EA030866B1 - Модифицированный вирус болезни марека и вакцины на его основе - Google Patents
Модифицированный вирус болезни марека и вакцины на его основе Download PDFInfo
- Publication number
- EA030866B1 EA030866B1 EA201401044A EA201401044A EA030866B1 EA 030866 B1 EA030866 B1 EA 030866B1 EA 201401044 A EA201401044 A EA 201401044A EA 201401044 A EA201401044 A EA 201401044A EA 030866 B1 EA030866 B1 EA 030866B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mdv
- birds
- ltr
- virus
- seq
- Prior art date
Links
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 106
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 241000712909 Reticuloendotheliosis virus Species 0.000 claims abstract description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 10
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 160
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 17
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 2
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 claims description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 2
- 101150045048 Ras85D gene Proteins 0.000 claims 1
- 206010038802 Reticuloendothelial system stimulated Diseases 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 claims 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 25
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 18
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 10
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 10
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 4
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 2
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 2
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229940118526 interleukin-9 Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000714235 Avian retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 101100247316 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241001314440 Triphora trianthophoros Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010026856 endodeoxyribonuclease DraIII Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108010008268 transforming growth factor type e Proteins 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
- A61K39/255—Marek's disease virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение предоставляет эффективную вакцину от болезни Марека, которая может быть приготовлена с использованием рекомбинантного вируса болезни Марека (MDV), штамм CVI988, трансформированного конструктом, содержащим чужеродную ДНК, включающим последовательность длинного концевого повтора вируса ретикулоэндотелиоза. Этот безопасный вирусный агент вызывает у цыплят сильный защитный иммунный ответ на инфицирование вирулентным MDV, не вызывая значительной степени патогенности. Подходящие вакцинные композиции, предназначенные для использования у цыплят, включают эффективные для иммунизации дозировки этого нового вирусного агента вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Description
Настоящее изобретение предоставляет рекомбинантный вирус болезни Марека (MDV), в который был вставлен путем гомологичной рекомбинации длинный концевой повтор (LTR), полученный из вируса ретикулоэндотелиоза (REV). Эти рекомбинанты эффективно вызывают иммунный ответ у птиц к вирусу болезни Марека, при отсутствии значительной степени патогенности. При использовании в этом описании отсутствие значительной степени патогенности определяется как отсутствие MD-специфических макроскопических повреждений, видимых невооруженным глазом, у инокулированных/вакцинированных птиц, даже у птиц с высокой чувствительностью. В отдельных вариантах осуществления птицы являются курами.
CVRM-2 был получен авторами Reddy et al., как описано в документе и суммировано на фиг. 1 и 2 данного раскрытия. После получения образца CVRM2 заявители текущего изобретения провели тщательный ПЦР-анализ для подтверждения идентичности/целостности изолята вируса (фиг. 3 представляет результат разделения амплифицированных продуктов в агарозном геле). К своему удивлению, заявители обнаружили, что образец не являлся изолятом клона, а в действительности представлял собой комбинированную популяцию рекомбинантного CVRM2 и исходного штамма MDV. Затем заявители провели
- 5 030866 необходимую очистку путем клонирования с помощью метода образования бляшек, чтобы получить чистый изолят, состоящий только из CVRM2 (и не являющийся исходным штаммом MDV Rispens). Для ясности новый, клональный изолят называется RN1250 на протяжении всего данного раскрытия.
Рекомбинантный MDV этого изобретения может быть получен модификацией серотипа 1 MDV штамма CVI988 или любого из его клонов или серийно пассированных штаммов, которые в этом описании носят собирательное название штаммы CVI988/X. Таким образом, при использовании в этом описании CVI988/X включает, но не ограничивается этим, ранее описанный исходный штамм с низким пассажным уровнем, CVI988/Rispens (Rispens et al., 1972, Avian Dis., 16:106-125 и 126-138), клон С штамма CVI988 (CVI988/C) (De Boer, U.S. Patent No.4673572, и De Boer et al., 1986, Avian Dis. 30:276283) и CVI988/C/R6 (De Boer et al., 1988, Advances in Marek's Disease Research, pp. 405-413). Содержание каждой из вышеуказанных публикаций/патентов включено в данное описание путем отсылки.
В одном варианте осуществления изобретение предоставляет новый рекомбинантный ослабленный штамм MDV, который получен путем замещения части нативной последовательности CVI988/X экзогенной ДНК, включающей последовательность длинного концевого повтора (LTR) вируса ретикулоэндотелиоза.
В одном варианте осуществления рекомбинация штамма CVI988 осуществлялась при помощи серотипа 1 MDV штамма RM1 в качестве источника экзогенных LTR (RM1 является рекомбинантным MDV, в который были интегрированы REV LTR). Как показано на фиг. 2, REV LTR был вырезан из очищенной вирусной ДНК RM1 путем расщепления Рас 1 и вставлен в челночный вектор В40, полученный из высоковирулентного штамма вируса болезни Марека Md5. Полученный рекомбинантный вектор В40Рас использовался для вставки LTR в штамм вируса болезни Марека CVI988. Для создания рекомбинантного MDV с LTR (штамма АТСС РТА-4945) проводили ко-трансфекцию клеток эмбриональных фибробластов кур или уток (CEF или DEF) очищенной вирусной ДНК штамма MDV CVI988 с рекомбинантным вектором, расщепленным по NotI. Рекомбинантные вирусы, обладающие RM1 LTR, интегрированными в их геном, реплицировались с большей скоростью, чем исходный штамм CVI988. Не будучи связанными теорией, авторы полагают, что это увеличенная скорость репликации является результатом вставки LTR вируса ретикулоэндотелиоза в геном MDV перед геном ICP4.
В другом варианте осуществления MDV CVI988/X может быть модифицирован путем добавления выделенных LTR вируса ретикулоэндотелиоза из источников, отличающихся от штамма RM1. Например, было показано, что сайт интеграции LTR в штамм RM1 MDV располагается между IRL и IRS генома (Jones et al., 1996, Retro viral insertional activation in a herpes virus: transcriptional activation of US genes by an integrated long terminal repeat in a MDV clone, J. Virology, 70(4):2460-2467). Это приблизительно соответствует положению 152,745 штамма Md5 вируса болезни Марека. Этот участок расположен внутри длинного фрагмента EcoRl длиной 1704 пар оснований (нуклеотиды 152, 198-153, 902) серотипа 1 Md5 (Tulman et al., 2000, The genome of very virulent Marek's Disease virus, J. Virology, 74d7):7980-7988). Этот EcoRl фрагмент длиной 1704 п.о. может быть клонирован в плазмидный вектор, не имеющий сайтов расщепления эндонуклеазой DraIII, и использован в качестве вектора переноса (transfer vector) для введения любого LTR в геном MDV. Этот EcoRX фрагмент обладает единственным сайтом рестрикции DraIII, расположенным на 10 п.о. выше (впереди) расположения LTR в RM1. LTR могут быть вставлены в DraIII сайт фрагмента EcoRl длиной 1704 пар оснований для создания вектора для переноса LTR, для того, чтобы создать рекомбинантный MDV со вставками LTR, вектор для переноса следует линеаризовать при помощи EcoRl, выделить с использованием фенола и хлороформа и осадить этанолом. Котрансфекция линеаризованного вектора для переноса вместе с ДНК любого штамма MDV серотипа 1 в подходящие клетки в культуре приведет к введению последовательностей LTR в геном MDV путем гомологичной рекомбинации.
