JP2003534240A

JP2003534240A - 強力な選択的メラノコルチン−４受容体アンタゴニストとなる環状ペプチド

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Publication number: JP2003534240A
Application number: JP2001552927A
Authority: JP
Inventors: ベドナレク，マリア・エイ
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2000-01-18
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2003-11-18
Also published as: WO2001052880A1; AU2001229491A1; US20020016291A1; EP1251865A1; US6693165B2; CA2396307A1

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）の環状ペプチドは、メラノコルチン−４受容体の強力な選択的アンタゴニストであり、従って、ＭＣ−４受容体の生理作用を判定する研究用ツールとして有用であり、また、ＭＣ−４受容体が介在する障害または疾患を診断、治療または予防するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】メラノコルチンペプチドまたはメラノトロピン、α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ
−ＭＳＨ及びＡＣＴＨは脊椎動物、哺乳動物及びヒトの体内で多くの生理作用に
関与している。これらは、皮膚の色素沈着及びステロイド産生を調節し、免疫反
応及び学習プロセスを変調し、エネルギーバランス、神経の成長と再生及びその
他の幾つかの作用に関与する。

【０００２】ヒトではメラノトロピンと相互作用する５種類の受容体ｈＭＣ−１ＲからｈＭ
Ｃ−５Ｒまでが公知である。これらの受容体は７ヘリックスの膜貫通型受容体で
あり、Ｇタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに所属する。これらが活性
化されるとｃＡＭＰが増加する。メラノコルチン受容体１，３、４及び５はα−
ＭＳＨ、β−ＭＳＨ及びγ−ＭＳＨを認識するが、メラノコルチン受容体２はＡ
ＣＴＨだけを認識する。

【０００３】最近では、中枢神経系で広範に発現されるメラノコルチン受容体３及び４が主
として注目され、また、脳及び種々の末梢組織に見出されるメラノコルチン受容
体５も注目されるようになった。ｈＭＣ−３Ｒ及びｈＭＣ−５Ｒの生理作用は十
分には確定されていないが、ｈＭＣ−５Ｒが外分泌腺による脂質及びフェロモン
の産生のコントロールに関与することが最近になって判明した。急激に増加して
いる薬理学的及び遺伝的な証拠は、ｈＭＣ−４Ｒが齧歯類のエネルギーバランス
及び体重の調節に関与することを示唆する。摂食及び体重の調節におけるＭＣ−
４Ｒの役割はラットのアゴニスト／アンタゴニスト投与及びマウスの遺伝学から
得られた結果によって確認される。アゴニストＭＴＩＩの脳室内投与は食物摂取
量を減少させ、逆にアンタゴニストＳＨＵ９１１９は食物摂取量及び体重を増加
させた。メラノコルチン受容体４が遺伝的に欠失したマウスは肥満になる。従っ
て、ＭＣ−４Ｒに活性の化合物は摂食障害の治療に有効であろうと予測された。

【０００４】メラノコルチン受容体４はまた、別の生理作用、即ち、グルーミング行動、勃
起及び血圧のコントロールにも１つの役割を果たすと考えられる。しかしながら
、天然ホルモンであるメラノトロピンはｈＭＣ３−５Ｒに対する親和性が比較的
小さく、また特に選択的ではない。メラノコルチン受容体４の生理作用を脳内の
別のメラノコルチン受容体、特にＭＣ−３Ｒの生理作用から識別するためには、
強力な選択的アンタゴニストが必要である。現在利用できる合成リガンドは複数
のメラノコルチン受容体を互いに識別できない。頻繁に使用される研究用ツール
はＳＨＵ９１１９ペプチドであり、これは、メラノコルチン受容体３及び４の強
力なアンタゴニストでメラノコルチン受容体５のアゴニストである。ＳＨＵ９１
１９はｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで広汎に研究された。このペプチド
の注入はラットの摂食を刺激する。同様のラクタム誘導体であるペプチドＭＴＩ
ＩはｈＭＣ３−５Ｒの強力なアゴニストであるが選択的でない。

