JPH09510953A

JPH09510953A - ヘモグロビンの精製

Info

Publication number: JPH09510953A
Application number: JP7514518A
Authority: JP
Inventors: イー．ミルネ，エリン; アール．ライランド，ジェイムズ; エイチ．マシューズ，モウラ−アン; ピー．アーンスト，ウルリッチ; ダブリュー．トレイラー，デイビッド; ジェイ．マシューズ，アントニー; オー．ニーウェイ，ジャスティニアン
Original assignee: ソマトジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-15
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 1997-11-04
Also published as: AU1176795A; NO961959L; CA2176494C; FI962041A; AU700366B2; NO961959D0; CA2176494A1; WO1995014038A2; FI962041A0; US5665869A; WO1995014038A3; EP0729475A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、純粋なヘモグロビン溶液、特に、組換え系でのヘモグロビンの発現に由来する純粋なヘモグロビン溶液、およびその組成物の産生の方法に関する。本方法はまた、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を生じるための迅速な加熱を用いた混入ヘモグロビンの除去、ならびに部分的に精製されたヘモグロビン溶液を生じるための大量の細菌タンパク質の除去およびそれと同時のヘモグロビン含有粗出発物質の精製について開示される。部分的に精製されたヘモグロビン溶液のさらなる精製、およびヘモグロビン溶液中の金属混入物の除去のための方法も、必要であるならば、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヘモグロビンの精製本出願は、1993年７月23日に出願されたChiversおよびBelvl、出願番号08/097 ,273および1993年11月15日に出願されたRyland,Matthews,Ernst,Houk,Traylor,W illiams,Mitchell,ChiversおよびBelvl、出願番号08/153,071の一部継続出願であり、両方はSomatogen,Incにより所有される。発明の分野本発明はヘモグロビン、特に組換えヘモグロビンの精製のための方法に関する。発明の背景重篤な失血は、失った液体の容積の補充および酸素運搬能力の補充の両方を必要とする。これは、代表的には濃縮されたRBCまたは全血の単位のいずれかとして、赤血球を輸血することにより達成される。しかし、献血される血液を患者に輸血することがいつも、可能である、実用的である、または望ましいわけではない。ヒト血液が利用できない場合、コロイドおよびクリスタロイド溶液のような血漿増量剤（plasma expander）を利用して、容積を補充し得る。しかし、現在ヒトへの使用が承認されている容積補充治療のいずれもが、酸素を運搬し得ない。このような場合、赤血球代替物（例えば、赤血球と同じように効果的に酸素を運搬するヘモグロビン溶液）の使用が所望される。ヘモグロビン溶液の投与は、血漿容積を増加および／または保持し、そして従来の血漿増量剤と同じ様式により血液粘性を減少させる。しかし、さらにヘモグロビンを基本とした赤血球代替物の投与は、肺から末梢組織への適切な酸素の運搬を支持し得るべきである。この能力を有する現存する唯一の治療法は、ヒト血液輸血である。しかし、ヒト血液輸血は、多くの危険性および制限に関係づけられている。その内のいくつかのみを以下に記す：１）伝染病の伝達の危険性（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、非A非 B 型肝炎、B型肝炎、Yersinia enterocolitica、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１）２）免疫反応の危険性（すなわち、穏やかな溶血性輸血反応から致命的な輸血反応まで、免疫抑制、対宿主移植片反応）３）投与前のタイピングおよび交差試験の要求４）限定された利用可能性５）限定された安定性（42日間以下の保存寿命；凍結され得ない）赤血球の酸素を運搬する構成成分は、タンパク質分子ヘモグロビンである。ヒトヘモグロビンA₀（自然に生じるまたは天然のヘモグロビンとして知られる）は、２つの同一のαグロビンサブユニット（α₁、α₂）および２つの同一のβグロビンサブユニット（β₁、β₂）からなる四量体のタンパク質分子である。ヘム分子がαおよびβグロビンのそれぞれに取り込まれている。ヘムは鉄原子に配位結合した大きな有機分子である。ヘモグロビン四量体において、それぞれのαグロビンはβグロビンと会合し、２つの安定なα／β二量体を形成する。そして、それらは引き続いて会合し、四量体を形成する。サブユニットは非共有結合的にファンデルワールス力、水素結合および塩橋を通じて会合する。脱酸素された（「デオキシ」、または「緊張した（tense）」を示す「Ｔ」）状態において、４つのサブユニットは４面体を形成する。リガンドが結合する間、α₁β₁とα₂β₂との境界面は比較的固定されたままであり、一方α₁β₂とα₂ β₁との境界面はかなりの運動性を示す。ヘモグロビン分子が酸素添加されているときには、サブユニット間の距離は脱酸素された距離と比較して増加し、そして分子は「Ｒ」配置（弛緩した（relaxed）状態）をとる。それは、リガンドがヘムに結合しているときには、優性な分子形態である。遺伝子工学技術は、多数の生物学的発現系（例えば、昆虫細胞、植物細胞、トランスジェニック細胞、酵母系および細菌系）における異種のタンパク質の発現を可能にした。ヘモグロビンのαおよびβグロビンの配列が公知であり、そして効率的な発現基準が決定されているので、任意の適切な生物学的タンパク質発現系を大量の組換えヘモグロビンを産生するために利用し得る。実際に、ヘモグロビンは、多数の生物学的な系において発現されており、それは細菌（Hoffmanら、 WO90/13645号）、酵母（De Angeloら、WO93/08831号およびWO91/16349号; Hoffm anら、WO90/13645号）およびトランスジェニック哺乳動物（Loganら、WO92/2264 6号; Townes，T.MおよびMcCune，S.L.，WO92/11283号）を含む。これらの系でのヘモグロビンの異種発現は高水準で達成され得るが、ヘモグロビンの薬学的使用のために要求される最終産物の極限レベルの純度への精製は困難なままである。それにもかかわらず、ヘモグロビンは、これらの発現系のいくつか、ならびに期限切れの（outdated）ヒトおよび哺乳動物の赤血球から精製されている。ヘモグロビンの精製は一般的に、細胞マトリックスからヘモグロビンを遊離するためのいくつかの溶解工程、混入している可溶性および非可溶性のタンパク質、脂質、膜、などを除去するための低分解能分画の工程（例えば、濾過、遠心分離、pH 依存性沈澱、加熱）、およびそれに続くクロマトグラフィーの最終的な精製工程のなんらかの形態を少なくとも要求する。例えば、ヘモグロビンは、赤血球の溶血とそれに続く以下の工程により、期限切れのヒト赤血球から単離、精製されている。陽イオン交換クロマトグラフィー（Bonhard，K.ら、米国特許第4,439,357 号）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Tayot,J.L.ら、欧州特許公開第0 132 178号; Shorrら、米国特許第5,264,555号）、アフィニティークロマトグラフィー（Hsia，J.C.，欧州特許第0 231 236 B1号）、ミクロ孔性膜を通した濾過（Ra biner，S.F.ら、(1967)J．Exp．Med．126: 1127-1142号）、残渣の混入物を沈澱させるための半精製されたヘモグロビンの脱酸素された溶液の緩徐な加熱（Este p，T.N.，PCT特許公開 PCT/US89/014890号，Estep，T.N.，米国特許第4,861,867 号）、多価イオンおよび多硫酸塩（polysulfate）の添加による混入物の沈澱（S immonds，R.SおよびOwen，W.P.，米国特許第4,401,652号）または亜鉛を用いたヘモグロビン自身の沈澱およびそれに続く再懸濁（Tye,R.W.，米国特許第4,473, 494号）。ヘモグロビンは他の供給源（例えば、ウシ血液）からも精製され、そして上の方法のいずれかまたはミクロ孔性濾過、限外濾過および最終的なイオン交換クロマトグラフィー（Rausch，C.W.およびFeola，M.，欧州第0 277 289 B1 号，Rausch，C.W.およびFeola，M.，米国特許第5,084,558号）または限外濾過単独（Kothe，N.およびEichentopf，B.，米国特許第4,562,715号）により処理される。トランスジェニック動物で産生された組換えヘモグロビンは、等電点クロマトグラフィーにより精製されている（Townes，T.M.およびMcCune，S．L.，PCT特許公開 PCT/US/09624号）。しかし、これらの技術は一般的に赤血球の出発物質からのヘモグロビンの精製に関連しており、酵母および細菌細胞のような組換え供給源由来の物質の精製には適さない。微生物発現系で産生された組換えヘモグロビンの精製は、微生物細胞の溶解の過程で、微生物のタンパク質、細胞性成分、そして特に細菌性リポ多糖（菌体内毒素）による発現されるタンパク質の非常に大量の混入による独特の問題を持ち出している。これら非ヘモグロビン成分の全ては、哺乳動物への極僅かの量での投与でさえ発熱性反応を誘発し得、そして敗血症および死にさえも導き得る（Rietschel，E.T.およびBrade，H.(1992)Scientific American 267: 54- 61; Suffredini，A.F.ら、（1989）New Eng.J.Med.，321: 280-287）。ヘモグロビンからの全ての細菌性混入物の除去の必要性は、ヘモグロビンおよび菌体内毒素の共投与が菌体内毒素単独の毒性と比較して菌体内毒素の死亡率を増強させるという観察の観点からもさらに急を要する（White，C.T.ら、(1986)J.Lab．Clin . Med．108: 132-137; Chang，T.M.S.ら、（1990）Biomat.,Art.Cells,Art.Org, 18(2): vii-viii）。細菌性成分由来の混入物の問題は、C.W．RauschおよびM．Feola、米国特許第5 ,084,558号に明確に例示されている。彼らは、特別な（extra）または超高純度の（ultrapure）ヘモグロビン血液代替溶液のために用いられる出発物質（ウシ赤血球）が、細菌性の混入を比較的含まないはすであると教示し、そして「細菌の導入を避けることおよび菌体内毒素を含まないまたは低い菌体内毒素レベルの物質の維持が重要である」と明記する（13欄、29〜31行）。彼らはさらに「（血液の）菌体内毒素レベルが１mlあたり６〜７EU（菌体内毒素単位）よりも高い場合、その血液は廃棄される」と明記する（13欄、57〜58行）。250EU/mlよりいくぶん sch，J.およびHeimburger，N.，米国特許第5,136,026号）。しかし、異種タンパク質を微生物系（特に細菌系）で発現させ、発現したタンパク質を遊離させるためにその細胞を溶解させるときには、結果として生じる溶解液中の菌体内毒素の混入は１mlあたり数百万EUである。従って、微生物系で発現されたヘモグロビンの精製のために利用される任意の精製技術は、大量の菌体内毒素混入物を少量で、薬学的に受容可能なレベルに減少させ得なければならない。さらに、商業用使用のために精製技術は拡大可能（scalable）および経済的でなければならない。さらに、細菌系の溶解は代表的には結果として生じる溶液中で還元環境を生じ、従って溶解した微生物細胞からのタンパク質の精製のために開発される任意の精製系は、還元環境下で利用可能でなければならない。多数の精製系がタンパク質溶液中の混入細菌性成分の量を減少させるために開発されている。例えば、細菌細胞溶解液（特にE.coli溶解液）の加熱は、組換え工学に由来するタンパク質の精製に利用される通常の技術である。しかし、細菌細胞の溶解後に溶液中の物質を加熱することは、一般的に公知の熱安定タンパク質の精製に制限されている。この技術は大部分の細菌タンパク質と異種タンパク質の間の温度安定性の違いを利用する。例えば、Tanakaおよび共同研究者ら（Ta nakaら、（1981）Biochemistry 89:677-682）は、好熱性細菌由来の3-イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをE.coli内で発現させ、粗溶解液を70℃で10分間加熱することにより、この酵素を精製した。彼らは、これが迅速にタンパク質を精製するための単純で効果的な手順であることを記載し、さらに「高度好熱菌の酵素は宿主として用いたE.coliのタンパク質のほとんどが熱変性し沈澱する条件で安定である」と明記する。．．．これらの観察は任意の好熱性酵索が問題の遺伝子をE.coliにクローニングすることにより比較的容易に精製され得ることを示唆する。 Tsukagoshiおよび共同研究者ら（Tsukagoshiら、(1984)Mol.Gen.Genet．193:5 8-63）はまた、E.coliで発現される熱安定性タンパク質を精製したが、彼らは、彼らが精製したαアミラーゼの熱安定性はリガンド依存性であることを見出した。Ca⁺⁺非存在下での熱安定性はCa⁺⁺在下より約10℃低かった（61頁図５参照）。結果として、これらの研究者らは、酵素の安定性を増強するため、そしてより多くの活性を回収するために、加熱前にCa⁺⁺を培地に加えた。さらに、この文献はまた、問題のタンパク質が、混入E.coliタンパク質よりも熱安定である、または熱安定になるようにするために、培地条件を操作し得ることを証明した。これらの系が混入タンパク質の大部分の熱安定性と目的のタンパク質の熱安定性との間の十分な違いを必要としていることに留意すべきである。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）はまた、タンパク質精製の分野において広範囲にわたって使用されている。例えば、組換えヒトインターロイキン-4は、インターロイキン-4が結合する亜鉛チャージしたIMACにpH7.2 でブロスを通過させること、および0.5M NaClまたは50mM EDTAを用いて溶出することにより粗発酵ブロスから精製されている（Tang，J.C.T.ら、米国特許第5,07 7,388）。哺乳動物系で発現されたインターロイキン-2およびインターフェロン γは陽イオン交換クロマトグラフィーおよびそれに続く亜鉛チャージしたIMACを用いて精製されている（Georgiades，J．A.およびGumulka，J．米国特許第4,723 ,000）。比較的純粋なインターロイキン-2、インターフェロンγ溶液をIMACカラムにロードし、そしてインターロイキンおよびインターフェロンがカラムを素通りする間に混入物をカラム物質に結合させることにより流出物から除去した。溶出は必要ではなかった。組換え産生された可溶性CD4レセプターもまたIMACを用いて精製されている（Staples，M.A.およびPargellis，C.A.，米国特許第5,169, 936号）。混入物は部分的に精製された出発溶液から塩およびより高濃度のIMAC をチャージする金属に対する弱いリガンドを用いて溶出することにより除去された。IMACはまた、比較的に純粋なタンパク質の混合物を個々の成分に分離するために用いられている（Kato，Y.ら(1986)J.Chrom．354:511-517）。水性二相金属アフィニティー抽出が、可溶性銅チャージ、ポリエチレングリコールチャージした二座のキレート剤を可溶性ヘモグロビンと錯体形成させること、およびヘモグロビンを可溶性キレート剤と錯体形成させて分配した二相系を生じさせることにより、ヘモグロビンを精製するために用いられている（Wuenschell，G.E.ら、(1 990)Bioprocess Eng．5: 199-202）。しかし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーは、いかなるヘモグロビン、特に組換え産生されたヘモグロビンの精製にも使用されていない。さらに、IMACを使用して、同時に溶解液からヘモグロビンを99％より高い純度に精製しながら1000倍より高いE.coliタンパク質の除去を達成していない。金属がヘモグロビン溶液に混入し得る（Marshallら、(1993)Blood Substitute s and Oxygen Carriers，Chang(編)、Marcel Dekker，Inc.，New York,pp.267- 270）。