen aus Stammzellen enthaltend folgende Schritte:

(1) Kombinieren mindestens eines Nukleinsäure-Fragments gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 9 mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Expressionsvektors;

(2) Einfuhren des Reporter-Gen-Expressionsvektors in mindestens eine Stammzelle;

(3) Kultivieren der Stammzelle(n);

(4) Initiieren der Differenzierung der kultivierten Stammzelle(n); und

(5) Isolieren der Endothelzelle(n) aus der (den) kultivierten Zelle(n).

33. Verfahren zur Selektion nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Reporter-Gen ein Antibiotikum Resistenzgen ist und die Endothelzel- le(n) isoliert werden, indem die differenzierte(n) Endothelzelle(n) nach Hinzufügen eines geeigneten Antibiotikums in Schritt (3) oder (4) gesammelt wird (werden).

34. Verfahren zur Selektion nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Resistenzgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hygromycin Resistenzgen (hph), Zeocin Resistenzgen (Sh ble), Puromycin

Resistenzgen (pacA), und Gentamycin or G418 Resistenzgen (aph).

35. Verfahren zur Selektion nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), rotes fluoreszierendes Protein und gelbes fluoreszierendes Protein, und die Endothelzelle(n) von der (den) kul- tivierten Zelle(n) mittels Fluoreszenz-aktivierter Zeil-Sortierung (FACS) i- soliert wird (werden).

36. Verfahren zur Selektion nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Reporter-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, Beta-Galaktosidase, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), rotes fluoreszierendes Protein gelbes fluoreszierendes Protein und ein an ein heterologes Gen gebundenes His-, Myc-, oder Flag-Tag, und die Endothelzelle(n) von der (den) kultivierte(n) Zelle(n) mittels Affinitäts-Reinigung isoliert wird (werden).

37. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle mit einem Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Anspruch 1 bis 9, einem Nukleinsäure-Konstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, einem Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 oder einem knock-out Gen- konstrukt nach Anspruch 15, transfiziert wird.

38. Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle nach Anspruch 20 zu einem transgenen nicht-menschlichen Tier regeneriert wird.

39. Verfahren zur Herstellung eines Tests nach mindestens einem der Ansprü- ehe 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Nukleinsaure- Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens ein Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen kombiniert wird.

40. Verfahren zur Herstellung eines Arrays nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Nukleinsaure-Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, an ein Trägermaterial gebunden wird.

41. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums nach einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Nukleinsaure- Fragment nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens ein Nukleinsäure-Konstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, mindestens ein Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen kombiniert wird.

42. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Nukleinsaure-Fragment nach mindes- tens einem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens ein Nukleinsäure-Konstrukt nach mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, mindestens ein Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 und/oder mindestens eine Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20, mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen kombiniert wird.

43. Verfahren zur Behandlung eines Säugetieres oder Menschens, dadurch gekennzeichnet, dass dem Säugetier oder Menschen eine pharmazeutisch wirksame Menge des Arzneimittels nach Anspruch 28 verabreicht wird.

44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel nach einem der Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus systemische Injektion, lokale Injektion, Perfusion und Katheter-basierender

Verabreichung, verabreicht wird.

45. Verwendung eines Nukleinsäure-Fragments gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, eines Nukleinsäure-Konstrukts gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 12, eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 13 o- der 14, einer Zelle gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis 20 und/oder eines transgenen nicht-menschlichen Säugetieres nach Anspruch 21, zur Expression eines heterologen Gens.

46. Verwendung eines Tests nach mindestens einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Funktion der Nukleinsäure-Fragmente nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 modulieren.

47. Verwendung eines an ein Trägermaterial gebundenen Arrays nach Anspruch 25 zur Analyse in Verbindung mit Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen.

48. Verwendung eines Diagnostikums nach einem der Ansprüche 26 oder 27 zur Diagnose von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen.

49. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 28 zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankungen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind,

Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen.

50. Verwendung nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur somatischen Gentherapie verwendet wird.

51. Verwendung eines nach Anspruch 31 hergestellten gentherapeutisch wirksamen Vektors, eines Arzneimittels oder eines Diagnostikums zur Diagnose, Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßerkrankungen, genetisch bedingten Erkrankun- gen, Erkrankungen, die mit pathologischer Vasodilatation oder Vasokonstriktion verbunden sind, Artherosklerose, Diabetes, krebsartigen Erkrankungen, Entzündungserkrankungen und/oder immunogenen Erkrankungen.

52. Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs enthaltend mindestens eine Endothelzelle, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 36 erhaltene Endothelzelle mit mindestens einer geeigneten Zelle und/oder einem Träger kombiniert und kultiviert wird, um das künstlichen Gewebe oder Organ zu erzeugen.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass das künstliche Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gefäßen, Herzklappen und Venenklappen.

54. Verfahren zum Testen der pharmakologischen Aktivität einer pharmakolo- gischen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 32 bis 36 erhaltene Endothelzelle der pharmakologischen Substanz ausgesetzt wird und die pharmakologische Aktivität der pharmakologischen Substanz bestimmt wird.