EA029392B1

EA029392B1 - Агонисты рецептора вазопрессина-2

Info

Publication number: EA029392B1
Application number: EA201690219A
Authority: EA
Inventors: Казимеж ВИСНЕВСКИ; Клаудио Штайнгарт; Пьер РИВЬЕР
Original assignee: Ферринг Б.В.
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2018-03-30
Also published as: PL3024829T3; AU2014292860A1; IL243730B; RS56604B1; PH12016500044B1; TWI640542B; CA2919208A1; KR20160034943A; WO2015013690A1; SG11201600031RA; MX363355B; PT3024829T; TW201536815A; HRP20180009T1; IL243730A0; US10131692B2; NZ716342A; US20190194257A1; JP6387095B2; EP3024829A1

Abstract

Раскрываются агонисты рецептора вазопрессина-2 формулы I, где все заместители раскрыты в формуле изобретения, их фармацевтические композиции и способы применения вышеуказанных агонистов для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза и никтурии.

Description

изобретение относится к новым соединениям с агонистической активностью в отношении рецептора вазопрессина-2 (У₂), содержащим их фармацевтическим композициям и к использованию указанных соединений для изготовления лекарственных средств для лечения заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Существует три известных подтипа рецепторов вазопрессина: У_1а, У_1Ь и У₂. Рецептор У_1Ь также известен как рецептор У₃, а рецептор У_1а также известен как рецептор У₁. Каждый подтип имеет особый паттерн экспрессии в тканях, так, У₂ в основном обнаруживается в почках, где он опосредует антидиуретическую активность эндогенного лиганда вазопрессина (Рауогу е! а1., 2009). У_1Ь широко распространен в головном мозге (Негпапбо е! а1., 2001). У_1а обнаруживается в различных тканях, включая гладкие мышцы, печень, почку, тромбоциты, селезенку и головной мозг (Ζΐη§§, 1996; Οδίπηνδία е! а1., 1994).

Агонисты рецептора У₂ являются клинически полезными. Десмопрессин является агонистом рецептора У₂, который одобрен на некоторых территориях для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза, никтурии и расстройств коагуляции, включая гемофилию А и болезнь фон Виллебранда. Десмопрессин связывается и активирует рецепторы У₂ и рецепторы У_1Ь и обладает более слабой активностью в отношении рецептора У_1а.

Было показано, что десмопрессин частично выводится почками (например, Р)е11е%а0-РаиЬеп е! а1., 1993), и период полувыведения десмопрессина увеличен у пациентов с нарушением функции почек (Ки71ска, е! а1., 2003; Адещое е! а1., 2004). Адещое е! а1. предполагают, что увеличенный период полувыведения может приводить к продленным антидиуретическим эффектам и увеличивать риск гипонатриемии, падения количества натрия в сыворотке, что может приводить к негативным эффектам, таким как припадки или кома. Они также заявляют, что, хотя десмопрессин по-видимому является безопасным и хорошо переносится пациентами с нарушенной почечной функцией, следует проявлять большую осторожность при титровании эффективных доз, если пациентов со средней или острой почечной функцией вообще лечить десмопрессином.

Таким образом, существует потребность в дополнительных агонистах рецептора У₂ с уменьшенной активностью в отношении рецептора У_1Ь. Кроме того, также могут быть желательны агонисты рецептора У₂, выведение которых не зависит от почек в такой сильной степени.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном из воплощений предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая

соль

где К² представляет собой Н, С₁-С₄алкил, галоген, -ОН или -О-С₁-С₄алкил;

К³ представляет собой Н, или -СН₂-ОН, или -С(О)-ИК⁵К⁶;

К⁴ представляет собой Н или ^(=ΝΗ)-ΝΗ₂;

К⁵ и К⁶ независимо представляют собой Н, С₁-С₆алкил, -СН₂-циклопропил, -циклопропил или арилалкил при условии, что К⁵ и К⁶ не являются оба Н;

X и Υ независимо представляют собой -СН₂- или -8- при условии, что если X представляет собой

-СН₂-, то Υ не является -СН₂-;

Ζ представляет собой -СНК⁷- или 8, и К⁷ представляет собой Н или С₁-С₄алкил, галоген, -ОН или

-О-С₁-С₄алкил;

- 1 029392

К⁸ представляет собой Н или -СН₃;

Аг представляет собой гетероарил или фенил, возможно замещенные одним Щ-С/алкилом. галогеном, -ОН или группой -О-С₁-С₄алкил.

В некоторых воплощениях К⁵ и К⁶ независимо представляют собой Н, С₁ -С₆алкил или арилалкил.

В некоторых воплощениях К⁵ и К⁶ не являются оба Н.

В некоторых воплощениях только один из X и Υ представляет собой -8-.

В некоторых воплощениях X представляет собой -СН₂-.

В некоторых воплощениях X и Υ оба представляют собой -8-.

В некоторых воплощениях Аг представляет собой тиофен.

В некоторых воплощениях К⁸ представляет собой -СН₃.

В некоторых воплощениях К³ представляет собой -С(О)-ЫК⁵К⁶. В определенных из этих воплощений К⁵ представляет собой Н, и К⁶ представляет собой С₁-С₄ алкил. В определенных из этих воплощений К⁵ и К⁶ оба представляют собой -СН2СН3.

В некоторых воплощениях К² представляет собой галоген. В определенных из этих воплощений К²представляет собой -С1. В определенных из этих воплощений К² представляет собой -Р.

Также в данной заявке согласно одному из воплощений предложен способ лечения одного из несахарного диабета, первичного ночного энуреза и никтурии, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I пациенту, нуждающемуся в этом. Данное изобретение также включает применение соединений, описанных в данной заявке, в лечении состояний, описанных в данной заявке, а также применение соединений, описанных в данной заявке, в производстве лекарственного средства для лечения состояний, описанных в данной заявке.

Согласно воплощению соединение формулы I используется в лекарственном средстве для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза или никтурии.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, следующие термины, используемые в данной заявке, в том числе в описании изобретения и формуле изобретения, имеют значения, приведенные ниже. Следует отметить, что использование в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включает ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Определение стандартных химических терминов можно найти в справочных изданиях, в том числе Сагеу апб 8ипйЬетд (2007) Айтапсей Отдалю СНспиЛгу 5* Ей. Уо18. А аий В, Р1епит Рге88, №и ΥογΕ. Если не указано иное, при практическом осуществлении настоящего изобретения будут использовать типичные методы синтетической органической химии, масс-спектроскопию, препаративные и аналитические методы хроматографии, химии белка, биохимии и фармакологии в пределах области техники.

"Алкил" представляет собой С_1-12 прямоцепочечный или разветвленный алкил. Разветвленный алкил включает изо-, втор- и трет-конфигурации.

"Арил" представляет собой моно- или бициклическую ароматическую углеводородную кольцевую систему из 5-12 атомов углерода, возможно замещенную С₁-С₄алкилом, галогеном, -ОН или группой -ОС₁-С₄алкил. Иллюстративные моно- и бициклические ароматические карбоциклические кольцевые системы включают возможно замещенный фенил и возможно замещенный нафтил.

