JP6861424B2 - 細胞のａｔｐ依存性逆輸送体の阻害剤およびそれを得る方法 - Google Patents

Description

本発明は、生理学的活性物質、すなわち、オリゴエーテルポリオール（ＯＥＰ）構造のキラル複合体（光学的に活性な混成分子）群の開発の分野に関し、この物質は、ＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ結合カセット輸送体）と略記される細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤である。本発明は、生物学、薬理学、医薬品、医学、農業および生態学の分野で使用して、請求されたＡＢＣ輸送体の阻害剤の作用に基づいて細胞の多剤耐性の機序を抑えることにより、薬物−抗腫瘍、心臓血管、抗アレルギー性、抗炎症性およびその他の薬物を含む生理学的に活性物質の作用の有効性を大きく高めることができる。

最も急を要する最近の薬物療法の問題の１つは、異常細胞の多剤耐性−薬物に対する細胞の自然または獲得免疫−であり、それらの作用機序および構造は様々である。病理学的細胞薬剤耐性の出現の主要な機序の１つは、ＡＢＣ輸送体ファミリーのＡＴＰ依存性ポンプを用いて、細胞中に侵入する生体異物分子を再捕捉するおよび細胞中に放出する能力である（非特許文献１）。

ＡＢＣ輸送体ファミリーには、Ｐ−ｇｐ糖タンパク質（Ｐ−糖タンパク質）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）が含まれる。これらのＡＢＣ輸送体の活性は、病理過程が細胞中で起こると発現が大きく増大し、薬物療法の有効性の大きな低下に繋がる。このような効果は、標的薬剤を含む、腫瘍の化学療法用のほとんどの薬物の例に対し詳細に示され、研究されている（非特許文献２）が、また、多くの他の病態においても同様に、ＡＢＣ輸送体は薬物の有効性を大きく低減させる。ＡＢＣ輸送体は、広い基質特異性を有し、異なる治療薬群の多くの薬物の逆捕捉および細胞からの放出を行っている。

網羅的ではない例として、ＡＢＣ輸送体基質は（非特許文献３）：鎮痛剤（アシマドリン、フェンタニール、モルヒネ、ペンタゾシン）；抗生物質（アンピシリン、アジスロマイシン、セフォペラゾン、セフトリアキソン、クラリスロマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、グラミシジンＡ、グラミシジンＤ、グレパフロキサシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レボフロキサシン、リファンピシン、スパルフロキサシン、テトラサイクリン、バリノマイシンなど）；抗ウイルス薬（デラビルジン、ロピナビル、ラミブジン、ネルフィナビル、ジドブジン）；抗不整脈薬（アミオダロン、ジゴキシン、リドカイン、プロパフェノン、キニジン、ベラパミル）；抗癌剤（５−フルオロウラシル、アクチノマイシンＤ、ビサントレン、クロラムブシル、コルヒチン、シスプラチン、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲフィチニブ、イリノテカン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、パクリタキセル、タモキシフェン、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、など）；抗ヒスタミン剤（シメチジン、フェキソフェナジン、ラニチジン、テルフェナジン）；抗高脂血症剤（ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン）；カルシウムチャネル遮断薬（アジドピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、ニフェジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、チアパミル、ベラパミル）；抗ＨＩＶ薬（アンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、サキナビル、リトナビル）；免疫抑制薬（シクロスポリンＡ、シロリムス、タクロリムス）抗うつ剤（クロルプロマジン、フェノチアジン）および多くの他の天然、合成または半合成起源の医薬化合物である。

したがって、効果的で安全な細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体阻害剤の生成は、薬物を含む広範囲の生理学的に活性物質の有効性を増大するための有望な手法である。このような薬物の生成は、活性物質の治療量を大きく低減し、その結果として、それらの副作用が大きく低減することにより、薬理学および医学における質的飛躍をもたらすであろう。

ＡＢＣ輸送体を阻害できる承認された薬物を含む研究レベルの技術由来の広範囲の化合物が知られている。したがって、抗癌剤の作用に対する癌細胞の感受性を高める薬物としてのＡＢＣ輸送体阻害剤の生成に関して大規模な研究作業が実施された（非特許文献３）。特に、Ｐ−ｇｐ阻害剤として、アトルバスタチン、アムロジピン、シクロスポリンＡ、ジスルフィラム、ニフェジピン、ベラパミル、製剤ＧＦ１２０９１８、ＬＹ４７５７７６、ＬＹ３３５９７９、ＭＳ−２０９、ＯＣ１４４−０９３、プルロニックＬ６１、ＰＳＣ−８３３、Ｒ１０１９３３、Ｓ９７８８、ＶＸ−７１０、ＸＲ−９５７６、Ｖ−１０４による抗腫瘍併用化学療法が活発になり、研究された。アジスロマイシン、シクロスポリンＡ、フロセミド、グリベンクラミド、プロベネシド、ＭＫ−５７１がＭＲＰ２の阻害剤として研究された。シクロスポリンＡ、ジピリダモール、エラクリダー、フミトレモルジンＣ、ノボビオシン、オルタタキセル、レセルピン、リトナビル、タリキダール、ＧＦ１２０９１８、ＶＸ−７１０、ＸＲ−９５７６がＢＣＲＰ阻害剤として研究された。

これらは、技術レベルから既知であるので、３つのＡＢＣ輸送体阻害剤世代が区別される：
世代１：シクロスポリンＡ、ベラパミル（例として）。これらの化合物は、効果的な逆輸送阻害剤であるが、それ自体で高い毒性がある。化学療法剤としてのそれらの使用は、効果のある臨床成績に繋がらなかった。
世代２：ＰＳＣ−８３３およびＶＸ−７１０（例として）。これらの化合物も、効果的な逆輸送阻害剤である。しかし、化学療法剤としてのそれらの使用は、いずれも効果のある臨床成績に繋がらなかった。加えて、薬物−薬物相互作用に関連する治療の顕著な副作用が観察された。
世代３：ＧＦ１２０９１８、ＬＹ３３５９７９、Ｒ１０１９３３およびＸＲ９５７６（例として）。これらの化合物は、インビトロモデルに対し、世代１および世代２よりもさらに効果的な逆輸送阻害剤である。しかし、化学療法剤としてのそれらの使用は、低い安全性（望ましくない副作用）および不十分な治療効力のいずれかの理由で、効果のある臨床成績に繋がらなかった。

一般に、この分野での研究の現状は、インビトロレベルでの狭い範囲の成功が特徴であるが、しかし、インビボへの移行、およびさらには臨床試験への移行は通常、望ましい効果をもたらさない。その理由は、主として、組成物の望ましくない副作用の存在、最適でない薬物動態学、ならびに阻害効果の有効性の欠如が原因である（非特許文献３）。同時に、全ての最近の研究では、この方向でのさらなる探求の見通しが述べられている。

