EP0920334A1 - Verwendung proteolytischer enzyme zur behandlung von septischem schock - Google Patents

Verwendung proteolytischer enzyme zur behandlung von septischem schock

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EP0920334A1
EP0920334A1 EP98937518A EP98937518A EP0920334A1 EP 0920334 A1 EP0920334 A1 EP 0920334A1 EP 98937518 A EP98937518 A EP 98937518A EP 98937518 A EP98937518 A EP 98937518A EP 0920334 A1 EP0920334 A1 EP 0920334A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
enzymes
trypsin
septic shock
cells
papain
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98937518A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Stauder
Karl Ransberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mucos Pharma GmbH and Co
Original Assignee
Mucos Pharma GmbH and Co
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Filing date
Publication date
Application filed by Mucos Pharma GmbH and Co filed Critical Mucos Pharma GmbH and Co
Publication of EP0920334A1 publication Critical patent/EP0920334A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to the use of at least one proteolytic enzyme and optionally rutoside for the treatment of septic shock.
  • the immune system is a biological functional unit with highly specific reaction processes on both the humoral and the cellular level. Disruptions in this complex system are causally involved in the development of numerous diseases. Defects in the development of the immune system lead to so-called immune deficiency diseases, such as also a septic shock that can take on life-threatening proportions.
  • septic shock there is a critical reduction in the microcirculation with hypoxia of the tissues and metabolic disorders.
  • the septic shock is preferably triggered by gram-negative bacteria, often with consumption coagulopathy.
  • the drop in blood pressure in shock leads to the release of catechoamines with an increase in heart rate and constriction of arterioles and venous capacity vessels.
  • These regulatory mechanisms can initially make arterial blood pressure normal.
  • the circulating amount of residual blood is redistributed in order to ensure blood flow to the heart and brain.
  • symptomatic therapy begins with the elimination or therapy of the cause of the shock.
  • symptomatic therapy is carried out, which consists in monitoring various parameters, such as pulse and blood pressure, as well as in general measures, such as keeping the airways clear, protecting against heat loss or giving oxygen through a nasogastric tube.
  • therapy with broad-spectrum antibiotics and volume substitution is indicated.
  • Low dose heparin and antithrombin-Ill can be given for the prophylaxis and therapy of complications.
  • Cytokines are small proteins with molecular weights of 8,000 to 30,000, with each cytokine having its own amino acid sequence and cell surface receptors. They are made from a variety of different cell types and act on almost every tissue and organ system. The names given to the various cytokines do not follow a logical system, but rather correspond to their biological properties. IL-1 and TNF (tumor necrosis factor) are the primary pro-inflammatory cytokines, and moreover, these two cytokines act in a synergistic manner in inducing inflammation, shock and death.
  • IL-1 and TNF as an essential element in the development of diseases, such as, for example, septic shock, and in the production of systemic acute phase reactions.
  • Neutralizing antibodies against murine or human TNF protect mice, rabbits and primates against death from septic shock.
  • coli ie LPS as a trigger for septic shock
  • TNF provides a significant stimulus for IL-1 and IL-6 synthesis. Therefore, the use of neutralizing antibodies against TNF or against IL-1 receptors can reduce the consequences of septic shock.
  • Antibodies are essential molecules for the humoral response.
  • the heavy and light protein chains forming the antibody are each divided into different functional domains.
  • the variable domain of the heavy chain V H is involved in the binding of the antigen, and the subsequent domains C H 1, C H 2 and C H 3 are responsible for the so-called effector functions of an antibody, such as the binding of complement proteins.
  • the C H 2 domain in particular is involved in the initial step of complement activation.
  • C H 2 domain is not restricted to immunoglobulins, but the C 2 structure is also very similarly present, for example, in T cell receptor proteins, cell adhesion molecules and the class I and II proteins encoded in the main histocompatibility complex. Numerous proteins with a structure similar to the domain structure of the immunoglobulins are combined to form the proteins of the so-called immunoglobulin superilamine. An overview of proteins containing a C H 2 structure is given in AF Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily Domains for Cell Surface Recognition", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.