"Арилалкил" представляет собой алкильную группу, которая имеет в качестве заместителя арильную или гетероарильную группу.

"Гетероарил" представляет собой ароматическую гетероциклическую пяти- или шестичленную кольцевую систему, возможно замещенную С1-С4алкилом, галогеном, -ОН или группой -О-С1-С4алкил. Пятичленная гетероароматическая кольцевая система представляет собой моноциклическую ароматическую кольцевую систему, имеющую пять кольцевых атомов, где 1, 2, 3 или 4 кольцевых атома независимо выбраны из Ν, О и 8. Иллюстративные пятичленные гетероароматические кольцевые системы включают возможно замещенные имидазолил, тиазолил, тиенил, фурил, пиразолил и триазолил. Шестичленная гетероароматическая кольцевая система представляет собой моноциклическую ароматическую кольцевую систему, имеющую шесть кольцевых атомов, где 1, 2, 3 или 4 кольцевых атома независимо выбраны из Ν, О и 8. Иллюстративные шестичленные гетероароматические кольцевые системы включают возможно замещенные пиридил, пиримидил и пиразинил.

В одном из воплощений изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединения по настоящему изобретению. В первом воплощении фармацевтическая композиция дополнительно включает один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов или носителей и, возможно, других терапевтических и/или профилактических ингредиентов. Такие эксципиенты известны специалистам в области техники. Соединения по настоящему изобретению включают без ограничения основные соединения, такие как свободные основания. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов и солей имеется в РепипдЮп'з Рйагтасеи1юа1 8с1епсе8, 18ΐΗ ΕάίΙίοιτ (Еа§1оп, Реппзу1уата: Маск РиЬЙ8Ыпд Сотрапу, 1990).

Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли присоединения кислоты, например соль, образованную путем реакции с галогенводородными кислотами, такими как соляная кислота, и не- 2 029392

органическими кислотами, такими как серная кислота, ортофосфорная кислота и азотная кислота, а также с алифатическими, алициклическими, ароматическими или гетероциклическими сульфоновыми или карбоновыми кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, янтарная кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, пировиноградная кислота, п-гидроксибензойная кислота, эмбоновая кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, гидроксиэтансульфоновая кислота, галогенбензолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, трифторметансульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота (см., например, Вегде е! а1., ί. РЬагт. §С1. 66:1 19, 1977 и АегтШк С.С. апб Р.Н. §1аЬ1, ебк. РЬагтасеибса1 8аЬк: Ргорегбек, 8е1есбоп апб Ике. Ζϋπαΐι: Уег1ад Некебса СЫтюа Лс1а. 2002).

В зависимости от предполагаемого способа введения фармацевтические композиции могут быть в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, кремы, мази, лосьоны или т.п., предпочтительно в единичной лекарственной форме, подходящей для однократного введения в точной дозировке. Композиции будут содержать эффективное количество выбранного лекарственного средства в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и, кроме того, могут включать другие фармацевтические агенты, адъюванты, разбавители, буферы и т.д.

Изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению, включая его изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и, возможно, с другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами.

Типичные нетоксичные твердые носители для твердых композиций включают, например, следующие ингредиенты фармацевтической степени чистоты: маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и тому подобное.

Композиции для перорального введения, как правило, имеют форму таблетки, капсулы, гелевой капсулы неводного раствора, суспензии или сиропа. Таблетки и капсулы являются предпочтительными пероральными лекарственными формами. В некоторых вариантах осуществления таблетка представляет собой пастилку, например быстрорастворимую пастилку. В некоторых воплощениях пастилку вводят посредством сублингвального пути введения. Таблетки и капсулы для перорального применения, как правило, включают в себя один или более широкоиспользуемых носителей, таких как лактоза и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. При использовании жидкой суспензии активный агент может быть объединен с эмульгирующими и суспендирующими агентами. Если это необходимо также могут быть добавлены вкусоароматические добавки, красители и/или подсластители. Другие дополнительные компоненты для включения в пероральную композицию включают консерванты, суспендирующие агенты, загустители и тому подобное, но не ограничиваются этим.

Дозировки для терапии будут зависеть от абсорбции, распределения, метаболизма и скорости выведения компонентов комбинированной терапии, а также других факторов, известных специалистам в области техники. Значения дозы также меняются в зависимости от тяжести состояния, подлежащего облегчению. Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования и графики могут быть скорректированы с течением времени в соответствии с потребностями индивида и профессиональной оценки человека, вводящего или контролирующего введение терапевтического препарата. В некоторых воплощениях внутривенная доза составляет около 100 нг. В некоторых воплощениях пероральная доза составляет от 1 мкг до 1 мг. В некоторых воплощениях доза назального введения составляет от 3 до 6 мг.

Использованы следующие сокращения:

- 3 029392

Сокращение	Определение
Ас	Ацетил
АсОН	Уксусная кислота
АУР	Аргинин Вазопрессин Су5-Туг-Рпе-С1п-А5П-Су5-Рго-Агд-С1у-МН₂ с дисульфидным мостиком между остатками Суз О ΝΗ η₂ν. х II н - н ² О О ΗΝ. .О Н₂М ΝΗ ' аАА···
	иу о

	НСУ
ВТА	Ν, О-Бис(триметилсилил)ацетамид
Ви	бутил - алкильные остатки также могут быть отмечены как н (нормальные, т.е. неразветвленные), и (изо), втор (вторичные) и трет (третичные)
ΒζΙ	Бензил
ΟΗ₃ΟΝ	Ацетонитрил
ОСЕ	1,2-дихлорэтан
ϋΟΜ	Дихлорметан
сЮАУР	Десмопрессин, [1 -деамино,8-О-аргинин]-
	вазопрессин
	но. У\
	Ч „

	νη₂ ο
ϋΙΟ	Ν, Λ/'-диизопропил карбодиимид
ϋΙΡΕΑ	/V,/ν-диизопропилэтиламин
ϋΜΡ	/\/,Л/-диметилформамид

- 4 029392

άλ/Ρ	1 -деамино-вазопрессин О ΝΗ ΥΊ ОО ΗΝ^Ο о Λ"""² V БА? ° Η₂Ν ΝΗ ' о/уБ о \ о 5 но
Εί	Этил
Ртос	9-флуоренилметоксикарбонил
нвти	О-бензотриазол-М.ЫЦ’Ц’-тетраметилурония гексафторфосфат
ΗΓΙΡ	1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол
ΗΟΒί	Ν-гидроксибензотриазол
НР1_С	высокоэффективная жидкостная хроматография
/Ви	изо-бутил
сРг	циклопропил
/Рг	изо-пропил
1_С	жидкостная хроматография
Ме	метил
МеОН	метанол
М3	масс-спектрометрия
ΝΜΜ	Л/-метилморфолин
Ρόί	2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5сульфонил
(Ви	тре/л-бутил
(ВиОН	трет-бутиловый спирт
ТРА	трифторуксусная кислота
ΤΙ3	триизопропилсилан
ТМОР	триметилортоформиат, триметоксиметан
Тг1	тритил [трифенилметил, (СбН₅)зС-]

