EP1144657A2 - Molekularbiologische marker für die analytische elektronenmikroskopie - Google Patents

Molekularbiologische marker für die analytische elektronenmikroskopie

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Publication number
EP1144657A2
EP1144657A2 EP00908920A EP00908920A EP1144657A2 EP 1144657 A2 EP1144657 A2 EP 1144657A2 EP 00908920 A EP00908920 A EP 00908920A EP 00908920 A EP00908920 A EP 00908920A EP 1144657 A2 EP1144657 A2 EP 1144657A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
plasmid
pbl
electron microscopy
repetitive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00908920A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sabine Bub
Helmut TRÖSTER
Karsten Richter
Ansgar Haking
Stefan Raddatz
Manfred Wiessler
Eberhard Spiess
Michael Trendelenburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1144657A2 publication Critical patent/EP1144657A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the invention relates to a series of new plasmids based on pBluescript KS (+) with more than 1 SK primer sequence element, preferably with 2, 7, 14, 21 and 27 repetitive SK primer sequence elements, and their use as a molecular biological marker for analytical electron microscopy .
  • Electron Spectroscopic Imaging is a method of analytical electron microscopy (EM), in which the distribution of a certain chemical element in the examined specimen is depicted.
  • EM analytical electron microscopy
  • the individual macromolecular components must be optically distinguishable.
  • the loading of gold particles or other particles that are visible in diffraction contrast is used to mark macromolecules for electron microscopy.
  • This technique uses different interactions of the beam electrons with the atoms in the specimen than the conventional transmission electron microscopy.
  • all elements can be specifically proven. This widens the range of elements that can be used for marking processes.
  • Decisive for the establishment of alternative marking methods is the verification of detection limits for the elements in question. Specifically, this means that information about the number of detectable element atoms per nm 2 area in the preparation is required. So it's about the detection limits of ESI technology. So far, there has been little research and inaccurate information on this parameter. The ESI technology is often used; however, no data on detection limits have been published so far.
  • the invention is therefore based on the object of providing a possibility with which data can be obtained before time-consuming cell and molecular biological experiments, by means of which the prospects of the planned experiment with the element in question or the marker structure in question can be assessed. Furthermore, the parameter of the detectable number of element atoms per unit area should be measurable in order to obtain the necessary information for the establishment of EM marking methods.
  • SK primer sequence element comprises the following sequence:
  • the SK primer sequence represents a section of 20 nucleotides which Stratagene designates in the vectors pBluescript KS (+/-) and Bluescript SK (+/-) it offers and in the "multiple cloning site” (MCS) lies.
  • pBluescript is a plasmid vector, which is sold by Stratagene. It is a circular DNA molecule that contains the genetic information necessary for reproduction in E. coli.
  • the "multiple cloning site” (MCS) is decisive for the cloning of foreign DNA sections into this vector.
  • the above-mentioned SK primer sequence repetitions were built into this MCS region, so that the resulting plasmids differ from pBluescript only in the MCS, i.e. derived from pBluescript.
  • a homologous sequence can be bound to this repetition sequence by hybridization. If this hybridizing sequence carries a marker complex, hybridization of the markers leads to the target structure.
  • the hybridizing sequence hereinafter referred to as the SK oligonucleotide or SKO, can be chemically modified at the ends, to allow different markers to be covalently bound. Any marking strategies can thus be examined.
  • a molecule can be coupled to the SKO which contains an element in the highest possible concentration, the suitability of which as a marker for ESI is to be checked.
  • Boron markers such as are described, for example, in German patent application 198 03 206.4 are suitable. Other promising markers are silicon, iron and manganese.
  • the marker compound will be constructed in a controlled synthesis so that the number of target element atoms is known and the target element is present in the largest possible amount in the center of the marker compound. It can also be linked to the SKO as a unit.
  • the boron marker structure is synthesized so that it is treated like a nucleoside unit in oligonucleotide synthesis.
  • the preferred way of coupling therefore provides for the preparation of a boron compound which contains the protective groups and coupling groups necessary for oligonucleotide synthesis by the phosphoramidite method, in the course of which an oligonucleotide, from the 3 'end to the 5' end, is a building block for building block.
  • the boron complex is attached to the 5 'end of the SKO alone or in the form of a 5' boron nucleotide (C) -3 'building block (see also German patent application 19803206.4 ).
  • the marker-containing building block contains a spacer, which will let the marker complex protrude from the SKO, in order not to hinder the hybridization of the marked SKO against the complementary plasmid regions.
  • Suitable spacers are aliphatic hydrocarbon chains with lengths between C 2 and C 10 , which may possibly contain oxygen groups in the form of ether bridges (preferably a maximum of 5) (see also German patent application 198 03 206.4).
  • any other marker structures, each containing a different target element can be used.
  • the labeled oligonucleotides are hybridized to the DNA and are selectively present in the preparation where the ring-shaped DNA molecules are located.
  • variable but defined amounts of target element atoms will depend on the DNA in the closest arrangement.
  • a densest packing can be assumed because the distances between the marker structures on the DNA were found to be 8 nm. This results from the calculation of the extent of double-stranded DNA regions over the SK repetition units present in the plasmids. Since the marker structure will have a maximum diameter of 5 nm, some space remains between the markers; however, this space should be preserved because the hydration envelope of the marker compounds must be taken into account.
  • the plasmid according to the invention is spread onto the carrier matrix of the sample holder and prepared for the ESI.
  • the above plasmids allow the preparation of single-stranded, ring-shaped plasmid DNA molecules after infection of plasmid-containing E. coli cells, preferably E. coli JM 110, with a so-called helper virus.
  • the (+) sign in the name of the original plasmid pBluescript KS (+) indicates that only the + strand of the plasmid molecule is isolated.
  • a single-stranded DNA sample is now available, against which complementary DNA regions can be hybridized immediately, without the otherwise necessary melting of the DNA double strand.
  • SK oligonucleotides complementary to the + strand of the plasmids
  • these naturally have to represent the sequence of the - strand, ie 5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3 '.
  • Such an oligonucleotide can be produced by means of automatic oligonucleotide synthesis. These molecules are mixed in an aqueous solution with one of the single-strand plasmid molecules mentioned above.
  • Double-stranded areas are formed where the SK-oligonucleotides (SKO) have found the complementary partner on the single-stranded DNA, that is to say SK-oligonucleotide / plasmid hybrids (hereinafter referred to as SKOPH).
  • SKOPH SK-oligonucleotide / plasmid hybrids
  • the gap of 4 nucleotides is preferably provided as an interstice between the SK oligonucleotide binding sites.
  • SKOPHs are separated from unbound SKOs, preferably by chromatography. This can be done by column chromatography, e.g. are offered by Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) column matrices (for example Sephadex or Sepharose). The cleaned SKOPHs are then spread. Otherwise, crumpled DNA molecules are pretreated so that they are stretched in solution and in this state are applied to electron microscope carrier networks coated with thin film, made visible by treatment with heavy metals, and analyzed in a transmission electron microscope (TEM). If an ESI analysis is provided, the heavy metal treatment should be omitted, since every element that is present in high amounts and / or concentrations in the preparation interferes with the specific detection of the target element or makes it impossible.
  • TEM transmission electron microscope
  • the DNA rings will now be evenly distributed over the surface of the TEM preparation and lie individually. This fulfills the basic requirements mentioned above: The circular DNA is clearly recognizable, the SKOs are bound to the DNA in more or less large numbers and there is (almost) nothing between the DNA areas.
  • SKOs labeled with digoxigenin or biotin at the 5 'position are used, against which an anti-digoxigenin or an anti-biotin antibody is used that is itself gold-marked and can be detected with conventional TEM; the gold grain size must not exceed approx. 6 nm diameter (otherwise the gold grains could interfere with each other); b) possibly in combination with a) the repetitive target plasmid can be linearized by restriction endonuclease digestion next to the repetitive SK region, so that after spreading the Binding locations of the SKOs are immediately identifiable by the fact that they must be at the end of a thread-like DNA molecule. Since restriction endonucleases only cut double-stranded DNA, its interface must first be made double-stranded by hybridizing an oligonucleotide that is complementary to the interface.
  • the repetitive sequences are arranged closely one behind the other and extend over about a third of the plasmid. These repetitive sequences greatly increase the significance of the test.
