KR102586316B1 - 개질된 마렉병 바이러스, 및 이로부터 제조된 백신 - Google Patents

개질된 마렉병 바이러스, 및 이로부터 제조된 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마렉병에 대한 효과적인 백신을 제공하며, 상기 백신은 망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복 서열을 포함하는 외부 DNA 구축물로 형질전환된 재조합 마렉병 바이러스 (MDV), 균주 CVI988 을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 안전한 바이러스제는 상당한 정도의 병원성을 야기하지 않으면서 닭에서 맹독성 MDV 유발에 대항하는 고도의 보호성 면역 반응을 도출한다. 닭에서 사용하기 위해 적합한 제형의 백신에는 유효한 면역화 투여량의 상기 신규 바이러스제가, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함된다.

Description

개질된 마렉병 바이러스, 및 이로부터 제조된 백신 {MODIFIED MAREK'S DISEASE VIRUS, AND VACCINES MADE THEREFROM}
인용참조
본 출원은 2012 년 3 월 22 일에 출원되고 그 전체가 본원에 참조로서 인용된, 미국 가특허 출원 번호 61/614,142 의 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 바이러스 백신 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 마렉병 바이러스에 의한 감염에 대항하여 닭을 보호하고, 기존의 백신에 비해 개선된 안정성 및 효율을 갖는 신규 백신에 관한 것이다.
닭의 매우 유행성이고 중요한 림프세포증식 질환인 마렉병 (Marek's Disease: MD) 은 약화된 또는 자연적으로 독성이 없는 MD-관련 헤르페스바이러스로 이루어지는 생 바이러스 백신에 의해 시판 닭에서 통제된다. 백신화 프로그램이 전반적으로 효과적인 것으로 고려되고 있지만, 가금류 산업은 MD 로 인한 손실을 지속적으로 경험한다. MD 바이러스가 시간이 지남에 따라 더욱 맹독성이 되는 경향과 (예를 들어, 더욱 맹독성인 형태로의 복귀에 의해) 가금류 산업에 닥치게 되는 경제적인 압력을 받으면서, 불리한 부작용 (예를 들어, 흉선 위축) 을 야기하지 않으면서 매우 맹독성인 필드 균주에의 초기 유발 초기 직면시 양호하게 보호할 안전하고 더욱 효과적인 제품을 개발하려는 강한 의욕이 남아 있다.
닭에서 발견되는 MD 바이러스에는 3 가지 구분되는 혈청형이 있다: (1) 혈청형 1, 고- 및 저-독성 MD 바이러스 및 이들의 약화된 변이체를 포함하는 질환의 원인이 되는 발암 형태; (2) 혈청형 2, 비-발암 MD 바이러스; 및 (3) 혈청형 3, 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT). 초기 MD 백신은 Witter et al. [Am. J. vet. Res.31:525-538 (1970)] 및 Okazaki et al. [U.S. Patent No.3,642,574] 에 보고된 바와 같이 칠면조로부터 기원적으로 단리된 혈청형 3 바이러스로 이루어진다. 이의 발암성 결핍, 자가-제한 감염, 생체 내 및 시험관 내 양호한 복제, 무-세포 및 세포-연관 제제로의 이용능, 및 높은 보호 효능이 HVT 를 전세계적으로 WID 백신에 대한 표준으로서 성립되도록 했다. HVT 의 통상 사용되는 균주는 FC126 이다.
자연적으로 독성이 없는 SB-1 균주로부터 제조된 백신 [Schat et al., J. Natl. Cancer inst.60:1075-1082 (1978) 및 미국 특허 번호 4,160,0241, 혈청형 2 MD 바이러스의 단리물] 이 1984 년부터 미국에서 허가를 받았다. SB-1 균주는 고도로 맹독성인 MDV 균주에 대항하여 보호력이 약하다. 이것은 통상 2가 백신으로서 HVT 와 조합되어 사용되는데, 2 가지 바이러스가 함께 하나가 단독으로 사용될 때보다 큰 보호를 산출하기 때문이다 [Schat et al., Avian Pathol. 11:593-606 (1982); Witter, Avian Pathol. 11:49-62 (1982), 이의 내용은 본원에 참조로서 인용됨]. 상기 현상은 "보호 시너지효과" 라고 불린다. SB-1 + HVT 2가 백신은 현재 MD 백신에 대해 미국 시장의 50% 초과를 차지하고, 이용가능한 다양한 MD 제품의 가장 효과적인 것 중 하나로 고려된다. 그러나, 이의 사용에도 불구하고 산발적인 손실이 발생한다.
균주 CVI988 클론 C (CVI988/C) 로부터 제조된 또다른 MD 백신은 미국에서 시판용으로 허가를 받았다. 상기 백신은 조직 배양 내 연속 계대에 의해 약화된 약한 독성의 혈청형 1 MD 바이러스로부터 유래되었고 De Boer et al. [Avian Dis. 30:276-283 (1986)] 에 의해 보고되었다. CVI988/C/R6 으로서 확인된, CVI988/C 의 추가 계대 유도체는 또한 De Boer et al. [Advances in Marek's Disease Research, pp.405-4 3 (1988)] 에 의해 기재되었다. 더욱 최근에, CVl988/Rispens 로 지칭된 본래의 저-계대 균주 (이것은 수 년동안 다른 국가에서 상용되었음) 는 Witter et al. [4th Intl. Symp. Marek's Disease, pp. 315-319 (1992)] 에 의해 여러 가지 매우 맹독성인 MD 바이러스 균주에 의한 유발에 대해 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다.
매우 맹독성인 혈청형 1 MD 필드 단리물인 Md11 로부터 유래된 실험 백신은 Witter, supra 에 의해 보고되었다. Md11 은 조직 배양에서 75 회 연속 계대에 의해 약화되었고, 산출 백신을 Md11/75C 로 지정하였다. 상기 백신은 Md5 및 시험된 대부분의 기타 고도로 맹독성인 MD 바이러스에 의한 유발에 대해 양호한 보호를 제공하는 것으로 보여졌으나; HVT 및 SB-1 백신에 의해 효과적으로 보호된 프로토유형 MD 바이러스 JM/102W 균주에 의한 유발에 대해서는 거의 효과가 없었다. 게다가, 이의 효능은 HVT 항체를 가진 병아리에서는 일관적으로 낮았다.
미국 특허 번호 4,895,717 (Witter) 에는 Md11/75C/R2 로서 불리는 Mdn/75C 의 복귀 유도체가 기재되어 있다. Md11/75C/R2 는 여러 가지 다른 1가 백신보다 우수하다는 것이 제시되었고 2가 (HVT + SB-1) 백신과 동등하였다 [Witter, Avian Dis. 31:752-765 (1987)]. 그러나, 혈청형 1 바이러스의 고유의 병원성 및 더 큰 병원성으로 복귀하려는 약화된 균주의 잠재력 [Witter et al., Avian Pathol. 13:75-92 (1984)] 이 이러한 제품의 허가를 고려하게 되는 요인이다. Md11/75C/R2/23 (또는 R2/23) 으로 지정된, Mdn/75C/R2 균주의 추가 계대로부터 유래된 클론은 Witter et al. [Avian Dis., 35:877-891 (1991)] 에 의해 그의 잔류 병원성 없이 모체 균주의 높은 보호적 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Witter 는 또한 미국 특허 번호 4,895,718 (이의 내용은 본원에 참조로서 인용됨) 에서, 비병원성 혈청형 2 필드 단리물인 301 B/1 로부터 유도된 또다른 MD 백신을 기재하고 있으며, 균주 301 B/1 은 SB-1 에 비해 우수한 복제 능력 뿐 아니라, 바이러스에 대한 유발에 대항하는 더 큰 보호성을 가지고 있다.
그 게놈의 짧은 반복 (repeat short: RS) 영역 내에 안정하게 통합된 망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복을 가진, RM1 로서 언급되는 재조합 마렉병 바이러스가 또한 기재되어 있다. 상기 균주는 병원성 혈청형 1 마렉병 바이러스 균주 JM 으로부터 USDA-ARS-ADOL 에서 발생되었다 [Witter et al., 1997, Avian Dis., 41:407-421, 및 Jones et al., 1996, J. Virology, 70(4):2460-2467i. 그러나, RM1 균주가 CVI988 와 유사한 또는 그보다 우수한 보호 수준을 제공하는 것으로 제시된 반면, 이것은 또한 잔류 병원성과 연관되어, 처리된 새에서 흉선 위축을 야기하였다.
그러므로, 기존 HVT, SB-1, CVI988, CVI988/C, Md11/75C, Md11/75C/R2 및 301 B/1 이 모두 특정 MD 바이러스에 대항하는 면역 반응을 도출하기는 하지만, 상기 백신 중 어느 것도 모든 닭에서 모든 MD 유발 바이러스에 대항하여 최적으로 보호하지 않는다. 게다가, 상기 백신은 MD 바이러스의 더욱 최근에 단리된 매우 맹독성인 균주 중 일부에 대항하여 감소된 효능을 나타냈다. 향후 MD 의 임의의 대규모 발발을 피하기 위해, MD 바이러스의 고도로 맹독성인 균주에 대해 개선된 효능을 갖는 보다 안전한 백신을 개발하려는 필요성이 존재한다.