【０００５】最近では、ジスルフィド架橋によって環化される幾つかのペプチドがＭＣ−３
％及びＭＣ−４Ｒのα−ＭＳＨレスポンスのアンタゴニストであり、最も強力な
ＭＣ−４Ｒ選択的アンタゴニストがＨＳ０１４、ＨＳ０２４及びＨＳ０２８であ
ると報告された。ＨＳ０１４及びＨＳ０２８はメラノコルチン受容体１及び５の
部分的アゴニストであるが、ＨＳ０２４は同じ受容体のアンタゴニストである。
ラット体内でこれらのアンタゴニストは食物摂取量及び体重を増加させる。ＳＨ
Ｕ９１１９、ＨＳ０１４、ＨＳ０２４及びＨＳ０２８はＭＣ−４Ｒの強力なアン
タゴニストであるが、その他のＭＣ受容体に比べてＭＣ−４Ｒに対して十分に選
択的ではない。従って、ＭＣ−４受容体の生理作用を別のメラノコルチン受容体
の生理作用から識別できるように強力なＭＣ−４Ｒ選択的アンタゴニストが依然
として必要とされている。このような選択的アンタゴニストはまた、ＭＣ−４受
容体が介在する疾患及び障害、より特定的には、何らかの理由によるヒトの体重
減少、悪液質または食欲不振に関連する摂食障害を診断、治療または予防するた
めの医薬として有用であろう。

【０００６】（発明の概要）本発明は、ヒトのメラノコルチン−４受容体の強力な選択的アンタゴニストで
ある環状ペプチドを提供する。これらの化合物は、ＭＣ−４受容体の生理作用を
判定する研究用ツールとして有用であり、また、ＭＣ−４受容体が介在する障害
または疾患を診断、治療または予防するために有用である。

【０００７】（詳細な説明）本発明は、式Ｉ：

【０００８】

【化３】〔式中、Ｄはアミノ酸がＤ−アミノ酸であることを表し、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは独立に０または１であり、但し、ｐが１のときはｑが
１であるかまたはｎ＋ｍが１であり、ｐが０のときはｑが０でｍ及びｎの各々が
１であり、ｓは１−４の整数であり、Ｒ^１及びＲ^２の各々は水素であるか、または、Ｒ^１とＲ^２とが一緒にメチレン
を表すか、または、Ｒ^１とＲ^２とが一緒に結合を表し、Ｒ^３は、Ｈ、Ａｃ、ＮｌｅまたはＮ−Ａｃ−Ｎｌｅを表し、但し、Ｒ^３がＮ−
Ａｃ−Ｎｌｅのとき、ｒは０であり、Ｒ^４は、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２または４−イミダゾリルを表し、Ｒ^５は、１−もしくは２−ナフチル、３−ベンゾチエニル、または、ハロゲン
、Ｃ_１−４アルキル及びＣ_１−４アルコキシから選択された基で置換されていて
もよいフェニルから選択され、Ｒ^６は、−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２また
は−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２から選択され、Ｒ^７は、３−インドリル、１−もしくは２−ナフチルを表すか、または、ハロ
ゲンで置換されていてもよいフェニルを表す〕を有している化合物またはその塩
を提供する。

【０００９】式Ｉの１つの実施態様では、ｒが０である。別の実施態様では、ｐ及びｑの各
々が０である。また別の実施態様では、ｓが３または４である。好ましい実施態
様では、ｒ、ｐ及びｑの各々が０であり、ｓが３または４であり、ｍ＋ｎが２で
ある。

【００１０】式Ｉのいま１つの実施態様では、Ｒ^１及びＲ^２の各々が水素である。

【００１１】式Ｉの別の実施態様では、Ｒ^５が、２−ナフチル、ベンゾチエニル及び４−置
換フェニルから選択され、該置換基は、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ
またはハロゲンである。この実施態様のサブセットでは、Ｒ^５が、２−ナフチル
及び４−置換フェニルから選択され、該置換基はｔ−ブチル、メトキシ、クロロ
、ヨードまたはフルオロである。

