CN114085294B - 一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法 - Google Patents

一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法，涉及植物化学研究领域。该藏黄连多糖硒纳米粒结构表征的研究方法，包括以下方法：A）粒径分布；B）红外光谱分析；C）扫描电子显微镜分析；D）X射线衍射分析；E）紫外可见光吸收光谱；F）刚果红测试。通过从藏黄连中提取分离藏黄连多糖，去除蛋白后再将去蛋白藏黄连多糖还原亚硒酸钠合成藏黄连多糖‑硒纳米颗粒，经天然多糖还原无机硒如亚硒酸钠，得到的多糖‑硒纳米颗粒具有粒径小，与无机硒比，其生物活性更高，并且毒性较低，研究其结构表征，抗氧化活性和细胞毒性，为研发新型的抗氧化型食品添加剂或饲料添加剂提供理论依据，值得大力推广。

Description

一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法
技术领域
本发明涉及植物化学研究技术领域，具体为一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法。
背景技术
藏黄连是玄参科植物圆穗兔耳草和全缘叶兔耳草的根，主要分布于西藏、四川等地，又名洪连、兔耳草，性寒，味苦、甘，入肺、心、肝经。具有清热解毒，利湿平肝，行经调血之功效。主治发热烦渴，肺热咳嗽，头痛眩晕，湿热黄疸，月经不调，药食中毒，现代植物化学研究表明，在草本植物中，植物根部活性成分较多，其中多糖的占比较大，而且作用效果明显，是值得关注的重要活性成分，多糖具有调节免疫、抗病毒、抗炎症、抗氧化等生物活性。微量元素是动植物体不可缺少的重要成分，硒是这些微量元素中尤为重要的一种，在药理活性上有调节免疫、抗炎等多种药理活性。
无机硒虽容易获得，但其使用安全范围极窄，不易把握；有机硒具有较高的生物相容性，易被机体吸收，但自然界中存在的有机硒的含量很低，不能满足人们的需求。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法，解决了自然界中存在的有机硒的含量很低，无法满足人们的需求的问题。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.提取分离
称取450～500g藏黄连放入粉碎机内粉碎，使用70～80目的筛网对粉碎后的藏黄连粉末进行筛分，将筛分下的粉末放入烧杯内，向烧杯内加入蒸馏水，将烧杯静置对藏黄连粉末浸泡10～12h，随后将烧杯内混合液体倒入煎煮锅中，煎煮2～2.5h，重复煎煮2～3次后将煎煮锅内液体倒入离心管放入离心机中，以1500～2500r/min的转速离心3～5min，将离心后的液体放入旋转蒸发仪内浓缩至500mL，将浓缩液体取出放入烧杯内，再向烧杯内加入无水乙醇，同时进行搅拌，无水乙醇添加完毕后停止搅拌，将搅拌后的溶液静置10～12h后，取烧杯底部沉淀物放入真空冷冻干燥机中，以-50～-60℃的温度进行真空冷凝干燥，制得藏黄连多糖；
S2.去除蛋白
使用烧杯配制藏黄连多糖浓度为10mg/mL的溶液1740mL，再向烧杯内加入60mLSevag混合液，对烧杯内进行搅拌，持续搅拌45～50min后静置30～40min分层，取上层清液去除下层沉淀，将上层清液再次放入搅拌罐中加入60mL Sevag混合液，重复操作8～10次后，将最终上层清液放入真空冷冻干燥机中，以-50～-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得去蛋白藏黄连多糖；
S3.最终制备
制备0.5～3.0mg/mL的去蛋白藏黄连多糖溶液，将溶液加入到烧杯内，向烧杯内加入20mL的50mM亚硒酸钠溶液，在避光环境下持续搅拌3h后，向烧杯内滴加20mL的50mM抗坏血酸溶液，再向烧杯内加入超纯水将烧杯内体积补至200mL，继续在避光条件下持续搅拌12h，反应结束后将混合液装入截留分子量为8000～12000的透析袋中，在4℃的外界温度条件下避光使用蒸馏水透析72h，取透析后的反应液测量粒径，将反应液放入真空冷冻干燥机内，以-50～-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖-硒纳米粒。
