EA034579B1 - Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения - Google Patents

Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
EA034579B1
EA034579B1 EA201900246A EA201900246A EA034579B1 EA 034579 B1 EA034579 B1 EA 034579B1 EA 201900246 A EA201900246 A EA 201900246A EA 201900246 A EA201900246 A EA 201900246A EA 034579 B1 EA034579 B1 EA 034579B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
inhibitor
glycol
cells
oep
atp
Prior art date
Application number
EA201900246A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201900246A1 (ru
Inventor
Юрий Григорьевич ШТЫРЛИН
Альфия Габдулахатовна ИКСАНОВА
Юрий Владимирович БАДЕЕВ
Константин Валерьевич БАЛАКИН
Original Assignee
Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты"
Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты", Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" filed Critical Акционерное Общество "Татхимфармпрепараты"
Publication of EA201900246A1 publication Critical patent/EA201900246A1/ru
Publication of EA034579B1 publication Critical patent/EA034579B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/25—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids with polyoxyalkylated alcohols, e.g. esters of polyethylene glycol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A61K31/77—Polymers containing oxygen of oxiranes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2603—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen
    • C08G65/2606—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen containing hydroxyl groups
    • C08G65/2609—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen containing hydroxyl groups containing aliphatic hydroxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2696—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds characterised by the process or apparatus used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G2650/28—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type
    • C08G2650/30—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type branched

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к химии лекарственных соединений, а именно к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы, являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток (ОЭП-ингибитор). ОЭП-ингибитор представляет собой конъюгат с эквимольным соотношением оптически активного полиоксипропиленгексола и полиоксипропиленгликоля. Заявленный способ, по которому получается конъюгат, обеспечивает возможность получения препарата, увеличивающего эффективность действия лекарственных средств посредством ингибирования механизмов множественной лекарственной устойчивости клеток. Полученный препарат может быть использован в области биологии, фармакологии, фармацевтики, медицины, сельского хозяйства. ОЭП-ингибитор получают оксипропилированием смеси сорбита и бифункционального кислородсодержащего соединения в присутствии гидроокиси щелочного или щелочно-земельного металла. Бифункциональное кислородсодержащее соединение может быть водой, пропиленгликолем, дипропиленгликолем, трипропиленгликолем, тетрапропиленгликолем, пентапропиленгликолем, гексапропиленгликолем, гептапропиленгликолем или их смесью. Ингибитор представляет собой коньюгат полиоксипропиленгликоля с молекулярной массой от 300 до 500 Да и полиоксипропиленгексола с молекулярной массой от 1000 до 1500 Да в эквимольном соотношении, с гидроксильным числом в пределах 215-240 мг KOH/г.

Description

Изобретение относится к области разработки физиологически активных веществ, а именно к группе хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы (ОЭП), являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, сокращенно называемых ABC-транспортерами (от англ. ATP-binding cassette transporters). Изобретение может быть использовано в области биологии, фармакологии, фармацевтики, медицины, сельском хозяйстве и экологии для существенного усиления эффективности действия физиологически активных веществ, в том числе лекарственных средств - противоопухолевых, сердечно-сосудистых, противоаллергических, противовоспалительных и др., за счет подавления механизмов множественной лекарственной устойчивости клеток под действием заявленных ингибиторов АВС-транспортеров.
Одной из наиболее актуальных проблем современной фармакотерапии является множественная лекарственная устойчивость патологических клеток - врожденная или приобретенная невосприимчивость клеток к лекарственным препаратам, различающимся по механизму действия и структуре. Одним из основных механизмов возникновения лекарственной устойчивости патологических клеток является способность к обратному захвату и выбросу проникающих в клетку молекул ксенобиотиков АТФзависимыми насосами семейства АВС-транспортеров [1].
В семейство АВС-транспортеров входят гликопротеин P-gp (P-glycoprotein), белки множественной лекарственной устойчивости семейства MRP (multidrug resistance-associated protein) и белок устойчивости рака молочной железы BCRP (breast cancer resistance protein). Активность указанных АВСтранспортеров, экспрессия которых существенно возрастает при возникновении патологических процессов в клетке, приводит к значительному снижению эффективности фармакотерапии. Подобные эффекты детально показаны и исследованы на примере большинства лекарственных средств для химиотерапии опухолей [2], в том числе таргетных, но и при многих других патологиях ABC-транспортеры существенно снижают эффективность лекарств. АВС-транспортеры обладают широкой субстратной специфичностью, осуществляя обратный захват и выброс из клетки многих лекарств из различных терапевтических групп.
В качестве примеров, не носящих исчерпывающий характер, субстратами АВС-транспортеров являются [3]: анальгетики (асимадолин, фентанил, морфин, пентазоцин); антибиотики (ампициллин, азитромицин, цефоперазон, цефтриаксон, кларитромицин, доксициклин, эритромицин, грамицидин А, грамицидин D, грепафлоксацин, итраконазол, кетоконазол, левофлоксацин, рифампицин, спарфлоксацин, тетрациклин, валиномицин и др.); противовирусные препараты (делавирдин, лопинавир, ламивудин, нелфинавир, зидовудин); антиаритмические препараты (амиодарон, дигоксин, лидокаин, пропафенон, хинидин, верапамил); противоопухолевые препараты (5-фторурацил, актиномицин D, бисантрен, хлорамбуцил, колхицин, цисплатин, цитарабин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, гефитиниб, иринотекан, метотрексат, митомицин С, митоксантрон, паклитаксел, тамоксифен, тенипозид, топотекан, винбластин, винкристин и др.); антигистаминные препараты (циметидин, фексофенадин, ранитидин, терфенадин); гиполипидемические препараты (ловастатин, симвастатин, правастатин, розувастатин); блокаторы кальциевых каналов (азидопин, бепридил, дилтиазем, фелодипин, нифедипин, низолдипин, нитрендипин, тиапамил, верапамил); анти-ВИЧ препараты (ампренавир, индинавир, лопинавир, нелфинавир, саквинавир, ритонавир); иммуносуппрессоры (циклоспорин А, сиролимус, такролимус), антидепрессанты (хлорпромазин, фенотиазин) и многие другие лекарственные соединения природного, синтетического или полусинтетического происхождения.
Таким образом, создание эффективных и безопасных ингибиторов АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток является перспективным подходом к увеличению эффективности действия широкого ряда физиологически активных веществ, в том числе лекарственных средств. Создание подобных препаратов позволило бы значительно уменьшить терапевтическую дозу активных веществ и, как следствие, их побочные эффекты, тем самым совершить качественный скачок в фармакологии и медицине.
Из исследованного уровня техники известен широкий ряд соединений, в том числе разрешенных к применению лекарственных препаратов, способных ингибировать АВС-транспортеры. Так, была проведена масштабная исследовательская работа по созданию ингибиторов ABC-транспортеров в качестве препаратов, увеличивающих чувствительность раковых клеток к действию противоопухолевых препаратов [3]. В частности, в качестве ингибиторов P-gp проявили активность и исследовались для комбинированной противоопухолевой химиотерапии аторвастатин, амлодипин, циклоспорин А, дисульфирам, нифедипин, верапамил, препараты GF120918, LY475776, LY335979, MS-209, OC144-093, pluronic L61, PSC833, R101933, S9788, VX-710, XR-9576, V-104. В качестве ингибиторов MRP2 исследовались азитромицин, циклоспорин А, фуросемид, глибенкламид, пробенецид, MK-571. В качестве ингибиторов BCRP исследовались циклоспорин А, дипиридамол, элакридар, фумитреморгин С, новобиоцин, ортатаксел, резерпин, ритонавир, тариквидар, GF120918, VX-710, XR-9576.
Как известно из уровня техники, различают три поколения ингибиторов АВС-транспортеров.
