EP0424413A1 - Dna-segment, plasmide, die dieses segment enthalten, transformierte bakterien sowie transformiertes pflanzenmaterial - Google Patents

Dna-segment, plasmide, die dieses segment enthalten, transformierte bakterien sowie transformiertes pflanzenmaterial

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Publication number
EP0424413A1
EP0424413A1 EP19890907148 EP89907148A EP0424413A1 EP 0424413 A1 EP0424413 A1 EP 0424413A1 EP 19890907148 EP19890907148 EP 19890907148 EP 89907148 A EP89907148 A EP 89907148A EP 0424413 A1 EP0424413 A1 EP 0424413A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plasmid
dna
transformed
bacteria
segment
Prior art date
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Ceased
Application number
EP19890907148
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Strasser
Arnold Bito
Markus Susani
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agrolinz Agrarchemikalien GmbH
Original Assignee
Agrolinz Agrarchemikalien GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Agrolinz Agrarchemikalien GmbH filed Critical Agrolinz Agrarchemikalien GmbH
Publication of EP0424413A1 publication Critical patent/EP0424413A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • DNA segment DNA segment, plasmids containing this segment, transformed bacteria, and transformed plant material
  • the invention relates to a DNA segment, the gene product of which is suitable for rendering an oriV sequence in ice or trans capable of replication, as well as plasmids containing this segment, bacteria transformed by these plasmids, and transformed plant material and seed from transformed plant material.
  • the naturally occurring plasmid RK2 which is identical or nearly identical to the plasmids RP1, RP4, R18 and R86 of the incompatibility group P1, is a broad host rank plasmid which has resistance genes against the antibiotics tetracycline ampicillin and kanamycin.
  • the sequence of the vegetative origins (oriV) and the gene product of the transacting factor A gene (trfA) is sufficient for replication (FIG. 1).
  • the base sequence of the trfA gene was elucidated in Christopher A. Smith and Christopher M. Thomas, J. Mol. Biol. (1984), 175, pp 251-262. It enables the replication of oriV in many species of gram-negative bacteria.
  • the plasmid has a complicated replication system.
  • pRK 290 a tetracycline-resistant plasmid component of the RK2 plasmid known as pRK 290 (FIG. 2).
  • pRK 290 can be transferred using an auxiliary plasmid, but does not itself have the ability to transfer itself or other plasmids.
  • the plasmid is 20 Kb in size, so it is a relatively large plasmid which is also difficult to isolate and is also only present in low copy numbers (5-8 copies per chromosome equivalent in Eschericha coli).
  • the present invention accordingly relates to a DNA segment whose gene product is suitable for making an oriV sequence capable of replication in ice or trans, which is characterized in that the segment is a sequence selected from a group containing the following nucleotide sequence
  • the gene product of this sequence and sequences derived therefrom enables the replication of plasmids which contain the oriV in a number of microorganisms, in particular in gram-negative bacteria.
  • Another object of the invention is a method for producing the DNA segment according to the invention, which is characterized in that the plasmid pRK 290 is cut with the restriction endonuclease SpH I, the DNA piece between 17.8 kb and 8.3 kb with the aid ligated the T4 DNA ligase, again with the
  • Restriction endonuclease SpH I cuts, into which the plasmid pUC 18 inserts, ligated with the aid of the T4 DNA ligase, linearized this plasmid with the restriction endonuclease Kpn I and shortened from both ends with the exonuclease Bai 31, the extent of the shortening using Gel electrophoresis is checked and the ends are ligated with T4 DNA ligase.
  • the DNA segment according to the invention is produced starting from plasmid pRK 290 by various DNA-modifying enzymes. These are initially restriction endonucleases that cut double-stranded DNA in the region of a defined recognition sequence.
  • Exonuclease Bai 31 is used to delete larger areas of plasmid DNA, the single- or double-stranded linearized DNA continuously degrades approximately symmetrically from the ends and thereby leaves blunt ends. The extent of the shortening is checked by gel electrophoresis and the plasmid DNA is then ligated again with a DNA ligase.
