EP1346032A2

EP1346032A2 - Verfahren zur herstellung von kohlenhydraten

Info

Publication number: EP1346032A2
Application number: EP01989498A
Authority: EP
Inventors: Dirk Engels; Alireza Haji Begli; Markwart Kunz; Ralf Mattes; Mohammad Munir; Manfred Vogel
Original assignee: Suedzucker AG
Current assignee: Suedzucker AG
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2003-09-24
Also published as: WO2002050257A2; MXPA03005645A; CA2431994A1; WO2002050257A3; AU2002227939A1; US20040086902A1; JP2004524826A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die modifizierte Polypeptide mit Fructosyltransferase-Aktivität codieren, diese Nucleinsäure enthaltende Vektoren zur Expression der modifizierten Fructosyltransferase in pro- oder eukaryontischen Zellen, diese Vektoren enthaltende Wirtszellen und/oder transgene Pflanzen, Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen Polyfructanen mit vorweigend βbeta-1, 2-Bindungen und einem sehr niedrigen Verzwendung des erfindungsgemäss hergestellten Inulins oder unter Verwendung von Saccharose, sowie Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden unter Verwendung des erfindungsgemäss hergestellten Inulins oder unter Verwendung von Saccharose, sowie die Verwendung des erfindungsgemäss hergestellten Inulins zur Herstellung von INulinethern und INulinestern und die Verwendung von Fructooligosacchariden oder hydrierten Fructooligosacchariden und Difructosedianhydriden als Lebensmittelszusatz, insbesondere als diätisches Lebensmittel.

Description

Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydraten

Besehreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsauren, die modifizierte Polypeptide mit Fructosyltransfe- rase-Aktivität codieren, diese Nucleinsäure enthaltende Vektoren zur Expression der modifizierten Fructosyltransferase in pro- oder eukaryontischen Zellen, diese Vektoren enthaltende Wirtszellen und/oder transgene Pflanzen, Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen Polyfruetanen mit vorwiegend ß-1, 2-Bindungen und einem sehr niedrigen Verzweigungsgrad, insbesondere von Inulin, Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden unter Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten^' Inulins oder unter Verwendung von Saccharose, sowie Verfahren zur Herstellung von Difruetosedianhydri- den unter Verwendung des erfindungsgemäß herge- stellten Inulins oder unter Verwendung von Saccharose, sowie die Verwehdung des erfindungsgemäß hergestellten Inulins zur Herstellung von Inulinethern und Inulinestern und die Verwendung von Fructooligosacchariden oder hydrierten Fructooligosacchari- den und Difructosediarihydriden als Lebensmittelzusatz, insbesondere als diätisches Lebensmittel.

Niedermolekulare Saccharide, beispielsweise Mono- saccharide wie Glucose, und Oligosaccharide, wie Saccharose, finden Anwendung als Substrate für bio- technologische Prozesse beziehungsweise in modifizierter Form als Hilfsstoffe für unterschiedliche Industriezweige . So werden zum Beispiel größere Mengen von Glucose für chemische Synthesen, beispielsweise von Sorbit und Glutamat, und für technische Zwecke, unter anderem zur alkoholischen Gä- rung, eingesetzt. Saccharose, die volkswirtschaftlich bedeutendste Zuckerart, wird hauptsächlich zu Speisezwecken und zur Konservierung verwendet, kann jedoch auch für Kunststoffe, Firnisse, zur Synthese von Eiweiß, Aminosäuren, Antibiotika etc. sowie als Zuschlagsstoff für Hart-PUR-Schäume verwendet werden.

Wesentlich häufiger werden Polysaccharide, wie Cel- lulose und Stärke, in nativer beziehungsweise modifizierter Form in der Industrie eingesetzt. Stärke ist nicht nur das wichtigste Nahrungsmittel des Menschen. Fabrikmäßig gewonnene Stärke wird auch in der Papierindustrie, unter anderem zur Herstellung von Kartonagen oder als Papierhilfsmittel, beispielsweise zum Leimen von Papier, in der Textilin- dustrie, beispielsweise als Schlichte oder zum Appretieren und Beschweren neuer Gewebe oder als Steifungsmittel für. Wäsche, und in der Pharmazie, beispielsweise als Spreng- und Füllmittel für Tabletten, als Gleit- und Füllmittel für Puder, als Grundlage für Salben etc., eingesetzt. Cellulose ist einer der wichtigsten Rohstoffe für zahlreiche Industriezweige. Die größten Cellulosemengen werden dabei von der Papier- und Textilindustrie verbraucht, wobei beispielsweise die verbreitesten Textilgewebe aus mehr oder weniger reiner, natürlicher oder künstlich umgewandelter Cellulose bestehen. Zunehmende Bedeutung . erlangen Polysaccharide beziehungsweise Polysaccharid-Derivate auch als Zuschlagsstoff in der Bauindustrie.

Trotz der zahlreichen bereits etablierten Anwendungen besitzen sowohl Cellulose als auch Stärke gra- vierende Nachteile. Beispielsweise erfordert die Herstellung von chemischen Cellulose-Derivaten, also von Produkten, die beispielsweise über Ver- esterungs- und/oder Veretherungsreaktionen, Substitutionen, Oxidations- oder Vernetzungsreaktionen erzeugt werden, die Verwendung zahlreicher chemischer Reagenzien, insbesondere die Verwendung von Lösungsmitteln, deren nachfolgende Entsorgung zum Teil mit erheblichen Kosten verbunden ist. Die Herstellung von Cellulose-Derivaten ist daher im All- gemeinen wesentlich teurer als die Herstellung von Stärke-Derivaten. Hingegen ist die Herstellung von Stärke-Derivaten mit dem Problem verbunden, dass Stärke eine heterogene Verbindung ist, die aus der linear aufgebauten Amylose und dem stark verzweig- ten Amylopektin besteht. Aufgrund dieser Heteroge- nität ist es nicht oder nur bedingt möglich, eine chemische Stärke-Derivatisierung reproduzierbar und gezielt durchzuführen. Seit Jahren wird daher, allerdings mit bislang mäßigem. Erfolg, versucht, Pflanzen zu züchten,^' die ausschließlich amylosehal- tige Stärke liefern. Kostengünstige, für den großtechnischen Einsatz geeignete Polysaccharide mit vorwiegend linearer Struktur stehen daher zur Zeit auf dem Markt nicht zur Verfügung.

Für Anwendungsfälle, in denen insbesondere eine lineare Struktur' der ^' Kohlenhydrat-Polymere für die gewünschten Eigenschaftsprofile die entscheidende Voraussetzung ist, stellen daher längerkettige Po- lyfructane eine wichtige Alternative dar. Bei den Polyfructanen handelt es sich um Polysaccharide, bei denen hauptsächlich Fructose-Einheiten mitein- ander verknüpft sind. Polyfructane unterscheiden sich durch die Art der Verknüpfung der Fructose- Einheiten. Beispielsweise liegen die Fructose- Einheiten bei dem wichtigsten Polyfructan Inulin in furanosider Form mit ß-1, 2-Bindung vor. Bei dem Po- lyfructan Levan sind die Fructose-Einheiten über ß- 2, 6-Bindungen verknüpft. Polyfructane sind Reserve- Kohlenhydrate, die bei einer Reihe monocotyler und dicotyler Pflanzen, beispielsweise Compositen, Gräsern und Getreiden, aber auch bei Algen sowie eini- gen grampositiven und gramnegativen Bakterien zu finden sind.

Inulin ist ein Polyfructan mit vorwiegend linearer Struktur, wobei Fructose-Einheiten über ß-1,2- Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette wahr- scheinlich von einer nicht reduzierenden α-D- Glucose-Einheit abgeschlossen wird. Inulin findet sich allein oder zusammen mit .Stärke als Reserve- Kohlenhydrat unter anderem in Dahlienknollen, Artischocken, Topinamburknollen, Zichorienwurzeln und in den Zellen von Inula und anderen Korbblütlern (Compositae) , seltener auch in verwandten Pflanzenfamilien (Campanulaceae, Lobeliaceae) . Die Inuline aus verschiedenen Pflanzenarten unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihren mittleren Polymerisati- onsgrad. Beispielsweise besitzt Inulin aus Topinambur einen mittleren Polymerisationsgrad von 5-7, Inulin aus Zichorien einen mittleren Polymerisationsgrad von 10-12 und Inulin aus Artischocken einen mittleren Polymerisationsgrad von etwa 25 (Beck, R. H. F. und Praznik, W., Inulinhaltige Pflanzen aus Rohstoffquelle. Starch/Stärke, 38 (1986), 391-394). Aufgrund ihrer linearen Struktur können aus diesen Inulinen relativ problemlos Derivate hergestellt werden, wobei diese Derivate weitestgehend biologisch abbaubar sind. Wegen der relativ kurzen Ketten sind derartige Inuline beziehungsweise daraus hergestellte Derivate jedoch für einen Einsatz als polymere Tenside, Emulgatoren und Weichmacher nicht geeignet. Ebenso bekannt ist die Verwendung von I- nulin als „bulking agent" beziehungsweise als Fettersatzstoff .

Es ist auch bekannt, Inulin zu Fructooligosacchari- den zu hydrolysieren und diese als präbiotische Lebensmittelzutaten einzusetzen (Wang, X. und Gibson, G. R., J. Appl. Biochem., 75 (1993), 373-380). Ein gravierender Nachteil dieser Fructooligosaccharide besteht jedoch in ihrem relativ hohen Glucosean- teil. So enthalten Fructooligosaccharide, die aus dem Inulin von Topinambur hergestellt wurden, etwa 40 bis 20 % Glucose, während aus dem Inulin von Zichorien hergestellte Fructooligosaccharide etwa 8 bis 10 % Glucose enthalten. Solche Fructooligosac- charide sind nur in beschränktem Maße für die Ernährung von Diabetikern geeignet.

Aus der EP 657 106 AI ist die Herstellung und Verwendung von hydrierten Fructooligosacchariden bekannt. Auch hier erweist sich der relativ hohe Glu- coseanteil der eingesetzten Fructooligosaccharide als nachteilig. Von besonderem Interesse sind Difructosedianhydri- de, die ebenfalls aus Inulin ^• hergestellt werden können und die sich als Nahrungsmittelzutaten verwenden lassen. Sie zeichnen sich insbesondere da- durch aus, dass sie im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhaltig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand beitragen. In der Industrie besteht deshalb großes Interesse an einer kostengünstigen Herstellung von Difructosedianhydriden. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden sind bekannt (Seki, K. et al., Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442; DE-PS 195 47 059; Uchiyama, T., in: Science and Technology of Fructans (Herausgeber Suzuki, M. und Chatter- ton, N. J.) (1993), CRC Boca Raton, Florida). Allerdings ist auch bei den so hergestellten Difruc- tosedianhydriden der hohe Glucosegehalt nachteilig.