これに基づいて、この手法の見通しを完全に実現するために、より活性でより安全なＡＢＣ輸送体の阻害剤が必要であることが明らかになる。

出願日における明確な特徴に合致するための請求された技術的解決策の類似体またはプロトタイプは特定されなかったが、しかし、出願者は、意図した目的のための課題を解決する多数の手段を特定した。

請求された技術的解決策は、同時に、治療効力を大きく増大し、安全性を高め、ならびに活性医薬物質のコストを大きく低減し、その物質を得るための製造プロセスの能力を改善する独創的な手法を用いる。同時に、請求された技術的解決策は、以前には世界で未知であった製品により、国際市場へ参入する機会を与える。

Ｃｈｏｉ Ｙ．Ｈ．，ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ／ Ｙ．Ｈ．Ｃｈｏｉ，Ａ．Ｍ．Ｙｕ ／／Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０（２０１４），Ｐ．７９３−８０７ Ｔｉｗａｒｉ Ａ．Ｋ．Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ＡＢＣｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ／ Ａ．Ｋ．Ｔｉｗａｒｉ，Ｋ．Ｓｏｄａｎｉ，Ｃ．Ｌ．Ｄａｉ，Ｃ．Ｒ．Ａｓｈｂｙ Ｊｒ．，Ｚ．Ｓ．Ｃｈｅｎ ／／ Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（２０１１），Ｐ．５７０−５９４ Ｃｈｅｎ Ｚ．，Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｄｅｃａｄｅ．／ Ｚ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｓｈｉ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｐ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｄｅｎｇ，Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈｕ など／／ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７０（２０１６），Ｐ．１５３−１６４ Ｃ．Ｋａｎｔｏｒ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃｈｅｓｋａｙａ ｃｈｉｍｉｙａ ［Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］．Ｖｏｌｕｍｅ ２．Ｍｅｔｏｄｙ ｉｓｓｌｅｄｏｖａｎｉａ ｓｔｒｕｋｔｕｒｙ ｉ ｆｕｎｋｔｓｉｉ ｂｉｏｐｏｌｉｍｅｒｏｖ／ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ］ Ｃ．Ｋａｎｔｏｒ，Ｐ．Ｓｈｉｍｍｅｌ，− Ｍｏｓｃｏｗ：ＭＩＲ Ｐｕｂｌ．，１９８５． Ｂａｔｒａｋｏｖａ Ｅ．Ｖ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＲ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｅｒｇｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ／ Ｅ．Ｖ．Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｓ．Ｌｉ，Ｗ．Ｆ．Ｅｌｍｑｕｉｓｔ など／／ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．−２００１．−Ｖ．８５，Ｎ．１２．−Ｐ．１９８７−１９９７． Ｋａｂａｎｏｖ Ａ．Ｖ．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＡＴＰ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ／ Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｅ．Ｖ．Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｖ．Ｙ．Ａｌａｋｈｏｖ ／／ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００３．− Ｖ．９１，Ｎ．１−２．− Ｐ．７５８３． Ｇａｕｔｈｅｒｏｔ，Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＡＢＣＢ１／ＡＢＣＢ４ ／ Ｊ．Ｇａｕｔｈｅｒｏｔ，Ａ−Ｍ．Ｄｕｒａｎｄ−Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｄ．Ｄｅｌａｕｔｉｅｒ，Ｊ−Ｌ．Ｄｅｌａｕｎａｙ，Ａ．Ｒａｄａ，Ｊ．Ｇａｂｉｌｌｅｔ，Ｃ．Ｈｏｕｓｓｅｔ，Ｍ．Ｍａｕｒｉｃｅ，Ｔ．Ａｉｔ−Ｓｌｉｍａｎｅ ／／ ＨＥＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．− ２０１２．− Ｖｏｌ．２８７．− Ｎｏ． ７．− Ｐ．５０７０−５０７８． Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＡＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＡＢＣＡ１ ／ Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｎ．Ｋｉｏｋａ，Ｍ．Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ．Ｕｅｄａ ／／ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６．Ｖｏｌ．２８１，ｎｏ．１６．Ｐ．１０７６０−１０７６８． Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｅ．Ｖ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５ ｏｎ ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ／ Ｅ．Ｖ．Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｓ．Ｌｉ，Ｙ．Ｌｉ，Ｖ．Ｙ．Ａｌａｋｈｏｖ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ ／／ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００４．Ｖ．２１，Ｎ．１２．Ｐ．２２２６−２２３３． Ｒｅｇｅｖ，Ｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｔｈｅｒ，ｏｔｈｅｒ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ａｇｅｎｔｓ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｆｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ ／ Ｒ．Ｒｅｇｅｖ，Ｙ．Ｇ．Ａｓｓａｒａｆ，Ｇ．Ｄ．Ｅｙｔａｎ ／／ Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９．Ｖｏｌ．２５９．ｐｐ．１８−２４． Ｗｏｍａｃｋ，Ｍ．Ｄ．Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ／ Ｍ．Ｄ．Ｗｏｍａｃｋ，Ｄ．Ａ．Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｃ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ ／／ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）− Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ．− １９８３．− Ｖｏｌ．７３３．−ＮＯ ２．− Ｐ．２１０−２１５． Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｅ．Ｖ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅｆｆｌｕｘ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ：ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ ／ Ｅ．Ｖ．Ｂａｔｒａｋｏｖａ，Ｓ．Ｌｉ，Ｓ．Ｖ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ など／／ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．− ２００１．− Ｖｏｌ．２９９．−ＮＯ ２．− Ｐ．４８３−４９３． ＳＰ１０４９Ｃ ［Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅ］．− ２０１６．− Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｃｅｓｓ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｐｒａｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｉｐｅｌｉｎｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ

請求された技術的解決策の目的は、３００〜５００Ｄａの分子量のポリオキシプロピレングリコールおよび１０００〜１５００Ｄａの分子量のポリオキシプロピレンヘキソールからなるオリゴエーテルポリオールの細胞の逆ＡＢＣ輸送体の阻害剤（ＯＥＰ阻害剤）を得ることである。

請求された技術的解決策の目的は、次の化学プロセスを下記スキームに従って実施することにより達成される：

ここで、
１−ソルビトール（（２Ｓ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−ヘキサン−１，２，３，４，５，６−ヘキソール）；
２−二官能性酸素含有化合物、式中、Ｒ＝−Ｏ−；［−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）］_ｋ−Ｏ−、ｋ＝１〜７；
３−ポリプロピレンオキシド；
Ｍ（ＯＨ）_ｘ‘−金属水酸化物、式中、Ｍは、アルカリまたはアルカリ土類金属、ｘ＝１または２；
ｎ＝２〜６、ほとんどの場合ｎ＝４；
ｍ＝５〜９、ほとんどの場合、ｍ＝７である。