  • the DNA segment according to the invention is a fusion gene composed of transacting factor B and transacting factor A, although the complete base sequences of the structural genes are not retained.
  • the first 25 amino acids of the trfA protein would be replaced in the gene product of this sequence, by the first 117 amino acids of a protein IncC encoded on the trfB gene or by the first 12 amino acids of another peptide (P 259) (CM.Thomas CASmith, Nucleic Acid Res. 14 (11), 4453 (1986).
  • the nucleotide sequence GTG which codes for the amino acid valine, has arisen at the fusion site.
  • the DNA segment according to the invention is not restricted to this nucleotide sequence , but also includes subfragments and mutants thereof whose gene products have essentially the same ability to make an oriV sequence replicable in ice or trans.
  • Another object of the invention is a recombinant plasmid containing a DNA segment according to claim 1.
  • Me thoden derivatives are produced which contain, for example, other resistance genes such as kanamycin or ampicillin resistance genes or the border sequences of Ti (tumor inducing) or Ri (root inducing) plasmids.
  • Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes contain natural plasmids, Ti-plasmids and Ri-plasmids, which due to certain functional components have the ability to transfer DNA segments in plants. In particular, these segments contain sequences that contain information on the synthesis of growth hormones. For transmission in.
  • flanking base pairs of these sequences which contain about 30 base pairs and are almost identical on both sides, are required for the plant cell.
  • These border sequences are the actual requirement for the transfer of the intervening pieces of DNA into the plant cell. Any pieces of DNA lying between the border sequences can be transferred into the plant cell.
  • the invention further relates to microorganisms, in particular gram-negative bacteria, which have been transformed with a plasmid containing one of the DNA sequences according to the invention.
  • a suitable bacterial strain for example E. coli HB. 101, E. coli JM 103, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas species and the like, is used for the transformation in a manner known per se. The like. Treated with a suitable transformation buffer, and mixed with plasmid DNA. The transformants are then selected, for example, by plating.
  • Another object of the invention is plant material which has been transformed by agrobacteria which contain a plasmid according to the invention, and Seed from this plant material.
  • the transformation of plant material by means of agrobacteria is described, for example, in Chiiton MD, Drummond MJ, Merlo DJ, Sciaky D., Montoja, AL, Gordon MP, Nester EW, Cell 11, (1977) pp 263-271; Chiiton MD, Tepfer DA, Davin c, Casse-Dellart F., Tempe J., Natur ⁇ 295 (1982) pp 432-434 and Barton KA, Chiiton MD, Methods in Enzym. 101 (1983) pp 527-539
  • the plasmid pRK 290 was with the restriction endonucleosis Sph I (from
  • Steptomycees phaeochromogenes at the interfaces SP (Fig. 2) with the
  • Bal 31 is.
  • the sequences of the trfB and the trfA are approximately equidistant from this Kpn I restriction site by the insertion of the pUC18.
  • Plasmid II was therefore initially with the restriction endonuclease KPnl (in one
  • Incubation buffer consisting of 10 mmol / l Tris HCl (pH 7.5), linearized 10 mmol / l MgCl 2 and 1 mmol / l dithiothreitol and then with the exonuclease Bal
  • Plasmid containing a DNA segment of claim 1 ligated. Transformation of the E.coli HB 101.
  • the transformation of the E-col ⁇ strain can be carried out in a manner known per se, for example according to that in Mandel M., and Higa AJ Mol. Biol. 53 159-162 (1970), and Cohen, SN, Chang, ACY, and Hsu, L Proc. Natl. Acad. Sei., USA 69, 2110-2114 (1972).
  • Lurea Broth - a nutrient medium consisting of meat extract, yeast extract and salt - is inoculated with 1 ml preculture of E.coli HB 101 and shaken at 37oC until a quarter of the maximum cell density (extinction in the photometer approx. 0.4 - 0, 6) is reached.