Reddy et al. было показано (выше), что полученный рекомбинантный вирус (т.е. MDV с LTR вируса ретикулоэндотелиоза) должен расти быстрее, чем соответствующий исходный штамм MDV и, таким образом, нет необходимости проводить очистку путем клонирования с помощью метода образования бляшек. Однако, принимая во внимание неожиданно обнаруженный заявителями факт, что образец CVRM-2 в действительности являлся комбинацией рекомбинантного MDV и соответствующего исходного MDV, специалисту настоятельно рекомендуется проводить очистку путем клонирования с помощью метода образования бляшек всех рекомбинантных MDV, предусмотренных настоящим раскрытием. Это особенно важно, поскольку специалист может ошибочно удалить потенциально пригодный рекомбинантный MDV после получения результатов, указывающих на то, что иммунизация вирусом не может обеспечить достаточный уровень защиты против последующего заражения вирулентным MDV (см. табл. 1 в Reddy et al., где CVRM-2, по-видимому, обеспечивает менее 80% защиты).
В другом варианте осуществления рекомбинантный MDV, имеющий RETV LTR, может быть приготовлен из любого MDV, включая другие штаммы CVI988/X, с использованием депонированного CVRM-2, при условии, что CVRM-2 очищается путем клонирования с помощью метода образования бляшек, чтобы гарантировать, что вирус является RN1250, а не сочетанием RN1250 и исходного штамма MDV.
- 6 030866
Множество REV LTR являются подходящими для использования в данном изобретении. Множество выделенных и описанных подходящих LTR вируса ретикулоэндотелиоза включает, но не ограничивается этим, описанные Kost et al. (1993, Retrovirus insertion into herpesvirus: characterization of a Marek's Disease virus harboring a solo LTR, Virology, 192:161-169), Ridgway (1992, REV LTR elements are efficient promoters in cells of various species и tissue origin, including human lymphoid cells, Gene, 121:213-218), Boerkoel and Kung [1992, Transcriptional interaction between retroviral long terminal repeats (LTRs): mechanism of 5' LTR suppression and 3' LTR promoter activation of c-myc in avian B-cell lymphomas, J. Virol., 66:4814-4823], Hippenmeyer and Krivi (1991, Gene expression from heterologous promoters in a replicationdefective avian retrovirus vector in quail cells, Poult. Sci., 70:982-92), Ridgway et al. (1989, Transient expression analysis of the reticuloendotheliosis virus long terminal repeat element, Nucleic. Acids. Res., 17:31993215), Embretson and Temin (1987, Transcription from a spleen necrosis virus 5' long terminal repeat is suppressed in mouse cells, J. Virol., 61:3454-3462), Notani and Sauerbier (1987, Sequence instability in the long terminal repeats of avian spleen necrosis virus and reticuloendotheliosis virus, J. Mol. Evol., 25:241-247), Robinson and Gagnon (1986, Patterns of proviral insertion and deletion in avian leukosis virus-induced lymphomas, J. Virol., 57:28-36), и Ridgway et al. (1985, In vitro transcription analysis of the viral promoter involved in cmyc activation in chicken В lymphomas: detection and mapping of two РНК initiation sites within the reticuloendotheliosis virus long terminal repeat, J. Virol., 54:161-170). Содержание каждой из вышеуказанных публикаций включено в данное описание путем отсылки, кроме того, множество LTRпоследовательностей доступно в GenBank и других геномных базах данных и может быть синтезировано при помощи ПЦР с использованием LTR-специфических праймеров. Амплифицированные в ходе ПЦР последовательности затем могут быть введены в любой из двух векторов для переноса (transfer vectors), описанных выше.
Раскрытые в этом документе нуклеиновокислотные последовательности REV LTR или их биологически функциональные эквиваленты могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Фраза биологически функциональные эквиваленты при использовании в этом документе означает нуклеиновокислотные последовательности, проявляющие такую же или аналогичную биологическую/иммунопротективную активность, как и указанные выше нуклеиновокислотные последовательности LTR вируса ретикулоэндотелиоза (т.е. при введении в CVI988 MDV хозяина с сохранением функциональности они вызывают защитный иммунный ответ, не вызывая значительной степени патогенности у кур).
Например, описанные в этом документе нуклеиновокислотные последовательности могут быть изменены путем замены, введения, добавления или делеции оснований с целью получения биологически и функционально эквивалентных нуклеиновых кислот, которые сохраняют промоторную или энхансерную активность.
Рассматриваемые в этом документе варианты геномных ДНК или кДНК (при получении при помощи ПЦР с обратной транскрипцией из РНК), должны обладать более 75% гомологии, предпочтительно более 85% гомологии и наиболее предпочтительно более 95% гомологии с природными REV LTR, обсуждаемыми в этом документе.
Вакцина на основе рекомбинантного вируса болезни Марека изобретения может быть приготовлена в виде бесклеточного препарата или в предпочтительном варианте осуществления в виде клеточноассоциированного препарата. Клеточно-ассоциированная вакцина может быть приготовлена непосредственно из in vitro культуры живых вирусных агентов в подходящей питательной среде, таких как фибробласты куриных эмбрионов, как описано Witter (US4,895,718, содержание которого включено в данное описание путем отсылки). Альтернативно, для приготовления бесклеточного вирусного инокулята клетки ткани инфицированного хозяина или клеточная культура подвергаются обработке ультразвуком или разрушению иным способом, как описано ранее. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а цетрифугат восстанавливают как инокулят. Более того, в то время как предпочтительная вакцина представляет собой жизнеспособный вирус, также предусматривается, что вакцина может быть приготовлена из убитого вируса или из иммуногенных компонентов, выделенных из вируса, хотя такая обработка повлечет за собой значительно большие затраты. Например, субъединичная вакцина может быть приготовлена путем отделения от убитого вируса одного или более очищенных вирусных белков, обладающих иммуногенными свойствами.
Предназначенный для введения вирусный агент в эффективной для иммунизации дозе заключают в состав с фармацевтически приемлемым переносчиком или растворителем, таким как физиологический раствор или среда для культуры ткани. Выражение эффективная для иммунизации доза определяется как количество, которое будет стимулировать иммунитет у кур против заражения вирулентным штаммом вируса болезни Марека, при этом считается, что иммунитет в популяции цыплят вызван, когда уровень защиты для данной популяции значительно выше, чем у невакцинированной контрольной группы (иммунитет оценивается при уровне достоверности по меньшей мере 80%, предпочтительно при уровне достоверности 95%). Одним из показателей уровня защиты является индекс защиты (Pi), который вычисляется как разница между числом случаев MD среди невакцинированных зараженных MDV контрольных птиц и числом случаев MD среди вакцинированных зараженных MDV птиц, деленная на число случаев
- 7 030866 болезни Марека у невакцинированных зараженных MDV контрольных птиц и умноженная на 100.
Как правило, вакцина будет содержать по меньшей мере приблизительно 200 БОЕ (бляшкообразующих единиц) вируса и предпочтительно приблизительно от 2000 до 5000 БОЕ. Вакцина может вводиться с эффективностью в любой момент после достижения цыпленком иммунокомпетентности, что происходит примерно на 18-й день инкубации (3 дня до вылупления); но, как правило, вводится инокуляцией в пределах 24-48 ч после вылупления. Альтернативно рекомбинантная вирусная ДНК может вводиться в виде ДНК-вакцины, как описано в Tischer et al. (2002, J. Gen. Virology, 83:2367-2376, содержание которой включено в данное описание путем отсылки).
Подходящие адъюванты, известные в данной области техники, также могут быть включены в вакцинную композицию. Во многих случаях эффективность вакцины может быть увеличена комбинацией рекомбинантных вирусов болезни Марека изобретения с другими вирусными агентами в бивалентной или поливалентной вакцине.
