EP1051436B1 - Nouveaux copolymeres tensioactifs a base de methylidene malonate - Google Patents

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EP1051436B1
EP1051436B1 EP99901660A EP99901660A EP1051436B1 EP 1051436 B1 EP1051436 B1 EP 1051436B1 EP 99901660 A EP99901660 A EP 99901660A EP 99901660 A EP99901660 A EP 99901660A EP 1051436 B1 EP1051436 B1 EP 1051436B1
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EP
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copolymers
poly
copolymers according
sequence
copolymer
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EP99901660A
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Nicole Bru-Magniez
Virginie Larras
Gérard Riess
Pascal Breton
Patrick Couvreur
Claude Roques-Carmes
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Virsol SNC
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    • C09K23/34—Higher-molecular-weight carboxylic acid esters
    • C09K23/36—Esters of polycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention generally relates to a new family of biocompatible surfactant copolymers with a wide spectrum of uses, especially in the pharmaceutical field and for the synthesis of materials to the dispersed state as well as the surface treatment of materials or biomaterials.
  • a more particular subject of the invention is copolymers biocompatible surfactants comprising one or more sequences of character hydrophobic mainly consisting of recurring units or not meeting the general formula defined below, forming in particular a poly (methylidene malonate).
  • Surfactant copolymers formed from one or more have been known for a long time. several sequences having a hydrophilic character and one or more sequences having a hydrophobic character.
  • products consisting of polyoxyethylene blocks with hydrophilic character and of polyoxypropylene sequences having hydrophobic character and marketed under the name PLURONIC® are commonly used for the preparation of compositions for cosmetic or pharmaceutical use.
  • WO-A-9625954 generally describes the use of poly (methylidenemalonate) for the preparation of microcapsules containing a gases, intended for ultrasound diagnosis.
  • the copolymers in accordance with the invention are susceptible to degrade chemically or biochemically by cutting the substituents lateral constituting the hydrophobic sequences and this bioerosion is advantageously accompanied by the passage of a copolymer having the characteristics of a surfactant to a fully hydrophilic copolymer likewise degree of polymerization as the starting polymer.
  • copolymers in accordance with the present invention have very numerous advantages over the surfactant copolymers known to date, which result from the particular chemical structure of their character sequences hydrophobic.
  • copolymers in accordance with the present invention have, according to the chemical structure of their hydrophobic sequences, kinetics of varied degradation and therefore suitable for a wide spectrum of applications.
  • the aforementioned hydrophobic sequence will be formed of a homopolymer consisting of repeating units corresponding to formula (I) such as defined above.
  • this hydrophobic sequence can also be formed from a random copolymer made up of units different recurrences corresponding to formula (I) as defined above or else of a statistical copolymer mainly consisting of units corresponding to formula (I) as defined above, that is to say constituted for at least 50%, expressed in molar proportion, of such units, the others units which can be formed from acrylic, vinyl, malonic monomers copolymerizable with the methylidene malonate units of formula (I).
  • the above-mentioned hydrophobic character sequence is formed of a homopolymer consisting of repeating units corresponding to the formula:
  • the hydrophilic sequence of biocompatible copolymers in accordance with the present invention is chosen from poly (oxyethylene), poly (vinyl alcohol), poly (vinylpyrrolidone), poly (N-2 hydroxypropyl methacrylamide), a poly (hydroxyethyl methacrylate), a hydrophilic poly (amino acid) such as a polylysine, a polysaccharide, and will be preferably made of poly (oxyethylene).
  • copolymers in accordance with the present invention may exhibit various structures, with blocks, preferably di-blocks or tri-blocks, or grafted.
  • copolymers according to the present invention can be prepared by conventional polymerization techniques well known to those skilled in the art job.
  • the anionic polymerization is more particularly suitable for the preparation of block copolymers.
  • the anionic polymerization will generally be carried out in a solvent compatible with the various blocks of the copolymer.
  • the block copolymers according to the invention will be preferably prepared by successive anionic polymerization of the oxide ethylene followed by methylidene malonate or by activation of a precursor commercial polyoxyethylenated monohydroxylate and anionic polymerization subsequent to the poly (methylidene malonate) sequence.
  • tetrahydrofuran will preferably be used as polymerization solvent, this product making it possible to work in a homogeneous medium and favorably influencing the polymerization kinetics.
  • the methylidene malonate can be prepared for example by following the process described in patent EP 283364 corresponding to patents US 4,931,584 and US 5,142,098, and will generally be degassed under a vane vacuum to constant weight to remove the polymerization inhibitor (SO 2 ).
  • the monomers used for the preparation of the hydrophilic blocks will generally be commercial products.
  • the coupling technique is also more particularly suitable for preparation of block copolymers.
  • This reaction is generally carried out using homopolymers presynthesized and functionalized, in the presence of a coupling agent and optionally an activating agent, in a suitable solvent.
  • the homopolymer of poly (oxyethylene) functionalized by an ⁇ -carboxy group can be obtained for example by transformation with anhydride succinic of a poly (oxyethylene) functionalized by an ⁇ -hydroxy group commercial.
  • the homopolymer of poly (methylidene malonate) functionalized with a ⁇ -hydroxy group can be obtained directly by anionic synthesis in aqueous medium or by anionic synthesis in a solvent using a solution aqueous sodium hydroxide as initiator of the polymerization.
  • DCCI dicyclohexylcarbodiimide
  • the coupling reaction can optionally be activated by catalysis basic and will generally take place in a solvent compatible with homopolymers, such as dichloromethane in the particular case preferred copolymers of the invention.
  • the radical polymerization is more particularly suitable for the preparation of graft copolymers.
  • This polymerization is generally carried out from a macromonomer, i.e. an oligomer carrying at one of its ends a ethylenic group which can be polymerized by a radical route and is capable of reacting with a monomer to form a graft structure copolymer.
  • a macromonomer i.e. an oligomer carrying at one of its ends a ethylenic group which can be polymerized by a radical route and is capable of reacting with a monomer to form a graft structure copolymer.
  • This polymerization will generally be carried out in the presence of an initiator in a suitable solvent.
  • a macromonomer of poly (oxyethylene) functionalized by a methacryloyl group It is more particularly preferable to use a macromonomer of poly (oxyethylene) functionalized by a methacryloyl group.
  • Such a product can be commercial (Aldrich) and will be constituted for example a poly (oxyethylene) chain with a molar mass between 308 and 440 g / mol, or will be prepared from a poly (ethylene glycol) monomethyl ether commercial by coupling with methacrylic acid in dichloromethane for form a methoxy terminal function.
  • copolymers with grafted structures according to the invention can also be prepared by transesterification of a poly (oxyethylene) monomethyl ether on side chains esters of a poly (methylidene malonate) pre-synthesized.
  • This transesterification will generally be carried out with alcohol in presence of a catalyst at high temperature.
  • copolymers in accordance with the present invention have a wide spectrum of applications as surfactants.
  • copolymers make it possible in particular to reduce the surface tension water and the interfacial tension of an immiscible organic water-solvent system at the water.
  • copolymers also make it possible to prepare micellar systems in aqueous medium, in particular useful as vectors of active principles.
  • copolymers also make it possible to prepare or stabilize simple water-in-oil or oil-in-water emulsions.
  • copolymers also make it possible to encapsulate active substances various, in particular substances for therapeutic use.
  • copolymers in accordance with the present invention also find application as protective colloids for the preparation or stabilization of nanoparticles.
  • these particles will be particularly useful when these particles are made from of polymers having repeating units identical to those of their hydrophobic sequences, which facilitates as we understand, the anchoring of the copolymer on the surface of these particles while giving them a biocompatible and hydrophilic character due to the presence in said copolymer at least one biocompatible hydrophilic sequence.