  • the cells are harvested by centrifugation at 5000 rpm and suspended in ice in 25 ml transformation buffer consisting of 150 mmol KCl, 50 mmol CaCl 2 , 5 mmol MgCl 2 and 1 mmol Tris HCl (pH 7.5). After centrifugation again, the cells are resuspended in 2 ml of transformation buffer. From this suspension, 0.1 ml of plasmid DNA (pPS 99) is added while cooling with ice, warmed to 42 ° C. after 1 hour and 1.2 ml of Lurea Broth at 37 ° C. after 90 seconds. After 5 - 15 minutes, it is plated on selection agar (Lurea Broth with 1.5% agar and a suitable antibiotic). The transformants are visible after 15-24 hours.
  • transformation buffer consisting of 150 mmol KCl, 50 mmol CaCl 2 , 5 mmol MgCl 2 and 1 mmol Tris HCl (pH 7.5). After centr
  • YEP 1% yeast extract, 1% pept ⁇ n, 0.5% NaCl
  • the cells were then plated on selection agar Nutrient broth (0.8% Nutrient broth, 1.5% agar) or on YEP (with 1.5% agar) with the desired antibiotic.
  • agrobacteria were transformed with the plasmids shown in FIG. 3 and in each case transformants were obtained which had the desired phenotype (antibiotic resistance (s)).
  • the plasmids used could be recovered from these transformants, which could be demonstrated by transforming Escherichia coli with this DNA and subsequent restriction analysis.
  • Amp r ampicillin resistance gene Tet r tetracycline resistance gene
  • NPT neomycin phosphotransferase gene, encoding kanamycin resistance
  • Pnos promoter of nopaline synathetase
  • SNPT structural gene of the NPT
  • Tnos terminator of the nopaline synthetethase gene
  • F fusion site of the trfA structural gene with the trfB region, right piece of the T-DNA of the Ti plasmid as a left recombination fragment.
  • EcoRI, Bglll, PvuII, BamHI, Aval, Hindill, Kpnl restriction enzymes
  • the PnosSNPTTnos unit can cause neomycin and kanamycin resistance in plants.

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Description

DNA-Segment, Plasmide, die dieses Segment enthalten, transformierte Bakterien, sowie transformiertes Pflanzenmaterial
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in eis oder in trans replikationsfähig zu machen, sowie Plasmide, die dieses Segment enthalten, durch diese Plasmide transformierte Bakterien, sowie transformiertes Pflanzenmaterial und Saatgut aus transformiertem Pflanzenmaterial.
Das natürlich vorkommende Plasmid RK2, das identisch oder nahezu identisch ist mit den Plasmiden RP1, RP4, R18 und R86 der Inkompatibilitätsgruppe P1, ist ein broad host ränge Plasmid, das Resistenzgene gegen die Antibiotika Tetracyclin Ampicillin und Kanamycin aufweist. Die Sequenz des vegetativen Origins (oriV) und das Genprodukt des transacting factor A Gens (trfA) ist für die Replikation hinreichend (Fig. 1). Die Basensequenz des trfA Gens wurde in Christopher A. Smith und Christopher M. Thomas, J. Mol. Biol. (1984), 175, pp 251 - 262 aufgeklärt. Es ermöglicht die Replikation des oriV in vielen Spezies von gramnegativen Bakterien. Das Plasmid besitzt jedoch ein kompliziertes Replikationssystem. Für die routinemäßige Anwendung ist aber auch seine Größe von 56 Kilobasenpaaren (Kb) ein großer Nachteil. Es wurde versucht, diese Nachteile durch Konstruktion kleinerer Plasmide ausgehend von RK2-Plasmid zu beheben. So ist aus Ditta et al, Proc Natl. Acad-Sci. Vol. 77 (12), Seiten 7347 - 7351, USA 1980 eine tetracyclinresistente Plasmidkomponente des RK2 Plasmids mit der Bezeichnung pRK 290 bekannt (Fig . 2). pRK 290 kann mit Hilfe eines Hilfsplasmids übertragen werden, besitzt aber selbst nicht die Fähigkeit sich selbst oder andere Plasmide zu übertragen. Das Plasmid ist 20 Kb groß, es ist also ein relativ großes Plasmid, das außerdem schwer isolierbar ist und außerdem nur in niedrigen Kopienzahlen vorhanden ist (5 - 8 Kopien pro Chromosomenäquivalent in Eschericha coli).