  • C H 2 structure or “C H 2 domain” means the region of a protein molecule that has a structure similar to the C H 2 domain of IgG.
  • C2 domain or C2 set is also used in the literature for such a structure.
  • the C H 2 structure also frequently has an effector function in the other members of the immunoglobulin superfamily, which can be involved in the development of a wide variety of clinical pictures, including septic shock.
  • Table 1 lists the immunological reaction partners for a C H 2 structure from various proteins and the pathoimmunological or physiological subsequent reactions which can be caused by the interaction of the C H 2 structure with the immunological reaction partner.
  • the present invention was therefore based on the technical problem of specifying substances which can be used for the treatment of septic shock.
  • the use of at least one proteolytic enzyme and optionally rutoside is provided for the treatment of septic shock.
  • the immunoglobulins modulated by the proteolytic enzyme or enzymes are distinguished by the fact that their binding capacity for the complement component C1q is reduced. This applies to natural C1 q-binding immunoglobulins (subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgM and partly IgA).
  • the changed C1q binding capacity is - without being bound by any theory - probably caused by a change in the conformation of the C H 2 domain due to the action of the enzyme.
  • the conformational change can either be caused directly by an enzyme-induced change in the C H 2 domain, or the proteolytic enzymes cause a structural change in the regions adjacent to the C H 2 domain, and these changes influence the conformation of the C H 2 domain. Domain.
  • the treatment of neutrophils with proteolytic enzymes significantly reduced the expression of, for example, receptor III for the Fc region of IgG and apparently also influences the number of Fc ⁇ -R-II on the cell surface.
  • IgG-covered erytrocytes to neutrophils is increased; their ability to perform IgG-mediated functions, such as antibody-dependent cellular cytotoxicity and chemiluminescence, induced by IgE is also enhanced. These reactions are completely dependent on Fc ⁇ -R-Il.
  • trypsin, bromelain, papain and optionally rutin or a combination thereof is used as the proteolytic enzyme.
  • the enzymes used according to the invention can be isolated inexpensively from the following raw materials.
  • Bromelain is a proteolytically active enzyme from the pineapple juice and can also be isolated from ripe fruit.
  • Papain is a proteolytic enzyme obtained from the milk sap of the immature, meaty fruits of the Carica Papaya melon tree. Pure papain is a crystalline polypeptide with an MG. from 23350 consisting of a chain of 212 amino acid residues with 4 disulfide bridges; Sequence and spatial structure are known. Papain is used in many different ways: due to its protein-splitting properties as "meat tenderizer” or “short salt", for clarifying beer, for bread and hard biscuit production, in leather preparation, in the textile industry for degassing silk and for preventing wool matting, in the tobacco industry for quality improvement, for the recovery of silver from used photographic material, furthermore in bacteriology for the extraction of peptone.
  • Papain is already used to support enzymatic digestion, for enzymatic wound cleaning and as an additive to denture cleaning agents.
  • Papain preparations are used for special purposes also available carrier bound on plastic polymers or agarose.
  • Papain has also been used as a catalyst for the synthesis of oligopeptides.
  • Trypsin is a proteolytic enzyme that is also formed in the pancreas and is already used therapeutically in conjunction with other enzymes. It belongs to the serine proteinases. Crystalline trypsin has an MG. of approx. 23300, is soluble in water but not in alcohol, has an optimum effect at pH 7-9 and cleaves peptide chains on the carboxy side of the basic amino acid residues L-lysine and L-arginine. The spatial structure of the 223 amino acid trypsin is known.
  • Rutoside can also be added to the medication.
  • Rutoside is a glycoside that belongs to the flavonoids.
  • the combined use of 20 to 100 mg bromelain, 40 to 120 mg papain and 10 to 50 mg trypsin per dose unit is particularly effective.
  • a combination of 90 mg bromelain, 120 mg papain and 100 mg rutoside x 3H 2 O is very particularly preferred.
  • a combination of 48 mg trypsin, 90 mg bromelain and 100 mg rutoside x 3H 2 O is used.
  • the medicament can furthermore contain all customary auxiliaries and / or carriers.