Поколение 1: циклоспорин А, верапамил (примеры). Эти соединения являются эффективными ингибиторами обратного транспорта, но сами обладают высокой токсичностью. Их применение с химиотерапевтическими препаратами не привело к существенным клиническим результатам.
Поколение 2: PSC-833 и VX-710 (примеры). Эти соединения также являются эффективными инги- 1 034579 биторами обратного транспорта. Однако их применение с химиотерапевтическими препаратами также не привело к существенным клиническим результатам; кроме того, наблюдались существенные побочные эффекты терапии, связанные с лекарство-лекарственными взаимодействиями.
Поколение 3: GF120918, LY335979, R101933 и XR9576 (примеры). Эти соединения являются еще более эффективными ингибиторами обратного транспорта на in vitro моделях, чем ингибиторы поколений 1 и 2. Однако их применение с химиотерапевтическими препаратами также не привело к существенным клиническим результатам по причинам низкой безопасности (наличия нежелательных побочных эффектов) и недостаточной терапевтической эффективности.
В целом современное состояние исследований в этой области характеризуется локальными успехами на уровне in vitro, однако переход к in vivo, а тем более к клиническим исследованиям, как правило, не приносит желаемого эффекта, в основном, в силу наличия нежелательных побочных эффектов композиций, неоптимальной фармакокинетики, а также недостаточной эффективности ингибирующего действия [3]. При этом во всех современных исследованиях отмечается перспективность дальнейших поисков в этом направлении.
Исходя из указанного, становится очевидным, что для полноценной реализации перспектив данного подхода требуются более активные и безопасные ингибиторы АВС-транспортеров.
Аналогов или прототипов у заявленного технического решения по совпадающим признакам на дату предоставления заявочных материалов не выявлено, однако заявителем выявлено большое количество средств для решения поставленной задачи по назначению.
В заявленном техническом решении применен творческий подход, который позволяет одновременно значительно увеличить терапевтическую эффективность, повысить безопасность, а также существенно снизить стоимость активной фармацевтической субстанции, повысить технологичность производственного процесса получения субстанции. При этом заявленное техническое решение обеспечивает возможность выхода на международный рынок с продуктом, ранее не известным в мире.
Целью заявленного технического решения является получение ингибитора обратных ABCтранспортеров клеток олигоэфирполиольной природы (ОЭП-ингибитор), состоящего из полиоксипропиленгликоля с молекулярной массой от 300 до 500 Да и полиоксипропиленгексола с молекулярной массой от 1000 до 1500 Да.
Цели заявленного технического решения достигаются путем осуществления следующего химиче ского процесса по схеме:
где 1 - сорбит ((2S,3R,4R,5R)-гексан-1,2,3,4,5,6-гексол);
- бифункциональное кислородсодержащее соединение, в котором R = -О-; [-OCH2CH(CH3)]k-O-, k=1-7;
- окись пропилена;
М(ОН)х - гидроокись металла, где М - щелочной или щелочно-земельный металл, х=1 или 2;
N = 2-6, преимущественно n = 4;
M = 5-9, преимущественно m = 7.
Таким образом, заявленное техническое решение в отношении способа реализуется единовременно, в одном реакторе, в один этап, с применением доступных реагентов, взятых в пропорциях, обеспечивающих получение целевого конъюгата с эквимольным соотношением оптически активного соединения 4 и соединения 5.
Процесс в целом реализуется в соответствии с представленной выше схемой, в соответствии с приведенным далее описанием.
В реактор-полимеризатор загружают исходные реагенты 1 и 2, добавляют щелочной катализатор, включают перемешивание и в атмосфере азота выдерживают реакционную смесь при температуре 90- 2 034579
100°С в течение 30 мин до получения гомогенной массы. Затем подается расчетное количество соединения 3 со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе-полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см2), и при температуре не выше 115°С. После этого проводится выдержка реакционной массы при температуре не выше 115°С в течение 1-1,5 ч до остановки падения давления.
При этом соотношение реагентов 1, 2 и М(ОН),. рассчитывается таким образом, чтобы в результате их реакции с окисью пропилена получилась эквимольная смесь соединений 4 и 5. Соединение 4 с n = 4 и соединение 5 с m = 7 представляют собой основные олигомерные компоненты, образующиеся в описанной реакции анионной олигомеризации. Количество соединения 3 рассчитывается таким образом, чтобы полученная эквимольная смесь соединений 4 и 5 обладала гидроксильным числом в пределах 215-240 мг КОН/г.
В качестве бифункционального кислородсодержащего соединения 2 могут выступать пропиленгликоль, дипропиленгликоль, трипропиленгликоль, тетрапропиленгликоль, пентапропиленгликоль, гексапропиленгликоль, гептапропиленгликоль или вода или их смесь. При взаимодействии гидроокиси щелочного или щелочно-земельного металла с кислородсодержащим соединением или сорбитом выделяется вода, которая также должна учитываться при расчете эквимольного соотношения образующихся целевых продуктов 4 и 5.
Для соединения 4 оптимальной молекулярной массой является 1200 Да, при этом оно проявляет эффективность также в диапазоне от 1000 до 1500 Да. Для соединения 5 оптимальной молекулярной массой является 400 Да, при этом в диапазоне от 300 до 500 Да оно также обладают эффективностью. Выход за указанные диапазоны молекулярных масс также возможен, но сопровождается некоторым снижением активности получаемого ингибитора АВС-транспортеров.
Ингибитор ABC-транспортеров может быть получен альтернативным способом, который не приводится заявителем в силу его известности как такового и заключается в раздельном получении соединений 4 и 5 путем взаимодействия соответственно соединений 1 и 2 с окисью пропилена 3 в условиях щелочного катализа, с дальнейшим их механическим смешением в эквимольных количествах.
Изобретение проиллюстрировано следующими материалами.
Фиг. 1 - график зависимости вязкости ОЭП-ингибитора от температуры;
фиг. 2 - ВЭЖХ-МС спектр ОЭП-ингибитора;
фиг. 3 - концентрации полумаксимального ингибирования роста (СС50 и IC50, мкМ) соединений для условно-нормальных и опухолевых клеток человека;
фиг. 4 - содержание ОЭП-ингибитора в анализируемых клеточных лизатах по данным ВЭЖХ-МС;
фиг. 5 - поляризация флуоресценции ДФГТ (1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен) в клеточной суспензии после добавления эффекторов: ОЭП-ингибитора, композиции доксорубицина и ОЭП-ингибитора, холестерола и Тритон Х-100; (А) клетки MCF-7; (В) клетки с МЛУ MCF-7/Vin. Плотность суспензии 2х106 клеток/мл, температура 25°С, в следующих концентрациях: ОЭП-ингибитор - 8,7, 87 и 870 мкг/мл, доксорубицин - 1 мкМ, холестерол - 100 мкг/мл, Triton Х-100 - 0,05%;
фиг. 6 - гистограмма трансэпителиального транспорта доксорубицина в поляризованных СаСо-2 клетках. Сокращения: апикально-базолатеральный транспорт (А-В), базолатерально-апикальный транспорт (В-А);
фиг. 7 - фотография результатов иммуноблоттинга исходных и генно-модифицированных клеток MCF-7 после обработки доксорубицином, ОЭП-ингибитором или их комбинацией в течение 48 ч;
фиг. 8 - влияние эффекторов на АТФ-азную активность Р-гликопротеина человека изолированных мембран клеток Sf9 (0,2 мг/мл по белку). Контроль: базовая активность мембран в присутствии 5 мМ АТФ и 0,1 мМ винбластина;
фиг. 9 - содержание АТФ в лизатах клеток MCF-7 (А) и MCF-7/Vin (В), обработанных ОЭПингибитором (87, 430, 2175 мкг/мл), доксорубицином (10 мкМ) и их композицией (ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл + DOX 10 мкМ).
Далее заявителем представлены примеры способов получения ОЭП-ингибитора.
Пример 1. Способ получения ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-вода.