Es ist bekannt, dass Polyfructan-enthaltende Pflanzen ebenso wie eine Anzahl von Mikroorganismen Fructosyltransferase (Ftf) -Proteine exprimieren, die die Polymerisierung linearer oder verzweigter Fructose-Polymere katalysieren. Mikrobielle Fructo- syltransferasen wurden beispielsweise in Strepto- coccus-, Bacillus-, Pseudomonas-, Xanthomonas-, A- cetobacter-, Erwinia- und Actinomyces-Stämmen nachgewiesen. Bei mikrobiellen Polyfructanen sind die Fructosereste über ß-1,2- und/oder ß-2, 6-Bindung verknüpft. Das ^• heißt, bei mikrobiellen Fructo- syltransferasen handelt es sich entweder um Inulin- sucrasen oder um Levansucrasen . Während pflanzliche Polyfructane ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweisen, wobei pro Molekül etwa 10 bis 30 Fructo- seeinheiten verknüpft sind, besitzen mikrobielle Polyfructane ein Molekulargewicht von bis zu 10⁶ bis ' 10⁸, wobei mehr als 100 000 Fructose-Einheiten verknüpft sein können. Untersuchungen zur Polyfruc- tan-Biosynthese haben zudem gezeigt, dass die Bio- 5 synthese in Bakterien generell wesentlich einfacher verläuft als in Pflanzen. Aus den genannten Gründen besteht ein starkes Interesse, insbesondere bakterielle Fructosyltransferasen zur Herstellung von Polyfructanen zu nutzen.

10 Derzeit ist jedoch lediglich eine bakterielle Fructosyltransferase bekannt, nämlich die aus dem grampositive Bakterium Streptococcus mutans, welche die Bildung von Inulin auf der Basis von Saccharose als Ausgangsmolekül katalysieren kann (Shiroza und Ku-

15 ra itsu, J. Bacteriol . , 170 (1988), 810-816); Ro- sell, K.-G. und Birkhead, D., Acta Chem. Scand., 28 (1974), 589). Das mit der S. mutans- Fructosyltransferase aus Saccharose hergestellte Inulin weist eine Molmasse von 20-60 x 10⁶ g/mol

20 auf. Damit ist der Glucosegehalt des Inulins vernachlässigbar, so dass das Inulin prinzipiell für die Herstellung von Fructooligosacchariden geeignet wäre. Andererseits weist so hergestelltes Inulin jedoch etwa 7 % Verzweigungen auf- und ist dadurch

25 für einen Einsatz als Rohstoff- zur weiteren chemischen Derivatisierung weniger geeignet. Darüber hinaus handelt es sich bei dem Mikroorganismus S. mutans um einen human-pathogenen Keim, so dass seine Verwendung und Vermehrung in industriellem Maß-

30. stab zur Enzymgewinnung mit großen Problemen behaftet ist. Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat- Polymeren, insbesondere Polyfructanen, in transge- nen Pflanzen unter Verwendung mikrobielle Fructo- syltransferasen codierender ftf-Gene, beispielswei- se des Fructosyltransferase-Gens von S. mutans, sind ebenfalls bekannt.

Die PCT/ÜS89/02729 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Kohlenhydrat-Polymeren, insbesondere Dextran oder Polyfructose, in transgenen Pflanzen. Zur Erzeugung dieser Pflanzen wird die Verwendung von Levansucrasen oder Dextransucrasen aus verschiedenen Mikroorganismen vorgeschlagen.

Die PCT/EP93/02110 offenbart ein Verfahren zur Herstellung Polyfructose erzeugender transgener Pflan- zen, die das Isc-Gen für eine Levansucrase aus einem gramnegativen Bateriu enthalten.

Die PCT/US94/12778 beschreibt Verfahren zur Synthese und Akkumulation von Kohlenhydrat-Polymeren in transgenen Pflanzen, wobei unter anderem ein bakte- rielles Fructosyltransferase-Gen verwendet wird, das eine Levansucrase codiert.

Die PCT/NL93/00279 offenbart die Transformation von Pflanzen mit Chimären Genen, die das sacB-Gen aus Bacillus subtiles oder das ftf-Gen aus Streptococ- cus mutans enthalten. Im Falle des eine Levansucrase codierenden sacB-Gens wird zur Erhöhung des Expressionsniveaus in transformierten Pflanzen eine Modifikation des 5 ' -untranslatierten Bereiches des bakteriellen Gens empfohlen. Für das Fructo- syltransferase-Gen aus Streptococcus mutans werden keine Sequenzmodifikationen beschrieben, so dass das Expressionsniveau der Fructosyltransferase vergleichsweise sehr gering ist.

Die PCT/NL95/00241 beschreibt Verfahren zur Produk- tion von Oligosacchariden in transgenen Pflanzen, wobei das Fructosyltransferase-Gen von Streptococcus mutans (Shiroza und Kuramitsu, 1988) verwendet wurde. Darüber hinaus wurden andere Fructosyltrans- ferase-Gene pflanzlichen Ursprungs verwendet. Eben- falls beschrieben ist die Verwendung der in transgenen Pflanzen erzeugten Oligosaccharide als Zuckerersatz, als Nahrungsergänzungsmittel und als bifidogenes Mittel in Nahrungsmitteln sowie als bi- fidogenes Mittel in Tierfutter.

Bei der Verwendung des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans in heterologen Expressi- onssystemen, das heißt sowohl heterologen bakteriellen Expressionssystemen als auch pflanzlichen Systemen, hat sich jedoch herausgestellt, dass das native Protein in äußerst geringen Mengen erzeugt wird und daher auch die Inulin-Produktion nur in sehr beschränktem Maße erfolgt. Diese geringe En- zymprodukt^'ion in heterologen Wirtszellen geht einher mit schwerwiegenden Wachstumsstörungen der Wirtszellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, Verfahren und Mittel, insbesondere Verfahren und Mittel auf der Basis des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans, zur Herstellung von hochmolekularen Polyfructanen, insbesondere Inulin, mit ß-1, 2-Bindungen und einer im wesentlichen linearen Struktur und einem sehr geringen Glucose-Gehalt bereitzustellen, die eine einfache und kostengünstige Erzeugung der Polyfructane in großen Mengen ermöglichen, wobei die vor- stehend beschriebenen Probleme im Stand der Technik, insbesondere die geringe Expression bakterieller Fructosyltransferase-Gene in heterologen Wirtssystemen, überwunden werden.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines modifizierten Fructosyltransferase-Gens aus Streptococcus mutans mit einer Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einer Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 codiert, das ein am N-Terminus und/oder am C-Terminus modifiziertes Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert, insbesondere wobei das Polypeptid am N-terminalen und/oder am C-terminalen Ende mindestens eine Deletion aufweist. Insbesonde- re stellt die vorliegende Erfindung ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinigtes, Nuc- leinsäuremolekül gemäß Hauptanspruch bereit, das ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase (ftf) codiert und welches in einer in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz oder in einer die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz mindestens eine Deletion aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :

a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222;

b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104; und c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

Durch die Deletion der Nucleotide 4 bis 222 beziehungsweise der Nucleotide 1 bis 104 wird die Signalsequenz des nativen Fructosyltransferase-Gens von S. mutans vollständig oder teilweise entfernt, so dass das codierte Signalpeptid der nativen S. mutans-Fructosyltransferase vollständig oder teilweise entfernt wird. Durch die somit erhaltene intrazelluläre Enzymproduktion werden die Wachstums- Störungen heterologer Wirtszellen, wie beispielsweise Escherichia coli, die auf die Expression der Fructosyltransferase von S. mutans zurückzuführen sind, beseitigt und das Enzym kann in hohen Volumenausbeuten aus diesen Zellen gewonnen werden.^'

Überraschenderweise wurde ebenso festgestellt, dass eine die Nucleotide 2254 bis 2385 umfassende Deletion am C-Terminus der Fructosyltransferase zu einer erheblichen Verbesserung des Wachstums heterologer Wirtszellen führt. Die Funktion des deletier- ten hydrophoben Bereiches im nativen Protein ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß führt auch diese Deletion innerhalb des C-terminalen Bereiches zu einer wesentlichen Verbesserung des Wachstums heterologer Wirtszellen und hohen Volumenausbeuten des exprimierten Proteins.

Erfindungsgemäß wurde ferner festgestellt, dass die im 5' -Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Se^¬ quenzbereich eines anderen Gens ersetzt werden kön- nen, wobei es sich bei dem anderen Gen vorzugsweise um das lacZα-Gen handelt. Auch eine ^' solche Mutation- bewirkt ein verbessertes Wachstum heterologer Wirtszellen und hohe Volumenausbeuten des expri- mierten Proteins.

Unter Verwendung der vorstehend genannten erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle lassen sich daher Vektoren herstellen, die in pro- und/oder eukaryon- tischen Zellen eine hohe Expression eines modifizierten Polypeptids mit der Aktivität einer Fructosyltransferase gewährleisten. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine besonders hohe Volumenausbeute des expri ierten Proteins in bakteriellen Wirtssystemen erreicht wird, wenn die erfindungsgemäßen, am 5' -Ende und/oder am 3' -Ende deletierten Nucleinsäuremoleküle beziehungsweise Nucleinsäure- moleküle, bei denen die am 5' -deletierten Sequenzen durch einen Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt sind, in die Expressionskassette des Escherichia coli-Vektors pJOE2702 (Volff et al . , Mol. Mic- robiol., 21 (1996), 1037-1047; Stumpp et al . , Bio- spektrum, 1 (2000) , 33-36) integriert werden. Dieser Vektor ist durch L-Rhamnose induzierbar und wird positiv reguliert.

Die erfindungsgemäß hergestellten pro- und eukary- ontischen Wirtszellen können in Verfahren zur Her- Stellung von Polyfructanen mit ß-1, 2-Bindungen verwendet werden, wobei nach der Kultivierung und Vermehrung -dieser Wirtszellen aus den Zellen ein Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase isoliert wird und das isolierte ^• Protein - in vitro zur Behandlung einer Saccharoselösung eingesetzt wird. Anschließend kann das enzymatisch gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein Polyfructan direkt aus Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten, oder aus einer trans- genen Pflanze, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthält, isoliert werden. Bei dem so hergestellten Polyfructan handelt es sich vorzugsweise um Inulin mit einem Polymerisationsgrad von >100 und einem Verzweigungsgrad von < 8 %, vor- zugsweise < 3 %.

Das erfindungsgemäß hergestellte Inulin wird in weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zur Herstellung von Fructooligosacchariden beziehungsweise Difructosedianhydriden verwendet. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden sieht vor, dass das erfindungsgemäß hergestellte Inulin mit einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert wer- den. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharose-Lösung gleichzeitig mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die enzymatisch erzeugten Fructooligo- saccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung von Difructose- dianhydriden. In einer Ausgestaltung wird erfin- dungsgemäß hergestelltes Inulin mit einer Endo- - Inulinase und Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung mit einer erfindungsgemäßen Fructosyltransferase und einer Endo- Inulinase und Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird also in bevorzugter Ausführungsform ein, vorzugsweise isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das ein bakterielles Fructosyltransferase (ftf) -Gen ist und ein^' Polypeptid mit der Aktivität einer Fructo- syltransferase codiert und am 5' -Ende und/oder am 3' -Ende mindestens eine Deletion enthält..