В другом варианте осуществления фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент или наполнитель (основа) может представлять собой эмульсию вода-в-масле. В еще одном варианте осуществления эмульсия вода-в-масле может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W). В другом варианте осуществления фармацевтически или ветеринарно приемлемый переносчик, эксципиент или наполнитель может представлять собой эмульсию масло-в-воде.
Способы применения и готовое изделие.
Настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления способа изобретения. В одном варианте осуществления способ вакцинирования птиц включает введение композиции, содержащей вирус болезни Марека (MDV).
В одном варианте осуществления изобретения может использоваться прайм-буст режим, состоящий по меньшей мере из одного первичного введения и по меньшей мере одного повторного (бустерного) введения с использованием по меньшей мере одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Как правило, иммунологическая композиция или вакцина, используемая при первичном введении, отличается по природе от вакцины, используемой в качестве бустер-инъекции. Однако следует отметить, что та же композиция может использоваться для первичного и вторичного введения. Этот протокол введения называется прайм-буст.
Прайм-буст режим введения включает по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одно вторичное введение с использованием по меньшей мере одного общего полипептида и/или его варианта или фрагмента. Вакцина, используемая при первичном введении, может отличаться по природе от вакцины, используемой позже в качестве бустерной вакцины. Первичное введение может включать одно или более введений. Аналогично, вторичное введение может включать одно или более введений.
Как правило, объем дозы композиций составляет приблизительно от 0.1 до 2.0 мл, приблизительно от 0.1 до 1.0 мл и приблизительно от 0.5 мл до 1.0 мл.
Специалисту в данной области техники понятно, что приведенное раскрытие предоставляется в качестве примера, и настоящее изобретение этим не ограничивается. Исходя из данного раскрытия и знаний в данной области техники, специалист может определить число введений, способ введения и дозы, которые должны использоваться для каждого протокола введения, не прибегая к избыточному экспериментированию.
Настоящее изобретение предполагает по меньшей мере одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, изготовленной в соответствии с изобретением. Животное может быть самцом, самкой, беременной самкой или новорожденным животным. Это введение может осуществляться различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, внутримышечную (IM), внутрикожную (ID) или подкожную (SC) инъекцию, или путем интраназального или перорального введения. В соответствии с изобретением терапевтическая композиция также может вводиться при помощи безыгольного устройства (например, как в случае устройств Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, США), Vetjet или Vitajet (Bioject, Oregon, США)). Другим подходом для введения содержащих плазмиды композиций является использование электропорации (см., например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT Application No. WO 99/01158). В другом варианте осуществления терапевтическая композиция доставляется животному при помощи генной пушки или бомбардировки частицами золота. В предпочтительном варианте осуществления животное является собакой, хорьком или тюленем.
Другим вариантом осуществления изобретения является набор для осуществления способа вызова или индукции иммунного или защитного ответа на MDV у животного, содержащий иммунологическую композицию или вакцину, включающую рекомбинантный MDV, и инструкции по осуществлению способа доставки в эффективном количестве для того, чтобы вызвать иммунный ответ у животного.
В одном варианте осуществления раскрытый в этом описании предмет изобретения имеет отношение к набору для осуществления способа получения или вызова иммунного ответа, который может содержать любую из композиций или вакцин, содержащих рекомбинантный MDV, и инструкции для осуществления данного способа.
Другие цитокины, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно
- 8 030866 макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α (IFNa), интерферон β (IFNP), интерферон γ (IFNy), интерлейкин-1а (IL-1a), интерлейкин-1в (IL-1e), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухоли a (TNFa), фактор некроза опухоли β (TNFe) и трансформирующий фактор роста β (TGFe). Понятно, что цитокины могут вводиться вместе с и/или последовательно с иммунологической или вакцинной композицией настоящего изобретения. Таким образом, например, вакцина данного изобретения также может содержать молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, например цитокин, подходящий для вакцинирования данного хозяина, или хозяина, у которого должен быть вызван иммунологический ответ (например, птичий цитокин для препаратов, предназначенных для введения птицам).
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих, неограничивающих примеров.
Пример 1. Эффективность SR-1 штаммов CVRM-2 RN1250 и RMI CN32399 и Rispens CN32553 вируса болезни Марека (MDV).
Ключевым аспектом настоящего изобретения является открытие авторов изобретения, сделанное после завершения описанного в этом примере исследования. Было установлено, что CVRM-2 MDV не являлся клональным рекомбинантным MDV, а в действительности представлял собой смешанную популяцию RN1250 рекомбинантного MDV и исходного Rispens MDV. Таким образом, теперь, когда авторы изобретения получили стабильный клональный RN1250 MDV, эффективность которого в качестве вакцины продемонстрирована в следующих примерах, специалист не будет удивлен широким (и неприемлемым) диапазоном уровня защиты (37-86%), который обеспечивал CVRM-2 MDV в этом предварительном исследовании.
Цель. Оценить и сравнить эффективность трех экспериментальных штаммов MDV SR-1 и штаммов Rispens с коммерческой вакциной (Rismavac®-Intervet, Inc.) у SPF кур с использованием раннего заражения MDV T. King.
Материалы и методы. Сто пятьдесят суточных SPF цыплят (SPAFAS стадо W-42) случайным образом разделили на пять групп по тридцать птиц каждая (группы 1-5). Затем каждую группу, предназначенную для лечения, случайным образом разделили по изоляционным блокам. Вначале цыплят группы 1, использовавшихся в качестве невакцинированных зараженных контрольных птиц, поместили в изоляционные блоки с отрицательным давлением, по пятнадцать птиц в блок. Затем каждую из оставшихся групп (группы 2-5) подкожно (SQ) вакцинировали препаратами Intervet Rispens Rismavac®; MDV SR-1 RMI CN32399 P4; MDV SR-1 CVRM-2 RN1250 P4 или MDV Rispens CN32553 P4 по 0.2 мл на птицу. Вакцинированных подкожно птиц из групп 2-5 также помещали в изоляционные блоки с отрицательным давлением, по 15 птиц в блок. Через четыре дня, в день исследования 4, птиц в группах 1-5 индивидуально инфицировали MDV Т. King, разведенным 1:500 (протокол 02-085 от 02 января 2003). Птиц инфицировали внутрибрюшинно (IP), по 0.2 мл на птицу. После инфицирования птиц наблюдали в течение 49 дней. Проводили вскрытие и обследование на наличие характерных для MDV повреждений всех птиц, умерших до 53 дня исследования. В День 53 забивали всех оставшихся птиц и проводили вскрытие и обследование на наличие характерных для MDV повреждений.
Результаты. Экспериментальные MDV SR-1 и Rispens штаммы обеспечивали степень защиты 3786% против раннего инфицирования MDV Т. King. Intervet's Rismavac® обеспечивал 83% защиты. Инфицирование подтверждалось уровнем заболеваемости MD среди невакцинированных зараженных контрольных птиц (97%).
Пример 2. Эффективность MDV, SR-1, RN1250 вакцины у товарных бройлеров с использованием Shedder Challenge Model (модели вызванной инфицированием линьки).