Если не указано иное, использовали Б-аминокислоты и традиционную терминологию аминокислот. Примеры аминокислот, отличных от двадцати традиционных аминокислот, включают

Сокращение	Традиционное название
ΤΗΪ	3-(2-тиенил)аланин
Сра	р-(4-хлорфенил)аланин
Ера	р-(4-фторфенил)аланин
Нур	4-Гидроксипролин
ΤΗΖ	1,3-тиазолидин-4-карбоновая кислота, тиопролин
АЬи	2-аминомасляная кислота
Адт	Агматин, (4аминобутил)гуанидин
РЬе(4-Ме)	Р-(4-метилфенил)аланин
РИе(4-Е1)	р-(4-этилфенил)аланин

- 5 029392

Соединения

Соединения по изобретению имеют структуру формулы I

и ее фармацевтических солей, где

К² представляет собой Н, С_гС₄алкил, галоген, -ОН или -О-С_гС₄алкил;

К³ представляет собой Н, или -СН₂-ОН или -С(О)-ЫК⁵К⁶;

К⁴ представляет собой Н или -С(=КН)-КН₂;

К⁵ и К⁶ независимо представляют собой Н, С₁-С₆алкил, -СН₂-циклопропил, -циклопропил или арилалкил при условии, что К⁵ и К⁶ оба не являются Н;

X и Υ независимо представляют собой -СН₂- или δ при условии, что если X представляет собой -СН₂-, то Υ не является -СН₂-;

Ζ представляет собой -СНК⁷- или δ, и К⁷ представляет собой Н или С_гС₄алкил, галоген, -ОН или -О-С_гС₄алкил;

К⁸ представляет собой Н или -СН₃;

Аг представляет собой гетероарил или фенил, возможно замещенные одним С_гС₄алкилом, галогеном, -ОН или группой -О-С1-С₄алкил.

Таблица 1

Пример соединений по изобретению

ЗЕО Ю	К²	К³ и конфигурация соединения	Р⁴	Αγ	X	Υ	Ζ
1	С1	СН₂ОН (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
2	Ме	СН₂ОН (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
3	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
4	С1	0(=Ο)-ΝΗΡγ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
5	С1	0(=Ο)-ΝΗίΒίΐ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
6	он	СН₂ОН (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
7	С1	Н	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	4-фторфенил	сн₂	8	сн₂
8	он	Н	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	4-фторфенил	сн₂	8	сн₂
9	он	Н	Η	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
10	С1	Н	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
11	С1	С(=О)-ЫНсРг (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
12	С1	С(=О)-ЫН-СН₂-сРг (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
13	С1	0(=Ο)-ΝΗΒζΙ (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
14	С1	С(=О)-ЫНВи (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
15	С1	0(=Ο)-ΝΗίΡΓ (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
16	С1	С(=О)-ЫН\|Ви (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	СН(ОН)
17	Е1	СН₂ОН (8)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
18	С1	0(=Ο)-ΝΗίΒίΐ (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	8	СН2	сн₂
19	С1	0(=Ο)-ΝΗίΒίΐ (8)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
20	С1	С(=О)-ЫНМе (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
21	С1	0(=Ο)-ΝΕ1₂ (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
22	С1	СН₂ОН (8)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
23	он	СН₂ОН (8)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	8	сн₂
24	С1	СН₂ОН (Р)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	4-фторфенил	сн₂	8	сн₂

- 6 029392

25	С1	СН₂ОН (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	СН2	СН₂
26	С1	0(=Ο)-ΝΗίΒιι (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	фенил	3	СН2	сн₂
27	С1	0(=Ο)-ΝΗίΒιι (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	СН2	СН(ОН)
28	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	3	сн₂
29	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	фенил	3	3	сн₂
30	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	СН2	сн₂
31	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	СН2	СН(ОН)
32	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	фенил	СН₂	3	СН(ОН)
33	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	СН₂	3	3
34	С1	0(=Ο)-ΝΗΕΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	3	СН2	3
35	С1	С(=О)-ЫНРг (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	СН₂	3	3
36	С1	С(=О)-ЫН-СН₂-₂тиенил (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	3	3
37	С1	С(=О)-ЫН-СН₂-₂тиенил (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	4-фторфенил	сн₂	3	3
38	он	0(=Ο)-ΝΗΒζΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	3	сн₂
39	С1	0(=Ο)-ΝΗΒζΙ (К)	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	3	3
40	С1	Н	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	2-тиенил	сн₂	3	3
41	С1	Н	Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂	4-фторфенил	сн₂	3	3

Структуры соединений 1-41 (ЗЕр ГО 1-41)

- 7 029392

- 8 029392

- 9 029392

- 10 029392

- 11 029392

- 12 029392

- 13 029392

- 14 029392

- 15 029392

- 16 029392

- 17 029392

Таблица 2

Физико-химические свойства соединений 1-41 (8Ε^ ΙΌ 1-41)

2ЕО ГО	М+Н (вычислено)	М+Н (найдено)	НРЬС чистота
1	976,4	976,4	99,3
2	956,5	956,4	98,3
3	1017,4	1017,4	100,0
4	1031,4	1031,5	100,0
5	1045,5	1045,5	100,0
6	958,4	958,5	100,0
7	958,4	958,5	95,8
8	940,5	940,5	99,6
9	886,4	886,4	99,6
10	946,4	946,7	99,1
11	1029,4	1029,4	100,0
12	1043,4	1043,4	100,0
13	1079,4	1079,5	100,0
14	1045,5	1045,8	97,3
15	1031,4	1031,5	100,0
16	1061,5	1061,5	100,0
17	970,5	970,4	100,0
18	1045,5	1045,4	100,0
19	1045,5	1045,5	100,0
20	1003,5	1003,4	100,0
21	1045,5	1045,5	99,2
22	976,4	976,5	98,2
23	948,4	958,5	96,6
24	988,4	988,5	99,3
25	976,4	976,5	100,0
26	1039,5	1039,5	100,0
27	1061,5	1061,5	99,8
28	1035,4	1035,4	97,4
29	1029,4	1029,5	99,3
30	1017,4	107,5	99,5
31	1033,4	1033,5	99,2
32	1027,5	1027,5	99,2
33	1035,4	1035,5	100,0
34	1035,4	1035,5	100,0
35	1049,4	1049,7	99,3

- 18 029392

36	1103,4	1103,7	100,0
37	1115,4	1115,7	99,2
38	1061,5	1061,7	98,3
39	1097,4	1097,7	96,8
40	964,3	964,6	99,6
41	976,4	976,7	100,0

Таблица 3

Данные исследований ΐη υϊϊγο для соединений 1-41

19

029392

Таблица 4

Соответствие аминокислотной номенклатуры

Примеры

Общий синтез.