この種類の混入は多数の異なる方法論を用いて除去され得るが、特定の溶液のための特定の方法の成就は予知不可能である。例えば、様々なキレート樹脂が様々な金属（ニッケルを含む）を溶液から分離するために用いられているが、そのような分離の多くの場合は非常に低いpHでのみ効果的であり、従ってヘモグロビン溶液での使用には不適切である（FiguraおよびMcDuffie，(1977)Anal.C hem．49: 1950-1953; Darnallら、(1986)Envir.Sci.Tech．20:206-208; Vernon, (1977)Chem.and Industry 15: 634-637; MoyersおよびFritz，(1977)Anal.Chem ．49: 418-423; Yipら、(1989)Anal.Biochem．183: 159-171; Yalpani, M.およびAbdeel-Malik，M.M.，米国特許第4,952,684号）。エチレンジアミン四酢酸（E DTA）のような金属キレート剤がまた、溶液から金属の混入を除去するために用いられている。しかし、これらのキレート剤は全ての金属混入を除去するために必要とされる濃度では有毒であり得（Heindorff，K.ら、(1983)Mutation Res．1 15: 149-173）、そしてヘモグロビン分子の酸化を増強し得る（Kikugawa，K.ら、(1981)Chem.Pham.Bull．29:1382-1389）。本発明は、薬学的に受容可能なレベルの純度の、効率的なヘモグロビンの産生を提供する。赤血球由来のヘモグロビンの精製における使用に適切である現在の精製技術（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）は、少量のE.coli由来の物質を除去し得るが、組換え産生されたヘモグロビンの精製の間に直面する大量の細菌性の混入を除去するためには効果的ではない。同様に、組換え産生されたタンパク質の精製のために開発された技術は、妥当な細菌性混入物除去を確証するために並外れたレベルの精製を提供する必要性、および適切な量のヘモグロビンを産生するためにこれらのプロセスを経済的に拡大する困難さの両方の理由により、ヘモグロビンに適用できない。発明の要旨本発明は部分的に精製されたヘモグロビン溶液の産生の方法に関し、その方法は以下の工程を包含する： a）ヘモグロビン含有溶解液を7.0より大きいpHで二価の金属イオンでチャージした固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させる工程、 b）第一の適切な緩衝液で樹脂を洗浄する工程、 c）第二の適切な緩衝液で樹脂を洗浄する工程、および c）第二の適切な緩衝液より高いpHの、キレート剤、または競合リガンドの溶液を用いて樹脂から部分的に精製されたヘモグロビン溶液を溶出する工程。ヘモグロビン含有溶解液は、好ましくは、明澄化したヘモグロビン含有溶解液であり、最も好ましくは実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液である；溶解液または溶液は好ましくは約7.5と約8.5との間のpHであり、好ましくは8.0〜8.35である；固定化金属クロマトグラフィー樹脂は約7.5より大きいpHおよび約25mS/cmより大きな伝導率を有する第一の適切な緩衝液、好ましくはTris/NaCl、より好ましくは約25〜50 mS/cmの伝導率を有する20 mM Tris/0.5M 〜0.75 M NaCl，pH 7.5〜8.5、最も好ましくは約46 mS/cmの伝導率を有する20mM Tris/500 mM NaCl，pH 8.3または約35 mS/cmの伝導率を有する20 mM Tris/750 mM NaCl，pH8.0で洗浄される；第二の適切な緩衝液は第一の適切な緩衝液と同一であるかまたは異なり、そして好ましくは第一の適切な緩衝液よりも低い伝導率を有し、より好ましくは２〜６ mS/cmの間の伝導率および7.6より大きいpH、より好ましくは7.6と8.5の間のpHを有する；より好ましくは約2.5〜５mS/cmの伝導率を有し、最も好ましくは第二の洗浄緩衝液は10mM Tris，25〜50 mM NaCl，pH 約8.0〜8.3である；好ましくは部分的に精製されたヘモグロビン溶液は、キレート剤、より好ましくはEDTA、さらにより好ましくは5〜30 mM EDTA、最も好ましくは10〜20 mM EDTAを用いてカラムから溶出され、そしてキレート剤または競合リガンドは７より大きいpHであり、より好ましくは８より大きいpHであり、最も好ましくは約pH8.5である。本発明の目的のために、全ての伝導率およびpH測定は８℃におけるpHおよび伝導率に標準化されていることに留意のこと。本発明はさらに、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液の産生のための方法を包含し、その方法は以下の工程を包含する：（a）ヘモグロビン含有細胞を溶解してヘモグロビン含有粗溶解液を産生する工程、（b）ヘモグロビン含有粗溶解液中のヘモグロビンを熱安定状態に変換する工程、（c）残存する細菌細胞の大部分を死滅させ、微生物性混入物および細胞片（c ell debris）を沈澱させ、混入ヘモグロビンを沈澱させ、そして特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを沈澱させるために十分な時間および十分な温度でヘモグロビン含有粗溶解液を加熱する工程、（d）ヘモグロビン含有粗溶解液から、沈澱した微生物性混入物および細胞片、沈澱した混入ヘモグロビンおよび特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを機械的に除去して実質的にプコトポルフィリンを含まないヘモグロビン溶液を産生する工程。ヘモグロビン含有細胞は好ましくは非赤血球であり、より好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはE.coli細胞であり、ヘモグロビン含有粗溶解液中のヘモグロビンはＲ状態またはＴ状態、最も好ましくはＲ状態に、好ましくは酸素、酸化窒素および一酸化炭素からなる群から選択される、最も好ましくは一酸化炭素であるリガンド化気体（liganding gas）を添加することにより変換され、そして沈澱した微生物性混入物、細胞片、沈澱した混入ヘモグロビンおよび特に沈澱したプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンは、ヘモグロビン含有粗溶解液からクロマトグラフィーまたは固体−液体分離技術により、より好ましくは濾過により、最も好ましくは回転ドラム真空濾過により機械的に除去される。本発明はさらに、実質的に精製されたヘモグロビン溶液を産生するための方法を提供し、その方法は以下の工程を包含する： a）部分的に精製されたヘモグロビン溶液を第一の適切な緩衝液に緩衝液交換して緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を産生する工程、 b）緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を陰イオン交換樹脂上にロードする工程、 c）緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液でロードした陰イオン交換樹脂を第一の適切な緩衝液を用いて洗浄する工程、 c）部分的に精製したヘモグロビン溶液をロードした陰イオン交換樹脂を第一の適切な緩衝液よりも低いpHを有する洗浄緩衝液を用いて洗浄する工程、 d）洗浄緩衝液よりさらに低いpHを有する溶出緩衝液を用いて、陰イオン交換樹脂から、緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を溶出して実質的に精製されたヘモグロビン溶液を産生する工程。好ましくは適切な緩衝液は、適切な陽イオンの緩衝液、好ましくはpH 8.5〜9. 5および200〜800 μS/cmの伝導率を有するTris緩衝液、最も好ましくは20 mM Tr is緩衝液、pH約8.9、伝導率約400 μS/cmであり；好ましくは陰イオン交換樹脂は強陰イオン交換樹脂、好ましくはSepharose Q Fast Flow樹脂であり；好ましくは洗浄緩衝液は適切な陽イオン交換緩衝液、好ましくはpH8.5未満のTris緩衝液、より好ましくはpH 7.6〜7.9、好ましくは10〜15 mM Tris緩衝液、最も好ましくは12 mM Tris，pH 7.7、好ましくは約600〜800 μS/cmの間の伝導率、最も好ましくは約700 μS/cmの伝導率を有し；好ましくは部分的に精製されたヘモグロビン溶液は洗浄緩衝液より低いpHの溶出緩衝液、より好ましくはTris緩衝液、より好ましくは550〜1200 μS/cmの間の伝導率を有する10〜15 mM Tris緩衝液pH 7.4〜7.7、より好ましくは550μS/cmと850μS/cmとの間の伝導率、最も好ましくは700 μS/cmの伝導率を有する、12 mM Tris緩衝液、pH 7.5を用いて溶出される。実質的に精製されたヘモグロビン上のリガンドが上の工程の後に交換され、酸素添加された、実質的に精製されたヘモグロビン溶液を産生し得ることに留意のこと。本発明はさらに任意の微量の金属（特にニッケル）の除去による純粋なヘモグロビン溶液の産生のための方法を包含する。その金属は、任意の製造または精製のプロセスの間に導入され得、そのプロセスは以下の工程を包含する： a）バッチ添加または限外濾過により、実質的に精製されたヘモグロビン溶液にキレート剤を添加する工程、 b）任意の適切な技術により、実質的に精製されたヘモグロビン溶液を適切な製剤緩衝液に緩衝液交換して純粋なヘモグロビン溶液を産生する工程。実質的に精製されたヘモグロビン溶液へのキレート剤の添加は、最も好ましくはキレート剤のバッチ添加により実施され、ここでキレート剤はEDTAおよびジエチルアミントリアミン五酢酸（DTPA、五酢酸（penta acetic acid）としても知られる）；好ましくは実質的に精製されたヘモグロビン溶液は限外濾過により緩衝液交換される。好ましくは適切な製剤緩衝液は、150 mM NaCl、5mMリン酸ナトリウム、約0.025〜0.035％ Tween、１mMアスコルビン酸塩または2.5 mM未満の亜ジチオン酸塩、50 mM未満の炭水化物、２％未満のポリエチレングリコール、pH 約７である。本発明はまた、純粋なヘモグロビン溶液の産生のための方法もさらに包含し、その方法は以下の工程を包含する： a）ヘモグロビン含有E.coli細胞を溶解してヘモグロビン含有粗溶解液を産生する工程、 b）一酸化炭素を添加することにより、ヘモグロビン含有粗溶解液中のヘモグロビンをＲ状態ヘモグロビンに変換する工程、 c）残存する細菌細胞の大部分を死滅させ、微生物性混入物および細胞片を沈澱させ、混入ヘモグロビンを沈澱を沈澱させ、そして特にプロトポルフィリンIX 含有ヘモグロビンを沈澱させるために十分な時間および十分な温度でヘモグロビン含有粗溶解液を加熱する工程、 d）ヘモグロビン含有粗溶解液から、沈澱した微生物性混入物および細胞片、沈澱した混入ヘモグロビンおよび特に沈澱したプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを機械的に除去して実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を産生する工程、 e）実質的にプロトポルフィリンIX非含有ヘモグロビン溶液をpH約8.0〜8.3で亜鉛でチャージした固定化金属アフィニティー樹脂に結合させる工程、 f）少なくとも４カラム量の約20 mM Tris/500〜750 mM NaCl，pH約8.0〜8.3，伝導率約35〜50 mS/cmを用いて固定化金属アフィニティー樹脂に結合した実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を洗浄する工程、 g）少なくとも４カラム量の約10 mM Tris/25〜50 mM NaCl，pH約8.0〜8.3，伝導率約2.5〜4.5 mS/cmを用いて固定化金属アフィニティー樹脂に結合した実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を洗浄する工程、 h）pH約8.5の約15 mM EDTAを用いて、固定化金属アフィニティー樹脂に結合した実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を溶出して部分的に精製されたヘモグロビン溶液を産生する工程、 i）部分的に精製されたヘモグロビン溶液をpH約8.9の20 mM Trisに緩衝液交換して、緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を産生する工程、 j）緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を陰イオン交換樹脂にロードする工程、 k）20 mM Tris緩衝液、pH約8.9、伝導率約400 μS/cmを用いて、緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液がロードされた陰イオン交換樹脂を洗浄する工程、 l）約12 mM Tris緩衝液pH約7.7、伝導率約700 μS/cmを用いて、緩衝液交換された、部分的に精製されたヘモグロビン溶液がロードされた陰イオン交換樹脂を洗浄する工程、 m）約550〜800 μS/cmの間の伝導率を有する12 mM Tris緩衝液、pH 7.5を用いて、陰イオン交換樹脂を溶出して実質的に精製されたヘモグロビン溶液を産生する工程、 n）加圧下で酸素を導入することにより、実質的に精製されたヘモグロビン溶液を酸素添加する工程、 o）EDTAおよびDTPAからなる群から選択されるキレート剤のバッチ添加により、精製されたヘモグロビン溶液中の任意の金属の混入を除去する工程（そのような金属の除去が必要である場合）、 p）キレート剤を除去する工程（そのような金属の除去が必要である場合）、および同時に、精製されたヘモグロビン溶液を適切な製剤緩衝液に緩衝液交換する工程。本発明の他の局面は本質的に純粋なヘモグロビン溶液および薬学的組成物に関し、好ましくはそのような溶液は、組換えヘモグロビンの精製から得られ、そしてそのような組換えヘモグロビンは特に本発明の方法により得られる。本特許の解釈を手助けするために、他に示されない限り、本明細書に添付される請求項を含め、本特許を通じて、以下の用語は以下の意味を有する。「ヘモグロビン」または「ヘモグロビン様タンパク質」は、（a）２つのα様グロビンおよび２つのβ様グロビン、（b）１つのジα様グロビンおよび２つの β様グロビン、（c）２つのα様グロビンおよび１つのジβ様グロビン、（d）１つのジα様グロビンおよび１つのジβ様グロビン、（e）１つの融合したα様／ β様グロビンおよび分離したα様およびβ様グロビン、または（f）２つの融合したα様／β様グロビンからなる、１つまたはそれ以上の四量体を包含する。１つの四量体のグロビンは、他の四量体のグロビンと架橋結合されるかまたは遺伝学子的に融合され得る。ヘモグロビンまたはヘモグロビン様タンパク質において、天然または組換え供給源のどちらに由来するにせよ、ＲまたはＴ状態のいずれにあるにせよ、α様グロビンおよびβ様グロビンのそれぞれはヘムまたはプロトポルフィリンIX補欠分子族を含有し得る。「遺伝子的に融合されたヘモグロビン」は、少なくとも１つの「遺伝子的に融合されたグロビン様ポリペプチド」を含有するヘモグロビン様タンパク質を意味し、後者は２つ以上のグロビン様領域、例えばジα様グロビンまたはβ様グロビンを含み、そしてそれらは同一または別であり得る。「ジα様グロビン」は、本質的に、第一のα様グロビン（ドメイン）のＣ末端と第二のα様グロビン（ドメイン）のＮ末端との間のペプチド結合により連結された２つのα様グロビン配列（ドメイン）からなる物質である。α様グロビン（またはそのドメイン）は天然のヒトαグロビンに対して少なくとも約75％の配列同一性を有する。しかし、より小さい配列同一性を有するポリペプチドは、それが偶然から予測され得るよりも高い配列同一性を有し、しかもαグロビンの特徴的な高次構造および同様の生物学的活性を有する場合、依然としてαグロビンと実質的に相同的であると考えられ、従ってα様グロビンであり得る。同様に、β 様グロビン（またはそのドメイン）は天然のヒトβグロビンに対して少なくとも約75％の配列同一性を有する。しかし、より少ない配列同一性を有するポリペプチドは、それが偶然から予測され得るよりも高い配列同一性を有し、しかもβグロビンの特徴的な高次構造をおよび同様の生物学的活性を有する場合、依然としてβグロビンと実質的に相同的であると考えられ、従ってβ様グロビンであり得る。ジα様グロビンにおいて、２つのα様グロビン配列は直接連結されるか、または１以上のアミノ酸のペプチドリンカーにより連結され得；用語「ペプチド結合」は両方の可能性を包含することが意図される。