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem bakteriellen Fructosyltransferase-Gen oder einem Nucleinsäuremolekül, das ein bakteriel- les Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert, die codierende DNA-Sequenz eines Genes verstanden, dessen Genprodukt die Aktivität einer Saccharose: 2, 1-ß-D-fructosyltrans- ferase (EC 2.4.1.9) aufweist und das ursprünglich aus einem Bakterium, vorzugsweise aus Streptococcus mutans, stammt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Fructosyltransferase" oder "ß-D-Fructosyltransferase" ein Polypeptid oder ein Protein, das die Synthese, eines hochmolekularen, aus sich wiederholenden Fructose- Einheiten bestehenden Kohlenhydrat-Polymers kataly- sieren kann, wobei Saccharose als Ausgangssubstrat für die weitere Polymerisation dient. In dem so synthetisierten polymeren Produkt sind die sich wiederholenden Fructose-Einheiten über ß-1,2- Bindungen miteinander verknüpft, so dass die Fructosyltransferase, die die Synthese dieses Produktes katalysiert, auch als Inulinsucrase bezeichnet werden kann. Das synthetisierte, aus sich wiederholenden Fructose-Einheiten bestehende hochmolekulare Polymer weist vorzugsweise eine lineare Struktur auf, kann einen terminalen, von einem Saccharose- Molekül stammenden Glucose-Rest enthalten und u - fasst mindestens zwei Fructose-Reste . Im Zusammenhang mit der Erfindung wird dieses Kohlenhydrat als Polyfructan bezeichnet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem synthetisierten Polyfructan um Inulin.

Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Beispiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine RNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann beispielsweise aus - Streptococcus mutans-Zellen isoliert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein.

Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül weist in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mindestens eine Deletion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) den Nucleotiden 4 bis 222, b) den Nucleotiden 1 bis 104 und c) den Nucleotiden 2254 bis 2385 auf. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ^• wird unter dem Begriff „De-- letion" eine Mutation verstanden, bei dem ein Teil der im Wildtyp-Gen vorhandenen Nucleinsäuresequenz fehlt. Deletionen können beispielsweise in vitro unter Verwendung von Restriktionsenzymen erzeugt werden, wenn der zu deletierende Bereich von geeigneten Restriktions-Schnittstellen flankiert wird. Deletionsmutationen lassen sich auch mit Hilfe bestimmter Endonucleasen, beispielsweise unter Verwendung des Enzyms BAL-31, einführen. Derartige En- zyme bauen die Enden ab, die durch Restriktionsenzym-Spaltung erzeugt wurden. Eine Deletionsmutage- nese kann aber auch unter Verwendung eines mutierten Primers in einer PCR-Reaktion erreicht werden. Die Sequenz eines solchen Primers überspannt dabei den Bereich, der deletiert werden soll, wobei der Primer an zwei Bereiche einer Zielregion bindet, die den zu deletierende Bereich flankieren. Bei der Amplifikation wird also der vom Primer überspannte Bereich nicht erfaßt und somit nicht amplifiziert .

Die erfindungsgemäßen Deletionen des Fructo- syltransferasegens betreffen vorzugsweise den 5'- Bereich. und den 3' -Bereich des nativen Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans .

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform mit einer Deletion im 5' -Bereich, die die Nucleotide 4 bis 222 umfasst, ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Protein mit der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Im Ursprungsorganismus S. mutans vermittelt eine Signalsequenz die Sekretion des Enzyms aus dem Cytoplas a, wobei die Signalsequenz während des Sekretionsvorgangs durch eine Signal- peptidase abgespalten wird. Der Signalpeptid- abhängige Proteinexport, der bei grampositiven und gramnegativen Bakterien in ähnlicher Weise abläuft, ist ein komplexer energieabhängiger Prozeß, an dem eine Vielzahl löslicher und membrangebundener Proteine beteiligt sind (Schatz und Beckwith, Annu. Rev. Genet . , 24 (1990), 215). Bei einer angestrebten Überproduktion des Fructosyltransferase- Proteins - in einem heterologen Wirtsorganismus könn- te die Signalsequenz insofern zu einer Beeinträchtigung des Wachstums des Wirtes und somit zur Verringerung der Produktausbeute führen, wenn die Signalsequenz auch im heterologen Wirt funktioneil ist und die- produzierte Proteinmenge die Kapazität des Sekretionsmechanismus übersteigt und/oder wenn andere physiologische intra- oder extrazelluläre Prozesse im Bereich der Zellmembran durch das rekombi- nante Protein selbst oder durch die Sekretion des rekombinanten Proteins gestört werden.

Eine vollständige Entfernung der das Signalpeptid codierenden Nucleinsäuresequenzen in dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 3 führt zu einer vollständigen Entfernung des Signalpeptids, so dass die Expression des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Proteins in einem heterologen Wirt zur intrazellulären Produktion des Genprodukts führt. Durch die intrazelluläre Produktion der Fructosyltransferase werden die Wachstumsstörungen, die bei Wirtssystemen, die das ' native Fructosyltransferase- Protein exprimieren, nahezu vollständig beseitigt und das gewünschte Proteinprodukt kann in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für eine Deletion im 3' -Bereich des nativen Fructosyltranbs- ferasegens ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 7 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das ein Polypeptid mit der in SEQ ID Nr. 8 gezeigten Aminosäuresequenz codiert. Bei diesem Nucleinsäuremolekül sind die Nucleotide 2254 bis 2385 deletiert. Dieser Bereich weist einen hohen Hydropathie-Index auf, wie mittels des Verfahrens von Kyte und Doo- little (J. Mol. Biol., 157 (1982), 105-142) gezeigt wurde. Obwohl diesem hydrophoben Bereich keine direkte Funktion zugeordnet werden kann, zeigen hete- rologe Wirtssysteme bei der Expression eines solchen modifizierten Fructosyltransferase-Proteins gegenüber Wirtszellen, die das native Fructosyltransferase-Protein exprimieren, ein erheblich verbessertes Wachstumsverhalten. Das modifizierte Protein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten isoliert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die im 5' -Bereich des Fruc_.tosyltransferasegens deletierten Sequenzen durch den Sequenzbereich eines anderen Gens ersetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem anderen Gen um das lacZα-Gen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der- Begriff „Ersetzen", dass die das Signalpeptid codierenden ftf- Sequenzen vollständig oder teilweise durch äquivalente Sequenzen eines anderen Gens ersetzt werden können. Bei Verwendung des lacZα-Gens werden also - äquivalente Sequenzen dieses Gens mit dem am

5' -Ende deletierten Fructosyltransferasegen fusio-

- niert. Ein besonders bevorzugtes Beispiel dafür ist das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 5 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Bei dieser ftf-Genvariante wurden die Nucleotide 1 bis 104 der nativen Fructosyltransferase-Nucleinsäure- sequenz gegen die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ausgetauscht. Das Nucleinsäuremolekül weist daher gegenüber der nativen ftf-Sequenz eine Deletion der Nucleotide 1 bis- 104 auf. Der Austausch am 5' -Ende führt bei einer Expression des Fusionsproteins in heterologen Wirtssystemen zur einer Lokalisation des Genproduktes im periplasmatischen Raum. Mit einem solchen Plasmid transformierte Wirtszellen zeigen daher gegenüber das Wildtyp-ftf-Gen enthalten- den heterologen Wirtszellen ein deutlich verbessertes Wachstum und das Fusionsprotein kann ebenfalls in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 9 gezeigten Nucleinsäuremolekül, das eine in ^■ SEQ ID Nr. 10 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, und das Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 11 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das eine in SEQ ID Nr. 12 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Das Nuclein- säuremolekül mit der SEQ ID Nr. 9 weist am 5' -Ende eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 auf und am 3' -Ende eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385. Bei dem Nucleinsäuremolekül mit der SEQ ID Nr. 11 sind die Nucleotide 1 bis 104 durch die Nucleotide 1 bis 83 des lacZα-Gen ersetzt worden und das 3'- Ende weist ebenfalls eine Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385 auf. Beide ftf-Genvarianten führen bei Expression der entsprechenden Genprodukte in heterologen Wirtssystemen zu einer deutlichen Verbesserung des Wachstums, wobei die entsprechenden Genprodukte in hohen Volumenausbeuten gewonnen werden können.

Die Erfindung umfasst ebenfalls modifizierte Nucleinsäuremoleküle, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines erfindungsgemäßen Nuc- leinsäuremoleküls erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Derivate und funktionelle Äquivalente, also strukturverschiedene aber funktionsidentische oder funktionsähnliche Abwandlungen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls bezeichnet v/erden können. Die Sequenz von Nucleinsäure olekülen kann beispielsweise weiter gezielt modifiziert werden, um innerhalb der Nucleotidsequenz geeignete Restriktionsschnittstellen zu erzeugen oder nicht erforderliche Sequenzteile zu entfernen. Die Modifikationen der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe ' von Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie erfolgen. Dazu werden die entsprechenden Nucleinsauren in Plasmiden inseriert und Mutagenese-Verfahren oder einer Sequenzverände- rung durch Rekombination unterworfen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen. oder Substitutionen, wie. Transitionen oder Transversionen, eignen sich beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "Primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren (vergleiche Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. Auflage (1989), Gold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA) . Weitere Sequenzverän- derungen lassen sich auch durch Anlagerung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugsweise um Plasmide, Cosmide, Viren, Liposomen, Bak- teriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere funktio- nelle Elemente, enthalten, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einer Wirtszelle bewirken oder zumindest dazu beitragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform um- fasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremole- ^• kül unter der funktioneilen Kontrolle von mindestens einem regulatorischen Element steht. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff "regulatori- sches Element" solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nuclein- säuremolekülen in prokaryontischen und/oder eukary- ontischen Wirtszellen gewährleisten, so dass ein Polypeptid oder Protein exprimiert wird. Bei regu- latorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Silencer und/oder Transkriptionstermina- tionssignale: handeln. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz, insbesondere den Protein-codierenden Abschnitten die- ser Nucleotidsequenz, funktioneil verbunden sind, können Nucleotidsequenzen sein, die aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Prote- in-codierende Nucleotidsequenz selbst. Beispiele davon sind: T7, T3, SP6 und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur in vitro-Transkription; P_LAC/' P_Ltet und weitere gebräuchliche Regulationsele- mente zur Expression in E. coli; GAL1-10, MET25, CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEF1, PMA1 und andere Regulationselemente zur Expression in der Bäckerhefe S. cerevisiae; Polyhedrin zur Expression in Baculovi- rus-Systemen; P_CMV, P_SV _O und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen; gewebe- oder organspezifische- insbesondere spei- cherorganspezifische Promotoren, wie der Vicillin- Promotor aus Pisum sativum, der Arabidopsis- Promotor AtAAPl oder der Patatin-B33-Promotor, zur Expression in pflanzlichen Systemen.