Es wurde nun gefunden, daß das in den Plasmiden RK2 und pRK 290 enthaltende trfA Gen, so mit dem trfB Gen, dessen Basensequenz in Nucleic Acid Res. 14 (11), 4453 beschrieben ist, unter Deletion dazwischenliegender Sequenzen fusioniert werden kann, daß eine DNA-Sequenz gebildet wird, deren Genprodukt die Replikation des oriV ermöglicht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in eis oder in trans replikationsfähig zu machen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Segment eine Sequenz, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend folgende Nukleotidsequenz
und Subfragmente und Mutanten davon, die im wesentlichen die gleiche Fähigkeit zur Replikation des oriV besitzen, enthält.
Das Genprodukt dieser Sequenz und davon abgeleiteter Sequenzen ermöglicht die Replikation von Plasmiden, die den oriV enthalten in einer Reihe von Mikroorganismen, insbesondere in gramnegativen Bakterien.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen DNA-Segments, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Plasmid pRK 290 mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, das DNA-Stück zwischen 17,8 kb und 8,3 kb mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, erneut mit der
Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, in die Schnittstelle das Plasmid pUC 18 einfügt, mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, dieses Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Kpn I linearisiert und mit der Exonuklease Bai 31 von beiden Enden her verkürzt, wobei das AusmaG der Verkürzung mittels Gelelektrophorese kontrolliert wird, worauf die Enden mit T4-DNA-Ligase ligiert werden. Das erfindungsgemäße DNA-Segment wird ausgehend von Plasmid pRK 290 durch verschiedene DNA-modifizierende Enzyme hergestellt. Dies sind zunächst Restriktionsendonukleasen, die doppelsträngige DNA im Bereich einer definierten Erkennungssequenz aufschneiden. Dabei entstehen Fragmente, an deren Enden entweder einzelsträngige Überhänge (cohäsive Enden, sticky ends) zurückbleiben, oder es werden beide Stränge am selben Basenpaar durchschnitten und es entstehen sog. stumpfe Enden oder blunt ends. Mit Hilfe einer DNA-Ligase werden diese Fragmente anschließend in der gewünschten Weise wieder zusammengesetzt (ligiert).
Dabei ist es möglich, blunt end Fragmente frei zu kombinieren, während bei sticky end Fragmenten Ligation nur möglich ist, wenn eine korrekte Basenpaarung der einzelsträngigen Überhänge gegeben ist.
Zur Deletion größerer Bereiche der Plasmid DNA wird die Exonuklease Bai 31 verwendet, die einzel- oder doppelsträngige linearisierte DNA von den Enden her kontinuierlich etwa symmetrisch abbaut und dabei blunt ends hinterläßt. Das Ausmaß der Verkürzung wird mittels Gelelektrophorese kontrolliert und die Plasmid DNA anschließend wieder mit einer DNA-Ligase ligiert.
Das erfindungsgemäße DNA-Segment ist ein Fusionsgen aus transacting factor B und transacting factor A, wobei jedoch nicht die vollständigen Basensequenzen der Strukturgene erhalten bleiben. In der im Anspruch 1 exemplarisch angegebenen Sequenz würden beispielsweise im Genprodukt dieser Sequenz die ersten 25 Aminosäuren des trfA-Proteins, durch die ersten 117 Aminosäuren eines am trfB-Gen codierten Proteins IncC oder durch die ersten 12 Aminosäuren eines anderen Peptids (P 259) ersetzt (CM.Thomas C.A.Smith, Nucleic Acid Res. 14 (11), 4453 (1986). An der Fusionsstelle ist die Nucleotidsequenz GTG, die für die Aminosäure Valin codiert, entstanden. Das erfindungsgemäße DNA-Segment ist jedoch nicht auf diese Nukleotidsequenz eingeschränkt, sondern umfaßt auch Subfragmente und Mutanten davon, deren Genprodukte im wesentlichen die gleiche Fähigkeit besitzen, eine oriV Sequenz in eis oder trans replikationsfähig zu machen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Plasmid, enthaltend ein DNA-Segment nach Anspruch 1.