ペプチド結合以外によりＮおよびＣ末端で架橋されたα様グロビン鎖（例えば、4,4'-ジイソチオシアネートスチルベン-2,2'-ジスルホネート，DIDS）はジα様グロビンではない。ジα様グロビンは好ましくは、βグロビンとともに折りたたまれ得、このタンパク質中の全てのグロビンはヘムを取り込んで、機能的なヘモグロビン様タンパク質を形成し得る。「ジβグロビン様ポリペプチド」は同様に定義される。「rHb1.1」は、１つのジα様グロビンおよび２つのβ様グロビンを意味し、ここで、２つのα様グロビンは、第一のα様グロビンのＣ末端と第二のα様グロビンのＮ末端の間の単一のグリシンにより連結され、β様グロビンはPresbyterian 変異、βN108-〉Kを含み、そして両方のβ様グロビンおよびジα様グロビンは、 N末端にval-〉met変異を含む。「組換えヘモグロビン」は天然型であるか変異体であるかに関わらず、α様グロビンタンパク質およびβ様グロビンタンパク質を包含し、少なくともその１方が、ヘモグロビン遺伝子および／またはヘモグロビンタンパク質が天然に見出される細胞以外の細胞（すなわち、ヘモグロビン遺伝子が発現される宿主に対して異種である）内の組換えDNA分子により保有されるグロビン遺伝子の発現により得られるヘモグロビンを意味する。それゆえ、ヒト赤血球以外の任意の細胞内での任意のヒトヘモグロビン遺伝子の発現は、組換えヘモグロビンであると考えれ得る。さらに、任意の非脊椎動物、または発現されるヘモグロビンが自然に生じる脊椎動物以外の任意の脊椎動物の任意種内での、脊椎動物ヘモグロビンの発現は、組換えヘモグロビンであると考えられる。変異が自然に生じる種以外の任意の種内における自然に生じる任意のヘモグロビン変異体の発現は、組換えヘモグロビンであると考えられる。任意の種内での自然に生じるのではない任意の変異ヘモグロビンの発現は組換えヘモグロビンであると考えられる。種に関わりなく、ヘモグロビン変異体が自然に発現される個々の生物以外の任意の個々の生物内での、自然に生じる任意の変異ヘモグロビンの発現は組換えヘモグロビンであると考えられる。「リガンド化ヘモグロビン」は任意のリガンドが結合したヘモグロビンを意味する。共通のリガンドはO₂、CO₂、NO、CO、HCNなどを包含するが、これらに限定されない。好ましくはリガンドはヘムポケットで結合するリガンドである。共通の好ましいリガンドはO₂、CO、NO、を包含するが、これらに限定されない。「オキシヘモグロビン」は機能的な酸素結合部位のそれぞれが酸素分子に結合しているヘモグロビンを意味する。「デオキシヘモグロビン」または「非リガンド化ヘモグロビン」はリガンドが αグロビン、βグロビン、および／または任意の機能的なヘム補欠分子族に結合していない、任意のヘモグロビンを意味する。「Ｒ状態ヘモグロビン」はヘモグロビンの高親和性状態であり、リガンドがヘムポケットで結合しているときのヘモグロビンの優勢な形態である。リガンドは代表的には酸素であり、従ってこの状態は「オキシ」または「Ｒ」（弛緩したを意味する）状態として知られる。Ｒ状態では、サブユニット間の距離はＴ状態ヘモグロビンにおける距離と比較して増加している。「Ｔ状態ヘモグロビン」は、サブユニットが四面体を形成するヘモグロビンの低親和性状態であり、ヘモグロビンが脱酸素（「デオキシ」、または「緊張した」を意味する「Ｔ」）されているときのヘモグロビンの優勢な形態である。「混入ヘモグロビン」は、本発明の実質的に純粋なヘモグロビンではない任意のヘモグロビンを意味し、プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン、ヘモグロビンのイソ型、メトヘモグロビン、凝集したヘモグロビン、アセチル化されたヘモグロビン、メチル化されたヘモグロビン、グリケートされたヘモグロビンなどを含み得る。「プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン」は、その１以上のヘム補欠分子族が鉄原子を含まない任意のヘモグロビンを意味する。「ヘモグロビン含有溶解液」は赤血球または非赤血球由来のヘモグロビン溶液を意味し、ここでヘモグロビンはもはやそれらの細胞を含まず、そして粗または明澄化したヘモグロビン溶解液のいずれかであり得る。「ヘモグロビン含有粗溶解液」は、赤血球由来であるか非赤血球由来であるかに関わらず、そのヘモグロビンを発現した細胞からそのヘモグロビンを遊離させるため以外の処理がなされていない、ヘモグロビン溶液を意味する。混入物質は溶液中にあるかまたは沈澱しているが、沈澱した混入物質は溶液から除去されていない。「明澄化したヘモグロビン含有溶解液」は、固体（例えば、混入細胞膜、沈澱した非ヘモグロビンタンパク質、および沈澱した混入しているヘモグロビン、特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンなど）を実質的に含まない、赤血球または非赤血球由来のヘモグロビン溶液を意味する。「実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液」は、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液中のプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの量が全ヘモグロビンの約10％未満の、より好ましくは、全ヘモグロビンの約６％未満の、より好ましくは全ヘモグロビンの１％未満の、ヘモグロビン溶液である。最も好ましくは、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液中のプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンは、実施例６に記載の測定技術においてプロトポルフィリンIXの検出限界以下である。「部分的に精製されたヘモグロビン溶液」は、溶液中の他のタンパク質と比較して、99重量％のヘモグロビンを含有し、そして明澄化したヘモグロビン含有溶解液よりも、少なくとも100倍少ない、より好ましくは500倍少ない、最も好ましくは1000倍少ないE.coliのタンパク質（実施例11に明記した技術を用いて測定したE.coliタンパク質）を含有するヘモグロビン溶液を意味する。「実質的に精製されたヘモグロビン溶液」は以下の仕様を満たすヘモグロビンを意味する：「純粋なヘモグロビン溶液」は以下の純度仕様を満たすヘモグロビン溶液を意味する：図面の説明図１A〜Cは本特許のプロセスのための形成を記載する。図１Aは発酵プロセスを示し、図1Bは精製プロセスの流れの最初の部分を示し、そして図１Cは精製プロセスの流れの最後の工程を示す。図２は、様々な温度（℃-Ｘ軸）におけるE.coliの10²⁵の死減を達成するために必要とされるレジデンス時間（residence time）（Ｙ軸）を秒で示す。図３は、完全に機能的なヘモグロビンの収率（パーセント表示）（左のＹ軸上に示されたスケールに対する灰色の棒）および実施例４に記載のスチームインジェクション（stream injection）による加熱の後のプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン溶液中のプロトポルフィリンIX残存量（右のＹ軸上に示されたスケールに対する●）の概要を示す。0.4％および0.5％値がPIX定量の限界であることに留意のこと。値を多くの温度（Ｘ軸）について示す。加熱保持時間を灰色の棒上に記す。図４は、変異体ヘモグロビン（rHb1.1）の組換え発現に用いたプラスミド、pS GE705のプラスミド地図を示す。このプラスミド地図は関連する制限部位を含む。発明の詳細な説明本発明はヘモグロビン、特に組換えヘモグロビンの精製のプロセスを提供する。特に、本発明は単一のクロマトグラフィーの工程、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を用いて驚くべき高い精製度を提供し、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を生じる。さらに、本発明は、ヘモグロビンがＲ状態またはＴ状態に安定化されているヘモグロビン粗溶解液を迅速に加熱することにより、混入タンパク質、特に、プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを除去するための方法を提供し、プロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を生じる。本発明はさらに、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた、部分的に精製されたヘモグロビン溶液の精製を提供し、実質的に精製されたヘモグロビン溶液を生じる。そして、必要であれば、本発明は添加により精製のプロセスの間に導入された金属の除去およびその後の適切なキレート剤の除去を提供する。これらのプロセスのそれぞれは単独で使用され得、また必要であれば併用され得る。ヘモグロビンは、当該分野に周知である多くの供給源（期限切れのヒト赤血球、ウシ赤血球を包含するが、これらに限定されない）、および多くの非赤血球系（細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞を包含するが、これらに限定されない）から精製されて、明澄化されたヘモグロビン含有溶解液を産生し得る。全てのこれらの系において、細胞性マトリックスからのヘモグロビンの精製における通常の開始工程の一つは、混入細胞性成分の除去である。このことは供給源物質が赤血球または細菌性発現系のどちらであるにせよ重要である。ヘモグロビンによる菌体内毒素の毒性の特別な増強は、菌体内毒素混入物の除去、または粗開始物質の細菌の混入の予防に対して特に注意を要求する（Rausch，C.W.およびFeola ，M.，米国特許第5,084,558号）。細胞性混入物、特に細菌性混入物の除去の問題は、細菌性の発現系での組換えヘモグロビンの発現の設定において特に深刻である、なぜなら、本発明以前は、開始時の高レベルの細菌性の混入物は、（特に大きな商業規模においては）最終産物であるヘモグロビンの品質を危険にさらすことなしに除去され得なかったからである。利用され得る付加的な工程は、混入物ヘモグロビン（例えば、ヘモグロビンイソ型、メトヘモグロビン、凝集したヘモグロビン、および特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン（「混入ヘモグロビン」））の除去である。このような混入ヘモグロビンは、提供されたヘモグロビン分子への１以上の不活性ヘム群の取り込みの結果、または最初の産生または精製の工程の間のヘモグロビン産物の酸化の結果として生じ得る。これらの混入ヘモグロビン（プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを含む）の除去は、産物の純度および安定性を極大化するために所望される。本発明の出発物質として適切なヘモグロビン含有細胞は、多数の供給源から容易に入手され得る。例えば、屠殺場は非常に大量のヘモグロビン含有細胞を産生する。動物の特定の種または品種が特定の使用のために特に適したヘモグロビン含有細胞を産生する場合、必要とされる血液を供給するために、それらの生物は特別に飼育され得る。また、ヘモグロビン含有細胞内で組換えヘモグロビンを発現し得るトランスジェニック動物もまた産生され得る。ヒト血液銀行は一定の満期日の後、ヘモグロビン含有細胞を含む、ヒト血液を廃棄しなければならない。さらに、所望のヘモグロビンのサブユニットをコードする遺伝子は、クローン化され、適切な発現ベクター中に配置され、微生物、動物、植物または他の生物体中に挿入され、あるいは培養された動物または植物の細胞または組織中に挿入され得る。これらの生物、細胞または組織は標準的な組換えDNA技術を用いて生じさせられ得、細胞培養または発酵中で成長させられ得る（図1A）。ヒトαおよびβグロビン遺伝子は、それぞれLiebhaberら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA(19 80)77:7054-7058）およびMarottaら（J．Biol．Chem．（1977）252:5040-5053）によりクローン化され、配列決定された。天然および変異体のαおよびβグロビンの両方の発現およびそれらのヘモグロビンへの構築のための技術は、米国特許第5,028,588号S.J．Hoffman; K，NagaiおよびHoffman，S.J.ら、PCT/US90/02654 号;Townes，T.M.およびMcCune，S.L.，PCT/US91/09624号;およびDe Angelo, J. ら、PCT/US91/02568号およびPCT/US91/08108号に記載されている。ほとんどの場合、純粋なヘモグロビン溶液の精製における第一の工程は、ヘモグロビンを、それを発現したヘモグロビン含有細胞の外側に出してヘモグロビン含有粗溶解液を産生することである。これは通常、細胞を開裂することにより達成され得る（例えば、超音波、ホモゲナイゼーション、酵素的溶解または当該分野で公知の他の細胞破壊技術により）。あるいは、細胞性成分によるいくらかの混入物が避けられ得るように、ヘモグロビンは、低浸透圧性の緩衝液を用いた制御された割合での希釈によりヘモグロビン含有細胞から遊離され得る（Shorrら、米国特許第5,264,555）。さらに、細胞はグロビンを分泌するように加工され得る。この第一工程の後またはそれと同時に、大量の様々な混入細胞性成分および混入物ヘモグロビン（プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを含む）は、必要であれば、本発明で前記したように、ヘモグロビン含有粗溶解液を加熱し、そして沈澱した物質を機械的に除去して明澄化したヘモグロビン含有溶解液を産生することにより除去され得る（図１B）。これは、組換え発現系由来のヘモグロビンのために特に相応しい。しかし、混入細胞性成分および混入ヘモグロビンの除去が必要でない場合は、この工程は省略され得、そしてヘモグロビン溶液は当該領域で公知の任意の方法（例えば、下記のような沈澱化（settling）および遠心分離）により細胞性混入物について明澄化され得る。ヘモグロビン含有粗溶解液の加熱は、当業者に公知の任意の適切な方法により達成され得、それらは、管形熱交換器（例えば、Process Engineers Inc.，Hayw ard，California）および平板形熱交換器（例えば、APV Crepaco Inc.，Rosemon t，Illinois）などの対流／伝導熱交換器；スチームインジェクション加熱、電磁波加熱（Charm，米国特許第 4,975,246号）などを含むが、これらに限定されない。最も好ましくは、ヘモグロビン含有粗溶解液は、極度に急速に溶液を加熱する方法、特にスチームインジェクションにより加熱される（図１B）。スチームインジェクションは、例えば、ヘモグロビン含有粗溶解液流に蒸気流を合わせることにより生じ得る。そのようなスチームインジェクションは、公知の工学技術、例えば、インラインスタチックミキサー（in-line static mixer）、Ventur i ミキサーまたは突発膨張ミキサー（sudden expansion mixer）を用いることにより達成されるが、突発膨張ミキサーは液体流ラインの付着が避け得る利点のために好まれる。他の技術は当業者に公知である、例えば、Chemical Engineering Handbook，第５版、McGraw-Hill，New York（1973）6-29〜6-32項。急速な加熱のための高熱の導入の前に、ヘモグロビン含有粗溶解液は、上に列挙した当該分野で公知の適切な熱交換器を用いて、最も好ましくは平板形熱交換器を使用して（APV Crepaco Inc，Rosemont，Illinois）前加熱される。ヘモグロビン含有粗溶解液の加熱は、十分な混入ヘモグロビンの沈澱、特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの沈澱を達成するために十分な時間および十分な温度で生じなければならない。加熱はまた、生存している微生物が死滅されることを確実にするために、十分な時間および十分な温度で生じ得る。本発明は、ヘモグロビン含有粗溶解液が驚くほどに短い時間熱に曝された場合、十分なプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンが除去され、そして組換え生物体の適切な死滅が達成されることを示す。好ましくは、加熱時間は約５分未満であり、より好ましくは約３分未満であり、最も好ましくは約２分未満である。そのような短時間で、細菌死滅およびヘモグロビン含有溶解液からの混入ヘモグロビンの除去を達成するために、比較的高い温度でヘモグロビン含有粗溶解液を加熱することが必要である。図２は、生存するE.coliにおける10²⁵の減衰を達成するための時間および温度を示す。そのような比較的高い温度は、ヘモグロビンがその天然の環境で曝される温度（すなわち、37℃）よりも高い温度であり、好ましくは少なくとも約55℃の温度であり、より好ましくは少なくとも約65℃、より好ましくは少なくとも約70℃、さらにより好ましくは約70℃〜約85℃である。