EP1360193A1 - Procede de purification de la proteine adhesine-like a (alpa) d'helicobacter - Google Patents

Procede de purification de la proteine adhesine-like a (alpa) d'helicobacter

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Publication number
EP1360193A1
EP1360193A1 EP02701347A EP02701347A EP1360193A1 EP 1360193 A1 EP1360193 A1 EP 1360193A1 EP 02701347 A EP02701347 A EP 02701347A EP 02701347 A EP02701347 A EP 02701347A EP 1360193 A1 EP1360193 A1 EP 1360193A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alpa
guanidine
solubilization
urea
point
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02701347A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laurence Fourrichon
Ling Lissolo
Olivier Pitiot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merieux Oravax
Original Assignee
Merieux Oravax
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merieux Oravax filed Critical Merieux Oravax
Publication of EP1360193A1 publication Critical patent/EP1360193A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the subject of the invention is a process for the purification of the protein AlpA with Helicobacter, which has the characteristics required for implementation on an industrial scale.
  • Helicobacter is a bacterial genus characterized by gram-negative spiral bacteria. Several species colonize the gastrointestinal tract of mammals. We cite in particular H. pylori, H. heilmanii, H. felis and H. mustelae. Although H. pylori is the species most commonly associated with human infections, in some rare cases, H. heilmanii and H. felis have been isolated from humans. A Helicobacter type bacterium, Gastrospirillum hominis has also been described in humans.
  • Helicobacter infects more than 50% of the adult population in developed countries and almost 100% of that in developing countries; making it one of the predominant infectious agents worldwide.
  • H. pylori is found exclusively to date on the surface of the stomach lining in humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Furthermore, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H. pylori.
  • the lipoprotein AlpA Adhesin-like lipoprotein A
  • AlpA and the gene encoding it were originally disclosed in WO 96/41880. It therefore remained to develop a production and purification process which made it possible to produce batches of pharmaceutical quality.
  • the main objective of the present invention is to provide a simple and robust process which can be implemented on an industrial scale. This process must in particular make it possible to produce a large quantity of antigen without having to make costly investments.
  • E. coli is par excellence the bacterium used as a host organism to produce all kinds of heterologous proteins by the recombinant route. When these proteins are not soluble or somehow excreted, they can accumulate as inclusion bodies. These inclusion bodies are intra-cytoplasmic corpuscles specific to E. coli. The appearance of these inclusion bodies is favored by a high level of expression (over-expression). The purification of the recombinant proteins from the inclusion bodies requires in particular that these inclusion bodies be dissolved beforehand. This solubilization is obtained in the usual way with a chaotropic agent (urea, guanidine) or a detergent.
  • a chaotropic agent urea, guanidine
  • the recombinant protein rAlpA deliberately produced in a non-lipid form in E. coli, still retains a high hydrophobicity. This strong intrinsic hydrophobicity makes its purification difficult by conventional means.
  • the rAlpA protein is found in the inclusion bodies of E. coli and the presence of a chaotropic agent at high concentration is almost compulsory throughout the purification.
  • hydrophobic interaction chromatographies are commonly used in order to purify proteins having a marked hydrophobic character.
  • a protein occurs in a medium with a high concentration of guanidine
  • the use of this type of chromatography becomes very problematic because the presence of guanidine must normally prevent adsorption.
  • a very large number of proteins capable of being adsorbed under conventional conditions on a CIH support would be eluted at a high concentration of guanidine.
  • AlpA we have now found that there is a narrow guanidine concentration window which allows both the maintenance of AlpA in soluble form and its adsorption on a CIH support. This window is between approximately 2.5 and 3.5 M.
  • the subject of the invention is a method of purifying the adhesin-like protein A (AlpA) from Helicobacter eg H. pylori, according to which (i) a preparation containing AlpA and 2.5 to 3.5 M of guanidine with a hydrophobic interaction chromatography material so that AlpA is adsorbed on the material and (ii) AlpA is eluted with a solution containing 3.5 to 4.5 M of guanidine.
  • AlphaA adhesin-like protein A
  • the preparation brought into contact with the chromatography material contains 3 M of guanidine and AlpA is eluted with 4 M of guanidine at neutral pH (6 - 8; e.g. 6.5 - 7.5).
  • a preparation containing AlpA in the presence of guanidine can in particular be obtained from a production process according to which (a) a Gram-negative bacterium, in particular E. coli, is capable of expressing AlpA in recombinant form, (b) the bacterial cells from the culture are recovered and lysed, (c) the bodies of inclusions contained in the cells are recovered, they are washed and solubilized, and (d) optionally, they are precipitated the inclusion bodies, the supernatant is removed and the precipitate is solubilized.
  • a Gram-negative bacterium in particular E. coli
  • the bacteria harvested after culture are first lysed.
  • Cell lysis can be carried out in various ways, in particular by microfluidization.
  • the cells can also be treated with benzonase during the lysis, so that the DNA of E. coli be digested.
  • the inclusion bodies are then subjected to successive washings; preferably in a buffer containing a high concentration of salt in order to eliminate the nucleic acids and to best dissociate rAlpA from the contaminants; suitably, it can be a sodium buffer eg a buffer containing 0.5 M NaCl.
  • the inclusion bodies are finally dissolved in highly concentrated guanidine eg guanidine 5.5 to 6.5 M, preferably 6 M.
  • the ammonium sulphate is 0.4 to 0.6 M ammonium sulphate, eg 0.5 M.
  • the precipitate containing rAlpA is again dissolved in highly concentrated guanidine eg 5.5 to 6.5 M guanidine, preferably 6 M.
  • the preparation is diluted with Vz and then loaded onto an appropriate column.
  • Chromatography of hydrophobic interactions can be carried out in a conventional manner using supports such as Sepharose TM (Pharmacia) and Fractogel TM (Merck) or else supports equivalent to the latter such as those found at Tosohaas or Biorad .
  • the ligand can be butyl, octyl or phenyl.
  • the ICIDH makes it possible in particular to separate the AlpA protein from its degradation products.
  • the eluate originating from the ICIDH can be concentrated in different ways and in particular by ultrafiltration. It is also advisable to eliminate guanidine which is a toxic product.