このように、この方法のために請求された技術的解決策は、一度に、１つの反応器中で、１ステップで、等モル比率の光学的に活性な化合物４および化合物５を含む目的の複合体が与えられる比率で加えた入手可能な試薬を用いて、実施される。

全体として、プロセスは、後述のように、上記スキームに従って実施される。

最初の反応物質１および２は、反応器−重合装置中に装填され、アルカリ触媒が加えられ、撹拌が開始され、均一塊を得るために、反応混合物が窒素雰囲気中、９０〜１００℃で３０分間維持される。その後、化合物３の計算量を、重合反応器中で０．３９ＭＰａ（４ｋｇｆ／ｃｍ^２）以下の圧力を与える速度、および１１５℃以下の温度で供給する。この後で、反応生成物は、圧力低下が止むまで、１１５℃以下の温度で１〜１．５時間保持される。

反応物質１、２およびＭ（ＯＨ）_ｘの比が、それらのプロピレンオキシドとの反応の結果として、化合物４と５の等モル混合物が得られるように計算される。ｎ＝４の化合物４およびｍ＝７の化合物５は、記載のアニオン性オリゴマー化反応で形成された主要オリゴマー成分である。化合物３の量は、得られた化合物４と５の等モル混合物が２１５〜２４０ｍｇＫＯＨ／ｇの範囲内のヒドロキシル価を有するように、計算される。

プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラプロピレングリコール、ペンタプロピレングリコール、ヘキサプロピレングリコール、ヘプタプロピレングリコール、もしくは水、またはこれらの混合物は、二官能性酸素含有化合物２として機能し得る。アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物が酸素含有化合物またはソルビトールと相互作用する場合、水が放出され、得られた標的生成物４と５の等モル比を計算する場合には、これも考慮に入れる必要がある。

化合物４に関しては、最適分子量は１２００Ｄａであるが、化合物４は１０００〜１５００Ｄａの範囲でも有効性を示す。化合物５に関しては、最適分子量は４００Ｄａであるが、化合物５は３００〜５００Ｄａの範囲でも有効である。指定範囲を超える分子量も同様に可能であるが、得られたＡＢＣ輸送体阻害剤の活性が幾分低下することを伴う。

ＡＢＣ輸送体阻害剤は、別法によっても得ることができ、それ自体の注目度のためにこれは出願者によっては提供されないが、化合物１と２を、アルカリ触媒作用の条件下で、等モル量で更に機械的混合をして、それぞれ、プロピレンオキシド３と反応させることにより、化合物４と５を別々に得ることから構成される。
本発明は、以下で図により説明される。

ＯＥＰ阻害剤の粘度対温度のプロットである。 ＯＥＰ阻害剤のＨＰＬＣ−ＭＳスペクトル図である。 条件的正常ヒト腫瘍細胞に対する化合物の最大半量増殖阻害濃度（ＣＣ_５０およびＩＣ_５０、μＭ）を示す。 ＨＰＬＣ−ＭＳデータによる分析した細胞ライセート中のＯＥＰ阻害剤の内容を示す。 エフェクター：ＯＥＰ阻害剤；ドキソルビシンならびにＯＥＰ阻害剤、コレステロールおよびトリトンＸ−１００の配合物の添加後の細胞懸濁液中のＤＰＨＴ（１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン）の蛍光偏光を示す。（Ａ）ＭＣＦ−７細胞；（Ｂ）ＭＤＲ ＭＣＦ−７／Ｖｉｎを含む細胞。懸濁液密度は、２ｘ１０^６個の細胞／ｍｌであり、２５℃で次の濃度を有する：ＯＥＰ阻害剤−８．７、８７および８７０μｇ／ｍｌ；ドキソルビシン−１μＭ；コレステロール−１００μｇ／ｍｌ；トリトンＸ−１００〜０．０５％。 極性ＣａＣｏ−２細胞中のドキソルビシンの経上皮輸送のヒストグラムである。略語：頂端面−基底面輸送（Ａ−Ｂ）、基底面−頂端面輸送（Ｂ−Ａ）。 ドキソルビシン、ＯＥＰ阻害剤、またはそれらの組み合わせで４８時間処理後の、元のおよび遺伝子改変ＭＣＦ−７細胞の免疫ブロッティングの結果の写真である。 Ｓｆ９細胞の単離膜（０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質）のヒトＰ−糖タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に与えるエフェクターの作用を示す。対照：５ｍｍｏｌのＡＴＰおよび０．１ｍｍｏｌのビンブラスチンの存在下での膜の基本活性。 ＯＥＰ阻害剤（８７、４３０、２１７５μｇ／ｍｌ）、ドキソルビシン（１０μＭ）およびそれらの配合物（ＯＥＰ阻害剤８７μｇ／ｍｌ＋ＤＯＸ１０μＭ）で処理した細胞ＭＣＦ−７（Ａ）およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ（Ｂ）中のライセートのＡＴＰ含量を示す。

さらに、出願者は、ＯＥＰ阻害剤を得るための方法の実施例を提供する。

ソルビトール−水出発系からＯＥＰ阻害剤を得る方法。
２７．３ｇ（０．１５ｍｏｌ）のソルビトールを、機械的撹拌機、冷却器、熱電対、酸化物注入管を備えた鋼製重合反応器に装填し、０．６ｇ（０．０１ｍｏｌ）の水酸化カリウムを２．５１ｇ（０．１３９ｍｏｌ）の水に加えた。反応器を窒素で３回フラッシングする。撹拌を開始し、均一塊を得るために、窒素雰囲気中、９０〜１００℃で３０分間保持される。温度を１１５℃に上げ、２７０ｇ（４．６５ｍｏｌ）のプロピレンオキシドを、重合反応器中で０．３９ＭＰａ（４ｋｇｆ／ｃｍ^２）以下の圧力を与える速度、および１１５℃以下の温度で少しずつ分けて供給する。計算量のプロピレンオキシドを供給後、反応生成物は、圧力低下が止むまで、１２０℃以下の温度で１〜１．５時間保持される。

得られたＯＥＰ阻害剤をオルトリン酸の５０％の水溶液を用いてｐＨ６．５〜７．５に中和し、８０〜９０℃の温度で真空下で水を除去し、帯布を通してモンモリロナイトで濾過する。全ての操作後、２７０ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６４５ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３８ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２２０ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−プロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
２８．７ｇ（０．１５７ｍｏｌ）のソルビトールを、機械的撹拌機、冷却器、熱電対、酸化物注入管を備えた鋼製重合反応器に装填し、０．６３ｇ（０．０１ｍｏｌ）の水酸化カリウムを１０．９８ｇ（０．１４５ｍｏｌ）のプロピレングリコールに加えた。反応器を窒素で３回フラッシングする。撹拌を開始し、均一塊を得るために、窒素雰囲気中、９０〜１００℃で３０分間保持される。温度を１１５℃に上げ、２７４ｇ（４．７３ｍｏｌ）のプロピレンオキシドを、重合反応器中で０．３９ｍＰａ（４ｋｇｆ／ｃｍ^２）以下の圧力を与える速度、および１１５℃以下の温度で少しずつ分けて供給する。プロピレンオキシドの計算量を供給後、反応生成物は、圧力低下が止むまで、１２０℃以下の温度で１〜１．５時間保持される。