  • copolymers in accordance with the invention can also be used as surface treatment agents for materials or biomaterials in particular for imparting a hydrophilic character to the surfaces treated by anchoring of said copolymers or to minimize interfacial adhesion with fabrics animals, cells or biomolecules, when these materials or biomaterials are likely to come into contact with said cells or biomolecules.
  • copolymers in accordance with the present invention can also be used for the manufacture of particles capable of being used as agents of contrast.
  • copolymers in accordance with the present invention can also be used as biocompatible materials, for example in the form of films or molded parts, as well as for the surface treatment of implant structures and to minimize or promote interfacial adsorption mechanisms.
  • Example 1 Preparation of a block copolymer according to the invention by anionic way
  • a 2.1.2 POE-PMM block copolymer was obtained by polymerization successive of the two monomers, starting with the preparation of the POE block, by implementing the following experimental protocol.
  • the reactor in which the polymerization is carried out (250 ml) is connected to a vacuum ramp allowing to work under high vacuum and to get rid of protic impurities.
  • the solvent (THF, 150 ml) purified of any trace of moisture is cryodistilled in the reactor at -70 ° C.
  • the initiator (potassium Terbutanolate (0.1N / THF); 10 ml) is then added using a syringe through a septum.
  • the ethylene oxide (5 g) is then introduced by cryodistillation.
  • the polymerization is carried out at room temperature for 48 hours. After this period, a sample makes it possible to control, by chromatography by gel permeation, molar mass (4,000 g / mol) and polymolecularity index (1.13) of the first sequence.
  • MM 2.1.2 (0.5 ml) freshly degassed under vacuum to remove the SO 2 used as a polymerization inhibitor, is then added quickly and all at once at room temperature.
  • the copolymer is deactivated by adding methanol and precipitated in diethyl ether.
  • Example 2 Preparation of block copolymers according to the invention by anionic way
  • the experimental protocol is the same as that described for Example 1.
  • the addition of the second sequence at room temperature leads to a copolymer with a final molar mass of 5,900 g / mol (for 2 ml of monomer added) and 9,300 g / mol (for 3.2 ml of added monomer), i.e. having incorporated respectively 10 and 25 MM 2.1.2 patterns, which corresponds to a total molar mass for PMM 2.1.2 of 2.300 and 5.750 g / mol respectively.
  • the thermal analysis of the copolymer makes it possible to highlight the glass transition temperature of the copolymer which is respectively -18 ° C. for the first copolymer and 6 ° C for the second copolymer, as well as the peak melting at respective temperatures of 33 ° C and 39 ° C ( ⁇ H of 53 and 63 J / g).
  • Example 2A Preparation of a block copolymer according to the invention by anionic way
  • the experimental protocol is the same as that described for examples 1 and 2.
  • the second monomer previously diluted in a few ml of THF anhydrous, is then quickly added to the alcoholate at room temperature and leads to a copolymer incorporating 5 MM 2.3.2 units corresponding to a molar mass for PMM 2.3.2 of 1.290 g / mol.
  • Example 2B Preparation of block copolymers according to the invention by anionic way
  • the experimental protocol is the same as that described for Example 2A.
  • the copolymer is precipitated from diethyl ether.
  • NMR and GPC analyzes indicate a respective mass percentage of 7% for MM 2.1.2 (4 patterns) and 13% for MM 2.3.2 (7 patterns).
  • Example 3 Preparation of a block copolymer according to the invention by anionic way
  • a POE-PMM 2.1.2 copolymer was obtained by priming a preformed POE precursor of determined length, then by reaction of the alcoholate obtained on methylidene malonate, by implementing the following protocol:
  • PEG monomethyl ether ALDRICH Mn 2,000 g / mol: 1.2 g
  • the temperature is then gradually increased to 20 ° C to allow solubilization of the polymer.
  • organometallic derivative (Diphenylhexyllithium (0.056 M in THF): 10.7 ml) is then added dropwise via a septum in the reactor.
  • the solution discolors almost instantly and after addition, the solution is pale yellow and attests to the presence of alcoholate anions.
  • the MM 2.1.2 (3.7 g) freshly degassed under vacuum and diluted in 10 ml of anhydrous THF is quickly added to the reactor ambient temperature. The medium discolours in a few seconds.
  • the copolymer is terminated by adding 5 ml of methanol.
  • the reaction medium is concentrated then the polymer is recovered after precipitation in ether, washing with ether and drying under vacuum.
  • Example 3A Preparation of a block copolymer according to the invention anionically
  • a PMM 2.1.2-POE-PMM 2.1.2 triblock copolymer was obtained by re-initiation of a dihydroxy POE precursor of predetermined molar mass, then by reaction of the dialcoholate obtained with methylidene malonate, by putting using a protocol similar to that of Example 3.
  • organolithium added allows metallation of the two ends hydroxylated POE and therefore the initiation and then the polymerization of the sequence MM 2.1.2 on either side of the hydrophilic sequence.
  • the copolymer is finished with introduction of 5 ml of methanol into the reaction medium. After concentration of the latter, the copolymer is recovered by reprecipitation in ether.
  • the final composition in MM 2.1.2 is 81.6% by mass in the copolymer, i.e. a succession of 19 MM 2.1.2 units, 45 OE units then new 19 motifs MM 2.1.2.
  • Example 4 Preparation of a block copolymer according to the invention by coupling reaction
  • DCHU dicyclohexylurea
  • the mixture is then washed with acid (elimination of the residual DCHU and DMAP) and then neutralized with a sodium carbonate solution.
  • the copolymer is then obtained by precipitation in water, non-solvent of the majority sequence, namely the PMM 2.1.2.
  • the two dry homopolymers are dissolved in toluene.
  • the mixture is degassed under nitrogen and brought to 60 ° C.
  • the catalyst (1-hexanol salt, 2-ethyl, titanate (4+), Tyzor TOT (Du Bridge)) diluted in a little toluene is then added to the reaction medium.
  • the reaction crude is then concentrated and then reprecipitated in water to separate the copolymer and the PMM 2.1.2 not transesterified from the PEG not fixed.
  • the whole is heated to 40 ° C.
  • the initiator (cyclohexyl percarbonate (1 mol% relative to the total of the monomers involved)) is then introduced in solution in THF.
  • reaction solvent is evaporated and the copolymer formed is still in mixing with a residual macromonomer fraction.
  • copolymer can be demonstrated by the technique of gel permeation chromatography and the formation of micelles in an aqueous medium.
  • Example 6A Preparation of a graft copolymer according to the invention by transesterification
  • a PMM 2.1.2 - POE graft structure copolymer was obtained by transesterification of a poly (oxyethylene) monomethyl ether on the chains lateral esters of a pre-synthesized poly (methylidene malonate).
  • THF is freshly cryodistilled in the polymerization reactor at -70 ° C.
  • the diphenylhexyllithium is then introduced and the temperature is allowed to rise temperature around 15 ° C.
  • the monomethyl ether POE is then added. Discoloration of the initiator, dark red at the start is immediate.
  • the polymerization is stopped by adding 1 ml of methanol and the polymer is recovered after evaporation under vacuum of the solvent of reaction.
  • Example 7 Use of the copolymers according to the invention for obtaining micelles in water
  • the purpose of this example is to demonstrate the surfactant properties POE-PMM 2.1.2 copolymers in water, by formation of micelles which by themselves can constitute vectors of active principle.
  • Dialysis is carried out through a membrane (SPECTRA POR ref 132 638, porosity 1,000 Daltons) allowing only solvent exchange but avoiding the copolymer does not pass through it. Dialysis leads to enrichment progressive in water inside the volume delimited by the membrane.