优选的，所述S1步骤提取分离中，藏黄连粉末与蒸馏水的重量比为1:15，浓缩液体与无水乙醇的体积比为1:4。
优选的，所述S2步骤去除蛋白中 Sevag混合液为正丁醇：三氯甲烷=1:4的混合溶液。
优选的，一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征的研究方法，包括以下方法：
A）.粒径分布
取藏黄连多糖-硒纳米粒，配制成1mg/mL的样品溶液，再使用纳米粒度仪检测其粒径分布；
B）.红外光谱分析
分别称取2mg的去蛋白藏黄连多糖、藏黄连多糖-硒纳米粒和硒纳米粒，将称取的材料分别放入玛瑙研钵中，并向研钵内加入10mg的溴化钾粉末混合研磨均匀，然后将研磨后的混合物放入压片机内压制成片，再将片状物放入红外光谱仪中以400～4000cm-1 的范围进行扫描；
C）.扫描电子显微镜分析
称取2mg干燥的藏黄连多糖-硒纳米粒，首先使用喷金仪对藏黄连多糖-硒纳米粒进行喷金处理，然后放入扫描电镜下分析；
D）.X射线衍射分析
称取2mg干燥的藏黄连多糖-硒纳米粒置于玻片上，铺匀压紧后放入X射线衍射分析仪内，检测其元素峰；
E）.紫外可见光吸收光谱
配置10mL的1mg/mL藏黄连多糖-硒纳米粒溶液，于紫外分光光度计中以200～800nm范围内全波长扫描；
F）.刚果红测试
取2mL的刚果红溶液、4mL不同浓度的NaOH溶液和2mL的去蛋白藏黄连多糖放入烧杯内混合，在室温条件下避光搅拌15min，随后使用紫外可见光光度计检测各待测样品在200～800nm范围内的最大吸收波长（λmax）；再使用2mg/mL的凝胶多糖替代去蛋白藏黄连多糖，作为对照。
优选的，一种藏黄连多糖硒纳米粒的活性研究方法，包括以下方法：
A）.体外抗氧化活性研究
a.DPPH自由基清除
分别取1mL浓度为（0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL）的去蛋白藏黄连多糖或者藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再分别向试管内加入2mL的DPPH溶液（0.05mM，无水乙醇配制）混匀，在室温条件下避光30min，在517nm处使用分光光度计测量吸光度，并记录吸光度值；将不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再向试管内加入2mL无水乙醇，再使用分光光度计测量吸光度，将吸光度值记为A0；取1mL蒸馏水置于试管内，再加入2mLDPPH溶液，使用分光光度计测定其吸光度，将吸光度值记为A1，DPPH自由基清除率=[1-（A1-A0）/A1]*100%；
b.羟自由基清除
分别取1mL浓度为（0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL）的去蛋白藏黄连多糖或者藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再向试管内依次加入1mL的70mM的硫酸亚铁溶液和1mL浓度为70mM水杨酸-乙醇溶液，最后分别向试管内加入1mL30%的双氧水溶液，将试管均放入水浴机内，以37℃恒温水浴30min后，在510nm下使用分光光度计测量吸光度为A1；以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度为A2；以蒸馏水代替H2O2作为损伤组，测得其吸光度为A3，羟自由基清除率=[（A1-A3）/（A2-A3）]*100%；
c.ABTS+自由基清除