Материалы и методы: семьдесят шесть (76) суточных товарных бройлеров, полученных из стада Harrison 1-1, случайным образом распределили по трем колониальным домикам и четырем различным группам, как указано далее: группа 1: 13 птиц; группа 2: 13 птиц; группа 3: 25 птиц; и группа 4: 25 птиц (один домик был разделен на два отделения, чтобы образовались два загона). После рандомизации заднюю часть шеи птиц окольцовывали для идентификации, и затем птиц внутрибрюшинно (IP) инокулировали vvMDV T. King 0,2 мл на птицу при разведении 1:500. После инфицирования птиц помещали в соответствующий колониальный домик по 25-26 птиц в домик. Эти птицы оставались в колониальных домиках в течение 14 дней перед помещением MDV вакцинированных и невакцинированных контактирующих контрольных птиц. Через 14 дней после размещения линяющих птиц (shedder birds), 304 суточных товарных бройлера случайным образом распределили, как указано далее: две группы по 75 птиц в каждой (группы 3 и 4) и две группы по 38 и 40 птиц (группы 1 и 2), для вакцинирования; кроме того, две группы по 25 птиц и две по 13 птиц использовались в качестве невакцинированных контактирующих контрольных птиц для групп 1-4 (группа 1: 13 птиц; группа 2: 13 птиц; группа 3: 25 птиц; и группа 4: 25 птиц). Для идентификации заднюю часть шеи этих невакцинированных контактирующих контрольных птиц окольцовывали, после чего их помещали в колониальные домики. Подвергавшихся вакцинирова
- 9 030866 нию птиц инокулировали подкожно (0.2 мл на птицу), как указано далее: птиц в группе 1 вакцинировали RN1250 pre MSV, P6 (изолят I); птиц в группе 2 вакцинировали RN1250 pre MSV, P7 (изолят U); птиц в группе 3 вакцинировали RN1250 pre MSV, P7 (изолят F); и птиц в группе 4 вакцинировали Rismavac® серийный номер 02760010, годен до 15.04.2012. После инокулирования вакцинированных птиц помещали в те же колониальные домики, что и невакцинированных контактирующих контрольных птиц, и линяющие птицы были размещены заранее. Дополнительно пятьдесят (50) неинокулированных суточных товарных бройлеров помещали в изолированные блоки и содержали в течение 49 дней для того, чтобы они служили второй группой контактирующих в более поздний день контрольных птиц. Через восемь дней заднюю часть шеи всех вакцинированных птиц окольцовывали, используя пронумерованные кольца с цветовой маркировкой. Линяющие птицы оставались в колониальных домиках в течение пятидесяти дней, а затем всех выживших птиц забивали и вскрывали.
Клинические проявления болезни и смертность контролировали ежедневно в течение 49 дней после вакцинации. Для выделения вируса собирали селезенки всех умерших контактировавших контрольных птиц. На 53 день исследования сорок неинокулированных товарных бройлеров, содержащихся в изолированных блоках и служивших второй группой контактирующих контрольных птиц, помещали в колониальные домики групп 1-4 в соответствии со схемой рандомизации, по 10 птиц на группу. Перед размещением этих птиц окольцовывали пронумерованными кольцами для идентификации. Селезенки этих птиц также собирали для выделения вируса в случае их смерти. Оставшихся вакцинированных птиц и исходных невакцинированных контактирующих контрольных птиц забивали и вскрывали на 63 день исследования после периода наблюдения, длившегося 49 дней. От 10 контактирующих контрольных птиц для выделения вируса собирали селезенку и по меньшей мере два перьевых фолликула от одной птицы. Птиц для отбора образцов определяли в соответствии со схемой рандомизации. В день исследования 83 забивали оставшихся контактирующих контрольных птиц, присоединенных к группам в день исследования 53 (вторая группа). От этих контактировавших контрольных птиц для выделения вируса собирали селезенки и по меньшей мере два перьевых фолликула от одной птицы.
Таблица 1
Число птиц, выживших к пятидневному возрасту
| Режим | Группа | Название | Выжившие к пятидневному возрасту/общее количество птиц |
| Вакцинированные | 1 | RN1250preMSV(I) | 38/38 |
| Вакцинированные | 2 | RN1250 pre MSV (U) | 40/40 |
| Вакцинированные | 3 | RN1250 pre MSV (F) | 73/75 |
| Вакцинированные | 4 | Rismavac'11’ | 73/75 |
| Контактировавший контроль | 1 | RN1250 pre MSV (I) | 12/13 |
| Контактировавший контроль | 2 | RN1250 pre MSV (U) | 13/13 |
| Контактировавший контроль | 3 | RN1250 pre MSV (F) | 22/25 |
| Контактировавший контроль | 4 | Rismavac® | 23/25 |
- 10 030866
Таблица 2
Индексы защиты против инфицирования vvMDV T. King
| Режим | Группа | Название | # зараженные /общее количество птиц | Процент инфицированных | Индекс защиты вакцины3 |
| Вакцинированные | 1 | RN1250 pre MSV (I)1 | 2/38 | 5.26% | 87.4 (81.2)6 |
| Вакцинированные | 2 | RN1250 pre MSV (U)2 | 6/40 | 15.0% | 2.6 (46.4)6 |
| Вакцинированные | 3 | RN1250 pre MSV (F)3 | 6/73 | 8.22% | 84.9 |
| Вакцинированные | 4 | Rismavac** | 15/73 | 20.5% | 63.7 |
| Линяющие птицы | 1 | RN1250 pre MSV (I) | 9/12 | 75.0% | N/A |
| Линяющие птицы | 2 | RN1250 pre MSV (U) | 11/12 | 91.7% | N/A |
| Линяющие птицы | 3 | RN1250preMSV(F) | 20/25 | 80.0% | N/A |
| Линяющие птицы | 4 | Rismavac* | 22/24 | 91.7% | N/A |
| Контактировавший контроль | 1 | RN1250 pre MSV (I) | 5/12 | 41.7% | N/A |
| Контактировавший контроль | 2 | RN1250 pre MSV (U) | 2/13 | 15.4% | N/A |
| Контактировавший контроль | 3 | RN1250 pre MSV (F) | 12/22 | 54.5% | N/A |
| Контактировавший контроль | 4 | Rismavac* | 13/23 | 56.5% | N/A |
| 2м контроль | 1 | RN 1250 pre MSV (I) | 9/10 | 90.0% | N/A |
| 2м1 контроль | 2 | RN1250 pre MSV (U) | 8/10 | 80.0% | N/A |
| 2° контроль | 3 | RN1250 pre MSV (F) | 9/10 | 90.0% | N/A |
| 20В контроль | 4 | Rismavac* | 8/10 | 80.0% | N/A |
'титр вакцины RN1250 (I): 3600 бое/0.2 мл.
1 титр вакцины RN1250 (U): 3144 бое/0.2 мл.
3 титр вакцины RN1250 (F); 3710 бое/0.2 мл. * титр вакцины Rismavac®: 2328 бое/0.2 мл.
5 Индекс защиты вакцины: процент невакцинированных контактировавших птиц с характерными для MD повреждениями (контроль инфицирования) - процент вакцинированных кур с характерными для MD повреждениями / процент невакцинированных контактировавших птиц с характерными для MD повреждениями (контроль инфицирования).
6 Индекс защиты вакцины с учетом процента невакцинированных контактировавших птиц с характерными для MD повреждениями (контроль инфицирования) в колониальном домике 10, Группы 1 и 2, в качестве одной группы (28% или 7 /25).
Заключение. Вакцина от болезни Марека, серотип 1, вакцина RN1250, pre MSV (I) и (F) были более эффективны, чем препарат Intervet's Rismavac® у товарных бройлеров при использовании MDV Т. King на модели shedder challenge model (вызванной инфицированием линьки).
Пример 3. Исследование безопасности MDV RN1250 (Х+5) на SPF суточных цыплятах.