  • a diafiltration step eg tangential diafiltration, can be implemented, against several volumes of neutral buffer eluate containing urea with a molarity greater than or equal to 4 M, preferably greater than or equal to 6 M, of preferably 8 M urea; urea being present to maintain rAlpA in soluble form.
  • 6 to 10 volumes of urea 7.5 to 8.5 M are used.
  • a “polishing” can be carried out by ion exchange chromatography, in particular by anion exchange chromatography in order to remove the residual contaminants coming from E. coli.
  • this last step is carried out in the presence of 8 M urea.
  • the preparation of rAlpA resulting from the diafiltration is then applied to anion exchange chromatography equipment; the contaminants are adsorbed on this material while rAlpA does not adsorb and ends up in the filtrate (also called direct eluate).
  • the presence of 8 M urea is essential for the following reasons: AlpA is a positively charged protein (very high pi) and therefore should not normally be adsorbed on anion exchange chromatography equipment. But its hydrophobic character is so marked that it would still be absorbed if 8 M urea was absent from the preparation.
  • the invention also relates to a process for the purification of AlpA according to which (i) a preparation containing AlpA and urea 7.5 to 8.5 M, preferably 8 M, is brought into contact with material. anion exchange chromatography so that the contaminants adsorb on this material and (ii) AlpA is recovered in the filtrate.
  • Anion exchange chromatography can be carried out in a conventional manner using supports such as Sepharose (Pharmacia) and Fractogel (Merck) or else supports equivalent to the latter such as those found at Tosohaas or Biorad.
  • the ligand can be a tertiary amine such as DEAE (diethyleaminoethyl) or quaternary amine such as Q (quaternary, hydroxypropylediethyleaminoethyl) and TMAE (trimethyleaminoethyl).
  • DEAE diethyleaminoethyl
  • quaternary amine such as Q (quaternary, hydroxypropylediethyleaminoethyl) and TMAE (trimethyleaminoethyl).
  • the AlpA protein characterized by a degree of purity greater than or equal to 90% of monomer, as measured by SDS-PAGE, staining with Coomassie blue and reading of densitometry.
  • the remaining material other than the monomeric form consists of AlpA protein in multimeric form.
  • the overall degree of purity being greater than or equal to 99%.
  • this preparation must constitute a batch; that is to say, it was obtained from a single culture and the singular implementation of a purification process.
  • the inclusion bodies can be dissolved by replacing guanidine with urea 7.5 to 8.5, preferably 8 M in a buffer with basic pH, preferably greater than or equal at 10.5, eg at pH 11.
  • a phosphate buffer is used.
  • the invention also relates to a process for the purification of the adhesin-like protein A (AlpA) Hél 'Helicobacter according to which (i) a preparation containing AlpA and 4.5 to 5.5 M is brought into contact. of urea with hydrophobic interaction chromatography equipment such that AlpA is adsorbed on the equipment and (ii) AlpA is eluted with a solution containing 7.5 to 8.5 M of urea.
  • AlphaA adhesin-like protein A
  • An inducible expression system has been constructed to produce the AlpA protein of Helicobacter pylori in E. coli.
  • the vector that was used is derived from the plasmid pET28c (Novagen). This vector comprises: an expression cassette under the control of the promoter of bacteriophage T7,
  • a transcription terminator also derived from bacteriophage T7, and
  • the promoter is upregulated in the presence of T7 RNA polymerase.
  • strains of E. genetically modified coli can be used, among which the strains BL21 ⁇ D ⁇ 3 (Studier, F.W. et al 1990 Meth. Enzymol 185, 60-69.). These strains contain the gene coding for the RNA polymerase of phage T7 under the control of the lac UV5 promoter, inducible by addition of IPTG. In addition, the BL21 ⁇ D ⁇ 3 strain is deficient for the OmpT and Lon protease activities.
  • a 1.6 Kb DNA fragment containing the sequence coding for the mature AlpA protein was obtained by PCR amplification using the strain of Helicobacter pylori X47-2 (ORV 2001) as a source of DNA.
  • the Ncol and Xh ⁇ l restriction sites used for cloning are included in the 5 '(HP3 ⁇ co C-) and 3' HP3 (Xho) PCR primers respectively.
  • the lipidation site [Cysteine codon (TGC codon)] has been replaced by an ATG initiation codon (Met).
  • the PCR amplified fragment was first cloned into the Topo TA shuttle vector (Invitrogen), then transferred into p ⁇ T28c using the Ncol and Xh ⁇ l sites.
  • the PCR amplification conditions were as follows: 97 ° C / 30 s; 55 ° C / 1 min; 72 ° C / 50 s; Wind DNA polymerase - 25 cycles.
  • Ncol and Xhol sites are indicated in italics and the ATG initiation and TAA termination codons (opposite strand) are in bold underlined characters.
  • Erlens of 2 liters each containing 500 mL of Luria Broth (LB) 2X medium modified (peptone replaced by yeast extract 30 g / L) and supplemented with kanamycin 50 ⁇ g / mL, are inoculated with 500 ⁇ L of a batch of E. coli BL21D ⁇ 3 / pMHp3.1 seed and are incubated for 15-18 hrs at 37 ° C with shaking 175 rpm.
  • This preculture is used to seed a 30 L fermenter (B Braun) containing the SKY ⁇ 4 medium (for one liter: yeast extract 40 g; MgCl 2 1 M 3 ml; K 2 SO 530 mg; NaCl 1 g; K 2 HPO 4844 g) supplemented with glucose monohydrate 44 g / L and kanamycin 50 mg / mL.
  • the inoculum corresponds to 5% of the total volume.
  • the culture parameters are as follows: pH: 7.00; regulation H3PO4 10% and NH4OH 28%; temperature: 37 ° C; initial agitation:
  • the culture is continued for more than 3 hrs.
  • the expression of AlpA is induced by adding the volume of IPTG (at 200 mM) necessary to obtain a final concentration equal to 1 mM.
  • the culture is immediately cooled.
  • the cells are harvested by centrifugation 20 min at 7,000 g and the pellets stored at - 35 ° C.