Производные аминокислот приобретали у коммерческих поставщиков (Аарр!ес, ΕΜΏ МПИроге и РерйПе8 1п!егпайопа1). Смолы приобретали у коммерческих поставщиков (РСА8 ВюМа!пх 1пс. и ΕΜΏ МПИроге). Все дополнительные реагенты, химикаты и растворители приобретали у 81дта-АМпсЬ и

УА'К.

Соединения, описанные в данной заявке, синтезировали посредством стандартных способов в твердофазной пептидной химии с использованием методологии Ртос. Пептиды собирали либо вручную, либо автоматически с использованием синтезатора пептидов ТпЬи!е (Рго!ет ТесЬпо1од1е8 1пс., Тис8оп, Ал/опа), либо путем комбинации ручных и автоматических методов синтеза.

Препаративную НРЬС осуществляли на системе ^а1ег8 Ргер ЬС с использованием картриджа РгерРаск ЭеЬа-Раск С18, 300 А, 15 мкм, 47x300 мм при скорости потока 100 мл/мин и/или на колонке РЬепотепех Рапа С18, 100 А, 5 мкм, 30x100 мм при скорости потока 40 мл/мин. Аналитическую обращеннофазовую НРЬС осуществляли на жидкостном хроматографе АдПеп! ТесЬпо1од1е8 1200гг 8епе8 с использованием колонки АдПеп! 2огЬах С18, 1,8 мкм, 4,6x110 мм при скорости потока 1,5 мл/мин. Анализы конечных соединений осуществляли на хроматографе Адйеп! ТесПпо1од1е8 1200 8епе8 посредством обращенно-фазовой НРЬС на колонке РПепотепех Оетт1 110 А С18, 3 мкм, 2x150 мм при скорости потока

O, 3 мл/мин. Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре с ионизацией электроспреем МАТ Ртшпдап ЬСр. Если не указано иное, все реакции осуществляли при комнатной температуре. В следующей стандартной справочной литературе представлено дальнейшее руководство по общей постановке эксперимента, а также по доступности требуемого исходного вещества и реагентов: Ка1е8, 8.А., А1Ьепсю, Р., Εά8., 8о1Ы РЬа8е 8уп!Ье818: А Ргасйса1 ОшПе, Магсе1 Эеккег, №\ν Υο^к, Ва8е1, 2000; Сгеепе, Т.^., ЖЛ8,

P. С.М., Рго!есйуе Сгоир8 т Огдашс 8уп!Ье818, 1оЬп ^Пеу 8оп8 1пс., 2пй ЕПШоп, 1991; 81е\уаг1, 1.М., Υοиηд, Ι.Ώ., 8оЬП РЬа8е 8уп!Ье818, Р1егсе СЬетюа1 Сотрапу, 1984; В18е11о, е1 а1., I. Вю1. СЬет. 1998, 273, 2249822505; МетйеЫ, I. Ат. СЬет. 8ос. 1963, 85, 2149-2154; и СЬапд апй Шше Р.Э., 'Ртос 8оЬП РЬа8е РерйПе 8уп!Ье818: а Ргасйса1 АрргоасЬ', ОхЬогй ИтуешПу Рге88, ОхЬогй, 2000.

Следующие защитные группы использовали для защиты данных аминокислотных функциональных групп: РЬГ (2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил) для Агд; !Ви (трет-бутил) для Туг и Тг1 (тритил) для Су8, С1п и А8п.

Сочетания аминокислот, защищенных Ртос, на синтезаторе ТпЬи!е осуществляли посредством

- 20 029392

ΗΒΤυ/ΝΜΜ в ΌΜΡ, за исключением производных цистеина, которые сочетали посредством О1С/НОВ1 в ΌΜΡ. В ходе синтеза использовали одиночные циклы по 30-60 мин с 5-кратным избытком активированных аминокислот, защищенных Ршос. Удаление защитных групп Ршос контролировали посредством УФ. Осуществляли многократные (до 10 раз при необходимости) двухминутные промывки пептидной смолы 20% пиперидином в ΌΜΡ.

Э1С/НОВ1-опосредованные сочетания в ΌΜΡ использовали для всех аминокислот в ручном режиме. В ходе синтеза использовали одиночные циклы длительностью по меньшей мере 2 ч с 3-кратным избытком активированных аминокислот, защищенных Ршос. Завершение сочетаний оценивали посредством нингидринового теста (тест Кайзера). Удаление защитных групп Ртос достигалось с помощью одной промывки пептидной смолы 20%-м пиперидином в ΌΜΡ длительностью 30 мин.

По завершении пептидного синтеза пептидные смолы промывали ОСИ и сушили в вакууме. Смолы обрабатывали ТРА/Н₂О/Т18 96:2:2 (об./об./об.) в течение 2 ч для удаления боковых защитных групп с сопутствующим отщеплением пептида от смолы. Пептиды фильтровали, осаждали диэтиловым эфиром и декантировали. Для получения пептидов с дисульфидными мостиками осадок растворяли в неразбавленной ТРА и затем раствор вливали в 10% ацетонитрил в воде. В некоторых случаях добавляли дополнительное количество ацетонитрила для солюбилизации субстрата. Линейный пептид окисляли 0,1М 1₂/МеОН. Раствор окислителя добавляли по каплям до тех пор, пока сохранялся желтый цвет. Избыток йода восстанавливали посредством твердой аскорбиновой кислоты. Затем рН доводили до примерно 4 с помощью концентрированного аммиака. Полученный раствор загружали непосредственно на препаративную колонку НРБС и элюировали градиентом компонента В (см. таблицу ниже).

Для циклизации пептидов путем образования амидной связи неочищенные линейные пептиды растворяли в ΌΜΡ, а также получали раствор ΗΒΤυ в ΌΜΡ. Раствор пептидов и активирующий раствор попеременно добавляли в емкость с интенсивно перемешиваемым ΌΜΡ, содержащим ΌΙΡΕΑ. рН поддерживали на уровне 9-10 путем добавления чистого ΌΙΡΕΑ. Реакцию контролировали посредством НРЕС и обычно после добавления последних порций растворов активатора и пептида не наблюдали пика субстрата. Реакционную смесь разбавляли 0,1% АсОН, и полученный раствор загружали непосредственно на препаративную колонку НРЕС и элюировали градиентом компонента В.

Каждый неочищенный пептид очищали с помощью буферной системы Т. Фракции с чистотой, превышающей 93%, определенной посредством обращенно-фазовой аналитической НРЕС, объединяли и повторно загружали на колонку и элюировали буфером Т с получением трифторацетатных солей. В некоторых случаях осуществляли дополнительную очистку с помощью буферной системы С. Для получения ацетатных солей фракции из прогонов с буфером Т или С повторно загружали на колонку, и эту колонку промывали 5 об. 0,1М ацетата аммония. Конечный продукт элюировали буфером А. Фракции объединяли и лиофилизировали.

Буферные композиции

Буфер	Компонент А	Компонент В
С	0,25 М Триэтиламмония перхлорат, рН 2,3	60% ацетонитрил, 40% Компонент А
т	0,1 % Трифторуксусная кислота (ТРА)	60% ацетонитрил, 0,1% ТРА
А	2% Уксусная кислота (АсОН)	60% ацетонитрил, 2% АсОН

Как обнаружено, полученные соединения обычно были по меньшей мере примерно 95%-ной чистоты.