  • Example 8 Use of the copolymers according to the invention for the stabilization of a water-in-oil emulsion (W / O)
  • Emulsions are produced by adding 1 ml of water to a solution of 10 ml of ethyl acetate containing a predetermined quantity of copolymer.
  • the mixture is emulsified for 5 minutes using an Ultra Turrax JANKE & KUNKEL T25 at a speed of 13,000 rpm.
  • the stability of the emulsions is assessed visually and using a device TURBISCAN MA 1.000 type optics.
  • a comparison example is carried out using a polymer of the type PLURONIC®.
  • Example 12 Use of the copolymers according to the invention for obtaining nanoparticles in water
  • the surfactant properties of the copolymers according to the invention are here set profit to allow the stabilization of PMM 2.1.2 hydrophobic particles of nanometric dimension in aqueous medium.
  • Nanoparticles are obtained by dispersion of 200 mg of PMM polymer 2.1.2 dissolved in 2 ml of acetone in an aqueous medium (10 ml, distilled water) containing the POE-PMM 2.1.2 copolymer (36% by mass in MM 2.1.2) with good agitation.
  • the average particle diameters were determined using a Coultronics type Coulter N4 switchgear, at 20 ° C.
  • Example 13A Formulation of stabilized PMM 2.1.2 nanoparticles with a PMM 2.1.2 - POE copolymer according to the invention loaded with cyclosporine A
  • the acetone phase is dispersed in water with magnetic stirring (1,000 rpm). 30 min after the start of polymerization, the mixture is added cyclosporine A cold / cyclosporine A hot (radiolabelled). The duration of the polymerization is 18 hours.
  • the average particle diameter measured using a Nanosizer device is 206 nm +/- 41 nm (average of 3 measurements).
  • the cyclosporin A binding rate thus measured corresponding to the percentage of active ingredient found in nanoparticles compared to the quantity initially introduced is 50% +/- 3%.
  • Example 13B Formulation of stabilized PMM 2.1.2 nanoparticles with a PMM 2.1.2 - POE copolymer according to the invention loaded with doxorubicin
  • Doxorubicin is dissolved in water. Then we disperse the phase acetone in the aqueous phase with magnetic stirring (1,000 rpm). The duration of the polymerization is 18 hours.
  • the average particle diameter measured using a Nanosizer device is 179 nm +/- 28 nm (average of 3 measurements).
  • the degree of encapsulation of doxorubicin thus measured corresponding to the percentage of active ingredient found in nanoparticles compared to the quantity initially introduced is 43%.
  • Example 13C Formulation of stabilized PMM 2.1.2 nanonarticles with a PMM 2.1.2 - POE copolymer according to the invention loaded with conjugate Peptide V3 / Ovalbumin
  • Peptide V3 / Ovalbumin conjugate is received as a suspension aqueous in PBS at a concentration of 2.3 mg of peptide and 1.2 mg of ovalbumin per ml of suspension.
  • concentration of the conjugate in the nanoparticle suspension is therefore 0.23 mg of peptide V3 and 0.12 mg ovalbumin per ml.
  • the acetone phase is added to the aqueous phase with stirring magnetic (1,000 rpm).
  • the duration of the polymerization is 18 hours.
  • the average particle diameter measured using a Nanosizer device is 161 nm +/- 19 nm (average of 3 measurements).
  • the rate of encapsulation of the Peptide V3 / Ovalbumin conjugate thus measured corresponding to the percentage of active ingredient found in the nanoparticles compared to the quantity initially introduced is 48% +/- 3%.
  • PMM 2.1.2 nanoparticles can thus be obtained in water osmosis pH 6.3, stabilized with at least 2% of PMM 2.1.2-POE copolymer.
  • active ingredients tested which are the cyclosporine A, doxorubicin and the peptide V3 / Ovalbumin conjugate could be encapsulated.

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Description

La présente invention concerne généralement une nouvelle famille de copolymères tensioactifs biocompatibles présentant un large spectre d'utilisations, notamment dans le domaine pharmaceutique et pour la synthèse de matériaux à l'état dispersé ainsi que le traitement de surface de matériaux ou biomatériaux.
L'invention a plus particulièrement pour objet des copolymères biocompatibles tensioactifs comportant une ou plusieurs séquences à caractère hydrophobe constituées majoritairement d'unités récurrentes ou non répondant à la formule générale définie ci-après, formant en particulier un poly(méthylidène malonate).
On connaít depuis longtemps des copolymères tensioactifs formés d'une ou plusieurs séquences présentant un caractère hydrophile et une ou plusieurs séquences présentant un caractère hydrophobe.
En particulier, les produits constitués de séquences polyoxyéthylène à caractère hydrophile et de séquences polyoxypropylène à caractère hydrophobe et commercialisés sous la dénomination PLURONIC® sont couramment utilisés pour la préparation de compositions à usage cosmétique ou pharmaceutique.
Le principal inconvénient de ces copolymères provient du fait qu'ils ne comportent aucune séquence biodégradable.
Des copolymères tensioactifs comportant des séquences biodégradables ont déjà été décrits par exemple dans le document EP 583955. Il s'agit de copolymères à blocs contenant des unités d'oxyde d'éthylène et des unités dérivées d'acides aminés en tant que séquences hydrophobes.
La biodégradabilité de ces copolymères connus s'accompagne d'une coupure de la chaíne principale.
Le document WO-A-9625954 décrit généralement l'utilisation de poly(méthylidènemalonate) pour la préparation de microcapsules contenant un gaz, destinées au diagnostic par ultrasons.
Il a été découvert, et ceci constitue le fondement de la présente invention, une nouvelle famille de copolymères tensioactifs biocompatibles et biodégradables par un mécanisme de bioérosion qui ne modifie pas sensiblement le degré de polymérisation dudit copolymère.
Plus précisément, les copolymères conformes à l'invention sont susceptibles de se dégrader par voie chimique ou biochimique par coupure des substituants latéraux constituant les séquences à caractère hydrophobe et cette bioérosion s'accompagne avantageusement du passage d'un copolymère présentant les caractéristiques d'un tensioactifà un copolymère entièrement hydrophile de même degré de polymérisation que le polymère de départ.
Les copolymères conformes à la présente invention présentent de très nombreux avantages par rapport aux copolymères tensioactifs connus à ce jour, qui résultent de la structure chimique particulière de leurs séquences à caractère hydrophobe.
Ces séquences permettent notamment de fournir des copolymères présentant des structures variées, à blocs ou greffées, ces dernières étant difficilement accessibles dans le cas des copolymères décrits par exemple dans le document EP 583 955.
La grande réactivité, aussi bien en polymérisation anionique que radicalaire, des monomères utilisés pour réaliser ces séquences à caractère hydrophobe facilite l'ajustement des masses moléculaires de ces séquences et par conséquent des propriétés des copolymères.
Enfin, les copolymères conformes à la présente invention présentent, selon la structure chimique de leurs séquences à caractère hydrophobe, des cinétiques de dégradation variées et conviennent donc à un large spectre d'applications.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente demande vise à couvrir des copolymères biocompatibles du type comportant au moins une séquence présentant un caractère hydrophile et au moins une séquence présentant un caractère hydrophobe, caractérisés en ce que ladite séquence à caractère hydrophobe est formée :
  • soit d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) suivante :
    Figure 00030001
    dans laquelle :
    • R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe (CH2)m- COOR3 dans lequel m est un nombre entier compris entre 1 et 5 et R3 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
    • R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
    • n est un nombre entier compris entre 1 et 5 ;
  • soit d'un copolymère statistique constitué d'unités récurrentes différentes répondant à la formule (I) telle que définie précédemment ;
  • soit enfin d'un copolymère statistique majoritairement constitué d'unités répondant à la formule (I) telle que définie précédemment.