В стальной реактор-полимеризатор, снабженный механической мешалкой, холодильником, термопарой, трубкой для ввода окиси, загружают 27,3 г (0,15 моль) сорбита и добавляют 0,6 г (0,01 моль) гидроксида калия в 2,51 г (0,139 моль) воды. Реактор трижды продувают азотом. Включают перемешивание и в атмосфере азота выдерживают при температуре 90-100°С в течение 30 мин до получения гомогенной массы. Поднимают температуру до 115°С и порционно подают 270 г (4,65 моль) окиси пропилена со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе-полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см2) и температуру не выше 115°С. После подачи расчетного количества окиси пропилена выдерживают реакционную массу при температуре не выше 120°С в течение 1-1,5 ч до остановки падения давления.
Полученный ОЭП-ингибитор нейтрализуют 50% водным раствором ортофосфорной кислоты до рН 6,5-7,5, удаляют воду в вакууме при температуре 80-90°С и отфильтровывают с монтмориллонитом через бельтинг. После всех операций получают 270 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 645 мПа-с, плотность 1,038 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 220 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
- 3 034579
Пример 2. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-пропиленгликоль.
В стальной реактор-полимеризатор, снабженный механической мешалкой, холодильником, термопарой и трубкой для ввода окиси, загружают 28,7 г (0,157 моль) сорбита и добавляют 0,63 г (0,01 моль) гидроксида калия в 10,98 г (0,145 моль) пропиленгликоля. Реактор трижды продувают азотом. Включают перемешивание и в атмосфере азота выдерживают при температуре 90-100°С в течение 30 мин до получения гомогенной массы. Поднимают температуру до 115°С и порционно подают 274 г (4,73 моль) окиси пропилена со скоростью, обеспечивающей давление в реакторе-полимеризаторе не выше 0,39 мПа (4 кгс/см2) и температуру не выше 115°С. После подачи расчетного количества окиси пропилена выдерживают реакционную массу при температуре не выше 120°С в течение 1-1,5 ч до остановки падения давления.
Полученный ОЭП-ингибитор нейтрализуют 50% водным раствором ортофосфорной кислоты до рН 6,5-7,5, удаляют воду в вакууме при температуре бани 80-90°С и отфильтровывают с монтмориллонитом через бельтинг. После всех операций получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 618 мПа-с, плотность 1,035 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 231 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пример 3. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-дипропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), дипропиленгликоль - 18,5 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 255 г (4,4 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 308 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 623 мПа-с, плотность 1,036 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 227 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пример 4. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-трипропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), трипропиленгликоль - 26,7 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 246 г (4,24 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 280 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 629 мПа-с, плотность 1,036 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 229 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пример 5. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-тетрапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,29 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), тетрапропиленгликоль - 34,75 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 246 г (4,24 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 620 мПа-с, плотность 1,034 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 233 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пента-, гекса- и гептапропиленгликоли были получены при взаимодействии пропиленгликоля с окисью пропилена в условиях щелочного катализа. Для каждого из образцов определялось гидроксильное число.
Пример 6. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-пентапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), пентапропиленгликоль - 42,8 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 230 г (3,95 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 285 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 627 мПа-с, плотность 1,033 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 231 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пример 7. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-гексапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,31 г (0,15 моль), КОН - 0,6 г (0,011 моль), гексапропиленгликоль - 50,87 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 222 г (3,83 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 283 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 615 мПа-с, плотность 1,037 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 225 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Пример 8. Получение ОЭП-ингибитора из стартовой системы сорбит-гептапропиленгликоль.
Реакцию проводили по методике, представленной в примере 2. Количество стартовых веществ: сорбит - 27,3 г (0,15 моль), КОН - 0,61 г (0,011 моль), гептапропиленгликоль - 58,9 г (0,14 моль). Количество окиси пропилена - 214 г (3,83 моль). После нейтрализации и фильтрования получают 283 г слегка желтоватого продукта. Вязкость 623 мПа-с, плотность 1,036 г/см3 (20°С). Гидроксильное число - 224 мг КОН/г (ГОСТ 25261-82 п.3.1).
Полученный ОЭП-ингибитор представляет собой бесцветную или слегка желтоватую жидкость с вязкостью при комнатной температуре 575-715 МПа-с (на фиг. 1 представлена зависимость вязкости ОЭП-ингибитора от температуры), с плотностью в пределах 1,01-1,05 г/см3 (20°С). Гидроксильное число 215-240 мг КОН/г, рН 10% раствора (этанол/вода - 70/30) составляет 5,5-7,5.
ОЭП-ингибитор характеризуется множеством m/z пиков в диапазоне как небольших (400-1200 Да), так и более тяжелых масс (1500-2000 Да) (фиг. 2), что отражает наличие статистического набора продуктов реакции поликонденсации. Анализ проводился с использованием хроматографической колонки Agilent ZORBAX Extend-C18 (размер колонки 1x150 мм, размер частиц 3,5 мкм) с предколонкой Extend
- 4 034579
Guard (1x17 мм, размер частиц 5 мкм) на хроматографе Agilent 1260 Binary System (вакуумный дегазатор G1379B, бинарный градиентный насос G1312B, колоночный термостат G1316A, автоматический пробоотборник G1367E, термостат для автоматического пробоотборника G1330 В). Детектор - квадрупольновремяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения АВ Sciex 5600 с источником ионизации DuoSpray. Подвижная фаза: растворитель А - 10 мМ раствор формиата аммония в смеси вода метанол (90:10%); растворитель В - 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Наиболее интенсивные пики ОЭПингибитора использовались для его количественного анализа в биологических матрицах.
Техническим результатом заявленного технического решения является способ получения хиральных конъюгатов (оптически активных гибридных молекул) олигоэфирполиольной природы, являющихся ингибиторами АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток (ОЭП-ингибиторами), для существенного усиления эффективности действия физиологически активных веществ из числа противоопухолевых, сердечно-сосудистых, противоаллергических, противовоспалительных и других лекарственных соединений.
Далее заявителем представлены обозначения и сокращения, которые использованы для реализации заявленного технического решения
ABC (от англ. ATP binding cassette) - АТФ-зависимый транспортер,
APS - ammonium persulfate, персульфат аммония,
АТР (от англ. adenosine triphosphate) - аденозин-3-фосфат, АТФ,
С - цитозин,
DOX - доксорубицин,
EGTA (от англ. ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) - этиленгликоль бис(2-аминоэтиловый эфир)-'Н.'Н.'Н'.'Н'-тетрауксусной кислоты,
FAM (от англ. 6-carboxyfluorescein) - 6-карбоксифлуоресцеин,
G - гуанин,
HRP (от англ. horseradish peroxidase) - пероксидаза хрена,
LC-MS - жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией, m/z - соотношение массы к заряду,
P-gp - Р-гликопротеин, рН - водородный показатель,
Pi (от англ. inorganic phosphate) - неорганический фосфат,
Т - тимин,
U/pL - единиц в микролитре,
Vin - винбластин,
А260 - значение длины волны в ангстремах при 260 нм,
А - аденин,
ДМСО - диметилсульфоксид,
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,
ДФГТ - дифенилгексатриен,
ЛС - лекарственное средство,
ЛФ - лекарственная форма, мкг - микрограмм, мл - миллилитр,
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость,
МТТ (от англ. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) - тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, об/мин - оборотов в минуту,
ОЭП - олигоэфирполиол,
РНК - рибонуклеиновая кислота,
ФСБ - фосфатно-солевой буфер,
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.
Материалы и методы
Химические реагенты и материалы.
