EA032179B1

EA032179B1 - Гемисульфатная соль 5,10-метилен-(6r)-тетрагидрофолиевой кислоты

Info

Publication number: EA032179B1
Application number: EA201600172A
Authority: EA
Inventors: Рудольф Мозер; Виола Грён; Томас Эггер; Томас Амманн
Original assignee: Мерк Э Сие
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2014-08-14
Publication date: 2019-04-30
Also published as: IL269170B; SG11201601016PA; EA201600172A1; CY1119694T1; EP2837631A1; IL244069A0; CN105452250A; NZ745811A; RS61986B1; HK1217018A1; HUE054504T2; EP3287460A1; US20190106431A1; PL3033344T3; EP3287460B1; KR102439605B1; ES2871483T3; HUE037615T2; JP7396960B2; CA2921178A1

Abstract

Изобретение касается гемисульфатной соли 5,10-метилен-(6R)-тетрагидрофолиевой кислоты, предпочтительно по сути в кристаллической форме, а также фармацевтических композиций и их применения в терапии, предпочтительно химиотерапии.

Description

Настоящее изобретение касается гемисульфатной соли 5,10-метилен-(6К)-тетрагидрофолиевой кислоты, предпочтительно по сути в кристаллической форме, а также фармацевтических композиций и их применения в терапии, предпочтительно химиотерапии.

Уровень техники

Восстановленный фолат 5,10-метилен-5,6,7,8-тетрагидрофолат (5,10-СН₂-ТНР) известен как эффективное цитостатическое средство и предпочтительно вводится в комбинации с фторированными пиримидинами, такими как 5-фтороурацил (5-Ρϋ), в лечении солидных опухолей (8е1еу, К.Ь. Штидк 4(1), 99, 2001). 5,10-СН₂-ТНР достигает своего химиотерапевтического эффекта вместе с аналогом основания и метаболит 5-Ρϋ 5-ΕάϋΜΡ путем ингибирования фермента тимидилатсинтазы (Т8). Т8 катализирует преобразование дезоксиуридилата (άϋΜΡ) в дезокситимидилат (бТМР), который является основной структурной единицей для синтеза ДНК. Дезактивация Т8 происходит путем образования ковалентного, тройного ингибирующего комплекса между Т8, аналогом основания 5-РбБМР. который является метаболитом 5-Ри, и 5,10-СН₂-ТНР. Усиление цитотоксического эффекта 5-Ρϋ может достигаться путем повышения внутриклеточной концентрации 5,10-СН₂-ТНР, после чего повышается устойчивость тройного комплекса. Это вызывает прямое ингибирование синтеза и репарации ДНК, которое в конечном итоге приводит к гибели клеток и задержке роста опухоли.

Однако существуют нежелательные свойства, связанные с 5,10-СН₂-ТНР, которые до настоящего времени ограничивали его фармацевтическое применение. Общеизвестно, что для соответствия фармацевтическому применению действующее вещество (такое как 5,10-СН₂-ТНР) должно отвечать нескольким требованиям, включая (ί) высокую (химическую, изомерную, кристаллическую) устойчивость самого действующего вещества, а также его фармацевтических композиций, таким образом, чтобы достигалось эффективное хранение в течение приемлемого периода времени без проявления значительных изменений в физико-химических характеристиках действующего вещества, (ίί) высокую (химическую, изомерную, кристаллическую) чистоту действующего вещества, (ίίί) легкость в обращении и обработке действующего вещества, позволяющая преобразовывать действующее вещество в подходящие композиции, и т.п.

5,10-СН₂-ТНР является продуктом присоединения тетрагидрофолиевой кислоты (ТНР) и формальдегида (см., например, Рое, М. е1 а1. ВюсйешЫту 18 (24), 5527, 1979; Ка11еп, КО. МеШобк ίη Еихуто1оду 18В, 705, 1971) и известен своей чрезвычайно высокой чувствительностью к окислению под воздействием воздуха, а также неустойчивостью в нейтральных и/или кислых средах, что может вести к химическому распаду и/или гидролизу (см., например, Οάίη, Е. е1 а1., Саисег 1пуек(1да(1ои 16 (7), 447, 1998; ОкЬогп, М.1. е1 а1., 1. Ат. СЬет. 8ос. 82, 4921, 1960; На\\кек, 1. и УШо1а, К. Рооб 8с1. Νυίτ. 28, 439, 1989). Попытки стабилизации 5,10-СН₂-ТНР включали, например, (ί) полное исключение атмосферного кислорода путем применения специальных технических средств для восстановления твердых композиций и нагнетание 5,10-СН₂-ТНР в безвоздушной среде (см., например, Οάίη, Е. е1 а1., Саисег 1пуекОда1юп 16 (7), 447, 1998; патент США № 4564054); (ίί) добавление восстановителя, такого как Ь(+)-аскорбиновая кислота или ее соли, восстановленный гамма-глутатион, бета-меркаптоэтанол, тиоглицерин, Ν-ацетил-Ьцистеин и т.п. в качестве антиоксиданта для высокочувствительного 5,10-СН₂-ТНР, в частности для ТНР; (ш) стабилизацию при помощи соединений включения циклодекстрина (см., например, документ ЕР 0579996 В1); (ίν) добавление цитрата при доведении уровня рН до основного значения (см., например, документ ЕР 1641460 В1) или (ν) образование разных солей, таких как сульфатная соль (см., например, документ ЕР 0537492 В1).

Несмотря на это, сохраняется значительная потребность в стабилизированных соединениях 5,10СН2-ТНР, которые демонстрируют высокую (химическую, изомерную и/или кристаллическую) чистоту и/или обладают высокой устойчивостью как в качестве соединений, так и при рецептировании в фармацевтические композиции, и при этом могут быть эффективно приготовлены, очищены и выделены и/или поддаются манипуляциям (например, для обеспечения соответствующей растворимости в фармацевтически приемлемых растворителях, текучести и размера частиц), и/или композиция с пренебрежимым распадом или изменением физических и химических характеристик соединения, предпочтительно рецептированная при высокой молярной концентрации (с целью минимизации количества материала, который должен быть рецептирован и введен для обеспечения терапевтически эффективной дозы).

Тем не менее, существование устойчивой твердой (полиморфной) формы химического соединения (известного) с этими подходящими свойствами невозможно рассчитать. Так же невозможно спрогнозировать, каким может быть характер этой твердой формы, т.е. является ли она солью, безводной, гидратированной или сольватированной формой, не говоря уже о специфических условиях, в которых может быть выделен конкретный полиморф (например, условия кристаллизации и переменные параметры, такие как растворители, температура, рН и т.п.). Выбор и контроль таких параметров являются ключевыми факторами для получения нужной твердой формы с высокой чистотой, стойкостью и технологичностью. Эти характеристики являются важными факторами, непосредственно влияющими на свойства и эффективность продуктов и их последующее применение. Невозможно спрогнозировать, какие из многих переменных (т.е. рН раствора, температура, давление, время, состав раствора, тип и концентрация приме

- 1 032179 сей) будут определяющим фактором.