본 발명은, 부분적으로, 출원 번호 USSN 10/623,891 (공개 번호 US2005/0019348A1, Reddy et al.) (이의 내용 뿐 아니라 출원인의 전체 기소 이력 모두가 본원에 참조로서 그 내용이 인용됨) 에 본래 기재된 마렉병 바이러스 (Marek's Disease Viruses: MDV) 를 포함하는 백신의 제조 및 용도에 기초한다. 구체적으로는, 본 발명은 CVRM2 "바이러스" (외부 DNA 구축물로 형질전환된 MDV 균주 "CVI988"; 예를 들어, Reddy et al. 의 문헌 표 1 에 기재됨) 가 사실은 클론이 구분되는, 단일 재조합 약화된 마렉병 바이러스 (MDV) 가 아니라는 놀랍고 예상치 못한 발견으로부터 출발한다. 대신, 출원인은 CVRM2 가 재조합 및 모체 MDV 의 이종 집단이었음을 측정하였고, 이들이 단리하고 이어서 CVRM2 의 순수 클론 주 (이하 본원에서 "RN1250" 으로서 언급됨) 를 조류에 투여하였을 때, 당업자가 Reddy et al 의 문헌을 판독 시 예상하였던 것을 초월하는 안전하고 효과적인 결과를 수득하였다.
상기 발견에 따르면, 본 발명의 목적은 닭을 비롯한 조류에서 MD 에 대항하는 신규한, 고도로 보호성인 백신을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 현재 통상의 용도에서 상기 백신보다 마렉병 바이러스의 고도로 맹독성인 균주에 대항하여 큰 보호를 제공하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 닭, 특히 육계 및 산란계의 생육성과 생산성을 개선하고, 마렉병에 의해 야기되는 가금류 산업에서의 경제적 손실을 감소시키는 것이다.
상기 및 다른 구현예가 하기 상세한 설명에 기재되고, 이로부터 명백해지며, 이에 의해 포함된다.
도 1 은 역위 반복 (IRS), 긴 말단 반복 (TRL), 긴 내부 반복 (IRL), 및 독특한 짧은 영역 (US) 이 측면에 위치한 독특한 긴 (UL) 영역을 함유하고, 2 개의 역위 반복, 짧은 내부 반복 (IRS) 및 짧은 말단 반복 (TRS) 이 측면에 위치한, MDV 게놈의 도식적 구조를 나타낸다. 또한 제시되는 것은 MDV 의 고도로 맹독성인 균주로부터의 감염성 바이러스를 구제하기 위해 생성되는 중복 코스미드 클론의 도식적 대표이다;
도 2 는 CVRM 백신을 생성하는데 사용된 B40-Pac 코스미드의 생성을 묘사하며;
도 3 은 재조합 MDV 의 PCR-기반 진단을 예증하며; CVRM2 가 클론성이 아니라, 사실상 재조합 및 모체 MDV 의 이중 집단이었다는 것을 나타내는, PCR 프라이머, 예상되는 생성물 크기, 및 아가로오스 겔 이미지를 제시한다. 라인: 1) 래더; 2) 음성; 3) Rispens; 4) GA 22; 5) Rismavac; 6) RB1B; 7) RN1250; 8) 양성 (본래 혼합된 집단);
도 4 는 RN1250 MSV, RN1250 x+5, 및 BP5 의 PCR 확인을 나타낸다. 라인: 주형 없음 (1), RN1250 MSV (2), RN1250 x+5 (3), RN1250 BP5 (4). 모든 프라이머 쌍을 이용한 PCR 반응은 예상된 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 산출하였고, 그러므로 RN1250 MSV, RN1250 x+5, 및 BP5 단리물 중에서 모체 Rispens 바이러스의 존재에 대한 증거가 없었다.
정의
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포- 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 전개이다. 통상, "면역학적 반응" 에는 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원(들) 에게 특이적으로 대항하는, 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성이라는 효과 중 하나 이상이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 것이고/거나 질환의 임상적 심각성이 감소되는 식의, 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 보다 낮은 바이러스 적정 농도에 의해 증명될 것이다.
"동물" 은 포유류, 새 등을 의미한다. 동물 또는 숙주에는 포유류 및 인간이 포함된다. 동물은, 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 흰담비, 물개 및 생선으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수형 관사에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 "및" 이 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서, 특히 청구항 및/또는 단락에서, "~ 을 포함한다", "~ 이 포함되는", "~ 을 포함함" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "~ 에 포함된다", "~ 에 포함되는", "~ 에 포함됨" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
클로닝. (a) 단일 개체로부터의 유전적 물질, (b) 하나의 유전자 또는 유전자 분절을 함유하는 벡터, 또는 (c) 하나의 그러한 유전자 또는 유전자 분절을 함유하는 단일 유기체의 선별 및 번식.
클로닝 벡터. 서열이 미리 결정된 방식으로 절단될 수 있는 하나의 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 특징으로 하는, 숙주 세포에서 복제할 수 있고, 형질전환된 세포의 확인에 사용하기 적합한 임의의 마커 (예를 들어, 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성) 를 함유할 수 있는, 플라스미드, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 인공 염색체 (박테리아 또는 효모), 또는 핵산 서열. 클로닝 벡터는 이것이 발현 벡터로서 작동하게 하는데 필요한 특징을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다.
발현. 폴리펩티드를 생성하기 위해 구조적 유전자에 의해 행해지는 과정. 발현은 DNA 의 전사, 초기 RNA 전사물의 전사후 개질, 및 RNA 의 번역을 필요로 한다.
발현 카세트. 전사하고자 하는 벡터 내 핵산 서열, 및 전사를 지정하는 프로모터. 발현 카세트는 하나 이상의 관심의 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 비-관련 DNA 서열을 함유할 수 있다.
발현 조절 서열. 발현 조절 서열은 전사 또는 번역의 조절에 임의의 방식으로 포함되는 DNA 서열이고, 프로모터를 포함해야만 한다. 적합한 발현 조절 서열 및 이들의 제조 및 사용 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
발현 벡터. 이종 DNA 서열의 삽입을 위해 서열이 미리 결정된 방식으로 절단될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 특징으로 하는, 숙주 세포에서 복제할 수 있는, 플라스미드, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 인공 염색체 (박테리아 또는 효모), 또는 핵산 서열과 같은 레플리콘. 발현 벡터는 이종 DNA 서열의 삽입을 위해 서열이 절단되는 부위의 업스트림에 위치된 프로모터를 가지며, 상기 인지 부위는 프로모터가 이종 DNA 서열과 작동가능하게 연관될 수 있도록 선택된다. 이종 DNA 서열은 프로모터 서열에 결합하는 RNA 폴리머라아제가 코딩 서열을 mRNA 로 전사하고 이것이 이후 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역되는 경우, 세포 내에서 프로모터와 "작동가능하게 연결된다".
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 혼성체인 RNA 또는 DNA 를 말한다. 용어는 또한 RNA/DNA 혼성체를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 분절, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보솜, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당 및 연결기, 예컨대 플루오로리보오스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 공액에 의한 것과 같은 중합 후에, 표지화 성분으로 추가로 개질될 수 있다. 본 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡, 하나 이상의 자연 발생적 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지화 성분, 기타 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키는 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성으로부터 수득될 수 있거나 또는 미생물로부터 유도될 수 있다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 및/또는 발현에 필요한 조절 서열이 포함된다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능적 RNA 를 발현하는, 또는 조절 서열을 포함하는 특정 단백질을 코드화하는 핵산 분절을 말한다.
"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 세포기관) 은 성분이 자연 발생하는 유기체의 세포에서 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리된 또는 정제되어지는 성분, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체-외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 세포기관을 말한다. "단리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 용어에는 또한 재조합 기술 뿐 아니라 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 및 단백질이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된" 은 절대적인 정제를 필요로 하지는 않으며, 그보다는, 이것은 상대적인 용어로서 의도된다. 그러므로, 예를 들어, 부분적으로 정제된 폴리펩티드 제제는 폴리펩티드가 자연 환경에 있는 것보다 폴리펩티드가 더욱 풍부한 제제이다. 이것은 폴리펩티드가 세포 성분으로부터 분리된 것이다. "실질적으로 정제된" 은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 그 이상의 세포 성분 또는 물질이 제거되는 것을 의도한다. 마찬가지로, 폴리펩티드는 부분적으로 정제될 수 있다. "부분적으로 정제된" 은 세포 성분 또는 물질의 60% 미만이 제거된 것을 의도한다. 동일한 것이 폴리뉴클레오티드에 적용된다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 수단 중 임의의 것에 의해 정제될 수 있다.