Avantageusement, la séquence à caractère hydrophobe précitée sera formée d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule (I) telle que définie précédemment.
Sans sortir du cadre de l'invention, cette séquence à caractère hydrophobe peut être également formée d'un copolymère statistique constitué d'unités récurrentes différentes répondant à la formule (I) telle que définie précédemment ou bien encore d'un copolymère statistique majoritairement constitué d'unités répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, c'est à dire constitué pour au moins 50 %, exprimé en proportion molaire, de telles unités, les autres unités pouvant être formées de monomères acryliques, vinyliques, maloniques copolymérisables avec les unités méthylidène malonate de formule (I).
Selon un mode de réalisation actuellement préféré de l'invention, la séquence à caractère hydrophobe précitée est constituée d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) précitée dans laquelle :
  • R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
  • R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
  • n est un nombre égal à 1.
    • Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, la séquence à caractère hydrophobe précitée est formée d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule :
    Figure 00040001
    Selon une caractéristique particulière, la séquence à caractère hydrophile des copolymères biocompatibles conformes à la présente invention est choisie parmi un poly(oxyéthylène), un poly(alcoolvinylique), une poly(vinylpyrrolidone), un poly(N-2 hydroxypropyl méthacrylamide), un poly(hydroxyéthyl méthacrylate), un poly(amino acide) hydrophile tel qu'une polylysine, un polysaccharide, et sera de préférence constituée d'un poly(oxyéthylène).
    Les copolymères conformes à la présente invention peuvent présenter des structures variées, à blocs, de préférence di-blocs ou tri-blocs, ou greffées.
    Ces copolymères peuvent être caractérisés de façon générale:
    • par une teneur pondérale en séquences à caractère hydrophobe comprise entre 5 et 95 %, de préférence entre 10 et 90 % ;
    • par une masse molaire totale des séquences à caractère hydrophobe comprise entre 1.000 et 80.000 g/mol, et de préférence entre 1.000 et 50.000 g/mol.
    Les copolymères conformes à la présente invention peuvent être préparés par des techniques de polymérisation classiques bien connues de l'homme de métier.
    Parmi ces techniques, on utilisera de préférence la polymérisation par voie anionique, la polymérisation par voie radicalaire, ou encore la technique de couplage des séquences précurseurs du copolymère, ces séquences ayant été au préalable fonctionnalisées en bout de chaíne de façon adéquate.
    La polymérisation par voie anionique convient plus particulièrement à la préparation de copolymères à blocs.
    Elle comporte l'addition séquentielle des monomères et permet d'obtenir des copolymères de structure parfaitement définie, les quantités d'amorceurs et de monomères engagés permettant de contrôler le degré de polymérisation de chacune des séquences.
    Un copolymère à blocs peut être ainsi obtenu :
    • soit par polymérisation anionique d'un premier monomère et réaction sur la chaíne en croissance d'un second monomère ;
    • soit par activation d'un polymère précurseur qui servira d'arnorceur à la polymérisation d'un second monomère.
    Les agents d'amorçage susceptibles d'être utilisés dans le cadre de ces polymérisations par voie anionique seront généralement :
    • d'une part, les dérivés organométalliques comme le butyllithium et en particulier le diphénylhexyllithium ;
    • d'autre part, des alcoolates et en particulier les alcoolates macromoléculaires tel qu'un alcoolate de POE qui peuvent être généré par activation d'une fonction hydroxy à l'aide de cumylpotassium, de diphénylméthylpotassium, de naphtalène potassium.
    La polymérisation par voie anionique sera généralement réalisée dans un solvant compatible avec les diverses séquences du copolymère.
    Dans le cas où la séquence à caractère hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) et la séquence à caractère hydrophobe est constituée d'un poly(méthylidène malonate), les copolymères à blocs selon l'invention seront préparés de préférence par polymérisation anionique successive de l'oxyde d'éthylène puis du méthylidène malonate ou par activation d'un précurseur polyoxyéthyléné monohydroxylé commercial et polymérisation anionique subséquente de la séquence poly(méthylidène malonate).
    D'une façon générale, on utilisera de préférence le tétrahydrofurane comme solvant de polymérisation, ce produit permettant de travailler en milieu homogène et influençant favorablement la cinétique de polymérisation.
    En ce qui concerne les monomères de départ, les méthylidène malonate pourront être préparés par exemple en suivant le procédé décrit dans le brevet EP 283364 correspondant aux brevets US 4 931 584 et US 5 142 098, et seront généralement dégazés sous vide de pompe à palettes jusqu'à poids constant pour éliminer l'inhibiteur de polymérisation (SO2).
    Les monomères utilisés pour la préparation des séquences hydrophiles seront généralement des produits commerciaux.
    La technique de couplage convient également plus particulièrement à la préparation de copolymères à blocs.
    Cette réaction est généralement réalisée à partir d'homopolymères présynthétisés et fonctionnalisés, en présence d'un agent de couplage et éventuellement d'un agent d'activation, dans un solvant approprié.
    Dans le cas de la préparation des copolymères préférés selon l'invention, dont la séquence hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) et la séquence hydrophobe est constituée d'un poly(méthylidène malonate), on utilisera avantageusement un homopolymère du poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-carboxy et un homopolymère du poly(méthylidène malonate) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy.
    L'homopolymère du poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-carboxy peut être obtenu par exemple par transformation par l'anhydride succinique d'un poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy commercial.
    L'homopolymère du poly(méthylidène malonate) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy peut être obtenu directement par synthèse anionique en milieu aqueux ou par synthèse anionique dans un solvant en utilisant une solution aqueuse de soude comme amorceur de la polymérisation.
    En tant qu'agent de couplage particulièrement adapté à cette polymérisation, on utilisera avantageusement le dicyclohexylcarbodiimide (DCCI).
    La réaction de couplage peut être éventuellement activée par catalyse basique et se déroulera généralement dans un solvant compatible avec les homopolymères, comme en particulier le dichlorométhane dans le cas particulier des copolymères préférés de l'invention.
    La polymérisation par voie radicalaire convient plus particulièrement à la préparation de copolymères greffés.
    Cette polymérisation est généralement réalisée à partir d'un macromonomère, c'est à dire d'un oligomère portant à l'une de ses extrémités un groupement éthylénique polymérisable par voie radicalaire et susceptible de réagir avec un monomère pour former un copolymère à structure greffée.
    Cette polymérisation sera généralement réalisée en présence d'un amorceur dans un solvant approprié.
    Dans le cas de la préparation des copolymères préférés selon l'invention, dont la séquence hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) divers macromomères fonctionnalisés pourront être utilisés.
    On préférera plus particulièrement utiliser un macromonomère de poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement méthacryloyle.
    Un tel produit peut être commercial (Aldrich) et sera constitué par exemple d'une chaíne de poly(oxyéthylène) de masse molaire comprise entre 308 et 440 g/mol, ou sera préparé à partir d'un poly(éthylèneglycol)monométhyléther commercial par couplage avec l'acide méthacrylique dans le dichlorométhane pour former une fonction terminale méthoxy.
    On peut encore préparer un tel macromonomère par activation d'un poly(oxyéthylène) et réaction subséquente sur le chlorure de méthacryloyle.
    Les copolymères à structures greffées selon l'invention, peuvent également être préparés par transestérification d'un poly(oxyéthylène) monométhyléther sur des chaínes latérales esters d'un poly(méthylidène malonate) pré-synthétisé.
    Cette transestérification sera généralement réalisée avec de l'alcool en présence d'un catalyseur à température élevée.
    D'une façon générale, les copolymères conformes à la présente invention ont un large spectre d'applications en tant que tensioactifs.
    Ces copolymères permettent en particulier de réduire la tension superficielle de l'eau et la tension interfaciale d'un système eau-solvant organique non miscible à l'eau.