  • a 2.5 IU / ⁇ L benzonase solution is prepared extemporaneously from a 250 IU / ⁇ L stock solution stored at ⁇ 20 ° C., ie 20 ⁇ L + 1980 ⁇ L of 50 mM Tris buffer pH 8.0. Then 1700 ⁇ L of this solution is added in 42.5 ml of 100 mM MgCl 2 . All of this preparation is poured into the germ suspension. The mixture is incubated at 5 ⁇ 3 ° C with magnetic shaking for at least 30 minutes.
  • the cells thus homogenized are broken using a PANDA cell disintegrator at a pressure set at 1000 bars, with 3 breaking cycles and at a temperature not exceeding 15 ° C, using the cooling system ( cryostat set at + 5 ° C).
  • the ratio DO before breaking / DO after the last breaking must be> 4.5.
  • the suspension of the inclusion bodies after 3 breaking cycles is centrifuged at 10,000 g for 30 min. at 5 ⁇ 3 ° C to remove contaminants (DNA, RNA and lipopolysaccharides ).
  • the pellet After centrifugation, the pellet is recovered and then resuspended in 4.25 L of 50 mM sodium phosphate buffer, 0.5 M NaCl pH 7.0 cooled to 5 ⁇ 3 ° C.
  • the protein concentration is around 8 g / L.
  • the suspension is homogenized with Ultraturrax in an ice bath of so as to maintain the suspension at 5 ⁇ 3 ° C. and then left under magnetic stirring for 30 min at 5 ⁇ 3 ° C.
  • the suspension thus washed is centrifuged at 10,000 g for 30 min at 5 ⁇ 3 ° C.
  • the washing operation is repeated twice. Approximately 110 g of washed inclusion bodies are thus obtained, ie approximately 0.3 g of proteins per gram of washed inclusion bodies. Storage is possible at - 20 ° C.
  • the inclusion bodies are then dissolved in 50 mM Tris buffer, 6 M Guanidine pH 7.5.
  • the final protein concentration to be obtained is 20 g / L.
  • the volume of buffer to be added is therefore approximately 1.65 L.
  • This suspension is homogenized with Ultraturrax at 16,000 rpm and then with magnetic stirring until complete solubilization, at a temperature maintained at 22 ⁇ 3 ° C.
  • the mixture is centrifuged at 10,000 g for 30 minutes at 22 + 3 ° C minutes in order to clarify the solution; then the solution is sterile filtered on Spiral Cap 0.8 / 0.2 ⁇ m.
  • the volume of the filtered supernatant is approximately 1.6 L
  • the supernatant is diluted by half with a 1 M ammonium sulphate solution, 50 mM Tris pH 7.5 with magnetic stirring.
  • the solution thus obtained is added in 30 minutes using a peristaltic pump at a slow and regular rate to obtain a solution with 10 g / L of proteins containing 0.5 M of (N ⁇ ) 2 SO 4 in the end.
  • the mixture is left under magnetic stirring for 30 minutes at 22 ⁇ 3 ° C. Then the incubation is continued without shaking overnight (15 hours) at laboratory temperature to allow the precipitate to mature.
  • the mixture is centrifuged for 30 min at 10,000 g at 22 ⁇ 3 ° C.
  • the precipitate is collected and then solubilized at 10 g / L of proteins with 50 mM Tris buffer, 6 M Guanidine pH 7.5 with magnetic stirring (The forecast volume after solubilization is close to 3.2 L).
  • This suspension is homogenized with Ultraturrax at 16,000 rpm and then with magnetic stirring until complete solubilization, at a temperature maintained at 22 ⁇ 3 ° C.
  • This suspension is then diluted to 1/2 by addition of 50 mM Tris buffer, 1.4 M NaCl pH 7.5 with magnetic stirring.
  • This buffer is added in 30 minutes using a peristaltic pump at a slow and regular flow to obtain a 5 g / L solution of proteins containing 50 mM Tris, 0.7 M NaCl, 3M Guanidine pH 7.5 in the end. .
  • the mixture is left under magnetic stirring for 15 minutes at 22 ⁇ 3 ° C.
  • the mixture is centrifuged at 10,000 g for 30 minutes at 22 ⁇ 3 ° C in order to clarify the solution; then it is sterile filtered on Supor Cap 0.8 / 0.2 ⁇ m.
  • the volume of the filtered supernatant is approximately 6 L.
  • the column is prepared as follows:
  • the gel is washed and then equilibrated at a flow rate close to 60 mL / cm 2 .h (19 L / h) with (i) 5 volumes of column of ultrafiltered water, then with (ii) 3 volumes of column of Tris 50 buffer mM, Guanidine 3 M, NaCl 0.7 M pH 7.5.
  • the column is loaded by injection of the filtrate (corresponding to 22 - 25 g of total proteins) at a flow rate close to 60 ml / cm 2 .h (19 L / h).
  • the column is then rinsed with 50 mM Tris buffer, 3M guanidine, 0.7 M NaCl pH 7.5 at a flow rate close to 90 ml / cm 2 .h (28 L / h) until the return to the baseline (2 column volumes).
  • AlpA is then eluted in 50 mM Tris buffer, 4 M Guanidine pH 7.5 at a flow rate of 90 mL / cm 2 .h (28 L / h) until the return to the baseline (1 column volume).
  • the eluate volume is approximately 8 L. Concentration and diafiltration on 30 kDa
  • the ultrafiltration module is prepared as follows:
  • the rAlpA eluate is concentrated in 50 mM Tris buffer, 4 M Guanidine pH 7.5, around 5 g / L of protein (concentration factor ⁇ 2.5).
  • the ultrafiltration conditions are as follows: (i) inlet pressure close to 1 bar, and (ii) flow rate of the ultrafiltrate at half that of the retentate.
  • the volume of the concentrated eluate is approximately 3.5 L.
  • the concentrated rAlpA eluate is diafiltered against 10 volumes of 50 mM Tris, 8 M urea pH 7.5 (35 L) under the same conditions as the concentration, at a flow rate of approximately 30 L / h, until obtaining:
  • the volume of the diafiltered concentrated eluate is approximately 3.7 L.
