Gene aus Corynebacterium glutami cum für die Folsäurebiosynthese und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit dem Herstellungsverfahren für Folsäure durch Fermentation mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Organismus. Diese Erfindung besteht aus den Nucleo- tidsequenzen von vier Genen ( folE, folP, folB und folK) aus Corynebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und deren Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure. Diese vier Gene bilden ein Operon und werden in der folgenden Reihenfolge transkribiert: folE, folP, folB, folK.
Folsäure ist essentiell für tierische Organismen. Ihr Derivat Tetrahydrofolat ist in Zellen des tierischen Organismus ein sehr vielseitiger Carrier von aktivierten Einkohlenstoffeinheiten. Folsäure besteht aus drei Gruppen: einem substituierten Pteridin- ring, p-Aminobenzoat und Glutamat. Säuger können einen Pteridin- ring nicht synthetisieren. Sie nehmen Folsäure mit der Nahrung und von Mikroorganismen in ihrem Darmtrakt auf . Folsäuremangel führt hauptsächlich zu Läsionen in den Schleimhäuten.
Die kommerzielle Bedeutung der Folsäure liegt im Futtermittel- und Lebensmittelmarkt. Folsäure wird hauptsächlich als Nahrungsmittelzusatz eingesetzt.
Mikroorganismen können zur fermentativen Herstellung von Folsäure eingesetzt werden. Man kann sie durch gentechnische Veränderung des Biosynthesewegs der Folsäure in ihrer Folsäurebiosyntheselei- stung optimieren. Gentechnische Veränderung bedeutet in diesem Zusammenhang, die Anzahl der Kopien und/oder die Transkriptionsgeschwindigkeit der Gene des Biosynthesewegs für die Folsäure zu erhöhen. Als Folge davon steigt der Anteil an Genprodukt und damit auch die intrazelluläre Enzymaktivität. Erhöhte Enzymaktivität führt zu einer vermehrten Umwandlungsgeschwindigkeit der Nahrung (z.B. Glucose) zu Folsäure und damit auch zu einer erhöhten Produktkonzentration. Zur gentechnischen Veränderung müssen die Nucleotidsequenzen der Gene des Folsäurebiosynthese- wegs identifiziert werden. Diese Erfindung befaßt sich mit vier neuen Gensequenzen für die Folsäurebiosynthese aus Corynebacterium glutamicum und mit ihrem Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure .
Ein Teil der Erfindung besteht im folE-Genprodukt . SEQ ID NR. 2 beschreibt eine Polypeptidsequenz . Das folE-Genprodukt kodiert ein Polypeptid aus 202 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 22029 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktio- nellen Derivaten dieses Polypeptids, die man erhalten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 2 durch Deletion, Insertion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 25% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 15% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzy- matische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Sequenz SEQ ID NR. 2. Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folP-Genprodukt . SEQ ID NR. 4 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folP-Genpro- dukt kodiert ein Polypeptid aus 285 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 29520 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktioneilen Derivaten dieses Polypeptids, die man erhalten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 4 durch Deletion, Insertion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 40% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 25% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Se- quenz SEQ ID NR. 4.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folB-Genprodukt . SEQ ID NR. 6 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folB-Genpro- dukt kodiert ein Polypeptid aus 131 Aminosäuren mit einem Moleku- largewicht von 14020 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktioneilen Derivaten dieses Polypeptids, die man erhalten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 6 durch Deletion, Insertion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 30% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 20% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Sequenz SEQ ID R. 6.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folfC-Genprodukt . SEQ ID NR. 8 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folK-Genpro- dukt kodiert ein Polypeptid aus 160 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 18043 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktionellen Derivaten dieses Polypeptids, die man erhalten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 8 durch Deletion, Insertion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion,
Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 40% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 30% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Sequenz SEQ ID NR . 8.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in den Polynucleotidse- quenzen, die die oben beschriebenen Polypeptide kodieren. Die Po- lynucleotidsequenzen lassen sich ausgehend von Sequenzen, die man aus Corynebacterium glutamicum isoliert (d.h. SEQ ID NR. 1, 3, 5 und 7) , erzeugen, in dem man diese Sequenzen durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert oder nach Rückübersetzung des entsprechenden Polypeptids mit dem genetischen Code eine chemische Total- synthese ausführt.
Diese Polynucleotidsequenzen lassen sich vorzugsweise einsetzen zur Transformation von Wirtsorganismen, und hierbei vorzugsweise von Mikroorganismen, und zwar in Form von Genkonstrukten, die zu- mindest eine Kopie eines dieser Polynucleotide zusammen mit mindestens einer regulatorischen Sequenz enthalten. Regulatorische Sequenzen beinhalten Promotoren, Terminatoren, Verstärker und ri- bosomale Bindungsstellen.