  • the advantage of the plasmids described above is that between one and 27 of the marker units can be accumulated in order to modulate the number of marker element atoms. If it is possible to display the marked SKOPHs in different spreading states from fully stretched to twisted in the spreading preparation, the target element atoms, particularly bound to kneaded DNA molecules, can i) be concentrated in a confined space, ii) can be localized because of the evenly fibrillary ring shape of the DNA bound to them, iii) analyzed in a defined but variable number and iv) in an otherwise element-free environment.
  • DNA sections outside the repetition areas, to which no marker can bind serve as a negative control for the ESI element detection.
  • a negative control is necessary because the specificity of a calculated target element distribution could be questioned if one could not show a comparison region without a target element and accordingly without a calculated E 1 emen t s i gna 1. Since the test is a molecular biological system, the marker is assessed in its physico-chemical environment. That also that the test comes very close to a medical / biological application, especially in situ hybridization.
  • the aim of the test procedure is to obtain reliable data on the minimum number of target element atoms per unit area required for an ES I detection.
  • you get data about the individual recognizability of the Marker structure because repetition of the same means that even weak element-specific signals can be averaged, especially on DNA molecules that are fully stretched out in the electron microscopic preparation.
  • the spreading preparations all plasmid states can be found from stretched to heavily twisted, especially if the spreading has not been optimal. This normally undesirable case is advantageous in connection with the explained determination of the element detection limits.
  • the threshold values for element-specific detection can be determined. No other method exists for this. It can therefore be imagined that this method is also of interest to those scientifically active persons who have no biological / medical application in mind, but are interested in the detection limits of any chemical elements other than those mentioned.
  • the prerequisite is that the target element is already as concentrated as possible and in the highest possible amount in the marker structure coupled to the oligonucleotide.
  • the repetition areas mentioned offer the possibility of making DNA generally detectable after hybridization even with those SKO-coupled markers which, as single molecules, are still below the detection limit, but in a more repetitive manner Order can be proven.
  • the repetition areas could also be cloned into the desired DNA molecules via Sac 1 / Kpn I-compatible ends. Such a procedure could be used, for example, to trace the path of DNA after insertion into a cell (transfection). Both light and electron microscopic applications are possible.
  • the chemical modifiability of the hybridizing sequence allows the test to be used in different ways for differently configured marker units. Since the test is a molecular biological system, the marker is assessed in its physico-chemical environment. The individual recognizability of the marker is tested. The strength of weak signals can be precisely determined by communication.
  • the plasmid construction is stabilized by introducing it into a dam " / the " strain (preferably E. coli JM 110).
  • JM110 is dam ' I dem ' and otherwise contains no conspicuous genotypic markers that would clearly distinguish this strain from the others used, so that these can also be used.
  • the repetitive plasmids according to the invention are introduced into the dam " / may strain according to standard methods (cf. Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T.: Molecular cloning; A laboratory manual; Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), which surprisingly avoids deletion of the directly repetitive elements during bacterial multiplication, since it is actually known that direct repeats or inverted repeats are lost during the multiplication in E. coli, dam / dem Strains have been documented in the literature (cf. Marinus et al., J. Bacteriol. 114 (3), 1143-1150 (1973)), but a stabilization of directly repetitive sequences by this has never been described.
  • E. coli JM110 could even be increased to 27x.
  • the combination of E. coli JMllO / pBl KS (+) 27xSK is for the first time a system in which a direct repetition sequence that is otherwise unstable in E. coli can be increased.
  • Bacterial geneticists have the opportunity to analyze the underlying mechanisms of this type of deletions in bacteria and to characterize the components involved. The question of the stabilization of repetitions of such a type in E. For example, col i is of interest to cloning specialists who want to preserve human DNA sections in their original state, even if they had been propagated in E. coli
  • the background is the one that short, directly repetitive sections also occur in human DNA sections, which may be difficult to stabilize comparable to the SK primer sequence repetition described above.
  • test kit contains e.g. the following materials: 1) competent E. coli JMllO bacterial cells for the multiplication of the repetitive plasmids; 2) the single-stranded plasmids lx or 2x, 7x, 14x, 21x and 27x SK for the differential analysis of marker structures for the electron microscope; 3) electron microscopic carrier nets already coated for spreading; 4) SK oligonucleotides marked by biotinylation or digoxygenation at the 5 'end, which serve to optimize the hybridization and spreading, by using a gold-coupled anti-biotin or anti-digoxigenin antibody to demonstrate that the repetitive arrangement on Plasmid is actually present; 5) a regulation that describes the individual work steps. If there is an interest in applications other than ESI-dependent, the test kit can be modified for such interested parties.
  • the plasmids with 2, 7, 14, 21 and 27 SK primer sequence elements were identified as E. coli cultures on December 22, 1998 at the DSMZ
  • Figure 1 Overview of the production of pBI KS (+) 2x SK.
  • the type of display selected here is continued in the following illustrations of this type.
  • the multiple cloning site (MCS) is shown as a dark gray block, the SK primer sequence contained therein is highlighted in light gray. The interfaces are marked with a fine broken line. The detailed sequence is given from the sections important for cloning.
  • MCS multiple cloning site
  • Figure 2 Simplified schematic representation of pBl KS (+) 7x SK.
  • the vector pBl is identified by a broken black line; His Kpn I / Sac I oriented MCS now contains seven SK primer sequences.
  • the SK-PH II fragment (dashed arrow above and line-highlighted sequence "SK-PH II" below) inserted the seventh SK primer and the additional Eag I site in the vector.
  • the important sequences are highlighted in detail.
  • the SK primer sequence is highlighted in light gray, the rest of the MCS and the 4-base spacer in dark gray. The interfaces are marked in the sequence with a finely broken black line.
  • FIG. 3 Schematic representation of the cloning of a pBl2x block plas ids a) insertion of a 7x SK block in the Not I opened pBl lx block DNA.
  • the labeling of the individual components is identical to that shown in FIG. 1 or FIG. 2.
  • the clone pBl lx block was linearized with the enzyme Not I and ligated with the PCR fragment which had previously been cut with Ea g I. To simplify the rest of the text, the seven SK fragments are combined to form a gray arrow, b) representation of the transitions between individual blocks.
  • the labeling of the components is comparable to that in Fig. 1a-d.
  • the Not I interface which previously opened pBl lx block, was masked by the 5 'end of the newly added 7x SK block (bold letters) and can no longer be cut by Not I.
  • the 3 'end of the fragment completes the Not I interface towards the vector. This will make it possible in the next cloning round to linearize pBl 2x block again with Not I, without losing the 14 SK-
  • Black bars mark the SK primer sequence areas in the repetitive region sequenced from both sides.
  • the 4 base pairs long sequences ATCT or GCCG lie between these S K - P r i m e r s e qu e n e c e s.
  • the SK primer element from pBluescript was used for repetition (Stratagene, Heidelberg) selected because it does not contain any self-complementary or homooligomeric regions, has a G / C content of 50% in the average range of natural DNA and is cloning-favorable for the almost complete production of directly repetitive regions. It is also advantageous that this region hybridizes reliably and stably with a complementary sequencing primer (identical to the SK primer described here), since it was designed by the Stratagene (Heidelberg) company as a sequencing primer binding site.
  • a short oligonucleotide fragment is required in which the SK primer sequence and interfaces for carrying out the cloning are contained.
  • Complementary oligonucleotides were synthesized for this. These ss-DNA fragments were converted into clonable ds fragments by hybridization, in which the two complementary oligonucleotides are attached to one another in equimolar amounts in 10 mM Tris buffer. The success control represents the successful cloning.
  • the fragments formed in this way became SK-PH I (SK primer hybrid I; fragment which was used for the SK primer propagation of 2-6 SK primer sequences, see Fig. 1) and SK-PH II (SK primer hybrid II; fragment that introduced the seventh SK primer and the Eag I interface, see Fig. 2).
  • coli for example XLl-Blue
  • plasmid DNA was isolated from the grown colonies by mini-preparation from three clones for cloning control.
  • the clones obtained in this way are called pBl KS (+) 2x SK (Fig.lc) below.
  • the interfaces into which another SK-PH I fragment was to be integrated were only six base pairs apart. Such a small distance between two restriction interfaces does not allow the simultaneous restriction of both interfaces. Accordingly, both enzymes had to be cut one after the other. In this way, the cloning up to the plasmid pBl KS (+) 6x SK was carried out.