Двести пятьдесят суточных SPF цыплят случайным образом распределяли на пять лечебных групп, по 50 цыплят на группу, а также случайным образом распределяли по изоляционным блокам с отрицательным давлением, использованным для содержания птиц. Сто цыплят были обозначены как вакцинируемые и названы группами 1 и 2. Сто цыплят были обозначены как ложновакцинируемые, контактирующие контрольные птицы групп 1 и 2 (группы 4 и 5, соответственно); оставшиеся ложновакцинируемые цыплята (50) были названы группой 3 и служили отрицательным контролем. После рандомизации ложновакцинированные контактирующие контрольные птицы и ложновакцинированные птицы отрицательного контроля были помечены для идентификации с помощью пронумерованных меток на крыльях и помещены в соответствующие блоки (7-10 птиц в блок). Ложновакцинированных птиц инокулировали разбавителем в объеме 0.2 мл на птицу. Цыплят, обозначенных вакцинированными, подкожно (SQ) инокулировали RN1250 (Х+5) (группа 1) или Rismavac® (группа 2), в объеме 0.2 мл на птицу (~5000-6500 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на дозу). После инокулирования вакцинированных птиц помещали в соответственно обозначенные блоки (7-10 птиц на блок) к их ложновакцинированным контактирующим контрольным птицам, которые были размещены предварительно, в количестве от 15 до 20 цыплят на блок.
- 11 030866
Таблица 3
Дизайн исследования
| Групца | Вакцина | Способ вакцинации * | Число птиц |
| 1 | MDVSR-1 RN1250 | SQ | 50 |
| 2 | MDVSR-1 Rismavac® | SQ | 50 |
| 3 | Ложновакцинированные (отрицательный контроль) | SQ | 50 |
| 4 | Ложновакцинированные контак1Мрующие контрольные птицы для вакцинированных MDV SR-1 RN1250 птиц | SQ | 50 |
| 5 | Ложновакцинированные контактирующие контрольные птицы для вакцинированных MDV SR-1 Rismavac® птиц | SQ | 50 |
На 7 день у птиц из групп 1-5 (у пяти птиц из каждой группы) были взяты и зафиксированы в 10% буферном формалине образцы органов (бурсы, тимуса и селезенки) для гистопатологических исследований. В соответствии со схемой рандомизации из каждого блока выбирали по 2-3 птицы. В день исследования 14 проводили определение массы тела и массы органов (бурсы, тимуса и селезенки) у 15 птиц из групп 1-5. Образцы органов (бурсы, тимуса и селезенки) птиц из групп 1-5 (пяти птиц из каждой группы) отбирали и фиксировали в 10% буферном формалине. Двух-трех птиц из блока взвешивали и использовали для взятия органов. Птиц выбирали в соответствии со схемой рандомизации. Процедуру, описанную для дня исследования 14, повторяли в дни 28 и 49 с оставшимися птицами.
Результаты. Атрофия органов RN1250. Бурса птиц, вакцинированных MDV SR-1 RN1250, и бурса ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц незначительно отличались по показателям от бурсы ложновакцинированных птиц из отрицательного контроля, за исключением дня 28, когда бурса контактировавших контрольных птиц для MDVSR-1 RN1250 по показателям была значительно больше, чем у птиц из группы отрицательного контроля (р>0.0111). Показатели тимуса птиц, вакцинированных MDVSR-1 RN1250, и ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц не обнаруживали значительных отличий от показателей тимуса ложновакцинированных птиц из группы отрицательного контроля (р>0.7265). Наконец, показатели селезенки у птиц, вакцинированных MDVSR-1 RN1250, и ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц не показали значительных отличий от этих показателей у ложновакцинированных птиц из группы отрицательного контроля (р>0.5286).
Атрофия органов при использовании Rismavac®.
Показатели бурсы птиц, вакцинированных вакциной MDVSR-1 Rismavac®, и ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц не обнаруживали значительных отличий от этих показателей ложновакцинированных птиц из группы отрицательного контроля (р>0.0581). Показатели тимуса птиц, вакцинированных вакциной MDVSR-1 Rismavac®, и ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц не обнаруживали значительных отличий от этих показателей у ложновакцинированных птиц из отрицательного контроля (р>0.4004). Показатель селезенки у птиц, вакцинированных вакциной MDVSR-1 Rismavac®, был значительно выше, чем показатель селезенки у ложновакцинированных птиц из отрицательного контроля в день 14 (р=0.0141); и показатели селезенки ложновакцинированных контактировавших контрольных птиц были значительно больше, чем показатели у ложновакцинированных птиц из группы отрицательного контроля в день 28 (р<0.0001). Показатели не обнаруживали существенных различий в другие дни (р>0.5558). В результате гистологического исследования не было обнаружено доказательств атрофии бурсы, тимуса или селезенки у птиц, зараженных вирусом болезни Марека SR-1 RN1250 или Rismavac®.
Заключение. В условиях данного исследования MDV SR-1, RN1250, Х+5 были безопасны при подкожном введении при оценке по показателям атрофии бурсы, тимуса и/или селезенки.
Пример 4. Распространение MDV, SR-1, RN1250 у SPF суточных цыплят.
Цель. Оценить распространение MDV при подкожном введении SR-1, RN1250 экспериментальной вакцины (Х+5) у суточных свободных от патогенной микрофлоры (SPF) цыплят и определить, будет ли он распространяться на невакцинированных контактирующих птиц.
Материалы и методы. 120 суточных SPF цыплят случайным образом распределяли по трем лечебным группам и шести блокам для содержания 15 вакцинированных и пяти контактирующих цыплят в каждом. Заднюю поверхность шеи птиц, обозначенных контактирующими, окольцовывали цветными пронумерованнными метками в соответствии со схемой рандомизации, после чего их помещали в соответствующие блоки. Птиц, отобранных как вакцинируемых, вакцинировали с использованием MDV RN1250 Х+5 или Rispens. Экспериментальную и коммерческую вакцины разводили в разбавителе Маре
- 12 030866 ка с получением приблизительно 100,000 бое на дозу (приблизительно 17Х предполагаемая полевая доза) и вводили подкожно. После вакцинации птиц помещали в соответствующие блоки вместе с контактирующими птицами, помещенными в них ранее. Вакцинированных птиц окольцовывали в возрасте 8 дней по задней поверхности шеи цветными пронумерованными метками в соответствии со схемой рандомизации. Сотрудники, принимавшие участие в клинической оценке в ходе исследования, не присутствовали при мечении контактирующих и вакцинированных птиц, а также не осуществляли клинические наблюдения в течение этого периода времени для сохранения статуса исследования как слепого.
Таблица 4
Группы исследования
| ГруппDa | Вакцина | Способ вакцинации/ объем | Число ПТИЦ * | |
| Вякцннировд иные | Невакцициро ванные контактирую щие | |||
| 1 | MDV SR.-1 RN1250 | SQ/ 0.2 мл на птицу | 30 | 10 |
| 2 | MDVSR-1 Rispens вакцина | SQ/ 0.2 мл на птицу | 30 | 10 |
| 3 | Ложновакцинированн ый отрицательный контроль | SQ/ 0.2 мл на птицу | 30 | 10 |
Через две недели после вакцинации у всех вакцинированных птиц брали мазки из трахеи и клоаки для выделения вируса. Мазки объединяли по группам, по пять трахеальных или клоакальных мазков в одну пробирку для взятия мазка, содержащую 5 мл стабилизатора SPGA. Первичные перьевые фолликулы для выявления вируса собирали от двух вакцинированных птиц в каждой группе, собирая по два или три перьевых фолликула от одной птицы. Двух птиц из группы для отбора перьевых фолликулов выбирали в соответствии со схемой рандомизации и оставляли в живых после отбора образцов. Все образцы направляли в аналитический отдел Merial Select's для обработки. Аналогичную процедуру отбора образцов повторяли дважды с семидневными интервалами.