In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit einer Signalsequenz fusioniert sind, welche ein Signalpeptid zur Aufnahme ins endoplas- atische Retikulum' einer Pflanzenzelle und zur Weiterleitung in die Vakuole codiert. Eine vakuoläre Lokalisation der Genprodukte ist besonders vorteilhaft. Erfindungsgemäß können beispielsweise- Signal- peptide zur vakuolären Lokalisation von Lektin aus Gerste, Signalsequenzen aus einem Patatin-Gen der Kartoffel oder Signalsequenzen von reifem Phytohä- maglutinin der Bohne verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die regulatorischen Elemente vom L- Rhamnose-Operon von Escherichia .coli stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül in die Expres- sionskassette des Vektors pJOE2702 (Volff et al., 1996; Stumppet al . , 2000) integriert. Die Expressionskassette umfaßt den Promotor rha_P, der aus dem zweistufig regulierten L-Rhamnose-Operon rhaBAD von Escherichia coli stammt (Egan und Schleif, J. Mol. Biol., 243 (1994), 821-829). Bei dem Vektor pJOE2702 handelt es sich also um einen über zwei Stufen positiv regulierbaren, L-Rhamnose- induzierbaren Expressionsvektor, der im Wirtsbakte- rium Escherichia coli in hoher Kopiezahl vorhanden ist. Die Transkriptionstermination und die Translationsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen der im Vektor enthaltenen Expressionskassette. Gegenüber den meisten kommerziell er- hältlichen E. coli-Expressionsvektoren besitzt pJOE2702 zwei entscheidende Vorteile. Erstens führt der Vektor im nicht-induzierte-n Zustand zu einer sehr niedrigen Basisexpression des zu exprimieren- den Polypeptids . Zweitens wird die Transkription der Expressionskassette verzögert induziert. Der Vektor eignet sich daher insbesondere zur Clonie- rung und Produktion von Proteinen, die die Vitalität und die Wachstumseigenschaften der Wirtszelle negativ beeinflussen, wie beispielsweise von bakte- riellen Fructosyltransferasen. Obwohl Escherichia coli-Zellen, die den Vektor pJOE2702 mit dem vollständigen S. utans-Fructosyltransferase-Gen enthalten, nach Induktion eine vollständige Wachstumshemmung zeigen, eignet sich der Vektor in besonde- rem Maße zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, - die am 5' -Ende und am 3' -Ende mindestens eine der erfindungsgemäßen Deletionen enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständlich auch Vektoren, die nicht nur eines, sondern mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten. Dabei können die Nucleotidsequenzen so angeordnet sein, dass gegebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, insbesondere der in SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 beschriebenen Sequenzen, von einem einzigen Satz regulato- rischer Elemente kontrolliert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vek- toren umfassen, und die fähig sind, die von den Nucleinsäuremolekülen codierten Polypeptide mit der Aktivität einer Fructosyltransferase zu exprimie- ren. Bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um^' prokaryontische als auch um eukary- ontische Zellen handeln. Bevorzugte Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Erfindungsgemäß bevorzugte Beispiele für eukaryonti- sche Wirtszellen umfassen Hefezellen, Insektenzel- len und Pflanzenzellen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz in Bezug auf die transformierte Zelle heterolog ist, das heißt, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nucleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen ' vorkommt oder aber an einem anderen -Ort in diesen Zellen oder aber in einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom dieser Zellen lokali- siert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz .

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Wirtszelle um eine gramnegative Zelle, insbesondere um eine Escherichia coli-Zelle. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine grampositive Zelle, beispielsweise um eine Bacillus-subtilis-Zelle handeln.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryontische Wirtszelle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine Hefezelle, zum Beispiel eine Saccharo yces cerevisiae-Zelle, handeln. Weitere bevorzugte Zellen Insektenzellen, beispielsweise die Insektenzelllinie IPLB-Sf21. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Pflanzenzelle, insbesondere um eine Zelle solcher Pflanzen, die natürlicherweise Polyfructane, insbesondere Inulin, erzeugen, wie beispielsweise eine Topinambur-, Artischocken- oder Zichorienzelle, oder um Zellen von landwirtschaftlich bedeutsamen Pflanzen, die natür- licherweise andere Monosaccharide, Oligosaccharide und/oder Polysaccharide erzeugen, wie beispielsweise eine Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Zelle.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen auf- weisen, , wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase oder ein Fragment davon zu produzieren.

Die Erfindung betrifft auch Pflanzen, die in mindestens einer ihrer Zellen mindestens ein erfin- dungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten oder aber die mindestens eine, vorzugsweise jedoch eine Vielzahl von Wirtszellen enthalten, die das erfindungsgemäße Fructosyltransferasegen oder dieses enthal- tende Vektoren oder Plasmide aufweisen, und die infolge dessen hochmolekulare Polyfructane, insbesondere hochmolekulares Inulin, erzeugen können. Die Erfindung ermöglicht also auch die Bereitstellung von Pflanzen der verschiedensten Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen, die aufgrund der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Lage sind, hochmolekulares Inulin zu erzeugen. Gegenüber den wenigen Pflanzen, die natürlicherweise Inulin erzeugen können, ergibt sich der Vorteil, dass eine gezielte ^' Lokalisierung des gebildeten Inulins möglich ist und dass zudem eine Erhöhung der Expressionsrate und damit der Menge an gebildeten Inulin erreicht wird. Zudem weist das in diesen transgenen Pflanzen erzeugte Inulin ein hö- heres Molekulargewicht auf als natürlicherweise gebildetes pflanzliches Inulin. Während natürlicherweise erzeugtes pflanzliches Inulin durchschnittlich 10 bis 30 Fructoseeinheit pro Molekül aufweist, kann das in transgenen Pflanzen gebildete Polyfructan mehr als 100 000 Fructoseeinheiten aufweisen. Die Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthaltendes transgenes Ernte- und Vermehrungsmaterial der Pflanze sowie Teile oder Kalli einer erfindungsgemäßen Pflanze, zum Beispiel Speicherorgane, Früchte, Knollen, Rüben, Samen, Blätter, Blüten oder ähnliches.

Die Erfindung sieht insbesondere vor, dass die zu transformierende Pflanze entweder eine Pflanze ist, die natürlicherweise ein Polyfructan, insbesondere Inulin, erzeugen kann, vorzugsweise eine Topinambur-, Artischocken- oder Zichorien-Pflanze, oder eine landwirtschaftlich bedeutsame Nutzpflanze, die natürlicherweise Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide erzeugen kann, vorzugsweise ei- ne Kartoffel-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Pflanzen, umfassend die Transformation einer oder mehrerer Pflanzenzellen mit einem Vektor der Erfindung, die Integration des in diesem Vektor enthaltenen Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle (n) und die Regeneration der Pflanzenzelle (n) zu intakten, transformierten Pflanzen, die ein hochmolekulares Polyfructan, insbesondere Inulin erzeugen können.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein modifiziertes Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Saccharose in ein^' Polyfructan, insbesondere .Inulin, mit furanosiden ß-l,2-Bindungen katalysieren kann. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gerei- nigtes, Protein, das durch Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküles oder eines Fragmentes davon in einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder einer erfindungsgemäßen Pflanze erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Eigenschaften, insbesondere die gleiche Aktivität einer Fructosyltransferase wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz codiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist .

Vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte und vollständig gereinigte monoclonale oder polyclonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Protein so spezifisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoclonalen oder po- lyclonalen Antikörper oder deren Fragmente mit Hil- fe üblicher immunologischer Verfahren beispielsweise ein Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst daher monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines er- findungsgemäßen Polypeptids oder Proteins mit der Aktivität einer Fructosyltransferase identifizieren und/oder daran binden können. Bei einer solchen Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Bezie^¬ hung steht. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergeb- nis posttranslationaler Modifikationen des erfindungsgemäßen Proteines entstanden sind. Die Erfindung umfasst auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc- oder F(ab')₂- beziehungswei- se Fab-Fragmente .

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die gegen einen erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet sind, das heißt einen erfindungsgemäßen Antikörper identifizieren und daran binden können, so dass ein spezifischer Nachweis der erfindungsgemäßen Antikörper möglich ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von längerkettigen Polyfructanen mit linearer Struktur, wobei die Fructose-Einheiten in der Kette durch ß-1, 2-Bindungen verknüpft sind, und mit einem Polymerisationsgrad von mehr als 100 und einem Verzweigungsgrad von weniger als 3 %. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polyfructan aus erfindungsgemäß transfor- mierten transgenen Pflanzen, insbesondere aus deren Vakuolen, isoliert und aufgereinigt wird. Besonders bevorzugt ist die Isolierung und Gewinnung von Po- lyfructanen aus den Speicherorganen von Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanzen. Das Verfahren umfasst die mechanische Zerkleinerung größerer pflanzlicher Zellmassen mit Hilfe eines Turbinenmischers, beispielsweise eines Waring Blender, wobei das Zerkleinern vorzugsweise in einem großen Volumen wäss- rigen Mediums bei tiefen Temperaturen, beispielsweise +4°C, erfolgt. Der weitere Aufschluss kann mit Hilfe physikalischer Aufschlussverfahren, bei- spielsweise mittels Ultraschall, einer „French press"-Vorrichtung, Mühlen oder Pressen, mit Hilfe chemischer Aufschlussverfahren, beispielsweise einer Lyophilisation oder unter Verwendung von Deter- genzien oder unter Anwendung osmotischer Druckänderung, oder mit Hilfe biologischer Aufschlussverfahren, beispielsweise unter Verwendung von die Zellwand angreifenden Enzymen oder mittels einer Säure- /Lauge-Behandlung, erfolgen. In einer besonders be- vorzugten Ausführungsform erfolgt die Gewinnung des hochmolekularen Polyfructans durch Herstellung eines wässrigen Extraktes, insbesondere der Speicherorgane, und anschließendes Fällen mit Alkohol.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des Ver- fahrens zur Herstellung von Polyfructanen sieht vor, dass erfindungsgemäße Wirtszellen, beispielsweise pflanzliche Wirtszellen oder mikrobielle Wirtszellen, beispielsweise Escherichia coli- Zellen, in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert und vermehrt werden. Anschließend wird das erzeugte Zellmaterial mit Hilfe geeigneter physikalischer, chemischer und/oder enzymatischer Verfahren aufgeschlossen und die Proteine mit der Aktivität einer Fructosyltransferase werden aus dem Aufschluss ate- rial aufgereinigt . Die weitere Aufreinigung der en- zymatischen Aktivität erfolgt mit Hilfe üblicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Zur Gewinnung eines Rohextraktes wird die AufSchlusslösung beispielsweise mit Hilfe von Extraktionsverfahren, Zentrifugationsverfahren und Filtrationsverfahren behandelt. Die Fällung der Proteine aus dem Rohextrakt sowie Ultrafiltrationsverfahren sind effi- ziente Verfahren zur Konzentrierung von Proteinen aus einer größeren Flüssigkeitsmenge . Als Fällungsmittel kommen unter anderem anorganische Salze, beispielsweise Natrium- und Amoniumsulfat, organi- sehe Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, und Polymere, beispielsweise Polyethylenglycol, zur Anwendung. Zur Abtrennung der verwendeten Fällungsmittel kann anschließend ein Dialyse-Verfahren durchgeführt werden. Eine weitere Feinreinigung kann mit Hilfe chromatographischer Verfahren und Verteilungsverfahren, beispielsweise unter Verwendung wässriger Phasensysteme, erfolgen. Zu diesen Verfahren zählen unter anderem Adsorptionschroma- tographie, Ionenaustauschchromatographie, Gel- Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie.