Неожиданно было обнаружено, что преобразование (бК)-изомера 5,10-СН₂-ТНР [(6К)-5,10-СН₂ТНР] в его гемисульфатную соль обеспечивает отличную стойкость соединения, а также его фармацевтических композиций и, таким образом, позволяет преодолевать вышеупомянутые недостатки. Благоприятные характеристики стойкости гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНР обеспечивают возможность эффективного применения этого соединения в медицине.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение в первом аспекте касается гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНР (в дальнейшем также именуемой гемисульфатной солью согласно изобретению или соединением согласно изобретению).

Предпочтительно гемисульфатная соль (6К)-5,10-СН₂-ТНР является химически и/или изомерно и/или кристаллически чистой формой, более предпочтительно гемисульфатная соль (6К)-5,10-СН₂-ТНР пребывает по сути в кристаллической форме.

В конкретных вариантах осуществления гемисульфатная соль (6К.)-5,10-СН₂-ТНР пребывает в безводной форме, поэтому в предпочтительном варианте осуществления гемисульфатная соль (6К.)-5,10СН₂-ТНР пребывает в кристаллической безводной форме.

Предпочтительно гемисульфатная соль (6К.)-5,10-СН₂-ТНР пребывает в кристаллической форме, характеризующейся одной или несколькими пиковыми позициями рентгенограммы под углом дифракции 2 тета (2Θ) 4,7°, 17,9° и 23,3°, выраженным в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение).

В конкретных вариантах осуществления гемисульфатная соль (6К.)-5,10-СН₂-ТНР характеризуется тем, что обеспечивает Фурье-Раман-спектр, содержащий пики при волновых числах (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363 см^-1.

В еще одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих гемисульфатную соль (6К.)-5,10-СН₂-ТНР и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель, необязательно также включающий как минимум одно дополнительное терапевтическое средство, включая, помимо прочих, бактерициды, антибиотики, противовирусные средства, антисептики, противоопухолевые средства, противораковые соединения, такие как химиотерапевтические средства, противогрибковые средства и/или противовоспалительные средства или другие биологически активные или терапевтические средства, подходящие для применения для человека, в частности, противораковые соединения, такие как химиотерапевтические средства, например 5-РИ и производные, и антифолаты, например метотрексат, пеметрексед.

В еще одном аспекте настоящее изобретение касается применения гемисульфатной соли (6К.)-5,10СН₂-ТНР (или ее фармацевтических композиций) в терапии, предпочтительно в противораковой химиотерапии.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - рамановский спектр гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1), записанный с использованием номинального уровня мощности лазерного излучения 300 мВт и 64 сканограмм.

Фиг. 2 (а) - рентгеновская порошковая дифрактограмма гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1), записанная в режиме отражения; фиг. 2(Ь) - рентгеновская порошковая дифрактограмма гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1), записанная в режиме передачи; фиг. 2(с) - сравнение рентгеновской дифрактограммы гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1), записанной в режиме передачи (верхняя кривая А) с записью для того же соединения в режиме отражения (нижняя кривая В); фиг. 2(6) - сравнение рентгеновской дифрактограммы гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1) (верхняя кривая А) с рентгеновской дифрактограммой сульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (нижняя кривая В), записанной в режиме передачи.

Фиг. 3 - Т6-РТ1К.-термограмма гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1). А означает изменение массы -0,5% (из-за потери воды) и В означает изменение массы -14.53% (из-за распада).

Фиг. 4 - О8С-термограмма гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (тип 1; первая сканограмма: сплошная линия; вторая сканограмма (после быстрого охлаждения): штриховая линия).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение в первом аспекте касается гемисульфатной соли (6К.)-5,10-СН₂-ТНР (также указывается как соединение согласно изобретению или гемисульфатная соль согласно изобретению). В одном варианте осуществления гемисульфатная соль (6К.)-5,10-СН₂-ТНР пребывает по сути в кристаллической форме, более конкретно - в кристаллической безводной форме.

В контексте данного описания (6К.)-5,10-СН₂-ТНР означает 5,10-СН₂-ТНР в его природной изомерной форме (5,10)-метилен-(6К.)-тетрагидрофолиевой кислоты, П-[4-[(6аК)-3-амино-1,2,5,6,6а,7гексагидро-1-оксоимидазо[1,5-Г|птеридин-8(9Н)-ил]бензоил]-Ь-глутаминовой кислоты), в которой хиральные центры в С6 птеридинового кольца и а-углерод глутаминовой кислоты пребывают в их природной конфигурации. Таким образом, термины изомерная чистота и соответственно стереоизомерная чистота в контексте данного описания касаются количества (6К.)-5,10-СН₂-ТНР в образце, который может содержать один или несколько других изомеров одного соединения. Термины изомерно чист и со

- 2 032179 ответственно стереоизомерно чистый в контексте данного описания означают соединение согласно изобретению, имеющее изомерный избыток нужного изомера (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ, превышающий приблизительно 80, предпочтительно превышающий приблизительно 90, предпочтительно превышающий приблизительно 95, более предпочтительно превышающий приблизительно 97, еще более предпочтительно превышающий приблизительно 99% или более, наиболее предпочтительно до 100%, причем остальную часть могут составлять один или несколько других изомеров.

Термин кристаллическая форма (или полиморф или форма кристалла) в контексте данного описания означает форму твердого состояния, которая состоит в специально упорядоченном трехмерном расположении структурных единиц. Таким образом, различные кристаллические формы одного соединения возникают в результате различной укладки молекул в твердом состоянии, что ведет к различным вариантам симметрии кристаллов и/или параметров кристаллической ячейки. Как правило, различные твердые или кристаллические формы обладают одним или несколькими различными физическими и/или химическими свойствами, такими как различные профили растворимости, различные показатели термодинамической и химической устойчивости, различные температуры точки плавления и/или различные рентгеновские дифрактограммы, и, таким образом, поддаются различению при помощи рентгеновской дифракции, инфракрасной (ΙΚ) спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии (Э8С), рамановской спектроскопии, ЯМР твердого тела, а также точки плавления, плотности, твердости, оптических и электрических свойств, профиля стойкости и/или растворимости и т.п. Отсутствие или незначительное наличие правильного трехмерного порядка обычно описывается термином аморфный.

Термин кристаллическое соединение (согласно изобретению) означает твердую форму соединения согласно изобретению, включающую различимое количество форм кристалла или полиморфов соединения согласно изобретению, предпочтительно количество, превышающее 50, 60, 70, 80, 90 или 95% одной (или нескольких) форм кристалла или полиморфов соединения согласно изобретению. Количество, степень и характер кристалличности кристаллического соединения согласно изобретению могут определяться при помощи одного или нескольких технических средств, включая оптическую микроскопию, электронную микроскопию, рентгеновскую порошковую дифрактометрию, спектроскопию ЯМР твердого тела или поляризующую микроскопию.

В контексте данного описания выражение гемисульфатная соль (согласно изобретению) означает все ее конкретные варианты осуществления, предпочтительно обеспечиваемые в химически и/или (стерео)изомерно и/или кристаллически чистой форме. В одном конкретном варианте осуществления она пребывает по сути в кристаллической форме, более конкретно - в кристаллической безводной форме (в дальнейшем также именуемой кристаллической формой типа 1).