  • the column used has the following characteristics: Column (EMD TMAE Merck) with a diameter of 7 cm and a surface of 38.5 cm 2 ; Frost height close to 18 cm; Gel volume close to 700 mL.
  • the chromatography column is prepared as follows:
  • the gel is washed and then equilibrated at a flow rate close to 4 L / h with (i) 5 volumes of column of ultrafiltered water, then with (ii) 3 volumes of column of 50 mM Tris buffer, 8 M urea pH 7.5.
  • the chromatography is carried out as follows: The column is loaded by injection of the diafiluted eluate corresponding to 15 - 17 g of total proteins, at a flow rate of 100 ml / cm 2 .h (4 L / h) then rinsed with 50 mM Tris buffer, 8 M urea, pH 7.5, same flow rate, until returning to the baseline (6 column volumes). The filtrate thus collected (approximately 4 L) contains the pure rAlpA protein at 90 ⁇ 5% in the absence of endotoxins.
  • the purified rAlpA eluate is filtered through a 0.8 / 0.2 ⁇ m Supor Cap 100 type filter with a surface area of 1000 cm 2 under a laminar flow hood.
  • the volume of the sterile filtered concentrated bulk is approximately 4 L.
  • the degree of purity of the batch of AlpA thus obtained is evaluated in a conventional manner by SDS-PAGE, staining with Coomassie blue and reading of densitometry, as being greater than 90%.
  • the overall yield is estimated at around 50%.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) d'Hélicobacter selon lequel: (i) on met en contact une préparation AlpA et 2,5 à 3,5 M de guanidine avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes (CIH), de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel; et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 3,5 à 4,5 M de guanidine. La préparation d'AlpA destinée à être purifiée peut être notamment issue d'une culture d'E. coli, capable d'exprimer AlpA sous forme recombinante à un niveau élevé. rAlpA se présentant sous forme de corps d'inclusion, ces derniers sont récupérés et solubilisés en présence de guanidine, et éventuellement précipités au sulfate d'ammonium à des fins de purification préliminaire. La purification par CIH peut être poursuivie notamment par une chromatographie échangeuse d'anions en présence d'urée 8 M.

Description

PROCEDE DE PURIFICATION DE LA PROTEINE ADHESINE-LIKE A (ALPA) D' HELICOBACTER
L'invention a pour objet un procédé de purification de la protéine AlpA à' Hélicobacter, qui possède les caractéristiques requises pour une mise en œuvre à l'échelle industrielle.
Hélicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien qu'H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Hélicobacter, Gastrospirillum hominis a également été décrite chez l'homme.
Hélicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement ; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.
H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.
II apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à Hélicobacter.
A ce jour, plusieurs protéines d'Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et parmi celles-ci, la lipoprotéine AlpA (Adhesin-like lipoprotein A) d'origine membranaire. AlpA et le gène codant pour cette dernière ont été initialement divulgués dans WO 96/41880. Il restait donc à mettre au point un procédé de production et de purification qui permette de réaliser des lots de qualité pharmaceutique. Ainsi, l'objectif principal de la présente invention est de fournir un procédé simple et robuste qui puisse être mis en œuvre à l'échelle industrielle. Ce procédé doit notamment permettre de produire une quantité importante d'antigène sans avoir à réaliser des investissements coûteux.
E. coli est par excellence la bactérie utilisée à titre d 'organisme-hôte afin de produire toute sorte de protéines hétérologues par voie recombinante. Lorsque ces protéines ne sont pas solubles ou excrétées d'une manière ou d'une autre, elles peuvent s'accumuler sous forme de corps d'inclusion. Ces corps d'inclusion sont des corpuscules intra-cytoplasmiques propres à E. coli. L'apparition de ces corps d'inclusion est favorisée par un fort niveau d'expression (sur- expression). La purification des protéines recombinantes à partir des corps d'inclusion requiert notamment que ces corps d'inclusion soient solubilisés au préalable. Cette solubilisation est obtenue de manière usuelle avec un agent chaotropique (urée, guanidine) ou un détergent.
La protéine recombinante rAlpA, délibérément produite sous forme non-lipidée dans E.coli, garde encore une forte hydrophobicité. Cette forte hydrophobicité intrinsèque rend sa purification difficile par des moyens conventionnels. De plus, la protéine rAlpA se trouve dans les corps d'inclusion d'E. coli et la présence d'un agent chaotropique à forte concentration est quasi obligatoire tout au long de la purification.
Pour une solubilisation à pH neutre, la forte hydrophobicité d'AlpA nécessite une forte concentration de guanidine ; cet agent apparaît donc comme un facteur essentiel dans l'opération de solubilisation des corps d'inclusion. Néanmoins, cet agent qui supprime les interactions ioniques et hydrophobes, est habituellement peu utilisable pour la purification par chromatographie et devrait donc être éliminé.
D'une manière générale, les chromatographies d'interactions hydrophobes (CIH) sont couramment utilisées afin de purifier des protéines ayant un caractère hydrophobe marqué. Mais, ainsi que mentionné précédemment, lorsqu'une telle protéine se présente dans un milieu à forte concentration de guanidine, l'usage de ce type de chromatographie devient très problématique car la présence de guanidine doit normalement empêche l'adsorption. En effet, un très grand nombre de protéines pouvant s'adsorber dans des conditions classiques sur un support de CIH seraient éluées à forte concentration de guanidine. Or, en ce qui concerne AlpA, on a maintenant trouvé qu'il existait une étroite fenêtre de concentration en guanidine qui permettait à la fois le maintien de AlpA sous forme soluble et son adsorption sur un support de CIH. Cette fenêtre est comprise entre environ 2,5 et 3,5 M.
C'est pourquoi l'invention a pour objet un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) à' Hélicobacter e.g. H. pylori, selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 2,5 à 3,5 M de guanidine avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 3,5 à 4,5 M de guanidine.
De préférence, la préparation mise en contact avec le matériel de chromatographie contient 3 M de guanidine et AlpA est éluée avec 4 M de guanidine à pH neutre (6 - 8 ; e.g. 6,5 - 7,5).