図３は、プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの形態の混入ヘモグロビンの好ましい１％レベルより低いレベルへの減少は、通常、より長い保持時間（約５秒より長い）、およびより高い温度（約70℃より高い）で生じることを示す。最も好ましい温度および時間の組み合わせは約82±2℃および約10〜12秒である。しかし、時間および温度の最も好ましい組み合わせの選択は、混入ヘモグロビン、特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの沈殿物の量を極大化させ、一方本発明のヘモグロビンの損失を極小化させることに基づく。プロトポルフィリン IXヘモグロビンを本明細書に記載の測定技術による検出可能レベル（0.4％）より低く減少させることが所望される。加熱処理の間、ヘモグロビン含有粗溶解液中のヘモグロビンはリガンド化または非リガンド化状態のどちらかであり得るが、産物ヘモグロビンの実質的な損失なしに混入物を選択的に除去するためには、好ましくは、完全なリガンド化または完全な非リガンド化状態のどちらかである。ヘモグロビンが完全なＴ状態または完全なＲ状態のどちらかであることを確実にするために、ヘモグロビン含有粗溶解液は最初に脱酸素（非リガンド化またはＴ状態を好む）され得、そして／または適切なリガンド化ガスで処理され得る（リガンド化またはＲ状態を好む）。脱酸素は、溶液への外因性化学的還元剤の添加（例えば、亜ジチオン酸塩または重亜硫酸塩）、または窒素のような不活性ガスで溶液を処理することにより達成され得る。好ましくは、脱酸素は、ヘモグロビン含有粗溶解液を大気との接触から隔離すること、およびヘモグロビン含有粗溶解液中の還元等量に任意の利用可能な酸素を消費させることにより生じさせ得る。この後者の方法は脱酸素の好ましい方法であり、特に組換えヘモグロビンの産生の結果として得られるヘモグロビン含有粗溶解液に適する。なぜなら最も適切な宿主細胞（特に細菌および酵母細胞）の内部細胞環境は高度に還元されているからである。それゆえ、細菌または酵母細胞の溶解に由来するヘモグロビン含有粗溶解液は、（本質的に還元した細胞成分の粗溶液であるが）、外因性の化学的還元剤を必要とすることなく還元した環境を提供する。ヘモグロビンは、ヘモグロビン含有粗溶解液を適切なガス混合物とともに、混合または散布することにより酸素または非酸素リガンドでリガンド化され得る。ヘモグロビンに結合し得る非酸素リガンドはAntoniniおよびBrunori、Hemoglobi n and Myoglobin in Their Reactions with Ligands，North Holland Publishin g Company，Amsterdam（1971）436項により認められたリガンドを包含する。ヘモグロビンに完全に酸素を結合させて完全にリガンド化したヘモグロビンを産生することは、ヘモグロビン含有粗溶解液中に存在する還元した環境下で達成することが難しいため非酸素リガンドが好ましい。好ましくは、非酸素リガンドは、ヘムポケットでヘモグロビンに結合するガスである。ヘムポケットで結合するそれらの非酸素ガスは、Ｒ状態への遷移を促進する。このような好ましいヘムポケットで結合する非酸素ガスの例は一酸化炭素および酸化窒素を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、非酸素ガスおよびヘモグロビン含有溶解液の混合は、ヘモグロビン含有細胞を破壊した後でしかも加熱の前に、ヘモグロビン含有粗溶解液を非酸素ガスと共に散布することにより生じる（図１B）。あるいは、非酸素ガスは、細胞の回収の前にヘモグロビン含有細胞と混合され得る（図１ A）。最も好ましい非酸素ガスは一酸化炭素（CO）であり、それは本質的に純粋なCOまたはCOと他のガス（例えば、空気、窒素、アルゴン、ヘリウムまたは水素）の混合物であり得る(Scott specialty Gases，Plumsteadville，Pennsylvania )。好ましくは、このCOは本質的に純粋なCOである。混合または散布の速度は、C Oまたは他の非酸素ガスにより溶液中のヘモグロビンの飽和を生じる任意の速度であり得る。それゆえ、散布の速度は、散布ガス中のCOの濃度の関数であり、そして特定化したガスの流動速度であり得（例えば、0.1-100標準立方リットル毎分［sclm]）、あるいは散布は特定化した量のヘモグロビンがカーボンモノオキシヘモグロビン（カルボニルヘモグロビンまたはHbCOとしても知られる）になるまで続けられ得る。カーボンモノオキシヘモグロビンの量は、種々の分析的技術を用いることにより測定され得る（Evelynら、(1938)J．Biol．Chem．126: 655; Collisonら、(19 68)Clin．Chem．14: 162; JohanssonおよびWollmer，(1989)Clin．Physiol．9: 581; Rodkeyら、(1979)Clin．Chem．25: 1388）。報告された方法の複雑さは、単純な２波長分析（ComminsおよびLawther（1965）Brit．J．Ind．Med．22: 139 ; Small(1971)J．Appl．Physiol．31(1):154-160）から広範な計算が要求される複数波長測定（Fogh-Andersenら、（1987）Clin．Chim．Acta 166: 283-289）までに及ぶ。本発明のために開発された好ましいアプローチは、rHb1.1のような変異体ヘモグロビンがヘモグロビン含有粗溶解液から精製されるべき所望のヘモグロビンである場合、様々な変異体ヘモグロビンのための消衰係数が使用され得ること以外は、商業的に入手可能なHemoximeter instruments（Fogh-Andersenら、(1987)Cl in．Chim．Acta 166: 283-289）に類似した方式の複数波長測定を使用することである。この方法は、与えられたサンプルの測定された吸光度に対して選択された波長における目的のヘモグロビン種の消衰係数に由来する偽逆行列（pseudoin verse matrix）の応用を使用する（さらなる詳細のために実施例５を参照のこと）。本発明の方法は、ヘモグロビン含有粗溶解液からの混入ヘモグロビンを除去して実質的に混入している細胞膜、沈澱した非ヘモグロビンタンパク質および混入ヘモグロビン、特にプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを含まない、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を産生するために用いられ得る。加熱されたまたは加熱されていないヘモグロビン含有粗溶解液のいずれか由来の細胞片および沈澱した混入物は、固体−液体分離に適した多数の機械的な方法により除去され得、それは遠心分離および沈澱のような沈降技術；拡張ベッド（expanded bed）またはフロースルービッグビード（flow through big bead ）クロマトグラフィーのような直接的な捕獲技術；および真空濾過、圧力濾過、接線フローまたはクロスフロー濾過、最も好ましくは回転ドラム真空濾過のような濾過方法を包含するが、これらに限定されない。拡張ベッドまたはフロースルービッグビード樹脂はまた、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IM AC）樹脂であり得、従って沈澱した混入ヘモグロビンおよび細胞片の除去は、１工程のIMAC精製（下記参照）と併用され得る。凝集補助剤（flocculant aid）（ポリエチレンイミン、DEAEセルロースなど）、他のポリカチオン性凝集剤（例えば、Magnafloc 573^TM、Cytec Industries，I ndianapolis，IN）または珪藻土（Eagel-Picher Minerals，Inc.）を添加して、細胞片および混入物質の沈澱を援助し得る。細胞片および沈澱した混入物質の機械的除去の後、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液がさらなる操作のために得られる。この物質はさらなる応用（例えば、酸素親和性を変化させる、またはポリマーの形成を引き起こすヘモグロビンの化学修飾）に使用され得、または本発明において教示されるようにしてさらに精製され得る。実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液は、リガンド化ガスで再び処理され得、溶液中の全てのヘモグロビンが適切な配座にあることを確実にし得る。最も好ましくは、ヘモグロビン溶液は、前記のように一酸化炭素を用いて再び散布される。さらに、キレート剤（例えば、EDTAまたはDTPA）は、溶液中のヘモグロビンの酸化的な損傷を妨げるために添加され得る。実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーに供されて、他のヘモグロビンおよび非ヘモグロビン混入物ならびに驚くべき大量のE.coliタンパク質をさらに除去し得る。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーは、固定化金属アフィニティー樹脂または二座キレート剤（例えば、イミノ二酢酸）に結合した膜シートを利用する。適切なIMAC樹脂は、ToyoPearl AF-Chelate 650M（TosoHaas，Inc.，Philadelphia，PA）、IMA C用に改変されたFlow Through Big Bead Resin（Sterogene，Inc.，Arcadia，CA ）、Chelating Sepharose Big Bead、Chelating Sepharose 6B^TM（共にPharmaci a、Piscataway，NJ）、最も好ましくはChelating Sepharose Fast Flow（Pharma cia，Piscataway，NJ）を包含するが、これに限定されない。適切な膜シートは、Acti-Mode Separation^TM（FMC，Inc.，Natick，MA）を包含するが、これに限定されない。IMAC樹脂または膜は、ニッケル、銅、コバルトおよび亜鉛を含む任意の二価の金属イオンでチャージされ得る。好ましくは、IMAC樹脂またはシートをチャージするために用いられる二価の金属イオンは、酢酸亜鉛の形態の亜鉛である。亜鉛は、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液である明澄化されたヘモグロビン含有溶解液に、（例えば、１Ｍ酢酸亜鉛を用いて）最終亜鉛濃度２〜４mMで添加される。亜鉛添加後、溶液は、0.5N NaOHを用いてより高いpH（好ましくは、7.0より高い、より好ましくはpH 8.0〜8.5、最も好ましくはpH8.0〜8.3）に至らされる。溶液は６℃と20℃の間に保たれるべきである。IMAC樹脂または膜上にロードする前に、溶液を濾過装置（好ましくはデプスフィルター、好ましくはCUNO濾過装置(Cuno，Inc.，Meriden，CT)）を通して濾過して、二価の金属の添加により沈澱した任意の物質を除去するべきである。IMAC 樹脂または膜は、適切な温度（好ましくは25℃よりも低い、より好ましくは４〜 15℃、より好ましくは４℃と10℃との間）に保たれ、そして上記のように二価の金属イオンでチャージされるべきである。樹脂または膜のチャージは、製造業者の推奨に従って、全ての可能な金属結合部位が負荷されるように、選択された金属の溶液と樹脂またはカラムに通過させることにより達成され得る。最も好ましくは、これは20mMの酢酸亜鉛溶液の少なくとも２カラム容積をChelating Sephar ose Fast Flowカラムを通過させることにより生じる。そして、チャージしたIMA C樹脂または膜は、塩溶液（塩溶液は好ましくは500mM未満のNaCl、最も好ましくは200 mM NaClである）の少なくとも２カラム容積により平衡化されるべきである。平衡化後、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液は、５〜10 0グラムヘモグロビン／リットル樹脂の間で、最も好ましくは15〜30g/lでチャージしたIMAC樹脂または膜上にロードされ得る。混入タンパク質（特にE.coliタンパク質）は、適切な緩衝液または緩衝液／塩溶液の十分な容積で樹脂を洗浄することにより、IMAC樹脂から除去され得る。そのような緩衝液は、Tris、HEPES、MOPS、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、重炭酸塩およびリン酸塩を包含する。好ましくは、第一の洗浄溶液は、ロード溶液より高い塩濃度の溶液を含み、そして好ましくは樹脂は、少なくとも４カラム容積で洗浄される。好ましくは洗浄溶液はTris/NaCl溶液、より好ましくは、25mS/cmと50mS/cmとの間、最も好ましくは約35mS/cmから46mS/cmの伝導率を有する、20mM Trisおよび0.5M〜0.75M NaCl（最も好ましくは0.5M NaCl）、pH 7 .5〜8.5（最も好ましくはpH 8.0〜8.3）である。第二の洗浄は、緩衝液および塩を含む第二の洗浄溶液を用いて実施され得、緩衝液は、Tris、HEPES、MOPS、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、重炭酸塩およびリン酸塩を包含し、第一の洗浄緩衝液よりさらに低い伝導率（好ましくは２mS/cmと６mS/cmとの間）を有し、最も好ましくは2.5〜4.5mS/cmの伝導率を有する。好ましい溶液は10mM Tr is、25〜50mM NaCl、pH7.5〜8.5、最も好ましくはpH8.0〜8.3である。次に本発明のヘモグロビンは、pHを増加するかあるいはキレート剤または適切な競合リガンドで溶出することによりカラム（IMAC膜シートが用いられる場合は膜シート）から溶出され、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を産生し得る。適切な競合リガンドはヒスチジン、イミダゾール、Tris、またはグリシンを包含する。適切なキレート剤はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびジエチルアミントリアミン五酢酸（DTPA、五酢酸とも呼ばれる）を包含するが、これらに限定されない。最も好ましくは、本発明のヘモグロビンは、本発明のヘモグロビンを溶出するための溶出緩衝液中の十分量のEDTA（好ましくはpH〉8.0の10〜45mM ED TA、最も好ましくはpH 8.5の15mM EDTAの少なくとも４カラム容積）により溶出される。溶出は任意の適切な溶出スキーム（例えば無勾配溶出、段階溶出、段階勾配溶出または勾配溶出）を利用して起こり得る。最も好ましくは、溶出は無勾配溶出により生じる。次に部分的に精製されたヘモグロビン溶液は、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製され得る。しかし、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、溶液は、所望の陰イオン交換樹脂上にロードするために適切なpHおよびイオン状態に至らされ得る。これは、適切な陽イオン緩衝液に対する透析または限外濾過により達成され得る。最も好ましくは、これは、陰イオン交換樹脂を平衡化するために用いられた緩衝液に対する限外濾過により達成される。適切な緩衝液は、アルキルアミン、アミノエチルアルコール、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、Trisおよびピリジンを包含する。好ましくはこれらの緩衝液はTrisまたはトリエタノールアミンであり、より好ましくはこの緩衝液はTrisであり、最も好ましくはこの緩衝液は20mM Tris、pH約8.9である。限外濾過は、適切な限外濾過膜（好ましくは〈50,000の名目上の分子量カットオフ（NMCO）、より好ましくは〈30,000、最も好ましくは〈10,000の限外濾過膜）を装備した任意の適切な限外濾過装置内で実施される。適切な陰イオン交換樹脂は当該分野で周知であり、そしてQ Sepharose Fast F low、DEAE Sephadex A-50（共にPharmacia，Inc.，Piscataway，NJ）、Dowex 1- X8樹脂、およびAG MP-1樹脂（BioRad，Richmond，CA）を包含するが、これらに限定されない。最も好ましくはQ Sepharose Fast Flowが、部分的に精製されたヘモグロビン溶液をさらに精製するために用いられる。Q Sepharose Fast Flow 樹脂上にロードするための部分的に精製されたヘモグロビン溶液の調製の後、または間に、樹脂自身は、陰イオン交換クロマトグラフィーのための部分的に精製されたヘモグロビン溶液を調製するために用いられたのと同一の緩衝液で洗浄することにより平衡化されるべきである。上記のように、この緩衝液は任意の適切な陽イオン性緩衝液であり得る。