将去蛋白藏黄连多糖或者藏黄连多糖-硒纳米粒配制成0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL的五个浓度，ABTS溶液使用蒸馏水配制成浓度为2mM，取50mLABTS溶液与200mL过硫酸钾溶液放入烧杯内混合均匀，在室温条件写避光放置12～16h，得到ABTS+溶液，使用PBS将ABTS+溶液稀释至吸光度为（0.7±0.02）时备用；分别将10μL的不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液加入到96孔细胞板中，每个浓度重复三个孔，并向每个孔内加入200μL孵育好的ABTS+溶液，混匀6min后检测各孔在734nm处的吸光度（A2）；在空白孔内加入10μL的不同样品溶液和200μL的PBS溶液，混匀6min后检测其在734nm处的吸光度（A0）；再取空白孔作为对照孔加入210μL的ABTS+溶液，检测其在734nm处的吸光度（A1），ABTS+自由基清除率=[1-（A2-A0）/A1]*100%；
d.总抗体氧化能力检测
将去蛋白藏黄连多糖或者藏黄连多糖-硒纳米粒配制成0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL的五个浓度，在96孔细胞板的每个检测孔中加入180μLFRAP工作液，在空白对照孔内加入5μL蒸馏水，取六个标准曲线检测孔，并分别向内加入5μL六种浓度依次为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM的硫酸亚铁溶液，样品检测孔内分别加入不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液5μL，在阳性对照孔内加入5μL的Trolox且Trolox浓度为0.15～1.5mM，混匀后在37℃下孵育3～5min后，测定593nm处的吸光度值，计算出藏黄连多糖-硒纳米粒的总抗氧化能力；
B）.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的体外活性研究
a.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的细胞增殖活性
取5000个RAW264.7细胞（100μL）分别加入到96孔板细胞培养板中，培养12h后分别将用PBS配制的0.1mg/mL的去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒倍比稀释后（100μL）加入到细胞中，在37℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养24h后，向每个孔内加入20μL的MTT溶液，培养4h后去除孔中的溶液，并加入150μL的DMSO溶液，使用震荡机震荡10min后，使用酶标仪检测OD570；
b.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的抗炎活性
取5000个RAW264.7细胞（100μL）分别加入96孔板细胞培养板中，培养12h，每孔加入100μL LPS溶液（0.2μg/mL），继续培养12h后分别将用PBS配制的0.1mg/mL的去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒倍比稀释后（100μL）加入到细胞中，在于37℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养24h后，向每个孔加入20μL的MTT溶液，培养4h后弃去孔中溶液，加入150μL的 DMSO溶液，使用震荡机震荡10min后，使用酶标仪检测OD570。
（三）有益效果
本发明提供了一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征及其活性研究方法。具备以下有益效果：
本发明通过从藏黄连中提取分离出藏黄连多糖，再将藏黄连多糖去除蛋白制得去蛋白藏黄连多糖，再将去蛋白藏黄连多糖还原亚硒酸钠合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒，经天然多糖还原无机硒如亚硒酸钠，得到的多糖-硒纳米颗粒具有粒径小，与无机硒比，其生物活性更高，并且毒性较低，从自然界的产物中进行提取，满足人们的需求，研究其结构表征，抗氧化活性和细胞毒性，为研发新型的抗氧化型食品添加剂或饲料添加剂提供理论依据，值得大力推广。
附图说明
图1为本发明的粒径分布示意图；
图2为本发明的红外光谱分析图；
图3为本发明的扫描电子显微镜-能谱分析图；
图4为本发明的X射线衍射分析图；