Термин кристаллическая чистота в контексте данного описания означает процент конкретной кристаллической формы соединения в образце, который может содержать аморфную форму соединения, одну или несколько других кристаллических форм соединения (отличных от конкретной кристаллической формы соединения) или их смесь. Термин по сути кристаллическая форма в контексте данного описания означает как минимум приблизительно 80, предпочтительно как минимум приблизительно 90, предпочтительно как минимум приблизительно 95 кристаллическую чистоту, предпочтительно приблизительно 97 кристаллическую чистоту, более предпочтительно приблизительно 99 или более кристаллическую чистоту, наиболее предпочтительно приблизительно 100% кристаллическую чистоту. Кристаллическую чистоту определяют при помощи рентгеновской порошковой дифрактометрии (ΧΚΡΌ), инфракрасной рамановской спектроскопии и других твердофазных способов.

Термин химическая чистота в контексте данного описания означает процент конкретного соединения в образце. Термин существенная химическая чистота в контексте данного описания относится к соединению согласно изобретению, имеющему приблизительно 80 химическую чистоту, предпочтительно приблизительно 90, более предпочтительно приблизительно 95, более предпочтительно приблизительно 97, более предпочтительно приблизительно 98% химическую чистоту, наиболее предпочтительно 99 или свыше 99 или до 100% химическую чистоту, определяемую при помощи НРЬС. К химическим примесям относятся непрореагировавший исходный материал (включая растворители), продукты распада (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ (такие как ТНЕ) и т.п.

Как указано выше, кристаллическую форму гемисульфатной соли согласно изобретению (и ее чистоту) определяют, характеризуют и отличают от других солевых форм, таких как другие формы сульфатной соли, по уникальным сигнатурам в твердом состоянии в отношении, например, рентгеновской порошковой дифрактометрии (ΧΚΡΌ), инфракрасной рамановской спектроскопии и с применением других твердофазных способов, как указывают представленные авторами данные.

Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает кристаллическую форму безводной гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ (в дальнейшем также именуемой кристаллической формой типа 1), характеризующейся тем, что она обеспечивает:

(ί) рентгеновскую порошковую дифрактограмму (ΧΚΡΌ), дающую расчетные периоды решетки (выраженные в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение)) при 4,7, 17,9 и 23,3°, предпочтительно 4,7, 16,6, 17,9, 18,4, 18,9, 20,2, 23,3, 23,5, 24,3 и 24,7°; и/или

- 3 032179 (ίί) Фурье-Раман-спектр, содержащий пики при волновых числах (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363; и/или (ίίί) ИК-спектр, имеющий одну или несколько полос поглощения согласно табл. 3.

В предпочтительных вариантах осуществления гемисульфатная соль (тип 1) согласно настоящему изобретению характеризуется как минимум двумя из следующих 10 пиков ΧΚΡΏ (выраженных в 2Θ ±0,2° 2Θ (СиКа-излучение)) при 4,7, 16,6, 17,9, 18,4, 18,9, 20,2, 23,3, 23,5, 24,3 и 24,7°, предпочтительно 4,7, 17,9 и 23,3°, и как минимум двумя из следующих 9 фурье-рамановских пиков (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363.

В других предпочтительных вариантах осуществления гемисульфатная соль (6В)-5,10-СН₂-ТНТ (тип 1) согласно настоящему изобретению обеспечивает Фурье-Раман-спектр по сути в соответствии с фиг. 1 и/или пики, как указано в табл. 1, и/или рентгеновскую порошковую дифрактограмму (ΧΚΡΏ) по сути в соответствии с фиг. 2(а), и/или пики, как указано в табл. 2.

Таблица 1

Т аблица рамановских пиков (уз = очень сильная, 8 = сильная, т = средняя, \ν = слабая, уа = очень слабая интенсивность)

- 4 032179

Таблица 2

Таблица пиков порошковой рентгеновской дифрактограммы, выраженных в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение) (νδ = очень сильная, 8 = сильная, т = средняя, ν = слабая, νν = очень слабая интенсивность)

Таблица 3

ИК-спектр гемисульфатной соли (6В)-5,10-СН₂-ТНТ (тип 1) с полосами поглощения в см^-1 и их распределение

Полоса поглощения (см'¹)	Распределение
3346	ОН и ΝΗ колебание
3168	ОН внутримолекулярных водородных мостиков, СН₂ колебание
1709, 1654	СО-валентное колебание монозамещенного амида
1612	Симметричное и антисимметричное валентное колебание СОО
1560,1504	Колебание арильного и пиримидинового кольца
1397,1300	Симметричное и антисимметричное валентное колебание СОО'
824	Примыкающий к арилу водород пара-замещенного ароматического соединения

Соединение согласно этому изобретению наиболее эффективно характеризуется и отличается от подобных соединений рентгеновской порошковой дифрактограммой, определяемой в соответствии с процедурами, известными специалистам в данной области (см., например, I. На1еЫ1ап, Т Рйагт. 8οΐ. 64: 1269, 1975; I. На1еЫат апб МсСгопе, I. Рйагт. 8οΐ. 58: 911, 1969). Фиг. 2(6), показывающая рентгеновскую дифрактограмму гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНТ, приготовленной согласно примерам, в сравнении с рентгеновской дифрактограммой сульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНТ, четко поясняет отличительную структуру двух этих солей.

Хотя известно, что относительная интенсивность пиков может быть разной, в зависимости от способа приготовления образца, процедуры закрепления образца и конкретного применяемого инструмента соединение согласно изобретению может определяться различимыми пиками и расположением пиков, характерным для конкретного полиморфа (с небольшими различиями в распределении пиков приблизительно ± 0,5° 2Θ, предпочтительно ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение).

Соединения согласно изобретению пребывают в несольватированной безводной форме, которая включает соединения, которые являются полностью безводными, и соединения, которые могут содержать следовое количество воды. Такое остаточное (нестехиометрическое) содержание воды может быть любым количеством воды, однако, как правило, оно составляет от 0 мас.% Н₂О до 3 мас.% Н₂О, предпочтительно от 0 мас.% Н₂О до 1 мас.% Н₂О.

Гемисульфатное соединение согласно изобретению может храниться в твердой форме, например в форме порошка, лиофилизата или жидкости.

В конкретном варианте осуществления соединения согласно изобретению получают путем добавления водного формальдегидного раствора (68)-ТНТ к водному раствору серной кислоты (или водного раствора уксусной кислоты и серной кислоты) и обеспечения возможности кристаллизации гемисульфатной соли (6В)-5,10-СН₂-ТНТ. Эта реакция кристаллизации происходит при повышенных температу

- 5 032179 рах, например при температуре более 35°С. В частности, способы получения кристаллической гемисульфатной соли (6В)-5,10-СН₂-ТНР включают этапы (ί) реакции раствора (68)-тетрагидрофолиевой кислоты с водным формальдегидным раствором для получения (6В)-5,10-СН₂-ТНР в растворе (в соответствии с известными процедурами), (и) добавления полученного (6В)-5,10-СН₂-ТНР в растворе в водный раствор серной кислоты (или, в альтернативном варианте, в водный раствор уксусной кислоты и серной кислоты) при температуре более 35°С, предпочтительно от 35 до 70°С, более предпочтительно от 40 до 60°С, наиболее предпочтительно 40 и 50°С для обеспечения возможности кристаллизации гемисульфата (6К.)-5,10СН₂-ТНР и (ш) выделение полученной кристаллической гемисульфатной соли (6В)-5,10-СН₂-ТНР, например, путем фильтрации.