Пример 1. 8ЕС ΙΌ:21.

Фрагмент 1-7 собирали вручную, начиная с 7,8 г (6,9 ммоль) Н-Рго-2-хлортритильной смолы ΑΜ (ΕΜΌ Μ^11^ρо^е, каталожный номер 856057, 0,88 ммоль/г). Применяли О1С/НОВ1-опосредованные сочетания в ΌΜΡ. В ходе синтеза использовали одиночные циклы длительностью по меньшей мере 2 ч с 3кратным избытком активированных аминокислот, защищенных Ртос. Завершение сочетаний оценивали посредством нингидринового теста. Удаление защитных групп Ртос достигалось с помощью одной промывки пептидной смолы 20% пиперидином в ΌΜΡ длительностью 30 мин. Следующие аминокислотные производные использовали для сборки остатков 1-7 связанного со смолой пептида: РтосСуз((СН₂)₃С(О)О1Ви)-ОН, Ртос-Азп(Тг!)-ОН, Ртос-Уа1-ОН, Ртос-ТЫ-ОН и Вос-Сра-ОН. После сборки пептидного фрагмента 1-7 смолу тщательно промывали ОСИ и обрабатывали коктейлем ^СΜ/ΗРIΡ 7:3 (об./об.) (2x1 ч, каждый 30 мл). Затем растворители выпаривали и осадок осаждали этиловым эфиром, фильтровали и сушили в вакууме. Получали 5,79 г (4,63 ммоль, 67%) неочищенного защищенного линейного пептида (остаток этого продукта использовали в синтезе других соединений, как описано в данной заявке).

- 21 029392

Н-О-Лгд-ХЕ!₂х2ТРЛ.

2,81 г (5,4 ммоль) Вос-Э-Агд(РЬГ)-ОН (СНет 1трех, кат. № 05282), 1,95 мл (11,2 ммоль) Э1РЕА и 2,13 г (5,6 ммоль) НВТи растворяли в 10 мл ΌΜΡ. Затем к раствору добавляли 0,62 мл (6 ммоль) диэтиламина. По прошествии 5 мин не обнаруживали субстрата посредством аналитической НРЬС. Реакционную смесь вливали в 500 мл воды и осадок отделяли центрифугированием и сушили в вакууме. Остаток обрабатывали 20 мл ТРЛ/Т1§/Н₂О (96/2/2, об./об./об.) в течение 1 ч и растворители выпаривали. Остаток обрабатывали этиловым эфиром и декантировали. Получали 1,65 г (3,6 ммоль, 67%) полутвердого производного, которое использовали на следующей стадии без очистки.

Сочетание с Н-О-Агд-ΝΕΚ

2,3 г (около 1,86 ммоль) линейного защищенного пептида и 0,76 г (2 ммоль) НВТИ растворяли в 10 мл ΌΜΡ, содержащего 0,73 мл (4,2 ммоль) Э1РЕА. Затем к реакционной смеси добавляли 0,93 г (2,05 ммоль) Н-Э-Агд(РЬГ)-ОН х 2ТРА в 1 мл ΌΜΡ. По прошествии 5 мин не обнаруживали субстрата посредством аналитической НРЬС. Продукт осаждали с помощью 1 л воды, отфильтровывали и сушили в вакууме. Получали 2,6 г (1,78 ммоль, 96%) неочищенного защищенного линейного пептида. Полностью защищенный пептид обрабатывали 20 мл ТРА/Т1§/Н₂О (96/2/2, об./об./об.) в течение 1 ч и растворитель выпаривали. Незащищенный линейный пептид осаждали этиловым эфиром и лиофилизировали. Выход составлял 1,82 г (1,55 ммоль, 83%).

Общее количество линейного пептида растворяли в 50 мл ΌΜΡ. Также получали раствор 0,59 г (около 1,55 ммоль) НВТИ в 10 мл ΌΜΡ. Раствор пептида и активирующий раствор попеременно добавляли к 50 мл интенсивно перемешиваемого ΌΜΡ, содержащего 200 мкл Э1РЕА, 10 порциями по 5 мл и 1 мл соответственно. рН поддерживали на уровне 9-10 путем добавления неразбавленного Э1РЕА. После добавления последних порций растворов активатора и пептида не обнаруживали пика субстрата посредством НРЬС. Реакционную смесь разбавляли 0,1% АсОН до 1 л. Полученный раствор загружали непосредственно на препаративную колонку НРЬС и очищали с помощью буферной системы Т, элюируя градиентом компонента В (см. таблицу выше). Фракции с чистотой, превышающей 93%, определенной посредством обращенно-фазовой аналитической НРЬС, объединяли и повторно загружали на колонку. Колонку промывали 5 об. 0,1М АсОМН₄, а затем соединение элюировали буфером С с получением ацетатной соли. Фракции объединяли и лиофилизировали. Получали 703,1 мг (0,60 ммоль, 22% всего на основе 89,6% содержания пептида) белого пептидного порошка. Чистоту продукта определяли посредством аналитической НРЬС как 99,7%, и найденный М+Н составлял 1045,6 (вычисленный М+Н = 1045,5).

Пример 2. 8ЕО ГО NО: 10.

2,32 г (примерно 1,8 ммоль) защищенного линейного пептида, полученного в синтезе 8ЕЦ ГО NО: 21, растворяли в 7 мл ΌΜΡ и добавляли 0,63 мл (3,6 ммоль, 2 экв.) ΝΜΜ, затем добавляли 0,76 г (2 ммоль, 1,1 экв.) НВТИ. В отдельном сосуде 0,64 г (2,8 ммоль, 1,5 экв.) агматина сульфата суспендировали в 7 мл ΌΜΡ, содержащего 0,49 мл (2,8 ммоль) Э1РЕА. К периодически перемешиваемой вихревым способом/обрабатываемой ультразвуком суспензии добавляли ^О-бис(триметилсилил)ацетамид (ВТА, 81дта-А1бг1сЬ, кат. № 128910). После добавления к суспензии 4 экв. ВТА получали прозрачный раствор. Эти два раствора объединяли и по прошествии 5 мин не обнаруживали субстратного пептида посредством НРЬС. Продукт осаждали с помощью 1 л воды, отфильтровывали и сушили в вакууме. Полученный порошок обрабатывали 50 мл коктейля ТΡА/ТI§/Н₂О 96/2/2 (об./об./об.) в течение 1,5 ч. Растворитель выпаривали и линейный пептид осаждали с помощью этилового эфира, восстанавливали в воде/ацетонитриле и лиофилизировали.