Gegebenenfalls kann die isolierte Fructosyltransferase auch mittels Adsorption an einem inerten oder an einem elektrisch geladenen, anorganischen oder organischen Trägermaterial immobilisiert werden. Als Trägermaterial kommen anorganische Materialien, wie poröse Gläser, Silikagel, Aluminiumoxid, Hydro- xylapatit oder verschiedene Metalloxide, natürliche Polymere, beispielsweise Cellulose, Stärke, Algina- te, Agarose oder Collagen, oder synthetische Poly- mere, wie Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Methy- lacrylat, Nylon oder Oxirane zur Anwendung. Die Immobilisierung erfolgt dabei durch physikalische Bindungskräfte wie beispielsweise Van-der-Waals- Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und ionische Bindungen. Die Immobilisierung der Fructosyl erase kann auch mittels kovalenter Bindung an Trägermaterialien erfolgen. Die Träger müssen dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen können. Geeignete Gruppen sind beispielsweise Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen. Die Oberfläche von porösen Gläsern kann beispielsweise durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Proteinen umgesetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können mit Bromcyan und Carboxy-Gruppen mit Thionylchlorid aktiviert und anschließend mit Enzymen gekoppelt werden. Eine weitere Möglichkeit der Immobilisie- rung von Fructosyltransferasen besteht im Ein- schluss ' in dreidimensionalen Netzwerken. Ein Vorteil dabei ist, dass die Enzyme innerhalb des Netzwerkes in freier, nicht gebundener Form vorliegen. Poren der umgebenden Matrix müssen dabei klein ge- nug sein, um das Enzym zurückzuhalten.

Nach der Gewinnung der Fructosyltransferase aus den erfindungsgemäßen Wirtszellen, entweder als Rohextrakt, in hoch aufgereinigter Form und/oder in immobilisierter Form an einem festen Träger wird eine Saccharoselösung unter geeigneten Bedingungen mit dem isolierten Enzym behandelt, wobei in vitro ein Polyfructan gebildet wird. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeig- neten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen. Anschließend wird das gebildete Polyfructan aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt .

Die Erfindung betrifft ebenfalls das mit Hilfe der vorstehend genannten Verfahren hergestellte hoch o- lekulare Polyfructan. Das so hergestellte Polyfructan ist durch eine vorwiegend lineare Struktur gekennzeichnet, wobei innerhalb der Kette Fructose- Einheiten durch ß-1, 2-Bindungen verknüpft sind und wobei die Kette als Abschluss eine nicht- reduzierende α-D-Glucose-Einheit trägt. Das Polyfructan zeichnet sich durch einen sehr hohen Po- lymerisationsgrad von >100 und einen sehr niedrigen Verzweigungsgrad von <3 % aus. Aufgrund der geringen Verzweigung enthält das so hergestellte Polyfructan nur sehr wenige endständige Glucose- Einheiten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Po- lyfructan um Inulin, das durch ein hohes Molekulargewicht von mehr als 1,5 Mio. Dalton gekennzeichnet ist .

Aufgrund des geringen Glucose-Gehaltes kann das erfindungsgemäß hergestellte Polyfructan, insbesonde- re Inulin, zur Herstellung von Fructooligosacchariden verwendet werden, die sich als diätisches Lebensmittel eignen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäß hergestellte Inulin unter geeigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht- im obilisierten geeigneten Endo-Inulinase behandelt und anschließend werden die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt . Erfindungsgemäß wird unter einer "Endo-Inulinase" eine 2, 1-ß-D-Fructan-Fructanhydrolase verstanden, das den Abbau von Inulin zu Fructooli- gosacchariden katalysiert,, wobei die enzymatische Wirkung insbesondere . innerhalb der Polymerkette erfolgt-.^' Im Zusammenhang - mit der vorliegenden Erfin- dung werden unter Fructooligosacchariden Saccharide verstanden, die aus 2 bis 10 Fructoseeinheiten bestehen, die ß-glycosidisch miteinander verbunden sind. Die verwendete Endo-Inulinase kann dabei in immobilisierter oder nicht-immobilisierter Form vorliegen. Die Immobilisierung der Endo-Inulinase kann dabei so erfolgen, wie vorstehend für die erfindungsgemäße Fructosyltransferase beschrieben. Geeignete Bedingungen umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH- Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Fructooligosacchari- den ist vorgesehen, dass eine Saccharoselösung in vitro unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten oder nicht-immobilisierten Fructosyltransferase und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem in vitro Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

Die Erfindung betrifft daher ebenfalls Fructooligosaccharide, die nach einem der vorstehend genannten Verfahren hergestellt wurden. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Fructooligosaccharide zeichnen sich insbesondere durch einen sehr niedrigen Glucose-Gehalt aus und sind daher in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel, insbe- sondere für Diabetiker, geeignet. Während Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Topinambur hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 14 bis 20 % aufweisen und Fructooligosaccharide, die aus Inulin von Zichorien hergestellt wurden, einen Glucosegehalt von etwa 10 % enthalten, besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide einen Glucosegehalt von weniger als 3 %, vorzugsweise von weniger als 1 %.

Die erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide können darüber hinaus einer Hydrierung unterworfen werden, wobei hydrierte Fructooligosac- charide hergestellt werden, die sich ebenfalls in besonderem Maße als diätisches Lebensmittel eignen. Die Hydrierung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide kann beispielsweise unter Anwendung höherer Drücke und Verwendung von Katalysa- toren erfolgen.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Difruktosedianhydriden. Difructosedianhydride sind als Nahrungsmittelzusatz von besonderem Interesse, da sie im Dünndarm unver- daulich sind und im Dickdarm eine ausgesprochen präbiotische Wirkung entfalten und dadurch nachhaltig zu einer gesunden Darmflora und Darmwand beitragen.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgese- hen, dass erfindungsgemäß hergestelltes Inulin unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten _. Endo- Inulinase und immobilsierten oder nicht- immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird. Dabei katalysiert die Endo-Inulinase, wie vorstehend aus- geführt, die Umwandlung von Inulin in Fructooligosaccharide. Diese werden anschließend durch die Inulinfructotransferase von A. globiformis oder A. ureafaciens (Seki et al . , Starch/Stärke, 40 (1988), 440-442) umgewandelt. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung liegen die Zellen von A. globiformis oder A. ureafaciens in immobilisierter Form vor. Zur Immobilisierung der Mikroorganismen können kultivierte inaktivierte Zellen nach geeigneter Copo- ly erisation, beispielsweise unter Zugabe eines neutralen Proteins und Vernetzung mit Glutardialde- hyd, direkt als Biokatalysatoren verwendet werden. Ebenso ist es möglich, vitale Mikroorganismen in Polymere, zum Beispiel Carrageen, einzuschließen und anschließend eine Inkubation in einem geeigneten Nährmedium durchzuführen. Die Polymerpartikel können dann für den eigentlichen Prozess eingesetzt und gegebenenfalls durch erneute Inkubation auch wieder regeneriert werden. Ebenso besteht die Mög- lichkeit, Mikroorganismen in Form photovernetzter Polymere zu verwenden, wobei eine Mikroorganismen- Suspension mit den löslichen Präpolymeren in dünner Schicht durch Bestrahlung mit beispielsweise einer Tageslichtlampe polymerisiert wird.

Geeignete Bedingungen zur Herstellung von Difructo- sedianhydriden umfassen dabei eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 30°C, einen geeigneten pH-Wert, einen geeigneten Puffer und geeignete Substratkonzentrationen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Difructosedianhydriden sieht vor, dass eine Saccharoselösung gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht- immobilisierten erfindungsgemäßen Fructosyltransferase, einer immobilisierten oder nicht- itttmobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformis oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedian- hydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Inulins in verschiedenen Non-Food-Anwendungen vorgesehen. Dabei wird das erfindungsgemäß hergestellte Inulin entsprechenden Derivatisierungs-Reaktionen unterworfen, wobei Inulinether und Inulinester hergestellt werden. Die so hergestellten Inulinether und Inulinester können beispielsweise als polymere Tenside, Weichmacher oder Emulgatoren eingesetzt werden .

Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Fructooligosaccharide, der erfindungsgemäß hergestellten hydrierten Fructooligosaccharide und der erfindungsgemäß hergestellten Difructosedianhydride als Lebens- mittelzusatz, diätisches Lebensmittel und als Tierfutterzusatz vor.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, sollen jedoch nicht den Schutzumfang der Erfindung beschränken. Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHEH3, dass das vollständige Fructosyltransferase (ftf) -Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz im L- Rhamnose-induzierbaren Escherichia coli- Expressionsvektor pJOE2702 enthält.

Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE225, dass das modifizierte Fructosyltransfera- se-Gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ4->222) mit der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz, das am 5 '-Ende um 219 Nucleotide verkürzt ist, im Expressionsvektor pJOE2702 enthält.

Figur 3 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH171, dass das Fusionsgen lacZα (1—»83) : : ftf (105 →2388) mit der in SEQ ID NR. 5 gezeigten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fusionsgen 83 Nucleotide des lacZα-Gens vom Vektor pBluescript II KS+ und ein modifizier- tes, am 5' -Ende um 104 Nucleotide verkürztes Fructosyltransferasegen aus Streptococcus mutans DSM20523 umfasst.

Figur 4 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDH132, dass das modifizierte Fructosyltransferase- gen aus Streptococcus mutans DSM20523 ftf (Δ2254-» 2385) mit der in SEQ ID Nr. 7 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei • das Fructosyltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 2254^' bis 2385 aufweist. Figur 5 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE172, dass das modifizierte Fructosyltransferasegen ftf (Δ4-»222, Δ2254-»2385) mit der in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expres- sionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltransferasegen eine Deletion der Nucleotide 4 bis 222 sowie der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist .

Figur 6 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmides pDHE143, dass das Fusionsgen lacZα (1—»83) : : ftf (105-»2388, Δ2254-»2385) mit der in SEQ ID Nr. 11 dargestellten Nucleinsäuresequenz im Expressionsvektor pJOE2702 enthält, wobei das Fructosyltrans- ferasegen eine Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und der Nucleotide 2254 bis 2385 aufweist und wobei der deletierte 5' -Bereich an 83 Nucleotide des lacZα-Gens fusioniert ist.

Das zu der erfindungsgemäßen Lehre gehörende Sequenzprotokoll umfasst:

SEQ ID Nr. 1 zeigt die 2388 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523.

SEQ ID Nr. 2 zeigt die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 795 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Fructosyltransferase-Proteins .

SEQ ID Nr. 3 zeigt die 2169 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase- Gens ftf (Δ4->222) . SEQ ID Nr. 4 zeigt die von SEQ ID Nr. 3 abgeleitete 722 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines modifizierten Fructosyltransferase-Proteins .

SEQ ID Nr. 5 zeigt die 2367 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des Fusionsgens lacZα (1—»83) :: ftf (105-»2388) .

SEQ ID Nr. 6 zeigt die von SEQ ID Nr. 5 abgeleitete 788 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins .

SEQ ID Nr. 7 zeigt die 2256 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des modifizierten Fructosyltransferase- gens. ftf (Δ2254-»2385) .

SEQ ID Nr. 8 zeigt die aus SEQ ID Nr. 7 abgeleitete 751 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransferase- Proteins .

SEQ ID Nr. 9 zeigt die 2037 Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen modifizierten Fructosyltransferasegens ftf(Δ4-»222, Δ2254-»2385) .

SEQ ID Nr. 10 -zeigt die aus SEQ ID Nr. 9 abgeleitete 678 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäß modifizierten Fructosyltransfe- rase-Proteins .

SEQ ID Nr. 11 zeigt die 2235. Nucleotide umfassende DNA-Sequenz des erfinduhgsgemäßen Fusionsgens lacZα (l-»83) : :ftf (105-»2388, Δ2254-»2385) . SEQ ID Nr. 12 zeigt die aus SEQ ID Nr. 11 abgeleitete 744 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.

SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz des Primers ftf1 (upper) .

SEQ ID Nr. 14 zeigt die Sequenz des Primers ftf2 (lower) .

SEQ ID Nr. 15 zeigt die Sequenz des Primers ftf3 (upper) .

SEQ ID Nr. 16 zeigt die Sequenz des Primers ftf4 (upper) . ^{^}

SEQ ID Nr. 17 zeigt die Sequenz des Primers ftf5 (upper) .

SEQ ID Nr. 18 zeigt die Sequenz des Primers ftf6 (lower) .

Beispiel 1

Clonierung des ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523

Zur Clonierung des Fructosyltransferase-Gens aus S. mutans DSM20523 wurde eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, wobei der Primer ftfl^'(upper) mit der Sequenz: 5'- TATATATCATATGGAAACTAAAGTTAG-3 ' und der Primer ftf2 (lower) mit der Sequenz: 5'- TAGGATCCTTATTTAAAACCAATGCT-3 ' verwendet wurden. Der Primer ftf1 (upper) enthielt dabei eine Ndel- Restriktions-Schnittstelle und der Primer ftf2 (lower) enthielt eine BamHI-Restriktions- Schnittstelle. Chromosomale DNA aus S. mutans DSM20523, die mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Reinigungs-Kits isoliert worden war, diente in der PCR-Reaktion als Template. Die PCR-Reaktion wurde in 40 μl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Pri- mer, 50 ng DNA-Template und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KC1, 5 mM (NH₄)S0₄, 2 mM MgS0₄, 5% Dimethylsulfoxid, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion u fasste dabei die folgenden Schritte: 5-minütige Denaturierung bei 96°C, 5 Zyklen, umfassend jeweils eine 1- minütige Denaturierung bei 63 °C, eine 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 40°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde Polymerisation bei 68 °C, 25 weitere Zyklen, umfassend jeweils eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Denaturierung bei 92°C, eine 1 Minute, 30 Sekunden dauernde Primeranlagerung bei 49°C und eine 2 Minuten, 30 Sekunden dauernde - Polymerisation bei , 68 °C, sowie eine 5-minütige Ab- schluss-Polymerisationsreaktion bei 68 °C. Mit Hilfe der PCR-Reaktion wurde ein etwa -2,4 kb großes Fragment amplifiziert . Das isolierte Fragment wurde- mit den Restriktasen Ndel- und BamHI gespalten und mit dem Vektor pJOE2702 (Volff et al . , Mol. Microbiol., 21 (1996) 1037-1047; Stumpp et al . , Biospectrum, 1 (2000) 33-36) ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Die codierende Sequenz des ftf-Gens wurde somit im korrekten Leseraster in die im Vektor enthaltene, L-Rhamnose- induzierbare Expressionskassette cloniert, so dass die Transkription der insertierten Nucleinsäure unter der Kontrolle des in dem Vektor pJOE2702 enthaltenen Promoters rha_P steht. Die Transkripti- onstermination des ftf-Gens und die Translationsinitiation der Transkripte erfolgen ebenfalls über Sequenzen des Vektors. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHEH3 transformiert. Transfor- manten wurden dabei über Ampicillin-Resistenz selektiert .

Beispiel 2

Modifikationen des clonierten ftf-Gens aus Streptococcus mutans DSM20523

Zur Modifizierung des ftf-Genproduktes im Bereich des N-terminalen Signalpeptides wurden am 5 ' -OH- Ende des ftf-Gens Deletionen eingeführt oder Sequenzbereiche ausgetauscht.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera- se-Gens ftf (Δ4-»222) wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf3 (upper) mit der Sequenz : 5'- TATATATCATATGGAAACTCCATCAACAAATCCCG-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf3 (upper) enthält eine Ndel-Schnittstelle. Als Template wurde gereinigte DNA des Plasmides pDHE113, dass das clonierte vollständige ftf-Gen aus S. mutans DSM20523 enthält, verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in 40 μl Reaktionsvolumen mit je 8 pmol Primer, 100 ng^' - Plasmid-DNA-Te^'mplate und 2,5 Einheiten Pwo- Polymerase in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,85, 25 mM KC1, 5 mM (NH₄)S0₄, 2 mM MgS0₄, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP und 0,2 mM dCTP durchgeführt. Die PCR-Reaktion umfasste die folgenden Schritte: eine 2-minütige Denaturierung bei 94°C, 25 Zyklen, um- fassend jeweils eine 1-minütige Denaturierung bei 93 °C, eine Primeranlagerung für 1 Minute 30 Sekunden bei 55°C und eine Polymerisation für 2 Minuten 20 Sekunden bei 68 °C, und eine 5-minütige Abschlusspolymerisation bei 68 °C. Das erhaltene, etwa 2,2 kb-PCR-Produkt wurde isoliert, mit Ndel und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Ligierung resultierenden Plasmid pDHE225 transformiert. Das Genprodukt der Variante ftf(Δl->222) ist gegenüber der Wildtyp- Sequenz am N-Terminus um 73 Aminosäuren verkürzt.

Zur Erzeugung des modifizierten Fusionsgens lacZα(l→83) : :ftf (105→2388) wurde eine PCR- Reaktion mit dem Primer ftf4 (upper) mit der Sequenz: 5'-ATATATGTCGACGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf (upper) enthält eine Sall-Schnittstelle . Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet, das eine Insertion des vollständigen ftf-Gens aus S. mutans DSM20523 enthält. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR- Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen Sall und BamHI gespalten und in den Vektor pBluescript II KS+ cloniert, wobei der verkürzte ftf-Leserahmen am 5 ' -Ende mit dem Anfangsbereich des im Vektor enthaltenen lacZα-Leserahmens fusioniert wurde. An- be ¬

schließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem resultierenden Plasmid pDHE166 transformiert. In einem zweiten PCR-Schritt wurde das in dem Vektor pDHE166 enthaltene Fusionsgen lacZα (1—»83)::ftf (105—»2388) in den Expressionsvektor pJOE2702 um- cloniert. Dazu wurde eine PCR-Reaktion mit dem Primer ftf5 (upper) mit der Sequenz: 5'- TATATATCATATGACCATGATTACGCCAAGC-3' und dem Primer ftf2 (lower) durchgeführt. Der Primer ftf5 (upper) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase Ndel. Als Template wurde eine gereinigte DNA des Plasmides pDHE166 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Das erhaltene etwa 2,4 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen Ndel und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Anschließend wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem aus der Li- gierung resultierenden Plasmid pDHEl71 transfor- miert.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Gens ftf (Δ2254-»2385) wurde der PCR-Primer ftf6 (lower) mit der Sequenz: 5'- TTGGATCCTTATTTTTGAGAAGGTTTGACAG-3' in Kombination mit anderen der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt. Der Primer ftf6 (lower) enthält eine Schnittstelle für die Restriktase BamHI. Als Template wurde die gereinigte DNA des Plasmides pDHE113 verwendet. Die PCR-Reaktion wurde durchge- führt, wie vorstehend beschrieben. Danach wurde das Amplifikationsprodukt isoliert, mit den Restriktasen Ndel und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Unter Verwendung der Primerkombination ftf1 (upper/ftf6 (lower) wurde so das Plasmid pDHE132 erhalten, das das vorstehend beschriebene modifizierte ftf-Gen enthält.

Zur Erzeugung des modifizierten Fructosyltransfera- se-Gens ftf(Δ4-»222, Δ2254-»2385) wurde unter Verwendung der DNA des Plasmides pDHE113 als Template und den Primern ftf3 (upper) und ftf6 (lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Nach Integration des Amplifikationsproduktes in den Vektor pJOE2702 wurde das Plasmid pDHE172 erhalten.