    Ces copolymères permettent encore de préparer des systèmes micellaires en milieu aqueux, notamment utiles comme vecteurs de principes actifs.
    Ces copolymères permettent également de préparer ou de stabiliser des émulsions simples de type eau-dans-huile ou huile-dans-eau.
    Ces copolymères permettent encore d'encapsuler des substances actives variées, en particulier les substances à usage thérapeutique.
    Les copolymères conformes à la présente invention trouvent encore application comme colloïdes protecteurs pour la préparation ou la stabilisation de nano particules.
    Ils seront particulièrement utiles lorsque ces particules sont réalisées à partir de polymères comportant des unités récurrentes identiques à celles de leurs séquences à caractère hydrophobe, ce qui facilite comme on le comprend, l'ancrage du copolymère en surface de ces particules tout en leur conférant un caractère biocompatible et hydrophile du fait de la présence dans ledit copolymère d'au moins une séquence hydrophile biocompatible.
    Les copolymères conformes à l'invention peuvent également être utilisés comme agents de traitement de surface de matériaux ou de biomatériaux en particulier pour conférer un caractère hydrophile aux surfaces traitées par ancrage desdits copolymères ou pour minimiser l'adhésion interfaciale avec des tissus animaux, des cellules ou des biomolécules, lorsque ces matériaux ou biomatériaux sont susceptibles d'entrer en contact avec lesdites cellules ou biomolécules.
    Les copolymères conformes à la présente invention peuvent également être utilisés pour la fabrication de particules susceptibles d'être utilisées comme agents de contraste.
    Les copolymères conformes à la présente invention peuvent encore être utilisés comme matériaux biocompatibles, par exemple sous forme de films ou de pièces moulées, ainsi que pour le traitement de surface de structures implantaires et pour minimiser ou favoriser les mécanismes d'adsorption interfaciaux.
    La présente invention va maintenant être illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Dans ces exemples, les abréviations suivantes ont été utilisées :
    OE :
    oxyde d'éthylène
    POE :
    poly(oxyéthylène)
    MM 2.1.2 :
    méthylidène malonate répondant à la formule :
    Figure 00090001
    encore dénommé :
    1-éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonylméthylène-oxycarbonyléthène
    MM 2.3.2:
    méthylidène malonate répondant à la formule :
    Figure 00100001
    PMM 2.1.2 :
    polymère constitué d'unités monomères récurrentes répondant à la formule
    Figure 00100002
    PMM 2.3.2 :
    polymère constitué d'unités monomères récurrentes répondant à la formule
    Figure 00110001
    THF :
    Tétrahydrofurane
    I.P. : :
    Indice de polymolécularité
    DCCI :
    Dicyclohexylcarbodiimide
    DMAP :
    Diméthylaminopyridine
    PEG :
    Polyéthylène glycol
    Exemple 1 : Préparation d'un copolymère à blocs selon l'invention par voie anionique
    Un copolymère à blocs POE-PMM 2.1.2 a été obtenu par polymérisation successive des deux monomères en commençant par la préparation du bloc POE, par la mise en oeuvre du protocole expérimental suivant.
    Le réacteur dans lequel est effectué la polymérisation (250 ml) est raccordé à une rampe à vide permettant de travailler sous vide poussé et de s'affranchir des impuretés protiques.
    Le solvant (THF, 150 ml) purifié de toute trace d'humidité est cryodistillé dans le réacteur à - 70°C.
    L'amorceur (Terbutanolate de potassium (0.1N/THF) ; 10 ml) est ensuite ajouté à l'aide d'une seringue au travers d'un septum.
    L'oxyde d'éthylène (5 g) est alors introduit par cryodistillation.
    La polymérisation s'effectue à température ambiante pendant 48 heures. Après cette durée, un prélèvement permet de contrôler, par chromatographie par perméation de gel, la masse molaire (4.000 g/mol) et l'indice de polymolécularité (1.13) de la première séquence.
    Le MM 2.1.2 (0,5 ml) fraíchement dégazé sous vide pour enlever le SO2 utilisé comme inhibiteur de polymérisation, est alors rajouté rapidement et en une seule fois à température ambiante.
    Après 5 heures, le copolymère est désactivé par ajout de méthanol et précipité dans l'éther diéthylique.
    5 motifs dérivés de MM 2.1.2 sont fixés au POE, ce qui correspond à une masse molaire pour le PMM 2.1.2 de 1.150 g/mol.
    L'analyse thermique du copolymère révèle une température de transition vitreuse de - 16°C ainsi qu'un pic de fusion de 45°C (ΔH = 117 J/g).
    Exemple 2 : Préparation de copolymères à blocs selon l'invention par voie anionique
    Le protocole expérimental est le même que celui décrit pour l'exemple 1.
    Les réactifs suivants ont été utilisés :
  • Solvant : THF 100 ml
  • Oxyde d'éthylène (OE) : 3 g
  • Amorceur : diphénylméthyle potassium (0.25 N/THF) : 3 ml
  • MM 2.1.2 : soit 2 ml ou soit 3,2 ml
    • Le POE synthétisé a une masse molaire de 3.600 g/mol (I.P = 1.12).
    L'ajout de la seconde séquence à température ambiante conduit à un copolymère de masse molaire finale de 5.900 g/mol (pour 2 ml de monomère ajouté) et 9.300 g/mol (pour 3,2 ml de monomère ajouté), c'est à dire ayant incorporé respectivement 10 et 25 motifs MM 2.1.2, ce qui correspond à une masse molaire totale pour le PMM 2.1.2 de 2.300 et 5.750 g/mol respectivement.
    L'analyse thermique du copolymère permet de mettre en évidence la température de transition vitreuse du copolymère qui est respectivement de -18° C pour le premier copolymère et 6°C pour le second copolymère, ainsi que le pic de fusion aux températures respectives de 33° C et 39°C (ΔH de 53 et 63 J/g).
    Exemple 2A : Préparation d'un copolymère à blocs selon l'invention par voie anionique
    Le protocole expérimental est le même que celui décrit pour les exemples 1 et 2.
    Les réactifs suivants ont été utilisés :
  • Solvant : THF 100 ml
  • Oxyde d'éthylène (OE) : 3 g
  • Amorceur : diphénylméthylpotassium (0,32M/THF) : 2,7 ml
  • MM 2.3.2 : 2 ml
    • Le POE, synthétisé de manière classique a une masse molaire de 3.500 g/mol (I.P= 1,10).
    Le second monomère, préalablement dilué dans quelques ml de THF anhydre, est alors rapidement ajouté sur l'alcoolate à température ambiante et conduit à un copolymère incorporant 5 motifs MM 2.3.2 correspondant à une masse molaire pour le PMM 2.3.2 de 1.290 g/mol.
    Exemple 2B : Préparation de copolymères à blocs selon l'invention par voie anionique
    Le protocole expérimental est le même que celui décrit pour l'exemple 2A.
    Les réactifs suivants ont été utilisés :
  • Solvant : THF 100 ml
  • Oxyde d'éthylène (OE) : 4 g
  • Amorceur : diphénylméthylpotassium (0,4M/THF) : 2,5 ml
  • MM 2.1.2 : 1,5 ml
  • MM 2.3.2 : 2 ml
    • Le POE, synthétisé de manière déjà décrite dans les exemples précédents a une masse molaire de 11.000 g/mol (I.P = 1,11).
    Le mélange des deux monomères (MM 2.1.2 ET MM 2.3.2) fraíchement dégazés sous vide est alors rapidement rajouté à température ambiante sur la fonction alcoolate du bloc POE.
    Après désactivation, le copolymère est précipité dans l'éther diéthylique.