Общее количество пептида (2,13 г, около 2 ммоль), полученное на предыдущей стадии, растворяли в 50 мл ΌΜΡ. Также получали раствор 0,76 г (2 ммоль) НВТИ в 10 мл ΌΜΡ. Раствор пептида и активирующий раствор попеременно добавляли к 50 мл интенсивно перемешиваемого ΌΜΡ, содержащего 400 мкл Э1РЕА, 10 порциями по 2,5 мл и 0,5 мл соответственно. рН поддерживали на уровне 9-10 путем добавления неразбавленной Э1РЕА. После добавления последних порций растворов активатора и пептида не обнаруживали пика субстрата. Реакционную смесь разбавляли 0,1% АсОН до 1 л и полученный раствор загружали непосредственно на препаративную колонку НРЬС и очищали с помощью буферной системы Т, элюируя градиентом компонента В (см. таблицу выше). Фракции с чистотой, превышающей 93%, определенной посредством обращенно-фазовой аналитической НРЬС, объединяли и повторно загружали на колонку. Колонку промывали 5 об. 0,1М АсОМН₄ и затем соединение элюировали буфером С с получением ацетатной соли. Фракции объединяли и лиофилизировали. Получали 656,7 мг (0,62 ммоль, 23% общий выход на основе 89,5% содержания пептидов) белого пептидного порошка. Чистоту продукта определяли посредством аналитической НРЬС как 100,0%, и наблюдаемый М+Н составлял 946,6 (вычисленный М+Н составлял 946,4).

Пример 3. 8ЕО ГО NО: 5.

1 г (около 1 ммоль) смолы ΡΜРВ ΑΜ (ΈΜΌ [^ПИроге, кат. № 855028) оставляли набухать в 15 мл смеси ^СЕ/ТΜОΡ 1:1. К суспензии смолы добавляли изобутиламин (1,5 мл, 15 ммоль), затем добавляли 3,2 г твердого натрия триацетоксиборгидрида. Суспензию встряхивали в течение ночи. Смолу промывали МеОН, ΌΜΡ и ΌΡΜ и затем ацилировали с помощью Ρтос-^-Α^д(РЬГ)-ОН/^IС (4 экв.) в ΌΡΜ. Смо- 22 029392

лу промывали ΌΜΡ и тестировали на завершенность ацилирования хлоранильным тестом (отрицательный). Смолу разделяли на три равных порции и синтез продолжали в масштабе 0,33 ммоль на синтезаторе ТпЪШе. Использовали одиночные сочетания, опосредованные ΗΒΤυ/ΝΜΜ в ΌΜΡ или ΌΚ,’/ΗΟΒΙ (для Сук) с 5-кратным избытком защищенных Ртос аминокислот. Защитную группу Ртос удаляли посредством нескольких последовательных 2-минутных промывок 20% пиперидином в ΌΜΡ. Для автоматизированного синтеза использовали следующие аминокислотные производные: Ртос-Рго-ОН, РтосСук((СН₂)₃С(О)О!Ви)-ОН, Ртос-Акп(Тг!)-ОН, Ртос-Уа1-ОН, Ртос-ТП-ОН и Вос-Сра-ОН. После сборки целой пептидной последовательности пептид отщепляли от смолы с помощью 20 мл ТРА/Н₂О/Т18 96:2:2 (об./об./об.) в течение 2 ч. Линейный пептид растворяли в 40 мл ΌΜΓ. содержащего 200 мл ΌΙΡΕΑ. Также получали раствор 152 мг (около 0,4 ммоль) НВТи в 5 мл ΌΜΕ. Раствор пептида и активирующий раствор попеременно добавляли к 40 мл интенсивно перемешиваемого ΌΜΕ 10 порциями по 4 мл и 0,5 мл соответственно. рН поддерживали на уровне 9-10 путем добавления неразбавленного ΌΙΡΕΑ. После добавления последней порции активирующего раствора не обнаруживали пика субстрата посредством НРЬС. Реакционную смесь разбавляли 0,1% АсОН до 1 л. Полученный раствор загружали непосредственно на препаративную колонку НРЬС. Соединение очищали путем трех последовательных прогонов в буфере Т.

Фракции с чистотой, превышающей 97%, объединяли и лиофилизировали. Получали 49,0 мг (0,042 ммоль, 12% общий выход, принимая содержание пептида за 90%) белого пептидного порошка. Чистоту продукта определяли посредством аналитической НРЬС как 99,5%, и наблюдаемый М+Н составлял 1045,6 (вычисленный М+Н = 1045,5).

Пример 4. 8ΕΟ ГО NΟ: 9.

0,37 г (около 0,3 ммоль) 1,4-диаминобутан-2-хлортритильной смолы (ΕΜΌ Μ^Шρо^е, кат. № 856085) оставляли набухать в 10 мл ΌΜΕ и смолу помещали в реакционный сосуд для автоматического синтеза. Сборку пептида осуществляли на синтезаторе ТпЪШе. Использовали одиночные сочетания, опосредованные НВТи/ΝΜΜ в ΌΜΓ или Э1С/НОВ1 (для Сук) с 5-кратным избытком аминокислот, защищенных Ртос. Защитные группы Ртос удаляли несколькими последовательными 2-минутными промывками 20% пиперидином в ΌΜΕ. В автоматическом синтезе использовали следующие производные аминокислот: Ртос-Рго-ОН, Ртос-Сук((СН₂)₃С(О)О!Ви)-ОН, Ртос-Акп(Тг!)-ОН, Ртос-Уа1-ОН, Ртос-ТП-ОН и Вос-Туг(!Ви)-ОН. После сборки всей пептидной последовательности пептид отщепляли от смолы с помощью 30 мл НР1Р/ЭСМ 3:7 (об./об.) в течение 2 ч. Смолу фильтровали и растворители выпаривали. Линейный защищенный пептид осаждали с помощью безводного этилового эфира. Осадок декантировали и суспендировали в 20 мл ацетонитрила. Затем к суспензии добавляли 111 мг (0,4 ммоль) Ζ(2-С1)-Οδи и 0,136 мл (0,8 ммоль) И1РЕА. После растворения субстрата растворитель выпаривали и остаток обрабатывали 20 мл коктейля ТРА/Т18/Н₂О 95/2,5/2,5 в течение 1,5 ч. Затем ТРА выпаривали и остаток осаждали диэтиловым эфиром. Неочищенный линейный пептид растворяли в 100 мл ΌΜΕ, содержащего 200 мкл И1РЕА. Затем к интенсивно перемешиваемой реакционной смеси добавляли раствор 120 мг (0,31 ммоль) НВТи в 5 мл ΌΜΕ. По прошествии 30 мин реакционную смесь разбавляли 1 л 0,1% АсОН и полученный раствор загружали на препаративную колонку НРЬС. Циклический пептид быстро элюировали (около 3% ΜеСN/мин) в буферной системе Т. Фракции с чистотой, превышающей 97% согласно аналитической НРЬС, объединяли и лиофилизировали. Лиофилизат обрабатывали 5 мл коктейля ΤΜ§Β^/тиоанизол/ΤΡА (1/1/6, об./об./об.) в течение 1 ч при 0°С. ТРА выпаривали и пептид осаждали этиловым эфиром. Конечный продукт очищали одной прогонкой в буфере Т.