  • Auxiliaries and carriers include e.g. Lactose, magnesium stearate, stearic acid, talc, methacrylic acid, copolymer type A, Shellack, Makrogol 6000, di-butyl phthalate, vanillin, titanium dioxide, white clay, polyindone, yellow wax and camauba wax.
  • the RPMI 1640 cell culture medium was used with the following additives: NaHCO 3 ( biochrom, 2 g / 1); L-glutamine (biochrom, 2 mM), Na pyruvate (biochrom,
  • phythaemagglutinin M biologicalchrome, 5 ⁇ g / ml
  • ⁇ -interferon 100 U / ml
  • Freshly isolated, human, peripheral, mononuclear blood cells were used as targets for the enzymes to be examined. After the usual isolation using Ficoll, the cells were washed several times and used fresh in the experiments. Neutrophil granulocytes were also isolated from fresh citrate blood. Here, the lymphocytes / monocytes were separated using a 2-stage Ficoll gradient. 2. Monoclonal antibodies used
  • Monoclonal antibodies were used for the specific recognition of the surface structures of the leukocytes. These recognize a defined epitope on the respective antigens, which occurs only once in the structure of the antigens examined by us.
  • Overview 1 shows the surface markers examined, the monoclonal antibodies and the analyzed target cells.
  • the freshly isolated and prepared cells were incubated with the enzymes bromelain, papain and trypsin (pharmaceutical ingredients from Mucos) with the concentrations given in the legends of the tables and figures.
  • bromelain papain: trypsin, based on 40 ⁇ g / ml, “BPT”).
  • Three enzyme concentrations (40, 10, 2.5 ⁇ g / ml) were examined.
  • the incubation took place in serum-free medium at 37 ° C.
  • the proteases were set up immediately before the incubations.
  • the cell culture media contained 0.01% sodium azide. This addition prevents the cells from re-expressing receptor molecules during the incubation process or the washing processes. After washing out the cell culture medium, the cells can be reactivated (not demonstrated).
  • a corresponding fluorescence-conjugated isotype control was carried out for each subclass of the monoclonal antibodies.
  • This is mouse immunoglobulin, with which the capacity of the non-specific binding of the target cells is determined by flow cytometry.
  • the evaluation and analysis of the data was carried out independently of the measurement process on the flow cytometer using device-specific software. there the histograms of the controls, ie the untreated cell samples, were compared with the histograms of the enzyme-treated cells.
  • the raw representation comprises an optically impressive, but relatively confusing histogram, in which various individual measurements are shown superimposed on one another.
  • the effect of the enzymes can be made optically transparent compared to the reference.
  • it is not the percentage of a subpopulation of the total leukocyte population that is the measured variable, but rather the relative receptor density, which is shown as the fluorescence intensity.
  • data can be derived which reflect the relative fluorescence intensity of the individual measurement. This is a measure of the relative receptor or surface molecule density in a measured cell population.
  • the bar graphs show the median of the relative fluorescence in logarithmic representation. Compared to the reference, the reduction in the density of the respective surface molecule as a function of the enzyme concentration can thus be represented.
  • the tables contain the data from independent experiments.
  • the donor numbers are only valid for the respective table and cannot be transferred to other tables. If, for example, a value of 40% is given in the table, this means that in this antigen 40% of all surface molecules are changed by the enzyme in such a way that the specific monoclonal antibody no longer recognizes its epitope. If no reduction is observed, the value "0" appears in the tables. The percentage given thus expresses the enzyme performance compared to the individual antigens. Values up to 20% are not considered relevant in individual cases.
  • the data were evaluated using non-linear regression.
  • the median of the fluorescence intensity versus the enzyme concentration used and the reference are correlated with one another, and from this the amount of enzyme can be calculated which leads to a 50% reduction in the relative fluorescence intensity or in the structure of the changed receptor density.
  • Figure 1 CD2 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD2.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 (see Tab. 1) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • FIG. 2 CD4 (epitope Leu3a) modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 2 (see Tab. 2) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • Figure 3 CD4 (Epitope OKT4 and Leu3a) modulation by trypsin; the median of the relative fluorescence intensity is indicated; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype.