Aus dem auf die oben beschriebene Weise hergestellten Plasmid, das ein erfindungsgemäßes DNA-Segment enthält, können durch dem Fachmann bekannte Me thoden Derivate hergestellt werden, die beispielsweise andere Resistenzgene wie Kanamycin- oder Ampicillinresistenzgene oder die Bordersequenzen von Ti (Tumorinducing) oder Ri (Rootinducing) Plasmiden enthalten. Agrobakterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes enthalten natürliche Plasmide, Ti- Plasmide bzw. Ri-Plasmide, die auf Grund bestimmter funktioneller Bestandteile die Fähigkeit besitzen DNA-Segmente in Pflanzen zu übertragen. Insbesondere enthalten diese Segmente Sequenzen, die Informationen zur Synthese von Wachstumshormonen enthalten. Für die Übertragung in . die Pflanzenzelle werden die flankierenden Basenpaare dieser Sequenzen benötigt, die etwa 30 Basenpaare enthalten und beiderseits nahezu identisch sind. Diese Bordersequenzen sind das eigentliche Erfordernis für die Übertragung der dazwischenliegenden DNA-Stücke in die Pflanzenzelle. Zwischen den Bordersequenzen liegende beliebige DNA-Stücke können in die Pflanzenzelle übertragen werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikoorganismen, insbesondere gram- negative Bakterien, die mit einem eine der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthaltenden Plasmid transformiert wurden.
Zur Transformation wird in an sich bekannter Weise ein geeigneter Bakterienstamm, beispielsweise E coli HB .101, E coli JM 103, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonasarten u. dgl. mit einem geeigneten Transformationspuffer behandelt, und mit Plasmid-DNÄ versetzt. Die Transformanten werden anschließend beispielsweise durch Plattieren selektiert.
Methoden zur Transformation von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Meth. in Enzymology Vol. 101, p. 527 ff (1983), Mol, Gen. Gen. Vol 163, 181 (1978), J. Mol. Biol. 53, 159 - 162 (1970), Proc. Natl. Acad. Sei., USA 69, 2110 - 2114 (1972) beschrieben. Da transformierte Bakterien eine mehr oder weniger ausgeprägte Tendenz aufweisen zu degenerieren, müssen die Bakterien unter günstigen Lebensbedingungen gehalten werden, um ihre künstlich erzeugten Fähigkeiten zu bewahren. Der Fachmann wird diese Bedingungen in Abhängigkeit vom verwendeten Bakterienstamm leicht bestimmten können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist Pflanzenmaterial, das durch Agrobakterien, die ein erfindungsgemäßen Plasmid enthalten, transformiert wurde, sowie Saatgut aus diesem Pflanzenmaterial. Die Transformation von Pflanzenmaterial mittels Agrobakterien ist beispielsweise in Chiiton M.D., Drummond M.J., Merlo D.J., Sciaky D., Montoja, A.L., Gordon M.P., Nester E.W., Cell 11, (1977) pp 263 -271; Chiiton M.D, Tepfer D.A., Davin c, Casse-Dellart F., Tempe J., Naturε 295 (1982) pp 432 - 434 sowie Barton K.A., Chiiton M.D., Methods in Enzym. 101 (1983) pp 527 - 539 beschrieben
Es besteht, wie bereits beschrieben, die Möglichkeit, jede zwischen den Bordersequenzen der Ti- oder Ri-Plasmide liegende Sequenz auf die Pflanze zu übertragen und somit ihre Eϊgenschften zu beeinflussen.
Beispiele:
1. Konstruktion eines Plasmids enthaltend ein erfindungsgemäßes DNA-Segments (Fig. 2). (pPS 99).
Das Plasmid pRK 290 wurde mit der Restriktionsendonucleose Sph I (aus
Steptomycees phaeochromogenes) an den Schnittstellen SP (Fig. 2) mit der
Erkennungssequenz geschnitten. Die Reaktion wird mit Plasmid-DNA
in einem Inkubationspuffer aus 10 mmol/1 TrisHCL, - 50 mmol/l NaCl, 10 mmol/1
MgCl2 und 1 mmol/l Dithiothreit (pH 7,5) bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wird das große Fragment mit Hilfe der T4-DNA Ligase in 40 μl 50 mM Tris/HCL ph 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreit 1 mM Adenosintriphosphat wieder zu einem Plasmid geschlossen, das die Region zwischen 17,8 Kb und 8,3 Kb des ursprünglichen Plasmids pRK 290 aufweist (Plasmid I in Fig. 2).