변이체에는 대립형질 변이체가 포함된다. "대립형질 변이체" 라는 용어는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 일으키고, 자연적인 집단 (예를 들어, 바이러스 종 또는 변종) 내에 존재하는 다형성을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 이러한 자연적인 대립형질 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 내 1-5% 변화를 산출할 수 있다. 대립형질 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열을 서열분석하여 확인될 수 있으며, 이것은 상기 종에서 동일한 유전자 유전적 좌를 확인하기 위한 혼성화 탐침의 사용에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 자연적인 대립형질 변이의 결과이고, 관심이 있는 경우 유전자의 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 및 모든 이러한 핵산 변이 및 수득되는 아미노산 다형성 또는 변이가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "유도체" 또는 "변이체" 라는 용어는 (1) 상응하는 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드와 비교하였을 때 실질적으로 동등한 기능을 갖도록 하는 또는 (2) 폴리펩티드에 대해 발생된 항체가 야생형 폴리펩티드와 면역반응성이도록 하는 1 이상의 보존적 아미노산 변이 또는 다른 미미한 개질을 갖는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 말한다. 이러한 개질은 부위-지정 돌연변이생성에 의한 바와 같이 의도적으로 이루어질 수 있고, 또는 자발적으로 이루어질 수 있다. "변이체" 라는 용어는 폴리펩티드가 본원에 기재된 면역 반응을 산출하는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환이 추가로 고려된다.
용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 상기 기재된 바와 같이 성질이 보존성일 것이다.
"벡터" 는 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포로 전달하고자 하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스를 말한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 치료 목적을 위해 관심의 서열을 포함할 수 있고, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상에서 복제가 가능해야할 필요는 없다. 용어에는 클로닝 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다.
"재조합" 이라는 용어는 자연에서 발견되지 않는 배치로의 또다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나 자연에서 발생하지 않는 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"이종" 이라는 용어는 비교되어 지는 실재의 나머지와 일반적으로 구별되는 실재로부터 유래하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전학 유전자조작 기술에 의해 상이한 근원으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입될 수 있고, 그러므로 이종 폴리뉴클레오티드이다. 고유의 코딩 서열로부터 제거되고 고유의 서열 이외의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 부가적인 서열, 예컨대 동일한 전사 단위 내의 부가적인 코딩 서열, 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 5'UTR, 3'UTR, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위, 동일 또는 상이한 프로모터의 조절 하의 부가적인 전사 단위, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동 재조합, 및 형질전환을 가능하게 하는 서열, 및 본 발명의 구현예를 제공하는데 바람직할 수 있는 임의의 이러한 구축물을 포함할 수 있다.
작동적으로 코딩하는 또는 연관됨. 작동적으로 코딩하는 또는 연관됨 각각은 프로모터와 핵산 서열 사이의 기능적인 연결을 말하며, 프로모터는 DNA 서열에 상응하는 RNA 의 전사를 개시한다. 이종 DNA 서열은 프로모터 서열에 결합하는 RNA 폴리머라아제가 코딩 서열을 mRNA 로 전사하고 이것이 이후 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역되는 경우, 세포 내에서 프로모터와 "작동가능하게 연결된다".
프로모터. RNA 폴리머라아제가 결합하고 전사를 개시할 수 있는 부위를 정의하는 큰 DNA 서열 내에 있는 DNA 서열. 프로모터는 임의의 원거리 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 동종, 즉, 원하는 핵산의 발현을 자연 발생적으로 지정하는 것, 또는 이종, 즉, 원하는 핵산 이외의 유전자로부터 유래된 핵산의 발현을 자연 발생적으로 지정하는 것일 수 있다. 프로모터는 구성성이거나 유도성일 수 있다.
백신. 백신은 본원에서 넓은 범위로 백신을 접종받은 동물에서 보호성 면역 반응을 촉진할 수 있는 투여가능한 형태의 임의의 유형의 생물학제를 말하는 것으로 정의된다.
구현예
본 발명은 상동 재조합을 통해, 망상내피증 바이러스 (REV) 로부터 유래된 긴 말단 반복 (LTR) 이 삽입된 재조합 마렉병 바이러스 (MDV) 를 제공한다. 상기 조합은 조류에서 상당한 정도의 병원성을 야기하지 않으면서 조류에서 마렉병 바이러스에 대한 면역 반응을 도출하는데 효과적이다. 본원에서 사용되는, "상당한 정도의 병원성을 야기하지 않으면서" 라는 구절은 접종된/유발된 조류에서, 심지어 고도로 감염되기 쉬운 조류에서도 육안으로 관찰가능한 전체적인 MD-특이적 병변이 없는 것으로 정의된다. 특정 구현예에서, 조류는 닭이다.
CVRM-2 는 본원에 기재되어 있고 본 출원의 도 1 및 2 에 요약되어 있는 바와 같은 Reddy et al. 의 문헌의 저자에 의해 생성되었다. CVRM2 샘플을 수령하고, 즉시 본 출원인은 바이러스 단리물의 확인/온전성을 확인하기 위해 주의 깊은 PCR-기반 분석을 수행하였다 (도 3 은 증폭된 생성물의 아가로오스 겔 해상 사진을 나타낸다). 본 출원인은 놀랍게도 샘플이 클론성 단리물이 아니라, 사실상 재조합 CVRM2 및 모체 MDV 균주의 조합 집단이었다는 것을 발견했다. 이후 본 출원인은 오직 CVRM2 만으로 (그리고 모체 MDV Rispens 균주는 없는) 이루어지는 순수한 단리물을 수득하기 위해 필요한 플라크 정제를 수행하였다. 명확성을 위해, 신규한, 클론성 단리물을 본 명세서 전반에 걸쳐 "RN1250" 으로서 언급한다.
본 발명의 재조합 MDV 는 MDV 혈청형 1 균주 CVI988, 또는 임의의 이의 클론 또는 연속 계대된 균주 (이들은 본원에서 균주 "CVI988/X" 로서 집합적으로 언급됨) 의 개질에 의해 생성될 수 있다. 그러므로, 본원에 기재된 바와 같이 CVI988/X 는, 이전에 기재된 저-계대 균주, CVI988/Rispens (Rispens et al., 1972, Avian Dis., 16:106-125 및 126-138), 균주 CVI988 클론 C (CVI988/C) (De Boer, U.S. Patent No. 4,673,572, 및 De Boer et al., 1986, Avian Dis. 30:276-283), 및 CVI988/C/R6 (De Boer et al., 1988, Advances in Marek's Disease Research, pp. 405-413) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 공개문헌/특허의 각각의 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
구현예에서, 본 발명은 고유의 CVI988/X 서열의 일부를, 망상내피증 바이러스 (REV) 로부터의 긴 말단 반복 (LTR) 서열을 포함하는 외생 DNA 로 대체하여 생성된, 신규한, 재조합, 약화된 MDV 균주를 제공한다.
구현예에서, 균주 CVI988 의 재조합은 외생 LTR 의 공급원으로서 MDV 혈청형 1 균주 RM1 을 사용하여 수행되었다 (RM1 은 REV LTR 이 내부에 통합된 재조합 MDV 이다). 도 2 에 제시된 바와 같이, REV LTR 을 Pac 1 소화에 의해, 정제된 RM1 바이러스 DNA 로부터 절단하고, 마렉병 바이러스의 매우 맹독성인 균주, Md5 로부터 제조된 셔틀 벡터, B40 내로 삽입하였다. 산출된 재조합 벡터, B40-Pac 을, LTR 을 마렉병 바이러스 균주 CVI988 내로 삽입하는데 사용하였다. LTR 을 가진 재조합 MDV 를 생성하기 위해, MDV 균주 CVI988 의 정제된 바이러스 DNA 를 닭 또는 오리 배아 섬유아세포 (CEF 또는 DEF) 세포 내에 Not I-소화된 재조합 벡터와 함께 공동-트랜스펙션하였다. 게놈 내에 RM1 LTR 이 삽입된 재조합 바이러스는 모체 CVI988 균주보다 더욱 빠르게 복제되었다. 이론에 구애됨 없이, 상기 증가된 복제 속도는 망상내피증 바이러스 LTR 의, ICP4 유전자의 MDV 업스트림의 게놈 내로의 삽입의 결과인 것으로 여겨진다.
또다른 구현예에서, MDV CVI988/X 는 RM1 균주 이외의 공급원으로부터 단리된 망상내피증 바이러스 LTR 의 첨가를 통해 개질될 수 있다. 예를 들어, MDV 의 RM1 균주 내에 LTR 의 삽입 부위는 게놈의 IRL 과 IRS 사이에 있는 것으로 제시되었다 (Jones et al., 1996, Retroviral insertional activation in a herpesvirus: transcriptional activation of US genes by an integrated long terminal repeat in a MDV clone, J. Virology, 70(4):2460-2467). 이것은 마렉병 바이러스의 Md5 균주의 위치 152,745 에 대략 상응한다. 상기 영역은 혈청형 1 Md5 의 1,704 염기쌍 길이 EcoRI 절편 (뉴클레오티드 152, 198-153, 902) 내에 위치한다 (Tulman et al., 2000, The genome of a very virulent Marek's disease virus, J. Virology, 74d7):7980-7988). 상기 1,704 bp EcoRI 절편은 DraIII 제한 엔도뉴클레아제 부위가 결여된 플라스미드 벡터 내로 클로닝되고, MDV 게놈 내로 임의의 LTR 의 도입을 위한 전달 벡터로서 사용될 수 있다. 상기 EcoRX 절편은 RM1 내 LTR 위치의 10 bp 업스트림에 위치한 독특한 DraIII 제한 부위를 갖는다. LTR 삽입을 가진 재조합 MDV 를 생성하기 위해서, LTR 전달 벡터를 생성하기 위해, LTR 은 1,704 염기쌍 EcoRI 절편의 DraIII 부위 내로 삽입될 수 있고, 전달 벡터는 EcoRI 로 선형화되고, 페놀 및 클로로포름으로 추출되고 에탄올로 침전되어야만 한다. 배양 중의 허용가능한 세포 내로 임의의 혈청형 1 MDV 균주로부터의 DNA 와 함께 선형화된 전달 벡터의 공동-트랜스펙션은 상동 재조합에 의해 MDV 게놈 내로의 LTR 서열의 도입을 산출할 것이다.