  • the incubation time with the enzymes was 60 min.
  • Donor see Tab. 3 as the mean of duplicate determinations and standard deviation.
  • Figure 4 CD25 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: PHA blasts.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD25.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 are shown as the mean of duplicate determinations and standard deviation.
  • Figure 5 Reduction of the Leu3a antigen density by trypsin. Freshly isolated human peripheral, mononuclear blood cells were incubated with trypsin in the serum-free medium, then washed and labeled with the monoclonal antibody anti-Leu3a. The reduction in the relative fluorescence density of CD4 in the lymphocyte population is the measure of enzyme activity. The half-effect concentration of trypsin compared to the epitope Leu3a of CD4 is calculated using the fitted curve.
  • Table 1 CD2 modulation by proteases; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the medium of the relative fluorescence intensity is given, which is a measure of the enzyme performance. The incubation time with the enzymes was 60 min. The results of three experiments with cells from three different donors are shown.
  • CD4 epitopope Leu3a modulation by proteases
  • Target cells lymphocytes.
  • the percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given.
  • the incubation time with the enzymes was 60 min. The results of two experiments with cells from two different donors are shown.
  • Table 3 Modulation of the CD4 epitopes Leu3a and OKT4 by trypsin; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The data from a donor are shown.
  • Enzyme epitope 40 ⁇ g / ml 20 ⁇ g / ml 10 ⁇ g / ml
  • Table 5 Calculated half-effect concentration ( ⁇ g / ml) of bromelain, papain, trypsin and their combination for the 50% reduction in the density of cellular surface molecules.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Behandlung von septischem Schock. Bevorzugte proteolytische Enzyme sind Trypsin, Bromelain und Papain. Außerdem kann Rutosid verwendet werden.

Description

Verwendung proteolytischer Enyzme zur Behandlung von septischem Schock
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enyzm und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von septischem Schock.
Das Immunsystem ist eine biologische Funktionseinheit mit hochspezifischen Reaktionsabläufen sowohl auf humoraler wie auch auf zellulärer Ebene. Störungen in diesem komplexen System sind an der Entstehung zahlreicher Krankheiten ursächlich beteiligt. So führen Defekte in der Entwicklung des Immunsystems zu sogenannten Immundefektkrankheiten, wie z.B. auch einem septischen Schock, der lebensbedrohliche Ausmaße annehmen kann.
Beim septischen Schock kommt es zu einer kritischen Verminderung der Mikro- zirkulation mit Hypoxie der Gewebe und metabolischen Störungen. Der septische Schock wird bevorzugt von gram-negativen Bakterien, oft mit einer Verbrauchs- koagulopathie, ausgelöst. Durch den Blutdruckabfall im Schock kommt es zur Ausschüttung von Katechoiaminen mit Herzfrequenzanstieg und Engstellung von Arteriolen und venösen Kapazitätsgefäßen. Durch diese Regulationsmechanismen kann anfangs der arterielle Blutdruck noch normal sein. Entsprechend der unterschiedlichen Verteilung von α- und ß-Rezeptoren erfolgt eine Umverteilung der zirkulierenden Restblutmenge, um die Durchblutung von Herz und Hirn zu gewährleisten. Während anfangs ein kompensatorisches Einströmen von intersti- tieller Flüssigkeit in die Strombahn besteht, kommt es mit zunehmender Gewebs- hypoxie und Ansammlung sauerer Metabolite zu transkapillären Verlusten an in- travasaler Flüssigkeit und somit zur Verstärkung des Volumenmangels. Die präkapillaren Gefäßabschnitte reagieren auf die Azidose empfindlicher als die post- kapillären; deshalb resultiert eine Atonie der präkapillaren Gefäßabschnitte bei noch bestehender Konstriktion der postkapillären Abschnitte: dadurch kommt es zu lokaler Abschließung von Blut und Ausbildung von Mikrothromben. Die "Schockspirale" kann an verschiedenen Stellen beginnen; hat sich der Teufelskreis einmal geschlossen, schreitet das Geschehen auch unabhängig von der auslösenden Ursache kontinuierlich weiter. Bei septischem Schock kommt es häufig zu Fieber, Unruhe und Verwirrtheit und zusätzlich zu einer Hyperventila- tion.
