DE19726248A1

DE19726248A1 - Verwendung proteolytischer Enzyme zur Behandlung von septischem Schock

Info

Publication number: DE19726248A1
Application number: DE19726248A
Authority: DE
Inventors: Karl Ransberger; Gerhard Dr Stauder
Original assignee: Mucos Pharma GmbH and Co
Current assignee: Mucos Pharma GmbH and Co
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 1998-12-24
Anticipated expiration: 2017-06-21
Also published as: DE19726248C2; WO1998058664A1; EP0920334A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Be handlung von septischem Schock.

Das Immunsystem ist eine biologische Funktionseinheit mit hoch spezifischen Reaktionsabläufen sowohl auf humoraler wie auch auf zellulärer Ebene. Störungen in diesem komplexen System sind an der Entstehung zahlreicher Krankheiten ursächlich beteiligt. So führen Defekte in der Entwicklung des Immunsystems zu sogenann ten Immundefektkrankheiten, wie z. B. auch einem septischen Schock, der lebensbedrohliche Ausmaße annehmen kann.

Beim septischen Schock kommt es zu einer kritischen Verminderung der Mikrozirkulation mit Hypoxie der Gewebe und metabolischen Störungen. Der septische Schock wird bevorzugt von gram-negati ven Bakterien, oft mit einer Verbrauchskoagulopathie, ausgelöst. Durch den Blutdruckabfall im Schock kommt es zur Ausschüttung von Katecholaminen mit Herzfrequenzanstieg und Engstellung von Arteriolen und venösen Kapazitätsgefäßen. Durch diese Regulati onsmechanismen kann anfangs der arterielle Blutdruck noch normal sein. Entsprechend der unterschiedlichen Verteilung von α- und β- Rezeptoren erfolgt eine Umverteilung der zirkulierenden Rest blutmenge, um die Durchblutung von Herz und Hirn zu gewährlei sten. Während anfangs ein kompensatorisches Einströmen von in terstitieller Flüssigkeit in die Strombahn besteht, kommt es mit zunehmender Gewebshypoxie und Ansammlung sauerer Metabolite zu transkapillären Verlusten an intravasaler Flüssigkeit und somit zur Verstärkung des Volumenmangels. Die präkapillaren Gefäßab schnitte reagieren auf die Azidose empfindlicher als die postka pillären; deshalb resultiert eine Atonie der präkapillaren Ge fäßabschnitte bei noch bestehender Konstriktion der postkapillä ren Abschnitte: dadurch kommt es zu lokaler Abschließung von Blut und Ausbildung von Mikrothromben. Die "Schockspirale" kann an verschiedenen Stellen beginnen; hat sich der Teufelskreis einmal geschlossen, schreitet das Geschehen auch unabhängig von der auslösenden Ursache kontinuierlich weiter. Bei septischem Schock kommt es häufig zu Fieber, Unruhe und Verwirrtheit und zusätzlich zu einer Hyperventilation.

Bei der Therapie beginnt man zunächst mit einer Beseitigung bzw. Therapie der Ursache des Schocks. Zusätzlich wird eine symptoma tische Therapie durchgeführt, die in einer Überwachung verschie dener Paraineter, wie Puls und Blutdruck, besteht sowie in Allge meinmaßnahmen, wie dem Freihalten von Atemwegen, dem Schutz vor Wärmeverlust oder einer Sauerstoffgabe durch eine Nasensonde. Zusätzlich ist eine Therapie mit Breitbandantibiotika und eine Volumensubstitution angezeigt. Heparin in niedriger Dosierung und Antithrombin-III können zur Prophylaxe und Therapie von Kom plikationen gegeben werden.

Wichtige Stoffwechselstoffe bei der Auslösung des septischen Schocks sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Proteine mit Mo lekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zelloberflächenrezeptoren aufweist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen herge stellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Organsystem. Die Na men, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, folgen kei nem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biolo gischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumornekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken die se zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der Indukti on von Entzündungen, Schock und Tod.

In ihrer Kombination können sie z. B. einen letalen septischen Schock bei Tieren erzeugen. Ein starkes Interesse hat sich auf IL-1 und TNF als wesentliches Element bei der Entstehung von Krankheiten, wie z. B. auch dem septischen Schock, und bei der Produktion von systemischen Akutphasenreaktionen gerichtet. Neu tralisierende Antikörper gegen murines oder humanes TNF schützen Mäuse, Kaninchen und Primaten gegen den Tod durch septischen Schock.