Reddy et al., supra 에는, 산출 재조합 바이러스 (즉, 망상내피증 LTR 을 갖는 MDV) 가 "그의 상응하는 모체 MDV 균주보다 좀더 빠르게 성장해야만 하고, 그러므로 플라크 정제에 대한 필요가 없다" 라고 나타나 있다. 그러나, CVRM-2 샘플이 사실상 재조합 MDV 과 이의 상응하는 모체 MDV 의 조합이었다는 본 출원인의 예상치 못한 발견의 견지에서, 당업자는 해당 문헌에 의해 구성된 모든 재조합 MDV 를 플라크 정제하는 것이 강하게 권고된다. 이것은 바이러스에 의한 면역화가 후속 맹독성 MDV 유발에 대항하여 상당한 보호를 제공하는 데 실패하는 것을 나타내는 결과를 얻은 후 당업자가 잠재적으로 유용한 재조합 MDV 를 실수로 폐기하도록 북돋을 수 있기 때문에 특히 중요하다 (문헌 Reddy et al. 의 표 1 을 참조하면, CVRM-2 가 80% 미만의 보호를 제공하는 것으로 보인다).
또다른 구현예에서, RETV LTR 를 가진 재조합 MDV 는 침전된 CVRM-2 를 사용하여, 다른 CVI988/X 균주를 비롯한 임의의 MDV 로부터 제조될 수 있으며, 단, 바이러스가 RN1250 이고, RN1250 및 모체 MDV 균주의 조합은 아닌 것임을 확인하기 위해 CVRM-2 를 플라크 정제한다.
다양한 REV LTR 이 본원에서의 사용에 적합하다. 수 많은 적합한 망상내피증 바이러스 LTR 가 단리되고 기재되었으며, 제한 없이, 하기 문헌들에 의해 기재된 것들을 포함한다: Kost et al. (1993, Retrovirus insertion into herpesvirus: characterization of a Marek's disease virus harboring a solo LTR, Virology, 192:161-169), Ridgway (1992, REV LTR elements are efficient promoters in cells of various species and tissue origin, including human lymphoid cells, Gene, 121:213-218), Boerkoel and Kung [1992, Transcriptional interaction between retroviral long terminal repeats (LTRs): mechanism of 5' LTR suppression and 3' LTR promoter activation of c-myc in avian B-cell lymphomas, J. Virol., 66:4814-4823], Hippenmeyer and Krivi (1991, Gene expression from heterologous promoters in a replication -defective avian retrovirus vector in quail cells, Poult. Sci., 70:982-92), Ridgway et al. (1989, Transient expression analysis of the reticuloendotheliosis virus long terminal repeat element, Nucleic Acids Res., 17:3199-3215), Embretson andTemin (1987, Transcription from a spleen necrosis virus 5' long terminal repeat is suppressed in mouse cells, J. Virol., 61:3454-3462), Notani and Sauerbier (1987, Sequence instability in the long terminal repeats of avian spleen necrosis virus and reticuloendotheliosis virus, J. Mol. Evol., 25:241-247), Robinson and Gagnon (1986, Patterns of proviral insertion and deletion in avian leukosis virus-induced lymphomas, J. Virol., 57:28-36), 및 Ridgway et al., (1985, In vitro transcription analysis of the viral promoter involved in c-myc activation in chicken B lymphomas: detection and mapping of two RNA initiation sites within the reticuloendotheliosis virus long terminal repeat, J. Virol., 54:161-170). 상기 언급된 공개문헌의 각각의 내용은 본원에 참조로서 인용되고, 또한, 수 많은 LTR 서열은 GenBank 및 기타 게놈 데이터베이스에서 이용가능하고 LTR 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 합성될 수 있다. PCR 증폭된 서열은 이후 상기 표시된 바와 같이 기재된 2 개의 전달 벡터 중 임의의 것 내로 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 REV LTR 핵산 서열, 또는 이들의 생물학적으로 기능성인 당량체는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "생물학적으로 기능성인 당량체" 라는 구절은 상기 언급된 망상내피증 바이러스 LTR 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 생물학적 활성/면역보호적 활성을 나타내는 핵산 서열을 나타낸다 (즉, CVI988 MDV 숙주 내로 기능적으로 작동가능한 방식으로 도입되는 경우, 이들은 닭에서 상당한 정도의 병원성을 야기하지 않으면서 보호성 면역 반응을 도출한다).
예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열은 프로모터 또는 인핸서 활성을 보유하는 생물학적으로 기능적으로 당량인 핵산을 산출하기 위해 염기 치환, 삽입, 부가 또는 결실에 의해 변경될 수 있다.
본원에 고려되는 게놈 DNAs 또는 cDNAs (RNA 로부터 RT-PCR 에 의해 수득되는 경우) 의 변이체는 본원에 기재된 자연 발생적 REV LTR 에 대해 75% 초과의 상동성, 바람직하게는 85% 초과의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 초과의 상동성을 소유해야만 한다.
본 발명의 재조합 마렉병 바이러스의 백신은 무-세포 제제로서, 또는 바람직한 구현예에서, 세포-연관 제제로서 제조될 수 있다. 세포-연관 백신은 Witter (US4,895,718, 이의 내용은 본원에 참조로서 인용됨) 에 의해 기재되는 바와 같은 닭 배아 섬유아세포와 같은, 적합한 성장 배지 내의 생 바이러스제의 시험관 내 배양물로부터 직접 제조될 수 있다. 대안적으로는, 무-세포 바이러스 접종물을 제조하기 위해, 감염된 숙주 조직 또는 세포 배양물로부터의 세포를 초음파분쇄하고 그렇지 않으면 이전에 기재된 바와 같이 파괴한다. 세포 잔해는 원심분리에 의해 제거하고, 원심분리액을 접종물로서 회수한다. 게다가, 바람직한 백신은 생균 바이러스이지만, 또한 백신은 치사된 바이러스로부터 또는 바이러스로부터 분리된 면역원성 성분으로부터 제조될 수 있다고 고려되며, 단지 이러한 가공이 상당히 큰 비용을 발생시킬 것이긴 하다. 예를 들어, 서브유닛 백신은 치사된 바이러스로부터 면역원성 특성을 갖는 것으로 확인된 하나 이상의 정제된 바이러스 단백질을 분리함으로써 제조될 수 있다.
바이러스제는 생리학적 식염수 또는 조직 배양 배지와 같은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 효과적인 면역화 투여량의 제형에 의해 투여하기 위해 제조된다. "효과적인 면역화 투여량" 이라는 표현은 마렉병 바이러스의 맹독성 균주에 의한 유발에 대항하여 닭에서 면역력을 유도할 양인 것으로 정의되며, 면역력은 집단에 대한 보호 수준이 비-백신화된 대조군에 비해 유의하게 높은 경우 (80% 이상의 신뢰 수준에서 측정됨, 바람직하게는 95% 의 신뢰 수준에서 측정됨), 닭의 집단에서 유도된 것으로 고려된다. 보호 수준의 하나의 측정은 보호 지수 (Pi) 인데, 이것은 비-백신화된, MDV 유발된 대조군에서의 MD 의 발병에서 백신화된, MDV 유발된 군에서의 MD 의 발병을 빼고, 그 차이를 비-백신화된, MDV 유발된 대조군에서의 마렉병의 백분율로 나눈 후, 결과에 100 을 곱하여 계산된다.
전형적으로, 백신은 약 200 PFU (플라크-형성 유닛) 이상의 바이러스, 바람직하게는 약 2000 내지 5000 PFU 의 바이러스를 함유할 것이다. 백신은 닭이 면역능력을 획득한 후 (이것은 약 인큐베이션 18일째 되는 날임 (부화전 3 일)) 임의의 시간에 효과적으로 투여될 수 있으며; 그러나 보통 부화후 24-48 시간 내에 접종에 의해 투여된다. 대안적으로는, 재조합 바이러스 DNA 는 Tischer et al. (2002, J. Gen. Virology, 83:2367-2376, 이의 내용은 본원에 참조로서 인용됨) 에 의해 기재된 바와 같은 DNA 백신으로서 투여될 수 있다.
당업계에 공지된 적합한 면역보조제가 또한 백신 제형에 포함될 수 있다. 많은 경우, 백신 효능은 본 발명의 재조합 마렉병 바이러스를 다른 바이러스제와 함께 2가 또는 다가 백신으로 조합함으로써 향상될 수 있다.