In einem weiteren Schritt wurde das 2,7 Kb große Plasmid pUC18 (beschrieben in
Vieira J., Messing J., 1982, Gene 19 S. 259) in das Plasmid I an der Schnittstelle
Sp eingesetzt. Dazu werden Plasmid I und pUC18 unter den oben beschriebenen
Bedingungen mit SpH I linearisiert und anschließend wieder mit T4 DNA-Ligase ligiert. (Plasmid II in Fig. 2) Das so hergestellte Plasmid enthält aus dem pUC18
Fragment eine einzige Kpn I Restriktionsstelle (K) mit der Erkennungssequenz die der Startpunkt für eine anschließende Deletion mit der Exonuclea
se Bal 31 ist. Die Sequenzen des trfB und des trfA liegen durch die Insertion des pUC18 etwa gleich weit von dieser Kpn I Restriktionsstelle entfernt.
Plasmid II wurde also vorerst mit der Restriktionsendonuclease KPnl (in einem
Inkubationspuffer bestehend aus 10 mmol/l Tris HCl (pH 7,5) 10 mmol/l MgCl2 und 1 mmol/l Dithiothreit linearisiert und anschließend mit der Exonuclease Bal
31 (aus Alteromonas espeijiani) von beiden Enden her verkürzt.
Das Außmaß der Verkürzung wurde mittels Gelektrophorese auf 1 % Agarosegel kontrolliert. Mit Hilfe der T4-DNA Ligase wurde schließlich ein 6,6 Kb großes
Plasmid, das ein DNA Segment des Anspruchs 1 enthält, ligiert. 2. Transformation des E.coli HB 101.
Die Transformation des E-colϊ Stammes kann in an sich bekannter Weise, beispeilsweise nach der in Mandel M., und Higa A. J. Mol. Biol. 53 159 - 162 (1970), und Cohen, S.N., Chang, A. C. Y., and Hsu, L. Proc. Natl. Acad. Sei., USA 69, 2110 -2114 (1972) angegebenen Vorschrift erfolgen.
Dazu werden 5 ml Lurea Broth - ein Nährmedium bestehend aus Fleischextrakt, Hefeextrakt und Salz - mit 1 ml Vorkultur von E.coli HB 101 inokuliert und bei 37ºC geschüttelt, bis ein Viertel der maximalen Zelldichte (Extinktion im Photometer ca 0,4 - 0,6) erreicht ist.
Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 5000 rpm geerntet und in 25 ml Transformationspuffer, bestehend aus 150 mmol KCl, 50 mmol CaCl2, 5 mmol MgCl2 und 1 mmol Tris HCl (pH 7,5), in Eis suspendiert. Nach erneuter Zentrifugation werden die Zellen in 2 ml Transformationspuffer resuspendiert. Von dieser Suspension werden 0,1 ml mit Plasmid DNA (pPS 99) unter Eiskühlung versetzt, nach 1 Stunde auf 42ºC erwärmt und nach 90 Sekunden 1,2 ml Lurea Broth bei 37ºC zugesetzt. Nach 5 - 15 Minuten wird auf Selektionsagar (Lurea Broth mit 1,5 % Agar und geeignetem Antibiotikum plattiert). Die Transformanten sind nach 15 - 24 Stunden sichtbar.
Ein auf diese Weise erhaltener transformierter E.coli HB 101 Stamm wurde am 16. Juni 1988 bei Deutschen Sammlung von Mikrooranismen und Zellkulturen GmbH, unter der Nummer DSM 4673 hinterlegt.
3. Transformation von Agrobakterien
Unter anderem wurden die Konstruktionen, die in Fig. 3 dargestellt sind, auf ihre Replikationsfähigkeit in Agrobakterien getestet.