  • the repetitive elements were multiplied in blocks. This could only work if there was an interface that separated the area with seven SK primers as a unit from the vector. This was made possible by the ligation of the SK-PH II (Fig. 2) in pBl 6x SK. In addition to the seventh SK element, SK-PH II introduced the new interface Eag I into the vector. Now the seven SK primers were limited by two Eag I interfaces (Fig.2) because the output vector pBl KS (+) already brought such an interface with it in the MCS. In order to accelerate the further cloning steps, the SK elements were multiplied in blocks by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the plasmid preparation from XLl-Blue which was derived directly from the original colony (pBl 7x SK), was used as the template DNA for the amplification of the fragment with seven repetitive elements.
  • the primers M13, Ml3 reverse, T3 and T7 (M13: TGTAAAACGACGGCCAG; M13 reverse :: CAGGAAACAGCTATGACC; T3: AATTAACCCTCACTAAAGGG; T7: TAATACGACT-CACTATAGGG) were tested in various combinations with one another.
  • the pBl lx block opened with Not I was ligated to the purified PCR fragment, which also contained seven SK primers. This was made possible by the single Not I interface on the edge of the repetitive elements, which linearized the pBl lx block.
  • the PCR fragment was cut with the enzyme Eag I compatible with Not I and ligated directly to the seven SK primers of the vector (pBI 2x block).
  • pBl 2x block was linearized with iVot I, as shown in Fig. 3. Complete digestion was checked on a 1% agarose gel. The 5 'ends of this plasmid opened with iVot I were dephosphorylated and ligated to the 7x SK block. The transformation resulted in seven colonies.
  • PBl 3x block was used as the starting plasmid of this cloning. This cloning was treated like the previous two.
  • pBl 3x block was linearized with iVot I, checked for complete digestion in a 1% agarose gel and then dephosphorylated. The dephosphorylated vector was inserted into a ligation batch together with the 7x SK block amplified and cut in the PCR. The control ligation to assess dephosphorylation revealed 2 clones. During the transformation of the ligation with insert, 59 clones developed, of which 16 colonies were selected for a mini-preparation. The separation with an agarose gel after a Sac I / Kpn I digestion was carried out as usual on a 2.2% gel matrix.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Plasmid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich von pBluescript KS(+) ableitet und mehr als 1, bevorzugt 2, 7, 14, 21 und 27, repetitive SK-Primerelemente enthält, sowie dessen Verwendung in der analytischen Elektronenmikroskopie.

Description

Molekularbiologische Marker für die analytische Elektronenmikroskopie
Die Erfindung betrifft eine Serie neuer Plasmide auf der Basis von pBluescript KS(+) mit mehr als 1 SK-Primersequenzelement, bevorzugt mit 2, 7, 14, 21 und 27 repetitiven SK- Primersequenzelementen , sowie deren Verwendung als molekularbiologischer Marker für die analytische Elektronenmikroskopie .
Das Electron Spectroscopic Imaging (ESI) ist ein Verfahren der analytischen Elektronenmikroskopie (EM) , bei dem die Verteilung eines bestimmten chemischen Elements im untersuchten Präparat bildlich dargestellt wird. Um die strukturellen Organisationen biologischer Systeme zu erhellen, müssen die einzelnen makromolekularen Komponenten optisch unterscheidbar sein. Gegenwärtig wird zur Markierung von Makromolekülen für die Elektronenmikroskopie die Beladung mit Goldpartikeln oder anderen Teilchen verwendet, die im Beu- gungskontrast sichtbar sind.
Bisher werden Mehrfachmarkierungsexperimente in der Elektronenmikroskopie so durchgeführt, dass man Goldkörner unterschiedlicher Grosse verwendet, um die verschiedenen Zielstrukturen in demselben Präparat unterscheiden zu können. Beispielsweise würde in einem Doppelmarkierungsexperiment ein Molekültyp mit 5nm grossen Goldkörnern, der andere mit 10-20nm grossen gekoppelt werden, um sicher zu sein, dass bei der späteren Auswertung die verschiedenen Moleküle eindeutig lokalisiert und voneinander unterschieden werden können. Grosse Goldkörner (grösser als lOnm) bringen Nachteile mit sich, weil deren Eindringvermögen in Gewebe und deren Kopplungseffizienz an das Zielmolekül reduziert sind (Giberson, R.T., und Demaree, R.S: The influence of immunogold particle size on labeling density. Microscopy Research and Technique, 27, 355-357, 1994); ausserdem lässt sich eine solch grosse Struktur nicht mehr eindeutig dem Ort der Bindung an die Zielstruktur zuordnen, d.h. man verliert an Au f l ö s ung s v e rm ö g e n . Wü r d e man e i n Dreifachmarkierungsexperiment planen, würden sich diese Nachteile besonders stark bemerkbar machen. Eine Alternative zu den Goldkörnern bieten nur sog. Ferritinmoleküle, grosse Proteineinheiten, die Hunderte von Eisenatomen im Zentrum enthalten und an Zielstrukturen koppelbar sind. Deren Elektronendichte und damit die Detektierbarkeit im Transmissionselektronenmikroskop sind allerdings so schlecht, dass ihre Anwendung sich nur in den seltensten Fällen als praktikabel erwiesen hat.
Demgegenüber existieren im Bereich der Lichtmikroskopie seit einiger Zeit Fluoreszenzverfahren, die vergleichsweise problemlos die Dr e i f achmarki erung , ja sogar die Vierfachmarkierung ermöglichen. Da die Elektronenmikroskopie auf dem Sektor der Markierungstechniken mit der Lichtmikroskopie momentan nicht konkurrieren kann, begnügen sich die Wissenschaftler mit dem vergleichsweise schlechten Auflösungsvermögen der Lichtmikroskope, bevor sie die Nachteile der Ma r k i e r un g s t e c hn o 1 o g i e auf dem elektronenmikroskopischen Sektor in Kauf nehmen. Mit der Entwicklung alternativer Markierungstechniken zur Goldmarkierung würde die Elektronenmikroskopie an Attraktivität gewinnen, weil die Konkurrenzfähigkeit bezüglich der Markierung einherginge mit einem mehr als 100 mal so guten Auflösungsvermögen wie es die Lichtmikroskopie ermöglicht. Als Alternative zum Markierungsverfahren mit Gold für konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie, das auf der Elektronendichte des Schwermetalls Gold basiert, besteht ein Bedarf für Markierungsverfahren für ESI. Diese Technik nutzt andere Wechselwirkungen der Strahlelektronen mit den Atomen im Präparat aus als die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie. Es lassen sich im Prinzip alle Elemente spezifisch nachweisen. Damit erweitert sich der Kreis der Elemente, die für Markierungsverfahren in Frage kommen. Entscheidend für die Etablierung alternativer Markierungsverfahren ist allerdings die Überprüfung von Detektionslimits für die in Frage kommenden Elemente. D.h. konkret, dass man Informationen über die Anzahl detektierbarer Elementatome pro nm2 Fläche im Präparat braucht. Es geht also um die Nachweisgrenzen der ESI-Technik. Zu diesem Parameter gibt es bisher wenig Untersuchungen und ungenaue Angaben. Die ESI-Technik wird zwar häufig genutzt; trotzdem wurden bisher keine Daten zu Detektionsgrenzen veröffentlicht.
Es besteht also ein Bedarf nach alternativen Markierungsmöglichkeiten für die Elektronenmikroskopie. Die Detektierbarkeit eines solchen Markerkomplexes sollte leicht getestet und beurteilt werden können.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit bereitzustellen, mit der vor zeitaufwendigen zell- und molekularbiologischen Versuchen Daten erhalten werden können, anhand derer die Aussichten des geplanten Experiments mit dem in Frage kommenden Element bzw. der in Frage kommenden Markerstruktur beurteilt werden können. Ferner soll der Parameter der detektierbaren Anzahl an Elementatomen pro Flächeneinheit messbar werden, um daraus die notwendigen Informationen für die Etablierung von EM-Markierungsverfahren zu erhalten.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der beigefügten Patentansprüche .
Die Ursache für die Notwendigkeit oben erwähnter Vorversuche liegt darin begründet, dass bis heute für die ESI-Detektion der verschiedenen chemischen Elemente keine genauen Grenzwerte der Detektierbarkeit bekannt sind. Der Grund ist unter anderem der, dass die Präparation einer geeigneten Testprobe nicht trivial ist. Eine solche Probe muss besondere Eigenschaften aufweisen. Es muss Bereiche geben, in denen das Zielelement in einer klar definierten Menge vorhanden ist. Diese Bereiche müssen eindeutig zu erkennen sein. In allen übrigen Bereichen darf das Zielelement nicht auftreten. Diese Problematik lässt sich anhand der Publikation von Golla, U. und Kohl, H.