또다른 구현예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀젼일 수 있다. 또다른 구현예에서, 유중수 에멀젼은 수/유/수 (W/O/W) 삼중 에멀젼일 수 있다. 또다른 구현예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 수중유 에멀젼일 수 있다.
사용 방법 및 제조 물품
본 발명은 하기 방법 구현예를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조류를 백신화하는 방법은 마렉병 바이러스 (MDV) 를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 하나 이상의 공통의 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 프라임 투여 및 하나 이상의 부스트 투여로 구성되는 프라임-부스트 섭생이 사용될 수 있다. 전형적으로는 프라임 투여에 사용된 면역학적 조성물 또는 백신은 부스트로서 사용되는 것과 사실상 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 프라임 투여 및 부스트로서 사용될 수 있다는 것을 유념한다. 상기 투여 프로토콜을 "프라임-부스트" 라고 부른다.
프라임-부스트 섭생은 하나 이상의 공통의 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 또는 절편을 사용하는 하나 이상의 프라임 투여 및 하나 이상의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용되는 백신은 이후의 부스트 백신으로서 사용되는 것과 특성이 상이할 수 있다. 프라임 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게는, 부스트 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.
조성물의 투여 부피는 일반적으로 약 0.1 내지 약 2.0 ml, 약 0.1 내지 약 1.0 ml, 및 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml 이다.
당업자는 본원의 설명이 예로 제공되지만 본 발명이 이에 제한되는 것이 아니라는 것으로 이해해야만 한다. 본원의 설명 및 당업계의 지식으로부터, 당업자는 임의의 과도한 실험 없이, 각각의 면역화 프로토콜에 사용되어지는 투여 횟수, 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 제조된 치료학적 조성물의 유효량을 동물에게 1 회 이상 투여하는 것을 고려한다. 동물은 수컷, 암컷, 임신한 암컷 및 새끼일 수 있다. 본 투여는 근육내 (IM), 피내 (ID) 또는 피하 (SC) 주사 또는 비강내, 알 내, 또는 경구 투여를 통한, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 경로를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물은 또한 바늘이 없는 장치 (예를 들어 Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, USA), Vetjet 또는 Vitajet 장치 (Bioject, Oregon, USA)) 에 의해 투여될 수 있다. 플라스미드 조성물을 투여하기 위한 또다른 접근법은 전기천공법을 사용하는 것이다 (예를 들어, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT Application No. WO99/01158 참조). 또다른 구현예에서, 치료 조성물은 유전자 총 또는 금 입자 포격에 의해 동물에게 전달된다. 유리한 구현예에서, 동물은 개, 흰담비 또는 물개이다.
본 발명의 또다른 구현예는 재조합 MDV 면역학적 조성물 또는 백신 및 동물에서 면역 반응을 도출하기 위해 유효량으로 전달 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는, 동물에서 MDV 에 대항하는 면역학적 또는 보호적 반응을 도출하거나 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 재조합 MDV 조성물 또는 백신 중 임의의 하나 및 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있는, 면역 반응을 도출하거나 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 사이토카인에는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구/대식구 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 α (IFNα), 인터페론 β (IFNβ), 인터페론 γ, (IFNγ), 인터류킨-1α (IL-1α), 인터류킨-1β (IL-1β), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-8 (IL-8), 인터류킨-9 (IL-9), 인터류킨-10 (IL-10), 인터류킨-11 (IL-11), 인터류킨-12 (IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 종양 괴사 인자 β (TNFβ), 및 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 사이토카인이 본 발명의 면역학적 또는 백신 조성물과 공동으로 투여되고/거나 연속으로 투여될 수 있다는 것으로 이해된다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명의 백신은 또한 생체 내에서 적합한 사이토카인, 예를 들어, 백신화하고자 하는 또는 면역학적 반응을 도출하고자 하는 상기 숙주와 부합된 사이토카인 (예를 들어, 조류에게 투여하고자 하는 제제를 위한 조류 사이토카인) 을 발현하는 외생 핵산 분자를 함유할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
[1] 조류 동물에게 망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 서열을 포함하는 외부 DNA 구축물로 안정적으로 형질전환된 재조합 마렉병 바이러스를 포함하는 바이러스제를 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하여, 보호성 면역 반응을 도출하는 것을 포함하는, 조류 동물에서의 마렉병 바이러스 (Marek's Disease Viruses: MDV) 에 대항하는 안전한 및 보호성 면역 반응의 도출 방법.
[2] [1] 에 있어서, 조성물이 수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 방법.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, MDV 가 CVI988/X MDV 인 방법.
[4] [3] 에 있어서, CVI988/X MDV 가 CVI988 인 방법.
[5] [1] 또는 [2] 에 있어서, 조류 동물이 닭인 방법.
[6] [1] 또는 [2] 에 있어서, LTR 가 SEQ ID NO:2 에 언급된 바와 같은 방법.
[7] [1] 또는 [2] 에 있어서, LTR 서열이 접근 번호 PTA-4945 로 ATCC 에 기탁된 균주의 모든 확인된 특성을 갖는 MDV 로부터의 Pac I 절단된-DNA 분절을 포함하는 방법.
[8] [1] 또는 [2] 에 있어서, LTR 서열이 상기 MDV 의 ICP4 유전자의 5' 에 삽입된 방법.
[9] [1] 또는 [2] 에 있어서, 바이러스제가 상기 조류에서 상당한 정도의 병원성을 야기하지 않으면서 MDV 에 대항하여 조류에서 면역 반응을 도출하는데 유효한 방법.
[10] [1] 또는 [2] 에 있어서, 바이러스제가 세포-연관성인 방법.
[11] MDV 균주 CVI988 을 망상내피증 바이러스의 LTR 서열을 포함하는 외부 DNA 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 마렉병에 대항하여 조류를 보호하기에 효과적인 바이러스제의 제조 방법.
[12] 망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 서열을 포함하는, 외부 DNA 구축물로 안정하게 형질전환된 마렉병 바이러스 (MDV).
[13] [12] 에 있어서, SEQ ID NO:2 에 언급된 바와 같은 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 MDV.
[14] [13] 에 있어서, 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2 에 언급된 바와 같은 서열을 갖는 MDV.
[15] [12] 내지 [14] 중 어느 하나의 MDV 를 포함하는 면역학적 조성물.
[16] [15] 에 있어서, MDV 가 클론 바이러스이고, 모체 및 재조합 바이러스의 혼합 집단이 아닌 조성물.
[17] [16] 에 있어서, 백신 조성물인 조성물.
[18] [17] 에 있어서, 85% 이상의 보호율을 제공하는 조성물.
[19] [18] 에 있어서, 90% 이상의 보호율을 제공하는 조성물.
[20] [19] 에 있어서, 95% 이상의 보호율을 제공하는 조성물.
[21] [13] 또는 [14] 의 MDV 로 안정하게 형질전환된 단리된 세포.
[22] [15] 에 있어서, 세포가 닭 또는 오리 배아 섬유아세포 (CEF, DEF) 세포인 단리된 세포.
본 발명은 이제 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 기재될 것이다.
실시예 1 - 마렉병 바이러스 (MDV), SR-1 균주, CVRM-2 RN1250 및 RMI CN32399, 및 Rispens CN32553 의 효능
본 발명의 중요한 양상은 본 실시예에 요약된 연구를 완료한 이후, 본 출원인은 후에 CVRM-2 MDV 가 클론성 재조합 MDV 가 아니었고, 사실상 RN1250 재조합 MDV 및 모체 Rispens MDV 의 혼합된 집단이었다는 것을 확인하였다는 것이다. 그러므로, 이제 본 출원인이 안정한, 클론성 RN1250 MDV 를 생산하였고, 백신으로서의 상기 바이러스의 강한 효능은 차후 실시예에서 입증되며, 당업자는 본 예비 연구에서 CVRM-2 MDV 에 의해 명백하게 제공되는 넓은 (및 용납할 수 없는) 범위의 보호 (37-86%) 에 의해 놀라지 않을 것이다.
목적. MDV T. King 에 의한 초기 유발을 사용하여 SPF 닭에서, 3 가지 실험적 MDV SR-1 및 Rispens 균주를 평가하고 시판 백신 제품 (Rismavac®-Intervet, Inc.) 과 비교하기 위함.
물질/방법. 150 마리의 1 일령 SPF 병아리 (SPAFAS 무리 W-42) 를 각각 30 마리씩 5 개의 상이한 그룹으로 무작위로 할당하였다 (그룹 1-5). 이후 각각의 처리군을 단리 단위로 무작위로 할당하였다. 비-백신화된, 유발된 대조군으로서 사용된 그룹 1 의 병아리를 먼저 음압 단리 유닛에, 유닛 당 15 마리씩 배치하였다. 이후 각각의 나머지 그룹 (그룹 2-5) 을 Intervet Rispens Rismavac®; MDV SR-1 RMI CN32399 P4; MDV SR-1 CVRM-2 RN1250 P4; 또는 MDV Rispens CN32553 P4 에 의해 새 마리 당 0.2 ml 로 피하 (SQ) 백신화하였다. 그룹 2-5 중의 SQ 백신화된 새를 또한 음압 단리 유닛에, 유닛 당 새 15 마리씩 배치하였다. 4 일 후 연구 제 4 일에, 그룹 1-5 중의 새를 1:500 희석된, MDV T. King 으로 개별적으로 유발시켰다 (프로토콜 02-085 02 January 03). 새를 마리 당 0.2 ml 로 복강내 (IP) 유발시켰다. 유발-후 49 일 동안 새를 관찰하였다. 연구 제 53 일 이전에 죽은 임의의 새는 부검하고, MDV 병변에 대해 검시하였다. 제 53 일에, 모든 나머지 새를 종결시키고, 부검하고, MDV 병변에 대해 검시하였다.