图5为本发明的紫外全波长扫描图；
图6为本发明的刚果红测试示意图；
图7为本发明的体外抗氧化能力示意图；
图8为本发明的细胞增殖活性示意图；
图9为本发明的抗炎活性示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.提取分离
称取500g藏黄连放入粉碎机内粉碎，使用80目的筛网对粉碎后的藏黄连粉末进行筛分，将筛分下的粉末放入烧杯内，向烧杯内加入蒸馏水，将烧杯静置对藏黄连粉末浸泡10h，随后将烧杯内混合液体倒入煎煮锅中，煎煮2.5h，重复煎煮3次后将煎煮锅内液体倒入离心管放入离心机中，以2500r/min的转速离心5min，将离心后的液体放入转转蒸发仪内浓缩至500mL，将浓缩液体取出放入烧杯内，再向烧杯内加入无水乙醇，同时进行搅拌，无水乙醇添加完毕后停止搅拌，将搅拌后的溶液静置静置12h后，取搅拌后烧杯底部沉淀物放入真空冷冻干燥机中，以-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖；
S2.去除蛋白
使用烧杯配制藏黄连多糖浓度为10mg/mL的溶液1740mL，向烧杯内加入60mLSevag混合液，对烧杯内溶液进行搅拌，持续搅拌50min后静置40min分层，取上层清液去除下层沉淀，将上层清液再次放入烧杯内加入60mLSevag混合液，重复操作10次后，将最终上层清液放入真空冷冻干燥机中，以-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得去蛋白藏黄连多糖；
S3.最终制备
制备3.0mg/mL的去蛋白藏黄连多糖溶液，将溶液加入到烧杯内，向烧杯内加入20mL的50mM亚硒酸钠溶液，在避光环境下持续搅拌3h后，向烧杯内滴加20mL的50mM抗坏血酸溶液，再向烧杯内加入超纯水将烧杯内体积补至200mL，继续在避光条件下持续搅拌12h，反应结束后将混合液装入截留分子量为8000～12000的透析袋中，在4℃的外界温度条件下避光使用蒸馏水透析72h，取透析后的反应液测量粒径，将反应液放入真空冷冻干燥机内，以-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖-硒纳米粒。
S1步骤提取分离中，藏黄连粉末与蒸馏水的重量比为1:15，浓缩液体与无水乙醇的体积比为1:4。
S2步骤去除蛋白中 Sevag混合液为正丁醇：三氯甲烷=1:4的混合溶液。
综上，通过从藏黄连中提取分离出藏黄连多糖，再将藏黄连多糖去除蛋白制得去蛋白藏黄连多糖，再将去蛋白藏黄连多糖还原亚硒酸钠合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒，经天然多糖还原无机硒如亚硒酸钠，得到的多糖-硒纳米颗粒具有粒径小，与无机硒比，其生物活性更高，并且毒性较低，研究其结构表征，抗氧化活性和细胞毒性，为研发新型的抗氧化型食品添加剂或饲料添加剂提供理论依据。
实施例二：
本发明实施例提供一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.提取分离
称取450g藏黄连放入研磨机内粉碎，使用70目的筛网对研磨后的藏黄连粉末进行筛分，将筛分下的粉末放入烧杯内，向烧杯内加入蒸馏水，将烧杯静置对藏黄连粉末浸泡12h，随后将量筒内混合液体倒入煎煮锅中，煎煮2h，重复煎煮三次后将煎煮锅内液体倒入离心管放入离心机中，以1500r/min的转速离心3min，将离心后的液体放入旋转蒸发仪内浓缩至500mL，将浓缩液体取出放入烧杯内，再向烧杯内加入无水乙醇，同时进行搅拌，无水乙醇添加完毕后停止搅拌，将搅拌后的溶液静置10h后，取烧杯底部沉淀物放入真空冷冻干燥机中，以-50℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖；
S2.去除蛋白
使用烧杯配制藏黄连多糖浓度为10mg/mL的溶液1740mL，向烧杯内加入60mLSevag混合液，对烧杯内进行搅拌，持续搅拌45min后静置30min分层，取上层清液去除下层沉淀，将上层清液再次放入烧杯内加入60mL Sevag混合液，重复操作8次后，将最终上层清液放入真空冷冻干燥机中，以-50℃的温度进行真空冷冻干燥，制得去蛋白藏黄连多糖；