Ainsi que mentionné précédemment, une préparation contenant AlpA en présence de guanidine peut être notamment issue d'un procédé de production selon lequel (a) on cultive une bactérie Gram-négative, notamment E. coli, capable d'exprimer AlpA sous forme recombinante, (b) on récupère les cellules bactériennes issues de la culture et on les lyse, (c) on récupère les corps d'inclusions contenus dans les cellules, on les lave et on les solubilise, et (d) de manière optionnelle, on précipite les corps d'inclusion, on élimine le surnageant et on solubilise le précipité.
Plus de détails sont donnés ci-après. Les bactéries récoltées après culture sont tout d'abord lysées. La lyse cellulaire peut être réalisée de différentes manières, notamment par microfluidisation. Selon un mode particulier, on peut aussi traiter les cellules à la benzonase au cours de la lyse, afin que l'ADN d'E. coli soit digéré. Les corps d'inclusion sont alors soumis à des lavages successifs ; de préférence dans un tampon contenant une forte concentration de sel afin éliminer les acides nucléiques et de dissocier au mieux rAlpA des contaminants ; de manière appropriée, il peut s'agir d'un tampon sodique e.g. un tampon contenant du NaCl 0,5 M. Les corps d'inclusion sont finalement dissous dans de la guanidine fortement concentrée e.g. de la guanidine 5,5 à 6,5 M, de préférence 6 M. Selon un mode particulier, on préfère éliminer à ce stade une partie des protéines bactériennes contaminantes (e.g. provenant d 'E. coli) en précipitant rAlpA de manière sélective par « salting out » au sulfate d'ammonium. De préférence, le sulfate d'ammonium est du sulfate d'ammonium 0,4 à 0,6 M, e.g. 0,5 M. Le précipité contenant rAlpA est solubilisé à nouveau dans de la guanidine fortement concentrée e.g. de la guanidine 5,5 à 6,5 M, de préférence 6 M. Afin de mettre en œuvre une chromatographie d'interactions hydrophobes, la préparation est diluée au Vz puis chargée sur une colonne appropriée.
La chromatographie d'interactions hydrophobes peut être mise en œuvre de manière conventionnelle en utilisant des supports tels que le Sepharose™ (Pharmacia) et le Fractogel™ (Merck) ou bien encore des supports équivalents à ces derniers tels que ceux trouvés chez Tosohaas ou Biorad. Le ligand peut être un butyl, octyl ou phenyl. La CIH permet notamment de séparer la protéine AlpA de ses produits de dégradation.
Selon un mode préféré, l' éluat issu de la CIH peut être concentré de différentes manières et notamment par ultrafiltration. Il convient aussi d'éliminer la guanidine qui est un produit toxique. A cette fin on peut mettre en œuvre une étape de diafiltration e.g. de diafiltration tangentielle, contre plusieurs volumes d'éluat de tampon neutre contenant de l'urée de molarité supérieure ou égale à 4 M, de préférence supérieure ou égale à 6 M, de manière préférée de l'urée 8 M ; l'urée étant présente pour assurer le maintien de rAlpA sous forme soluble. Selon un mode avantageux, on utilise 6 à 10 volumes d'urée 7,5 à 8,5 M.
Enfin, afin de parfaire la purification, on peut effectuer un « polissage » par chromatographie d'échanges d'ions, notamment par chromatographie échangeuse d'anions afin d'éliminer les contaminants résiduels provenant d'E. coli. Selon un mode approprié, cette dernière étape est réalisée en présence d'urée 8 M. La préparation de rAlpA issue de la diafiltration est alors appliquée sur du matériel de chromatographie échangeuse d'anions ; les contaminants sont adsorbés sur ce matériel tandis que rAlpA ne s'adsorbe pas et se retrouve dans le filtrat (aussi appelé éluat direct). La présence d'urée 8 M est indispensable pour les raisons suivantes : AlpA est une protéine chargée positivement (pi très élevé) et donc ne devrait pas normalement s'adsorber sur du matériel de chromatographie échangeuse d'anions. Mais son caractère hydrophobe est tellement marqué qu'elle s'adsorberait quand même si l'urée 8 M était absente de la préparation.
A cet égard, l'invention concerne également un procédé de purification de AlpA selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et de l'urée 7,5 à 8,5 M, de préférence 8 M, avec du matériel de chromatographie échangeuse d'anions de telle sorte que les contaminants s'adsorbent sur ce matériel et (ii) on récupère AlpA dans le filtrat. La chromatographie échangeuse d'anions peut être mise en œuvre de manière conventionnelle en utilisant des supports tels que le Sepharose (Pharmacia) et le Fractogel (Merck) ou bien encore des supports équivalents à ces derniers tels que ceux trouvés chez Tosohaas ou Biorad. Le ligand peut être une aminé tertaire telle que du DEAE (diéthyleaminoéthyle) ou quaternaire telle que le Q (quaternaire, hydroxypropylediéthyleaminoéthyle) et le TMAE (triméthyleaminoéthyle).
Le procédé de purification de AlpA faisant l'objet de la présente invention permet dans sa globalité d'atteindre un degré de pureté sans précédent pour la protéine considérée ; en particulier compte tenu de l'importante quantité traitée au départ. C'est pourquoi l'invention concerne également :
La protéine AlpA caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie. Le matériel restant autre que la forme monomérique est constitué de protéine AlpA sous forme multimérique. Le degré de pureté global étant supérieur ou égal à 99 %.
- Une préparation contenant au moins 5 g, de préférence au moins 10 g, de manière tout à fait préférée au moins 15 g de la protéine AlpA ; celle-ci étant caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie. Bien évidemment cette préparation doit constituer un lot ; c'est-à-dire avoir été obtenue à partir d'une culture unique et mise en œuvre singulière d'un procédé de purification.