Доксорубицин (DOX) гидрохлорид, уабаин октагидрат, пентаэтиленгликоль 98%, β-меркаптоэтанол, этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), бериллия сульфат тетрагидрат, натрия фторид, аммония молибдат были приобретены в Sigma-Aldrich (США). Бромфеноловый синий, деоксихолат натрия, трис-гидрохлорид (трис-(оксиметил)аминометан гидрохлорид), аммоний персульфат (APS), натрия додецилсульфат (SDS) приобретены в компании Amresco (США). МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия бромид) от Life technologies (США). L-глутамин, раствор Дульбекко, не содержащий ионы Са2+ и Mg2+, раствор трипсина-ЭДТА, раствор Хэнкса без фенолового красного, среды α-МЕМ и DMEM приобретены в компании ПанЭко (Россия). 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (ДФГТ), дитиотреитол (1,4-бис(сульфанил)бутан-2,3-диол), аскорбиновая кислота, холестерол, Triton® Х-100, винбластина
- 5 034579 сульфат, АТФ динатриевая соль гидрат, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) от компании Acros Organics. В компании Helicon были приобретены лаурилсульфат натрия (SDS) и этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
Условия культивирования клеток.
Клетки MCF-7, MCF-7/Vin, HSF, СаСо-2, НСТ-15, НСТ-116, OVCAR-4, РС-3, А-498, NCI-H322M, М-14, SNB-19, SF-539 (табл. 1) культивируют в среде α-МЕМ с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5% СО2 при 37°С до образования монослоя. Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизируют с последующей инактивацией трипсина добавлением среды α-МЕМ с сывороткой. Подсчёт клеток производится в камере Неубайера методом исключения трипанового синего. Клетки пересевают 2 раза в неделю в отношении 1:6.
Таблица 1
Перечень используемых клеточных линий
Название клеточной линии Описание ID NCI-60 (коллекция опухолевых клеточных линий(и8))
MCF-7 Аденокарцинома молочной железы человека АТСС® НТВ-22™
HSF Условно нормальные фибробласты кожи человека
СаСо-2 Колоректальная аденокарцинома человека АТСС® НТВ-37™
НСТ-15 Колоректальная аденокарцинома человека GSM136289
НСТ-116 Колоректальная карцинома человека GSM136288
OVCAR-4 Аденокарцинома яичников человека GSM136312
РС-3 Аденокарцинома простаты человека GSM136316
А-498 Карцинома почки человека GSM136294
NCI-H322M Немелкоклеточная карцинома легкого человека GSM136307
М-14 Меланома кожи человека GSM136320
SNB-19 Глиобластома человека GSM136283
SF-539 Глиосаркома человека GSM136282
Пример 9. Исследование цитотоксического эффекта ОЭП-ингибитора in vitro.
Исследовали влияние ОЭП-ингибитора на пролиферативный потенциал опухолевых и условнонормальных клеток человека при 72-часовой инкубации с использованием МТТ-теста. В лунки 96луночного планшета вносили 1000 клеток в 90 мкл культуральной среды и инкубировали 24 ч в СО2 инкубаторе для адгезии клеток к субстрату. Далее вносили аликвоты приготовленных растворов исследуемых соединений (ОЭП-ингибитор) в объеме 10 мкл/лунку. Исследование проводили в трипликатах. В контрольные лунки планшета вместо анализируемых соединений вносили аналогичные объемы mQ. После внесения исследуемых веществ клетки культивировали в СО2 инкубаторе в стандартных условиях в течение 72 ч. Далее культуральную среду с исследуемыми веществами удаляли из планшета с помощью вакуумного аспиратора, добавляли питательную среду и МТТ-реагент 5 мг/мл, инкубировали в СО2 инкубаторе 3-4 ч. По истечении времени инкубации культуральную среду с МТТ-реагентом удаляли вакуумным аспиратором, вносили по 100 мкл ДМСО и инкубировали 5-10 мин. Появившееся фиолетовое окрашивание детектировали на планшетном ридере Tecan при 555 нм (референтная длина волны 650 нм). Строили графики зависимости доза-эффект и определяли концентрацию полумаксимального ингибирования роста клеток (IC50). Результаты представлены в табл. 2 на фиг. 3.
Таким образом, детальный анализ таблицы позволяет сделать однозначно трактуемые выводы о том, что для большей части исследованных клеток IC50 ОЭП-ингибитор превышает 1,5 мг/мл, что свидетельствует о полной безопасности заявленного коньюгата. При этом можно констатировать специфичность ОЭП-ингибитора к клеткам глиобластомы SNB-19 и глиосаркомы SF-539 (IC50 составляет 0,46 ± 0,12 мг/мл и 0,46 ± 0,12 мг/мл соответственно), что свидетельствует о его некотором, хотя и незначительном собственном противоопухолевом действии на указанные виды клеток.
Пример 10. Оценка влияния ОЭП-ингибитора на микровязкость плазматических мембран клеток MCF-7 и MCF-7/Vin.
Ключевой физико-химической характеристикой клеточных мембран, влияющей на их физиологическую активность, является микровязкость - мера подвижности липидов в бислое, которая играет важную роль в проницаемости мембраны и функционировании мембранных белков. Для оценки микровязкости плазмалеммы применяют флуоресцентный метод, основанный на использовании липофильного индикатора дифенилгексатриена (ДФГТ), флуоресценция которого зависит от текучести клеточной мембраны.
Клеточную суспензию плотностью 2х106 клеток/мл инкубировали с ДФГТ в конечной концентрации 1 мкМ в течение 30 мин. Далее в суспензию клеток с помощью многоканального дозатора вносили
- 6 034579 аликвоты (по 10 мкл) растворов ОЭП-ингибитора до конечной концентрации 8,7; 87 и 870 мкг/мл, а также доксорубицин в концентрации 1 мкМ и его композиции с ОЭП-ингибитором (DOX 1 мкМ + ОЭПингибитор 8,7 мкг/мл; DOX 1 мкМ + ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл). В качестве положительных контролей, значимо изменяющих микровязкость плазматических мембран клеток, тестировали холестерол в конечной концентрации 100 мкг/мл, а также липофильный детергент Triton Х-100 в концентрации 0,05%. Непосредственно после внесения аликвот проб детектировали поляризацию флуоресценции ДФГТ в течение 1 ч с интервалом 10 мин.
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на микровязкость плазматических мембран клеток MCF-7 и MCF-7/Vin представлены на фиг. 5.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ОЭП-ингибитор в концентрациях 8,7, 87 и 870 мкг/мл, а также доксорубицин, как и его композиции ОЭП-ингибитором, значимо не изменял поляризацию флуоресценции ДФГТ в суспензиях клеток MCF-7 и MCF-7/Vin. Поскольку поляризация флуоресценции пропорциональна вязкости микроокружения флуорофора [4], из чего можно заключить, что исследуемый ОЭП-ингибитор не влиял на микровязкость плазматических мембран исследуемых клеток.
Холестерол, обладая большей вязкостью, чем фосфолипиды плазмалеммы, значительно увеличивал поляризацию флуоресценции ДФГТ и микровязкость мембраны. Triton Х-100, являясь сильным детергентом, постепенно растворяет плазмалемму, о чем свидетельствует значительное уменьшение поляризации флуоресценции ДФГТ. Исследуемый ОЭП-ингибитор не оказал значимого эффекта на микровязкость цитоплазматических мембран клеток млекопитающих, что свидетельствует об его инертности в отношении липидного бислоя цитоплазматических мембран опухолевых клеток.
Пример 11. Оценка накопления ОЭП-ингибитора в резистентных опухолевых клетках.
Известно, что некоторые гидрофобные блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида обладают способностью проникать через барьер плазматической мембраны клеток, накапливаться в цитоплазме и оказывать эффекты на внутриклеточные органеллы и ферменты. В частности, показано, что плуроник Р85 обладает свойством изменять микровязкость мембран митохондрий и разобщать окислительное фосфорилирование [5], [6]. В связи с этим, представляло интерес определить степень внутриклеточного накопления тестируемого ОЭП-ингибитора. Идентификацию и количественное определение содержания ингибитора в лизатах клеток осуществляли с использованием жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектроскопией (ВЭЖХ-МС).