결과. 실험 MDV SR-1 및 Rispens 균주는 초기 MDV T. King 유발에 대항하여 37-86% 의 보호율을 제공하였다. Intervet's Rismavac® 는 83% 보호율을 제공하였다. 유발은 97% 의 MD 발병률을 보이는 비-백신화된, 유발된 대조군 새에서 입증되었다.
실시예 2 - Shedder 유발 모델을 사용하는 시판 육계에서의 MDV, SR-1, RN1250 백신의 효능
물질 & 방법: Harrison 가금류 무리 1-1 로부터 수득한 76 마리의 1 일령 시판 육계를 3 개의 상이한 콜로니 계사 내에 하기와 같이 4 개 그룹으로 무작위로 배분하였다: 그룹 1: 13 마리의 새; 그룹 2: 13 마리의 새; 그룹 3: 25 마리의 새; 및 그룹 4: 25 마리의 새 (하나의 계사를 2 개의 부분으로 나누어 우리 (pen) 1 및 우리 2 를 만들었다). 무작위화 후, 새들을 식별을 위해 목덜미 뒤에 밴드 표시를 한 다음, 새 당 0.2 ml 로 1:500 희석된, vvMDV T. King 유발에 의해 복강내 (IP) 접종하였다. 유발 후, 새들을 각각의 콜로니 계사 내에, 계사 당 25-26 마리로 배치하였다. 상기 새를 MDV 백신화 및 비-백신화, 접촉 대조군 새의 배치 전 14 일 동안 콜로니 계사에 남겨두었다. shedder 새의 배정 14 일 후, 304 마리의 1 일령 시판 육계를 다음과 같이 무작위화하였다: 백신접종군으로서 담당하기 위한 각각 75 마리의 새가 있는 2 개의 그룹 (그룹 3 및 4) 및 각각 38 마리 및 40 마리의 새가 있는 2 개의 그룹 (그룹 1 및 2); 또한, 25 마리의 새의 2 개의 그룹 및 13 마리의 새의 2 개의 그룹을 그룹 1-4 (그룹 1: 13 마리의 새; 그룹 2: 13 마리의 새; 그룹 3: 25 마리의 새; 및 그룹 4: 25 마리의 새) 에 대한 비-백신화, 접촉 대조군 새로서 담당하도록 사용하였다. 상기 접촉 대조군 새들을 식별을 위해 목덜미 뒤에 밴드 표시를 하고 콜로니 계사에 배치하였다. 백신접종군에는 피하 경로 (SQ) 경로 (새 마리 당 0.2 ml) 에 의해 다음과 같이 접종하였다: 그룹 1 을 RN1250 pre MSV, P6 (단리물 I) 으로 백신접종하였고; 그룹 2 를 RN1250 pre MSV, P7 (단리물 U) 로 백신접종하였고; 그룹 3 을 RN1250 pre MSV, P7 (단리물 F) 로 백신접종하였고; 그룹 4 를 Rismavac® serial 02760010, exp. 15 APR 2012 로 백신접종하였다. 접종 후, 백신접종군을 비-백신화, 접촉 대조군 새 및 shedder 를 이전에 배치했던 동일한 콜로니 계사에 배치시켰다. 부가적인 50 마리의 비-접종된 1 일령 시판 육계를 단리 유닛에 거주시키고, 후일에 접촉 대조군의 두번째 그룹으로서 담당하게 하기 위해 49 일 동안 유지시켰다. 모든 백신화된 새들을 8 일 이후 색상 코드, 숫자 밴드로 목덜미 뒤에 밴드 표시를 하였다. shedder 를 콜로니 계사에 50 일 동안 남겨두었고, 이후 모든 생존자를 종결시키고 부검하였다.
임상 질환 및 폐사율을 백신화-후 매일 49 일 동안 모니터링하였다. 죽은 임의의 접촉 대조군 새로부터의 비장을 바이러스 단리를 위해 수집하였다. 연구 제 53 일에, 접촉 대조군의 두번째 그룹으로서 담당하게 하기 위해 단리 유닛에 거주시켰던 40 마리의 비-접종된 시판 육계를 콜로니 계사에, 무작위화 스케쥴에 따라, 그룹 1 내지 4 로, 그룹 당 10 마리의 새로 배치시켰다. 상기 새들을 식별을 위해 배치 전에 숫자 밴드로 밴드 표시를 하였다. 폐사가 발생된 경우 바이러스 단리를 위해 상기 새들로부터의 비장을 또한 수집하였다. 남아있는 백신접종군 및 초기 비-백신화, 접촉 대조군 새를 연구 제 63 일에 49 일의 관찰 기간에 종결시키고 부검하였다. 새 마리 당 비장 및 2 개 이상의 우포를 바이러스 단리를 위해 10 개의 접촉 대조군으로부터 수집하였다. 샘플 새를 무작위화 스케쥴에 의해 결정하였다. 연구 제 83 일에, 연구 제 53 일에 그룹에 첨가되었던 남아있는 접촉 대조군 새 (두번째 그룹) 를 종결시켰다. 새 마리 당 비장 및 2 개 이상의 우포를 바이러스 단리를 위해 상기 접촉 대조군 새로부터 수집하였다.
표 1. 5 일령에 살아남은 새의 수
섭생 그룹 명칭 5 일령에 생존 새 #/총 새 #
백신화 1 RN1250 pre MSV (I) 38/38
백신화 2 RN1250 pre MSV (U) 40/40
백신화 3 RN1250 pre MSV (F) 73/75
백신화 4 Rismavac® 73/75
접촉 대조군 1 RN1250 pre MSV (I) 12/13
접촉 대조군 2 RN1250 pre MSV (U) 13/13
접촉 대조군 3 RN1250 pre MSV (F) 22/25
접촉 대조군 4 Rismavac® 23/25
표 2. vvMDV T. King 유발에 대항하는 보호 지수
섭생 Gp 명칭 감염된 # / 총 새 # 감염된 % 보호 지수5
백신화 1 RN1250 pre MSV (I)1 2/38 5.26% 87.4(81.2)6
백신화 2 RN1250 pre MSV (U)2 6/40 15.0% 2.6(46.4)6
백신화 3 RN1250 pre MSV (F)3 6/73 8.22% 84.9
백신화 4 Rismavac®4 15/73 20.5% 63.7
Shedders 1 RN1250 pre MSV (I) 9/12 75.0% N/A
Shedders 2 RN1250 pre MSV (U) 11/12 91.7% N/A
Shedders 3 RN1250 pre MSV (F) 20/25 80.0% N/A
Shedders 4 Rismavac® 22/24 91.7% N/A
접촉 대조군 1 RN1250 pre MSV (I) 5/12 41.7% N/A
접촉 대조군 2 RN1250 pre MSV (U) 2/13 15.4% N/A
접촉 대조군 3 RN1250 pre MSV (F) 12/22 54.5% N/A
접촉 대조군 4 Rismavac® 13/23 56.5% N/A
2 번째 대조군 1 RN1250 pre MSV (I) 9/10 90.0% N/A
2 번째 대조군 2 RN1250 pre MSV (U) 8/10 80.0% N/A
2 번째 대조군 3 RN1250 pre MSV (F) 9/10 90.0% N/A
2 번째 대조군 4 Rismavac® 8/10 80.0% N/A
1RN1250 (I) 백신 역가: 3600 pfu/0.2ml.
2RN1250 (U) 백신 역가: 3144 pfu/0.2ml.
3RN1250 (F) 백신 역가: 3710 pfu/0.2ml.
4Rismavac® 백신 역가: 2328 pfu/0.2ml.
5보호 지수: MD 병반을 가진 비-백신화 접촉의 백분율 (유발 대조군) - MD 병반을 가진 백신화된 닭의 백분율 / MD 병반을 가진 비-백신화 접촉의 백분율 (유발 대조군).
6오직 하나의 그룹으로서 콜로니 계사 10, 그룹 1 및 2 에서의 MD 병반을 가진 비-백신화 접촉 대조군의 백분율을 고려하는 보호 지수 (28% 또는 7 /25).
결론. 마렉병 백신, 혈청형 1, RN1250 백신, pre MSV (I) 및 (F) 는 shedder 유발 모델에서, MDV T. King 을 사용하는 시판 육계에서의 Intervet's Rismavac® 보다 더욱 효과적이었다.