【００１２】式Ｉのまた別の実施態様では、Ｒ^６が、 −（ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である。

【００１３】式Ｉの別の実施態様では、Ｒ^７が３−インドリル、２−ナフチル及び４−ハロ
フェニルから選択される。この実施態様の１つのサブセットは、Ｒ^７が３−イン
ドリルを表す化合物を提供する。

【００１４】式Ｉａ：

【００１５】

【化４】〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びｓは式Ｉの定義と同義であり、Ｒ^５は、２−ナフチル、ベンゾチエニル及び４−置換フェニルから選択され、
該置換基はＣ_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシまたはハロゲンであり、Ｒ^７は、３−インドリル、２−ナフチルまたは４−ハロフェニルを表す〕の化
合物は式Ｉのサブセットを表す。

【００１６】本文中で使用されたＡｃはアセチル、Ａｒｇはアルギニン、Ｈｉｓはヒスチジ
ン、Ｄ−（２′）−ＮａｌはＤ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｎｌｅはノル
ロイシン、Ｔｒｐはトリプトファンである。他に特定されない限り、式Ｉのアミ
ノ酸成分はＬ−アミノ酸である。

【００１７】本発明の化合物はメラノコルチン−４受容体の強力な選択的アンタゴニストで
あり、従って、メラノコルチン−４受容体の生理作用を研究する分析研究用サブ
セットとして有用である。更に、本発明の化合物は、ＭＣ−４受容体の遮断によ
って好転し得る疾患及び障害、特に摂食障害を診断、治療及び予防するために有
用である。

【００１８】本発明化合物は放射性ラベルを含む放射性形態で分析目的及び診断目的に使用
できる。より特定的には本発明の化合物は、放射性ヨウ素もしくはトリチウムま
たは別の任意の適当な放射性核種を取り込むように製造され得る。このような放
射性標識化合物は、特異的メラノコルチン受容体を定量するため、メラノコルチ
ン受容体の特定サブタイプと競合する薬剤の解離定数（ＫｉまたはＫｄ）を分析
するため、及び、例えば受容体オートラジオグラフィー技術の使用による組織及
び組織切片中のＭＣ−受容体の所在を検出するためのラジオリガンド結合に使用
し得る。ラジオリガンド結合及び受容体オートラジオグラフィーの原理は当業界
で公知である。代替的には、物質を検出し得る任意の別種ラベル、例えば蛍光ラ
ベルまたはビオチンによって化合物を標識し、得られた化合物を放射性標識化合
物として同様の目的に使用してもよい。

【００１９】本発明の化合物はまた、光、特にＵＶ光によって活性化され得る基を取り込む
ように製造できる。このような活性化の目的は光親和性標識技術を使用してＭＣ
−受容体の共有結合標識に有効な化合物を得ることである。光親和性標識は当業
界で公知の技術であり、本発明においてはＭＣ−受容体の構造及びトポロジカル
な編成を解明するために有用である。本発明化合物のこのような光活性誘導体も
本発明の一部を構成する。更にまた、本発明化合物の好ましくは光活性の誘導体
は、容易に検出できる基またはラベル、例えば放射性原子、蛍光発生基及び／ま
たはビオチンを取り込むように製造してもよい。

【００２０】本発明化合物は、（１種または複数の）ガンマ及び／またはポジトロン放出ア
イソトープによって標識できる。このような標識化合物は本発明の極めて特異な
実施態様であり、動物好ましくはヒトに全身的または局所的に投与され得る。こ
れらの標識化合物は公知技術を使用することによってＭＣ−受容体のｉｎｖｉ
ｖｏレベル及び／または所在を造影するために有用である。公知技術としては、
シンチグラフィー、ポジトロン放出トモグラフィー（ＰＥＴ）及び単一フォトン
放出コンピュータトモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）がある。このような方法を使用
して、検査対象である動物またはヒトの組織中の特異的ＭＣ−受容体の分布及び
／または量に関する情報が得られる。このような情報が、疾患、特にＭＣ−受容
体に関する脳内の機能障害を診断するために有効である。