Клетки MCF-7/RES рассеивали в 6-луночные планшеты в количестве 50000 клеток в лунку планшета и культивировали при 37°С и 5% СО2 в течение 24 ч. К клеткам добавляли аликвоты ингибитора, конечные концентрации которого составляли 8,7, 87 и 870 мкг/мл и культивировали в течение 96 ч при 37°С и 5% СО2. К контрольным пробам вносили соответствующие объемы деионизированной воды. По истечении времени инкубации среду, содержащую ОЭП-ингибитор, отбирали аспиратором. Клетки отделяли от поверхности планшета при помощи суспендирования раствором Хенкса и переносили в 15 мл пробирки для отмывки не менее 5 раз (400 g, 4 мин). К осадку клеток вносили 150 мкл деионизированной воды, содержащей внутренний стандарт - пентаэтиленгликоль концентрацией 10-5 М. Клетки лизировали двумя циклами замораживания и оттаивания (4 мин при -75°С, с инкубацией на водяной бане при 37°С в течение 2 мин) с последующей обработкой ультразвуком 4 мин. Аликвоты лизатов отбирали для последующего определения количества белка в пробах с использованием набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit производства Life Technologies. К клеточным лизатам вносили 700 мкл охлажденного метанола, инкубировали в течение 15 мин при - 20°С с последующим центрифугированием при 17400 g и 0°С в течение 20 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и высушивали под вакуумом на лиофильной сушке. Непосредственно перед анализом высушенные клеточные лизаты растворяли в 200 мкл смеси метанол/вода 1:1 с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Все ВЭЖХ-МС эксперименты осуществляли с использованием хроматографической системы на хроматографе Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., USA), сопряженном с масс-спектрометром AB Sciex 5600 (AB Sciex, USA).
Результаты оценки накопления ОЭП-ингибитора в резистентных опухолевых клетках представлены в табл. 3 на фиг. 4.
ВЭЖХ-МС анализ внутриклеточного накопления ОЭП-ингибитора показал наличие фемто- и пикомолярных количеств полимера в лизатах клеток, которые культивировались с ОЭП-ингибитором (концентрации ингибитора 8,7, 87 и 870 мкг/мл, время культивирования 96 ч). Примечательно, что с увеличением концентрации ОЭП-ингибитора в культуральной среде с 8,7 до 870 мкг/мл увеличение внутриклеточного содержания не прослеживается. Отсутствие концентрационных зависимостей и низкое содержание ОЭП-ингибитора в лизатах позволяет заключить, что обнаруженные следы ОЭП-ингибитора связаны с его неспецифической адсорбцией на плазматической мембране и не обусловлены его проникновением в цитоплазму клеток, в силу указанного представляется возможным сделать вывод о высокой безопасности заявленного конъюгата.
Пример 12. Оценка влияния ОЭП-ингибитора на трансэпителиальный транспорт доксорубицина через плазматическую мембрану клеток СаСо-2.
- 7 034579
В поляризованных клетках СаСо-2 обратный транспортер P-gp располагается на апикальной стороне цитоплазматической мембраны и осуществляет обратный транспорт (В-А) большого количества субстратов, включая доксорубицин.
Клетки Сасо-2 рассаживали в планшеты с двухкомпонентными ячейками Millicell 96 в количестве 10000 кл/лунку и инкубировали в течение 21 дня при 37°С и 5% СО2. Целостность монослоя проверяли путем измерения электрического сопротивления (TEER) с помощью прибора Millicell-ERS, при значении TEER не менее 3 кОм/лунку начинали эксперимент. Для определения скорости транспорта доксорубицина из апикальной (А) в базолатеральную (В) область [А-В] добавляли по 90 мкл доксорубицина либо доксорубицина и ОЭП-ингибитора (0,087-870 мкг/мл) в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл буфера HBSS в акцепторные лунки нижней плашки. Для определения скорости транспорта из базолатеральной (В) области в апикальную (А) [В-А] добавляли по 90 мкл Буфера HBSS с 1% ДМСО в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл доксорубицина либо доксорубицина и ОЭП-ингибитора (0,087-870 мкг/мл) в нижние лунки плашки. Инкубировали собранную Millicell 96 СаСо-2 систему в течение 2 ч при 37°С на шейкере с перемешиванием при 300 об/мин. Затем отбирали 70 мкл аликвоты из каждой части вставки и подвергали ВЭЖХ-МС анализу с использованием системы QTRAP 5500 (Applied Biosystems) с хроматографом Agilent Infinity 1290 (Agilent Technologies).
Результаты оценки влияния ОЭП-ингибитора на трансэпителиальный транспорт доксорубицина представлены на фиг. 6 в виде скорости проницаемости доксорубицина через плазматическую мембрану клеток СаСо-2.
Как видно, клетки СаСо-2 экспортируют доксорубицин с базолатеральной на апикальную часть мембраны (В-А). ОЭП-ингибитор, воздействуя на P-gp, располагающийся на апикальной части мембраны, ингибирует обратный транспорт доксорубицина, увеличивая его содержание в направлении А-В: в концентрации 8,7 мкг/мл в 1,9 раз, в концентрации 87 мкг/мл в 3,5 раза и в концентрации 870 мкг/мл в 3,8 раза. Данные эксперимента представлены средним значением трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался критерий Стьюдента для множественных сравнений с введением поправки Бонферрони, Р<0,05. В силу указанного представляется возможным сделать вывод о высокой эффективности АТФ-зависимого ингибитора обратных АВС-транспортеров.
Пример 13. Влияние ОЭП-ингибитора на экспрессию P-gp (ABCB1).
ОЭП-ингибитор способен элиминировать активную гликозилированную изоформу 190 кДа АВСВ1, при этом наблюдается накопление в клетках неактивной высокоманнозной изоформы 175 кДа транспортера.
Клетки MCF-7, MCF-7-ABCC1-DsRed (с гиперэкспрессией MRP-1), MCF-7-ABCC2-BFP (с гиперэкспрессией MRP-2), MCF-7-ABCB1-GFP (с гиперэкспрессией P-gp) в концентрации 3х104 клеток/см2 культивировали в полной питательной среде DMEM с добавлением или доксорубицина до конечной концентрации 3 мкМ; или ОЭП-ингибитора до конечной концентрации 261 мкг/мл; или композиции доксорубицин-ОЭП-ингибитор до конечной концентрации 3 мкМ, 261 мкг/мл в течение 48 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Для исследования белков методом иммуноблоттинга (Western Blot) применялся адаптированный и модифицированный протокол АВСАМ (http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/wbbeginner.pdf). Моноклональные антитела к АВСВ1 (кат. № sc-13131, Santa Cruz) были использованы при разведении 1:200. В качестве вторичных использовали антимышиные антитела, конъюгированные с HRP (кат. № ab6728, Abcam) в разведении 1:10000. Моноклональные антитела к β-актину (кат. № mAbcam 8226, Abcam) были использованы при разведении 1:2000. Результаты проведенного анализа визуализировали на приборе ChemiDoc XRS+ system (Bio-Rad).
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на экспрессию P-gp (ABCB1) представлены на фиг. 7.
Белок АВСВ1 представлен 2 изоформами с молекулярным весом в 190 и 175 кДа (фиг. 7, верхний и нижние банды). При этом изоформа 190 кДа представляет собой гликозилированную активную форму белка, а 175 кДа банд представляет высокоманнозный неактивный белок [7]. Результаты свидетельствуют о том, что контрольные клетки MCF-7 содержат эквивалентное количество активного и неактивного белков. Воздействие с доксорубицином увеличивает количество активной формы белка, в то время как ОЭП-ингибитор практически полностью элиминирует активную форму АВСВ1. При этом наблюдается накопление в клетках неактивной формы транспортера. Клетки, подвергшиеся воздействию комбинированного препарата, экспрессируют как активную, так и высокоманнозную формы белка. Экспрессия неактивной формы доказывает, что ОЭП-ингибитор смог частично обратить доксорубицинопосредованную активацию транспортеров. Аналогичную картину мы наблюдаем в клетках, гиперэкспрессирующих гены АВСС1 и АВСС2. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что ОЭПингибитор способен подавлять активность АТФ-зависимых ингибиторов обратных АВС-транспортеров.