Фракции с чистотой, превышающей 97%, объединяли и лиофилизировали. Получали 77,5 мг (0,079 ммоль, 26% общий выход, принимая содержание пептида за 90%) белого пептидного порошка. Чистоту продукта определяли посредством аналитической НРЬС как 99,6%, и найденный М+Н составлял 886,4 (вычисленный М+Н = 886,4).

Пример 5. §ЕЦ ГО NΟ: 17.

0,43 г (ок. 0,3 ммоль) Н-Агд(РЪР)-О-2-хлортритильной смолы (ΕΜΌ Μ^Шρо^е, кат. № 856067) оставляли набухать в 10 мл ΌΜΕ и смолу помещали в реакционный сосуд для автоматического синтеза. Сборку пептида осуществляли на синтезаторе ТпЪШе. Использовали одиночные сочетания, опосредованные НВТи/ΝΜΜ в ΌΜΕ или Э1С/НОВ1 (для Сук) с 5-кратным избытком аминокислот, защищенных Ртос. Защитную группу Ртос удаляли посредством нескольких последовательных 2-минутных промывок 20% пиперидином в ΌΜΕ. В автоматическом синтезе использовали следующие производные аминокислот: Ртос-Рго-ОН, Ртос-Сук((СН₂)₃С(О)О!Ви)-ОН, Ртос-Акп(Тг!)-ОН, Ртос-Уа1-ОН и Ртос-ТП-ОН. После сборки пептидной последовательности 3-8 вручную сочетали Ртос-Р11е(4-Р1)-ОН с использованием способа И1С/НОВ! с 2-кратным избытком реагентов. Затем группу Ртос заменяли группой Вос путем обработки смолы 20% ΡIΡ/^ΜΡ в течение 30 мин и ацилирования Ν-терминальной амино-функции с помощью Вос₂О в ΌΜΕ. Линейный пептид отщепляли от смолы с помощью 30 мл ΗΡIΡ/^СΜ 3:7 (об./об.) в течение 2 ч. Смолу фильтровали и растворители выпаривали. Линейный защищенный пептид осаждали безводным этиловым эфиром. Осадок декантировали и сушили в вакууме. Получали 450 мг неочищенного защищенного пептида. Общее количество пептида (около 0,3 ммоль) растворяли в 10 мл 1,2дихлорэтана, содержащего 0,5 мл ^ΜΡ и 61 мкл (0,45 ммоль) ΝΜΜ. Раствор охлаждали до 0°С на ледя- 23 029392

ной бане и добавляли 61 мкл (0,45 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин при 0°С. Одной порцией добавляли раствор 160 мг (4,5 ммоль) натрия боргидрида в 5 мл воды. Реакционную смесь разбавляли 200 мл воды и продукт отделяли центрифугированием и сушили в вакууме. Затем продукт обрабатывали 20 мл коктейля ΤΡΑ/ΤΙδ/Η₂Θ 95/2,5/2,5 в течение 1,5 ч. Затем ΤΡΆ выпаривали и остаток осаждали диэтиловым эфиром. Неочищенный линейный пептид растворяли в 80 мл ΌΜΡ, содержащего 200 мкл ΌΙΡΕΑ. Затем к интенсивно перемешиваемой реакционной смеси добавляли раствор 61 мг (0,15 ммоль) ΗΒΤυ в 5 мл ΌΜΡ. По прошествии 30 мин реакционную смесь разбавляли 1 л 0,1% АсОН и полученный раствор загружали на препаративную колонку НРЬС. Циклический пептид очищали двумя последовательными прогонками в буфере Т.

Фракции с чистотой, превышающей 97%, объединяли и лиофилизировали. Получали 41,7 мг (0,039 ммоль, 13% общий, принимая 90% содержание пептида) белого пептидного порошка. Чистоту продукта определяли посредством аналитической НРЬС как 95,1%, и наблюдаемый М+Н составлял 970,6 (вычисленный М+Н = 970,5).

Экспериментальная часть (биологические тесты)

Анализы ίη νίίτο в отношении рецепторов.

Активность в отношении рецептора ν₂.

Активность соединения в качестве агониста в отношении человеческого рецептора ν₂ (ΐν₂Κ) определяли в анализе с транскрипционным геном-репортером путем временного трансфицирования экспрессирующей рецептор ΐν₂ ДНК в ΗΕΚ-293 (клеточная линия почки человеческого эмбиона 293) клетки вместе с репортерной ДНК, содержащей внутриклеточные чувствительные к кальцию промоторные элементы, которые регулируют экспрессию люциферазы светлячка. См. Βο88, V., Ταίραάο. Ό.Ε, МигрЬу, Τ.Ι

1. ΒίοΙ. СЬет. 1996, Мау 3; 271(18), 10429-10432 для дальнейших инструкций по данному анализу. Клетки подвергали действию серийных разбавлений соединений, разбавленных 10-кратно на дозу, в течение 5 ч с последующим лизированием клеток, определением активности люциферазы, а также определением эффективностей соединений и значений ЕС₅₀ путем нелинейной регрессии. Десмопрессин (άΌΑνΡ) использовали в качестве внутреннего контроля в каждом эксперименте. Результаты, полученные для тестированных соединений, показаны в табл. 3.

Активность в отношении рецептора ν^.

Для определения селективности соединения тестировали в анализах, основанных на использовании транскрипционного гена-репортера люциферазы, при экспрессии человеческого рецептора ν_№ (ΐν^Κ). Агонистическую активность соединений в отношении 1Ац,Р определяли в исследовании транскрипционного гена-репортера в клеточной линии Р1р-1п™ 293 (ΗΕΚ-йрш), стабильно трансфицированной для экспрессии 1Ац,Р. Эти клетки временно трансфицировали репортером, чувствительным к ΝΕΑΤэлементам люциферазы (ΝΡΑΤ-Еие). Клетки подвергали серийным разбавлениям соединений, разбавленных 10-кратно на дозу, в течение 5 ч, с последующим лизированием клеток, определением активности люциферазы и определением эффективностей соединений и значениям ЕС₅₀ путем нелинейной регрессии. В каждом эксперименте использовали ΑνΡ в качестве внутреннего контроля. Результаты, полученные для тестированных соединений, показаны в табл. 3.

Почечный клиренс.

Десмопрессин выводится из организма преимущественно почками ("почечный клиренс"). Соединения по изобретению имеют большую степень клиренса через непочечные механизмы. Фармакокинетические эксперименты осуществляли на нефрэктомизированных крысах и фиктивно-оперированных крысах. Непочечный клиренс (СЬпг) определяли у нефрэктомизированных крыс, и общий клиренс определяли у фиктивно-оперированных крыс (СЬзЬат). % непочечного клиренса вычисляли как (СЕпг/СЬкЬат) х 100.