適切な緩衝液は、アルキルアミン、アミノエチルアルコール、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、Trisおよびピリジンを包含する。好ましくはこれらの緩衝液はTrisまたはトリエタノールアミンであり、より好ましくは、この緩衝液はTrisであり、最も好ましくは、この緩衝液は 20mM Tris，pH 8.9である。部分的に精製されたヘモグロビン溶液は樹脂の１リットルあたり５〜50グラムのヘモグロビン、最も好ましくは、樹脂の１リットルあたり20グラムのヘモグロビンのチャージで樹脂にロードされ得る。ロードされた樹脂は適切な陽イオン性緩衝液（例えば、平衡化緩衝液、より好ましくは15〜25mM Tris，pH 7.5〜9.5、200〜800μS/cmの伝導率、最も好ましくは20mM Tris，pH 8.9、400μS/cmの伝導率）で洗浄され得る。ロードされた樹脂は、適切な陽イオン性緩衝液（より好ましくは10〜15mM Tris，pH 7.5〜8.9、200〜800μS/cmの伝導率、最も好ましくは12mM Tris，pH7.7、700μS/cmの伝導率）を用いてさらに洗浄され得る。実質的に精製されたヘモグロビン含有溶液を作製するためのヘモグロビンの溶出は、上記の適切な緩衝液、最も好ましくは12mM Trisを用いて、p Hを7.4〜7.6まで（最も好ましくはpH 7.5まで）低下させることにより達成され得る。溶出は任意の適切な溶出ストラテジー（例えば、無勾配溶出、段階溶出、段階勾配または勾配溶出）を利用して生じ得る。最も好ましくは溶出は無勾配溶出によって生じる。溶出緩衝液の伝導率は、550μS/cmと1200μS/cmとの間であり得、より好ましくは550μS/cmと850μS/cmとの間、最も好ましくは700μS/cm であり得る。精製のこの時点で、以前に加えられたヘモグロビンリガンドは脱酸素されたヘモグロビンを産生するために除去され得、または他のリガンド（好ましくは酸素または酸化窒素、最も好ましくは酸素）に交換され得る。これは光分解（Di Ior io，E．E.，(1981)Methods in Enzymology，E.Antonini，L Rossi-BernardiおよびE．Chiancone，（編）Academic Press，NY，pp57-72);および当該分野で周知であるガス質量の転移（gas mass transfer）を増加するために設計された技術（方法の例示のためにChemical Engineering Handbook，第５版，McGraw-Hill,N ew York(1973)18章を参照のこと）を含む多数の技術を用いて達成され得る。これらの方法は以下のような技術を含む。すなわち、カーボンモノオキシヘモグロビンをホローファイバー膜またはガス交換装置内の酸素含有ガス流に対して流すこと；限外濾過膜を通してダイアフィルトレートされるように、交換緩衝液を酸素でダイアフィルトレーションおよび散布すること；加圧されたガス掃引器を装備した、または光介在性の一酸化炭素除去を可能にする薄膜流（thin-film flow ）装置を使用すること；酸素でスローフロートリクルベッド（slow flow trickl e-bed）を散布すること；充填されたベッドを酸素で散布すること、そして最も好ましくは、加圧したホールディングタンク中の溶液を酸で散布し、遊離したCO を除去すること。最後に、混入金属が、ヘモグロビンの産生またはプロセッシングの間に、実質的に精製されたヘモグロビン溶液に導入されているのであれば、それらは本発明のさらなる局面において除去され得る。この除去は、1993年７月23日に出願された、同時係属出願の出願番号08/097,273にさらに記載されるような、任意の適切なキレート剤（好ましくはEDTAまたはDTPA、最も好ましくはEDTA）の実質的に精製されたヘモグロビン溶液への添加、およびそれに続く添加されたキレート剤の除去、またはキレート剤（好ましくはEDTAまたはDTPA、最も好ましくはEDTA）の制御された量に対してのダイアフィルトレーションにより達成され、純粋なヘモグロビン溶液を生じ得る。金属の除去が必要であろうとなかろうと、実質的に精製されたヘモグロビン溶液は、適切な製剤緩衝液へダイアフィルトレートされるべきである。そのような緩衝液は、HoffmanおよびNagai、米国特許第5,028,588 号、1993年７月23日に出願されたChiversおよびBelval、米国出願第08/097,273 号、および1994年３月８日に出願されたRosenthalおよびGerber、米国出願第08/ 208,740号に記載されており、さらに約150mM NaCl、約５mMリン酸ナトリウム、約0.025〜0.035％ Tween、1mM未満のアスコルビン酸塩、2.5mM未満の亜ジチオン酸塩、50mM未満の炭水化物、および２％未満のポリエチレングリコール、pH約７を包含し得る。本発明の目的のために、純粋なヘモグロビン溶液は、与えられた有用性のために必要な機能性を有する、プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン混入物、菌体内毒素および混入金属（特にニッケル）を実質的に含まない任意のヘモグロビン溶液である。純粋なヘモグロビン溶液は、例えば、食物補充物中の生体利用可能な鉄の供給源、研究室応用のための高度に精製された分子量マーカー、増量剤、および最も好ましくは、溶液の酸素含量の改変剤（例えば、血液の酸素含量を改変する酸素運搬溶液としてヘモグロビンを使用する場合、あるいは組織または細胞培養の酸素含量を変化させるためにヘモグロビンを使用する場合）として用いられ得る。混入物が除去された純粋なヘモグロビン溶液は、自然に生じるヒトヘモグロビン、または他の種由来の種々のヘモグロビン、変異体ヘモグロビン、またはヘモグロビン様分子のいずれかであり得る。純粋なヘモグロビンは溶液中で単独で使用され得、または、HoffmanおよびNagai、米国特許第5,028,588号、199 3年７月23日に出願されたChiversおよびBelval、米国出願第08/097,273号および 1994年３月８日に出願されたRosenthalおよびGerber、米国出願第08/208,740号に記載されるような適切な薬学的組成物の一部になり得る。本明細書中に記載の方法および説明から、本発明はまた、ヘモグロビン溶液から細菌性混入物以外の他の混入物を除去するためにも用いられ得る（例えば、同一のプロセスが酵母発現系において発現されたヘモグロビンを精製するために用いられ得る）ことが認識される。特定の実施態様の前記の記述は、本来の概念を逸脱することなしに、他者が現在の知識を応用することにより、このような特定の実施態様を様々な応用に、容易に改変および／または適合し得るように本発明の一般的な特性を示す。それゆえ、このような適用および改変は、開示された実施態様の等価物の趣旨および範囲内において理解されるべきであり、そして理解されることが意図される。本明細書中に用いられた辞句および用語は記載の目的のためであり、限定ではないことを理解されるべきである。本明細書中で引用された書籍、雑誌、記事、特許および特許出願の全ての参考は、それらの関連する教示のために参考として援用される。実施例以下の実施例は、本発明の特定なそして好ましい実施態様のために提供され、いかなる点においても本発明の範囲を制限しようとするものではない。実施例１ヘモグロビン含有タンパク質溶液の産生Ａ．rHb1.1のための細菌系の構築表１に記載した株の１つの発酵によりヘモグロビンを産生し、それにはプラスミドpSGE1.1E4またはpSGE705のいずれかを利用した。２つのプラスミドからのrH b1.1の発現のレベルはおおよそ同じであり、同一の発酵条件下で用いた場合、株に依存しなかった。プラスミドpSGE1.1E4は、Hoffmanら、WO90/13645号に記載される。pSGE705の構築は以下に記載する。プラスミドpSGE1.1E4を保有するSGE127株はSGE128と呼ばれる。プラスミドpSG E705を保有するSGE800株はSGE1353である。プラスミドpSGE705を保有するSGE166 1株はSGE1662と呼ばれる。材料．pBR322、pUC19およびpNEB193をNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入した。pSGE705の調製のために用いたほとんどのプラスミドを表２に記載する。オリゴヌクレオチドをApplied Biosystems DNA Synthesizer Model 392（ Foster City，CA）で合成した。pSGE705の調製に用いたオリゴヌクレオチドを表３に列記する。制限エンドヌクレアーゼをNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入し、製造業者の仕様書に従って使用した。T4 DNAリガーゼをNew Englan d Biolabs（Beverly，MA）またはGibco-BRL（Gaithersburg，MD）のいずれかから購入し、製造業者の仕様書に従って使用した。PfuポリメラーゼをStratagen e（La Jolla，CA）から購入し、製造業者の仕様書に従って使用した。使用した培地は、J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics．（Cold Spring Harbor Press，(1972)Cold Spring Harbor，NY)およびJ.H.Miller，A Sh ort Course in Bacterial Genetics（Cold Spring Harbor Press，(1992)Cold S pring Harbor，NY）に記載される。アクリジンオレンジ、アンピシリンおよび硫酸カナマイシンをSigma Chemical Co．(St．Louis，MO)から購入した。テトラサイクリンをAdrich Chemicals（Milwaukee，WI）から購入した。遺伝学的および分子生物学的手順。標準的な細菌の遺伝学的手順は、J.H.Mi ller,Experiments in Molecular Genetics．（Cold Spring Harbor Press，(197 2)Cold Spring Harbor，NY）およびJ.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics（Cold Spring Harbor Press，(1992)Cold Spring Harbor，NY）に記載される。標準的な分子生物学の手順をSambrook（Sambrookら、Molecular Clonin g，(1989)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor，NY）に記載のように実施した。プラスミドDNA形質転換。 DNA形質転換をWensick（Wensickら、(1974)Cell 3 : 315-325）に記載の手順により実施した。手短に説明すると、対数期中期まで細胞を増殖させ、次いでペレット化し、等量の10mM MgSO₄に再懸濁し、氷上で30 分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ペレットをもとの容積の1/2の50m M CaCl₂に再懸濁し、氷上で20分間放置した。細胞を再び遠心分離し、次いでもとの容積の1/10の50mM CaCl₂に再懸濁した。プラスミドDNAを10mM Tris-HCl pH 8.0，10mM MgCl₂および10mM CaCl₂の溶液中でコンピテントセルに添加した。混合物を氷上で15分間インキュベートし、次いで37℃で５分間インキュベートした。１mlのLB培地を添加し、そして混合物を振とうしながら30〜60分間インキュベートした。次いで、培養物を遠心分離し、0.1mlのLB培地に再懸濁し、そして適切な選択培地上にプレートした。SGE1662を一工程形質転換法（Chung，C.T.ら、（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．86:2172-2175）によりpSGE705をSGE1661に導入して調製した。 DNAの精製。 DNAフラグメントをGeneclean system（Bio 101，Inc．La Jolla , CA;方法は製品と共に提供される）を用いてアガロースゲルから精製した。PCR 産物をDouble Geneclean system（Bio 101，Inc．La Jolla，CA;方法は製品と共に提供される）を用いて調製し、制限エンドヌクレアーゼで切断した。手短に説明すると、PCR産物からPCRプライマーを取り除き、次いてPCR産物を制限エンドヌクレアーゼで切断し、そして制限エンドヌクレアーゼおよび緩衝液から精製した。そして、PCR産物はライゲーション反応への準備ができた。オリゴヌクレオチドのアニーリング。相補的なオリゴヌクレオチドを以下の手順によりアニールした。各々のオリゴヌクレオチドの等モル量を15〜25μlの1 0mM Tris-HCl pH 8.0/lmM EDTA中に混合し、65℃で30分間インキュベートした。サンプルを37℃の水浴に30分間移動させた。最後に、サンプルを氷上で60分間、または冷蔵庫内で一晩インキュベートした。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を Muta-gene phagemid in vitro mutagenesis kit（Bio-Rad，Hercules，CA）を用いて、製造業者の指示に従い実施した。これはKunkelの方法（Kunkel，T.A．(19 85)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 488; Kunkelら、(1987)Methods Enzymol, 154: 367）に基づく。pSGE515のrHb1.1領域をpTZ18U（Bio-Rad，Hercules，CAまたはU.S．Biochemical，Cleveland，OH）のBamHI-Hind IIIフラグメントにクローン化し、pSG700を作製した。３つのオリゴヌクレオチド、MW007、MW008、およびMW009を単一の反応で複数の変化を同時に導入するために用いた。 pBR322 oriの調製。 pBR322の複製起点を増幅するためにPCRプライマーを設計した。これらのプライマー、TG62およびTG63をpBR322のDNA配列上の2380〜240 4位および3170〜3148位にアニールさせた（Sutcliffe，J.G．(1979)Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．43: 77-90）。PCR産物をNot IおよびPme Iで消化した。DNAフラグメントをGenecleanの手順に従って精製した。 tet遺伝子フラグメントの調製。 tet遺伝子の供給源は、pSELECT-1（Promega Corp.，Madison，WI）である。このプラスミドは、tet遺伝子から多数の制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、Bam HI，Hind III，Sal IおよびSphI）を除去している（LewisおよびThompson（1993）Nucleic Acids Res．18:3439-3443）。 Pme ＩリンカーをpSELECT-1のSty I部位に挿入した。このプラスミドをpSGE504 と名付けた。オリゴヌクレオチドTG71およびTG72をアニールさせ、pSGE504のEco RI-Cla Iフラグメントに結合させた。このプラスミド、pSGE505は、期待される制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、pSELECT-1のマルチクローニング部位に存在する部位を消失していることが示された。pSGE505をNot IおよびPme Iで消化した。1417 bpのフラグメントをGenecleanのプロトコルに従って精製した。 lacI遺伝子の調製。 lacI遺伝子を、lacI遺伝子を保有するpRGl（R．Garcia, Dana-Farber Cancer Inst.，Boston，MAからの贈与）から、この遺伝子配列を増幅することにより単離した。PCRプライマー、TG59およびTG60をlacI遺伝子の上流に野生型のlacIのプローター（Farabaugh，P.J.(1978)Nature 274: 765）を生成し、遺伝子の下流にtrpターミネーター配列（Christieら、(1981)Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 78: 4180-4184）を配置するために設計した。Y1089（Promeg a）またはlac領域を保有する任意のE.coli株（例えば、MM294（ATCC 33625)）由来の染色体DNAを用いて、同一の工程を実行し得た。