得られたＯＥＰ阻害剤をオルトリン酸の５０％の水溶液を用いてｐＨ６．５〜７．５に中和し、８０〜９０℃の浴温度、真空下で水を除去し、帯布を通してモンモリロナイトで濾過する。全ての操作後、２８５ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６１８ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３５ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２３１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−ジプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．３ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、ジプロピレングリコール−１８．５ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２５５ｇ（４．４ｍｏｌ）である。中和および濾過後、３０８ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６２３ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３６ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２２７ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−トリプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．３ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、トリプロピレングリコール−２６．７ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２４６ｇ（４．２４ｍｏｌ）である。中和および濾過後、２８０ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６２９ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３６ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２２９ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−テトラプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．２９ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、テトラプロピレングリコール−３４．７５ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２４６ｇ（４．２４ｍｏｌ）である。中和および濾過後、２８５ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６２０ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３４ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２３３ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ペンタ、ヘキサ、およびヘプタプロピレングリコールを、プロピレングリコールとプロピレンオキシドとをアルカリ触媒条件下で反応させることにより得た。ヒドロキシル価をそれぞれの試料について測定した。

ソルビトール−ペンタプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．３ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、ペンタプロピレングリコール−４２．８ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２３０ｇ（３．９５ｍｏｌ）である。中和および濾過後、２８５ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６２７ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３３ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２３１ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−ヘキサプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．３１ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、ヘキサプロピレングリコール−５０．８７ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２２２ｇ（３．８３ｍｏｌ）である。中和および濾過後、２８３ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６１５ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３７ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２２５ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

ソルビトール−ヘプタプロピレングリコール出発系からのＯＥＰ阻害剤の調製。
実施例２に示した方法により反応を実施した。出発物質の量：ソルビトール−２７．３ｇ（０．１５ｍｏｌ）、ＫＯＨ−０．６１ｇ（０．０１１ｍｏｌ）、ヘプタプロピレングリコール−５８．９ｇ（０．１４ｍｏｌ）。プロピレンオキシドの量は、２１４ｇ（３．８３ｍｏｌ）である。中和および濾過後、２８３ｇのわずかに黄色の生成物が得られる。粘度は６２３ｍＰａ・ｓ、密度は、１．０３６ｇ／ｃｍ^３（２０℃）である。ヒドロキシル価は、２２４ｍｇ ＫＯＨ／ｇ（ＧＯＳＴ ２５２６１−８２ ｃｌ．３．１）である。

得られたＯＥＰ阻害剤は無色またはわずかに黄色い液体で、室温で５７５〜７１５ＭＰａ・ｓの粘度（図１は、ＯＥＰ阻害剤の粘度の温度依存性を示す）、１．０１〜１．０５ｇ／ｃｍ^３（２０℃）の範囲の密度を有する。ヒドロキシル価は２１５〜２４０ｍｇ ＫＯＨ／ｇであり、１０％溶液（エタノール／水＝７０／３０）のｐＨは５．５〜７．５である。

ＯＥＰ阻害剤は、小さい質量（４００〜１２００Ｄａ）およびより重い質量（１５００〜２０００Ｄａ）の両方の範囲中の一組のｍ／ｃピーク（図２）により特徴付けられ、これは、重縮合反応生成物の統計的セットの存在を反映している。分析は、Ｅｘｔｅｎｄ Ｇｕａｒｄプレカラム（１ｘ１７ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（カラム寸法は、１ｘ１５０ｍｍ、粒子サイズは３．５μｍ）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍクロマトグラフ（真空脱気装置Ｇ１３７９Ｂ、２成分勾配ポンプＧ１３１２Ｂ、カラムサーモスタットＧ１３１６Ａ、自動サンプラーＧ１３６７Ｅ、自動サンプラー用サーモスタットＧ１３３０Ｂ）により実施した。検出器は、ＤｕｏＳｐｒａｙイオン化源を備えた高解像度四重極飛行時間質量分光計ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５６００である。移動相：溶媒Ａは、水とメタノール（９０：１０％）混合物中の１０ｍＭの蟻酸アンモニウム溶液であり；溶媒Ｂはアセトニトリル中の０．１％ギ酸である。ＯＥＰ阻害剤の最強ピークを生物学的マトリックス中の定量分析に使用した。

請求された技術的解決策の技術的結果は、オリゴエーテルポリオール構造のキラル複合体（光学的に活性混成分子）を得る方法であり、このキラル複合体は、抗癌、心臓血管、抗アレルギー、抗炎症およびその他の医薬化合物の内の１つ由来の生理学的活性物質の作用の有効性を大きく高めるための、細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤（ＯＥＰ阻害剤）である。

さらに、出願者は、請求された技術的解決策を実施するために使用される表記および略語を示す。
ＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）
ＡＰＳ−過硫酸アンモニウム
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）−アデノシン ３−リン酸塩
Ｃ−シトシン
ＤＯＸ−ドキソルビシン
ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）
ＦＡＭ−６−カルボキシフルオレセイン
Ｇ−グアニン
ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）
ＬＣ−ＭＳ−質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー
ｍ／ｃ−質量電荷比
Ｐ−ｇｐ−Ｐ−糖タンパク質
ｐＨ−水素指数
Ｐ_ｉ（無機リン酸塩）
Ｔ−チミン
Ｕ／μＬ−マイクロリットル単位
Ｖｉｎ−ビンブラスチン
Ａ_２６０−２６０ｎｍの波長の値（Å単位）
Ａ−アデニン
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ−デオキシリボ核酸
ＤＰＨＴ−ジフェニルヘキサトリエン
薬物−薬用製品
ＤＦ−剤形
Ｍｋｇ−マイクログラム
ＭＬ−ミリリットル
ＭＤＲ−多剤耐性
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物、黄色テトラゾール）−テトラゾリウム色素
ＲＰＭ−回転数／分
ＯＥＰ−オリゴエーテルポリオール
ＲＮＡ−リボ核酸
ＰＳＢ−リン酸塩緩衝液
ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸

材料および方法
化学試薬および材料
ドキソルビシン（ＤＯＸ）塩酸塩、ウアバイン八水和物、ペンタエチレングリコール９８％、Β−メルカプトエタノール、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、硫酸ベリリウム四水和物、フッ化ナトリウム、モリブデン酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。ブロモフェノールブルー、デオキシコール酸ナトリウム、トリス塩酸塩（トリス（オキシメチル）アミノメタン塩酸塩）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）は、Ａｍｒｅｓｃｏ（ＵＳＡ）から購入した。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入した。Ｌ−グルタミン、ダルベッコ溶液（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋イオン不含）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液、ハンクス溶液（フェノールレッド不含）、α−ＭＥＭおよびＤＭＥＭ培地は、ＰａｎＥｃｏ（ロシア）から購入した。１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨＴ）、ジチオスレイトール（１，４−ビス（スルファニル）ブタン−２，３−ジオール）、アスコルビン酸、コレステロール、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、ビンブラスチン硫酸塩、ＡＴＰ二ナトリウム含水塩、ヘペス（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、Ｈｅｌｉｃｏｎから購入した。