De manière alternative, on a également trouvé que les corps d'inclusion pouvaient être solubilisés en remplaçant la guanidine par de l'urée 7,5 à 8,5, de préférence 8 M dans un tampon à pH basique, de préférence supérieur ou égal à 10,5, e.g. à pH 11. De manière avantageuse on utilise un tampon phosphate. Une fois réalisée la solubilisation, on abaisse la molarité de l'urée entre 4,5 et 5,5 M, e.g. 5 M ainsi que le pH, aux alentours de la neutralité e.g. à 7,5. Ceci peut être mis en œuvre en diluant avec un tampon Tris. Puis on réalise une CIH dans laquelle AlpA est éluée en urée 7,5 à 8,5 M, e.g. 8 M. C'est pourquoi l'invention a également pour objet un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) ά' Hélicobacter selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 4,5 à 5,5 M d'urée avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 7,5 à 8,5 M d'urée.
Exemple
Système d'expression
Un système d'expression inductible a été construit afin de produire la protéine AlpA d' Hélicobacter pylori dans E. coli. Le vecteur que l'on a utilisé est dérivé du plasmide pET28c (Novagen). Ce vecteur comprend : - une cassette d'expression sous le contrôle du promoteur du bactériophage T7,
- un polylinker destiné au clonage des gènes d'intérêt en aval du promoteur,
- un terminateur de transcription dérivé aussi du bactériophage T7, et
- un gène de résistance à la Kanamycine.
Le promoteur est régulé positivement en présence de la T7 RNA polymérase.
Aux fins d'expression, différentes souches d'E. coli modifiées génétiquement peuvent être utilisées, parmi lesquelles les souches BL21 λ DΕ3 (Studier, F.W. et al 1990 Meth. Enzymol 185, 60-69.). Ces souches contiennent le gène codant pour la RNA polymérase du phage T7 sous le contrôle du promoteur lac UV5, inductible par addition d'IPTG. De plus, la souche BL21λDΕ3 est déficiente pour les activités protéasiques OmpT et Lon.
Un fragment d'ADN de 1,6 Kb contenant la séquence codant pour la protéine AlpA mature a été obtenu par amplification PCR en utilisant la souche d' Hélicobacter pylori X47-2 (ORV 2001) en tant que source d'ADN. Les sites de restriction Ncol et Xhόl utilisés pour le clonage, sont inclus respectivement dans les amorces PCR 5' (HP3 Νco C-) et 3' HP3 (Xho). Le site de lipidation [codon Cysteine (TGC codon)] a été remplacé par un codon d'initiation ATG (Met). Le fragment amplifié par PCR a été d'abord clone dans le vecteur navette Topo TA (Invitrogen), puis transféré dans pΕT28c en utilisant les sites Ncol et Xhόl. Les conditions d'amplification par PCR étaient comme suit : 97°C / 30 s ; 55°C / 1 min ; 72°C / 50 s ; Vent DNA polymérase - 25 cycles.
Amorce 5' : 5' CATGCC4r(?GCTAGCATAAGTTATGCCGAA 3' Amorce 3 ' : 5 ' CCCJCG GCCTTTCTTAGAATGAAT ACCC AT A 3 '
Les sites Ncol et Xhol sont indiqués en italiques et les codons d'initiation ATG et de terminaison TAA (brin opposé) sont en caractères gras soulignés.
Préculture et Culture
Des erlens de 2 litres contenant chacun 500 mL de milieu Luria Broth (LB) 2X modifié (peptone remplacée par extrait de levure 30 g/L) et complémenté avec de la kanamycine 50 μg/mL, sont inoculés avec 500 μL d'un lot de semence E. coli BL21DΕ3/pMHp3.1 et sont incubés pendant 15-18 hrs à 37°C sous agitation 175 rpm.
Cette préculture sert à ensemencer un fermenteur de 30 L (B Braun) contenant le milieu SKYΕ 4 (pour un litre : extrait de levure 40 g ; MgCl2 1 M 3 ml ; K2SO 530 mg ; NaCl 1 g ; K2HPO4 844 g) complémenté avec du monohydrate de glucose 44 g/L et de la kanamycine 50 μg/mL. L'inoculum correspond à 5 % du volume total. Les paramètres de culture sont les suivants : pH : 7,00 ; régulation H3PO4 10% et NH4OH 28% ; température : 37 °C ; agitation initiale :
200 rpm ; débit d'air initial : 1 1/1 de culture/minute ; PO2 : 30%, régulation (1) agitation 200 rpm à 700 rpm (2) débit d'air 20% à 60% (3) débit O2 0% à 100%.
La culture est poursuivie pendant plus de 3 hrs. Lorsque la DO à 600 nm est comprise entre 25 et 35, on induit l'expression de AlpA par addition du volume d'IPTG (à 200 mM) nécessaire pour obtenir une concentration finale égale à 1 mM. Après 2 hrs d'induction, la culture est immédiatement refroidie. Les cellules sont récoltées par centrifugation 20 min à 7 000 g et les culots stockés à - 35°C. Préparation des corps d'inclusion
Mise en suspension des germes et traitement du culot humide
Cinq cent grammes de culot cellulaire (poids humide) (correspondant à environ 5 L de culture) sont décongelés une nuit à 5 ± 3°C et mis en suspension dans du tampon Tris 50 mM pH 8.0 préalablement refroidi à 5 ± 3°C à raison de 7. mL de tampon par g de culot de cellules soit 3.75 L pour 500 g. Le volume prévisionnel de cette suspension est de 4.25 L. Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax pendant 2 à 3 cycles de 30 à 60 sec. et à une température maintenue à 5 ± 3°C dans un bain glacé.
On prépare de manière extemporanée une solution de benzonase à 2.5 UI/μL à partir d'une solution mère à 250 UI/μL conservée à - 20°C, soit 20 μL + 1980 μL de tampon Tris 50 mM pH 8.0. Puis on ajoute de 1700 μL de cette solution dans 42.5 ml de MgCl2 à 100 mM. La totalité de cette préparation est versée dans la suspension de germes. Le mélange est incubé à 5 ±3°C sous agitation magnétique au moins 30 minutes.
Rupture des cellules
Les cellules ainsi homogénéisées sont cassées à l'aide d'un désintégrateur de cellules PANDA à une pression fixée à 1000 bars, avec 3 cycles de cassage et à une température ne dépassant pas 15°C, à l'aide du système de refroidissement (cryostat réglé à +5°C). Le rapport DO avant cassage/ DO après le dernier cassage doit être > 4.5.