Zur Herstellung des modifizierten Fructosyltransfe- rase-Gens lcZα(l→83) : : ftf (105-»2388 , Δ2254-»2385) wurde unter Verwendung der DNA des Vektor pDHE113 und der Primer ftf4 (upper) und ftf6 (lower) eine PCR-Reaktion durchgeführt. Das erhaltene, etwa 2,2 kb große PCR-Produkt wurde über die Schnittstellen Sall und BamHI in den Vektor Bluescript II KS+ integriert. Dabei wurde das Plasmid pDHEl40 erhalten. Anschließend wurde eine zweite PCR-Reaktion durchgeführt, wobei die Primer ftf5 (upper) und ftf6 (lower) sowie die DNA des Plasmides pDHE140 als Template verwendet wurden. Das erhaltene, etwa 2,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert, mit den Restriktasen Ndel und BamHI gespalten und in den Vektor pJOE2702 ligiert, der zuvor mit den gleichen Restriktasen gespalten worden war. Dabei wurde das Plasmid pDHEl43 erhalten. Beispiel 3

Heterologe Expression der verschiedenen Varianten des tf-Gens in E . coli

Zum Nachweis der Genprodukte in Rohextrakten des zur Expression verwendeten E. coli-Stammes JM109 wurden E. coli-Stämme, die eines der vorstehend hergestellten Plasmide beziehungsweise das Plasmid pJOE2702 zur Kontrolle enthielten, kultiviert und induziert. Die Stämme wurden die Nacht über in 5 ml dYT-Vollmedium (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) mit 100 μg Ampicillin/ml bei 30°C im Brutroller vorkultiviert. Mit der Übernachtkultur wurden je 50 ml dYT- Medium so angeimpft, dass die optische Dichte bei 600 nm (OD₆oo) etwa 0,02 betrug. Dann wurden die Zellen in Erlenmeyerkolben auf dem Brutschüttler bis zu einer ODgoo von 0,2 kultiviert. Zur Induktion des mit L-Rhamnose induzierbaren Promoters wurden 0,2 % (Gew. /Vol.) L-Rhamnose zum Medium gegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 7 Stunden kultiviert. Nach der 7-stündigen Induktion wurden die Zellen mittels Zentrifugation, Waschen der Zellen in 50 mM KH₂P0₄/K₂HP0₄-Puffer, pH-Wert 6,5, und anschließender Resuspension^' der Zellen in dem gleichen Puffer geerntet. Danach wurde die Suspension auf einen OD₆oo^_Wert von 10 eingestellt. Die Zellen wurden mittels Ultraschallbehandlung oder mittels French-Press-Behandlung aufgeschlossen. Anschlie- ßend wurden alle Extrakte mittels einer. 20- minütigen Zentrifugation bei 10000 x g behandelt. Danach wurde der Gesamt-Proteingehalt nach Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) bestimmt, wobei ein Rinderserumalbumin-kalibriertes Reagenz von Biorad (Biorad-Laboratories GmbH, Mün- chen) verwendet wurde. Zum Vergleich der Proteinmuster der erhaltenen Rohextrakte mit dem Proteinmuster der nicht-induzierten Kontrolle wurden die Extrakte elektrophoretisch in 7,5 %igen SDS- Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt (Laemmli, Nature, 227 (1979) 680-685) .

Die quantitative Bestimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte, indem die spezifischen Ftf-Aktivitäten in Rohextrakten gemessen wurden. Zellkultivierung, Zellaufschluss und die Herstellung der Rohextrakte wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Da bei jedem Umsatz von einem Molekül Saccharose jeweils ein Molekül Glucose freigesetzt wird, wurde die Aktivität ermittelt, indem die pro Zeiteinheit freigesetzte Glucose-Menge ermittelt wurde. Die Be- Stimmung der Ftf-Aktivitäten erfolgte über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 30°C unter Verwendung einer etwa 1 bis 3 mE Fructosyltransferase enthaltenden Rohextraktmenge in einem Volumen von 1 ml mit 100 mM Scr in 50 mM K₂HP0₄/KH₂P0₄-Puffer, pH 6,5. Eine Einheit entspricht dabei der Freisetzung von 1 μmol Glucose pro^' Minute in Gegenwart von 100 mM Saccharose bei 30 °C und einem pH-Wert von 6,5. Nach einer einstündigen Inkubation wurde die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen bei 100°C beendet. Danach erfolgte eine .10-minütige Zentrifugation bei 10000 x g. Anschließend wurde in einem 100 μl- Aliquot die freigesetzte Glucose-Menge mit Hilfe des gekoppelten Glucoseoxidase (GOD) /Peroxidase (POD) -Enzymtests (Werner et al . , Z. Analyt . Chem. , 252 (1970) 224-228) bestimmt. Dabei wurde der GOD- Perid^®-Test (Röche Diagnostics) verwendet, bei dem photometrisch die Oxidation des Farbstoffs 2,2'- Azino-di- (3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) (ABTS^®) nachgewiesen wird. Der Test wurde in einem Gesamtvolumen von 1 ml mit 80 μg/ml GOD, 10 μg/ml POD und 1 μg/ml ABTS^® in 50 mM K₂HP0₄/KH₂P0₄-Puffer, pH-Wert 6,5, durchgeführt, wobei nach 30 Minuten die Ex- tinktion bei 578 nm gemessen wurde. Die Kalibrierung des Testes erfolgte mit Hilfe von Glucose- Standardlösungen. Die für die Rohextrakte der verschiedenen Expressionsstämme ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst .

Tabelle 1

Spezifische Ftf-Aktivitäten im Rohextrakt von E . coli- Stämmen, die mit den erfindungsgemäßen Plasmiden transformiert wurden

Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigen E. coli- Stämme, die mit einem im Vektor pJOE2702 enthaltenen, erfindungsgemäßen ftf-Nucleotidmolekül transformiert sind, nach einer Induktionsdauer von 6 h gegenüber dem E. coli-Stamm, der das vollständige ftf-Gen enthält, ein deutlich erhöhte Zelldichte, d.h. das Wachstum dieser Stämme ist somit deutlich verbessert. Gleichzeitig ist auch die Volumenaus- beute des exprimierten Proteins gegenüber dem E. coli-Stamm mit dem vollständigen ftf-Gen deutlich erhöht .

Beispiel 4

Isolierung und Immobilisierung der Fructosyltrans- ferase

Vorkultur 1: 5 ml Medium (pro 1000 ml Wasser, pH 7,0, 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 100 mg Ampicillin) wurden mit dem Stamm E. coli JM109 (pDHE143) beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37 °C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert.

Vorkultur 2: 200 ml des gleichen Mediums wurden mit 1 ml der Vorkultur 1 beimpft und 12 bis 15 Stunden bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.

Kultivierung im Fermenter und Expression der Fruc- tosyltransferase : 16 1 Medium, dem 0,2 % L-Rhamnose zur Expression der Fructosyltransferase zugesetzt worden waren, wurden mit 200 ml Vorkultur 2 beimpft und bei 30 °C, 400 Upm und 0,5 vvm Luft etwa 12 Stunden, das heißt bis zu einer optischen Dichte (OD_{5 8}) von etwa 0,6 oder mehr kultiviert.

Zellernte und Aufschluss: Die Zellen wurden mit einer kontinuierlichen Zentrifuge, beispielsweise einer Contifuge (Heraeus) bei 4°C und 24300 x g ab- zentrifugiert . Die Zelimasse wurde 1-mal mit 2000 ml eines 100 mM-Phosphatpuffers, pH-Wert 6,5, gewaschen und dann in 100 ml Phosphatpuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen im Homogenisator bei 800 bar aufgeschlossen. Danach wurde die Suspension 20 Minuten bei 17360 x g zentrifugiert , um Zelltrümmer von dem im Überstand vorliegenden Enzym zu trennen.

Immobilisierung: Der Rohextrakt wurde zunächst gefriergetrocknet. Vom Lyophylisat wurden 23,6 g (ca. 10 g Protein) in 500 ml 1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5, gelöst und nach Zugabe von 100 g EUPERGIT^® C (Röhm) 94 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Das Ftf-Immobilisat wurde danach mit 50 mM Phosphatpuffer gewaschen.

Beispiel 5

Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein zur Polyfructan-Herstellung

60 1 einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden nach Zugabe^' von 640 E Fructosyltransferase pro Liter Ansatzlösung 28 Stunden bei 30°C unter Rühren inkubiert, wobei ein Rohextrakt des E. coli- Stammes JM109 (pDHEl43) verwendet wurde. Anschließend wurde die Lösung einer direkten Ultrafiltration (Sartocon Mini; 3 Module mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 100 000 Dalton) ausgesetzt. Das erhaltene Retentat von 4,5 1 wurde 2-mal mit jeweils 6 1 entsalztem - Wasser verdünnt und schließlich auf 4,5 1 konzentriert. Anschließend wurde Inulin mit Isopropanol (Endkonzentration 62 Gew.-%) ausgefällt. Der abgetrennte Niederschlag wurde mit 5 1 der gleichen Isopropanol-Lösung gewaschen und anschließend bei 45°C schonend getrocknet. Dabei wurden 0.36 kg eines weißen Produktes mit einem Trockensubstanzgehalt (TS) von 93 % erhalten. Bezo- gen auf den Saccharoseverbrauch wurde eine Ausbeute von 8,5 % erreicht. Das unter Verwendung des HPLC- GPC-Verfahrens ermittelte Molekulargewicht von Inulin beträgt 40 x 10^δ g/mol, wobei der Verzweigungsgrad 3 Mol% beträgt.

Beispiel 7

Umsetzung von Ftf-Inulxn mit Endo-Inulinase zur Herstellung von Fructooligosacchariden

20 g des in Beispiel 6 erhaltenen Ftf-Inulins mit 95 % TS wurden nach Herstellung einer 1 %igen Lö- sung durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C und Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 unter Verwendung von 0,1 molarer Essigsäure mit Endo-Inulinase (0,13 ml/Ansatz; SP 168, Fa. Novo) 8 Stunden bei 50°C unter Rühren inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms durch 15-minütiges Erhitzen bei 95°C wurden die gebildeten Fructooligosaccharide mittels Ultrafiltration (Sartocon Mini, Modul mit einem molekularen Rückhaltevermögen von 10 000 Dalton) abgetrennt. Das Permeat enthielt 7,5 g Fructooligosaccharide, während das auf 1 1 verdünnte Retentat entsprechend 11,6 g TS enthielt. Anschließend wurde das Retentat nach erneutem Einstellen des pH-Wertes mit Endo- Inulinase bei einem konstanten Enzym/Substrat- Verhältnis inkubiert, wie zuvor beschrieben. Dieser Vorgang wurde insgesamt 5-mal wiederholt. Mittels einer Gelpermeations-Chromatographie wurde in den vereinigten Permeaten die folgende Kettenlängenver- teilung bestimmt:

Die Kohlenhydratzusammensetzung wurde wie folgt bestimmt: 0,5 ml vereinigte Permeatlösung (1 % TS) wurden nach Zugabe von 0,5 ml 1 %iger Oxalsäure 2,5 h bei 65°C hydrolysiert . Eine Analyse mittels des HPAEC-Verfahrens zeigte, dass Fructose der einzige Kohlenhydratbaustein war, das heißt bei den isolierten Oligosacchariden handelt es sich um homoo- ligomere Fructooligosaccharide vom Typ F_n mit n =

Beispiel

Umsetzung von Saccharose mit dem Ftf-Protein und immobilisierter Endo-Inulinase

Endo-Inulinase (beispielsweise SP 168; NOVO) wurde wie in Beispiel 5 für Fructosyltransferase beschrieben, an EUPERGIT^® C (Röhm) immobilisiert. Zu 1 1 einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructosyltrans- ferase (vergleiche Beispiel 2) und 20 g immobilisierte Endo-Inulinase zugegeben und unter langsamen Rühren inkubiert. Stündlich wurden Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reaktion beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration entfernt. Mittels Gelpermeati- ons-Chromatographie wurde die Zusammensetzung der dabei erhaltenen Produktlösung wie folgt bestimmt:

Gegenüber Beispiel 7 wurden somit Produkte mit einem wesentlich höheren Fructosegehalt erhalten.