細胞培養条件：
細胞ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／Ｖｉｎ、ＨＳＦ、ＣａＣｏ−２、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＯＶＣＡＲ−４、ＰＣ−３、Ａ−４９８、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、Ｍ−１４、ＳＮＢ−１９、ＳＦ Ｃｅｌｌｓ−５３９（表１）を、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ培地を用い、５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で単分子膜が形成されるまで培養する。細胞懸濁液を得るために、細胞単分子膜はトリプシン処理した後、血清含有α−ＭＥＭ培地の添加によりトリプシンを不活化する。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でトリパンブルー色素排除法により細胞計数を実施した。細胞を１：６の比率で週２回継代する。

ＯＥＰ阻害剤の細胞傷害性効果のインビトロ調査
ＯＥＰ阻害剤のヒト腫瘍および条件的正常細胞の増殖性潜在能力に与える効果を、ＭＴＴ試験を用いて、７２時間のインキュベーション中に調査した。１０００個の細胞を９６ウェルプレートのウエルの９０μｌの培地中に加え、ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間インキュベートして、細胞を基材に付着させた。次に、調査化合物（ＯＥＰ阻害剤）の調製溶液の一定分量を１０μｌ／ウエルの量で加えた。試験を３回繰り返した。分析した化合物の代わりに、類似の量のｍＱをプレートの対照ウエル中に導入した。試験物質を適用後、細胞をＣＯ_２インキュベーター中で、標準条件下で７２時間培養した。次に、試験物質を含む培地を真空アスピレータを使ってプレートから取り出し、栄養培地および５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を加え、ＣＯ_２インキュベーター中で３〜４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了後、ＭＴＴ試薬含有培地を真空アスピレータで取りだし、１００μｌのＤＭＳＯを加え、５〜１０分間インキュベートした。出現した紫色の染色を、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて５５５ｎｍで検出した（基準波長は６５０ｎｍ）。用量反応曲線をプロットし、最大半量細胞増殖阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定した。結果を図３の表２に示す。

このように、表の詳細分析により、調査した細胞のＩＣ_５０の大部分では、ＯＥＰ阻害剤は、１．５ｍｇ／ｍｌを超え、これは、請求された複合体が完全に安全であるということを示す、明確に解釈可能な結論を出すことができる。同時に、ＳＮＢ−１９神経膠芽腫およびＳＦ−５３９膠肉腫細胞に対し、ＯＥＰ阻害剤の特異性（ぞれぞれ、ＩＣ_５０が０．４６±０．１２ｍｇ／ｍｌおよび０．４６±０．１２ｍｇ／ｍｌ）を確認することができ、これは、わずかであるとはいえ、これらの細胞型に対するそれ自体のある程度の抗腫瘍作用を示している。

ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞の細胞膜のミクロ粘性に対するＯＥＰ阻害剤の効果の評価
細胞膜の生理学的活性に影響を与える重要な物理化学的特性は、二重層中の脂質の流動性の尺度であるミクロ粘性であり、これは、膜透過性および膜タンパク質の機能動作に重要な役割を果たしている。原形質膜ミクロ粘性を評価するために、ジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨＴ）の親油性指標の使用に基づいた蛍光法を用いる。ＤＰＨＴの蛍光は、細胞膜流動性に依存する。

２ｘ１０^６個の細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液を、１μＭの最終濃度のＤＰＨＴと共に３０分間インキュベートした。次に、一定分量（１０μｌ）のＯＥＰ阻害剤溶液を多チャンネル分注器を用いて、８．７、８７および８７０μｇ／ｍｌの最終濃度まで細胞懸濁液に加えた試料、さらに、１μＭの濃度のドキソルビシンを細胞懸濁液に加えた試料、およびそれとＯＥＰ阻害剤との配合物（ＤＯＸ １μＭ＋ＯＥＰ阻害剤 ８．７μｇ／ｍｌ；ＤＯＸ １μＭ＋ＯＥＰ阻害剤 ８７μｇ／ｍｌ）試料とした。１００μｇ／ｍｌの最終濃度のコレステロール、ならびに０．０５％の濃度の親油性合成洗剤トリトンＸ−１００を、細胞膜のミクロ粘性を大きく変えた陽性対照として試験した。一定分量の試料を導入直後に、ＤＰＨＴの蛍光偏光を１０分の間隔で１時間にわたり検出した。

ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞の細胞膜のミクロ粘性に対するＯＥＰ阻害剤の効果の結果を図５に示す。

このように、得られたデータは、８．７、８７、および８７０μｇ／ｍｌの濃度のＯＥＰ阻害剤、ならびにドキソルビシン、さらにはＯＥＰ阻害剤とのその配合物は、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞懸濁液中のＤＰＨＴの蛍光偏光を大きく変化させなかったことを示す。蛍光偏光は、フルオロフォア微小環境の粘度に比例する（非特許文献４）ので、このことから、試験しているＯＥＰ阻害剤は、試験細胞の細胞膜のミクロ粘性に影響を与えなかったということが結論づけられる。細胞膜のリン脂質よりも大きな粘度を有するコレステロールは、ＤＰＨＴ蛍光の偏光および膜のミクロ粘性を大きく高めた。強力な合成洗剤であるトリトンＸ−１００は、ＤＰＨＴ蛍光の偏光の大きな低下からも明らかなように、細胞膜を徐々に溶解する。調査しているＯＥＰ阻害剤は、哺乳動物細胞の細胞膜のミクロ粘性に大きな作用を示さず、これは、腫瘍細胞の細胞膜の脂質二重層に対し不活性であることを示す。

耐性腫瘍細胞中のＯＥＰ阻害剤の蓄積の評価
いくつかのエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの疎水性ブロックコポリマーは、細胞の細胞膜の障壁に侵入し、細胞質中に蓄積し、細胞内のオルガネラおよび酵素に影響を及ぼす能力を有することが知られている。特に、プルロニックＰ８５は、ミトコンドリアの膜のミクロ粘性を変化させる特性、および酸化的リン酸化を脱共役させる特性を有することが示された（非特許文献５、６）。これに関して、試験したＯＥＰ阻害剤の細胞内の蓄積程度を決定することに着目した。細胞ライセート中の阻害剤含量の特定と定量化を、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を用いて実施した。