Bei der Therapie beginnt man zunächst mit einer Beseitigung bzw. Therapie der Ursache des Schocks. Zusätzlich wird eine symptomatische Therapie durchgeführt, die in einer Überwachung verschiedener Parameter, wie Puls und Blutdruck, besteht sowie in Allgemeinmaßnahmen, wie dem Freihalten von Atemwegen, dem Schutz vor Wärmeverlust oder einer Sauerstoffgabe durch eine Nasensonde. Zusätzlich ist eine Therapie mit Breitbandantibiotika und eine Volumensubstitution angezeigt. Heparin in niedriger Dosierung und Antithrombin-Ill können zur Prophylaxe und Therapie von Komplikationen gegeben werden.
Wichtige Stoffwechsel Stoffe bei der Auslösung des septischen Schocks sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Proteine mit Molekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zelloberflä- chenrezeptoren aufweist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen hergestellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Organsystem. Die Namen, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, folgen keinem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biologischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumomekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken diese zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der Induktion von Entzündungen, Schock und Tod.
In ihrer Kombination können sie z.B. einen letalen septischen Schock bei Tieren erzeugen. Ein starkes Interesse hat sich auf IL-1 und TNF als wesentliches Element bei der Entstehung von Krankheiten, wie z.B. auch dem septischen Schock, und bei der Produktion von systemischen Akutphasenreaktionen gerichtet. Neutralisierende Antikörper gegen murines oder humanes TNF schützen Mäuse, Kaninchen und Primaten gegen den Tod durch septischen Schock. Diese Experimente waren die ersten, die zeigten, daß eine Cytokinblockade eine potentielle Strategie für die Behandlung des septischen Schocksyndroms war. Die Menge an IL-1 und IL-6, die nach Injektion von E. coli, d.h. LPS als Auslöser eines septischen Schocks, noch zirkulierten, ist deutlich reduziert, wenn die Tiere mit Anti-TNF-Antikörpem vorbehandelt werden, was nahelegt, daß TNF einen Signifikaten Stimulus für die IL-1- und IL-6-Synthese zur Verfügung stellt. Daher kann die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern gegen TNF oder gegen IL-1 -Rezeptoren die Konsequenzen des septischen Schocks, reduzieren.
Antikörper stellen für die humorale Antwort wesentliche Moleküle dar. Die den Antikörper bildenden schweren und leichten Proteinketten sind jeweils in verschiedene funktioneile Domänen unterteilt. So ist die variable Domäne der schweren Kette VH an der Bindung des Antigens beteiligt, und die nachfolgenden Domänen CH1 , CH2 und CH3 sind für die sogenannten Effektorfunktionen eines Antikörpers, wie beispielsweise die Bindung von Komplementproteinen, verantwortlich. Insbesondere die CH2-Domäne ist am initialen Schritt der Komplementaktivierung beteiligt.
Das Vorhandensein einer CH2-Domäne ist jedoch nicht auf Immunglobuline beschränkt, sondern die C 2-Struktur ist beispielsweise auch in T-Zell-Rezeptor- proteinen, Zeiladhäsionsmolekülen und den im Haupthistokompatibilitätskomplex kodierten Proteinen der Klasse I und II sehr ähnlich vorhanden. Zahlreiche Proteine mit einer zu der Domänenstruktur der Immunglobuline ähnlichen Struktur werden zu den Proteinen der sogenannten immunglobulinsupei amilie zusammengefaßt. Eine Übersicht über Proteine, enthaltend eine CH2-Struktur, ist gegeben in A.F. Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily-Domains for Cell Surface Recognition", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.