S3.最终制备
制备0.5mg/mL的去蛋白藏黄连多糖溶液，将溶液加入到烧杯内，向烧杯内加入20mL的50mM亚硒酸钠溶液，在避光环境下持续搅拌3h后，向烧杯内滴加20mL的50mM抗坏血酸溶液，再向烧杯内加入超纯水将烧杯内体积补至200mL，继续在避光条件下持续搅拌12h，反应结束后将混合液装入截留分子量为8000～12000的透析袋中，在4℃的外界温度条件下避光使用蒸馏水透析72h，取透析后的反应液测量粒径，将反应液放入真空冷冻干燥机内，以-50℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖-硒纳米粒。
S1步骤提取分离中，藏黄连粉末与蒸馏水的重量比为1:15，浓缩液体与无水乙醇的体积比为1:4。
S2步骤去除蛋白中 Sevag混合液为正丁醇：三氯甲烷=1:4的混合溶液。
综上，通过从藏黄连中提取分离出藏黄连多糖，再将藏黄连多糖去除蛋白制得去蛋白藏黄连多糖，再将去蛋白藏黄连多糖还原亚硒酸钠合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒，经天然多糖还原无机硒如亚硒酸钠，得到的多糖-硒纳米颗粒具有粒径小，与无机硒比，其生物活性更高，并且毒性较低，研究其结构表征，抗氧化活性和细胞毒性，为研发新型的抗氧化型食品添加剂或饲料添加剂提供理论依据。
实施例三：
如图1-6所示，本发明实施例提供一种藏黄连多糖硒纳米粒结构表征的研究方法，包括以下方法：
A）.粒径分布
取藏黄连多糖-硒纳米粒，配制成1mg/mL的样品溶液，再使用纳米粒度仪检测其粒径分布；如图1中a表所示，当去蛋白藏黄连多糖浓度为1.5mg/mL时，藏黄连多糖-硒纳米粒的粒径分布相对比较集中且较小，因此，筛选1.5mg/mL的去蛋白藏黄连多糖作为最佳浓度，如图1中b表所示，藏黄连多糖-硒纳米粒的平均粒径为101.96nm。
B）.红外光谱分析
分别称取2mg的去蛋白藏黄连多糖、藏黄连多糖-硒纳米粒和硒纳米粒，将称取的材料分别放入玛瑙研钵中，并向研钵内加入10mg的溴化钾粉末混合研磨均匀，然后将研磨后的混合物放入压片机内压制成片，再将片状物放入红外光谱仪中以400～4000cm-1 的范围进行扫描；如图2所示，去蛋白藏黄连多糖在3148cm-1、1653cm-1处的振动吸收峰分别为O-H、C=O，在3016 cm-1形成吸收峰是由于-CH2基团的C-H伸缩和弯曲振动所形成的，以上表明去蛋白藏黄连多糖中有多糖的特征吸收峰的存在；藏黄连多糖-硒纳米粒中O-H拉伸震动形成的吸收峰和C=O吸收峰分别为3430cm-1、1631cm-1，表明藏黄连多糖-硒纳米粒中有多糖的存在，形成了新的吸收峰。藏黄连多糖-硒纳米粒在2858cm-1附近的吸收峰与硒纳米粒在2854cm-1附近的吸收峰类似，表明合成的藏黄连多糖-硒纳米粒中有硒纳米粒的存在，与藏黄连多糖比较，藏黄连多糖-硒纳米粒吸收峰向低波段移动，羟基的特征峰从3149cm-1（去蛋白藏黄连多糖）移动到3140cm-1（藏黄连多糖-硒纳米粒），表明去蛋白藏黄连多糖和硒纳米粒的O-H基团之间存在氢键相互作用。藏黄连多糖-硒纳米粒表面的-OH吸收峰从3446cm-1移至3430cm-1，C=O吸收峰从1653cm-1移至1631cm-1，C-O-C吸收峰从1253cm-1移至1251cm-1，以上结果表明硒纳米粒与藏黄连多糖之间是通过非共价作用的方式结合。
C）.扫描电子显微镜分析
称取2mg干燥的藏黄连多糖-硒纳米粒，首先使用喷金仪对藏黄连多糖-硒纳米粒进行喷金处理，然后放入扫描电镜下分析；图3中a和b为藏黄连多糖在300倍与1200倍下的扫描图，结果显示藏黄连多糖表面为片状，边缘呈针状；图3中d和e为藏黄连多糖-硒纳米粒在300倍和1200倍下的扫描图，结果显示Se纳米粒子覆盖在藏黄连多糖表面，片状加厚，边缘圆润；藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒能谱结果如图3中c和f，藏黄连多糖-硒纳米粒中Se的质量百分百为11.66%。
D）.X射线衍射分析