Diese Experimente waren die ersten, die zeigten, daß eine Cyto kinblockade eine potentielle Strategie für die Behandlung des septischen Schocksyndroms war. Die Menge an IL-1 und IL-6, die nach Injektion von E. coli, d. h. LPS als Auslöser eines septi schen Schocks, noch zirkulierten, ist deutlich reduziert, wenn die Tiere mit Anti-TNF-Antikörpern vorbehandelt werden, was na helegt, daß TNF einen signifikaten Stimulus für die IL-1- und IL-6-Synthese zur Verfügung stellt. Daher kann die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern gegen TNF oder gegen IL-1- Rezeptoren die Konsequenzen des septischen Schocks, reduzieren.

Antikörper stellen für die humorale Antwort wesentliche Moleküle dar. Die den Antikörper bildenden schweren und leichten Protein ketten sind jeweils in verschiedene funktionelle Domänen unter teilt. So ist die variable Domäne der schweren Kette VH an der Bindung des Antigens beteiligt, und die nachfolgenden Domänen C_H1, C_H2 und C_H3 sind für die sogenannten Effektorfunktionen ei nes Antikörpers, wie beispielsweise die Bindung von Komplement proteinen, verantwortlich. Insbesondere die C_H2-Domäne ist am in itialen Schritt der Komplementaktivierung beteiligt.

Das Vorhandensein einer C_H2-Domäne ist jedoch nicht auf Immunglo buline beschränkt, sondern die C_H2-Struktur ist beispielsweise auch in T-Zell-Rezeptorproteinen, Zelladhäsionsmolekülen und den im Haupthistokompatibilitätskomplex kodierten Proteinen der Klasse I und II sehr ähnlich vorhanden. Zahlreiche Proteine mit einer zu der Domänenstruktur der Immunglobuline ähnlichen Struk tur werden zu den Proteinen der sogenannten Immunglobulinsuper familie zusammengefaßt. Eine Übersicht über Proteine, enthaltend eine C_H2-Struktur, ist gegeben in A.F. Williams and Barcley, "The Immunoglobulin Superfamily-Domains for Cell Surface Recogniti on", Ann. Rev. Immunol., 1988, 6, 381-405.

Im folgenden wird unter dem Begriff C_H2-Struktur bzw. C_H2-Domäne der Bereich eines Proteinmoleküls verstanden, der eine ähnliche Struktur wie die C_H2-Domäne von IgG aufweist. In der Literatur wird für eine solche Struktur auch der Begriff C2-Domäne oder C2-Set verwendet.

Wie oben für die Immunglobuline erläutert, besitzt die C_H2- Struktur auch in den weiteren Mitgliedern der Immunglobulinsu perfamilie häufig eine Effektorfunktion, die an der Entstehung verschiedenster Krankheitsbilder, unter anderem dem septischen Schock, beteiligt sein kann.

In Tabelle 1 sind die immunologischen Reaktionspartner für eine C_H2-Struktur aus verschiedenen Proteinen sowie die durch die In teraktion der C_H2-Struktur mit dem immunologischen Reaktionspart ner hervorrufbaren pathoimmunologischen bzw. physiologischen Folgereaktionen aufgelistet.

Immunologische Reaktionspartner von C_H2-haltigen Strukturen

Stoffe, die solche Antikörper positiv oder negativ beeinflussen, könnten daher eine wichtige Rolle bei der Behandlung des septi schen Schocks spielen.

Der vorliegenden Erfindung lag daher das technische Problem zu grunde, Stoffe anzugeben, die zur Behandlung des septischen Schocks verwendbar sind.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteo lytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Behandlung von septischem Schock vorgesehen.

Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Im munglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähig keit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1q-bindende Immunglobuline (Subklassen IgG1, IgG2, IgG3, IgM und teilweise IgA).

Die geänderte C1q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der C_H2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enyzmatisch verursachte Änderung unmittelbar in der C_H2-Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Struktu ränderung in den der C_H2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der C_H2-Domäne.