    Les analyses RMN et GPC indiquent un pourcentage massique respectif de 7 % pour le MM 2.1.2 (4 motifs) et 13 % pour le MM 2.3.2 (7 motifs).
    Exemple 3 : Préparation d'un copolymère à blocs selon l'invention par voie anionique
    Un copolymère POE-PMM 2.1.2 a été obtenu par réamorçage d'un précurseur POE préformé de longueur déterminée, puis par réaction de l'alcoolate obtenu sur le méthylidène malonate, par la mise en oeuvre du protocole suivant :
    Du PEG monohydroxylé (PEG monométhyléther ALDRICH Mn = 2.000 g/mol : 1.2 g) est séché sous vide poussé dans un réacteur de polymérisation raccordé à la rampe à vide.
    100 ml de THF anhydre sont cryodistillés sur le polymère placé à - 70° C.
    La température est alors remontée progressivement à 20° C pour permettre la solubilisation du polymère.
    La juste quantité de dérivé organométallique (Diphénylhexyllithium (0.056 M dans le THF) : 10.7 ml) est alors ajoutée goutte à goutte par l'intermédiaire d'un septum dans le réacteur.
    La solution se décolore presque instantanément et après l'ajout, la solution est jaune pâle et atteste de la présence d'anions d'alcoolates.
    Après 3 heures de réaction, le MM 2.1.2 (3,7 g) fraíchement dégazé sous vide et dilué dans 10 ml de THF anhydre est ajouté rapidement dans le réacteur à température ambiante. Le milieu se décolore en quelques secondes.
    Après 5 heures de polymérisation, le copolymère est terminé par ajout de 5 ml de méthanol. Le milieu réactionnel est concentré puis le polymère est récupéré après précipitation dans l'éther, lavage à l'éther et séchage sous vide.
    Exemple 3A : Préparation d'un copolymère à blocs selon l'invention par voie anionique
    Un copolymère tribloc PMM 2.1.2-POE-PMM 2.1.2 a été obtenu par réamorçage d'un précurseur POE dihydroxylé de masse molaire prédéterminée, puis par réaction du dialcoolate obtenu sur le méthylidène malonate, par la mise en oeuvre d'un protocole analogue à celui de l'exemple 3.
    Les réactifs suivants ont été utilisés :
  • Solvant : THF, 100 ml
  • POE dihydroxylé (Fluka) 2.000 g/mol : 2 g
  • Amorceur : diphénylhexyllithium (0,145M/THF) : 13,8 ml
  • MM 2.1.2 : 3 ml.
    • La quantité d'organolithien ajouté permet la métallation des deux extrémités hydroxylées du POE et de ce fait, l'amorçage puis la polymérisation de la séquence MM 2.1.2 de part et d'autre de la séquence hydrophile.
    5 heures après l'ajout du MM 2.1.2, le copolymère est terminé par introduction de 5 ml de méthanol dans le milieu réactionnel. Après concentration de ce dernier, le copolymère est récupéré par reprécipitation dans l'éther.
    La composition finale en MM 2.1.2 est de 81,6 % en masse dans le copolymère, soit une succession de 19 motifs MM 2.1.2, 45 motifs OE puis de nouveau 19 motifs MM 2.1.2.
    Exemple 4 : Préparation d'un copolymère à blocs selon l'invention par réaction de couplage
    Un copolymère à blocs selon l'invention a été obtenu par réaction de couplage entre un homopolymère oxyéthyléné fonctionnalisé en α par un groupement carboxy (Mn = 5.000 g/mol) et un homopolymère du MM 2.1.2 fonctionnalisé en α par un groupement hydroxy.
    La terminaison OH de la séquence PMM 2.1.2 α hydroxy fonctionnalisée peut être obtenue :
    • soit par la synthèse du polymère en milieu aqueux (voir Lescure F. et al ; Pharmaceutical Research, 11, 9, 1270-1276, 1994) ;
    • soit par l'utilisation d'une solution aqueuse de soude comme amorceur de la polymérisation du MM 2.1.2 en milieu THF ou acétone.
    Un équivalent de chacun des homopolymères est solubilisé dans du dichlorométhane ; on ajoute ensuite un équivalent de DCCI et 0,3 équivalent de DMAP en solution dans le dichlorométhane.
    Après 10 heures de réaction à température ambiante, le trouble caractéristique de la dicyclohexylurée (DCHU) est éliminé par filtration.
    Le mélange est ensuite lavé à l'acide (élimination de la DCHU résiduelle et de la DMAP) puis neutralisé avec une solution de carbonate de sodium.
    Le copolymère s'obtient ensuite par précipitation dans l'eau, non solvant de la séquence majoritaire à savoir le PMM 2.1.2.
    Exemple 5 : Préparation d'un copolymère greffé selon l'invention par voie radicalaire
    Un copolymère greffé selon l'invention a été obtenu à partir des deux homopolymères suivants :
    • PEG monométhylether ALDRICH (Mn = 2.000 g/mol) : 0,1 g
    • PMM 2.1.2 (Mn = 30.000 g/mol) : 0.27 g
       en suivant le protocole expérimental décrit ci-après.
    Les deux homopolymères secs sont dissous dans le toluène.
    Le mélange est dégazé sous azote et porté à 60°C.
    Le catalyseur (sel de 1-hexanol, 2-ethyl, titanate (4+), Tyzor TOT (Du Pont)) dilué dans un peu de toluène est alors ajouté au milieu réactionnel.
    La synthèse se poursuit pendant 12 heures à 60°C.
    Le brut de réaction est ensuite concentré puis reprécipité dans l'eau pour séparer le copolymère et le PMM 2.1.2 non transéstérifié du PEG non fixé.
    Exemple 6 : Préparation d'un copolymère greffé selon l'invention par voie radicalaire
    Un copolymère greffé selon l'invention a été obtenu à partir des deux produits suivants :
    • PEG méthacrylate (macromonomère), Mn = 2.000 g/mol : 0.71 g
    • MM 2.1.2 : 0.62 g
    Dans un ballon tricol sont introduits les deux comonomères ainsi que le solvant (THF, 30 ml).
    L'ensemble est chauffé à 40°C.
    L'amorceur (percarbonate de cyclohexyle (1 % molaire par rapport au total des monomères engagés)) est ensuite introduit en solution dans du THF.
    La synthèse se poursuit 18 heures à 40°C.
    Le solvant de réaction est évaporé et le copolymère formé est encore en mélange avec une fraction de macromonomère résiduel.
    L'obtention effective de copolymère peut être mise en évidence par la technique de chromatographie par perméation de gel et par la formation de micelles en milieu aqueux.
    Exemple 6A : Préparation d'un copolymère greffé selon l'invention par transestérification
    Un copolymère à structure greffé PMM 2.1.2 - POE a été obtenu par transestérification d'un poly(oxyéthylène) monométhyléther sur les chaínes latérales esters d'un poly(méthylidène malonate) pré-synthétisé.
    Les réactifs suivants ont été utilisés :
  • Solvant: THF, 150 ml
  • PMM 2.1.2 (Mn = 30.000 g/mol) : 2 g
  • Amorceur : diphénylhexyllithium (0,02M/THF) : 3,3 ml
  • POE monométhyléther Mn = 2.000 g/mol : 0,15 g
    • Le protocole suivant a été mis en oeuvre.
    Le THF est fraíchement cryodistillé dans le réacteur de polymérisation à-70°C.
    Le diphénylhexyllithium est ensuite introduit et on laisse remonter la température à environ 15°C.
    Le POE monométhyléther est alors ajouté. La décoloration de l'amorceur, rouge sombre au départ est immédiate.
    Le PMM 2.1.2, synthétisé par voie anionique dans le THF à - 70°C et en utilisant également le diphénylhexyllithium comme amorceur est alors introduit dans le réacteur où se trouve l'alcoolate.