称取2mg干燥的藏黄连多糖-硒纳米粒置于玻片上，铺匀压紧后放入X射线衍射分析仪内，检测其元素峰；如图4所示藏黄连多糖-硒纳米粒的XRD结果与标准Se比色卡（PDF：32-0992）对比，标准硒的2θ在24°和31°处有两个强烈的反射峰，表明结晶硒的存在。藏黄连多糖-硒纳米粒显示出与标准Se有相似的反射峰，结果表明，藏黄连多糖-硒纳米粒中有Se存在，合成成功。
E）.紫外可见光吸收光谱
配置10mL的1mg/mL藏黄连多糖-硒纳米粒溶液，于紫外分光光度计中以200～800nm范围内全波长扫描；如图5所示，藏黄连多糖-硒纳米粒最大吸收峰值出现位置小于200nm，而硒纳米粒在480nm处有最大吸收峰值，其位于可见光区，说明硒纳米粒呈现橙黄色。核酸的紫外最大吸收峰在260nm处，藏黄连多糖在260nm未出现明显吸收峰，表明藏黄连多糖中核酸含量低；藏黄连多糖-硒纳米粒在260nm未出现吸收峰，表明中核酸含量低。蛋白质的紫外最大吸收峰在280nm处，藏黄连多糖在280nm未出现明显吸收峰，说明藏黄连多糖中蛋白质含量较低，藏黄连多糖-硒纳米粒在280nm未出现吸收峰，表明藏黄连多糖-硒纳米粒中无蛋白存在。
F）.刚果红测试
取2mL的刚果红溶液、4mL不同浓度的NaOH溶液和2mL的去蛋白藏黄连多糖放入烧杯内混合，在室温条件下避光搅拌15min，随后使用紫外可见光光度计检测各待测样品在200～800nm范围内的最大吸收波长（λmax）；再使用2mg/mL的凝胶多糖替代去蛋白藏黄连多糖，作为对照；如图6所示，随着NaOH浓度的增大，凝胶多糖的λmax也随之增加，凝胶多糖是可知的具有三螺旋结构的多糖，而试验中藏黄连多糖也表现出相同红移情况。因此，推测藏黄连多糖具有三螺旋构象。
实施例四：
如图7-9所示，本发明实施例提供一种藏黄连多糖硒纳米粒的活性研究方法，包括以下方法：
A）.体外抗氧化活性研究
a.DPPH自由基清除
分别取1mL浓度为（0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL）的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再分别向试管内加入2mL的DPPH溶液混匀，在室温条件下避光30min，在517nm处使用分光光度计测量吸光度，并记录吸光度值；将不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再向试管内加入2mL无水乙醇，再使用分光光度计测量吸光度，将吸光度值记为A0；取1mL蒸馏水置于试管内，再加入2mLDPPH溶液，使用分光光度计测定其吸光度，将吸光度值记为A1，DPPH自由基清除率=[1-（A1-A0）/A1]*100%；藏黄连多糖-硒纳米粒对DPPH自由基的清除能力见图7中b，由图可知，当浓度为2-10 mg/mL时，藏黄连多糖-硒纳米粒清除DPPH自由基能力随着浓度的升高逐渐增加，且在10mg/mL时达到最高为66.85%，而藏黄连多糖对DPPH自由基清除能力与藏黄连多糖-硒纳米粒相比较弱，最高达到47.35%，表明硒纳米粒子可以增强藏黄连多糖对DPPH自由清除能力。
b.羟自由基清除
分别取1mL浓度为（0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL）的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液置于试管中，再向试管内依次加入1mL的70mM的硫酸亚铁溶液和1mL浓度为70mM水杨酸-乙醇溶液，最后分别向试管内加入1mL30%的双氧水溶液，将试管均放入水浴机内，以37℃恒温水浴30min后，在510nm下使用分光光度计测量吸光度为A1；以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度为A2；以蒸馏水代替H2O2作为损伤组，测得其吸光度为A3，羟自由基清除率=[（A1-A3）/（A2-A3）]*100%；藏黄连多糖-硒纳米粒对羟自由基的清除能力见图7中c，由图可知，各浓度藏黄连多糖-硒纳米粒均有清除羟自由基能力，随着浓度的升高，其对羟自由基清除能力逐渐增加，且在10mg/mL时达到最高为84.92%，而藏黄连多糖对羟自由基清除能力与藏黄连多糖-硒纳米粒相比较弱，最高可达到62.29%，表明硒纳米粒子可以增强藏黄连多糖对羟自由基清除能力。