Пример 14. Влияние ОЭП-ингибитора на АТФ-азную активность мембран с гиперэкспрессией АВСВ1.
АТФ-азную активность мембранного Р-гликопротеина исследовали с использованием коммерческого препарата изолированных мембран клеток насекомых Spodoptera frugiperda (линия Sf9), гиперэкспрессирующих человеческий рекомбинантный Р-гликопротеин, согласно методике [8]. Гидролиз АТФ в
- 8 034579 процессе каталитической активности Р-гликопротеина сопровождается образованием неорганического фосфата (Pi), детектируемого посредством спектрофотометрической реакции. Показано, что ОЭПингибитор ингибирует АТФ-азную активность с прямой концентрационной зависимостью - с увеличением концентрации ингибирующий эффект увеличивается.
Тестируемый ОЭП-ингибитор в концентрации 8,7-870 мкг/мл инкубировали с рекомбинантными мембранами, гиперэкспрессирующими Р-гликопротеин, и субстратами в 1,5 мл микропробирках в трипликатах. Измеряли оптическую плотность продукта реакции при 880 нм, пропорциональную активности обратного транспортера и АТФ-азной активности фермента. В качестве контролей применяли неспецифический ингибитор активности ферментов - фторид бериллия.
Полученные значения АТФ-азной активности Р-гликопротеина человека изолированных мембран клеток Sf9 в присутствии контрольных ингибиторов и исследуемых соединений представлены в виде гистограммы на фиг. 8.
Установлено, что ОЭП-ингибитор значительно ингибирует АТФ-азную активность Ргликопротеина. Ингибирующая активность ОЭП-ингибитора незначительно уменьшается с увеличением его концентрации с 8,7 до 87 мкг/мл, однако сильно увеличивается при концентрации 870 мкг/мл. В литературных источниках превалирует мнение, что амфифильные блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида ингибируют АТФ-азную активность Р-гликопротеина вследствие встраивания в липидную мембрану и изменения микровязкости липидного микроокружения транспортера [9]-[11]. Исследуемый ОЭП-ингибитор значимо не изменяет микровязкость клеточных мембран, следовательно, механизм его действия не исключает возможности прямого ингибирующего влияния на Р-гликопротеин. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что ОЭП-ингибитор значимо подавляет активность АТФзависимого обратного АВС-транспортера P-gp.
Пример 15. Влияние ОЭП-ингибитора на уровень АТФ в клетках MCF-7, MCF-7/Vin.
Клеточную суспензию (MCF-7 или MCF-7/Vin) плотностью 2х106 клеток/мл инкубировали 2 ч при 25°С с ОЭП-носителем (конечные концентрации 87, 430 и 2175 мкг/мл), или доксорубицином (конечная концентрация 10 мкМ), или композицией доксорубицина с ОЭП-ингибитором в концентрациях 10 мкМ и 87 мкг/мл. Далее клетки осаждали центрифугированием (300g, 4 мин) и промывали в буферном растворе, активирующем выработку АТФ в клетках. Состав буфера: NaCl (122 мМ), NaHCO3 (25 мМ), глюкоза (10 мМ), KCl (3 мМ), MgSO4 (1,2 мМ), K2HPO4 (0,4 мМ), CaCl2 (1,4 мМ) и HEPES (10 мМ). Полученный клеточный осадок лизировали в течение 5 мин в охлажденном лизирующем буфере при интенсивном перемешивании. Состав лизирующего буфера: Tris-HCL (0,05 М), EDTA (2 мМ), TritonX100 (1%), NaF (10 мМ). Лизаты клеток немедленно замораживали и хранили до проведения анализа при -74°С. Непосредственно перед анализом клеточные лизаты размораживали и центрифугировали от клеточного дебриса 7 мин при 20000g, супернатант отбирали для последующего анализа содержания АТФ. Содержание АТФ в клеточных лизатах определяли с помощью хемилюминесцентного метода в реакции с участием люциферазы, D-люциферина и АТФ с использованием высокочувствительного АТФ-реагента производства Люмтек.
Интенсивность хемилюминесценции в реакции окисления люциферина, пропорциональную концентрации АТФ в пробе, определяли с помощью планшетного ридера Infinite 200 PRO (TECAN).
Результаты влияния ОЭП-ингибитора на уровень АТФ в клетках MCF-7, MCF-7/Vin представлены на фиг. 9.
Установлено, что ОЭП-ингибитор при 2-часовом воздействии даже в высокой концентрации не вызывает уменьшения содержания АТФ в клетках MCF-7 и MCF-7/Vin. Из литературы известно, что гидрофобные блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида вызывают уменьшение содержания АТФ в клетках млекопитающих в культуре в результате проникновения в цитоплазму и воздействия на функциональное состояние мембран митохондрий. В частности, показано, что плуроник Р85 изменяет микровязкость мембран митохондрий и разобщает окислительное фосфорилирование [12], [6]. Сопоставляя полученные данные с литературными, можно заключить, что исследуемый ОЭП-ингибитор вследствие особенностей структуры не проникает в цитозоль клеток и не воздействует на функции митохондрий. Совместное применение доксорубицина с ОЭП-ингибитором (ОЭП-ингибитор 87 мкг/мл + DOX 10 мкМ) также не оказало ингибирующего действия на биосинтез АТФ в клетках MCF-7 и MCF-7/Vin. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что АТФ-зависимый ингибитор обратных ABCтранспортеров не влияет на процесс биосинтеза АТФ в опухолевых клетках.
Пример 16. Параметры токсичности ОЭП-ингибитора in vivo.
Исследование острой токсичности ОЭП-ингибитора проводили на мышах линии CD-1 (6-8 недель), крысах линии Sprague Dawley (6-8 недель) и кроликах породы Советская шиншилла (2-2,5 кг) обоего пола при внутривенном и внутрижелудочном способах введения.
Внутрижелудочное введение осуществляли животным, лишенным корма (на промежуток времени не менее 8 ч), со свободным доступом к воде. Объем введения рассчитывали индивидуально для каждого животного, основываясь на массе тела, зарегистрированной непосредственно перед введением вещества. Доступ к корму возобновляли через час после введения.
- 9 034579
Параметры острой токсичности (ЛД50) ОЭП-ингибитора при разных путях введения указаны в табл. 4.
Таблица 4
ЛД50 ОЭП-ингибитора при разных путях введения
Вид животных Способ введения
Мыши CD-1 per os
в/в
Крысы SD per os
в/в
Кролики Советская шиншилла per os
в/в
Пол животных ОЭП-ингибитор, мг/кг
Самцы >5000
Самки >5000
Самцы 1059
Самки 1384
Самцы >5000
Самки >5000
Самцы 1439
Самки 1438
Самцы+самки 4167
Самцы+самки 1183
* per os - внутрижелудочное введение, в/в - внутривенное введение.
Согласно полученным результатам ОЭП-ингибитор при введении внутрижелудочно по степени токсичности относится к нетоксичным веществам, при внутривенном введении - к малотоксичным веществам. При этом известно, что наиболее активный Плуроник L-61, входящий в состав препарата SP1049C, находящегося на 3 стадии клинических исследований, обладает более высокой токсичностью [13]. Так, ЛД50 Плуроника L-61 при внутривенном способе введения мышам соответствует 800 мг/кг. В силу указанного возможно сделать вывод о том, что АТФ-зависимый ингибитор обратных ABCтранспортеров по классу токсичности может быть отнесен к классу малотоксичных и нетоксичных соединений, более безопасных в сравнении с Плуроником L-61.