Этап (ί) может выполняться в соответствии с известными процедурами, как описывается в примерах.

На этапе (п) полученный прозрачный раствор может добавляться к раствору серной кислоты (или водному раствору уксусной кислоты и серной кислоты) при температуре приблизительно от 40 до 50°С, что обеспечивает возможность выборочной кристаллизации нужного продукта. Необязательно после завершения добавления полученную реакционную смесь перемешивают при температуре приблизительно от 40 до 50°С в течение периода до 5 ч, затем кристаллизованный продукт отфильтровывают или центрифугируют при той же температуре, необязательно промывают водой и высушивают.

В еще одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, включающей (в терапевтически эффективном количестве) гемисульфатную соль (6В)-5,10-СН₂-ТНР согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель (также называется фармацевтической композицией согласно изобретению) для введения пациенту. Термин фармацевтически приемлемый в контексте данного описания означает, что носитель утвержден или признан как приемлемый для применения на животных, в частности для человека, т.е. не токсичен для организма-хозяина или пациента. Кроме того, носитель не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента. Термин носитель относится к любому вспомогательному материалу, необходимому для выбранного режима введения, и охватывает, например, растворитель (растворители) вспомогательные вещества или другие добавки, с которыми вводят соединение согласно изобретению. К традиционно применяемым растворителям и фармацевтическим носителями относятся стерильные жидкости, такие как водные растворы и масла (например, нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения), например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. К традиционно применяемым водным жидкостям относятся вода, солевые растворы, водный раствор декстрозы и растворы глицерина и т.п. К подходящим фармацевтическим вспомогательным веществам относятся лимонная кислота, аскорбиновая кислота, крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат магния, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т.п. Необязательно композиция может включать добавки, такие как смачивающие агенты или эмульгаторы, рН-буферные агенты или связующие. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области техники и описаны например, в КсшшдХои'к РНагтасеибса1 8с1еисек Ьу Е.^. Магйи (18111 еб., Маск РиЬйкЫпд Со., Еайои, РА (1990).

Необязательно, фармацевтическая композиция согласно изобретению также может включать как минимум одно дополнительное терапевтическое средство. В конкретных вариантах осуществления как минимум одно дополнительное терапевтическое средство может быть выбрано из веществ, к которым относятся бактерициды, антибиотики, противовирусные средства, антисептики, противоопухолевые средства, противораковые соединения, такие как химиотерапевтические средства, противогрибковые средства, и/или противовоспалительные средства или другие биологически активные или терапевтические средства, подходящие для применения для человека, в частности противораковые соединения, такие как химиотерапевтические средства. К противораковым лекарствам, таким как химиотерапевтические средства, относятся, помимо прочих, химиотерапевтические средства, включающие элементы специфического связывания, белки, нуклеиновые кислоты или аналоги нуклеиновых кислот (к которым, помимо прочих, относятся антисмысловые молекулы, рибозимы и миРНК), липиды, стероиды, макромолекулы, малые молекулы или металлы. Одно или несколько противораковых лекарств могут включать одно или несколько химиотерапевтических средств, к которым, помимо прочих, относятся нуклеиновые кислоты, в частности фторированные нуклеиновые кислоты (например, 5-фтороурацил или его аналог или пролекарство), антифолаты (например, пеметрексед, ралтитрексед, лометрексол), ингибиторы топоизомеразы (например, иринотекан, топотекан), антиметаболиты (например, метотрексат, гемцитабин, тезацитабин), модуляторы 5-РИ, алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, кармустин), ингибиторы биосинтеза нуклеиновых кислот (такие как митомицин, антрациклины (например, эпирубицин, доксорубицин), производные платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин), медикаменты, разрушающие микротрубочки (например, паклитаксел, доцетаксел, винорелбин, винкристин), медикаменты, блокирующие гормоны (например, тамоксифен), ингибиторы киназ, включая, помимо прочих, рецепторные и нерецепторные тирозинкиназы (например, 1гекка, Тагсеуа, 8И5416, РТК787, О1ееуес), ингибиторы протеосом (например, бортезомиб), иммуномодуляторы (например, левамизол), противовоспалительные медикаменты, ингибиторы васкуляризации, цитокины (например, интерлейкины, факторы некроза опухолей)

- 6 032179 и медикаменты, ингибирующие активность цитокинов, гормонов или рецепторов для цитокинов или гормонов (например, антитело к ФРЭС бевацизумаб или Луазйи). Противораковые медикаменты также могут включать моноклональные антитела, к которым, помимо прочих, относятся моноклональные антитела, которые связываются с цитокинами, гормонами или рецепторами гормонов (например, антитела, блокирующие активацию факторов роста ЭФР или ФРЭС, такие как Луазйи, ЕгЬИих, герцептин) и т.п.

Соединения согласно изобретению или их фармацевтические композиции могут применяться для терапии, в частности противораковой химиотерапии, т.е. в соответствии со способами лечения рака, включающими введение терапевтически эффективного количества гемисульфатной соли согласно изобретению или ее фармацевтических композиций субъекту, нуждающемуся в таком лечении.

Таким образом, в еще одном аспекте настоящее изобретение также касается применения гемисульфатной соли согласно изобретению (или ее фармацевтических композиций) в терапии, предпочтительно в химиотерапии, т.е. при лечении рака. Примерами видов рака, поддающихся лечению согласно изобретению, могут быть, помимо прочих, рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка, рак желчного пузыря, рак желчного протока, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак головы и шеи и мезотелиома.

Подходящая фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть приспособлена для перорального, парентерального или ректального введения и в этом качестве может быть предусмотрена в форме таблеток, капсул, жидких препаратов для перорального приема, порошков, лиофилизатов, гранул, пастилок, порошков с восстанавливаемым влагосодержанием, подходящих для инъекций или инфузий растворов или суспензий или суппозиториев. Предпочтительно фармацевтические композиции пребывают в форме, подходящей для парентерального введения, такого как внутривенное или внутримышечное, подкожное, внутриартериальное.

Для парентерального введения жидкие лекарственные формы, как правило, включают соединение согласно изобретению, необязательно другое терапевтическое средство и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель для образования, например, растворов на водной основе или суспензий на масляной основе (или их лиофилизатов). Соединения, в зависимости от присутствия других терапевтических средств, носителя и применяемой концентрации, могут быть суспендированы или растворены в носителе. Для парентеральных растворов соединение может быть растворено для инъекций и стерилизовано путем фильтрации перед помещением в соответствующий флакон или ампулу и запечатыванием. Необязательно, в индифферентном носителе растворяют адъюванты, такие как местный анестетик, консерванты и буферные вещества. В случае необходимости полученные растворы могут поддаваться лиофилизации (т.е. композиция может быть заморожена после помещения во флакон, с удалением воды в вакууме). Для парентеральных суспензий соединение суспендируют в индифферентном носителе (вместо растворения), и предпочтительный способ стерилизации включает подвергание воздействию этиленоксида перед помещением суспензии в стерильную тару (такую, как флакон или ампула). Необязательно в композицию может быть включено поверхностно-активное вещество или смачивающий агент, которые способствуют равномерному распределению соединения.