В день исследования 21 в дополнение к взятию трахеального и клоакального мазков и перьевых фолликулов, пять вакцинированных и невакцинированных контактировавших птиц из группы (выбранных в соответствии со схемой рандомизации) забивали, проводили вскрытие и извлекали селезенку. Выделение вируса проводили только из селезенок, взятых у невакцинированных контактировавших птиц (у вакцинированных птиц селезенки брали для сохранения статуса исследования как слепого). В последний день исследования (день 49) проводили эвтаназию и вскрытие всех оставшихся птиц и завершали исследование. Проводили индивидуальное извлечение селезенки у оставшихся пяти вакцинированных и не вакцинированных контактировавших птиц в каждой группе. Выделение вируса проводили только из селезенок, взятых у невакцинированных контактировавших птиц (у вакцинированных птиц селезенки брали для сохранения статуса исследования как слепого).
Результаты. В первой группе MDV SR-1 RN1250 Х+5 среднее арифметическое титра (АМТ) составило 94,160 БОЕ/0.2 мл дозу. Во второй группе MDV SR-1 Rispens - 51,800 БОЕ/0.2 мл дозу. Все трахеальные и клоакальные мазки на наличие вируса были отрицательными.
Группа 1, MDV SR-1 RN1250: все протестированные на наличие вируса образцы перьевых фолликулов из этой группы были отрицательными.
Группа 2, MDV SR-1 Rispens: в день 21 перьевые фолликулы от обеих птиц были положительными в отношении цитопатического эффекта вируса болезни Марека (MD СРЕ). В дни 14 и 28 перьевые фолликулы от всех птиц, у которых были взяты образцы, были отрицательными.
Группа 3, ложновакцинированный отрицательный контроль: все протестированные на наличие вируса образцы перьевых фолликулов были отрицательными.
Из селезенок, взятых у контактировавших птиц в дни 21 и 49, вирус выделить не удалось. Образцы от дня 49 были исходно контаминированы, однако были заново протестированы при помощи ПЦР и оказались отрицательными. Замороженный материал лейкоцитарной пленки из этих же образцов также был высеян повторно, и было подтверждено, что все эти образцы являлись отрицательными.
Заключение. В условиях этого исследования птиц вакцинировали подкожно экспериментальной вакциной MDV, SR-1, RN1250, продемонстрировавшей распределение, аналогичное таковому у птиц, вакцинированных подкожно коммерчески доступной вакциной MDV, SR-1 Rispens. Вирус не был выделен и не было получено доказательств клинических проявлений болезни у невакцинированных птиц, находившихся в контакте с птицами, вакцинированными экспериментальной вакциной MDV RN1250.
Пример 5. Оценка эффективности MDV, S1, RN1250 вакцины (Х+5) против инфицирования вирусом vvMDV, RB1B при введении суточным цыплятам.
Материалы и методы. 280 суточных SPF цыплят случайным образом распределили в восемь групп и 24 изоляционных блока в соответствии со схемой рандомизации (по 11-12 птиц на блок, 35 птиц на лечебную группу). После рандомизации птиц в группах 6 и 7 (ложновакцинированной зараженной группе и
- 13 030866 ложновакцинированной ложнозараженной группе отрицательного контроля) подвергали ложной вакцинации разбавителем вакцины Марека и помещали в соответствующие блоки согласно схеме рандомизации. Затем оставшихся птиц вакцинировали MDV SR-1 RN1250 в количестве 287, 578, 736, 1085 или 1392 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на дозу одной птицы или MDV SR-3 HVT в количестве 1728 БОЕ на дозу одной птицы. Вакцину вводили подкожно (SQ) в объеме 0.2 мл. После вакцинации каждую вакцинированную группу помещали в соответствующие блоки согласно схеме рандомизации. В день исследования 4 птиц в группе 7 подвергали ложному инфицированию, используя разбавитель вакцины Марека, а птиц в группах 1-6 и 8 внутрибрюшинно (IP) инфицировали vvMDV RB1E в объеме 0.2 мл на птицу. Птиц наблюдали ежедневно в течение 45 дней после инфицирования на предмет каких-либо нежелательных реакций на заражение, в особенности смерти или угнетенного состояния. В день исследования 49 птиц забивали и проводили вскрытие для исследования обширных поражений, связанных с болезнью Марека.
Результаты. Доля птиц, защищенных от заражения vvMDV RB1B в группах 1-5, находилась в пределах от 0.84 до 0.94. Доля птиц, защищенных от заражения, в группе 8 (вакцинированной HVT группе) составила 0.73. Заболеваемость MDV в ложновакцинированной зараженной контрольной группе 6 составила 91.2%. У птиц в группе 7 (ложновакцинированной ложнозараженной группе отрицательного контроля) не наблюдалось поражения MDV в ходе всего периода исследования.
Заключение. MDV вакцина, серотип-1, живой вирус, RN1250 экспериментальная вакцина (Х+5) при подкожном (SQ) введении суточным SPF цыплятам была эффективной при использовании для заражения 287 бляшкообразующих единиц вируса RB 1B на дозу.
Таблица 5
Краткое изложение дозозависимой эффективности
| Гдуп па | Труп на | Фшшкодс» кая доза | Внфипировянн ые/#общее количество птвц | % Защищенных | % Инфи цяроваины X | |
| 1 | в | MDV RN1250 (Х+5) вакцина 250 бое | 287.2 бое/0.2 мл (АМТ) | 5/34 | 85.3% | 14.7% |
| 2 | н | MDV RN1250 (Х+5) вакцина 500 бое | 578.4 бое/0.2 мл (АМТ) | 4/34 | 88.2% | 11.8% |
| 3 | с | MDV RN1250 (Х+5) вакцина 750 бое | 736 бое/0.2 мл (АМТ) | 2/34 | 94.1% | 5.9% |
| 4 | А | MDV RN1250 (Х+5) вакцина 1000 бое | 1084.8 бое/0.2 мл (АМТ) | 3/35 | 91.4% | 8.6% |
| 5 | D | MDV RN1250 (Х+5) вакцина 1500 бое | 1392 бое/0.2 мл (АМТ) | 4/34 | 88.2% | 11.8% |
| 6 | Е | Ложновакцинированный/ зараженный контроль | 31/34 | N/A (8.8% *) | 91.2% | |
| 7 | G | Ложновакцинированный/ ложнозараженный отрицательный контроль | 0/35 | N/A | 0.0% | |
| 8 | F | Титр высвобожденного HVT | 1725 бое/0.2 мл (АМТ) | 8/33 | 75.8% | 24.2% |
Таким образом, после прочтения подробно описанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения следует понимать, что изобретение, определенное вышеизложенными разделами, не ограничивается изложенными в приведенном выше описании конкретными подробностями, поскольку возможно много очевидных вариантов без выхода за пределы существа и объема изобретения.