Beispiel 9

Herstellung von hydrierten Fructooligosacchariden

Die in den Beispielen 7 und 8 erhaltenen homooligo- meren Fructooligosaccharid-Gemische mit einer Ket- tenlänge von DP 1 - DP 25 wurden durch Eindampfen auf jeweils einen Trockensubstanzgehalt von 10 % eingestellt. 450 ml jeder Lösung wurden in einem Laborautoklaven in Gegenwart von Raney-Nickel 10 Stunden mit Wasserstoff bei 150 bar und 80°C^'hyd- riert. Die dabei erhaltene Lösung wurde aus dem Au- toklaven gepumpt, filtriert und mittels Ionenaustauscher gereinigt. Eine Analyse zeigte, dass die Lösung (Fructosyl) _n-mannit , (Fructosyl) _n-sorbit (n = 1-24) sowie Mannit und Sorbit, die aus der in der Ausgangslösung vorhandenen Fructose gebildet worden waren, enthielt. Mannit und Sorbit wurden mit Hilfe bekannter Chromatographie-Verfahren abgetrennt, so dass ein aus (Fructosyl) _n-mannit und (Fructosyl) _n- sorbit bestehendes Produkt erhalten wurde.

Beispiel 10

Umsetzung von Saccharose mit Fructosyltrans erase , Endo-Inulinase und Arthrobacter ureafaciens zur Bildung von Difructosedianhydrid III

Zellen des Stammes Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 wurden in vier Schüttelkolben mit jeweils 100 ml einer Nährlösung, enthaltend 8 g Zichorien- Inulin (Raftiline^®) , 2 g Na₂HP0₄, 1 g KH₂P0 , 1 g NH₄N0₃, 0,5 g MgS0₄, 0,01 g Fe₂S0₄, 0,03 g CaS0₄, 0,5 g Hefe-Extrakt in entsalztem Wasser, überimpft. Danach wurde eine 24-stündige Inkubation bei 27 °C unter Schütteln bei 150 Upm durchgeführt. Danach ur- den die Zellen mittels Zentrifugation abgeerntet und in Polyvinylalkohol-Gelpartikeln immobilisiert.

Zu 1 1 einer 10 %igen Saccharoselösung, pH-Wert 6,5, wurden bei 30°C 50 g immobilisierte Fructo- syltransferase (vergleiche Beispiel 5) und 20 g immobilisierte Endo-Inulinase sowie immobilisierte A. ureafaciens-Zellen gegeben. Danach wurde bei 30°C unter langsamem Rühren eine Inkubation durchgeführt. Es wurden stündlich Proben entnommen und auf den Saccharosegehalt überprüft. Sobald keine Saccharose mehr nachweisbar war, war die Reaktion beendet und die Enzyme wurden aus dem Ansatz mittels Filtration abgetrennt.

Eine HPLC-Analyse der erhaltenen Produktlösung zeigte die Bildung von 18 g DFA III.

Claims

Ansprüche

1. Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleinsäuresequenz, dargestellt in SEQ ID Nr. 1, oder einer Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz codiert, wobei die Nucleinsäu- resequenz ein Polypeptid mit der Aktivität einer Fructosyltransferase codiert und in der Nucleinsäuresequenz mindestens eine Deletion im 5'- oder 3'- Bereich aufweist, wobei die Deletion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus :

a) Deletion der Nucleotide 4 bis 222,

b) Deletion der Nucleotide 1 bis 104 und

c) Deletion der Nucleotide 2254 bis 2385.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 3 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;

b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon; c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 7 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;

d) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 8 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon;

e) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID ^'Nr. 9 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;

f) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 10 angegebene Aminosäuresequenz codiert, o- der einem komplementären Strang davon; und

g) einem Nucleinsäuremolekül, das durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a) bis f) erhältlich ist, oder einem komplementären Strang davon.

3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die im 5 ' -Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch zumindest einen Bereich eines anderen Gens ersetzt sind.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die im 5' -Bereich der Nucleinsäuresequenz des ftf-Gens deletierten Sequenzen durch Sequenzen des lacZα- Gens ersetzt sind, wobei das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 5 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;

b) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr . 6 angegebene Aminosäuresequenz codiert, oder einem komplementären Strang davon;

c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer in SEQ ID Nr. 11 angegebenen Nucleinsäuresequenz oder einem komplementären Strang davon;

d) einem Nucleinsäuremolekül, das eine in SEQ ID Nr. 12 angegebene Aminosäuresequenz codiert, o- der einem komplementären Strang davon; und

e) einem Nucleinsäuremolekül, das durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrer Basen eines Nucleinsäuremoleküls nach a)bis d) erhältlich ist, oder einem komplementären Strang davon.

5. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein DNA- oder RNA-Molekül ist.

-6. Vektor, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Vektor nach Anspruch 6, wobei der ^' Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage, Liposom oder Virus ist .

8. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, wobei das mindestens eine Nucleinsäuremolekül unter der funktioneilen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Ele- mentes steht, das in pro- und eukaryontischen Zellen die Transkription einer translatierbaren RNA und/oder die Translation der RNA in ein Polypeptid oder Protein gewährleistet.

9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine regulatorische Element ein Promoter, Enhancer, Silencer oder 3 ' -Transkriptionsterminator ist.

10. Vektor nach Anspruch 8 oder 9, wobei das mindestens eine regulatorische Element eine Signalse- quenz zur Lokalisierung des vom Nucleinsäuremolekül codierten Polypeptids oder Proteins innerhalb bestimmter Zellorganellen, Kompartimente oder im extrazellulären Raum ist.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das mindestens eine regulatorische Element vom L-

Rhamnose-Operon von Escherichia coli stammt.

12. Wirtszelle, enthaltend mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 11.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine pro- oder eukaryontische Zelle ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, ausgewählt aus Bakterien, Hefezellen und Pflanzenzellen.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Zelle ist.

16. Pflanze, die in mindestens einer ihrer Zellen mindestens ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder die mindestens eine Zelle nach Anspruch 15 enthält.

17. Pflanze nach Anspruch 16, wobei es sich um eine Kartoffel-, Topinambur-, Artischocken-, Zichorien-, Maniok- oder Zuckerrüben-Pflanze handelt.

18. Samen, Früchte, Vermehrungsmaterial, Erntemate- rial und Pflanzengewebe, das von einer Pflanze nach

Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.

19. Protein mit der Aktivität einer Fructosyltransferase, das die Umwandlung von Saccharose in ein Polyfructan mit vorwiegend ß-2 , 1-Bindungen kataly- siert und durch die Expression eines Nucleinsäure- moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlich ist.

20. Protein nach Anspruch 19, das durch Expression in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder in einer Pflanze nach Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.

21. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 19 oder 20 erkennt und bindet.

22. Antikörper nach Anspruch 21, der ein monoclona- 1er, polyclonaler und/oder modifizierter Antikörper ist .

23. Antikörper, der gegen einen Antikörper nach Anspruch 21 oder 22 gerichtet ist.

24. Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanze, umfassend

a) die Transformation einer oder mehrerer Pflanzen- zellen mit einem Vektor nach einem der Ansprüche

6 bis 10,

b) die Integration des in dem Vektor enthaltenen Fructosyltransferase-Gens in das Genom der transformierten Zelle (n) , und

c) die Regeneration von intakten, ein Polyfructan erzeugenden Pflanzen.

25. Verfahren zur Herstellung eines Polyfructans, wobei Wirtszellen gemäß Anspruch 15 oder Pflanzen gemäß Anspruch 16 oder 17 oder Pflanzengewebe gemäß Anspruch 18 unter für die Herstellung des Polyfruc- tans geeigneten Bedingungen kultiviert werden, das Polyfructan isoliert und aufgereinigt wird.

26. Verfahren zur Herstellung eines Polyfructans, umfassend die folgenden Schritte:

a) Kultivierung und Vermehrung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in einem geeigneten Nährmedium und unter geeigneten Kulturbedingungen,

b) Aufschluss des erzeugten Zellmaterials mittels geeigneter physikalischer, chemischer und/oder enzymatischer Verfahren und Isolierung und/oder

Aufreinigung eines Proteins . mit der Aktivität einer Fructosyltransferase^' entweder als Rohex- trakt, in hoch aufgereinigter Form und/oder in immobilisierter Form an einem festen Träger,

c) Behandlung einer Saccharoselösung mit einem bei b) gewonnenen Protein mit der Aktivität einer Fructosyltrans erase und

d) Isolierung und Aufreinigung des gebildeten Polyfructans aus dem Reaktionsansatz.

27. Polyfructan, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26.

28. Polyfructan nach Anspruch 27, wobei es sich um Inulin mit einem Polymerisationsgrad > 100 und einem Verzweigungsgrad < 3% handelt.

29. Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden, wobei Inulin nach Anspruch 28 unter ge- eigneten Bedingungen mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

30. Verfahren zur Herstellung von Fructooligosacchariden, wobei eine Saccharose-Lösung unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einem immobilisierten oder nicht-immobilisierten Protein nach Anspruch 19 oder 20 und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase behandelt wird und anschließend die erzeugten Fructooligosaccharide aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

31. Fructooligosaccharide, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 29 oder 30.

32. Hydrierte Fructooligosaccharide, hergestellt durch Hydrierung der Fructooligosaccharide nach An- Spruch 31.

33. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden, wobei Inulin nach Anspruch 28 unter geeigneten Bedingungen gleichzeitig mit einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten Endo-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformes oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

34. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydriden, wobei eine Saccharoselösung gleichzeitig mit einem immobilisierten oder nicht-immobilisierten Protein nach Anspruch 19 oder 20 und einer immobilisierten oder nicht-immobilisierten En- do-Inulinase und immobilisierten oder nicht-immobilisierten Zellen von Arthrobacter globiformes oder Arthrobacter ureafaciens behandelt wird und anschließend die erzeugten Difructosedianhydride aus dem Reaktionsansatz isoliert und aufgereinigt werden.

35. Difructosedianhydride, hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 33 oder 34.

36. Verwendung von Inulin nach Anspruch 28 zur Herstellung von Inulinethern und Inulinestern.

37. Verwendung der Fructooligosaccharide nach Anspruch 31 als Lebensmittelzusatz, diätisches Lebensmittel oder Tierfutterzusatz.

38. Verwendung der hydrierten Fructooligosaccharide nach Anspruch 31 als Lebensmittelzusatz, diätisches

Lebensmittel oder Tierfutterzusatz.

39. Verwendung der Difructosedianhydride nach Anspruch 35 als Lebensmittelszusatz, diätisches Lebensmittel oder Tierfutterzusatz.