    Après 3 heures de réaction, la polymérisation est stoppée par ajout de 1 ml de méthanol et le polymère est récupéré après évaporation sous vide du solvant de réaction.
    Exemple 7 : Utilisation des copolymères selon l'invention pour l'obtention de micelles dans l'eau
    Obtention de micelles dans l'eau après dialyse d'une solution de copolymères dans un mélange initial THF/MeOH/H2O de composition 2/1/1 en volume.
    Cet exemple a pour but de mettre en évidence les propriétés tensio-actives des copolymères POE-PMM 2.1.2 dans l'eau, par formation de micelles qui par elles-mêmes peuvent constituer des vecteurs de principe actif.
    La dialyse est réalisée à travers une membrane (SPECTRA POR ref 132 638, porosité 1.000 Daltons) ne permettant qu'un échange de solvant mais évitant que le copolymère ne la traverse. La dialyse conduit à un enrichissement progressif en eau à l'intérieur du volume délimitée par la membrane.
    La taille des micelles obtenues est donnée au tableau suivant :
    Copolymères nb unité OE/nb unité MM 212 Concentration de la solution dialysée (g/l) Diamètre moyen en unité de poids (Dw) et déviation standard (SD) (exprimés en nm)
    OE 84 -MM 13 3.5 Dw = 36.5 ± 0.4 SD=7
    OE 84-MM 23 4.5 Dw= 40.6 ±0.1 SD=5
    OE 114-MM 13 4.0 Dw= 33.8 ±1.4 SD= 12
    OE114 -MM 8 6.8 Dw = 80.2 ±3.2 SD = 24
    Exemple 8 : Utilisation des copolymères selon l'invention pour la stabilisation d'une émulsion eau-dans-huile (E/H)
    Des émulsions sont réalisées en ajoutant 1 ml d'eau dans une solution de 10 ml d'acétate d'éthyle contenant une quantité prédéterminée de copolymère.
    Le mélange est émulsifié durant 5 minutes à l'aide d'un Ultra Turrax JANKE & KUNKEL T25 à la vitesse de 13.000 tr/mn.
    La stabilité des émulsions est évaluée visuellement et à l'aide d'un dispositif optique de type TURBISCAN MA 1.000.
    Un exemple de comparaison est réalisée en utilisant un polymère de type PLURONIC® .
    Les caractéristiques des émulsions sont rassemblées dans le tableau ci-dessous :
    Copolymères étudiés % POE massique HLB selon GRIFFIN Durée de sédimentation de l'émulsion (heures)
    PLURONIC F68 (ref) 80 16 24
    OE 91 - MM 3 85.3 17 40
    OE 114 - MM 10 68.5 14 50
    OE 114 - MM 13 62.6 12.5 170
    OE 84 - MM 13 55.3 11 400
    OE 84 - MM 23 41.1 8 >450
    Exemple 9 : Mesure de tension superficielle de solution aqueuse de copolymères PMM212.POE
    Dans le but de vérifier le caractère tensioactif des copolymères synthétisés, des mesures de tension superficielle sont réalisées sur des solutions aqueuses de copolymères de concentration 10 g/l, obtenues par dissolution directe du copolymère dans l'eau. Les solutions sont laissées au repos 12 heures avant d'être étudiées.
    Les mesures ont été réalisées à 20°C, à l'aide d'un appareil TENSIMAT® n3 (Prolabo) en utilisant une lame de platine
    Solution Tension superficielle (mN/m)
    Eau pure 72
    Pluronic F68 46
    OE 114-MM 13 44
    OE 84-MM 13 40
    OE 84-MM 23 41
    Exemple 10
    Des calculs d'énergies superficielles de films de copolymères, déposés sur une lame de verre, ont été effectués par mouillabilité (méthode de la goutte posée) avec un appareil NFT Communication (MONTS, France), par mesure d'angle de contact O de liquides (eau pure, Prolabo, éthylène glycol, formamide, glycérol, diiodométhane et le bromo-1-naphtalène, Sigma-Aldrich) de tension superficielle connue.
    Les résultats obtenus sont comparés à ceux d'un film de matériau hydrophobe, le PMM 2.1.2.
    Matériau γdispersive (γD) γpolaire (γD)
    PMM 2.1.2 39 4.5
    OE 84 -MM 13 39 11
    OE 114 -MM 10 41 13
    OE 91 - MM 3 42 13
    Il peut être constaté que la composante de l'énergie superficielle caractéristique de l'hydrophilie, γP augmente avec le pourcentage en OE dans les différents copolymères.
    Exemple 11
    Dans le but de vérifier le caractère inhibiteur d'adsorption de biomolécules ou de cellules des copolymères selon l'invention des calculs d'énergie superficielle par mouillabilité (méthode de la goutte posée) avec un appareil NFT Communication (Monts, France) ont été réalisés sur des films secs de copolymères seuls et après avoir été mis en contact de solutions aqueuses de biomolécules (Chicken egg ovalbumine, Aldrich).
    A chaque fois, une comparaison avec un matériau hydrophobe, le PMM 2.1.2 est réalisée:
    Copolymères seuls Copolymères en présence d'ovalbumine
    Matériau γ dispersive (γD) γ polaire (γP) γ dispersive γ polaire
    PMM 2.1.2 39 4,5 40 15
    OE 84 - MM 13 39 11 40 12
    OE 114 - MM 10 41 13 42 10
    OE 91 - MM 3 42 13 41 11
    On constate que l'augmentation du pourcentage d'oxyde d'éthylène diminue les variations des valeurs des composantes de l'énergie superficielle mesurée en présence et en absence d'ovalbumine. Le taux d'adsorption des biomolécules sur le film de copolymère est alors plus faible.
    Exemple 12 : Utilisation des copolymères selon l'invention pour l'obtention de nanoparticules dans l'eau
    Les propriétés tensioactives des copolymères selon l'invention sont ici mises à profit pour permettre la stabilisation de particules de PMM 2.1.2 hydrophobes de dimension nanométrique en milieu aqueux. Les nanoparticules sont obtenues par dispersion de 200 mg de polymère PMM 2.1.2 dissous dans 2 ml d'acétone dans un milieu aqueux (10 ml, eau distillé) contenant le copolymère POE-PMM 2.1.2 (36 % massique en MM 2.1.2) sous bonne agitation.
    Les diamètres moyens des particules ont été déterminés à l'aide d'un appareillage Coultronics de type Coulter N4, à 20°C.
    Les résultats obtenus sont les suivants :
    % en PMM 2.1.2 - POE Diamètre moyen des particules (nm)
    0,5 161+/-40
    1 220 +/- 60
    2 240 +/- 70
    Ces résultats montrent que les copolymères conformes à l'invention présentent des propriétés tensioactives qui leur permettent de stabiliser une suspension de nanoparticules dans l'eau en l'absence de tout autre tensioactif ou colloïde protecteur.
    Exemple 13A : Formulation de nanoparticules de PMM 2.1.2 stabilisées par un copolymère PMM 2.1.2 - POE selon l'invention chargées en cyclosporine A
    Le protocole expérimental suivant a été mis en oeuvre :
    Milieu de polymérisation :
    Eau osmosée pH 6.3 = 5 ml
    Phase acétonique :
    • MM 2.1.2 = 50 mg
    • PMM 2.1.2-POE =100 mg
    • Acétone = 1ml
    Cyclosporine A :
    5 mg de cyclosporine non radiomarquée (froide)/500 µl éthanol et cyclosporine A tritiée (4,4 µCi)
    On disperse la phase acétonique dans l'eau sous agitation magnétique ( 1.000 tpm). 30 min après le début de la polymérisation, on ajoute le mélange cyclosporine A froide/cyclosporine A chaude (radiomarquée). La durée de la polymérisation est de 18 heures.