(Micron, 28 (5), 397-406, 1997) aufzeigen, in der versucht wurde, die Auflösung und die Detektierbarkeit am Beispiel Uran mittels körniger Präzipitate zu dokumentieren.
Erfindungsgemäß wurde eine Serie neuer Plasmide mit mehr als 1, bevorzugt 2, 7, 14, 21 und 27 SK-Primersequenzelementen in direkter Kopf/Schwanz orientierter Repetition auf der Basis von pBluescript KS(+) hergestellt. Das ringförmig geschlossene Plasmid liegt als Zielstruktur vor, in der eine kurze DNA- Sequenz (SK-Primersequenzelement) repetitiv enthalten ist. Das SK-Primersequenzelement umfaßt folgende Sequenz :
5 ' -GATCCACTAGTTCTAGAGCG-3 ' .
Die SK-Primersequenz stellt einen Abschnitt von 20 Nukleotiden dar, der von der Fa. Stratagene in den von ihnen angebotenen Vektoren pBluescript KS(+/-) sowie Bluescript SK (+/-) so bezeichnet wird und in der "multiple cloning site" (MCS) liegt. pBluescript ist ein Plasmidvektor, der von der Fa. Stratagene verkauft wird. Es handelt sich um ein ringförmiges DNA-Molekül, das die für die Vermehrung in E.coli notwendigen genetischen Informationen enthält. Für die Klonierung von Fremd-DNA-Abschnitten in diesen Vektor entscheidend ist die "multiple cloning site" (MCS) . In diese MCS-Region wurden erfindungsgemäß die oben genannten SK-Primersequenz- Repetitionen einbaut, so daß sich die entstehenden Plasmide von pBluescript nur in der MCS unterscheiden, d.h. sich von pBluescript ableiten.
An diese Repetitionssequenz kann eine homologe Sequenz durch Hybridisierung gebunden werden. Trägt diese hybridisierende Sequenz einen Markerkomplex, gelangt durch Hybridisierung der Marker an die Zielstruktur.
Die hybridisierende Sequenz, nachfolgend SK-Oligonukleotid bzw. SKO genannt, kann an den Enden chemisch modifiziert sein, um eine kovalente Bindung unterschiedlicher Marker zu erlauben. Damit können beliebige Markierungsstrategien untersucht werden. An das SKO kann ein Molekül gekoppelt werden, das ein Element in möglichst hoher Konzentration enthält, dessen Tauglichkeit als Marker für ESI man überprüfen will. Es eignen sich Bor-Marker wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung 198 03 206.4 beschrieben sind. Weitere erfolgversprechende Marker sind Silizium sowie Eisen und Mangan. Die Markerverbindung wird in einer kontrollierten Synthese so aufgebaut werden, dass die Anzahl an Zielelementatomen bekannt ist und das Zielelement in möglichst grosser Menge im Zentrum der Markerverbindung vorliegt. Sie kann ausserdem als Einheit an das SKO gekoppelt werden. Zur Erfüllung dieser Erfordernisse wird beispielsweise die Bor-Markerstruktur so synthetisiert, dass sie wie eine Nukleosid-Einheit in der Oligonukleotidsynthese behandelt wird. Der bevorzugte Weg der Kopplung sieht also die Herstellung einer Borverbindung vor, die die notwendigen Schutzgruppen und Kopplungsgruppen für die Oligonu- kleotidsynthese nach dem Phosphoramidit-Verfahren enthält, in dessen Verlauf ein Oligonukleotid, vom 3 ' -Ende zum 5 ' -Ende hin, Baustein für Baustein, aufgebaut wird. Es besteht dabei die Möglichkeit, daß dazu im letzten Schritt an das 5 ' -Ende des SKO der Borkomplex alleine oder in Form eines 5 ' -Bor- Nukleotid(C) -3 ' -Bausteins angehängt wird (s. dazu auch deutsche Patentanmeldung 19803206.4). Vorteilhaft ist es, wenn der Marker-haltige Baustein einen Abstandhalter (Spacer) enthält, der den Markerkomplex vom SKO abstehen lassen wird, um die Hybridisierung des markierten SKO gegen die komplementären Plasmidbereiche nicht zu behindern. Als Spacer kommen aliphatische Kohlenwasserstoffketten mit Längen zwischen C2 und C10 in Frage, die eventuell Sauerstoffgruppen in Form von Etherbrücken (vorzugsweise maximal 5 Stück) enthalten können (siehe dazu auch deutsche Patentanmeldung 198 03 206.4). In vergleichbarer Weise kann auch mit beliebigen anderen Markerstrukturen, jeweils ein anderes Zielelement enthaltend, verfahren werden. Die markierten Oligonukleotide werden an die DNA hybridisiert und liegen im Präparat selektiv dort vor, wo die ringförmigen DNA-Moleküle liegen. Je nach Repetitionsgrad der SK-Elemente auf den verwendeten Plasmidmolekülen werden also variable aber definierte Mengen an Zielelementatomen in dichtester Anordnung an der DNA hängen. Man kann deshalb von einer dichtesten Packung ausgehen, weil gefunden wurde, daß die Abstände der Markerstrukturen an der DNA 8 nm betragen. Dies ergibt sich aus der Berechnung der Ausdehnung doppelsträngiger DNA- Bereiche über die in den Plasmiden vorliegenden SK- Repetitionseinheiten. Da die MarkerStruktur einen Durchmesser von maximal 5 nm haben wird, bleibt zwar etwas Raum zwischen den Markern frei; dieser Raum sollte allerdings erhalten bleiben, weil die Hydrathülle der Markerverbindungen berücksichtigt werden muss.
Das erfindungsge äße Plasmid wird gespreitet auf die Trägermatrix des Probenhalters für das ESI präpariert. Die obigen Plasmide erlauben die Präparation einzelsträngiger, ringförmiger Plasmid-DNA-Moleküle nach Infektion plasmidhalti- ger E. coli-Zellen, bevorzugt E. coli JM 110, mit einem sogenannten Helfervirus. Das (+) -Zeichen im Namen des Ursprungsplasmids pBluescript KS (+) gibt an, dass nur der + - Strang des Plasmidmoleküls isoliert wird. Nun steht eine einzelsträngige DNA-Probe zur Verfügung, gegen die, ohne das sonst notwendige Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs, sofort komplementäre DNA-Bereiche hybridisiert werden können. Um gegen den + - Strang der Plasmide komplementäre SK- Oligonukleotide (SKO) zu hybridisieren, müssen diese naturgemäss die Sequenz des - - Strangs darstellen, d.h. 5'- CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3 ' . Ein solches Oligonukleotid kann mittels automatischer Oligonukleotidsynthese hergestellt werden. Diese Moleküle werden in einer wässrigen Lösung mit einem der obengenannten Einzelstrang-Plasmidmoleküle gemischt. Es bilden sich an den Stellen Doppelstrangbereiche, wo die SK- Oligonukleotide (SKO) den komplementären Partner auf der Einzelstrang-DNA gefunden haben, also SK-Oligonu- kleotid/Plasmid-Hybride (nachfolgend SKOPH genannt) . Um die Bindung der einzelnen SKOs an die DNA nicht zu behindern, wird vorzugsweise als Abs t andshal t er zwischen den SK- Oligonukleotid-Bindungsstellen die Lücke von 4 Nukleotiden vorgesehen.
Diese SKOPHs werden vorzugsweise durch Chromatographie von ungebundenen SKOs getrennt. Dies kann durch Säulenchromatografie geschehen, z.B. werden von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) Säulenmatrices angeboten (bei- spielsweise Sephadex oder Sepharose) . Die gesäuberten SKOPHs werden dann einer Spreitung unterzogen. Dabei werden ansonsten geknäuelte DNA-Moleküle so vorbehandelt, dass sie in Lösung gestreckt sind und in diesem Zustand auf mit dünner Folie beschichtete elektronenmikroskopische Trägernetzchen aufgetra- gen, durch Behandlung mit Schwermetallen sichtbar gemacht und im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) analysiert. Falls eine ESI-Analyse vorgesehen ist, sollte die Schwermetall- Behandlung entfallen, da jedes Element, das in hohen Mengen und/oder Konzentrationen im Präparat vorkommt, den spezifi- sehen Nachweis des Zielelements stört oder unmöglich macht. Die DNA-Ringe werden nun gleichmässig über die Oberfläche des TEM-Präparats verteilt sein und einzeln liegen. Damit sind die obengenannten Grundvoraussetzungen erfüllt: Die ringförmige DNA ist eindeutig erkennbar, an die DNA gebunden liegen die SKOs in mehr oder weniger grosser Zahl vor und zwischen den DNA-Bereichen ist (annähernd) nichts.