Таблетки и капсулы для перорального введения могут быть предусмотрены в форме дозированных единиц и могут содержать традиционные вспомогательные вещества, такие как связующие агенты, наполнители, скользящие вещества для таблеток, разрыхлители и приемлемые смачивающие агенты. На таблетки может наноситься покрытие в соответствии со способами, общеизвестными среди фармацевтов.

Жидкие препараты для перорального приема могут быть предусмотрены в форме, например, водной или масляной суспензии, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или могут быть предусмотрены в форме сухого продукта для восстановления влагосодержания водой или другой подходящей основой перед применением. Такие жидкие композиции могут содержать традиционные добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульгаторы, неводные основы (которые могут включать пищевые масла), консерванты и, в случае надобности, традиционные ароматизаторы или красители.

В случае комбинированной терапии, при которой фармацевтическая композиция согласно изобретению включает соединение согласно изобретению и как минимум еще одно терапевтическое средство, действующие вещества могут вводиться как часть одной фармацевтической композиции, или как минимум еще одно терапевтическое средство может вводиться отдельно, т.е. как отдельные (и, возможно, другие) фармацевтические композиции, необязательно другими путями введения, одновременно или последовательно.

Доза действующего(их) вещества (веществ), т.е. соединения согласно изобретению (и, необязательно как минимум еще одного терапевтического средства), для применения в лечении, как описывается авторами, зависит от различных факторов, включая возраст и состояние здоровья подлежащего лечению субъекта, типа и тяжести болезни, пути и частоты введения и т.п. Специалисты в области лечения рака и химиотерапии смогут определить терапевтически эффективное количество и режимы для соединения согласно изобретению, отдельно или в комбинации с как минимум еще одним терапевтическим средством, как определено выше, на основе известных протоколов оценки токсичности и эффективности.

Термин терапевтически эффективное количество касается количества активного соединения, обеспечивающего биологическую или лечебную реакцию в ткани, системе, организме животного, субъ

- 7 032179 екта или человека, которой добивается специалист-практик (например, исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист или специалист по уходу), включая (ί) профилактику заболевания; и/или (ίί) подавление заболевания (например, задержку дальнейшего развития патологии и/или симптоматологии); и/или (ίίί) облегчение болезни (например, реверсию патологии и/или симптоматологии). Подобным образом термин лечение в контексте данного описания касается (ί) профилактики заболевания; и/или (ίί) подавления заболевания (например, задержки дальнейшего развития патологии и/или симптоматологии); и/или (ίίί) облегчения болезни (например, реверсии патологии и/или симптоматологии).

Выбранная фармацевтическая композиция может содержать от 0,1 до 99 мас.%, предпочтительно от 10 до 60 мас.% действующего вещества (т.е. соединения согласно изобретению, необязательно в комбинации с как минимум еще одним терапевтическим средством), в зависимости от способа введения.

Типичный диапазон доз соединения согласно изобретению, применяемого для лечения рака, может охватывать от 10 мг/м² до 1 г/м², предпочтительно от 50 до 500 мг/м² (для лечения рака толстой и прямой кишки), соответственно от 10 до 200 мг/м² (для терапии с применением метотрексата), более предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 250 мг/м² (для лечения рака толстой и прямой кишки), соответственно от 50 до 150 мг/м² (для терапии с применением метотрексата).

Следующие примеры служат для пояснения настоящего изобретения, не ограничивая его объема.

Примеры

Дифференциальная сканирующая калориметрия (термический анализ 02000): закрытые (герметично запечатанные) золотые тигли; образец помещали в окружающих условиях или после 3 мин уравновешивания в атмосфере Ν₂; скорость нагрева 10 К мин^-1; диапазон от -50 до 254°С. При осуществлении двух приемов нагрева образец быстро охлаждали до -50°С между приемами. Перечисленные переходные температуры соответствуют пиковым максимумам и минимумам, а не начальным температурам.

Спектроскопия КР с Фурье-преобразованием (Вгикег ΚΡ8100; с программой ОРИ8 6.5; оффлайновый анализ данных осуществляли с применением программы ОРИ8 7.0): возбуждение излучением Νά: УЛС-лазера (1064 нм); номинальная мощность лазерного излучения 300 мВт; Се детектор; 64-256 сканограмм; спектральный диапазон 3500-100 см^-1, применяемый для анализа; разрешение 2 см^-1.

¹Н-ЯМР (Вгикег ΌΡΧ300): ¹Н-ЯМР-спектры записывали с использованием частоты протона 300,13 МГц, импульс возбуждения 30° и задержка повторного цикла 1 с. Накапливали 16 или 256 сканограмм и дейтерированный ΌΜ8Ο использовали в качестве растворителя. Пик растворителя использовали в качестве эталона, и химические сдвиги сообщаются в масштабе ΤΜ8.

¹³С ЯМР (Вгикег ΑΜΧ 300): спектр ¹³С ЯМР получали с применением спектрометра Вгикег ΑΜΧ 300, оснащенного 5 мм измерительной головкой ТХО. Гемисульфат растворяли в 0,1 Ν ΝαΟΩ. Спектр измеряли при 303 К, с 4000 сканограммами и цифровым разрешением 32768 точек данных. Химические сдвиги указаны в ррт относительно внутреннего стандарта Τ8Ρ (((3-триметилсилил)-2,2',3,3'тетрадейтеропропионовой кислоты, натриевой соли)).

Порошковая рентгеновская дифракция (Вгикег Ό8 Абсансе): Κα-излучение меди, 40 кВ/40 мА, детектор ЬупхЕуе, отражательная геометрия Брегга-Брентано, размер шага 0,02° 2Θ, время шага 37 с, диапазон 2,5-50° 2Θ. Образцы порошка измеряли в держателях образцов кремниевых монокристаллов глубиной 0,1 или 0,5 мм. При приготовлении образцов не применяли специальной обработки, кроме применения небольшого давления для получения плоской поверхности. Использовали окружающую воздушную атмосферу для всех измерений и образцы вращали во время измерений. При отсутствии информации об обратном данные рентгеновской дифракции показываются как данные отражения.

Порошковая рентгеновская дифракция (81ое 8ΐα6ί Р.): Ка1-излучение меди, 40 кВ/40 мА, детектор Μν11^η1Κ. режим передачи, германиевый монохроматор, размер шага 0,02° 2Θ, время шага 60 с, диапазон сканирования 1,5-50,5° 2Θ с шагом детектора 1° 2Θ в режиме пошагового сканирования. Образцы (1020 мг порошка) измеряли между листами ацетатной пленки. При приготовлении образцов не применяли специальной обработки. Использовали окружающую воздушную атмосферу для всех измерений и каждый образец вращали во время измерений.

ТС-РТ1К (термомикроаналитические весы №1ζδΛ ТС 209 со спектрометром Вгикег ΡΤ-ΙΚ ΙΡ8 28): алюминиевый тигель (с микроотверстием); атмосфера Ν₂; скорость нагрева 10 К мин^-1; диапазон от 25 до 300°С.

ΙΚ (ΡΤ-ΙΚ Рагадоп 1000): инфракрасный спектр записывали в 100 сканограммах на системе для инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием Реткт Е1тег для образца гемисульфата на фоне бромидного диска.

Пример 1. Приготовление гемисульфатной соли (6Κ)-5,10-ΟΗ₂-ΤΗΡ.