PCR産物をゲル精製し、Gene cleanの手順に従って単離し、Bam HI-Hind IIIで消化したpUC19DNAにクローン化し、pSGE490を作製した。 pSGE515の構築。 PCRプライマーEV29およびEV18をpDLII-91F（Hoffmanら、WO 90/13645号）からα遺伝子を増幅するために選出した。精製されたPCR産物を制限エンドヌクレアーゼEag IおよびXba Iを用いて切断した。 P_tac-αを含むプラスミドを作製するために、α遺伝子（上記から）およびtac プロモーター（これはEV27およびEV28をアニールすることにより調製された）を Eco RI-Xba I切断pUC19 DNAと混合した。ほぼ等モルの割合の３つのDNAフラグメントの混合物を、T4 DNA リガーゼで処理した。インキュベーション後、ライゲーション混合物を用いて、SGE476（MM294、ATCC 33625と同様）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。（MM294(ATCC 33625)株への形質転換は同等の結果を生じる。）適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメントを（図４と一致する）有する単離物をpSGE492と命名した。α遺伝子およびtacプロモーターのDNA配列をDNA配列決定により確認した。プライマーEV30およびEV31を、PCRによりpSGE1.1E4からβ遺伝子を増幅するために用いた。精製されたβ遺伝子フラグメントをXba IおよびHind IIIで消化し、次いでXba I-Hind III消化したpUC19 DNAと混合し、T4 DNAリガーゼで処理した。ライゲーション混合物を用いてコンピテントSGE476を形質転換し、形質転換体をLB+アンピシリン（100μg/ml）プレート上で選択した。適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメント（図４と一致）を含む単離物を選択し、pSGE493と命名した。β遺伝子をDNA配列決定法により確認した。 Xba IおよびHindIIIによる制限およびそれに続くGeneclean法に従った精製により、β遺伝子をpSGE493から単離した。このDNAフラグメントをXba I-Hind III 制限pSGE492 DNAに結合させ、そしてSGE713を形質転換した。（JM110（ATCC 470 13)またはGM119(ATCC 53339)のような任意のdam株もまた用いられ得た。）適切な制限フラグメント（図４と一致する）を有するプラスミドを保有したアンピシリン耐性形質転換体を選択し、pUC19αβ（pSGE500）と命名した。 pSGE500のαおよびβ遺伝子を含むBam HI-Hind IIIフラグメントをGeneclean 法に従って精製した。グリシンリンカー領域を含むジα遺伝子の一部を保有する Xho IフラグメントをpSGE1.1E5からゲル精製した。pSGE1.1E5（1991年11月８日に出願された、Hoffmanら、米国出願第789,179号に記載される）は、pSGE1.1E4 （Hoffmanら、WO90/13645号）のテトラサイクリン感受性アナログであり、それも使用され得た。 pBR322の複製起点領域（pBR322 ori、上記）をtet遺伝子フラグメント（上記）に結合させ、ライゲーション混合物でSGE476を形質転換した。（MM294の形質転換（上記）は同様の結果を生じ得る。）テトラサイクリン耐性形質転換体を選択し、そしてプラスミドDNAを単離して、解析した。適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメント（図４と一致する）を含む単離物を選択し、pSGE507と命名した。次に、pSGE507およびpSGE490をBam HIおよびNot Iで消化し、適切なフラグメント（図４と一致する）を精製した。２つの精製フラグメントをともに結合させ、ライゲーション混合物を用いてコンピテントSGE713を形質転換した。（任意の dam株も用いられ得た；上記参照。）テトラサイクリン耐性形質転換体を選択し、プラスミドDNAを単離して解析した。適切な制限フラグメント（図４と一致する）を有したプラスミドを選択しpSGE509と命名した。 αおよびβ遺伝子を含むpSGE500の精製されたBam HI-Hind IIIフラグメントを、Bam HI-Hind III消化したpSGE509に結合した。ライゲーション混合物を用いて pSGE713（同等の株については上記を参照）を形質転換し、そしてテトラサイクリン耐性形質転換体を選択し、特徴付けをした。期待される制限エンドヌクレアーゼフラグメント（図４と一致する）を有する適切なサイズのプラスミドを生成する単離物を選択し、pSGE513と命名した。ジαグリシンリンカー配列を含むpSGE1.1E5（1991年11月8日に出願された、Ho ffmanら、米国出願第789，179号）のXho IフラグメントをXho I消化したpSGE513 に結合し、ジα遺伝子を含むプラスミドを作製した。SGE753をライゲーション混合物で形質転換し、テトラサイクリン耐性形質転換体を選択した。（SGE800への形質転換は同等の結果を生じ得る。）単離物をスクリーンして適切な方向（図４と一致する）でpSGE513に挿入されているXho Iフラグメントを含有している単離物を同定した。ジα遺伝子の適切な配置を含んだ単離物（Eag Iを用いた制限エンドヌクレアーゼ解析により決定された）をpSGE515と命名した。 pSGE705を作製するためのpSGE515の修飾。 β遺伝子の増幅のためのPCRプライマーを設計するために用いたDNA配列記録は、Ｃ末端の３アミノ酸を含んでいなかった。これらの９つのヌクレオチドをβ遺伝子のDNA配列に付加するためにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いた。同一の反応中で、修飾を導入し、ジαおよびβ遺伝子のリボソーム結合部位を至適化し、ジα遺伝子の末端近くの Bgl II部位を除去した。プラスミドの構築において、最後の工程の内の１つは、配列を至適化するためのリボソーム結合部位の修飾であった。以下はオリゴヌクレオチドMW008およびM W009により生じた変異である。上に示した、４ヌクレオチド変化（２ヌクレオチドの挿入を含む）を、MW008を用いて、ジαのリボソーム結合部位を至適化するために導入した（｜は同一であることを示し、＊は変化を示す）。上に示した６ヌクレオチド変化（４ヌクレオチドの挿入を含む）を、MW009を用いて、βのリボソーム結合部位を至適化するために導入した。変異前の鎖上の小文字の「a」は、Bgl II部位をこの配列に導入したα遺伝子の構築におけるＴからＡへの変異であった。これを、pSGE705のBgl II部位を単一にするために除去した（｜は同一であることを示し、＊は変化を示す）。上に示したように、MW007により、β遺伝子の最後の３つのアミノ酸のためのコード配列を導入した（｜は同一であることを示し、＊は変化を示す）。推定上の変異体をBgl II制限エンドヌクレアーゼ切断部位の消失（M008により導入）についてスクリーニングした。24個の内の17個は、この部位を欠失しており、他の２つの変異誘発された部位でのDNA配列決定によりさらに特徴付けを実施した。17個の内の１個は、全ての３つの修飾を取り込んでいた。これらの変異をDNA配列決定により確認し、rHb1.1遺伝子をBam HI-Hind III消化したpSGE509 にクローン化した。適切な制限エンドヌクレアーゼフラグメントを有した単離物をpSGE705と命名した。 pSGE705のプラスミド地図を図４に示す。プラスミド地図は制限エンドヌクレアーゼ切断部位の多くを示す。pSGE705は、その対応物（pSGE1.1E4）よりも小さく、そしてその制限部位の配置は配列のモジュールの改変を促進する。使用されない抗生物質耐性マーカーを除去し、rHb1.1の発現をより厳格に調節し得るようにプロモーターをlacI遺伝子に付加した。 α遺伝子の上流の新しい配列は、tacプロモーター（De Boerら、(1983)Proc. Natl．Acad．Sci．80:21-25）とα遺伝子の最初のコドンとの間の距離を極小化した。ジα遺伝子とβ遺伝子との間の遺伝子間領域も、制限エンドヌクレアーゼ部位およびβ遺伝子のリボソーム結合部位を含む最小配列を含むように設計した。 1993年11月10日に、E.coli SGE127およびSGE800株をアメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Rockville，MDに寄託した（ATCC寄託番号69485、69484）;E.coli SGE1661株を1994年１月20日に寄託した（ATCC寄託番号55545）。寄託は特許の手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条件下でなされた。これは寄託の日から30年間の生存する培養物の維持を保証する。この生物体はブダペスト条約の条件下でAT CCにより利用可能にされ、そして関連する米国特許の発行上に無制限の利用可能性を保証する、出願人とATCCの間の同意が結ばれる。寄託された株の利用可能性は、特許法に従って任意の政府の権威下で認められる権利の違反として発明を実施するライセンスとして解釈されていない。Ｂ．発酵以下に記載の600リットルの発酵の手順を、精製および機能性決定のための物質を得るために使用した。種ストック種ストックを10g/L BactoTryptone^TM、5g/Lイーストエキストラクト、5g/L Na Cl、0.2g/L NaOH、および10μg/mlテトラサイクリンを含有するLBブロスで、600 nmの吸光度が1.5〜1.7になるまで培養した。次いでこの溶液を10％グリセロールとし、必要になるまで-80℃で保存した。発酵槽接種物（2L撹拌フラスコ内の500mlブロス）発酵槽接種物を調製するために、種ストックを解凍し、0.1〜0.4mlの種ストックをおおよその以下を含む500mlの溶液に接種した：この培養物をシェーカーで37℃で10時間増殖させた。４個のフラスコを合わせ、種発酵槽に接種するために用いた。種発酵槽（20L発酵槽内の14L容積）次いで全部の発酵槽接種物を以下に記載の10リットルの溶液を含む20リットルの発酵槽に移した。試薬の添加は発酵の最終容積（14リットル）を用いて計算されており、それらがおおよそ測定誤差の範囲にあることに留意のこと。 15％〜30％のNH₄OHを添加することによりpHを6.8〜6.95に維持し、溶存酸素を2 0％以上に維持し、そして50〜70％のグルコースを増殖の間中ずっと添加して、培養物中のグルコースを低いが適切なレベルに維持した（0.1g/L〜10g/L）。溶存酸素を可能な限り20％に近く維持した。600リットル発酵槽に移す前に、培養物を28℃と32℃との間で、約12時間増殖させた。生産発酵次いで全部の種発酵槽を以下に記載の約375リットルの溶液を含む600リットル発酵槽に移した。試薬の添加は発酵の最終的な容積（450リットル）から計算されていることに留意のこと。すべての数値はおおよその値である。 15％〜30％のNH₄OHを添加することによりpHを6.8〜6.95に維持し、溶存酸素を20 ％以上に維持し、そして50〜70％のグルコースを増殖の間中ずっと添加して、培養物中のグルコースを低いが適切なレベルに維持した（0.1g/L〜10g/L）。10〜1 000μMのIPTGで誘導する前に、培養物を25℃と30℃との間で、OD₆₀が約10〜40になるまで増殖させた。ヘモグロビン合成の誘導において、E.coliヘム生合成を以下のいずれかによる1N NaOHに溶解したヘミンの添加により補充した。すなわち、誘導に必要とされるヘミンの総量の添加、誘導期間を通じての連続的なヘミンの添加、または50mM〜1M NaOHに溶解したヘミンの定期的な添加（例えば、発酵槽に添加されるべきヘミンの全量の1/3を誘導時に添加し、別の1/3を発酵の総時間の1/4が経過してから添加し、そして最後の1/3を誘導期の中間に添加した。）のいずれかである。添加した全ヘミンは50〜300mg/Lの範囲であった。発酵槽を誘導後８〜12時間継続させた。この期間の終了時に、いくつかの１mlのアリコートをヘモグロビン産生およびプロトポルフィリンIX含量の測定のためにブロスから採取した。精製に用いた物質のほとんどを600リットルスケールの発酵により産生したが、いくらかは1000リットルスケールで調製した。このスケールでの発酵は以下に考察する範囲を除いて、600リットルスケールとほとんど異なる点はなかった。発酵槽接種物を0.5リットルの最終容積よりむしろ2.5リットルの最終容積で増殖させた。しかし、それらは500ml接種物のための記載と同じ培地で増殖させた。14リットルの最終容積よりむしろ110リットルの最終容積を用いて種発酵を実施し、以下のようにわずかに異なる培地を用いて発酵を実施した： 2.6g/L KH₂PO₄ 4.6g/L K₂HPO₄ 2.6g/L (NH₄)₂SO₄ 全ての他の成分は14リットル種発酵槽についての記載の通りである。発酵の最終容積が1100リットルであること以外は、450リットル発酵についての記載と全く同じようにして、産生発酵を実施した。実施例２管形熱交換機によるデオキシヘモグロビン含有粗溶解液の加熱発酵を、E.coli株SGE127またはSGE800（それぞれプラスミドpSGE1.1E4およびp SGE705を含む）を用いて実施例１に記載のように、実施した。これらの２つの株は、同一の変異ヘモグロビンを産生し、発酵産物は本質的に同一であった。未洗浄E.coli細胞（100-300L）をNiroホモゲナイザーを用いて破砕した。粗溶解液を管形熱交換器を用いて1.6〜36秒間70〜90℃で加熱した。次いで、溶解液１Lあたり５mlの50％Magnafloc 573^TM（Cytec Industries，Indianapolis，IN）溶液を加え、溶解液を遠心分離により明澄化した。いずれの溶解物質においても、プロトポルフィリンIXおよびヘムを正確に定量することはできなかった。これは、粗製であっても明澄であっても、他種からの干渉（ヘミンおよびその他の発酵産物および成分）による。従って、プロトポルフィリンIXの測定のために、サンプルを亜鉛チャージした固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した。IMACを用いて調製した材料は、プロトポルフィリンIXの測定に適しており、そして溶解液中に存在するプロトポルフィリンIXと同一の比率を反映した（スパイク回収実験により示される）。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを２カラム容積の20mM Zn(OAc)₂ をチャージした、キレートしたSepharose Fast Flow 6B（Pharmacia，Inc.，Pi scataway，NJ）カラムを用いて、実施した。次いでカラムを２カラム容積の200m M NaClで平衡化した。未洗浄細胞から調製した明澄化したE.coli溶解液を1〜2mM Zn(OAc)₂にし、濾過し、次いでカラム上にロードした。カラムを４カラム容積の500mM NaCl/20mM Tris，pH 8.3-8.5で洗浄し、次いで４カラム容積の20mM Tri s，pH 8.3-8.5でさらに洗浄した。捕獲されたヘモグロビンをカラムから15mM ED TA，pH 8.5で溶出した。次いでカラムを２カラム容積の200mM NaClおよび引き続き２カラム容積の0.5N NaOHで浄化した。実施例３デオキシ条件下での迅速な加熱を用いたプロトポルフィリンIX除去の効率に及ぼす温度の影響 E.coliの２つの異なる株、SGE127およびSGE800（それぞれプラスミドpSGE1.1 E4およびpSGE705を含む）の２つの発酵からの細胞をNiroホモゲナイザーで破砕した（40℃）。脱酸素されたまたはリガンド化状態のいずれかを確認するために特定なプロセス工程を用いていないが、粗溶解液溶液のスペクトル分析は、溶液中の全てのヘモグロビンが脱酸素された状態であることを示した。E.coli粗溶解液は、溶液を脱酸素された状態に維持するに十分な還元力を含んでいた。粗溶液の４つの部分を管形加熱装置（Process Engineers Inc.，Hayward，Californi a）を用いて、６秒間、70、80、85、および90℃で加熱した。実施例４ヘモグロビン含有粗溶解液の加熱−リガンド化状態実施例１においてE.coli株SGE127およびSGE800の両方（それぞれプラスミドpS GE1.1E4およびpSGE705を含む）を用いて、発酵により産生したヘモグロビンを99 .99％の一酸化炭素で１分当たり約５標準立方リットルの流速で散布した。あるいは、ヘモグロビンを実施例１におけるようにプラスミドpSGE705を含むE.coli 株SGE1661を用いて、発酵により産生し、99.99％の一酸化炭素で溶液中の全ての利用可能なリガンド結合部位と比較して、計算上、化学量的に過剰の一酸化炭素が存在するように約300〜500mls/分の流速で散布した。