Die Behandlung von Neutrophilen mit proteolytischen Enzymen re duzierte deutlich die Expression z. B. des Rezeptors III für den Fc-Bereich von IgG und beeinflußt offenbar auch die Anzahl von Fcγ-R-II auf der Zelloberfläche. Es wird dabei die Bindung von IgG bedeckten Erytrozyten an Neutrophile verstärkt; ferner wird auch ihre Fähigkeit, IgG-vermittelte Funktionen, wie z. B. die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität und Chemolumines zenz, die durch IgE induziert werden, verstärkt. Diese Reaktio nen sind komplett abhängig von Fcγ-R-II.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und gegebenenfalls Rutin ver wendet oder eine Kombination derselben.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.

Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert wer den.

Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya ge wonnen wird. Reines Papain ist ein kristalines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäurere sten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Protein-spaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstel lung, in der Lederzubereitung, in der Textil-Industrie zum Ent basten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur en zymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reini gungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwen det worden.

Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzymen bereits the rapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG. von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist be kannt.

Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswerten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme bei der Behandlung des septischen Schocks hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädigenden Nebenwirkungen auftreten.

Weiterhin kann zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt werden. Rutosid ist ein Glycosid, das zu den Flavonoiden gehört.

Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Brome lain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid×3H₂O.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombina tion von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid×3H₂O verwendet.

Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trä gerstoffe enthalten.

Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z. B. Lactose, Magnesiumstea rat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Dibutylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Carnaubawachs in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläu tern.

Beispiel 1 Material und Methoden 1. Material

Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHCO₃ (Biochrom, 2 g/l); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom, 1 mM), NaN₃ (Sigma, 0,01%).

Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phythämag glutinin M (Biochrom, 5 µg/ml) oder γ-Interferon (100 U/ml) ein gesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (Biochrom).

Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch iso lierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten einge setzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lymphozyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten.

2. verwendete monoklonale Antikörper

Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leu kozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden Antigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten Antigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuch ten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.

Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklo nale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung

3. Inkubationsbedingungen

Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den En zymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mi schung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 15,5 : 11,9 (Bromelain : Papain : Trypsin, bezogen auf 40 µg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 µg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt.

Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01% Natriumazid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des In kubationsprozesses oder der Waschvorgänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).

Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen En zymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analy se der Oberflächenmarker vorgenommen.

4. Analytische Durchflußcytometrie

Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezi fischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Ein stellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d. h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wur den, erfolgte die Messung.

Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine ent sprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus-Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytome trisch erfaßt wird.

Pro Histogramm wurden 10 000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zell population wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" se pariert, in dem sich dann mindestens 3 500 Zellen befanden.

5. Darstellung der Ergebnisse

Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezi fischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kon trollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogram men der enzymbehandelten Zellen verglichen.

Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber re lativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzel messungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leu kozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptor dichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.

Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.

Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Median der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmo leküls in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen.

In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthal ten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40% angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40% aller Oberflächenmole küle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische mono klonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistung gegen über den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20% werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.

Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen An tigene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen un ter standardisierten Inkubationsbedingungen durchgeführt. Damit kann für diese experimentellen Bedingungen die aus früheren For schungsberichten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben wer den.

Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mit tels nicht-linearer Regression ausgewertet. Der Median der Fluo reszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Re ferenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Redukti on der relativen Fluoreszenzintensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.

Abb. 1

CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lym phozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel len, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1) als Mittelwert von Doppelbestimmun gen und Standardabweichung.

Abb. 2

CD4 (Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; An gegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Tar getzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind un behandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklona len Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbe handelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 3

CD4 (Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Tryp sin; angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensi tät; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen mono klonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wur den. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Darge stellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittel wert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 4

CD25-Modulation durch Proteasen, Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA-Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel len, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Stan dardabweichung.

Abb. 5

Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wur den mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a mar kiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Hal beffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefittete Kurve berechnet.

Ergebnisse Tabelle 1

CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lympho zyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Mediums der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei ver schiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 2

CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Tar getzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen be trug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 3

Modulation der CD4-Epitope Leu3a und CKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozen tuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensi tät, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt.

Tabelle 4

CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lym phozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den En zymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimen ten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuliert.

Tabelle 5

Berechnete Halbeffektkonzentration (µg/ml) von Brome lain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50%ige Re duktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen.

Claims

1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und ge gebenenfalls Rutosid zur Behandlung von septischem Schock.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Enzyme verwendet wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.

4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.

6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.

7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 100 mg, vorzugsweise 10 mg Rutosid×3H₂O pro Dosiseinheit verwendet werden.