- 14 030866
Перечень последовательностей <110> ПРИТЧАРД, Джойс
МЕБАТСЬОН, Тезом БЮБЛО, Мишель <120> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ВИРУС БОЛЕЗНИ МАРЕКА
И ВАКЦИНЫ НА ЕГО ОСНОВЕ <130> MER 09-144 <150> US 61,614,142 <151> 2012-03-22 <160> 2 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> DMA <213> искусственная последовательность <220>
<223> Genbak S82226.1 Рекомбинантный штамм MDV RM1 мешающий rpt <400> 1
| ttaacctctc | tataggcggg | ggtgtgggag | ggagctccgg | gggaatgtgg | gagggagctc | 60 |
| cggggggaat | agcgctggct | cgctaactgc | catattagct | tctgtaatca | tgcttgcttg | 120 |
| ccttagccgc | cattgtactt | gatatatttc | gctgatatca | tttctcggaa | tcggcatcaa | 180 |
| gagcaggctc | ataaaccata | aaaggaaatg | tttgttgaag | gcaagcatca | gaccacttgc | 240 |
| accatccaat | cacgaacaaa | cacgagatcg | aactatcata | ctgagccaat | ggttgtaaag | 300 |
| ggcagatgct | atcctccaat | gagggaaaat | gtcatgcaac | atcctgtaag | cggctatata | 360 |
| agccaggtgc | atctcttgct | cggggtcgcc | gtcctacaca | ttgttgtgac | gtgcggccca | 420 |
| gattcgaatc | tgtaataaaa | gctttttctt | ctatatcctc | agattggcag | tgagaggaga | 480 |
| ttttgttcgt | ggtgttggct | ggcctactgg | gtggggtagg | gatccggact | gaatccgtag | 540 |
| tatttcggta | caacaggggg | gaagtccctc | ttatattggc | gagtg | 585 |
<210> 2 <211> 533 <212> DMA <213> искусственная последовательность <220>
<223> Длинный терминальный повтор из вируса ретикулоэндотелиоза <4©0> 2
| tgtgggaggg | agctccgggg | gaatgtggga | gggagctccg | gggggaatag | cgctggctcg | 60 |
| ctaactgcca | tattagcttc | tgtaatcatg | cttgcttgcc | ttagccgcca | ttgtacttga | 120 |
| tatatttcgc | tgatatcatt | tctcggaatc | ggcatcaaga | gcaggctcat | aaaccataaa | 180 |
| aggaaatgtt | tgttgaaggc | aagcatcaga | ccacttgcac | catccaatca | cgaacaaaca | 240 |
| cgagatcgaa | ctatcatact | gagccaatgg ttgtaaaggg | cagatgctat | cctccaatga | 300 | |
| gggaaaatgt | catgcaacat | cctgtaagcg | gctatataag | ccaggtgcat | ctcttgctcg | 360 |
| gggtcgccgt | cctacacatt | gttgtgacgt | gcggcccaga | ttcgaatctg | taataaaagc | 42Θ |
| tttttcttct | atatcctcag | attggcagtg | agaggagatt | ttgttcgtgg | tgttggctgg | 480 |
| cctactgggt | ggggtaggga | tccggactga | atccgtagta | tttcggtaca | аса | 533 |
- 15 030866
Claims (17)
1. Способ вызова безопасного и защитного иммунного ответа у птиц против вируса болезни Марека (MDV), включающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества композиции, содержащей вирусный агент, включающий рекомбинантный вирус болезни Марека, стабильно трансформированный чужеродной ДНК-конструкцией, содержащей последовательность длинного концевого повтора (LTR) вируса ретикулоэндотелиоза, где рекомбинантный MDV содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична последовательности SEQ ID NO:2, и где вирусный агент является клональным вирусом, а не смешанной популяцией исходного и рекомбинантного вирусов, где MDV представляет собой CVI988/X MDV.
2. Способ по п.1, согласно которому композиция дополнительно содержит ветеринарно или фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
3. Способ по п.1, согласно которому CVI988/X MDV представляет собой CVI988.
4. Способ по п.1 или 2, согласно которому птица является курицей.
5. Способ по п.1 или 2, согласно которому LTR представляет собой последовательность SEQ ID NO:2.
6. Способ по п.1 или 2, согласно которому последовательность LTR вводится с 5' конца относительно гена ICP4 указанного MDV.
7. Способ по п.1 или 2, согласно которому вирусный агент является ассоциированным с клетками.
8. Способ получения вирусного агента, эффективного для защиты птиц от болезни Марека, включающий трансформацию MDV штамма CVI988 чужеродной ДНК-конструкцией, включающей последовательность LTR вируса ретикулоэндотелиоза, имеющую по меньшей мере 90% гомологию с последовательностью SEQ ID NO:2, и отделения вирусного агента от исходного вируса путем клонирования с помощью метода образования бляшек.
9. Вирус болезни Марека (MDV), стабильно трансформированный чужеродной ДНК-конструкцией, содержащей последовательность LTR вируса ретикулоэндотелиоза, где MDV представляет собой клональный вирус, а не смешанную популяцию исходного и рекомбинантного вирусов, и где MDV содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична последовательности SEQ ID NO:2, где MDV представляет собой CVI988/X MDV.
10. MDV по п.9, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2.
11. Иммунологическая композиция, содержащая MDV по любому из пп.9, 10.
12. Композиция по п.11, которая представляет собой вакцинную композицию.
13. Композиция по п.12, которая обеспечивает уровень защиты по меньшей мере 85%.
14. Композиция по п.13, которая обеспечивает уровень защиты по меньшей мере 90%.
15. Композиция по п.14, которая обеспечивает уровень защиты по меньшей мере 95%.
- 16 030866
Md5 косм ид a
RM1 ^—^**Рас1 расщепление | Лигирование
I Бактериальная ▼ трансформация
В40 Рас Скрининг клонов
MDV
U3 RUS
LTR
LTR из аш из киз jd LTR bj----|ы LTR
Рас I Рас I ч__________ ________j
--v----RM 1
I Ко-трансфекция CV1988 ДНК и BC-40-Рас в клетки
I Гомологичная рекомбинация у Подтверждение рекомбинации методом ПЦР CVRM-2
U3 RUS ^l LTR ) из rTAACCTCTCTATAGGCGGGGdgGTGGGAGGGAGCTCCGGSGGafirGTGGGAGGGAGCTCCGGGGGGAArAGGGCTGGCTCGCTAAC'rGC
3ATATTAGCTTCTGTAATCATGCrrGCTTGCCTIAGCCGCCAITGTACTTGATATATTTCGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAA SAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAATGTTrGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCACCATCCMTCACGAACAAACACGAGATCG AACTATCATACTGAGCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAAATGTCATGCAACATCCTGTAAGCGeCTATAlA AGCCAGGrGCAICTCTTGCTaGGGGTCGCCGTCCTACACATTGTTGTGACGTGCGGCCCAGAITCGAAICIGTAATAAAAGCTTITTCTT CTATATCCTCAGATTGGCAGTGAGAGGAGATTTTGITCGTGGTGTIC-GCTGGCCrACTGGGTGGCGTAGGGATCCGGACTC-AATCCGTAG TArrTCGGTACAACrjGGGGGGAAGTCCCTCTrATATTGGCGAGTG..
U5 LTR MDV
Фиг. 2
SEQ ID N0:3
SEQ ID N0:4
SEQ ID N0:5
SEQ ID N0:6
SEQ ID N0:7
SEQ ID N0:8
SEQ ID N0:9
16. Изолированная клетка, стабильно трансформированная MDV по п.9 или 10.
17. Изолированная клетка по п.16, где клетка представляет собой куриный или утиный эмбриональный фибробласт (CEF, DEF).