ＭＣＦ−７／ＲＥＳ細胞を５０，０００個の細胞／プレートのウエルの量で、６ウェルプレートに分散させて、３７℃、５％ ＣＯ_２下で２４時間培養した。一定分量の阻害剤を細胞に加え、その最終濃度を８．７、８７、および８７０μｇ／ｍｌとし、３７℃、５％ ＣＯ_２下で９６時間培養した。対応する量の脱イオン水を対照試料に加えた。インキュベーション時間の終了後、ＯＥＰ阻害剤含有培地をアスピレータで集めた。ハンクス溶液で懸濁させることによりプレート表面から細胞を分離し、１５ｍｌのチューブに移し、少なくとも５回洗浄した（４００ｇ、４分）。１５０μｌの内部標準−１０^−５Ｍの濃度のペンタエチレングリコール−含有脱イオン水を細胞ペレットに加えた。凍結および解凍（−７５℃で４分間、３７℃の水浴中で２分間インキュベート）を２サイクル行って細胞を溶解し、続けて、４分間超音波処理した。その後の、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキットを用いた試料中のタンパク質量の測定のために、一定分量のライセートを採取した。７００μｌの冷却メタノールを細胞ライセートに加え、−２０℃で１５分間インキュベートし、続けて、０℃で２０分間、１７４００ｇの遠心分離を行った。上清を清浄なチューブに移し、凍結乾燥機中で真空下で乾燥した。分析の直前に、乾燥した細胞ライセートを、２００μｌの０．１％ギ酸補充メタノール／水（１：１）混合物に溶解した。全てのＨＰＬＣ−ＭＳ実験を、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５６００質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ，ＵＳＡ）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）のクロマトグラフシステムを使って実施した。

耐性腫瘍細胞中のＯＥＰ阻害剤の蓄積の評価の結果を図４の表３に示している。

ＯＥＰ阻害剤の細胞内蓄積のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、ＯＥＰ阻害剤と培養した（阻害剤濃度：８．７、８７および８７０μｇ／ｍｌ、培養時間は９６時間）細胞ライセート中のフェムトおよびピコモル量のポリマーの存在を示した。培地中のＯＥＰ阻害剤の濃度の８．７〜８７０μｇ／ｍｌへの増加と一緒に、細胞内の含量の増加が観察されなかったことは注目に値する。濃度依存性の非存在およびライセート中のＯＥＰ阻害剤の低含量は、検出された微量のＯＥＰ阻害剤が、細胞膜上のその非特異的吸着と関連し、細胞の細胞質中へのその浸透に起因しないことを示唆する。したがって、複合体は高度に安全であると、結論できる。

ＣａＣｏ−２細胞の細胞膜を横切るドキソルビシンの経上皮輸送に対するＯＥＰ阻害剤の効果の評価
極性ＣａＣｏ−２細胞では、逆Ｐ−ｇｐ輸送体は、細胞膜の頂端面側に位置し、ドキソルビシンを含む多数の基質の逆輸送（Ｂ−Ａ）を可能とする。

ＣａＣｏ−２細胞をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ９６ ２成分プレートに、１０，０００個細胞／ウエルで播種し、３７℃、５％ Ｃｏ_２下で２１日間インキュベートした。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ測定器を用いて、単分子膜の健全性を電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を測定することにより調べ、少なくとも３ＫΩ／ウエルのＴＥＥＲ値で、実験を開始した。頂端面（Ａ）から基底面（Ｂ）への領域［Ａ−Ｂ］のドキソルビシンの輸送速度を測定するために、９０μｌのドキソルビシンまたはドキソルビシンとＯＥＰ阻害剤（０．０８７〜８７０μｇ／ｍｌ）を３つのフィルター付きウエルに加え、２５０μｌのＨＢＳＳ緩衝液を下側プレートのアクセプターウエルに加えた。基底面（Ｂ）から頂端面（Ａ）の領域［Ｂ−Ａ］のドキソルビシンの輸送速度を測定するために、９０μｌのＨＢＳＳ緩衝液を１％ＤＭＳＯと共に３つのフィルター付きウエルに加え、２５０μｌのドキソルビシンまたはドキソルビシンとＯＥＰ阻害剤（０．０８７〜８７０μｇ／ｍｌ）を下側プレートのウエルに加えた。組み立てたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ９６ ＣａＣｏ−２システムを３７℃で２時間、震盪機上で、３００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。その後、７０μｌの一定分量をインサートの各部分より採取し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０ クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたＱＴＲＡＰ ５５００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるＨＰＬＣ−ＭＳ分析に供した。

ドキソルビシンの経上皮輸送に対するＯＥＰ阻害剤の効果の評価結果を、ＣａＣｏ−２細胞の細胞膜を横切るドキソルビシンの透過速度として、図６に示す。

図から分かるように、ＣａＣｏ−２細胞は、膜の基底面から頂端面部分へ（Ｂ−Ａ）ドキソルビシンを輸送する。膜の頂端面部分に位置するＰ−ｇｐに作用するＯＥＰ阻害剤は、ドキソルビシンの逆輸送を抑制し、方向Ａ−Ｂの含量を：８．７μｇ／ｍｌの濃度で１．９倍、８７μｇ／ｍｌの濃度で３．５倍および８７０μｇ／ｍｌの濃度で３．８倍、増大させる。実験データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差により示される。統計処理のために、ボンフェローニの補正を導入した多重比較に対しスチューデントの基準、Ｐ≦０．０５を用いた。したがって、逆ＡＢＣ輸送体のＡＴＰ依存性阻害剤は、高度に効果的であると結論することが可能であると思われる。

Ｐ−ｇｐ（ＡＢＣＢ１）発現に対するＯＥＰ阻害剤の効果
ＯＥＰ阻害剤は、活性グリコシル化アイソフォーム１９０ｋＤａ ＡＢＣＢ１を除去できるが、不活性高マンノースアイソフォーム１７５ｋＤａ輸送体は、細胞中に蓄積される。

３ｘ１０^４個の細胞／ｃｍ^２の濃度の、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７−ＡＢＣＣ１−ＤｓＲｅｄ（過剰発現ＭＲＰ−１を含む）、ＭＣＦ−７−ＡＢＣＣ２−ＢＦＰ（過剰発現ＭＲＰ−２を含む）、ＭＣＦ−７−ＡＢＣＢ１−ＧＦＰ（過剰発現Ｐ−ｇｐを含む）細胞を、完全ＤＭＥＭ栄養培地中で、３μＭの最終濃度としたドキソルビシン；または２６１μｇ／ｍｌの最終濃度としたＯＥＰ阻害剤；または３μＭ：２６１μｇ／ｍｌの最終濃度としたドキソルビシン−ＯＥＰ阻害剤配合物と共に、５％ ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で４８時間培養した。適合させ、変更したＡＢＣＡＭプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｐｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｗｂ−ｂｅｇｉｎｎｅｒ．ｐｄｆ）を用いて、免疫ブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）によりタンパク質を調査した。ＡＢＣＢ１に対するモノクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−１３１３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、１：２００の希釈で用いた。１：１０，０００で希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体−（カタログ番号ａｂ６７２８、Ａｂｃａｍ）を２次抗体として使用した。β−アクチンに対するモノクローナル抗体（カタログ番号ｍＡｂｃａｍ ８２２６、Ａｂｃａｍ）を、１：２０００の希釈で用いた。分析の結果をＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で可視化した。