Im folgenden wird unter dem Begriff CH2-Struktur bzw. CH2-Domäne der Bereich eines Proteinmoleküls verstanden, der eine ähnliche Struktur wie die CH2- Domäne von IgG aufweist. In der Literatur wird für eine solche Struktur auch der Begriff C2-Domäne oder C2-Set verwendet. Wie oben für die Immunglobuline erläutert, besitzt die CH2-Struktur auch in den weiteren Mitgliedern der Immunglobulinsuperfamilie häufig eine Effektorfunktion, die an der Entstehung verschiedenster Krankheitsbilder, unter anderem dem septischen Schock, beteiligt sein kann.
In Tabelle 1 sind die immunologischen Reaktionspartner für eine CH2-Struktur aus verschiedenen Proteinen sowie die durch die Interaktion der CH2-Struktur mit dem immunologischen Reaktionspartner hervorrufbaren pathoimmunologischen bzw. physiologischen Folgereaktionen aufgelistet.
TABELLE 1
Stoffe, die solche Antikörper positiv oder negativ beeinflussen, könnten daher eine wichtige Rolle bei der Behandlung des septischen Schocks spielen.
Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zugrunde, Stoffe anzugeben, die zur Behandlung des septischen Schocks verwendbar sind.
Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von septischem Schock vorgesehen.
Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Immunglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähigkeit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1 q-bindende Immunglobuline (Subklassen lgG1 , lgG2, lgG3, IgM und teilweise IgA).
Die geänderte C1q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der CH2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enyzmatisch verursachte Änderung unmittelbar in der CH2- Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Strukturänderung in den der CH2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der CH2-Domäne. Die Behandlung von Neutrophilen mit proteolytischen Enzymen reduzierte deutlich die Expression z.B. des Rezeptors III für den Fc-Bereich von IgG und beeinflußt offenbar auch die Anzahl von Fcγ-R-Il auf der Zelloberfläche. Es wird dabei die Bindung von IgG bedeckten Erytrozyten an Neutrophile verstärkt; ferner wird auch ihre Fähigkeit, IgG-vermittelte Funktionen, wie z.B. die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität und Chemolumineszenz, die durch IgE induziert werden, verstärkt. Diese Reaktionen sind komplett abhängig von Fcγ-R-Il.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und gegebenenfalls Rutin verwendet oder eine Kombination derselben.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.
Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert werden.
Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya gewonnen wird. Reines Papain ist ein kristalines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäureresten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Proteinspaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstellung, in der Lederzubereitung, in der Tex- til-lndustrie zum Entbasten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur enzymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reinigungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwendet worden.
Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzmen bereits therapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG. von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist bekannt.
Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswerten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme bei der Behandlung des septischen Schocks hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädigenden Nebenwirkungen auftreten.
Weiterhin kann zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt werden. Rutosid ist ein Glycosid, das zu den Flavonoiden gehört.
Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid x 3H2O.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid x 3H2O verwendet. Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten.
Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z.B. Lactose, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Di- butylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Camaubawachs in Frage.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläutern.
Beispiel 1
Material und Methoden
1. Material
Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHCθ3 (Biochrom, 2 g/1 ); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom,
1 mM), NaN3 (Sigma, 0,01 %).
Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phythämagglutinin M (Biochrom, 5 μg/ml) oder γ-lnterferon (100 U/ml) eingesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (Biochrom).
Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch isolierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten eingesetzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lympho- zyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten. 2. Verwendete monoklonale Antikörper
Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leukozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden An- tigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten An- tigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuchten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.
Übersicht 1 : Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklonale Antikör- , per und Targetzelien der Enzymbehandlung
1 Phycoerythrin, rote Fluoreszenz; FFlluuoorreesszzeeiinniissootthhiiooicyanat, grüne Fluoreszenz;
3 3 BBeeccttoonn DDiicckkiinnssoonn,, Heidelberg;
4 Ortho Diagnostics
3. Inkubationsbedinqungen
Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den Enzymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mischung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 (Bromelain : Papain : Trypsin, bezogen auf 40 μg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 μg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt. Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01 % Natriumazid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des Inkubationsprozesses oder der Waschvorgänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).
Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen Enzymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analyse der Oberflächenmarker vorgenommen.
4. Analytische Durchflußcytometrie
Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezifischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Einstellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d.h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wurden, erfolgte die Messung.
Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine entsprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus- Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytometrisch erfaßt wird.
Pro Histogramm wurden 10 000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zellpopulation wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" separiert, in dem sich dann mindestens 3 500 Zellen befanden.
5. Darstellung der Ergebnisse
Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezifischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kontrollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogrammen der enzymbehandelten Zellen verglichen.
Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber relativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzelmessungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leukozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptordichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.
Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.
Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Mediän der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmoleküls in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen.
In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthalten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40 % angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40 % aller Oberflächenmoleküle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische monoklonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistung gegenüber den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20 % werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.
Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen Antigene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen unter standardisierten Inkubationsbedin- gungen durchgeführt. Damit kann für diese experimentellen Bedingungen die aus früheren Forschungsberichten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben werden.
Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mittels nichtlinearer Regression ausgewertet. Der Mediän der Fluoreszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Referenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Reduktion der relativen Fluoreszenzintensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.
Abbildung 1 : CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1 ) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 2: CD4 (Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 3: CD4 (Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Trypsin; angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA-Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 5: Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wurden mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a markiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Halbeffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefit- tete Kurve berechnet.
Ergebnisse
Tabelle 1 : CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Mediums der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 11 ,1 17,9 17,4
2 6,1 12,2 14,3
3 0 0 0
Papain 1 22,4 21 ,4 34,7
2 5,4 9,5 17,0
3 0 0 0 Trypsin 1 75,7 73,6 73,0
2 83,7 21 ,1 0,7
3 96,3 85,4 50,9
BPT 1 71 ,9 54,7 38,2
2 74,1 8,8 18,4
3 94,8 72,6 25,2
Tabelle 2: CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 24,6 0 0 2 16,2 0 0
Papain 1 2,5 3,2 0 2 0 0 5,7
Trypsin 1 99,3 93,0 64,1 2 99,4 96,2 57,5
BPT 1 98,3 49,3 23,0 2 99,4 79,2 20,2
Tabelle 3: Modulation der CD4-Epitope Leu3a und OKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt.
Enzym Epitop 40 μg/ml 20 μg/ml 10 μg/ml
Trypsin Leu3a 9 988,,55 96,7 87,1
OKT4 66,,55 6,3 19,5
Epitop 55 μμgg//mmll 2,5 μg/ml 1 ,25 μg/ml
Trypsin Leu3a 6655,,22 41 ,9 28,8
OKT4 1133,,33 10,8 9,3 Tabelle 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuliert.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 90,7 80,1 59,7 2 62,6 43,6 0
Papain 1 92,2 81 ,0 60,7 2 62,6 43,6 0
Trypsin 1 91 ,2 88,2 71 ,0 2 78,9 73,9 52,8
BPT 1 92,1 89,7 50,9 2 79,4 44,1 12,2
Tabelle 5: Berechnete Halbeffektkonzentration (μg/ml) von Bromelain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50 %ige Reduktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen.
Enzyme CD2 CD43 CD254
Bromelain Halbeffektkonz.1 n w n w 18,4
Bereich2 - - 14-23
Papain Halbeffektkonz.1 n w n w 12,4
Bereich2 - - 11-14
Trypsin Halbeffektkonz.1 1 ,5 2,5 < 2,5
Bereich2 1-2 2,3-3,1
B-P-T5 Halbeffektkonz.1 9,3 16,4 16,0
Bereich2 7,5-14 15,5-18 13-19
1 berechnet aus Mittelwerten von 2 oder 3 unabhängigen Experimenten
2 minimaler und maximaler Wert, 95 % Konfidenzbereich = 1 δ, geschätzt
3 Modulation von CD4-Epitop Leu3a
4 auf stimulierten Zellen präsent
5 Mischung der Proteasen im Verhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 -Bromelain : Papain : Trypsin n w: nicht wirksam im untersuchten System (max. 40 μg Enzym/ml, 1 h Inkubation)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von septischem Schock.
2. Vewendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Enzyme verwendet wird.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 100 mg, vorzugsweise 10 mg Rutosid x 3H2O pro Dosiseinheit verwendet werden.
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