Раствор (68)-тетрагидрофолиевой кислоты (16 ммоль, 7,93 г) в 78,0 г дистиллированной воды обеспечивали в колбе с круглым дном при комнатной температуре в атмосфере Ν₂. Уровень рН этого раствора доводили до рН 11 путем добавления (медленного) 32% раствора ΝαΟΗ. Как только раствор становился прозрачным, добавляли 1,00 М раствора НС1 для доведения уровня рН раствора до 8,3 при 25°С. Полученный прозрачный раствор охлаждали до температуры приблизительно 0°С, при которой он демонстрировал уровень рН 8,8. Путем добавления 1 М НС1 уровень рН доводили до рН 8,6 и одной пор

- 8 032179 цией добавляли 1,44 г 36,8% раствора НСНО (110 мол.%). По завершении добавления раствор перемешивали при 0°С (ледяная баня) в течение 1 ч. Добавляли активированный уголь (0,2 г, Νοίίΐ С Ех1га) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°С, а затем подвергали холодному фильтрованию на вакуум-фильтре для получения прозрачного раствора, который использовали на этапе (Ь) без дальнейшей очистки.

(Ь) Смесь 55 мл 1 М Н₂8О₄ (0,055 моль; 344 мол.%) обеспечивали в колбе с круглым дном при 60°С в атмосфере Ν₂. К этому раствору в течение 15-минутного периода времени по капле добавляли раствор, полученный на этапе (а), и полученную реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Реакционную смесь затем фильтровали при 50°С на вакуум-фильтре, дважды промывали 25 мл дистиллированной воды при комнатной температуре и высушивали при 30°С и 10 мбар в течение 12 ч (до следующего дня) для получения гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ в форме светло-серых кристаллов (7,36 г, выход 86%). Полученный продукт обладал чистотой 98,4%, которую определяли при помощи НРЬС, изомерной чистотой 97,6% (6К-изомер). Анализ путем ΧΡΡΡ продемонстрировал форму кристалла типа 1 (полная характеризация представлена в примерах 2 и 3).

Пример 2. Характеризация.

(a) Фурье-Раман-спектр гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНР, записанный с использованием номинального уровня мощности лазерного излучения 300 мВт и 64 сканограмм, показан на фиг. 1.

(b) Соответствующая порошковая рентгеновская дифрактограмма, записанная в режиме передачи, показана на фиг. 2.

(c) ТО-ЕТ1К-термограмма гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНР показана на фиг. 3. Ее производили в потоке Ν₂ (во избежание окислительной деструкции). Образец демонстрирует потерю 0,5 мас.% Н₂О приблизительно с 40 по 210°С, которая представляет собой остаточную воду (из-за гигроскопичности или неполного высушивания). Распад происходит лишь при температуре свыше 210°С.

(б) Э8С-термограмма гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ показана на фиг. 4. Перед первым нагревом образец уравновешивали в течение 3 мин в потоке газообразного азота, и в течение этого времени он терял 0,6 мас.% своей массы. Это соответствует содержанию воды, наблюдаемому в ТО-ЕТ1Ктермограмме (см. фиг. 3), и подтверждает, что эта вода является свободносвязанной. Затем образец нагревали в закрытом золотом тигле до 254°С при 10 К мин^-1, быстро охлаждали до -50°С и нагревали во второй раз при 10 К мин^-1. Единственным термическим явлением при первом нагреве является эндотермический при приблизительно 247,4°С (ΔΗ = 60,9 Дж г^-1) и обусловлен плавлением. Это эндотермическое явление, возможно, частично совпадает с началом экзотермического распада. При втором нагреве наблюдается стеклование при Тд = 104°С (Δίφ = 0,38 Дж г'¹К'¹), что подтверждает, что плавление произошло при первом нагреве. Никаких других явлений не наблюдалось до температуры 250°С.

(е) ИК-спектр записывали в сжатой пластинке КВг и характеристические полосы поглощения показаны в табл. 3.

(ί) Ηΐ ЯМР-спектр гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ записывали в ЭМ8О-б₆, и химические сдвиги (б) в ррт показаны в табл. 8.

Таблица 8 ^ХН-ЯМР гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ с химическими сдвигами (б) в ррт (б = дублет, т = мультиплет, 1 = триплет; с Т8Р при 0 ррт и растворителем Р₂О^;\аОР при 4,85 ррт)

δ(1Η)	Кратность	Интенсивность
7,75	б	2Н
6,62	б	2Н
4,99	т	1Н
4,33	т	1Н
3,74	т	2Н
3,52	т	1Н
3,28	т	2Н
2,91	т	1Н
2,33	1	2Н
2,17	т	1Н
2,05	т	1Н

(д) ¹³С ЯМР записывали в 0,1 Ν ХаОР, и химические сдвиги (б) в ррт относительно Т8Р показаны в табл. 9.

- 9 032179

Таблица 9 ¹³С-ЯМР гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ с химическими сдвигами (б) в ррт (б = дублет, т = мультиплет, ΐ = триплет)

δ (1зс)	Кратность	δ (13С)	Кратность
185,12	8	114,19	б
182,05	8	103,99	8
173,12	8	70,67	ΐ
172,41	8	58,61	б
162,26	8	56,94	б
156,78	8	51,6	ΐ
151,78	8	41,71	ΐ
131,18	б	37,07	ΐ
123,27	8	31,41	ΐ

(К) Анализ гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ путем оптической микроскопии подтвердил ее кристалличность. Образец состоял из агломератов малых двоякопреломляющих частиц.

Пример 3. Испытание устойчивости гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ.

(а) Уравновешивание суспензии гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ в качестве исходного материала при температурах, отличных от комнатной температуры, в разных растворителях и смеси показано в табл. 10.

Таблица 10

Стойкость уравновешенной суспензии гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ

Растворитель (растворители)	Температура (°С)	Длительность (часы, дни)	Наблюдение
МеОН/муравьиная кислота 1:1	50	2 ч	Без изменений
АсОН насыщенный Е-аскорбиновой кислотой	50	1 Д	Без изменений
ТНГ с ~2 мМ Ь-аскорбиновой кислоты	40	3 д	Без изменений
2-РгОН с ~2 мМ Ь-аскорбиновой кислоты РЕ(34500/ЕЮН 1:9, насыщенный Еаскорбиновой кислотой Н₂О муравьиная кислота/ТНГ 1:3	40 50 5 10 - 20	3 д 7 д 6 д 6 д	Без изменений Без изменений Без изменений Без изменений
АсОН, насыщенный Б-аскорбиновой кислотой	50	5 д	Без изменений
ΜσΟΝ, насыщенный Б-аскорбиновой кислотой	50	5 д	Без изменений

(b) Стойкость в 85% этаноле при комнатной температуре.

Гемисульфатную соль (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ (3,01 г) диспергировали в 100 мл 85% ЕЮН при комнатной температуре и перемешивали в течение 5 ч, затем фильтровали и высушивали при 30°С и 8 мбар в течение 12 ч (до следующего дня). Анализ путем ΧΚΡΏ продемонстрировал, что рентгенограмма, отличающая форму кристалла типа 1, осталась неизменной.

(c) Стойкость при высокой температуре/низком давлении.

Гемисульфатную соль (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ (2,17 г) помещали в сушильную камеру при 65°С и 8 мбар на 21 ч. Анализ путем ΧΚΡΏ продемонстрировал, что рентгенограмма, отличающая форму кристалла типа 1, осталась неизменной.