Ｐ−ｇｐ発現（ＡＢＣＢ１）に対するＯＥＰ阻害剤の効果の結果を図７に示す。

ＡＢＣＢ１タンパク質は、１９０ｋＤａと１７５ｋＤａの分子量の２つのアイソフォームにより表される（図７、上段と下段のバンド）。同時に、１９０ｋＤａアイソフォームは、タンパク質のグリコシル化活性型であり、１７５ｋＤａのバンドは高マンノース不活性タンパク質である（非特許文献７）。結果は、ＭＣＦ−７対照細胞は、等価量の活性および不活性タンパク質を含むことを示す。ドキソルビシンへの曝露は、タンパク質の活性型の量を高め、一方、ＯＥＰ阻害剤はほぼ完全に活性型のＡＢＣＢ１を除去する。同時に、不活性型の輸送体は細胞中に蓄積される。複合薬へ曝露された細胞は、活性型および高マンノース型の両方のタンパク質を発現する。不活性型の発現は、ＯＥＰ阻害剤が輸送体のドキソルビシン媒介活性化を部分的に逆転させることができることを実証している。我々は、ＡＢＣＣ１およびＡＢＣＣ２遺伝子を過剰発現している細胞中でも類似の状況を確認している。したがって、ＯＥＰ阻害剤は、逆ＡＢＣ輸送体のＡＴＰ依存性阻害剤の活性を抑制できると結論することが可能である。

ＡＢＣＢ１の過剰発現を有する膜のＡＴＰアーゼ活性に対するＯＥＰ阻害剤の効果
膜Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を、ヒト組換えＰ−糖タンパク質を過剰発現している単離昆虫細胞膜ヨトウガ（Ｓｆ９系統）の市販の調製物を用いて方法（非特許文献８）に従って調査した。Ｐ−糖タンパク質の触媒作用中のＡＴＰ加水分解は、無機リン酸塩（Ｐｉ）の形成に付随して起こることが、分光光度法反応により検出される。ＯＥＰ阻害剤は、直接濃度依存性的にＡＴＰアーゼ活性を抑制し、濃度が増加すると、阻害効果が高まることが示された。

８．７〜８７０μｇ／ｍｌの濃度の試験ＯＥＰ阻害剤を、Ｐ−糖タンパク質および基質を過剰発現している組換え膜と共に、１．５ｍｌのマイクロチューブ中で３回繰り返してインキュベートした。逆輸送体の活性および酵素のＡＴＰアーゼ活性に比例して、反応生成物の光学密度を８８０ｎｍで測定した。非特異的酵素活性阻害剤−フッ化物ベリリウム−を対照として使用した。

対照阻害剤および試験化合物の存在下でのＳｆ９細胞の単離膜のヒトＰ−糖タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の得られた値を図８にヒストグラムとして示す。

ＯＥＰ阻害剤は、Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を大きく抑制することが確認された。ＯＥＰ阻害剤の阻害活性は、阻害剤の濃度が８．７から８７μｇ／ｍｌに増加するに伴いわずかに低下するが、８７０μｇ／ｍｌの濃度ではその活性は大きく増加する。文献における通常の見解は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの両親媒性ブロックコポリマーは、脂質膜中への組み込みおよび輸送体の脂質微小環境のミクロ粘性の変化に起因して、Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害するということである（非特許文献９〜１１）。調査中のＯＥＰ阻害剤は、細胞膜のミクロ粘性を大きく変化させず、したがって、その作用機序は、Ｐ−糖タンパク質に対する直接阻害効果の可能性を排除しない。したがって、ＯＥＰ阻害剤は、Ｐ−ｇｐのＡＴＰ依存性逆ＡＢＣ輸送体の活性を大きく抑制すると結論することが可能である。

ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞中のＡＴＰのレベルに対するＯＥＰ阻害剤の効果
２ｘ１０^６個の細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液（ＭＣＦ−７またはＭＣＦ−７／Ｖｉｎ）をＯＥＰ担体（最終濃度８７，４３０および２１７５μｇ／ｍｌ）またはドキソルビシン（最終濃度１０μＭ）、またはそれぞれ１０μＭおよび８７μｇ／ｍｌの濃度のドキソルビシンおよびＯＥＰ阻害剤の配合物と共に、２５℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離（３００ｇ、４分）により沈降させ、細胞中のＡＴＰ産生を活性化する緩衝液中で洗浄した。緩衝液組成：ＮａＣｌ（１２２ｍＭ）、ＮａＨＣＯ_３（２５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（３ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４（１．２ｍＭ）、（Ｋ_２ＨＰＯ_４）（０．４ｍＭ）、ＣａＣｌ_２（１．４ｍＭ）およびヘペス（１０ｍＭ）。得られた細胞ペレットを冷却溶解緩衝液中で強力に撹拌しながら５分間溶解した。溶解緩衝液の組成：トリス塩酸（０．０５Ｍ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）、トリトンＸ−１００（１％）、ＮａＦ（１０ｍＭ）。細胞ライセートを直ぐに凍結し、分析まで−７４℃で貯蔵した。分析の直前に細胞ライセートを解凍し、２０，０００ｇで７分間、細胞デブリから遠心分離し、次工程のＡＴＰ含量の分析のために上清を収集した。Ｌｕｍｔｅｋにより製造された高感受性ＡＴＰ試薬を使って、ルシフェラーゼ、Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰを含む反応における化学発光技術を用いて細胞ライセート中のＡＴＰ含量を測定した。試料中のＡＴＰ濃度に比例するルシフェリン酸化反応中の化学発光強度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使って測定した。

ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞中のＡＴＰレベルに対するＯＥＰ阻害剤の効果の結果を図９に示す。

ＯＥＰ阻害剤の２時間曝露は、高濃度であっても、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞中のＡＴＰ含量の低下をもたらさないことが確認された。文献から、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの疎水性のブロックコポリマーは、細胞質中への浸透およびミトコンドリア膜の機能状態に対する影響の結果として、培養液中の哺乳動物細胞のＡＴＰ含量を低下させることが知られている。特に、プルロニックＰ８５は、ミトコンドリアの膜のミクロ粘性を変化させ、酸化的リン酸化を脱共役させることが示された（非特許文献１２、６）。得られたデータと、文献データとを比較すると、調査したＯＥＰ阻害剤は、構造の性質に起因して、細胞のサイトゾル中に浸透せず、ミトコンドリアの機能に影響を与えないことが結論できる。ドキソルビシンとＯＥＰ阻害剤との組み合わせ使用（ＯＥＰ阻害剤８７μｇ／ｍｌ＋ＤＯＸ１０μＭ）も同様に、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／Ｖｉｎ細胞中のＡＴＰ生合成を抑制しなかった。したがって、逆ＡＢＣ輸送体のＡＴＰ依存性阻害剤は、腫瘍細胞中のＡＴＰ生合成プロセスに影響を与えないと結論することが可能である。