    Le diamètre moyen des particules mesuré au moyen d'un appareil Nanosizer (Coultronics, France) est de 206 nm +/- 41 nm (moyenne de 3 mesures).
    La détermination du taux de fixation de la cyclosporine A est réalisée de la manière suivante :
    • Méthode : comptage en scintillation liquide (Compteur Beckman LS 6000 TA).
    • Liquide de scintillation : Ultima Gold* (Packard).
    • Ultracentrifugation de 1 ml de la suspension à 140.000 g pendant 45 min.
    • Mesure de la radioactivité dans 200 µl de surnageant et 200 µl de suspension totale.
    Le taux de fixation de la cyclosporine A ainsi mesuré correspondant au pourcentage de principe actif retrouvé dans les nanoparticules par rapport à la quantité initialement introduite est de 50 % +/- 3 %.
    Exemple 13B : Formulation de nanoparticules de PMM 2.1.2 stabilisées par un copolymère PMM 2.1.2 - POE selon l'invention chargées en doxorubicine
    Le protocole expérimental suivant a été mis en oeuvre :
    Milieu de polymérisation :
    Eau osmosée pH 6.3 = 5 ml doxorubicine = 4 mg
    Phase acétonique :
    • MM 2.1.2 = 50 mg
    • PMM 2.1.2-POE =100 mg
    • Acétone = 1ml
    On dissout de la doxorubicine dans l'eau. Ensuite, on disperse la phase acétonique dans la phase aqueuse sous agitation magnétique ( 1.000 tpm). La durée de la polymérisation est de 18 heures.
    Le diamètre moyen des particules mesuré au moyen d'un appareil Nanosizer (Coultronics, France) est de 179 nm +/- 28 nm (moyenne de 3 mesures).
    La détermination du taux d'encapsulation de la doxorubicine est réalisée de la manière suivante :
    • Méthode : HPLC ; colonne C18 ; Phase mobile : Méthanol / Acétate d'éthyle / Acide acétique : 70 : 28,7 : 1,3.
    • Ultracentrifugation de 1 ml de la suspension à 140.000 g pendant 45 min.
    • Détermination de la concentration en doxorubicine dans la suspension totale et dans le surnageant.
    Le taux d'encapsulation de la doxorubicine ainsi mesuré correspondant au pourcentage de principe actif retrouvé dans les nanoparticules par rapport à la quantité initialement introduite est de 43 %.
    Exemple 13C : Formulation de nanonarticules de PMM 2.1.2 stabilisées par un copolymère PMM 2.1.2 - POE selon l'invention chargées en conjugué Peptide V3/Ovalbumine
    Le protocole expérimental suivant a été mis en oeuvre :
    Milieu de polymérisation :
    Eau osmosée pH 6.3 = 5 ml
    Peptide V3/Ovalbumine = 1,15 mg et 0,6 mg respectivement
    Phase acétonique :
    • MM 2.1.2 = 50 mg
    • PMM 2.1.2-POE =100 mg
    • Acétone = 1ml
    Le conjugué Peptide V3/Ovalbumine est reçu sous forme de suspension aqueuse dans du PBS à la concentration de 2,3 mg de peptide et 1,2 mg d'ovalbumine par ml de suspension. La concentration du conjugué dans la suspension de nanoparticules est donc de 0,23 mg de peptide V3 et 0,12 mg d'ovalbumine par ml.
    On additionne la phase acétonique dans la phase aqueuse sous agitation magnétique (1.000 tpm). La durée de la polymérisation est de 18 heures.
    Le diamètre moyen des particules mesuré au moyen d'un appareil Nanosizer (Coultronics. France) est de 161 nm +/- 19 nm (moyenne de 3 mesures).
    La détermination du taux d'encapsulation du conjugué Peptide V3/Ovalbumine est réalisée de la manière suivante :
    • Méthode : HPLC en gradient sur colonne C18 après dégradation des nanoparticules et analyse des acides aminés. Phase mobile A : CH3COONa 0,05M pH 5,1 ; Phase mobile B : Acétonitrile/Eau (60:40) ; Détecteur UV : λ = 254 nm.
    • Ultracentrifugation de 1 ml de la suspension à 140.000 g pendant 45 min.
    • HPLC sur le résidu de dégradation de la suspension totale et du surnageant.
    Le taux d'encapsulation du conjugué Peptide V3/Ovalbumine ainsi mesuré correspondant au pourcentage de principe actif retrouvé dans les nanoparticules par rapport à la quantité initialement introduite est de 48 % +/- 3 %.
    Conclusion générale
    Les nanoparticules de PMM 2.1.2 peuvent ainsi être obtenues dans de l'eau osmosée pH 6,3, stabilisée par au minimum 2 % de copolymère PMM 2.1.2-POE. Dans ces conditions opératoires, les principes actifs testés que sont la cyclosporine A, la doxorubicine et le conjugué peptide V3/Ovalbumine ont pu être encapsulés.

    Claims (10)

    1. Copolymères biocompatibles du type comportant au moins une séquence présentant un caractère hydrophile et au moins une séquence présentant un caractère hydrophobe, caractérisés en ce que ladite séquence à caractère hydrophobe est formée :
      soit d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) suivante :
      Figure 00280001
      dans laquelle :
      R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe (CH2)m - COOR3 dans lequel m est un nombre entier compris entre 1 et 5 et R3 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
      R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
      n est un nombre entier compris entre 1 et 5 ;
      soit d'un copolymère statistique constitué d'unités récurrentes différentes répondant à la formule (I) telle que définie précédemment ;
      soit enfin d'un copolymère statistique majoritairement constitué d'unités répondant à la formule (I) telle que définie précédemment.
    2. Copolymères selon la revendication 1, caractérisés en ce que la séquence à caractère hydrophobe précitée est constituée d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) précitée dans laquelle :
      R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
      R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
      n est un nombre égal à 1.
    3. Copolymères selon la revendication 1, caractérisés en ce que la séquence à caractère hydrophobe précitée est constituée d'unités récurrentes répondant à la formule :
      Figure 00290001
    4. Copolymères selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que la séquence à caractère hydrophile précitée est choisie parmi un poly(oxyéthylène), un poly(alcoolvinylique), une poly(vinylpyrrolidone), un poly(N-2 hydroxypropyl méthacrylamide), un poly(hydroxyéthylméthacrylate), un poly(amino acide) hydrophile tel qu'une polylysine, un polysaccharide.
    5. Copolymères selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils présentent une structure à blocs, de préférence di-blocs ou tri-blocs, ou une structure greffée.
    6. Copolymères selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils présentent une teneur pondérale en séquence à caractère hydrophobe comprise entre 5 et 95 %, de préférence entre 10 et 90 %.
    7. Copolymères selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que la masse molaire totale des séquences à caractère hydrophobe est comprise entre 1.000 et 80.000 g/mol, et de préférence entre 1.000 et 50.000 g/mol.
    8. Utilisation des copolymères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation de systèmes micellaires, d'émulsions, pour la préparation ou la stabilisation de nano particules, ou pour l'encapsulation de substances actives.
    9. Utilisation des copolymères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme agents de traitement de surface de matériaux ou de biomatériaux en particulier pour conférer par ancrage desdits copolymères un caractère hydrophile aux surfaces traitées.
    10. Utilisation des copolymères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 comme agents de traitement de surface de matériaux ou de biomatériaux susceptibles d'entrer en contact avec des tissus animaux, des cellules ou des biomolécules, en particulier pour minimiser l'adhésion interfaciale avec lesdits tissus animaux, cellules ou biomolécules.
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