Приведенные выше заявителем сведения позволяют сделать выводы о том, что заявленный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток значительно увеличивает поглощение лекарственных средств живыми клетками и тканями. При этом ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток характеризуется высокой безопасностью и эффективностью.
Таким образом, в результате экспериментов достигнута поставленная цель - получен новый ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток.
Техническим результатом заявленного технического решения является то, что в результате проведенных исследований получен ОЭП-ингибитор способом, включающим приготовление стартовой системы, оксипропилирование стартовой системы в присутствии щелочного катализатора, нейтрализацию полученного продукта, очистку с получением искомого ОЭП-ингибитора, характеризующимся тем, что соотношение сорбит:гидроокись щелочного или щелочно-земельного металла:бифункциональное кислородсодержащее соединение в стартовой системе рассчитывается таким образом, чтобы в результате их реакции с окисью пропилена получалась эквимольная смесь полиоксипропиленгликоля и полиоксипропиленгексола.
Заявленный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток обладает низкой цитотоксичностью в отношении культур клеток человека по сравнению с большинством описанных в литературе ингибиторов АВС-транспортеров; не влияет на микровязкость цитоплазматических мембран опухолевых клеток линии MCF-7 и клеток MCF-7/RES с приобретенной лекарственной устойчивостью; не проникает через цитоплазматическую мембрану внутрь опухолевых клеток MCF-7; в диапазоне концентраций 8,7870 мкг/мл вызывает специфическое ингибирование P-gp-опосредованного обратного транспорта доксорубицина, увеличивая его концентрации в акцепторных лунках в 1,9-3,8 раз соответственно; способен элиминировать активную гликозилированную изоформу 190 кДа АВСВ1, при этом наблюдается накопление в клетках неактивной высокоманнозной изоформы 175 кДа транспортера; ингибирует АТФ-азную активность изолированных мембран клеток Sf9 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина человека; не изменяет внутриклеточный уровень АТФ; при введении внутрижелудочно по степени токсичности относится к нетоксичным веществам, при внутривенном введении - к малотоксичным веществам; характеризуется простотой получения, дешевизной исходного сырья, производство может быть осуществлено на существующих предприятиях химической отрасли промышленности, обеспечивает возможность выхода на международный рынок с продуктом, ранее не известным в мире.
В списке приведенной литературы представлены некоторые публикации, описывающие состояние области техники, к которой относится заявленное техническое решение.
При этом следует обратить внимание на то, что, основываясь на заявленном техническом решении, представляется возможным проводить различного рода модификации и/или изменения, не выходя за
- 10 034579 объём патентных притязаний.
Заявленное техническое решение соответствует критерию новизна, предъявляемому к изобретениям, по совокупности признаков, приведенных в независимом пункте формулы изобретения, т.к. указанная совокупность признаков не выявлена из исследованного заявителем уровня техники.
Заявленное техническое решение соответствует критерию изобретательский уровень, предъявляемому к изобретениям, т.к. полученный ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения обеспечивают возможность решения неразрешимых ранее проблем, а именно, при значительном увеличении терапевтической эффективности значительно повысить безопасность, а также при этом существенно снизить стоимость готовой лекарственной формы.
Заявленное техническое решение соответствует критерию промышленная применимость, предъявляемому к изобретениям, так как может быть использовано в производстве на специализированных предприятиях, с использованием известных материалов, оборудования и технологий.
Список использованных источников
Choi Y.H., ABC transporters in multidrug resistance and pharmacokinetics, and strategies for drug development / Y.H. Choi, A.M. Yu //Curr. Pharm. Des. 20 (2014), P. 793807
2. Tiwari A.K. Revisiting the ABCs of multidrug resistance in cancer chemotherapy/
A.K. Tiwari, K. Sodani, C.L. Dai, C.R. Ashby Jr., Z.S. Chen // Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2011), P. 570-594
3. Chen Z., Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family in multidrug resistance: A review of the past decade./ Z. Chen, T. Shi, L. Zhang, P. Zhu,
M. Deng, C. Huang, T. Hu et al. 11 Cancer Letters, 370 (2016), P. 153-164
4. Кантор, Ч. Биофизическая химия. Том 2. Методы исследования структуры и функции биополимеров / Ч. Кантор, П. Шиммел, - Москва: МИР, 1985.
5. Batrakova, E.V. Mechanism of sensitization of MDR cancer cells by Pluronic block copolymers: Selective energy depletion / E.V. Batrakova, S. Li, W.F. Elmquist et al. // Br J
Cancer. -2001. -V. 85, N. 12.-P. 1987-1997.
6. Kabanov A.V. An essential relationship between ATP depletion and chemosensitizing activity of Pluronic block copolymers / A.V. Kabanov, E.V. Batrakova, V.Y. Alakhov // J
Control Release. 2003. - V. 91, N. 1-2. - P. 7583.
7. Gautherot, J. Effects of Cellular, Chemical, and Pharmacological Chaperones on the
Rescue of a Trafficking-defective Mutant of the ATP-binding Cassette Transporter Proteins
ABCB1/ABCB4 / J. Gautherot, A-M. Durand-Schneider, D. Delautier, J-L. Delaunay, A. Rada,
J. Gabillet, C. Housset, M. Maurice, T. A’it-Slimane // HEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. - 2012. - Vol. 287. - № 7. - P.5070-5078.
8. Takahashi, K. Purification and ATPase Activity of Human ABCA1 / K. Takahashi, Y.
Kimura, N. Kioka, M. Matsuo, K. Ueda // The Journal of biological chemistry. - 2006. - Vol.
281, № 16. P. 10760-10768.
9. Batrakova, E.V. Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters /
E.V. Batrakova, S. Li, Y. Li, V.Y. Alakhov, A.V. Kabanov // Pharm Res. - 2004. - V. 21, N. 12.
-P. 2226-2233.
10. Regev, R Membrane fluidization by ether, other anesthetics, and certain agents abolishes P-glycoprotein ATPase activity and modulates efflux from multidrug-resistant cells /
R. Regev, Y.G. Assaraf, G.D. Eytan // Eur J Biochem. - 1999. - Vol. 259. - P. 18-24
- 11 034579
11. Womack, M.D. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes / M.D. Womack, D.A. Kendall, R.C. MacDonald // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. - 1983. - Vol. 733. -№ 2. - P. 210-215.
12. Batrakova, E.V. Mechanism of pluronic effect on P-glycoprotein efflux system in blood-brain barrier: contributions of energy depletion and membrane fluidization / E.V. Batrakova, S. Li, S.V. Vinogradov et al. // J Pharmacol Exp Ther. - 2001. - Vol. 299. -№ 2. P. 483-493.
13. SP1049C [Электронный ресурс]. - 2016. - Режим доступа: http://www.supratek.com/pipeline/products

Claims (4)

1. Ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток, относящийся к группе хиральных конъюгатов олигоэфирполиольной природы, представляющий собой смесь полиоксипропиленгексола формулы 4
где n = 2-6, и полиоксипропиленгликоля формулы 5
где m = 5-9, имеющий мольное соотношение соединений 4:5, равное 0,9:1,1, гидроксильное число 215-240 мг КОН/г, соединение 4 имеет молекулярную массу 1000-1500 Да, соединение 5 имеет молекулярную массу от 300 до 500 Да.
2. Ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток по п.1, отличающийся тем, что для соединения 4 n преимущественно равно 4 с предпочтительной молекулярной массой 1200 Да, а для соединения 5 m преимущественно равно 7 с предпочтительной молекулярной массой 400 Да.
3. Ингибитор АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток по п.1, характеризующийся тем, что предпочтительное мольное соотношение соединений 4:5 составляет 1:1.