실시예 3 - SPF 1 일령 병아리에서의 안정성 MDV RN1250 (X+5)
250 마리의 1 일령, SPF 닭을 5 개의 처리 그룹으로, 그룹 당 50 마리의 병아리 씩 무작위로 배정하고, 뿐만 아니라 거주에 사용되는 음압 단리 유닛에 무작위로 배정하였다. 100 마리의 병아리를 백신접종군으로서 지정하였고, 그룹 1 및 2 로서 확인하였다. 100 마리의 병아리를 그룹 1 및 2 의 sham-백신화, 접촉 대조군으로서 지정하였고 (그룹 4 및 5, 각각); 남아있는 sham-백신화 병아리 (50 마리) 를 음성 대조군으로 담당하기 위해 그룹 3 으로서 확인하였다. 무작위화 후, sham-백신화, 접촉 대조군 및 sham-백신화, 음성 대조군을 식별을 위해 숫자 밴드로 날개에 밴드 표시를 하였고, 이들 각각의 유닛 내에 배치시켰다 (유닛 당 7-10 마리의 새). sham-백신화 새를 마렉병 희석액, 새 마리당 0.2 ml 으로 접종하였다. 백신접종군으로서 지정된 병아리를 RN1250 (X+5) (그룹 1) 또는 Rismavac® (그룹 2) 로, 새 마리 당 0.2 ml (투여량 당 ~ 5000-6500 플라크-형성 단위 (pfu)) 으로 피하 (SQ) 접종시켰다. 접종 후, 백신접종군을 그들의 배정된 유닛 (유닛 당 7-10 마리의 새) 내로, 미리 거주시켜둔 이들의 sham-백신화, 접촉 대조군과 함께, 유닛 당 총 15 내지 20 마리의 병아리로 배치시켰다.
표 3. 연구 디자인
그룹 백신 백신화 경로* 새의 수
1 MDV SR-1
RN1250		 SQ 50
2 MDV SR-1
Rismavac® 		SQ 50
3 Sham-백신화
(음성 대조군)		 SQ 50
4 Sham-백신화 MDV SR-1 RN1250 백신화 새에 대한 접촉 대조군 SQ 50
5 Sham-백신화 MDV SR-1 Rismavac® 백신화 새에 대한 접촉 대조군 SQ 50
연구 제 7 일에, 각 그룹, 그룹 1-5 에 속하는 5 마리의 새로부터 기관 샘플 (활액, 흉선 및 비장) 을 수확을 위해 선택하고, 조직병리학을 위해 10% 완충 포르말린 내에 고정하였다. 새들 (유닛 당 2-3 마리의 새) 을 무작위화 스케쥴에 따라 선택하였다. 연구 제 14 일에, 각 그룹, 그룹 1-5 로부터의 15 마리의 새의 체중 및 기관 중량 (활액, 흉선 및 비장) 을 수집하였다. 각 그룹 (그룹 1-5) 에서 5 마리의 새로부터의 기관 샘플 (활액, 흉선 및 비장) 을 수확하고, 10% 완충 포르말린 내에 고정하였다. 칭량 및 기관 수확을 위해 유닛 당 2 내지 3 마리의 새를 사용하였다. 새들을 무작위화 스케쥴에 따라 선택하였다. 연구 제 14 일에 기재된 절차를, 남아있는 새를 이용하여 제 28 일, 및 제 49 일에 반복하였다.
결과. 기관 위축 RN1250. MDV SR-1 RN1250 백신으로 백신화된 새의 활액 비 및 sham-백신화, 접촉 대조군의 비는 sham-백신화, 음성 대조군 새의 비와 크게 다르지 않았는데, 단 제 28 일에, MDVSR-1 RN1250 에 대한 접촉 대조군의 활액 비는 음성 대조군보다 상당히 높았다 (p≥ 0.0111). MDVSR-1 RN1250 백신으로 백신화된 새의 흉선 비 및 sham-백신화, 접촉 대조군의 비는 sham-백신화, 음성 대조군 새의 비와 크게 다르지 않았다 (p≥ 0.7265). 마지막으로, MDVSR-1 RN1250 백신으로 백신화된 새의 비장 비 및 sham-백신화, 접촉 대조군의 비는 sham-백신화, 음성 대조군 새의 비와 크게 다르지 않았다 (p≥ 0.5286).기관 위축 Rismavac®
MDVSR-1 Rismavac®-백신으로 백신화된 새의 활액 비 및 sham-백신화, 접촉 대조군의 비는 sham-백신화, 음성 대조군 새의 비와 크게 다르지 않았다 (p≥ 0.0581). MDVSR-1 Rismavac®-백신으로 백신화된 새의 흉선 비 및 sham-백신화, 접촉 대조군의 비는 sham-백신화, 음성 대조군 새의 비와 크게 다르지 않았다 (p≥ 0.4004). MDVSR-1 Rismavac®-백신으로 백신화된 새의 비장 비는 제 14 일에 p-값 = 0.0141으로, sham-백신화, 음성 대조군의 비장 비보다 상당히 컸고; sham-백신화 접촉 대조군의 새의 비장 비는 제 28 일에 p-값 <0.0001 으로, sham-백신화, 음성 대조군보다 상당히 컸다. 상기 비는 다른 날에는 크게 다르지 않았다 (p≥ 0.5558). 조직 검사로부터의 조직학적 검사 결과는 마렉병 SR-1 RN1250 또는 Rismavac® 로 접종된 새의 활액, 흉선 또는 비장에서의 위축의 증거를 보이지 않았다.
결론. 상기 시험 조건 하에서, 흉선, 활액 및/또는 비장 위축에 의해 평가되는 바와 같이, MDV SR-1, RN1250, X+5 는 SQ 투여된 경우 안전하였다.
실시예 4 - SPF 1 일령 병아리에서의 MDV, SR-1, RN1250 의 파급
목적. SQ 투여된 경우 1 일령 특정-병원균이 없는 (SPF) 닭에서의 MDV, SR-1, RN1250 실험 백신 (X+5) 의 파급력 및 이것이 비-백신화 접촉에 대해 퍼져나가는지를 평가하기 위함.
물질 & 방법. 120 마리의 1 일령 SPF 닭을 3 개의 상이한 처리 그룹으로, 각 유닛이 15 마리의 백신접종군 및 5 마리의 접촉군을 함유하는 6 개의 유닛으로 무작위로 나눴다. 접촉군으로서 무작위화된 새는 무작위화 스케쥴 당 색조 숫자 밴드로 목덜미 뒤에 밴드 표시를 한 다음, 그들의 각각의 유닛 내에 배치시켰다. 백신접종군으로서 무작위화된 새는 MDV RN1250 X+5 또는 Rispens 로 백신화시켰다. 실험 및 시판 백신을 Marek's 희석액에 희석하여, SQ 경로에 의해 투여된, 투여량 당 대략 100,000 pfu (예상된 필드 투여량의 대략 17X) 가 투여되도록 산출하였다. 백신화 후, 새들을 미리 배치되어 있는 접촉군과 함께 그들의 각각의 유닛 내로 배치시켰다. 백신화된 새를 무작위화 스케쥴에 따라 색조 숫자 밴드로 목덜미 뒤에 8 일령에 밴드 표시를 하였다. 연구 동안 임상 측정에 관여한 사람은 블라인드 상태의 유지를 위해, 접촉군 또는 백신접종군의 밴드 표시에 참여하지 않았고 또한 상기 기간 동안의 임의의 임상적 관찰도 수행하지 않았다.
표 4. 연구 그룹
GP 백신 백신화 경로/
부피		 새의 수*
백신화 비-백신화 접촉
1 MDV SR-1
RN1250		 SQ/
새 마리당 0.2 ml		 30 10
2 MDV SR-1
Rispens 백신		 SQ/
새 마리당 0.2 ml		 30 10
3 Sham-백신화
음성 대조군		 SQ/
새 마리당 0.2 ml		 30 10
백신화 후 2 주에, 모든 백신화된 새로부터의 바이러스 회수를 위해 기관 및 배설강 면봉채취를 실시하였다. 면봉채취물을 그룹에 따라 모았고, 5 ml 의 SPGA 안정화제를 함유하는 면봉 튜브 당 5 개의 기관 및 배설강 면봉채취물을 넣었다. 각각의 그룹에서 2 마리의 백신화된 새로부터 바이러스 회수를 위해 일차 우포를 수집하였고, 새 마리 당 2 내지 3 개의 깃털 샘플을 수집하였다. 우포 샘플링을 위해 그룹 당 2 마리의 새를 무작위화 스케쥴에 따라 선택하였고, 샘플링 후 살아있는 상태로 유지시켰다. 모든 샘플을 프로세싱을 위해 Merial Select 의 분석 부서에서 취급하였다. 동일한 샘플링 절차를 7 일간의 간격을 두고 2 회 반복하였다.
연구 제 21 일에, 기관 및 배설강 면봉채취 샘플링 및 우포 샘플링에 더해, 그룹 당 5 마리의 백신화 및 비-백신화 접촉군 (무작위화 스케쥴에 따라 선택됨) 을 종결시키고 부검하였고, 비장을 개별적으로 수확하였다. 바이러스 단리는 비-백신화 접촉군으로부터 수확된 비장에서만 시도되었다 (백신화 새는 블라인드 상태의 유지를 위해 수확되었다). 연구 최종일에 (제 49 일), 모든 남아있는 새를 안락사시키고 부검하고, 연구를 종결하였다. 그룹 당 남아있는 5 마리의 백신화 및 비-백신화 접촉군으로부터의 비장을 개별적으로 수확하였다. 바이러스 단리는 비-백신화 접촉군으로부터 수확된 비장에서만 시도되었다 (백신화 새는 블라인드 상태의 유지를 위해 수확되었다).