Для фармакокинетических исследований взрослых самцов крыс Зргадие Оа\\1еу катетеризировали в яремную вену (для введения соединения) и сонную артерию (для сбора крови). Раствор, содержащий несколько соединений (кассетная дозировка), инъецировали в катетер в яремной вене (0,1 мг ΡΒ/мл каждого соединения, 0,3 мл/животное; номинальная доза 0,1 мг ΕΒ/кг/соединение). Образцы крови отбирали через 2, 6, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 мин после введения с использованием автоматической системы забора крови 1п81ееЬ ЬаЪога1ог1е8 Αиΐοтаΐеά Β1οοά 8атр1шд υηίΐ 2ηά депегайоп (ΑΒ82). Из цельной крови получали плазму с использованием Κ2ΕΌΤΑ в качестве антикоагулянта. Последующий биоанализ образцов включал экстрагирование соединений и определение концентрации в плазме с использованием стандартных способов ЬС/Μδ. Концентрацию аналита вычисляли, исходя из площадей пиков и калибровочных кривых. Параметры ΡΚ получали путем наилучшей аппроксимации профиля соединения концентрация-время для каждого животного посредством модельно-независимого способа анализа с использованием программного обеспечения ΑΙΝΝΘΝΕΙΝ™ ν6.3 (РЬагадЫ Сο^рο^аΐ^οη).

Антидиурез.

Соединения тестировали на антидиуретическую активность на крысиной модели. Вкратце, катетеризованных нормоволемических крыс Зргадие Оа\\1еу помещали в метаболические клетки. Каждую метаболическую клетку настраивали на непрерывное измерение спонтанного мочеиспускания посредством датчиков усилия, размещенных над емкостями для сбора мочи, с целью контроля и регистрирования хо- 24 029392

да отклика мочеиспускания с использованием программного обеспечения ΝΟΤΟΟΟΕΌ™. Крысы получали внутривенную инфузию тестируемого соединения или носителя в течение 3 ч посредством шприцевого насоса и методом шарнирного соединения. Данные для мочеиспускания собирали в ходе введения соединения (0-3 ч) и собирали в течение 5 ч после введения. В некоторых случаях также определяли осмоляльность мочи. Соединения по изобретению демонстрировали антидиуретическую активность.

Фармацевтические композиции.

Также предложено применение соединения формулы (I), как определено в данной заявке, в качестве лекарственного средства. Кроме того, предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), как определено в данной заявке, в качестве активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.

Фармацевтическая композиция может быть приспособлена для различных путей введения, включая, например, пероральный и назальный пути. Так, композиция может находиться, например, в форме таблеток, капсул, порошков, микрочастиц, гранул, сиропов, суспензий и растворов.

Фармацевтическая композиция возможно может содержать, например, по меньшей мере одну другую добавку, выбранную из разрыхлителя, связующего, смазывающего вещества, вкусоароматического вещества, консерванта, красителя и любой их смеси. Примеры таких и других добавок можно найти в 'НапбЬоок о£ РйагшасеиЕса1 Ехс1р1еп1§'; Еб. А.Н. К1ЪЪе, 3^гб Еб., Ашепсап Рйагшасеибса1 Аззосхабоп, И8А апб Рйагшасеибса1 Ргезз ϋΚ, 2000.

Способы лечения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения, как обозначено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза и никтурии. Кроме того, предложены способы лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза и никтурии. Как использовано в данной заявке, термин "лечение" обозначает облегчение симптомов, отсрочку начала заболевания и/или излечение заболевания, когда соединение по изобретению вводят в подходящей дозе.

Типичная доза соединений согласно настоящему изобретению варьируется в широком диапазоне и будет зависеть от различных факторов, таких как индивидуальные потребности каждого пациента и путь введения. Указанная доза может быть введена один раз в сутки или чаще, чем один раз в сутки, например, в виде дробных доз. Врач обычной квалификации в данной области сможет легко оптимизировать дозу в зависимости от ситуации.

Все публикации и патентные заявки, ссылки на которые приведены в настоящем описании изобретения, включены в данную заявку посредством ссылки, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было конкретно и индивидуально указано, что она включена посредством ссылки.

Хотя вышеизложенное изобретение было описано более детально посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, в свете принципов изобретения обычному специалисту в данной области будет очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть сделаны в нем без отступления от смысла или объема прилагаемой формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы I

или его фармацевтически приемлемая соль, где

К² представляет собой Н, С₁-С₄алкил, галоген, -ОН или -О-С₁-С₄алкил;

К³ представляет собой Н, или -СН₂-ОН, или -Ο(Ο)-ΝΚ⁵Κ⁶;

К⁴ представляет собой Н или -Ο(=ΝΗ)-ΝΗ₂;

К⁵ и К⁶ независимо представляют собой Н, С₁-С₆алкил, -СН₂-циклопропил, -циклопропил или арилС₁-С₁₂алкил, где арил представляет собой фенил или тиенил, при условии, что К⁵ и К⁶ оба не явля- 25 029392

ются Н;

X и Υ независимо представляют собой -СН₂- или -δ- при условии, что если X представляет собой -СН₂-, то Υ не является -СН₂-;

Ζ представляет собой -СНК⁷- или δ;

К⁷ представляет собой Н или С_гС₄алкил, галоген, -ОН или -О-С_гС₄алкил;

К⁸ представляет собой Н или -СН₃;

Аг представляет собой ароматическое гетероциклическое пяти- или шестичленное кольцо, возможно замещенное одним С_гС₄алкилом, галогеном, -ОН или группой -О-С_гС₄алкил, или фенил, возможно замещенный одним С₁-С₄алкилом, галогеном, -ОН или группой -О-С_гС₄алкил.
2. Соединение по п.1, где К₅ и К₆ независимо представляют собой Н, С_гС₆алкил или арилС_гС₁₂алкил.
3. Соединение по п.1, где только один из X и Υ представляет собой -δ- или X и Υ оба представляют собой -δ-.
4. Соединение по п.1, где X представляет собой -СН₂-.
5. Соединение по любому из пп.1-4, где Аг представляет собой тиофен.
6. Соединение по любому из пп.1-5, где К⁸ представляет собой -СН₃.
7. Соединение по любому из пп.1-6, где К³ представляет собой -С(О)-ХК⁵К⁶.
8. Соединение по любому из пп.1-7, где К⁵ представляет собой Н и К⁶ представляет собой С₁С4алкил.
9. Соединение по любому из пп.1-7, где К⁵ и К⁶ оба представляют собой -СН₂СН₃.
10. Соединение по любому из пп.1-9, где К² представляет собой галоген.
11. Соединение по п.10, где К² представляет собой -С1 или -Р.
12. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 5

соединение 10

соединение 13

- 26 029392

соединение 14

соединение 21

о

или соединение 33
13. Соединение по п.1

- 27 029392
14. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 10
15. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 13
16. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 14

- 28 029392
17. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 21
18. Соединение по п.1, представляющее собой соединение 33
19. Способ лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза или никтурии, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-18 пациенту, нуждающемуся в этом.
20. Применение любого из соединений по пп.1-18 для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза или никтурии.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-18, для использования в лечении несахарного диабета, первичного ночного энуреза или никтурии.
22. Применение соединения по любому из пп.1-18 в изготовлении лекарственного средства для лечения несахарного диабета, первичного ночного энуреза или никтурии.