Bevorzugte Wirtsorganismen für die Transformation mit diesen Gen- konstrukten sind Coryneibacterium- und Bacillus-Arten. Auch jeden beliebigen eukaryontisehen Mikroorganismus kann man einsetzen, vorzugsweise Hefestämme der Gattung Ashbya , Candlda , Plchla , Sac- charomyces und Hansenula .
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem Verfahren zur Herstellung von Folsäure durch Kultivierung eines Wirtsorganismus, der in der oben beschriebenen Art transformiert ist, und in der nachfolgenden Isolierung der Folsäure.
Die Verfahren und die Vorgehensweisen zur Kultivierung von Mikroorganismen und zur Isolierung von Folsäure aus einer mikrobiellen Produktion sind dem geschulten Personal geläufig.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung genauer beschrieben, ebenso ihre Anwendung zur gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen zur Steigerung der Syntheseleistung von Folsäure.
Beispiel 1
Darstellung einer Genombibliothek aus Corynebacterium glutamlcum ATCC 13032
DNA aus dem Genom von Corynebacterium glutamlcum ATCC 13032 läßt sich nach Standardmethoden gewinnen, die bereits beschrieben sind, z. B. von J. Altenbuchner und J. Cullum (1984, Mol. Gen. Genet. 195:134-138). Die Genombibliothek läßt sich nach Standard- Vorschriften (z.B.: Sambrook, J. et al . (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) mit jedem beliebigen Klonierungsvektor herstellen, z.B. pBluescript II KS- (Stratagene) oder ZAP Express™ (Stratagene) . Dabei kann man jede beliebige Fragmentgröße benutzen, vorzugsweise 5'au3AI-Frag- mente mit einer Länge von 2-9 kb, die sich in Klonierungsvektoren mit verdautem BamHI einbinden lassen.
Beispiel 2
Analyse der Nucleinsäuresequenz der Genombibliothek
Einzelne E. coli-Klone kann man aus der im Beispiel 1 dargestellten Genombibliothek auswählen. E. coli-Zellen werden nach Standardvorfahren in geeigneten Medien kultiviert (z.B. LB ergänzt mit 100 mg/1 Ampicillin) , danach läßt sich die Plasmid-DNA isolieren. Klont man Genomfragmente aus der DNA von Corynebacterium glutamlcum in pBluescript II KS- (siehe Beispiel 1) , läßt sich die DNA mit Hilfe der Oligonucleotide 5 ' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ' und 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' sequenzieren.
Beispiel 3
Computeranalyse der Sequenzen der isolierten Nukleinsäuren
Die Nucleotidsequenzen lassen sich z.B. mit Hilfe des BLASTX-Al- gorithmus (Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol . 215: 403-410) aneinanderfügen. Auf diesem Weg kann man neuartige Sequenzen entdecken und die Funktion dieser neuartigen Gene aufklären.
Beispiel 4
Identifizierung eines E. coii-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die GTP-Cyclohydrolase I (EC 3.5.4.16) enthält Bei der Analyse der E . coli-Klone , wie sie im Beispiel 2 be- schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene
Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 1 beschrieben ist. Bei der Anwen-
düng des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit GTP-Cyclohydrolasen I (FolE; EC 3.5.4.16) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der GTP-Cyclohydrolase-I (FolE) aus Mycobacterlum tuberculoslε (NRDB 5 006273; 72% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 5
Identifizierung eines E. coIi-Klons, der eine Nucleotidsequenz 0 des Gens für die Dihydropteroat-Synthase (EC 2.5.1.15) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 beschrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine 5 Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 3 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit Dihydropteroat-Synthasen (FolP; EC 2.5.1.15) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der Dihydropteroat-Synthase (FolP) aus Mycobacterlum tu- 0 berculosls (NRDB 006274; 53% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren) .
Beispiel 6
5 Identifizierung eines E. coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die Dihydroneopterin-Aldolase (EC 4.1.2.25) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 beschrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene 0 Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 5 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit Dihydroneopterin-Aldolasen (FolB; EC 4.1.2.25) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit 5 war mit der Dihydroneopterin-Aldolase (FolB) aus Mycobacterlum tuberculosis (NRDB 006275; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren) .
Beispiel 7 0
Identifizierung eines E. coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteri- din-pyrophosphokinase (EC 2.7.6.3) enthält
5 Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 beschrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine
Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 7 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydrop- teridin-pyrophosphokinasen (FolK; EC 2.7.6.3) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der
2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki- nase (FolK) aus Nyco acteriurn leprae (EMBL AL023093; 43% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren) .