Lavages des corps d'inclusion
La suspension des corps d'inclusions après 3 cycles de cassage est centrifugée à 10 000 g pendant 30 min. à 5 ± 3°C pour éliminer des contaminants (ADN, ARN et lipopolysaccharides ... ).
Après centrifiigation, le culot est récupéré puis remis en suspension dans 4.25 L de tampon phosphate sodique 50 mM, NaCl 0.5 M pH 7.0 refroidi à 5 ± 3°C. La concentration protéique est d'environ 8 g/L. La suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax dans un bain glacé de façon à maintenir la suspension à 5 ± 3°C puis laissée sous agitation magnétique 30 min à 5 ± 3°C. La suspension ainsi lavée est centrifugée à 10 000 g pendant 30 min à 5 ±3°C.
L'opération de lavage est renouvelée deux fois. On obtient ainsi environ 110 g de corps d'inclusion lavés soit environ 0,3 g de protéines par gramme de corps d'inclusion lavés. Le stockage est possible à - 20°C.
Purification à partir des corps d'inclusion
Solubilisation des corps d'inclusion
Les corps d'inclusions sont ensuite solubilisés dans du tampon Tris 50 mM, Guanidine 6 M pH 7.5. La concentration protéique finale à obtenir est de 20 g/L. Le volume de tampon à ajouter est donc d'environ 1,65 L.
Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax à 16 000 rpm puis sous agitation magnétique jusqu'à complète solubilisation, à une température maintenue à 22 ± 3°C. Le mélange est centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes à 22 +3°C minutes afin de clarifier la solution ; puis la solution est filtrée stérilement sur Spiral Cap 0.8/0.2 μm. Le volume du surnageant filtré est d'environ 1.6 L
Précipitation au sulfate d'ammonium
Le surnageant est dilué de moitié avec une solution de sulfate d'ammonium 1 M, Tris 50 mM pH 7.5 sous agitation magnétique. La solution ainsi obtenue est ajoutée en 30 minutes à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit lent et régulier pour obtenir une solution à 10 g/L de protéines contenant 0.5 M de (NΗ )2 SO4 en finale. On laisse sous agitation magnétique pendant 30 minutes à 22 ± 3°C. Puis l'incubation est poursuivie sans agitation une nuit (15 heures) à température du laboratoire pour permettre un mûrissement du précipité.
Le lendemain matin, le mélange est centrifugé 30 min à 10000 g à 22 ± 3°C. Le précipité est recueilli puis solubilisé à 10 g/L de protéines avec du tampon Tris 50 mM, Guanidine 6 M pH 7.5 sous agitation magnétique (Le volume prévisionnel après solubilisation est voisin de 3.2 L). Cette suspension est homogénéisée à l'Ultraturrax à 16 000 rpm puis sous agitation magnétique jusqu'à complète solubilisation, à une température maintenue à 22 ± 3°C.
Chromatographie d'interaction hydrophobe
Cette suspension est ensuite diluée au 1/2 par addition de tampon Tris 50 mM, NaCl 1.4 M pH 7.5 sous agitation magnétique. Ce tampon est ajouté en 30 minutes à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit lent et régulier pour obtenir une solution à 5 g/L de protéines contenant du Tris 50 mM, NaCl 0.7 M, Guanidine 3 M pH 7.5 en finale. On laisse sous agitation magnétique pendant 15 minutes à 22 ±3°C.
Le mélange est centrifugé à 10 000 g pendant 30 minutes à 22 ± 3°C afin de clarifier la solution ; puis elle est filtrée stérilement sur Supor Cap 0.8/0.2 μm. Le volume du surnageant filtré est d'environ 6 L.
La colonne utilisée possède les caractéristiques suivantes :
Colonne (Hi Prep butyl Sepharose FF Pharmacia - Amersham) de diamètre 20 cm et surface 314 cm2 ; Hauteur de gel voisine de 26 cm ; Volume de gel voisin de 8 L respectant la capacité de 3.2 g de protéines/mL de gel.
La colonne est préparée comme suit :
Le gel est lavé puis équilibré à un débit voisin de 60 mL/cm2.h (19 L/h) avec (i) 5 volumes de colonne d'eau ultrafiltrée, puis avec (ii) 3 volumes de colonne de tampon Tris 50 mM, Guanidine 3 M, NaCl 0.7 M pH 7.5. Les valeurs de conductivité et de pH du tampon en sortie de colonne doivent correspondre aux spécifications d'utilisation suivantes : Conductivité à 20°C = 135 ms/cm ± 15%, et (ii) pH = 7.5 ± 0.3,
La chromatographie est mise en œuvre comme suit :
La colonne est chargée par injection du filtrat (correspondant à 22 - 25 g de protéines totales) à un débit voisin de 60 mL/cm2.h (19 L/h). La colonne est ensuite rincée avec du tampon Tris 50 mM, Guanidine 3 M, NaCl 0.7 M pH 7.5 à un débit voisin de 90 mL/cm2.h (28 L/h) jusqu'au retour à la ligne de base (2 volumes de colonne). AlpA est ensuite éluée en tampon Tris 50 mM, Guanidine 4 M pH 7.5 à un débit de 90 mL/cm2.h (28 L/h) jusqu'au retour à la ligne de base (1 volume de colonne). Le volume d'éluat est d'environ 8 L. Concentration et diafiltration sur 30 kDa
Le module d'ultrafiltration est préparé comme suit :
On utilise 4 cassettes d'ultrafiltration en polyéthersulfone de seuil de coupure 30 kDa, chacune de surface voisine de 5000 cm2 (soit une surface totale de 20 000 cm2), pour concentrer environ 20 g de protéines. Ces cassettes sont lavées avec NaOH 0.5 N pendant 1 heure puis rincées avec de l'eau ultrafiltrée. Elles sont ensuite équilibrées avec du tampon Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7.5 pendant 5 min à l'aide d'une pompe de débit voisin de 80 L/h.
L 'éluat rAlpA est concentré en tampon Tris 50 mM, Guanidine 4 M pH 7.5, autour de 5 g/L en protéines (facteur de concentration ≈ 2.5). Les conditions de l'ultrafiltration sont les suivantes : (i) pression d'entrée voisine de 1 bar, et (ii) débit de l'ultrafiltrat de moitié celui du rétentat. Le volume de l'éluat concentré est d'environ 3.5 L.