c.ABTS+自由基清除
将藏黄连多糖-硒纳米粒配制成0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL的五个浓度，ABTS溶液使用蒸馏水配制成浓度为2mM，取50mLABTS溶液与200mL过硫酸钾溶液放入试管内混合均匀，在室温条件写避光放置12～16h，得到ABTS+溶液，使用PBS将ABTS+溶液稀释至吸光度为（0.7±0.02）时备用；分别将10μL的不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液加入到96孔细胞板中，每个浓度重复三个孔，并向每个孔内加入200μL孵育好的ABTS+溶液，混匀6min后检测各孔在734nm处的吸光度（A2）；在空白孔内加入10μL的不同样品溶液和200μL的PBS溶液，混匀6min后检测其在734nm处的吸光度（A0）；再取空白孔作为对照孔加入210μL的ABTS+溶液，检测其在734nm处的吸光度（A1），ABTS+自由基清除率=[1-（A2-A0）/A1]*100%；藏黄连多糖-硒纳米粒对ABTS+自由基的清除能力见图7中a，由图可知，藏黄连多糖-硒纳米粒在各浓度均有清除ABTS+自由基能力，随着浓度的升高，对ABTS+自由基清除能力逐渐提高，且在10mg/mL时达到最高为76.52%，而藏黄连多糖对ABTS+自由基清除能力与藏黄连多糖-硒纳米粒相比较弱，最高为54.98%，表明硒纳米粒子可以增强藏黄连多糖对ABTS+自由清除能力。
d.总抗体氧化能力检测
将藏黄连多糖-硒纳米粒配制成0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL的五个浓度，在96孔细胞板的每个检测孔中加入180μLFRAP工作液，在空白对照孔内加入5μL蒸馏水，取六个标准曲线检测孔，并分别向内加入5μL六种浓度依次为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM的硫酸亚铁溶液，样品检测孔内分别加入不同浓度的藏黄连多糖-硒纳米粒溶液5μL，在阳性对照孔内加入5μL的Trolox且Trolox浓度为（0.15～1.5mM），混匀后在37℃下孵育3～5min后，测定593nm处的吸光度值，计算出藏黄连多糖-硒纳米粒的总抗氧化能力；藏黄连多糖-硒纳米粒总还原能力见图7中d，由图可知，当浓度为6.0-10.0mg/mL时，藏黄连多糖-硒纳米粒总还原能力达到1级以上，随着浓度的升高，总还原能力逐渐提高，且在10mg/mL时达到最高接近于2级，而藏黄连多糖总还原能力明显弱于藏黄连多糖-硒纳米粒，最高仅能达到1级，表明硒纳米粒子可以增强藏黄连多糖的还原性。
B）.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的体外活性研究
a.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的细胞增殖活性
取5000个RAW264.7细胞（100μL）分别加入到96孔板细胞培养板中，培养12h后分别将用PBS配制的0.1mg/mL的去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒倍比稀释后（100μL）加入到细胞中，在37℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养24h后，向每个孔内加入20μL的MTT溶液，培养4h后去除孔中的溶液，并加入150μL的DMSO溶液，使用震荡机震荡10min后，使用酶标仪检测OD570；如图8显示，藏黄连多糖在500-1000μg/mL浓度范围内均能显著促进RAW264.7的增殖；藏黄连多糖-硒纳米粒在250-500μg/mL浓度范围内均能显著促进RAW264.7的增殖；当浓度为500μg/mL时，藏黄连多糖-硒纳米粒促RAW264.7增殖效果显著高于藏黄连多糖，而在浓度为1000μg/mL时，两者表现出相反的效果，表明当藏黄连多糖-硒纳米粒增加到一定浓度时，其中的硒纳米粒浓度也随之增大，可抑制多糖的促细胞增殖活性。