Beispiel 8
Einsatz der Gene für die GTP-Cyclohydrolase I, für die Dihydropteroat-Synthase, für die Dihydroneopterin-Aldolase und für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki- nase aus Corynebacterium glutamicum zur Herstellung von Folsäure
Die Gene für die GTP-Cyclohydrolase I, für die Dihydropteroat- Synthase, für die Dihydroneopterin-Aldolase und für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki- nase aus Corynebacterium glutamicum lassen sich mit Hilfe geeigneter Klonierungs- und Expressionssysteme in Corynebacterium glutamicum oder in jeden beliebigen anderen Mikroorganismus einbringen. Man kann gentechnisch veränderte Mikroorganismen herstellen, die sich vom Wildtyp-Organismus hinsichtlich der Aktivität oder der Anzahl der Genkopien unterscheiden. Diese neuartigen, gentechnisch veränderten Stämme lassen sich zur Herstellung von Folsäure einsetzen.
Sequenzliste
(I) Allgemeine Angaben
[1) Anmelder:
(A) Name: BASF-LYNX Bioscience AG
(B) Straße: Im Neuenheimer Feld 515
(C) Stadt : Heidelberg
(D) Land: Deutschland
(E) Postleitzahl 69120
(F) Telephon: 06221/4546
(G) Telefax: 06221/454770
(2) Titel: Gene aus Corynebacterium glutamicum für die Biosynthese der Folsäure und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Fol säure
(3) Anzahl der Sequenzen: 8
SEQ ID NR. 1: DNA ( folE)
ATGAAGGAGACAACCGTGGATAACCACGCTGCAGTTCGCGAGTTCGATGAGGAGCGCGCAACAGC TGCGATTCGTGAGTTGCTCATCGCTGTGGGTGAGGATCCAGATCGCGAAGGCCTGTTGGAAACCC CAGCTCGAGTGGCTAGGGCGTACAAGGAAACTTTCGCGGGTCTGCATGAGGATCCCACCACTGTG CTGGAGAAGACGTTCTCTGAGGGCCATGAAGAGTTGGTTCTGGTTCGTGAGATCCCGATTTACTC CATGTGTGAGCACCACTTGGTGCCGTTCTTTGGCGTGGCGCACATTGGTTACATTCCGGGTAAGT CCGGCAAGGTGACTGGCCTGTCCAAGCTGGCGCGTTTAGCGGATATGTTTGCTAAGCGACCTCAG GTTCAGGAGCGCTTGACCTCCCAAATTGCGGATGCTCTCGTCGAAAAGCTTGATGCCCAGGCCGT GGCCGTGGTGATTGAAGCTGAGCACCTGTGCATGGCCATGCGCGGAATCCGTAAGCCTGGTGCTG TGACCACGACGTCTGCGGTGCGCGGCGGTTTTAAGAACAACGCTGCCTCCCGCGCTGAGGTGTTC TCCCTGATTCGGGGGCACTAA
SEQ ID NR. 2: Aminosäure (FolE)
MKETTVDNHAAVREFDEERATAAIRELLIAVGEDPDREGLLΞTPARVARAYKETFAGLHEDPTTV LEKTFSEGHEELVLVREIPIYSMCEHHLVPFFGVAHIGYIPGKSGKVTGLSKLARLADMFAKRPQ VQERLTSQIADALVEKLDAQAVAWIEAEHLCMAMRGIRKPGAVTTTSAVRGGFKNNAASRAEVF SLIRGH
SEQ ID NR. 3: DNA ( folP)