Falls unklar sein sollte, ob die SKOs an die repetitive Region gebunden wurden, bestehen zwei Kontrollmöglichkeiten: a) man verwendet durch Digoxigenin oder Biotin an der 5 '-Position markierte SKOs, gegen die ein anti-Digoxigenin oder ein anti- Biotin-Antikörper eingesetzt wird, der selbst goldmarkiert ist und mit herkömmlicher TEM nachweisbar ist; die Goldkorngrösse darf allerdings ca. 6 nm Durchmesser nicht überschreiten (ansonsten könnten sich die Goldkörner gegenseitig behindern) ; b) evtl. in Kombination mit a) kann das repetitive Zielplasmid durch Restriktionsendonuklease-Verdau neben der repetitiven SK-Region linearisiert werden, so dass nach Spreitung die Bindungsorte der SKOs sofort dadurch identifizierbar sind, dass sie am Ende eines fadenförmigen DNA-Moleküls liegen müssen. Da Restriktionsendonukleasen nur Doppelstrang-DNA schneiden, muss man dessen Schnittstelle allerdings zuerst durch Hybridisierung eines um die Schnittstelle herum komplementären Oligonukleotids doppelsträngig machen.
Die repetitiven Sequenzen sind dicht hintereinander angeordnet und erstrecken sich etwa über ein Drittel des Plasmids . Durch diese repetitiven Sequenzen erhöht sich die Signifikanz des Tests stark. Der Vorteil der oben beschriebenen Plasmide besteht darin, dass zwischen einem und 27 der Markereinheiten angehäuft werden können, um so die Zahl an Markereiementatomen zu modulieren. Gelingt es, die markierten SKOPHs in unterschiedlichen Spreitungszuständen von vollständig gestreckt bis geknäuelt im Spreitungspräparat darzustellen, können die Zielelementatome, besonders an geknäuelte DNA- Moleküle gebunden, i) auf engstem Raum konzentriert, ii) wegen der gleichmässig fibrillären Ringform der daran gebundenen DNA lokalisierbar, iii) in definierter, aber variabler Anzahl und iv) in ansonsten elementfreier Umgebung analysiert werden.
DNA-Abschnitte ausserhalb der Repetitionsbereiche, an die kein Marker binden kann, dienen als Negativkontrolle für die ESI- Elementdetektion. Eine solche Negativkontrolle ist notwendig, weil die Spezifität einer errechneten Zielelement-Verteilung angezweifelt werden könnte, wenn man keine Vergleichsregion ohne Zielelement und dementsprechend ohne errechnetes E 1 emen t s i gna 1 zeigen könnte. Da der Test ein molekularbiologisches System darstellt, erfolgt die Bewertung des Markers in seiner physikalisch-chemischen Umgebung. D.h. auch, dass der Test einer medizinisch/biologischen Anwendung, speziell der in situ-Hybridisierung, sehr nahe kommt.
Ziel des Testverfahrens ist es, zuverlässige Daten über die für eine ES I -Detekt ion notwendige Mindestzahl an Zielelementatomen pro Flächeneinheit zu erhalten. Gleichzeitig erhält man Daten über die Einzelerkennbarkeit der Markerstruktur, weil aufgrund der Repetition derselben eine Mittelung auch schwacher elementspezifischer Signale möglich ist, besonders an DNA-Molekülen, die vollständig ausgestreckt im elektronenmikroskopischen Präparat vorliegen. Somit lässt sich vor einem technisch aufwendigen Einsatz einer Markerstruktur in der Medizin oder Biologie bereits feststellen, ob gegebenenfalls die Zahl oder/und die Konzentration an Zielelementatomen in der Markerstruktur noch erhöht werden muss. E f ahr ung s g emä s s finden sich in Spreitungspräparaten alle Plasmidzustände von ausgestreckt bis stark geknäuelt, besonders wenn die Spreitung nicht optimal verlaufen ist. Dieser normalerweise unerwünschte Fall ist im Zusammenhang mit der erläuterten Bestimmung der Element- Detektionsgrenzen von Vorteil.
Spreitungsmethoden finden sich mit vielfältigen Variationen in der Literatur (für eine Zusammenfassung s.: Electron Microscopy in Molecular Biology; a practical approach, Sommerville, J. und Scheer, U. (eds.), IRL Press, 1987).
Mit den Standardverfahren der Elementdetektion mittels ESI lassen sich die Schwellenwerte für den elementspezifischen Nachweis ermitteln. Dazu existiert bisher kein anderes Verfahren. Es lässt sich deshalb vorstellen, dass dieses Verfahren auch für solche wissenschaftlich tätigen Personen von Interesse ist, die keine biologisch/medizinische Anwendung im Auge haben, sondern an den Nachweisgrenzen beliebiger anderer als der erwähnten chemischen Elemente interessiert sind. Voraussetzung ist, dass das Zielement bereits in der an das Oligonukleotid gekoppelten Markerstruktur so konzentriert wie möglich und in möglichst hoher Menge vorliegt.
Die Anwendung für ESI wurde vorstehend ausführlich beschrieben. Daneben sind auch Anwendungen von Teilen des Testsystems möglich, die über die Anwendung in der Elektronenmikroskopie hinausgehen. Zwei weitere Anwendungsbeispiele sind hier kurz erwähnt und werden weiter unten genauer beschrieben: 1) die SK-Primer-Repetitionskassette lässt sich mittels Hybridisierung markierter Oligonukleotide allgemein zur effizienten und lokalisierten DNA-Markierung nutzen; 2) zur Untersuchung der Mechanismen zur Deletion von direkten Repetitionen in DNA bilden die nachstehend beschriebenen Plasmide das ideale Substrat.
Über die Anwendung im Bereich der Elektronenmikroskopie hinaus, bieten, wie vorstehend bereits erwähnt, die genannten Repetitionsbereiche die Möglichkeit, DNA ganz allgemein auch mit solchen SKO- gekoppelten Markern nach Hybridisierung detektierbar zu machen, die als Einzelmoleküle noch unterhalb der Detektionsgrenze liegen, aber in repetitiver Anordnung nachweisbar werden. Dazu könnten die Repetitionsbereiche auch in die gewünschten DNA-Moleküle über Sac 1/ Kpn I-kompatible Enden umkloniert werden. Mit einem solchen Verfahren könnte beispielsweise der Weg von DNA nach Einführung in eine Zelle (Transfektion) verfolgt werden. Dabei kommen sowohl licht- als auch elektronenmikroskopische Anwendungen in Frage.
Die chemische Modifizierbarkeit der hybrisierenden Sequenz erlaubt variable Einsatzmöglichkeiten des Tests für unterschiedlich konfigurierte Markereinheiten. Da der Test ein molekularbiologisches System darstellt, erfolgt die Bewertung des Markers in seiner physikalisch-chemischen Umgebung. Getestet wird die Einzelerkennbarkeit des Markers. Die Stärke schwacher Signale kann durch Mitteilung genau bestimmt werden.
Die folgenden Ausführungen zur Herstellung der unterschiedliche Repetitionen enthaltenden Plasmide zeigen, dass für die Versuche zur eigentlichen Elementdetektion für ESI prinzipiell die Repetitionsstufen (pBluescript KS ( + ) ) , 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 14x, 21x sowie 27x SK zur Verfügung stehen. Da die Analyse von Unterschieden zur Detektierbarkeit des Zielelements mit ESI besonders überzeugend ausfallen wird, wenn die Zahl an analysierten Elementatomen stark schwankt (s. dazu Ausführungen unten) , sind die Repetitionsgrade 2x, 7x, 21x und 27x SK von besonderem Interesse. Wie bereits erwähnt, basiert die vorliegende Erfindung darauf, daß in einem Testpräparat Bereiche vorhanden sind, in denen das Zielelement in einer klar definierten Menge vorhanden und eindeutig zu erkennen ist; in allen übrigen Bereichen darf das Zielelement nicht auftreten.