発酵の全てのセットは、類似した結果を生じた。散布の後、ヘモグロビン含有粗溶解液を平板形装置（APV Crepaco Inc.，Rose mont，Illinois）内で55℃の温度まで前加熱し、次いで、図1Bの配置中で例示されるように、前加熱したヘモグロビン含有粗溶解液のスチームインジェクションにより、特定の温度で一定時間加熱した。スチームインジェクション加熱は液体のほぼ瞬間的な加熱を生じさせた。種々の加熱温度および保持時間を検討した。実施例２〜４に記載の全ての時間および温度の組み合わせ、およびリガンドの選択は、図３に示したように、著しく減少したプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビン濃度を有する実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を産生した。加熱後の溶解液中のプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの最終的な量は、40〜80℃ではゆっくりと、80〜90℃の間では急速に減少した（図３）。これらのデータは80〜90℃の間で加熱したE.coli溶解液がプロトポルフィリン IX含有ヘモグロビンにおいて最も著しい減少を有することを示す。しかし、85〜 90℃より上での溶解液の加熱は、rHb1.1の損失を生じさせた（図３）。これらのデータは、プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンの除去は、より高い温度またはより長い保持時間で増大することを示す。しかし、このデータは、ヘモグロビンの除去も、加熱の行われる条件に関わりなく、より高い温度およびより長い保持時間で増大することも示す。実施例５カーボンモノオキシヘモグロビン測定の分光光度的方法水溶液中のヘモグロビン種の定量のための分光光度的方法を開発した。特に重要なことは、ヘモグロビンの様々なリガンド化した形態（例えば、メトヘモグロビン（HbMet）、カーボンモノオキシヘモグロビン（HbCO）、オキシヘモグロビン（HbO₂）、還元ヘモグロビン（Hb）および溶液の全ヘモグロビン含有物それ自体（HbTotal））を定量する能力であった。 rHB1.1のための消衰係数を用いた以外は、商業的に入手可能なHemoximeter機器（Fogh-Andersenら、(1987)Clin．Chim．Acta 166:283-289）に類似した方式の複数波長測定を開発した。この方法は偽逆（pseudoinverse）行列（選択された波長での目的のヘモグロビン種の消衰係数に由来する）の与えられたサンプルの測定された吸光度への適用を用いた。この方法のためになされた仮定は以下のとおりであった：１．定義されたヘモグロビン種だけが測定波長での吸収の原因となる。２．全ての波長で観測された吸光度は、その波長でのそれぞれの種の吸収の和である。３．それぞれの種の吸光度はBeerの法則に従う、すなわち、吸収は濃度の一次関数である。 Beerの法則はいくつかの種についての一連の連立方程式として表され得る。 A₁が波長１での吸収である場合、ε₁₁は波長１における種１の消衰係数であり、 ε₁₂は波長２における種１の消衰係数であり、など、そしてc₁は種１の濃度である。消衰行列が正方（square）でない場合、単純逆行列を生成し得ず、かわりに偽逆行列を以下のようにして用いなければならない： ε^Tが移項された吸光行列である場合、（ε^T*ε）^-1が行列^Tおよびεの積の逆行列であり、[(ε^T*ε)^-1*ε^T]は偽逆行列である。全ての分光光度的測定を、空気をブランクにして２nm解像度HP8452ダイオード配列分光光度計（Hewlett Packard，Palo Alto，CA）を用いて実施した。スペクトルの大多数は、0.1mmの経路長のクォーツセルを用いて補集したが、いくつかの実験は１mmおよび１cmの経路長のクォーツセルを必要とした。スペクトルを19 0〜820nmウィンドウから５秒間の積分時間で補集した。プラスミドpSGE1.1E4を含有するE.coli株SGE127の発酵由来の産物を用いて、以下に記載の条件下で、消衰係数を測定した。補集時間における消衰係数についてのスペクトルをベースライン補正する試みを行わなかった。続くサンプルのスペクトルを、700nmと800nm との間の平均吸収を０に特定化する分光光度計のベースライン補正ルーチンを用いて補集した。消衰係数の決定与えられた波長のセットのrHb1.1の偽逆行列を決定するために、これらの波長での目的の種の消衰係数を確立する必要があった。以下の手順を、HbMet、HbCO 、HbO₂およびHbの消衰係数を計算するために用いた。１．ヘムに関して２倍過剰のフェリシアン化カリウム（K₃Fe(CN)₆）を発酵産物のアリコートに加え、測定の前に30分以上反応させた。次いでスペクトルを補集し、100％ HbMetであると仮定した。CO添加および不添加で希釈したサンプルを測定し、酸化の完了を測定した。２．組換えヘモグロビンのサンプルを、５mlシリンジに入れた。シリンジを9 9％一酸化炭素で充満し、封着し、そして約５分間回転した。ガスを排出し、新鮮な一酸化炭素に交換し、封着し、そして約５分間回転した。次いでこの手順を一酸化炭素を用いてもう一度繰り返し、そしてサンプルをヘッドスペースなしで封着して保存した。一酸化炭素の添加は、HbMet含量に影響を与えないと仮定した。３．発酵産物のサンプルを、酸素を一酸化炭素のかわりに用いた以外は、サンプル２でのように処理した。酸素の添加は、HbMetまたはHbCO含量に影響しないと仮定した。４．ヘムに基づく100倍過剰の亜ジチオン酸ナトリウム（Na₂S₂O₄）を、発酵産物のアリコートに添加し、測定の前に５分間反応させた。亜ジチオン酸塩の添加は、HbMetおよびHbO2のHbへの還元を生じるが、HbCO含量に影響しないと仮定した。もとのHb全濃度をシアノメトヘモグロビン分析から50.79g/Lとした（シアノメトヘモグロビン分析の詳細については、Tentori，T.およびSalvati，A.M.，（19 81）Methods in Enzymology，E．Antonini，L Rossi- BernardiおよびE．Chianc one，（編）Academic Press，NY，pp707-715を参照のこと）。もとのHbMet含量は、Evelyn-Malloy法により測定したところ5.64％であった。もとのHbCO含量をC Oガスクロマトグラフィー分析から0.82％とした。還元ヘモグロビン含量は、亜ジチオン酸塩還元を除いた全てのサンプルで０％であると仮定した。 HbMet、HbCOおよびHbO₂のそれぞれについて、総計30のスペクトルを収集し、H bのために10スペクトルを補集した。０ベースラインを保証するために、それぞれのスペクトルについて700〜800nmあるいは790〜810nmのいずれかの平均吸収を計算し、そのスペクトルの全ての吸収から減じた。２つの異なる補正ウインドウを評価するための理由は、有意な吸収がバックグラウンド補正により失われないことを保証するためであった。続く計算を、補正ウィンドウの影響を確立するために並行して実施した。与えられた種についての補正ウインドウ内で、全てのスペクトルをそれぞれの波長で平均化した。K₃Fe(CN)₆およびNa₂S₂O₄の添加に関連した希釈、ならびにいくつかのサンプルの混合した性質を調整して、それぞれの種について消衰係数を、OD*L/g*0.1mmおよびOD*L/４mmol*cmの単位で計算した。次いで計算値を天然のHbA₀の文献値と比較した（Zijlstraら、(1991)Clin．Chem. 37: 1633; van AssendelfdtおよびZijlstra（1975）Anal．Biochem．69: 43; Be neschら、(1973)Anal．Biochem．55: 245）。偽逆行列を以下の消衰係数のセットおよびそれぞれの補正ウインドウについて作成した：１．Hbを含む500〜640nmの全波長（全波長／Hb）２．Hbを含む６波長（６波長／Hb）３．Hbを含まない500〜640nmの全波長（全波長／無Hb）４．Hbを含まない６波長（６波長／無Hb）６波長は、504nm，538nm，554nm，562nm，580nm，および630nmであった。これらの波長の選択は、目的の４種の相対消衰係数に基づいた。それぞれの波長は、全種の最大分離点または残りの２種の最大分離を有する２種の等吸収点のいずれかである。最初の実験を、種の濃度および分布の結果として生じる計算への影響を測定するために設計した。全ての場合において、複合スペクトルをそれぞれの条件について補集した。次いで上記のそれぞれの偽逆行列を用いて行列の乗法を実施し、最も有効な偽逆行列を決定した。偽逆行列の遂行能力の比較は、理論的な種の濃度の平均回収に基づいた。全波長／Hb行列は、rHb1.1溶液中のヘモグロビン種の濃度の決定のための偽逆行列解法とともに用いた場合には、他の行列よりも一貫して優れた遂行能力を示した。しかし、全ヘモグロビン濃度は、成分種の消衰係数に影響を有するようである。それゆえ、低濃度（10g/L未満）では、希釈ヘモグロビン溶液を用いて得られた独自の行列を、正確な濃度および組成値を得るために用いなければならない。実施例６プロトポルフィリンIX含量測定の方法ヘモグロビンサンプル中のプロトポルフィリンIX（PIX）含量の測定を、逆相カラムでのグロビンからのヘムおよびプロトポルフィリンIXの分離に基づくHPLC （高圧液体クロマトグラフィー）分析により、達成した。サンプルを、分析の前に約１mg/mlヘモグロビンに希釈した。全てのヘム化合物が同一の色因子を用いて定量されることを保証するために、溶液中の全てのヘムを分析の前にヘミンに酸化した。これは、カラムへのサンプルの注入の直前に、K₃[Fe(CN)₆]をヘモグロビンサンプルと混合して、ヘム中のFe²⁺をFe3⁺に酸化することにより、達成した。ヘム、プロトポルフィリンIX、およびグロビンの溶出を、増加する非極性緩衝液勾配（例えば、水／TFAからアセトニトリル）により、達成した。ヘミンおよびプロトポルフィリンIXのスペクトルは類似しており、それぞれ398nmおよび4 05nmで最大吸収を有する。396nmにおいて、ヘムおよびプロトポルフィリンIXの色因子はほとんど等しく、それゆえそれぞれのピーク下の面積は、それぞれの成分の相対含量に直接的に相当する。0.4％未満のプロトポルフィリンIXのレベル（プロトポルフィリンIX／ヘム＋プロトポルフィリンIX）は、分析方法論の検出限界下にあると考えられた。スペクトル測定は、約390〜410nmの範囲のいずれにおいても、同様の結果でが行われた。実施例７実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液の産生方法実施例１に記載のようにヘモグロビンを産生した。次いで発酵槽内容物を10℃ まで冷却し、約pH 8.0に調整した。調整後、発酵槽ブロス（非破砕E.coli細胞を含む）を800バールの破砕圧力にセットしたNiroホモゲナイザーに、17psiの入口圧力（inlet pressure）で5.7〜6.3リットル／分の流速で、直接流し込んだ。ホモゲナイザーを一度通過させた後、細胞片およびヘモグロビンの流動物を、400c c／分で100％一酸化炭素を用いて散布し、そして平板形プレヒーターに導き、55 ℃まで温めた。次いでプレヒーターからの流出物を突発性膨張撹拌器に導いた。ここでプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンおよび他の細菌性混入物ならびにヘモグロビンイソ型を約11秒間、スチームインジェクションにより82℃±２℃に加熱することにより除去する。同様の結果が、約30秒間の約77℃、あるいは、90 〜120秒間、72℃での加熱で得られ得る。次いで、粗細胞溶解液をさらなる処理の前に25℃まで冷却した。冷却後、溶液に最終濃度12（wt/wt）までけい藻土を添加し、けい藻土を予めコートした回転ドラム真空フィルターにロードした。溶解液の濾過により、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を生じ、これを回収の前に一酸化炭素でインラインで再分布した。粗細胞溶解液のプロトポルフィリンIX含有量を、細胞破砕後および実施例２および６に記載の任意の処理の前に、そしてさらにRDVF濾過の後、同じ技術を用いて測定した。結果を図３に示す。これは、実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液が72℃またはより高い温度で、11秒またはより長い保持時間で産生されることを示す。実施例８部分的に精製されたヘモグロビン溶液の産生方法実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液を、実施例７に記載のように産生し、次いで以下のようにさらに処理した。記載がない限り全ての処理工程の間で、この溶液を６〜20℃に維持したことに留意のこと。１モーラーの酢酸亜鉛を実質的にプロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液に添加し、溶液中の最終亜鉛濃度を２mMとし、pHを8.35〜8.5に調整した。亜鉛の添加およびpHの変化が、亜鉛複合型物質の沈澱を生じさせたために、溶液を、Zeta P lus 90LAフィルターを装着したCUNO濾過装置（Cuno，Inc.，Meriden，CT）を通してデプス濾過により、再明澄化した。次いでこの溶液を、２カラム容積の20mM Zn(OAc)₂でチャージしたキレート化Sepharose Fast Flow 6B（Pharmacia，Inc. , Piscataway，NJ）カラムを用いて、さらに処理した。次いでこのカラムを、２カラム容積の200mM NaClにより平衡化した。次いで実施的にプロトポルフィリン IXを含まないヘモグロビン溶液を、約20グラムヘモグロビン／リットル樹脂のロードでカラム上にロードした。このカラムを、４カラム容積の20mM Tris/750mM NaCl，pH 8.35〜8.5で洗浄し、さらに４カラム容積の10mM Tris/25mM NaCl，pH 8.35〜8.5で洗浄した。捕獲したヘモグロビンを、６〜８カラム容積の15mM EDTA , pH 8.5でカラムから溶出した。次いでカラムを、２カラム容積の200mM NaClで、そして引き続き３カラム容積の0.5N NaOHにより浄化した。全て工程の直線流速は、100〜200cm/時であり；カラムを４〜10℃に維持した。次いで部分的に精製されたヘモグロビン溶液を、タンパク質分析により特徴付けし、IMAC分離工程を通しての精製度を測定した。プロトポルフィリンIXを含まないヘモグロビン溶液中のヘモグロビンを、遠心分離、0.2μmフィルターを通しての濾過、プロトポルフィリンIX測定のための実施例２に記載の固定化金属（亜鉛）アフィニティークロマトグラフィー、および412nmでの検出により、定量した。部分的に精製されたヘモグロビン溶液のヘモグロビンを、540nmでの吸光度により測定した。出発物質（実質的にプロトポルフィリンIXを含まない溶液）中の全タンパク質を、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いて、Bradfordアッセイにより測定した（Bradford，M.，(1976) Anal．Biochem．72: 248）。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー後に産生された部分的に精製されたヘモグロビン溶液中の全タンパク質を定量することはできなかった。これは、ヘモグロビン以外の任意の残留タンパク質がBradfordアッセイの検出限界より下であったためであり、従って、E.coliタンパク質のための特異的アッセイを用いた（詳細のために実施例11を参照のこと）。３回の実施はIMAC精製工程を通しての精製について、以下の結果と類似していた。実施例９実質的に精製されたヘモグロビン溶液の産生方法部分的に精製されたヘモグロビン溶液を、実施例７および８に記載のように産生した。IMAC分離後、次いで部分的に精製されたヘモグロビン溶液を、10,000 N MCOフィルター（Millipore，Inc.，Bedford，MA）を装着した接線フローフィルターで限外濾過した。限外濾過は、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を濃縮し、しかも20mM Tris，pH8.9への緩衝液交換をさせた。この緩衝液は、陰イオン交換樹脂にロードするために必要である。Q Sepharose Fast Flowカラム（陰イオン交換カラム）上にロードするための、部分的に精製されたヘモグロビン溶液の調製の間に、カラム自身を、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を調製するために用いたのと同一の緩衝液である20mM Tris，pH 8.9で洗浄することにより平衡化した。次いで部分的に精製されたヘモグロビン溶液をカラム上にロードし、樹脂１リットル当たり20グラムのヘモグロビンをチャージした。