Es wurden 100 ml YEP (1 % Hefeextrakt, 1 % Peptαn, 0,5 % NaCl) mit 2 ml Vorkultur bei 30ºC 4 - 6 h lang inokuliert. Die Zellen wurden 4 - 6 h bei 30ºC gezüchtet und durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 Minuten geerntet. Anschließend wurden die Zeilen in 10 mMl NaCl suspendiert und wiederum zentrifugiert. Dann wurde in ml YEP resuspendiert. 0,2 ml dieser Suspension wurden mit 1 μg Plasmid-DNA versetzt und sofort bei - 80ºC in einem EtOH-Bad eingefroren. Nach 5 min wurden die Zellen aufgetaut und 25 Minuten bei 37ºC gehalten. Danach wurde mit 0,5 ml YEP verdünnt und 1 - 2 h bei 30ºC inkubiert.
Danach wurden die Zellen auf Selektionsagar Nutrient broth (0,8 % Nutrient broth, 1,5 % Agar) oder auf YEP (mit 1,5 % Agar) mit dem gewünschten Antibiotikum plattiert.
Auf diese Weise wurden Agrobakterien mit den in Fig. 3 dargestellten Plasmiden transformiert und in jedem Fall Transformanten erhalten, die den gewünschten Phaenotyp (Antibiotikuresistenz(en)) aufwiesen. Aus diesen Transformanten konnten die eingesetzten Plasmide wiedergewonnen werden, was durch Transformation von Escherichia coli mit dieser DNA und anschließender Restriktionsanalyse bewiesen werden konnten.
Die in Fig. 3 angeführten Abkürzungen bedeuten:
Ampr Ampicillinresistenzgen, Tetr Tetracyclinresistenzgen, NPT: Neomycinphosphotransferasegen, kodiert für Kanamycinresistenz, Pnos: Promotor der Nopalinsynathetase, SNPT: Strukturgen des NPT, Tnos: Terminator des Nopalinsynthethetasegens, ori (pUC) origin of Replication des Plasmids pUC18, oriV: origin of replication des Plamids RK22, trfBA das beschriebene Fragmentessentiell für die Replikation des oriV, F: Fusionsstelle des trfA Strukturgens mit der trfB Region, rech Stück der T-DNA des Ti-Plasmids als linkes Recombinationsfragment. EcoRI, Bglll, PvuII, BamHI, Aval, Hindill, Kpnl: Restriktionsenzyme
Die Einheit PnosSNPTTnos kann in Pflanzen Neomycin und Kanamycin-Restistenz bewirken.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in eis oder in trans replikationsfähig zu machen, dadurch gekennzeichnet, daß das Segment eine Sequenz, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend folgende Nukleotidsequenz
und Subfragmente und Mutanten davon, die im wesentlichen die gleiche Fähigkeit zur Replikation des oriV besitzen, enthält.
Verfahren zur Herstellung eines DNA-Segments nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pRK 290 mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, das DNA-Stück zwischen 17,8 kb und 8,3 kb mit
Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, erneut mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, in die Schnittstelle des Plasmid pUC 18 einfügt, mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, dieses Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Kpn I linearisiert und mit der Exonuklease Bal 31 von beiden Enden her verkürzt, wobei das Ausmaß der Verkürzung mittels Gelelektrophαrese kontrolliert wird, worauf die Enden mit T4-L igase ligiert werden.
3. Rekombinantes Plasmid, enthaltend ein DNA-Segment nach Anspruch 1.
4. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Resistenzgεn gegen mindestens ein Antibiotikum enthält.
5. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bordersequenzen von Ti oder Ri-Plasmiden aufweist.
6. Transformierte Bakterien, enthaltend ein Plasmid nach einem der Ansprüche 3 bis 5.
7. Transformierte Bakterien nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien aus der Gruppe der gramnegativen Bakterien ausgewählt sind.
8. Transformierte Bakterien nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe der Agrobakterien ausgewählt sind.
9. Pflanzenmaterial, das durch Bakterien nach Anspruch 8 transformiert wurde.
10. Saatgut aus Pflanzenmaterial nach Anspruch 9.
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