결과. 그룹 1 MDV SR-1 RN1250 X+5 산술 평균 역가 (AMT) 는 94,160 pfu/0.2 ml 투여량이었다. 그룹 2 MDV SR-1 Rispens 는 51,800 pfu/0.2 ml 투여량이었다. 모든 기관 및 배설강 면봉채취물은 바이러스 회수에 대해 음성이었다.
그룹 1 MDV SR-1 RN1250: 본 그룹에 대해 시험된 모든 샘플은 우포로부터의 바이러스 회수에 대해 음성이었다.
그룹 2 MDV SR-1 Rispens: 제 21 일에, 샘플링된 두가지 새로부터의 우포는 마렉병 세포변성 효과 (MD CPE) 에 대해 양성이었다. 제 14 일 및 제 28 일에 샘플링된 모든 새로부터의 우포는 음성이었다.
그룹 3 Sham-백신화 음성 대조군: 시험된 모든 우포 샘플은 깃털로부터의 바이러스 회수에 대해 음성이었다.
제 21 일 및 제 49 일에 접촉군 새로부터 수확된 임의의 비장으로부터 회수된 바이러스는 없었다. 제 49 일로부터의 샘플은 처음에는 오염되었으나, PCR 을 사용하여 다시 시험하였고 모두 음성이었다. 상기 동일한 샘플로부터의 동결 연막 물질을 또한 재-플레이팅하였고, 상기 샘플 모두가 음성인 것으로 확인되었다.
결론. 상기 연구 조건 하에서, MDV, SR-1, RN1250 실험 백신으로 SQ 백신화된 새는 시판 MDV, SR-1 Rispens 백신으로 SQ 백신화된 새와 유사한 파급 패턴을 나타냈다. MDV RN1250 실험 백신으로 백신화된 새들과 접촉하였던 비-백신화 새에서 바이러스의 회수 또는 임상 질환의 증거는 없었다.
실시예 5 - vvMDV, RB1B 바이러스에 대항하는 일령 병아리에게 투여된 MDV, S1, RN1250 백신 (X+5) 의 효능 평가
물질 & 방법. 280 마리의 1 일령 SPF 병아리를 무작위화 스케쥴에 따라 8 개의 상이한 그룹 및 24 개의 상이한 단리 유닛으로 무작위화하였다 (유닛 당 11-12 마리의 새; 처리 당 35 마리의 새). 무작위화 후, 그룹 6 및 7, sham-백신화, 유발된 및 sham-백신화/sham 유발된 음성 대조군 내의 새를, Marek's 백신 희석물로 sham 백신화하고, 무작위화 스케쥴에 따라 이들의 지정된 유닛 내로 배치시켰다. 남아있는 새를 이후 MDV SR-1 RN1250 으로, 새 당 287, 578, 736, 1085, 또는 1392 플라크 형성 단위 (pfu) 투여량, 또는 MDV SR-3 HVT 로, 새 당 1728 pfu 투여량으로 백신화시켰다. 새를 병아리 당 0.2 ml 으로 피하 (SQ) 백신화시켰다. 백신화 후, 각각의 백신화된 그룹을 무작위화 스케쥴에 따라 지정된 유닛 내로 배치시켰다. 연구 제 4 일에, 그룹 7 내의 새를 Marek's 백신 희석액으로 sham 유발시켰고, 그룹 1-6 및 8 을 vvMDV RB1B 로 새 당 0.2 ml 으로 복강내 (IP) 경로에 의해 유발시켰다. 새를 유발 후 45 일 동안 매일 유발에 대한 임의의 바람직하기 않은 반응에 대해, 특히 폐사 또는 우울에 대해 관찰하였다. 연구 제 49 일에, 새를 종결시키고 마렉병과 연관된 총 병반에 대해 검시하기 위해 부검하였다.
결과. 그룹 1-5 에서 vvMDV RB1B 유발에 대항하는 예방된 부분 비율은 0.84 내지 0.94 의 범위를 가졌다. 그룹 8, HVT 백신화 그룹에서의 예방된 부분은 0.73 이었다. 백신화, 유발 대조군 그룹 6 에서의 MDV 의 발병률은 91.2% 였다. 그룹 7, sham 백신화, sham 유발된 음성 대조군에서의 새는 연구 전반에 걸쳐 MDV 병반이 없는 것으로 남아있었다.
결론. 일령 SPF 닭에 피하 (SQ) 투여된 MDV 백신, 혈청형-1, 생 바이러스, RN1250 실험 백신 (X+5) 은 유발제로서 RB1B 바이러스를 사용하는 투여량 당 287 플라크 형성 단위에서 효과적이었다.
표 5. 투여량 반응 효능 요약
Gp Gp 그룹 명칭 실제 투여량 감염된 #/총 새 # 보호된 % 감염 %
1 B MDV RN1250 (X+5) 백신 250 pfu 287.2 pfu/0.2ml (AMT) 5/34 85.3% 14.7%
2 H MDV RN1250 (X+5) 백신 500 pfu 578.4 pfu/0.2ml (AMT) 4/34 88.2% 11.8%
3 C MDV RN1250 (X+5) 백신 750 pfu 736 pfu/0.2ml (AMT) 2/34 94.1% 5.9%
4 A MDV RN1250 (X+5) 백신 1000 pfu 1084.8 pfu/0.2ml (AMT) 3/35 91.4% 8.6%
5 D MDV RN1250 (X+5) 백신 1500 pfu 1392 pfu/0.2ml (AMT) 4/34 88.2% 11.8%
6 E Sham 백신화 / 유발 대조군 31/34 N/A
(8.8% *)		 91.2%
7 G Sham 백신화 /Sham 유발 음성 대조군 0/35 N/A 0.0%
8 F MDV HVT 방출 역가 1725 pfu/0.2ml (AMT) 8/33 75.8% 24.2%
* * * * * * * *
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기재하였으므로, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명이 이의 많은 명백한 변형이 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어남 없이 가능하므로, 상기 설명에 언급된 특정 설명에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
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Claims (8)

  1. 조류에게 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 조류에서 마렉병 바이러스 (Marek's Disease Viruses: MDV) 에 대항하는 보호성 면역 반응을 도출하는 방법으로서,
    상기 백신은 수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제, 및 망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 서열을 포함하는 외부 DNA 구축물로 안정적으로 형질전환된 효과적인 면역화 투여량의 MDV 바이러스제를 포함하고,
    여기서 상기 MDV 바이러스제는 클론 바이러스이고, 모체 및 재조합 바이러스의 혼합 집단이 아니며,
    상기 MDV 바이러스제는 CVI988/X MDV SR-1 RN1250 이고, 조류당 용량당 200 플라크-형성 유닛 (pfu) 이상을 포함하고,
    백신화된 조류는 vvMDV RB1B 바이러스로 유발되었을 때 0.84 이상의 예방된 부분 비율을 갖는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 조류가 닭인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 백신이 투여되었을 때, 백신이 상기 조류에서 상당한 정도의 병원성을 야기하지 않는, 방법.
  4. 하기를 포함하는, 조류에서 MDV 에 대항하는 보호성 면역 반응을 도출하기 위한 백신:
    수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제; 및
    망상내피증 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 서열을 포함하는 외부 DNA 구축물로 안정적으로 형질전환된, 효과적인 면역화 투여량의 MDV 바이러스제,
    여기서 상기 바이러스제는 클론 바이러스이고, 모체 및 재조합 바이러스의 혼합 집단이 아니며,
    상기 MDV 바이러스제는 CVI988/X MDV SR-1 RN1250 이고,
    백신 내 상기 MDV 바이러스제는 조류당 용량당 200 pfu 이상의 양으로 존재하고,
    상기 백신으로 백신화된 조류는 vvMDV RB1B 바이러스로 유발되었을 때 0.84 이상의 예방된 부분 비율을 갖는, 백신.
  5. 제 4 항에 있어서, 0.1 mL 내지 2.0 mL 의 부피를 갖는 투여 형태인, 백신.
  6. 제 1 항에 있어서, 조류에게 0.1 mL 내지 2.0 mL 의 백신이 투여되는, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, LTR 은 SEQ ID NO:2 의 서열을 갖고, LTR 서열은 접근 번호 PTA-4945 로 ATCC 에 기탁된 균주의 모든 확인된 특성을 갖는 MDV 로부터의 Pac I 절단된-DNA 분절을 포함하고, 상기 LTR 서열이 상기 MDV 의 ICP4 유전자의 5' 에 삽입된, 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, LTR 은 SEQ ID NO:2 의 서열을 갖고, LTR 서열은 접근 번호 PTA-4945 로 ATCC 에 기탁된 균주의 모든 확인된 특성을 갖는 MDV 로부터의 Pac I 절단된-DNA 분절을 포함하고, 상기 LTR 서열이 상기 MDV 의 ICP4 유전자의 5' 에 삽입된, 백신.
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