SN5
SN16
SgrAI (42294) SgrAI (67529)
Р89
SgrAI BlpI (140186) (109416)
A6
Narl (35537) Pmel Asci (78402) (102314)
Фиг. 1
SanDI (145776)
- 17 030866
Фиг. 4
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261614142P | 2012-03-22 | 2012-03-22 | |
| PCT/US2013/032539 WO2013142377A2 (en) | 2012-03-22 | 2013-03-15 | Modified marek's disease virus, and vaccines made therefrom |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201401044A1 EA201401044A1 (ru) | 2015-01-30 |
| EA030866B1 true EA030866B1 (ru) | 2018-10-31 |
Family
ID=48045766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201401044A EA030866B1 (ru) | 2012-03-22 | 2013-03-15 | Модифицированный вирус болезни марека и вакцины на его основе |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20130251737A1 (ru) |
| EP (2) | EP3326646A1 (ru) |
| JP (1) | JP2015512396A (ru) |
| KR (5) | KR20230145532A (ru) |
| CN (1) | CN104602706A (ru) |
| AP (1) | AP2014007955A0 (ru) |
| AR (1) | AR090472A1 (ru) |
| BR (1) | BR112014023398A8 (ru) |
| CA (1) | CA2868099C (ru) |
| CR (1) | CR20140432A (ru) |
| DO (1) | DOP2014000215A (ru) |
| EA (1) | EA030866B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP14023407A (ru) |
| ES (1) | ES2663610T3 (ru) |
| GE (1) | GEP201706650B (ru) |
| GT (1) | GT201400199A (ru) |
| HK (1) | HK1255682A1 (ru) |
| IL (1) | IL234721B (ru) |
| MA (1) | MA37432A1 (ru) |
| MX (1) | MX355332B (ru) |
| MY (1) | MY169061A (ru) |
| NL (1) | NL301087I2 (ru) |
| PE (1) | PE20150323A1 (ru) |
| PH (1) | PH12014502085B1 (ru) |
| TN (1) | TN2014000393A1 (ru) |
| UA (1) | UA117345C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013142377A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201406884B (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112014023398A8 (pt) * | 2012-03-22 | 2022-08-16 | Merial Ltd | Vírus da doença de marek modidicado e vacinas feitas do mesmo |
| CN106397602B (zh) * | 2016-08-02 | 2019-06-18 | 青岛明勤生物科技有限公司 | 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050019348A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-01-27 | Reddy Sanjay M. | Marek's disease virus vaccine |
| US20130251737A1 (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Merial Limited | Modified Mareks Disease Virus, and Vaccines Made Therefrom |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3642574A (en) | 1970-04-29 | 1972-02-15 | Us Agriculture | Method for producing vaccine for immunization of poultry against marek{3 s disease |
| US4160024A (en) | 1978-05-01 | 1979-07-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Marek's disease vaccine |
| NL8401120A (nl) | 1984-04-09 | 1985-11-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Viruspreparaat, waarmee gevaccineerd kan worden tegen de ziekte van marek. |
| US4895717A (en) | 1987-07-10 | 1990-01-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Revertant serotype 1 Marek's disease vaccine |
| US4895718A (en) | 1987-07-10 | 1990-01-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Serotype 2 Marek's disease vaccine |
| CZ299473B6 (cs) | 1997-06-30 | 2008-08-06 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva |
| US9113301B1 (en) | 2014-06-13 | 2015-08-18 | Snapchat, Inc. | Geo-location based event gallery |
-
2013
- 2013-03-15 BR BR112014023398A patent/BR112014023398A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-03-15 CA CA2868099A patent/CA2868099C/en active Active
- 2013-03-15 MA MA37432A patent/MA37432A1/fr unknown
- 2013-03-15 EP EP17199985.7A patent/EP3326646A1/en active Pending
- 2013-03-15 JP JP2015501821A patent/JP2015512396A/ja active Pending
- 2013-03-15 ES ES13714141.2T patent/ES2663610T3/es active Active
- 2013-03-15 KR KR1020237033927A patent/KR20230145532A/ko active Application Filing
- 2013-03-15 CN CN201380023461.4A patent/CN104602706A/zh active Pending
- 2013-03-15 EA EA201401044A patent/EA030866B1/ru unknown
- 2013-03-15 KR KR1020147029496A patent/KR20140146136A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-03-15 MX MX2014011388A patent/MX355332B/es active IP Right Grant
- 2013-03-15 KR KR1020237005968A patent/KR102586316B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-15 UA UAA201411478A patent/UA117345C2/uk unknown
- 2013-03-15 KR KR1020227000586A patent/KR102503316B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-15 WO PCT/US2013/032539 patent/WO2013142377A2/en active Application Filing
- 2013-03-15 KR KR1020197024099A patent/KR20190100431A/ko not_active IP Right Cessation
- 2013-03-15 MY MYPI2014002694A patent/MY169061A/en unknown
- 2013-03-15 AP AP2014007955A patent/AP2014007955A0/xx unknown
- 2013-03-15 US US13/841,684 patent/US20130251737A1/en not_active Abandoned
- 2013-03-15 PE PE2014001444A patent/PE20150323A1/es not_active Application Discontinuation
- 2013-03-15 EP EP13714141.2A patent/EP2827898B1/en active Active
- 2013-03-15 GE GEAP201313604A patent/GEP201706650B/en unknown
- 2013-03-22 AR ARP130100944A patent/AR090472A1/es not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-09-18 IL IL234721A patent/IL234721B/en active IP Right Grant
- 2014-09-19 DO DO2014000215A patent/DOP2014000215A/es unknown
- 2014-09-19 GT GT201400199A patent/GT201400199A/es unknown
- 2014-09-19 CR CR20140432A patent/CR20140432A/es unknown
- 2014-09-19 ZA ZA2014/06884A patent/ZA201406884B/en unknown
- 2014-09-19 TN TNP2014000393A patent/TN2014000393A1/fr unknown
- 2014-09-22 PH PH12014502085A patent/PH12014502085B1/en unknown
- 2014-10-17 EC ECIEPI201423407A patent/ECSP14023407A/es unknown
-
2018
- 2018-11-20 HK HK18114829.8A patent/HK1255682A1/zh unknown
-
2019
- 2019-01-30 US US16/262,774 patent/US11510978B2/en active Active
-
2021
- 2021-01-12 NL NL301087C patent/NL301087I2/nl unknown
-
2022
- 2022-11-23 US US18/058,619 patent/US20230310589A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050019348A1 (en) * | 2003-07-21 | 2005-01-27 | Reddy Sanjay M. | Marek's disease virus vaccine |
| US20130251737A1 (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Merial Limited | Modified Mareks Disease Virus, and Vaccines Made Therefrom |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WITTER R L, ET AL.: "RETROVIRAL INSERTIONAL MUTAGENESIS OF A HERPESVIRUS: A MAREK'S DISEASE VIRUS MUTANT ATTENUATED FOR ONCOGENICITY BUT NOT FOR IMMUNOSUPPRESSION OR IN VIVO REPLICATION", AVIAN DISEASES., AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS, KENNET SQ., PA., US, vol. 41, 1 January 1997 (1997-01-01), US, pages 407 - 421, XP008045174, ISSN: 0005-2086 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2624037C2 (ru) | Конструкции рекомбинантного непатогенного вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса болезни ньюкасла | |
| US20230310589A1 (en) | Modified Marek's Disease Virus, and Vaccines Made Therefrom | |
| US20220088187A1 (en) | Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding multiple heterologous antigens | |
| WO2003039593A1 (en) | Fowl adenovirus vaccine | |
| WO2001005988A1 (en) | Live recombinant vaccine against avian leukosis virus using a marek's disease virus (mdv) virus as vector | |
| CN114828882A (zh) | 多价hvt载体疫苗 | |
| US11696947B2 (en) | H52 IBV vaccine with heterologous spike protein | |
| ES2284277T3 (es) | Vacunacion en huevo contra el virus de la enfermedad de marek del tipo i. | |
| US20240058436A1 (en) | Multivalent hvt vector vaccine | |
| OA17137A (en) | Modified marek's disease virus, and vaccines made therefrom | |
| US20050019348A1 (en) | Marek's disease virus vaccine | |
| Boone | The Effect of in Ovo Vaccination with Herpesvirus of Turkey (HVT) on the Ability to Hasten Immunocompetence in Meat-Type Chickens | |
| WO2023213946A1 (en) | New multivalent hvt vector vaccine | |
| WO2014125369A2 (en) | Deletion mutants of gallid herpes virus and vaccinal compositions containing the same |