Die Plasmidkonstruktion wird durch Einschleusung in einen dam" /dem" -Stamm (vorzugsweise E. coli JM 110) stabilisiert. JM110 ist dam' I dem' und enthält ansonsten keine auffälligen genotypischen Marker, die diesen Stamm von den anderen verwendeten deutlich unterscheiden würden, so daß auch diese verwendet werden können. Die E i ns ch 1 eu s ung der erfindungsgemäßen repetitiven Plasmide in den dam"/darf -Stamm erfolgt gemäß Standardmethoden (vgl. Sambrook, J., Fritsch, E.F. undManiatis, T. : Molecular cloning; A laboratory manual ; Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Überraschenderweise wird dadurch eine Deletion der direkt repetitiven Elemente während der Bakterienvermehrung vermieden. Es ist nämlich eigentlich bekannt, daß direct repeats oder inverted repeats während der Vermehrung in E . coli verloren gehen, dam-/dem -Stämme sind in der Literatur dokumentiert (vgl. Marinus et al . , J. Bacteriol . 114 (3), 1143-1150 (1973)), eine Stabilisierung direkt-repetitiver Sequenzen dadurch wurde jedoch noch nie beschrieben.
In E. coli JM110 konnte der Repetitionsgrad sogar auf 27x gesteigert werden. Darüberhinaus ist die Kombination von E. coli JMllO/pBl KS (+) 27xSK erstmalig ein System, in dem eine ansonsten in E. coli instabile direkte Repetitionssequenz vermehrt werden kann. Für Bakteriengenetiker eröffnet sich die Möglichkeit, die zugrunde liegenden Mechanismen dieses Typs von Deletionen in Bakterien zu analysieren und die beteiligten Komponenten zu charakterisieren. Die Frage der Stabilisierung von Repetitionen eines solchen Typs in E . col i ist beispielsweise für Klonierungsspezialisten von Interesse, die menschliche DNA-Abschnitte in ihrem Ursprungszustand erhalten wollen, auch wenn diese in E. coli vermehrt worden waren
(siehe z. B. Human Genome Project) . Der Hintergrund ist der, dass auch in menschlichen DNA-Abschnitten kurze, direkt- repetitive Abschnitte vorkommen, die vergleichbar schlecht stabilisierbar sein können wie die oben geschilderte SK- Primersequenz-Repetition.
Die erfindungsgemäßen Plasmide können zu Testkits zur Verwendung in der Elektronenmikroskopie zusammengestellt werden. Ein Testkit enthält z.B. folgende Materialien: 1) kompetente E. coli JMllO-Bakterienzellen zur Vermehrung der repetitiven Plasmide; 2) die einzelsträngigen Plasmide lx oder 2x, 7x, 14x, 21x und 27x SK zur differentiellen Analyse von Markerstrukturen für das Elektronenmikroskop; 3) elektronenmikroskopische Trägernetzchen, die für die Spreitung bereits beschichtet sind; 4) durch Biotinylierung oder Digoxygenierung am 5 ' -Ende markierte SK-Oligonukleotide, die dazu dienen, die Hybridisierung und Spreitung zu optimieren, indem man mit einem goldgekoppelten anti-Biotin- bzw. anti- Digoxigenin- Antikörper nachweist, dass die repetitive Anordnung am Plasmid tatsächlich vorliegt; 5) eine Vorschrift, die die einzelnen Arbeitsschritte beschreibt. Falls ein Interesse an anderen als den ESI-abhängigen Anwendungen bestehen sollte, kann für solche Interessenten der Testkit modifiziert werden.
Die Plasmide mit 2, 7, 14, 21 und 27 SK-Primersequenzelementen wurden als E . coli-Kulturen am 22. Dezember 1998 bei der DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ,
Mascheroder Weg 1, Braunschweig unter den Hinterlegungsnummern
DSM 12600, DSM 12601, DSM 12602, DSM 12603 und DSM 12604 hinterlegt :
pBI KS(+)2xSK DSM 12600 pBI KS(+)7xSK DSM 12601 pBI KS(+)14xSK DSM 12602 pBI KS(+)21xSK DSM 12603 pBI KS(+)27xSK DSM 12604
Die folgenden Figuren erläutern die Erfindung näher. Figur 1: Überblick über die Herstellung von pBI KS(+) 2x SK.
Die hier gewählte Art der Darstellung wird in den folgenden Abbildungen dieses Typs fortgeführt. Die Multiple Klonierungstelle (MCS) ist als dunkelgrauer Block dargestellt, die darin enthaltene SK-Primer-Sequenz ist hellgrau unterlegt. Die Schnittstellen sind mit einer fein unterbrochenen Linie gekennzeichnet. Die detaillierte Sequenz ist von den für die Klonierung wichtigen Abschnitten angegeben. a) Schematische Darstellung von pBI KS ( + ) . Für die nachfolgende Klonierung wurde pBl KS(+) mit den
Restriktionsenzymen Kpn I und BamH I verdaut. Die Restriktionsschnittstellen sind mit einer fein unterbrochenen Linie gekennzeichnet. Das dazwischenliegende MCS-Fragment fällt heraus. b) Schematische Darstellung des mit BamH I und Kpn I verdauten pBl KS(+) und dem SK-PH I-Fragment, das durch Ligation mit pBl KS(+) zu pBl KS(+) 2x SK führen sollte. Durch den Verdau mit Kpn I und BamH I wurde ein Teil des MCS herausgetrennt (s. auch a) , im Gegenzug wurde das Fragment SK-PH I insertiert. Durch SK-PH I wurde die zuvor vorhandene Bam H I-Schnittstelle mittels Modifizierung eines Basenpaars (fette Buchstaben) maskiert und gleichzeitig eine neue BamH I-Schnittstelle eingeführt. Wegen der unterschiedlichen Schnittstellen (Kpn I/BamH I) kann das Fragment nur in einer möglichen Orientierung kloniert werden. Die Schnittstelle Pvu I diente als
Kontrollschnittstelle für den erfolgreichen Einbau des
Inserts SK-PH I (keine weiteren Daten dazu gezeigt) . c) Schematische Darstellung von pBl KS( +) 2x SK. pBl KS(+) 2x SK entstand durch die Ligation von SK-PH I mit dem
BamH I /Kpn I verdauten pBl KS(+) (vgl. b).Die mit Stern gekennzeichnete, modifizierte BamH I-Schnittstelle liess sich mit BamH I nicht mehr schneiden. Zur Vereinfachung im folgenden Text wird die in der Abbildung gekennzeichnete Region (SK-Primer + nicht zu hybridisierende Sequenz) mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Daraus ergibt sich die Schemazeichnung für pBl KS(+) 2x SK wie unter d) gezeigt, d) Vereinfachte Darstellung von pBl KS(+) 2x S . Durchgezogene schwarze Linie steht für das MCS, die unterbrochene Linie für den verbleibenden Vektor pBl KS(+). Die schwarzen Pfeile zeigen die 5'—> 3' Richtung der klonierten SK-Primer zuzüglich 4 bp nicht zu hybridisierende Sequenz an (vgl. c) .
Figur 2: Vereinfachte schematische Darstellung von pBl KS(+) 7x SK.
Der Vektor pBl ist durch eine unterbrochene, schwarze Linie gekennzeichnet; in seiner Kpn I /Sac I orientierten MCS sind jetzt sieben SK-Primersequenzen enthalten. Das SK-PH II- Fragment (gestrichelter Pfeil oben und durch Linien hervorgehobene Sequenz "SK-PH II" unten) fügte den siebten SK- Primer und die zusätzliche Eag I-Schnittstelle in den Vektor ein. Die wichtigen Sequenzen sind detailliert herausgehoben. Die SK-Primer-Sequenz ist hellgrau unterlegt, das restliche MCS und der 4-Basen-Spacer dunkelgrau. Die Schnittstellen sind in der Sequenz mit fein unterbrochenen, schwarzen Linie gekennzeichnet .