b.去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒的抗炎活性
取5000个RAW264.7细胞（100μL）分别加入96孔板细胞培养板中，培养12h，每孔加入100μL LPS溶液（0.2μg/mL），继续培养12h后分别将用PBS配制的0.1mg/mL的去蛋白藏黄连多糖和藏黄连多糖-硒纳米粒倍比稀释后（100μL）加入到细胞中，在于37℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中培养24h后，向每个孔加入20μL的MTT溶液，培养4h后弃去孔中溶液，加入150μL的 DMSO溶液，使用震荡机震荡10min后，使用酶标仪检测OD570；如图9所示，与BC和LPS组相比，藏黄连多糖在1000μg/mL浓度范围内，显著缓解LPS对细胞的刺激；与BC组相比，藏黄连多糖-硒纳米粒在250-1000μg/mL范围内显著缓解LPS对细胞的刺激；与LPS组相比，藏黄连多糖-硒纳米粒在500-1000μg/mL范围内显著缓解LPS对细胞的刺激。62.5-500μg/mL浓度范围内，同一浓度时藏黄连多糖-硒纳米粒缓解LPS对细胞的刺激效果高于或显著高于CTP，表明藏黄连多糖-硒纳米粒的抗炎效果更好，硒纳米粒可增强藏黄连多糖的抗炎效果，结合图8，当藏黄连多糖-硒纳米粒在1000μg/mL时对正常RAW264.7细胞增殖无显著促进作用，而可显著缓解LPS对细胞的刺激，表明硒纳米粒可增强藏黄连多糖的抗炎效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.提取分离
称取450～500g藏黄连放入粉碎机内粉碎，使用70～80目的筛网对粉碎后的藏黄连粉末进行筛分，将筛分下的粉末放入烧杯内，向烧杯内加入蒸馏水，将烧杯静置对藏黄连粉末浸泡10～12h，随后将烧杯内混合液体倒入煎煮锅中，煎煮2～2.5h，重复煎煮2～3次后将煎煮锅内液体倒入离心管放入离心机中，以1500～2500r/min的转速离心3～5min，将离心后的液体放入旋转蒸发仪中浓缩至500mL，将浓缩液体取出放入烧杯，再向烧杯内加入无水乙醇，同时进行搅拌，无水乙醇添加完毕后停止搅拌，将搅拌后的溶液静置10～12h后，取烧杯底部沉淀物放入真空冷冻干燥机中，以-50～-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖；
S2.去除蛋白
使用烧杯配制藏黄连多糖浓度为10mg/mL的溶液1740mL，再向烧杯内加入60mL Sevag混合液，对烧杯内溶液进行搅拌，持续搅拌45～50min后静置30～40min分层，取上层清液去除下层沉淀，将上层清液再次放入烧杯内加入60mL Sevag混合液，重复操作8～10次后，将最终上层清液放入真空冷冻干燥机中，以-50～-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得去蛋白藏黄连多糖；
S3.最终制备
制备0.5～3.0mg/mL的去蛋白藏黄连多糖溶液，将溶液加入到烧杯内，再向烧杯内加入20mL的50mM亚硒酸钠溶液，在避光环境下持续搅拌3h后，向烧杯内滴加20mL的50mM抗坏血酸溶液，再向烧杯内加入超纯水将烧杯内体积补至200mL，继续在避光条件下持续搅拌12h，反应结束后将混合液装入截留分子量为8000～12000的透析袋中，在4℃的外界温度条件下避光使用蒸馏水透析72h，取透析后的反应液测量粒径，将反应液放入真空冷冻干燥机内，以-50～-60℃的温度进行真空冷冻干燥，制得藏黄连多糖-硒纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S1步骤提取分离中，藏黄连粉末与蒸馏水的重量比为1:15，浓缩液体与无水乙醇的体积比为1:4。
3.根据权利要求1所述的一种藏黄连多糖硒纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S2步骤去除蛋白中 Sevag混合液为正丁醇：三氯甲烷=1:4的混合溶液。
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