4. Способ получения ингибитора АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток по п. 1, заключающийся в том, что готовят смесь сорбита и бифункционального кислородсодержащего соединения HR-H, где R=-O-; [-ОСН2СН(СН3)]к-О-, а k=1-7, далее смесь взаимодействует с окисью пропилена в присутствии гидроокиси щелочного или щелочно-земельного металла, далее полученный продукт нейтрализуют кислотой и очищают.
EA201900246A 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения EA034579B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016143074A RU2641304C1 (ru) 2016-11-02 2016-11-02 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения
PCT/RU2017/000809 WO2018084749A1 (ru) 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201900246A1 EA201900246A1 (ru) 2019-07-31
EA034579B1 true EA034579B1 (ru) 2020-02-21

Family

ID=62075563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201900246A EA034579B1 (ru) 2016-11-02 2017-10-31 Ингибитор атф-зависимых обратных транспортеров клеток и способ его получения

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10987429B2 (ru)
EP (1) EP3536315B1 (ru)
JP (1) JP6861424B2 (ru)
CN (1) CN109890375B (ru)
EA (1) EA034579B1 (ru)
RU (1) RU2641304C1 (ru)
WO (1) WO2018084749A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2680834C1 (ru) * 2018-05-23 2019-02-28 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) Противоопухолевая композиция доксорубицина с ингибитором АТФ-зависимых обратных транспортеров клеток
AU2021366966A1 (en) * 2020-10-19 2023-03-02 Oxiteno S.A. Indústria E Comércio Composition, agrochemical formulation, methods for increasing water and nutrient availability and for improving pest control in plants and seeds, and uses of the composition and the agrochemical formulation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027054A1 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Perstorp Specialty Chemicals Ab Process for alkoxylation of di, tri and polyalcohols

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101497559A (zh) * 2008-12-30 2009-08-05 浙江皇马科技股份有限公司 山梨醇和甘油混合醇聚氧丙烯醚的制备方法
RO127401B1 (ro) * 2010-10-06 2013-04-30 Oltchim S.A. Procedeu de obţinere a polieter poliolilor pe bază de sorbită
CN101974149B (zh) * 2010-10-21 2012-07-25 句容宁武新材料发展有限公司 一种聚醚多元醇的制备方法
CN102585201B (zh) * 2011-12-30 2014-04-02 高春青 一种用餐厨废弃物制备硬泡聚氨酯用多元醇的方法
RU2501570C1 (ru) * 2012-05-11 2013-12-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУВПО КФУ) Трехфункциональные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида для доставки активных веществ в живые клетки
RU127401U1 (ru) * 2012-10-16 2013-04-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кузбасский государственный технический университет имени Т.Ф. Горбачева" (КузГТУ) Проходческий комбайн
MX337785B (es) * 2013-02-22 2016-03-18 Bayer Materialscience Ag Procedimiento de preparacion de polioles de polieter.
EP3130924B1 (en) * 2014-04-08 2019-06-12 Kyoto University Method for screening for inhibitor of atp11c or cdc50a
CN104610060A (zh) * 2015-02-05 2015-05-13 南京工业大学 一种高羟值植物油多元醇及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027054A1 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Perstorp Specialty Chemicals Ab Process for alkoxylation of di, tri and polyalcohols

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IKSANOVA A.G. Novaia sistema dostavki biologicheski aktivnykh veshchestv na osnove oligoefirpoliola. 03.01.04-Biokhimiia. Avtoreferat. Dissertatsiia na soiskanie uchenoi stepeni kandidata biologicheskikh nauk. Federalnoe gosudarstvennoe avtonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego professionalnogo obrazovaniia "Kazanskii (Privolzhskii) federalnyi universitet". Kazan-2012 *
SOLODOV V.A. Poliefiry mnogoatomnykh spirtov i razrabotka deemulgiruiushchikh sostavov na ikh osnove. 02.00.13-Neftekhimiia. Avtoreferat. Dissertatsiia na soiskanie uchenoi stepeni kandidata tekhnicheskikh nauk. Kazanskii gosudarstvennyi tekhnologicheskii universitet. Kazan-2007 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018084749A1 (ru) 2018-05-11
EP3536315A4 (en) 2019-11-20
US20190255184A1 (en) 2019-08-22
CN109890375B (zh) 2022-03-22
EA201900246A1 (ru) 2019-07-31
CN109890375A (zh) 2019-06-14
JP6861424B2 (ja) 2021-04-21
JP2020503370A (ja) 2020-01-30
EP3536315B1 (en) 2021-03-31
EP3536315A1 (en) 2019-09-11
US10987429B2 (en) 2021-04-27
RU2641304C1 (ru) 2018-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10993945B2 (en) CDK8-CDK19 selective inhibitors and their use in anti-metastatic and chemopreventative methods for cancer
Chhillar et al. Microwave-assisted synthesis of antimicrobial dihydropyridines and tetrahydropyrimidin-2-ones: novel compounds against aspergillosis
Liu et al. Functionalized chalcones as selective inhibitors of P-glycoprotein and breast cancer resistance protein
JP2021519792A (ja) 新規低分子免疫アゴニスト、免疫標的化合物、およびそれらの応用
Zimmermann et al. N-substituted prodrugs of mebendazole provide improved aqueous solubility and oral bioavailability in mice and dogs
MX2007014843A (es) Induccion apoptotica selectiva en celulas cancerigenas que incluyen activacion apoptotica de procaspasa-3.
US10987429B2 (en) Inhibitor of ATP-dependent cellular reverse transporters and method for producing same
Fraix et al. Cationic lipophosphoramidates with two disulfide motifs: synthesis, behaviour in reductive media and gene transfection activity
Gu et al. Synthesis and biological evaluation of novel bifendate derivatives bearing 6, 7-dihydro-dibenzo [c, e] azepine scaffold as potent P-glycoprotein inhibitors
EP3350182B1 (en) Novel piperazine and piperidine derivatives, their synthesis and use thereof in inhibiting vdac oligomerization, apoptosis and mitochondria dysfunction
Dei et al. Design and synthesis of new potent N, N-bis (arylalkyl) piperazine derivatives as multidrug resistance (MDR) reversing agents
Abu-Fayyad et al. Synthesis, characterization, and in-vitro antitumor activity of the polyethylene glycol (350 and 1000) succinate derivatives of the tocopherol and tocotrienol isomers of Vitamin E
US9012455B2 (en) Pharmaceutical compositions containing an indoyl isoquinoline containing compound and uses thereof
US20150342978A1 (en) Method of inhibiting abcg2 and related treatments
Peng et al. Discovery of novel acridane-based tubulin polymerization inhibitors with anticancer and potential immunomodulatory effects
Mundra et al. Formulation and characterization of polyester/polycarbonate nanoparticles for delivery of a novel microtubule destabilizing agent
KR20020059341A (ko) 치료법-내성 종양의 치료 방법
US11993589B2 (en) Prodigiosin analogs and methods of use
Abu-Fayyad et al. Synthesis, physiochemical characterization, and in vitro antitumor activity of the amide and pH cleavable hydrazone conjugates of γ-tocotrienol isomer of vitamin E with methoxy-poly (ethylene) glycol
US8470888B2 (en) Botryllamides and method of inhibiting PGP in a mammal afflicted with cancer
KR20020059340A (ko) 효소 촉매 항-감염 치료제
Khanifudin et al. The synthesis of cinchonine tiglat ester compound and cytotoxic test against MCF-7 breast cancer cell
Pont et al. Development of potent tripodal G-quadruplex DNA binders and their efficient delivery to cancer cells by aptamer functionalised liposomes
Kamil et al. Benzimidazole derivatives with potential cytotoxic activity-synthesis and their structure-activity relationship
ES2657282A1 (es) Dendrones carbosilano funcionalizados con ácidos grasos: formación de micelas y usos