Figur 3: Schematische Darstellung der Klonierung eines pBl2x Block-Plas ids a) Insertion eines 7x SK-Blocks in die Not I-geöffnete pBl lx Block-DNA. Die Kennzeichnung der einzelnen Komponenten ist identisch mit denen unter Fig. 1 bzw. Fig. 2. Der Klon pBl lx Block wurde mit dem Enzym Not I linearisiert und mit dem, zuvor mit Ea g I nachgeschnittenen, PCR-Fragment ligiert. Zur Vereinfachung im weiteren Text werden die sieben SK-Fragmente zu einem grauen Pfeil zusammengefaßt, b) Darstellung der Übergänge zwischen einzelnen Blöcken. Die Kennzeichnung der Komponenten ist vergleichbar mit der in Fig. l.a-d. Durch die Ligation des 7x SK-Block (grauer
Pfeil) in der richtigen Orientierung wurde die Not I- Schnittstelle, die zuvor pBl lx Block öffnete, durch das 5 ' -Ende des neu hinzugekommenen 7x SK-Blocks maskiert (fette Buchstaben) und durch Not I nicht mehr schneidbar. Das 3 ' -Ende des Fragments komplettiert die Not I- Schnittstelle in Richtung Vektor. Dadurch wird es in der nächsten Klonierungsrunde möglich, pBl 2x Block wieder mit Not I zu linearisieren, ohne Verlust der 14 SK-
Primer. Die BamH I-Schnittstelle am 5 ' -Ende eines 7x Blocks bleibt, im Gegensatz zu der BamH I- Schnittstelle zwischen den einzelnen SK-Primern im Block (BamH I*), erhalten (BamH I) und kann später als Orientierungskontrolle eingesetzt werden.
Figur 4: Sequenzierungsergebnis des 27 SK-Primerelements enthaltenden Plas idkonstrukts
Schwarze Balken markieren die SK-Primersequenzbereiche in der von beiden Seiten sequenzierten repetitiven Region. Zwischen diesen S K - P r i m e r s e qu e n z b e r e i c h e n liegen aus klonierungstechnischen Gründen die 4 Basenpaare langen Abfolgen ATCT oder GCCG.
Figur 5: Schema des Markierungsexperiments
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung näher.
Beispiel
Die nachstehend dargestellten Verfahren zur Herstellung der Repetitionen enthaltenden Plasmide sind in Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual ; second edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und in Current Protocols in Molecular
Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) beschrieben, wobei die nachfolgenden Techniken, wie DNA- Ve rmehrung Restriktionsendonukleasenverdau , Ligation, Agarosegelelektrophorese, PCR dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.
Für die Repetition wurde das SK-Primer-Element von pBluescript (Fa. Stratagene, Heidelberg) ausgewählt, weil es keine selbstkomplementären oder homooligomeren Bereiche enthält, mit einem G/C-Gehalt von 50% im Durchschnittsbereich natürlicher DNA liegt und klonierungstechnisch zur annähernd lückenlosen Herstellung direkt repetitiver Bereiche günstig ist. Ausserdem ist von Vorteil, daß diese Region mit einem komplementären Sequenzierprimer (mit dem hier beschriebenen SK-Primer identisch) zuverlässig und stabil hybridisiert, da sie von der Firma Stratagene (Heidelberg) als Sequenzierprimer-Bindestelle konzipiert worden ist.
Zum Zweck der Konstruktion von SK-Primersequenzelementen in repetitiver Folge wird ein kurzes Oligonucleotid-Fragment benötigt, in dem die SK-Primersequenz sowie Schnittstellen zur Durchführung der Klonierungen enthalten sind. Hierfür wurden zueinander komplementäre Oligonukleotide synthetisiert. Diese ss-DNA-Fragmente wurden durch Hybridisierung zu klonierbaren ds-Fragmenten umgewandelt, indem die beiden komplementären Oligonukleotide äquimolar in 10 mM Tris-Puffer aneinandergelagert werden. Die Erfolgskontrolle stellt die gelungene Klonierung dar. Die so entstandenen Fragmente wurden SK-PH I (SK-Primer-Hybrid I; Fragment, das für die SK- Primervermehrung von 2-6 SK-Primersequenzen genutzt wurde, vgl. Abb.l) und SK-PH II (SK-Primer-Hybrid II; Fragment, das den siebten SK-Primer und die Eag I-Schnittstelle einführte, vgl . Abb.2 ) genannt .
Für die Herstellung des Plasmids pBl KS(+) (pBluescript KS(+)) mit zwei SK-Primern (pBl KS(+) 2x SK) mußte pBl KS(+ ) mit BamH I und -FCp-n I geöffnet werden, wobei ein Teil der multiplen Klonierungsstelle MCS entfernt wurde (Abb.l a). Der vollständige Doppelverdau wurde auf einem 2%-Agarosegel nachgewiesen. Es folgte eine Ethanolfällung. Das Insert SK- PH I (Abb.lb) wurde in einem 10 fachen Überschuß zum geöffneten Vektor zur Ligation gegeben (s. Abb.l b) . Diesen hohen Überschuß konnte man deshalb verantworten, da die 5'- Enden des Fragments nicht phosphoryliert waren, also keine Oligomere der Inserts entstehen konnten. Mit diesem Ligationsansatz wurde die Transformation in E. coli, z.B. XLl- Blue durchgeführt. Von den gewachsenen Kolonien wurde zur Klonierungskontrolle aus drei Klonen die Plasmid-DNA durch Mini-Präparation isoliert. Die so gewonnenen Klone werden nachfolgend pBl KS(+) 2x SK (Abb.l.c) genannt.
Die weitere Klonierung von Plasmiden mit bis zu sieben in gleicher Orientierung enthaltenen SK-Elememten war zeitaufwendig, da jeweils ein Klon aus der letzten Klonierungsrunde als Grundlage für die nächste Klonierung diente. Dementsprechend wurde die Midi-Präp-DNA des ausgewählten pBl 2x SK-Klons wiederum BamH 11 ' Kpn I doppelverdaut und mit SK-PH I versetzt, ligiert und in E. coli XLl-Blue transformiert. Abweichend von der für die Klonierung von pBl 2x SK benutzten Strategie mußte nun in besonderem Maß auf einen effizienten Doppelverdau mit BamH I und Kpn I geachtet werden. Wie Abb.l.c zeigt, lagen die Schnittstellen, in die ein weiteres SK-PH I-Fragment integriert werden sollte, nämlich nur sechs Basenpaare voneinander entfernt. Ein derartig geringer Abstand zweier Restriktionsschnittstellen läßt die gleichzeitige Restriktion beider Schnittstellen nicht zu. Es mußte dementsprechend nacheinander mit beiden Enzymen geschnitten werden. In dieser Weise wurden die Klonierungen bis zum Plasmid pBl KS(+) 6x SK durchgeführt.
Nach der Klonierung der siebten SK-Primersequenz erfolgte die Vermehrung der repetitiven Elemente blockweise. Dies konnte nur funktionieren, wenn es eine Schnittstelle gab, die den Bereich mit sieben SK-Primern als Einheit vom Vektor trennte. Durch die Ligation des SK-PH II (Abb. 2) in pBl 6x SK wurde dies ermöglicht. SK-PH II brachte neben dem siebten SK-Element die neue Schnittstelle Eag I in den Vektor ein. Jetzt wurden die sieben SK-Primer von zwei Eag I-Schnittstellen begrenzt (Abb.2) weil der Ausgangsvektor pBl KS(+) bereits eine solche Schnittstelle im MCS mitbrachte. Zur Beschleunigung der weiteren Klonierungsschritte erfolgte die blockweise Vermehrung der SK-Elemente mittels der Polymerase Chain Reaction (PCR) . Als Template-DNA für die Amplifizierung des Fragments mit sieben repetitiven Elemente wurde die Plasmid-Präparation aus XLl-Blue genommen, die direkt aus der Originalkolonie abstammte (pBl 7x SK) . Bei der ersten Optimierung der PCR sollte herausgefunden werden, welches Primerpaar das Zielfragment mit der besten Qualität und Quantität amplifizierte . Es wurden die Primer M13, Ml3 reverse, T3 und T7 (M13 : TGTAAAACGACGGCCAG ; M13 reverse:: CAGGAAACAGCTATGACC ; T3 : AATTAACCCTCACTAAAGGG; T7 : TAATACGACT- CACTATAGGG) in verschiedenen Kombinationen miteinander ausgetestet. Alle diese Primer hatten ihre Bindungsstellen außerhalb der MCS, entweder nahe des ß-Galaktosidase Startpunkts oder nahe der T7-Transkriptions-Startstelle in pBluescript KS (+) . Die PCR fand unter Standardbedingungen statt. Die verschiedenen Ansätze enthielten die zueinander passenden Primer in den verschiedenen möglichen Kombinationen: M13/M13 reverse, T7/T3, T7/M13 reverse und T3/M13. In der Negativkontrolle waren alle vier Primer ohne das Template vereinigt. Da der PCR-Ansatz mit T3/T7 die besten Ergebnisse lieferte, wurde dieses Primerpaar für die PCR gewählt.