ＯＥＰ阻害剤のインビボ毒性のパラメーター
ＯＥＰ阻害剤の急性毒性の調査を、静脈内および胃内投与法により、両方の性の、ＣＤ−１系統（６〜８週齡）のマウス、スプラーグドーリーラット（６〜８週齡）およびＳｏｖｉｅｔ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａウサギ（２〜２．５ｋｇ）で実施した。

食料を与えていない（８時間以上の期間）が水は自由に与えた動物に対し、胃内投与を実施した。投与の量は、投与の直前に記録した体重を基準にして、各動物に対し個別に計算した。フィードは投与の１時間後に新しくした。

種々の投与経路によるＯＥＰ阻害剤の急性毒性（ＬＤ_５０）のパラメーターを表４に示す。

得られた結果によると、ＯＥＰ阻害剤は、毒性の程度に従って、胃内投与の場合、非毒性物質に属し、静脈内に投与される場合には、低毒性物質に属する。第３相の臨床試験が行われている薬物ＳＰ１０４９Ｃの一部である活性プルロニックＬ−６１のほとんどは、より高い毒性を有する（非特許文献１３）ことが知られている。このように、マウスの静脈内投与経路によるプルロニックＬ−６１のＬＤ_５０は、８００ｍｇ／ｋｇに相当する。したがって、毒性クラスに従って、逆ＡＢＣ輸送体のＡＴＰ依存性阻害剤は、プルロニックＬ−６１と比較してより安全である低毒性および非毒性化合物に割り付けることができると結論することが可能である。

出願者により提供される上記情報は、請求された細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤は、生細胞および組織による薬物の吸収を大きく増加させるという結論に繋がる。同時に、細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤は、高い安全性と有効性を特徴とする。

したがって、実験の結果として、目標は達成され−細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の新規阻害剤が得られた。

請求された技術的解決策の技術的結果は、実施した研究の結果として、ＯＥＰ阻害剤が、出発系の調製、出発系のアルカリ触媒の存在下でのオキシプロピル化、得られた生成物の中和、目的のＯＥＰ阻害剤を得るための精製を含む方法により得られ、出発系中のソルビトール比率：アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物：二官能性酸素含有化合物が、それらのプロピレンオキシドとの反応の結果として、ポリオキシプロピレングリコールとポリオキシプロピレンヘキソールの等モル混合物が得られるように計算されることを特徴とすることである。

請求された細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤は：
−文献に記載されているほとんどのＡＢＣ輸送体の阻害剤と比較して、ヒト細胞培養物に対して低細胞毒性を有する；
−後天性薬剤耐性を有するＭＣＦ−７系統およびＭＣＦ−７／ＲＥＳ細胞の腫瘍細胞の細胞膜のミクロ粘性に影響を与えない；
−細胞膜を通ってＭＣＦ−７の腫瘍細胞中へ浸透しない；
−８．７〜８７０μｇ／ｍｌの濃度範囲で、これは、ドキソルビシンのＰ−ｇｐ媒介逆輸送の特異的阻害をもたらし、アクセプターウエル中の濃度をそれぞれ１．９〜３．８倍増大させる；
−活性グリコシル化アイソフォーム１９０ｋＤａ ＡＢＣＢ１を除去でき、一方、不活性高マンノースアイソフォーム１７５ｋＤａ輸送体は、細胞中に蓄積される；
−ヒトＰ−糖タンパク質を過剰発現したＳｆ９細胞の単離膜のＡＴＰアーゼ活性を抑制する；
−ＡＴＰの細胞内のレベルを変化させない；
−毒性の程度に従って、胃内投与の場合、非毒性物質に属し、静脈内に投与される場合には、低毒性物質に属する；
−製造の容易さ、原材料の安さ、生産が既存の化学産業企業で実施できる；
−以前には世界で未知であった製品により、国際市場へ参入する機会を与える。

参考文献のリストは、請求された技術的解決策が関連する最先端技術を記載するいくつかの刊行物を含む。

同時に、特許請求の範囲を逸脱することなく、請求された技術的解決策に基づいて、様々な修正および／または変更が実施できることに留意されたい。

請求された技術的解決策は、本発明の独立請求項で与えられた一連の特徴に基づいて、本発明に該当する「新規」の基準に適合する。理由はこの一連の特徴は、出願者により調査された技術のレベルからは特定されなかったためである。

請求された技術的解決策は、本発明に該当する「進歩性」の基準に適合する。理由は、得られた細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤およびそれを得る方法は、以前には解決できない問題を解決する可能性、すなわち、治療効力の顕著な増大をもたらし、安全性を大きく高め、また、完成剤形のコストを大きく低減する可能性を提供するためである。

請求された技術的解決策は、既知の材料、装置および技術を用いて特殊化された事業で生産に使用できるので、本発明に該当する「産業上の利用可能性」の基準に適合する。

Claims (3)

1. オリゴエーテルポリオール構造のキラル複合体（光学的に活性な混成分子）群に属する、細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤であって、式４：
   

   

   ,
   （式中、ｎ＝２〜６）のポリオキシプロピレンヘキソールと、
   式５：
   

   

   ,
   （式中、ｍ＝５〜９）のポリオキシプロピレングリコールとの混合物である、細胞のＡＴＰ依存性逆輸送体の阻害剤。
2. ソルビトール（（２Ｓ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−ヘキサン−１，２，３，４，５，６−ヘキソール）および二官能性酸素含有化合物Ｈ−Ｒ−Ｈの混合物を調製し、式中、Ｒ＝−Ｏ−；［−ＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）］_ｋＯ−、およびｋ＝１〜７であり、この混合物とプロピレンオキシドとをアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物の存在下でさらに相互作用させ、前記得られた生成物を酸でさらに中和し、続けて、前記得られた生成物を精製して目的の請求項１に記載のＡＴＰ依存性逆細胞輸送体の阻害剤を得ることを含み、得られた請求項１に記載の阻害剤が、２１５〜２４０ｍｇ ＫＯＨ／ｇのヒドロキシル価を有し、化合物４が１０００〜１５００Ｄａの分子量を有し、化合物５が３００〜５００Ｄａの分子量を有し、ならびに化合物４および５のモル比が０．９〜１．１である、請求項１に記載のＡＴＰ依存性逆細胞輸送体の阻害剤を製造する方法。
3. 前記化合物４および５のモル比が、１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の阻害剤。

Images