ロードしたカラムを700μS/cmの伝導率の12mM Tris，pH7.7で洗浄し、そして最終的に、pHをp H 7.5に低下させて12mM Trisにより溶出した。次いで、加圧下でこの溶液に酸素を散布させることにより、溶液を酸素添加し、そしてHbCOが３％未満になるまで溶液を再循環させた。実施例10 純粋なヘモグロビン溶液の産生方法混入金属、特にニッケルを実施例７、８および９の方法を用いて以下の手順により、産生された実質的に精製されたヘモグロビン溶液から、除去した。１ミリモーラーのEDTAを酸素添加タンクに添加し、この溶液を限外濾過の前に30分間インキュベートした。酸素添加した、EDTA処理したヘモグロビン溶液を前記のMill ipore限外濾過システムに移し、5〜6倍に濃縮した。次いで製剤緩衝液（150mM N aCl，5mM リン酸ナトリウム，pH7.4）にダイアフィルトレーションを開始し、ED TAが約５ppm未満になるまで継続し、純粋なヘモグロビン溶液を産生した。純粋なヘモグロビンの10バッチを上記の実施例７、８、９および10により調製し、そして実施例６および11に記載の技術を用いて特徴付けを行った。これらの溶液は、平均して、以下の特徴を有した。実施例11 純度および機能性の測定ニッケルを、B.Welz、Atomic Absorption Spectroscopy（1985，Verlagsgesel lschaft，Weinheim，Germany）により記載のように原子吸光法により最終溶液中において測定した。 P⁵⁰およびHill係数を、承認された特許第5,028,588号に記載のように37℃で決定した。プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンを、実施例６に記載のように測定した。 HbCOおよびメトヘモグロビンを、実施例５に記載のように測定した。 EDTAレベルを、分析の前に精製されたヘモグロビンのサンプルを取得し、そして精製されたヘモグロビンを製剤緩衝液（150mM NaCl，5mMリン酸ナトリウム，p H7.4）で10mg/mlの濃度に希釈することにより、クロマトグラフィーで測定した。次いで100μlの10mg/ml FeCl₃・6H₂O溶液を900μlの希釈したサンプルに加えた。次いで鉄処理した物質を30,000 NMCOフィルター（Centricon，Amicon，Bost on，MA）を通して限外濾過し、そして浸透物をODS-Hypersil^TM逆相クロマトグラフィーカラム（５μm; 100×2.1mm）（Hewlett Packard，Palo Alto，CA）で分析した。910ml水、160mlメタノール、10mlの55％（重量/容積）テトラブチルアンモニウムヒドロキシド、pH 6.0から成る緩衝液で無勾配溶出により分離を達成した。次いでこのカラムを、400ml水、600mlメタノール、10mlテトラブチルアンモニウムヒドロキシド、pH 6.0から成る緩衝液で浄化した。EDTA溶出を254nmでモニターし、そしてEDTAに割り当てられたピークをEDTAスタンダードに対して定量した。菌体内毒素を、Cape Cod and Associates（Falmouth，MA）により産生された発色性LALアッセイを製造業者の指導に従って用いて、測定した。 ECPを、ELISAダブルサンドイッチフォーマットイムノアッセイを用いて、測定した。コーティング抗体は、E.coli K-12株の粗溶解液に対するウサギ血清のIgG 画分であり、Dakopatts，Inc．（Glostrup，Denmark）から商業的に入手可能である。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したコーティング抗体と同一のものであった。このアッセイのための酵素基質は、TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン）であった。ECPスタンダードを、２つの陽イオン交換カラムを通してのE.coli溶解液の精製により生成させ、これは、プロセスの最終的な陰イオン交換の工程により除去されたECPを示していると仮定される。前記の記載は、当業者が本発明を実施し得るために十分であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マシューズ，モウラ−アンエイチ. アメリカ合衆国コロラド 80304，ボールダー，エヌ．ブロードウェイ 3100，アパートメント 205 (72)発明者アーンスト，ウルリッチピー. アメリカ合衆国ニューヨーク，オッシニング，セダーレーン 96 (72)発明者トレイラー，デイビッドダブリュー. アメリカ合衆国コロラド，ウィートリッジ，フィールドドライブ 4045 (72)発明者マシューズ，アントニージェイ. アメリカ合衆国コロラド 80027，ルイスビル，ローカストコート 6732 (72)発明者ニーウェイ，ジャスティニアンオー. アメリカ合衆国コロラド 80503，ロングモント，ネルソンロード 3197

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液を産生するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：（a）ヘモグロビン含有粗溶解液を取得する工程、（b）該ヘモグロビン含有粗溶解液を十分な温度で、十分な時間、加熱して、該ヘモグロビン含有粗溶解液中の混入物を減らして、該実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液を取得する工程。２．前記混入物がプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンである、請求項１に記載の方法。３．前記ヘモグロビン含有粗溶解液が、ヘモグロビン含有細胞から取得される、請求項１に記載の方法。４．前記ヘモグロビン含有細胞が、非赤血球細胞である、請求項３に記載の方法。５．前記非赤血球細胞が、細菌細胞である、請求項４に記載の方法。６．前記細菌細胞が、E.coliである、請求項５に記載の方法。７．前記実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液中の前記プロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンが、全ヘモグロビンの約６％未満、より好ましくは該ヘモグロビンの約１％未満である、請求項２に記載の方法。８．前記十分な時間が、一時間未満である、請求項１に記載の方法。９．前記十分な時間が、約５分までである、請求項８に記載の方法。 10．前記十分な時間が、約30秒までである、請求項９に記載の方法。 11．前記十分な時間が、約10〜12秒である、請求項10に記載の方法。 12．前記十分な温度が、約70℃〜約90℃の範囲にある、請求項８〜11のいずれかに記載の方法。 13．前記十分な温度が、約75℃〜85℃の範囲にある、請求項12に記載の方法。 14．前記十分な温度が、約77℃である、請求項13に記載の方法。 15．前記約77℃が、75℃〜79℃の範囲にある、請求項14に記載の方法。 16．前記十分な温度が、約82℃である、請求項13に記載の方法。 17．前記約82℃が、80℃〜84℃の範囲内にある、請求項16に記載の方法。 18．工程（a）の前に、前記ヘモグロビン含有粗溶解液中のヘモグロビンを熱安定状態に変換する工程をさらに包有する、請求項１に記載の方法。 19．前記ヘモグロビン含有粗溶解液をリガンド化ガスに曝してリガンド化ヘモグロビンを産生することにより、ヘモグロビンを熱安定状態に変換する、請求項18 に記載の方法。 20．前記リガンド化ガスが、酸素、一酸化炭素、または酸化窒素である、請求項 19に記載の方法。 21．前記リガンド化ガスが、一酸化窒素である、請求項20に記載の方法。 22．工程（b）の後に、沈澱した混入物を除去して前記実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 23．前記除去が、クロマトグラフィーまたは固体−液体分離による、請求項22に記載の方法。 24．前記加熱が、前記ヘモグロビン含有粗溶解液のスチームインジェクションによる、請求項１に記載の方法。 25．請求項１〜24のいずれかに記載の方法により取得可能な、実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液。 26．ヘモグロビン溶液を産生するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：（a）ヘモグロビン含有溶解液を、２価の金属イオンでチャージした固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）樹脂に接触される工程；（b）該IMAC樹脂を少なくとも１つのIMAC洗浄溶液で洗浄する工程；および（c）溶出溶液で該IMAC樹脂を溶出してヘモグロビン溶液を得る工程。 27．前記２価の金属イオンが、ニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である、請求項26に記載の方法。 28．前記２価の金属イオンが、亜鉛である、請求項27に記載の方法。 29．前記ヘモグロビン含有溶解液が、明澄化されたヘモグロビン含有溶解液である、請求項26に記載の方法。 30．前記明澄化したヘモグロビン含有溶解液が、実質的にプロトポルフィリンIX を含まないヘモグロビン溶液である、請求項29に記載の方法。 31．工程（b）のIMAC樹脂を少なくとも１つのIMAC洗浄溶液で洗浄する工程が、以下の工程を包含する、請求項26に記載の方法：該IMAC樹脂を第一のIMAC洗浄溶液を用いて洗浄する工程；および該IMAC樹脂を第二のIMAC洗浄溶液を用いて洗浄する工程であり、ここで第一のIM AC洗浄液が第二のIMAC洗浄溶液と同一かまたは異なる、工程。 32．前記第一および第二のIMAC洗浄溶液が、Tris、塩、および７より高いpHを含む、請求項31に記載の方法。 33．前記第一のIMAC洗浄溶液が、約20mM Tris、約0.5〜約0.75Ｍ NaCl、および7 .5以上のpHを含み、そして前記第二のIMAC洗浄溶液が、約５〜約19mM Tris、約0 .25〜約0.75M NaCl、および7.6以上のpHを含む、請求項31に記載の方法。 34．前記第二のIMAC洗浄溶液が、前記第一のIMAC洗浄溶液より低い伝導率を有する、請求項33に記載の方法。 35．工程（a）の前に、前記ヘモグロビン含有溶解液がリガンド化ガスで処理される、請求項26に記載の方法。 36．前記リガンド化ガスが、酸素、一酸化炭素、および酸化窒素からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。 37．前記リガンド化ガスが一酸化炭素である、請求項36に記載の方法。 38．前記IMAC樹脂が、pH変化、キレート剤または競合リガンドにより溶出される、請求項26に記載の方法。 39．前記IMAC樹脂が、キレート剤で溶出される、請求項38に記載の方法。 40．前記キレート剤が、約７以上のpHを有する溶出溶液中のエチレンジアミン四酢酸である、請求項39に記載の方法。 41．前記ヘモグロビン含有溶解液が、組換えヘモグロビンを含む、請求項26に記載の方法。 42．前記ヘモグロビン含有溶解液が、微生物細胞の溶解により得られる、請求項 26に記載の方法。 43．前記微生物細胞が、細菌細胞である、請求項42に記載の方法。 44．前記細菌細胞が、E.coliである、請求項43に記載の方法。 45．前記ヘモグロビン含有溶解液が、IMAC樹脂と接触する前に、実質的に混入物を含まない組換えヘモグロビン溶液に変換され；前記二価の金属イオンが亜鉛であり；前記第一のIMAC洗浄溶液が約500〜750mM NaCl、約20mM Tris、約8.0〜約8.3のpH を含み；前記第二のIMAC洗浄溶液が約25mM〜50mM NaCl、約20mM Tris、約8.0〜約8.3のpH を含み；そして前記IMAC樹脂が、約8.0のpHの、約15mMエチレンジアミン四酢酸により溶出される、請求項31に記載の方法。 46．さらに以下の工程を包含する、請求項26に記載の方法：（d）工程（c）の前記ヘモグロビン溶液を陰イオン交換樹脂にロードする工程；（e）該陰イオン交換樹脂を洗浄する工程；および（f）第二の溶出溶液を用いて該陰イオン交換樹脂を溶出して該ヘモグロビン溶液を得る工程。 47．工程（d）の前に、前記ヘモグロビン溶液を交換溶液に交換する工程をさらに含む、請求項46に記載の方法。 48．前記陰イオン交換樹脂を洗浄する工程が以下の工程を包含する、請求項47に記載の方法：前記交換溶液を用いて前記陰イオン交換樹脂を洗浄する工程；および前記交換溶液より低いpHを有する陰イオン交換洗浄溶液を用いて該陰イオン交換樹脂を洗浄する工程。 49．前記第二の溶出溶液が、前記陰イオン交換樹洗浄溶液よりも低いpHを有する、請求項48に記載の方法。 50．前記交換溶液、陰イオン交換洗浄溶液、および前記第二の溶出溶液が陽イオン性である、請求項49に記載の方法。 51．前記交換溶液が、約8.5〜約9.5のpHの約10〜約30mM Trisを含み；前記陰イオン交換洗浄溶液が、約7.6〜約7.9のpHの約10〜約15mM Trisを含み；そして前記第二の溶出溶液が、約7.4から約7.6未満のpHの約10〜約15mM Trisを含む、請求項50に記載の方法。 52．前記交換溶液が、約8.5のpHの約20mM Trisであり、前記陰イオン交換洗浄溶液が、約7.7のpHの約12mM Trisであり、そして前記第二の溶出溶液が約7.5のpH の約12mM Trisである、請求項51に記載の方法。 53．前記交換溶液が、約8.5〜約9.5のpHの約10〜約30mMトリエタノールアミンを含み；前記陰イオン交換洗浄溶液が、約7.5〜約8.5のpHの約20〜約30mMトリエタノールアミンを含み；そして前記第二の溶出溶液が、約7.0〜約8.0未満のpHの約10〜約30mMトリエタノールアミンを含む、請求項51に記載の方法。 54．前記交換溶液が、約8.9のpHの約25mMトリエタノールアミンであり、前記陰イオン交換洗浄溶液が、約8.2のpHの約23mMトリエタノールアミンであり、そして第二の溶出溶液が、約7.5のpHの約13mMトリエタノールアミンである、請求項5 3に記載の方法。 55．工程（a）の前に、前記ヘモグロビン含有溶解液が、リガンド化ガスを用いて処理される、請求項54に記載の方法。 56．工程（f）の前記実質的に精製されたヘモグロビン溶液を酸素に曝すことにより、前記リガンド化ガスを除去して、同時に一酸化炭素ガスを除去する工程をさらに含む、請求項55に記載の方法。 57．（g）キレート剤を工程（f）の前記ヘモグロビン溶液に添加する工程をさらに含む、請求項46に記載の方法。 58．（h）工程（g）の前記ヘモグロビン溶液から前記キレート剤を除去する工程をさらに含む、請求項57に記載の方法。 59．前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸である、請求項58に記載の方法。 60．請求項26〜59のいずれかに記載の方法により得られ得る、ヘモグロビン溶液。 61．薬学的に受容可能な製剤緩衝液中に製剤された、請求項60に記載のヘモグロビン溶液。 62．実質的に精製されたヘモグロビン溶液を産生するための方法であり、以下の工程を包含する、方法：（a）ヘモグロビン含有粗溶解液を取得する工程；（b）該ヘモグロビン含有粗溶解液を十分な温度で、十分な時間加熱して、該ヘモグロビン含有粗溶解液中の混入物を減少させて、前記実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液を取得する工程；（c）該実質的に混入物を含まないヘモグロビン溶液を、二価の金属イオンでチャージした固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）樹脂に接触させる工程；（d）該IMAC樹脂を洗浄する工程；（e）該IMAC樹脂を溶出して、部分的に精製されたヘモグロビン溶液を得る工程；（f）該部分的に精製されたヘモグロビン溶液を陰イオン交換樹脂上にロードする工程；（g）該陰イオン交換樹脂を洗浄する工程；および（h）該陰イオン交換樹脂を溶出して、該実質的に精製されたヘモグロビン溶液を得る工程。 63．（i）前記実質的に精製されたヘモグロビン溶液を酸素に曝すことにより一酸化炭素を除去する工程をさらに含む、請求項62に記載の方法。 64．（j）キレート剤を前記実質的に精製されたヘモグロビン溶液に加える工程をさらに含む、請求項63に記載の方法。 65．（k）前記キレート剤を除去して純粋なヘモグロビン溶液を得る工程をさらに含む、請求項64に記載の方法。 66．前記混入物がプロトポルフィリンIX含有ヘモグロビンである、請求項65に記載の方法。 67．請求項62〜66のいずれかに記載の方法により得られ得る、実質的に精製されたヘモグロビン溶液。 68．薬学的に受容可能な製剤緩衝液中に製剤された、請求項67に記載の実質的に精製されたヘモグロビン溶液。