Um das mittels PCR gewonnene Insertfragment in den mit Notl geöffneten Vektor ligieren zu können, mußte es "sticky ends" besitzen, die mit Not I kompatibel waren. Hierfür mußte das
PCR-Fragment, das die sieben SK-Primer enthielt, an den
Rändern nachgeschnitten werden. Das Restriktionsenzym Eag I verkürzte das 246 bp lange PCR Fragment, dessen Ränder die Sequenzen der Primer T3/T7 abschlössen, um 47 und um 51 bp auf der anderen Seite. Mit einem 2,2 %igen Gel konnte dieser
Unterschied zur Kontrolle noch sichtbar gemacht werden. Mit dem durch die PCR amplifizierten 7x SK-Fragment, dessen Ränder durch den -Eag I-Verdau zu Not I kompatibel wurden, wurde pBl KS(+) 7x SK in nur einem Schritt zu pBl KS(+) 14x SK. Für einen Überblick der Klonierungsweise siehe Abb.3. Das verdaute
Fragment wurde vor der Ligation durch den PCR-Purification Kit (Fa. Qiagen) gereinigt. Dies sollte die nicht in der PCR- Reaktion verbrauchten Primer und die durch den Verdau entstandenen Bruchstücke entfernen.
Gegenüber den ersten Klonierungsschritten, die zu pBl KS(+) 7x SK führten, wurde der Vektor nicht mit zwei verschiedenen Enzymen (Kpn I/BamH I vgl. Abb 1) geöffnet sondern mit Not I linearisiert . Deshalb mußte mit einer Häufung an Religationen gerechnet werden. Bei dieser Klonierung konnte einer Religation nicht durch eine vielfach erhöhte Insertkonzentration (7x SK-Fragment) entgegengewirkt werden, da die DNA-Blöcke an den 5 ' -Enden phosphoryliert waren und mit unkontrollierbaren Oligomerisierungen der Insert-DNA zu rechnen war. Die Religationen wurden deshalb durch eine Dephosphorylierung des Vektors reduziert oder sogar verhindert. Im Verlauf der weiteren Ausführungen wird die bisher pBlKS(+)7xSK genannte DNA als pBl lxBlock bezeichnet.
Der mit Not I geöffnete pBl lx Block wurde mit dem gereinigten PCR-Fragment ligiert, das ebenfalls sieben SK-Primer enthielt. Dies wurde durch die am Rand der repetitiven Elemente befindlichen einzigen Not I-Schnittstelle möglich, durch die der pBl lx Block linearisiert wurde. Das PCR-Fragment wurde, wie oben erwähnt, mit dem zu Not I kompatiblen Enzym Eag I nachgeschnitten und direkt an die sieben SK-Primer des Vektors ligiert (pBI 2x Block) .
Da sich pBl 7x SK im Wirtsstamm JM110 als stabil erwies, wurde auch der Ligationsansatz des Plasmids mit 14 SK-Elementen in diesen Stamm transformiert. Die Transformation von pBl KS(+) 14x SK in JM110 brachte 118 Transformanten hervor. Dies entsprach einer Transformationsrate von l,7xl03 cfu (colony forming units)/μg DNA.
Es wurde weiter mit schrittweiser Vermehrung gearbeitet, in 20 diesem Fall mit dem Ziel, mit den 7x SK-Blöcken ein Plasmid mit 28 repetitiven SK-Primersequenzen aufzubauen. Hierfür wurde, analog wie in Abb. 3 gezeigt, pBl 2x Block mit iVot I linearisiert. Der vollständige Verdau wurde auf einem 1 %igen Agarosegel überprüft. Die 5 ' -Enden dieses mit iVot I geöffneten Plasmids wurden dephosphoryliert und mit dem 7x SK- Block ligiert. Aus der Transformation resultierten sieben Kolonien.
Der Kontrollverdau mit BamH I mehrerer Kandidaten-Klone ergab, daß ein kompletter 7x SK-Block zusätzlich insertiert worden war. Einer der Klone wurde für eine Midi-Präparation vermehrt und die DNA präpariert. Die Sequenzanalyse aus dieser Midi-Präparation bewies die komplette und korrekte Sequenz von 21 SK-Primern mit den funktionsfähigen Schnittstellen, die für die nächste Klonierung benötigt wurden. Die Gelanalysen wurden dabei bestätigt. Dieser Klon wird im folgenden Text mit pBl 3x Block bezeichnet. Er diente als Vorstufe für die nächste Insertionsrunde.
Um zu einem Plasmid mit 28 repetitiven SK-Elementen zu gelangen, wurde die blockweise Vermehrung des 7x SK-Blocks fortgeführt. Als Ausgangsplasmid dieser Klonierung wurde pBl 3x Block eingesetzt. Diese Klonierung wurde wie die beiden vorangegangenen behandelt. pBl 3x Block wurde mit iVot I linearisiert, auf vollständigen Verdau in einem 1 %igen Agarosegel überprüft und danach dephosphoryliert. Der dephosphorylierte Vektor wurde zusammen mit dem in der PCR amplifizierten und nachgeschnittenen 7x SK- Block in einen Ligationsansatz eingesetzt. Die Kontrolligation zur Beurteilung der Dephosphorylierung erbrachte 2 Klone. Bei der Transformation der Ligation mit Insert entwickelten sich 59 Klone, davon wurden 16 Kolonien für eine Mini-Präparation ausgewählt. Die Auftrennung mit einem Agarosegel nach einem Sac I/Kpn I-Verdau erfolgte wie gewöhnlich auf einer 2,2 %igen Gelmatrix.
Insgesamt 5 Klone wiesen verlängerte Insertbereiche auf. Kontrollverdaus mit BamH I sowie Dreifachverdaus mit Sac I/Kpn I/BamH I zeigten Fragmentemuster, die darauf hindeuteten, dass kein kompletter 7x SK-block hinzugekommen sein dürfte. Stattdessen musste bei der Klonierung eine BamHI-site im neu hinzugekommenen Block deletiert worden sein.
Von den fünf sich gleichenden Klonen wurde einer ausgewählt und mit seiner midi-präparierten DNA eine Sequenzanalyse durchgeführt. Die Sequenzierung bestätigte das Ergebnis, daß die neu dazugekommene BamH I-Schnittstelle deletiert war. Es fehlte der komplette SK-Primer mit intakter BaHI- Schnittstelle des zuletzt hinzugekommenen 7x SK-Blocks. Das Ergebnis war also ein pBl KS(+) Plasmid mit 27x SK Primern. Die Sequenz dieses Klons ist in Figur 4 gezeigt.

Claims

Patentansprüche
1) Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von pBluescript KS(+) ableitet und mehr als 1 repetitives SK-Primersequenzelement enthält.
2) Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 2, 7, 14, 21 oder 27 repetitive SK-
Primersequenzelemente enthält.
3) Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Primerse uenzelemente einen Markerkomplex tragen.
4) Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das SK-Primersequenzelement folgende Sequenz umfaßt : 5 ' -GATCCACTAGTTCTAGAGCG-3 '
5) Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß daran SK-Oligonukleotide gebunden werden können, die an ihren Enden durch ein im Elektronenmikroskop detektierbares Element modifiziert sind.
6) Plasmid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente ausgewählt sind aus Bor, Silizium, Eisen oder Mangan.
7 ) Verwendung eines Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in der analytischen Elektronenmikroskopie.
8) E. coli Zellen, transformiert mit einem Plasmid nach einem der Anprüche 1 bis 6.
9) E. coli Zellen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um E. coli JMllO handelt.
10) Testkit zur Verwendung in der Elektronenmikroskopie, umfassend mindestens die folgenden Komponenten: kompetente E. coli JMllO-Bakterienzellen zur Vermehrung eines Plasmides nach einem der Ansprüche 1 bis 5, - einzelsträngige Plasmide umfassend 2x, 7x, 14x, 21x und 27x SK.
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