(б) Долгосрочная стойкость гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ и ее фармацевтической композиции.

Для определения показателей долгосрочной стойкости гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ соединения согласно изобретению хранили на открытом воздухе при 25°С и при 60% относительной влажности. Содержание оставшейся гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ измеряли путем ВЭЖХ с периодическими интервалами и представляли путем сравнения с первоначальным значением (% отн.). Результаты показаны в табл. 11.

- 10 032179

Таблица 11

Долгосрочная стойкость трех разных партий продукции гемисульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ

	Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (% отн.)
	0 мес.	3 мес.	6 мес.	9 мес.	12 мес.	18 мес.	24 мес.	36 мес.
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия 1)	100,0	99,7	99,5	99,6	99,2	99,2	99,4	98.5
Гемисульфат (6к)-5,10-СН₂-ТНР (партия 2)	100,0	99,9	99,9	100,0	99,7	99,4	99,4	99.0
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия 3)	100,0	99,5	99,5	99,4	99,1	99,0	99,0

Для определения показателей долгосрочной стойкости гемисульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ в качестве фармацевтических композиций, более конкретно - в форме лиофилизатов (приготовленных, например, согласно примеру 5), лиофилизаты хранили на открытом воздухе при 25°С и при 60% относительной влажности. Содержание оставшейся гемисульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНР измеряли путем ВЭЖХ с периодическими интервалами и представляли путем сравнения с первоначальным значением (% отн.). Результаты показаны в табл. 12.

Таблица 12

Долгосрочная стойкость пяти разных партий продукции гемисульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНР в форме лиофилизата

	Гемис;	ульфат (6К)-5,1 0-СН₂-ТНР (% отн.)
	0 мес.	3 мес.	6 мес.	9 мес.	12 мес.	18 мес.	24 мес.	36 мес.
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия А)	100,0	100,1	100,2	99,9	100,0	99,7	100,0
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия В)	100,0	100,1	99,9	100,0	99,8	99,7	100,1
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНЕ (партия С)	100,0	99,6	99,7	99,8	99,5	99,6	99,2	98,6
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия ϋ)	100,0	100,0	99,8	99,4	99,4	99,3	99,2	99,4¹’
Гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (партия Е)	100,0	100,1			99,7		99,4	98,9

^υ Показатель за 45 месяцев.

В табл. 11 и 12 четко показано, что гемисульфат (6Р)-5,10-СН₂-ТНР обладает высокой стойкостью в течение длительного периода времени даже при комнатной температуре в форме чистого соединения, а также в форме фармацевтической композиции, такой как лиофилизат.

Пример 4. Сравнительная стойкость сульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНР.

Для сравнения показателей долгосрочной стойкости гемисульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНР соединений согласно изобретению с показателями долгосрочной стойкости (6Р)-5,10-СН₂-ТНР сульфатной соли, полученной в соответствии с документом ЕР 0537492 В1, данные стойкости для сульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ получали при разных температурах и значениях влажности.

(а) Стойкость сульфата (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ.

Сульфатную соль (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ приготавливали в соответствии с описанными в литературе процедурами (документ ЕР 0537492 В1) и хранили в течение 15 месяцев при -20°С. Затем образцы продукта хранили при 5°С, соответственно при 25°С и 60% относительной влажности и соответственно при 40°С и 75% относительной влажности. Содержание сульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ, оставшейся в образце, измеряли путем ВЭЖХ с периодическими интервалами. Содержание сульфата (6Р)-5,10-СН₂ТНЕ сравнивали с первоначальным значением во время приготовления (% отн.). Результаты показаны в табл. 13 и 14.

Таблица 13

Долгосрочная стойкость сульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ при -20°С

Температура / относительная влажность	Сульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (% отн.)
0 мес.	15 мес.
-20°С	100,0	98,7

Таблица 14

Дальнейшая долгосрочная стойкость сульфатной соли (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ при 5°С, 25°С/60% отн. вл. и соответственно 40°С/75% отн. вл.

Температура / относительная влажность	Сульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР (% отн.)
0 мес.	6 мес.
5°С	98,7	97,3
25°С/60% отн. вл.	98,7	95,5
40°С/75% отн. вл.	98,7	95,0

Сравнение данных в табл. 13 и 14 с данными стойкости гемисульфата (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ, как описывается в примере 3, четко показывает, что:

ί) существует заметная разница в стойкости гемисульфата (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ по сравнению с сульфатом (6Р)-5,10-СН2-ТНЕ и ΐΐ) гемисульфат (6Р)-5,10-СН₂-ТНЕ является значительно более стойким в течение длительного пе

- 11 032179 риода времени по сравнению с сульфатом (6К)-5,10-СН₂-ТНТ.

(Ъ) Содержание продукта распада 10-формил-(6К)-тетрагидрофолиевой кислоты.

Сульфатную соль (6К)-5,10-СН₂-ТНТ получали в соответствии с описываемыми в литературе процедурами (документ ЕР 0537492 В1) и хранили в течение 15 месяцев при -20°С. Затем образцы продукта хранили при 5°С, соответственно при 25°С и 60% относительной влажности и соответственно при 40°С и 75% относительной влажности. Содержание 10-формилетрагидрофолиевой кислоты, главного продукта распада, измеряли путем ВЭЖХ с периодическими интервалами и указывали в абсолютных значениях (% мас./мас.). Результаты показаны в табл. 15 и 16.

Таблица 15

Содержание продукта распада 10-формилтетрагидрофолиевой кислоты при хранении при -20°С

Температура / относительная влажность	10-формилтетрагидрофолиевая кислота (% масса/масса)
0 мес.	15 мес.
-20°С	0,53	1,37

Таблица 16

Дальнейшее содержание продукта распада 10-формилтетрагидрофолиевой кислоты при хранении при 5°С, 25°С/60% отн. вл. соответственно 40°С/75% отн. вл.

Температура / относительная влажность	10-формилтетрагидрофолиевая кислота (% масса/масса)
0 мес.	6 мес.
5°С	1,37	1,47
25°С/60% отн. вл.	1,37	1,89
40°С/75% отн. вл.	1,37	2,36

Пример 5. Фармацевтические дозированные формы гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНТ.

(a) Лиофилизат для восстановления влагосодержания, предназначенный для внутривенного применения.

К 18,480 кг воды при 4°С, через которую барботировали аргон в течение 1 ч, добавляли 1,386 кг \аО11 2 М и 968,9 г тригидрата цитрата натрия. Смесь перемешивали при 4°С в атмосфере аргона до полного растворения (рН 13,0). Затем добавляли 473,9 г гемисульфата (6К)-5,10-СН₂-ТНТ при использовании 210 г насыщенной аргоном промывочной воды при температуре 4°С (медленное растворение, рН 6,5). Затем уровень рН доводили при помощи \аО11 2 М до 9,3 ± 0,1 (121,8 г). Добавляли 203,6 г насыщенной аргоном воды при температуре 4°С (общее количество раствора 21,844 кг).

Затем раствор фильтруют сквозь стерильный фильтр. В каждый флакон по 10 мл добавляли 5,201 г (5 мл) стерильного фильтрованного раствора, а затем лиофилизировали при -45°С.