L 'éluat rAlpA concentré est diafiltré contre 10 volumes de Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7.5 (35 L) dans les mêmes conditions que la concentration, à un débit d'environ 30 L/h, jusqu'à obtenir :
(i) une conductivité à 20°C du rétentat voisine de 2.8 mS /cm ± 15% correspondant à la conductivité du tampon urée 8 M ; et
(ii) une concentration protéique voisine de 5 g/L après 2 rinçages finaux successifs de l'ultrafiltrat par le tampon de diafiltration.
Le volume de l'éluat concentré diafiltré est d'environ 3.7 L.
Chromatographie d'échanges d'ions
La colonne utilisée possède les caractéristiques suivantes : Colonne (EMD TMAE Merck) de diamètre 7 cm et de surface 38.5 cm2 ; Hauteur de gel voisine à 18 cm ; Volume de gel voisin de 700 mL.
La colonne de chromatographie est préparée comme suit :
Le gel est lavé puis équilibré à un débit voisin de 4 L/h avec (i) 5 volumes de colonne d'eau ultrafiltrée, puis avec (ii) 3 volumes de colonne de tampon Tris 50 mM, Urée 8 M pH 7.5. Les valeurs de conductivité et de pH du tampon en sortie de colonne doivent correspondre aux spécifications d'utilisation suivantes : Conductivité à 20°C = 2.8 ms/cm ± 15%, et pH = 7.5 ± 0-3,
La chromatographie est mise en œuvre comme suit : La colonne est chargée par injection de l'éluat diafiltré correspondant à 15 - 17 g de protéines totales, à un débit de 100 mL/cm2.h (4 L/h) puis rincée avec du tampon Tris 50 mM, Urée 8 M, pH 7.5, même débit, jusqu'au retour à la ligne de base (6 volumes de colonne). Le filtrat ainsi collecté (environ 4 L) contient la protéine rAlpA pure à 90 ± 5% en l'absence d'endotoxines.
Filtration stérile 0.2 μm et stockage du produit final vrac
L'éluat rAlpA purifié est filtré sur filtre type Supor Cap 100 0.8/0.2 μm de surface 1000 cm2 sous hotte à flux laminaire. Le volume du vrac concentré filtré stérile est d'environ 4 L.
Le degré de pureté du lot de AlpA ainsi obtenu est évalué de manière conventionnelle par SDS- PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie, comme étant supérieur à 90 %. Le rendement global est estimé à 50 % environ.

Claims

Revendications
1. Un procédé de purification de la protéine adhésine-like A (AlpA) d' Hélicobacter selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et 2,5 à 3,5 M de guanidine avec un matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes de telle sorte qu'AlpA s'adsorbe sur le matériel et (ii) on élue AlpA avec une solution contenant 3,5 à 4,5 M de guanidine.
2. Un procédé selon la revendication 1, dans lequel la préparation mise en œuvre au point (i) contient 3 M de guanidine.
3. Un procédé selon la revendication 2, dans lequel la solution mise en œuvre au point (ii) contient 4 M de guanidine.
4. Un procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel la préparation mise en œuvre au point (i) est une préparation issue de la culture d'une bactérie Gram-négative, notamment E. coli, capable d'exprimer AlpA sous forme recombinante.
5. Un procédé selon la revendication 4, dans lequel la préparation mise en œuvre au point (i) est obtenue après rupture des cellules bactériennes, lavage et solubilisation des corps d'inclusion.
6. Un procédé selon la revendication 5, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion est réalisée en 5,5 à 6,5 M de guanidine.
7. Un procédé selon la revendication 6, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion est réalisée en 6 M de guanidine.
8. Un procédé selon la revendication 5, 6 ou 7, dans lequel la préparation mise en œuvre au point (i) est obtenue après rupture des cellules bactériennes, lavages et solubilisation des corps d'inclusion, précipitation au sulfate d'ammonium des corps d'inclusion solubilisés et solubilisation du précipité.
. Un procédé selon la revendication 8, dans lequel la solubilisation des corps d'inclusion et/ou du précipité est réalisée en 5,5 à 6,5 M de guanidine.
10. Un procédé selon la revendication 9, dans lequel la solubilisation du précipité est réalisée en 6 M de guanidine.
11. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel le matériel de chromatographie d'interactions hydrophobes comprend (i) un support qui est le
Sepharose ou le Fractogel et (ii) un ligand qui est du butyl, de l'octyl ou du phényl.
12. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel AlpA obtenue après l'élution mise en œuvre au point (ii) est mise en 7,5 à 8,5 M d'urée puis purifiée sur un matériel de chromatographie d'échanges d'ions.
13. Un procédé selon la revendication 12, dans lequel la mise d'AlpA en urée est effectuée par diafiltration de l'éluat obtenu au point (ii), et optionnellement concentré, contre 6 à 10 volumes d'urée 7,5 à 8,5 M.
14. Un procédé selon la revendication 12 ou 13, dans lequel AlpA obtenue après l'élution mise en œuvre au point (ii) est mise en urée 8 M.
15. Un procédé selon l'une des revendications 11 à 14, dans lequel le matériel de chromatographie d'échanges d'ions comprend (i) un support qui est le Sepharose™ ou le Fractogel™ et (ii) un ligand qui est une aminé tertaire ou quaternaire.
16. Un procédé de purification de AlpA selon lequel (i) on met en contact une préparation contenant AlpA et de l'urée 7,5 à 8,5 M, de préférence 8 M, avec du matériel de chromatographie échangeuse d'anions de telle sorte que les contaminants s'adsorbent sur ce matériel et (ii) on récupère AlpA dans le filtrat.
17. La protéine AlpA caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS-PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie.
8. Une préparation contenant au moins 5 g de la protéine AlpA ; celle-ci étant caractérisée par un degré de pureté supérieur ou égal à 90 % de monomère, tel que mesuré par SDS- PAGE, coloration au bleu de Coomassie et lecture de densitométrie.
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