ATGAACGTATCCTCTTTGACCATCCCGGGACGCTGTTTGGTCATGGGAATTGTCAATGTCACTGA GGATTCCTTTTCGGACGGTGGCAAGTACATTGACGTTGATCAGGCGATCGCGCATGCCAAGGAAT TGGTGGCTGCTGGCGCCGACATGATTGATGTCGGCGGCGAGTCCACCCGGCCTGGGGCAGTGCGC GTCGACGCGTCCGTGGAACGGGACCGGGTTGTGCCGGTCATTAAGGCGCTTCACGACGCCGGCAT CCACACTTCCGTAGACACCATGCGGGCCTCCGTGGCGCAGGCTGCCGCGGGCGCTGGCGTCTCCA TGATCAACGACGTCTCTGGCGGTTTGGCTGATCCTGAGATGTTTTCTGTCATGGCGGAAGCGCAA ATTCCCGTGTGTTTGATGCACTGGCGCACCCTCCAATTCGGTGATGCCGCAGGTCAGGCAGATCA CGGTGGAGACGTTGTAGCCGATGTGCACGCAGTGCTTGATGATCTTGTCGCCCGCGCCACCGCTG CTGGTGTGGCCGAAAACCAGATCGTGCTTGATCCAGGTTTGGGTTTTGCCAAATCACGTGAAGAC AACTGGCGTTtGCTGCAAGCACTGCCCGAGTTTATTTCTGGACCTTTCCCCATCCTGGTGGGAGC ATCCCGGAAGCGATTCCTGGCTGGCGTGCGCAAAGACCGTGGCCTAGATGTCACCCCCATTGATG CCGACCCAGCAACCGCAGCGGTGACCGCAGTGTCTGCACATATGGGAGCATGGGGTGTGCGCGTG CACGATGTCCCAGTATCAAGGGACGCTGTTGATGTTGCCGCATTGTGGCGAAGTGGAGGAACTCA CCATGGCTGA
SEQ ID NR. 4: Aminosäure (FolP)
MNVSSLTIPGRCLVMGIVNVTEDSFSDGGKYIDVDQAIAHAKELVAAGADMIDVGGESTRPGAVR VDASVERDRWPVIKALHDAGIHTSVDTMRASVAQAAAGAGVSMINDVSGGLADPEMFSVMAEAQ IPVCLMHWRTLQFGDAAGQADHGGDWADVHAVLDDLVARATAAGVAENQIVLDPGLGFAKSRED 'NWRLLQALPEFISGPFPILVGASRKRFLAGVRKDRGLDVTPIDADPATAAVTAVSAHMGAWGVRV HDVPVSRDAVDVAALWRSGGTHHG
SEQ ID NR . 5 : DNA ( folB)
ATGGCTGATCGTATTGAACTTAAAGGCCTTGAATGCTTCGGACACCACGGTGTGTTCGACTTTGA AAAAGAGCAAGGCCAGCCCTTCATTGTGGATGTCACCTGCTGGATGGATTTCGATGCCGCAGGTG CCAGCGATGACCTTTCCGACACCGTAGATTACGGCGCGTTGGCATTGTTGGTTGCTGAAATCGTG GAAGGCCCATCCAGGGATTTGATCGAGACGGTGGCCACGGAATCTGCGGATGCTGTGATGGCTAA ATTTGATGCGCTTCATGCGGTGGAAGTAACCATCCATAAGCCCAAAGCACCGATCCCACGTACTT TTGCTGACGTCGCGGTGGTTGCCCGACGTTCCAGGAAATCCATGGCTGCTGGAAGGAGCAACGCC TAA
SEQ ID NR. 6: Aminosäure (FolB)
MADRIELKGLECFGHHGVFDFEKEQGQPFIVDVTCWMDFDAAGASDDLSDTVDYGALALLVAEIV EGPSRDLIETVATESADAVMAKFDALHAVEVTIHKPKAPIPRTFADVAWARRSRKSMAAGRSNA
SEQ ID NR. 7 : DNA ( folK)
ATGCATGCAGTTTTGTCCATCGGTTCCAACATGGATGATCGCTACGCGCTGCTCAACACAGTGAT CGAGGAATTCAAAGATGAGATCGTGGCGCAGTCTGCGATCTACTCAACCCCACCGTGGGGCATTG AGGATCAGGATGAATTCCTCAACGCAGTGCTCGTTGTTGAGGTTGAAGAAACCCCCATCGAGTTG CTGCGCCGTgGCCAAAAACTCGAAGAAGCCGCCGAGCGGGTCCGCGTCCGCAAATGGGGGCCACG CACCCTCGATGTGGATATCGTGCAGATCATTAAAGATGGGGAAGAGATCCTTTCTGAGGATCCCG AACTGACCTTGCCACACCCTTGGGCTTGGCAGCGTGCCTTCGTGTTGATCCCTTGGTTGGAAGCA GAACCTGATGCCGTCCTGCACGGCACGACCATTGCAGAACATGTGGATAATCTTGATCCCACAGA CATTGAAGGTGTCACCAAGATTTAA
SEQ ID NR. 8: Aminosäure (FolK)
MHAVLSIGSNMDDRYALLNTVIEEFKDEIVAQSAIYSTPPWGIEDQDEFLNAVLWEVEETPIEL LRRGQKLEEAAERVRVRKWGPRTLDVDIVQIIKDGEEILSEDPELTLPHPWAWQRAFVLIPWLEA EPDAVLHGTTIAEHVENLDPTDIEGVTKI