Перед инъекцией в каждый флакон добавляли 10 мл воды (\\ТТ) (293 мосмол/кг).

(b) Рецептирование лиофилизированной композиции гемисульфата (6К)-5,10-СН₂-ТНТ при по сути нейтральном уровне рН.

Применяли следующие материалы (мг/100 мл) и процедуру для получения лиофилизированной композиции

Материалы (мг/100 мл):

5,530 г гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНТ (эквивалент 5000 г (6К)-5,10-СН₂-ТНТ),

6,000 г лимонной кислоты, безводная, порошок, ϋ8Ρ,

4,000 г аскорбиновой кислоты, гранулированной, ϋ8Ρ,

ΝαΟΙ 1/11С1 для регулирования рН,

100 мг воды для инъекций (\ΤΙ), υ8Ρ ς§.

(ΐ) Процедура: барботирование \ΕΙ фильтрованным газообразным азотом, ΝΕ в течение 30 мин.

(ΐΐ) Запись массы тары - 100 мл пластиковой бутылки.

(ϊϊΐ) Взвешивание лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты и приблизительно 90 г барботированной Ν₂ воды.

(ΐν) Перемешивание до растворения.

(ν) Доведение рН до 7,0 ± 0,1 при помощи 1 Ν ΝαΟΙ I или НС1.

(νΐ) Охлаждение раствора до 10°С.

(νΐΐ) Добавление гемисульфатной соли (6К)-5,10-СН₂-ТНТ, перемешивание до растворения.

(νΐΐΐ) Запись рН (7,0 ± 0,2).

(ΐχ) Добавление воды до конечной массы 110 г (или 100 мл). Запись массы.

(х) Пропускание сквозь 0,2-мкм фильтр при поддержании раствора в максимально охлажденном состоянии.

(χΐ) Разливание во флаконы (2 мл или 100 мг 5,10-СН₂-ТНЕ на флакон) при поддержании раствора в максимально охлажденном состоянии.

(χΐΐ) Высушивание замораживанием.

(χΐΐΐ) Запечатывание флаконов в низком вакууме с азотом в свободном пространстве.

(χΐν) Закрывание флаконов обжимными колпачками.

- 12 032179

Пример 6. Доклинические/клинические результаты.

(a) Результаты доклинических исследований на животных моделях, производимых согласно указаниям 1СН 89. показывают, что гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР является безопасным в наивысших дозах, вводимых крысам (100 мг/кг/день) и собакам (50 мг/кг/день). Кроме того, клинические данные показывают, что гемисульфат (6К)-5,10-СН₂-ТНР, вводимый в дозах до 200 мг/м², является безопасным для пациентов.

(b) В одностороннем слепом, рандомизированном исследовании фазы Ι/ΙΙ (18О-СС-002), проводимом на 32 пациентах, у которых был диагностирован рак толстой кишки, изучали фармакокинетические и фармакодинамические свойства гемисульфата (6К)-5,10-СН₂-ТНР по сравнению с леволейковорином в опухолевой ткани, сопредельной слизистой оболочке и плазме крови. Исследование проводили в университете в Сальгренской больнице Гетеборгского университета, Швеция. Анализ полных данных исследования показал, что введение гемисульфата (6К)-5,10-СН₂-ТНР обеспечивает значительно большее воздействие и пиковые показатели концентрации метилентетрагидрофолата в плазме по сравнению с полученными после введения леволейковорин. Концентрация метилентетрагидрофолата и тетрагидрофолата в ткани и сопредельной слизистой оболочке также была выше после введения гемисульфата (6К)-5,10СН₂-ТНР по сравнению с показателем, полученным после введения леволейковорина.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гемисульфатная соль 5,10-метилен-(6К)-тетрагидрофолиевой кислоты.
2. Гемисульфатная соль по п.1 в кристаллической форме.
3. Гемисульфатная соль по п.1 или 2, отличающаяся тем, что ее кристаллическая чистота составляет по меньшей мере 80, предпочтительно 90, предпочтительно 95, более предпочтительно 97, наиболее предпочтительно 99% или более.
4. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что ее химическая чистота составляет по меньшей мере 80, предпочтительно 90, предпочтительно 95, более предпочтительно 97, наиболее предпочтительно 99% или более.
5. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов в безводной форме.
6. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет одну или несколько пиковых позиций рентгенограммы под углом дифракции 2Θ 4,7, 17,9 и 23,3°, выраженным в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение, отражение).
7. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет одну или несколько пиковых позиций рентгенограммы под углом дифракции 2Θ 4,7, 16,6, 17,9, 18,4, 18,9, 20,2, 23,3, 23,5, 24,3 и 24,7°, выраженным в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение, отражение).
8. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет ФурьеРаман-спектр, содержащий один или несколько пиков при волновых числах (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363.
9. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет ФурьеРаман-спектр в соответствии с фиг. 1 и/или рентгеновскую порошковую дифрактограмму (ΧΚΡΌ) в соответствии с фиг. 2(а) или 2(Ь).
10. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет по меньшей мере два из следующих 10 пиков ΧΚΡΌ (выраженных в 2Θ ± 0,2° 2Θ (СиКа-излучение)) при 4,7, 16,6, 17,9, 18,4, 18,9, 20,2, 23,3, 23,5, 24,3 и 24,7° и по меньшей мере два из следующих 9 Фурьерамановских пиков (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363.
11. Гемисульфатная соль по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что имеет по меньшей мере два из следующих 3 пиков ΧΚΡΌ (выраженных в 2Θ ±0,2° 2Θ (СиКа-излучение)) при 4,7, 17,9 и 23,3° и по меньшей мере два из следующих 5 Фурье-рамановских пиков (выраженных в ±2 см^-1) 1672, 1656, 1603, 1553, 1474, 1301, 637, 624 и 363.
12. Фармацевтическая композиция, включающая гемисульфатную соль 5,10-метилен-(6К)тетрагидрофолиевой кислоты по любому из предыдущих пунктов и необязательно фармацевтически приемлемый носитель.
13. Фармацевтическая композиция по п.12 в форме таблеток, капсул, жидких препаратов для перорального приема, порошков, лиофилизатов, гранул, пастилок, порошков с восстанавливаемым влагосодержанием, растворов для инъекций или инфузий или суспензий или суппозиториев, предпочтительно лиофилизатов.
14. Фармацевтическая композиция по п.12 или 13, отличающаяся тем, что также включает по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, выбранное из бактерицидов, антибиотиков, противовирусных средств, антисептиков, противоопухолевых средств, противораковых соединений, особенно химиотерапевтических средств, противогрибковых средств и/или противовоспалительных средств.
15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.12-14, отличающаяся тем, что является фармацевтической композицией для перорального, парентерального или ректального введения.

- 13 032179
16. Применение гемисульфатной соли 5,10-метилен-(6К)-тетрагидрофолиевой кислоты по любому из пп.1-11 в противораковой химиотерапии.
17. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.12-15 в противораковой химиотерапии.
18. Способ лечения рака, включающий введение гемисульфатной соли 5,10-метилен-(6К)тетрагидрофолиевой кислоты по любому из пп.1-11 или фармацевтической композиции по любому из пп.12-15 субъекту, нуждающемуся в таком лечении.

2 тета (Си К-альфа-излучение)