【００２１】分析及び診断という用途に加えて、本発明のペプチドはまた、天然メラノトロ
ピン（例えば、アルファ−ＭＳＨ）に対する細胞の正常な生理的応答をＭＣ−４
受容体で遮断するために使用され得る。従って、本発明の化合物は、発熱、疼痛
、慢性の炎症性疾患、または、アルツハイマー病及び神経変性のような特に高齢
者の記憶障害、または、緊張性障害及び癲癇のような精神医学的障害の病的精神
運動機能の予防及び／または治療に有用であろう。

【００２２】本発明の１つの目的は、有効量の式Ｉの化合物を治療を要するヒトに投与する
ことから成る何らかの原因によるヒトの体重減少、悪液質、食欲不振または貪食
症の治療方法を提供することである。これらの障害では、本発明の化合物が食物
摂取量を増加させ、これによって患者の全身状態が改善され、体重が増加または
回復し、寿命が延長する。本発明化合物の投与は特に、高齢患者、癌患者及びの
化学療法で治療中の癌患者に有効である。これらの患者はしばしば食欲不振に陥
り、食物摂取量が減少して体重が著しく減少する。

【００２３】本発明の別の目的は、有効量の式Ｉの化合物を動物に投与することから成る動
物の成長促進方法を提供することである。家禽、養豚及び畜牛のような食肉用動
物の飼育には成長促進が特に要望される。

【００２４】本発明の別の目的は、式Ｉの化合物と医薬として許容される担体とから成る医
薬組成物を提供することである。本発明の医薬組成物は、有効成分として式Ｉの
化合物または医薬として許容されるその塩を含有しており、更に、医薬として許
容される任意の担体及び場合によってはその他の治療用成分を含有している。“
医薬として許容される担体”という用語は、無機の塩基もしくは酸または有機の
塩基もしくは酸を包含する医薬として許容される無毒性の塩基または酸から製造
された塩を意味する。

【００２５】組成物は、経口、直腸内、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内など）、眼
内（眼薬）、肺内（鼻腔内または口腔内吸入）、または、鼻腔内投与に適した組
成物を包含する。但し、所与の場合に最適の経路は、治療される障害の種類及び
重篤度並びに有効成分の種類に依存する。組成物は投薬単位の形態を有している
のが便利であり、製薬業界で公知の方法のいずれかによって調製され得る。

【００２６】実際に使用するためには、有効成分となる式Ｉの化合物を慣用の医薬配合技術
に従って医薬担体と混合する。担体は、経口または非経口（静脈内を含む）のよ
うな投与に望ましい調製物の形態次第で多様な形態を有し得る。組成物を経口剤
形に調製する場合、例えば懸濁液剤、エリキシル剤及び溶液剤のような液体経口
調製物の場合には例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、
着色剤などのような常用の医薬担体のいずれかを使用でき、例えば散剤、硬カプ
セル剤、軟カプセル剤及び錠剤のような固体経口調製物の場合には、デンプン、
糖もしくは微晶質セルロースなどの担体、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩
壊剤などを任意に使用できる。液体調製物よりも固体経口調製物のほうが好まし
い。

【００２７】投与が容易であるという理由で、錠剤及びカプセル剤が最も有利な経口投薬単
位の形態であり、この場合には明らかに固体医薬担体が使用される。所望の場合
、錠剤を水性または非水性の標準技術によってコーティングし得る。このような
組成物及び調製物は少なくとも０．１％の活性化合物を含有している。これらの
組成物中の活性化合物のパーセンテージは勿論増減可能であり、単位量の約２重
量％−約６０重量％の範囲が好適である。このような治療有効組成物中の活性化
合物の量は、有効な投薬量が得られるような量である。活性化合物はまた、例え
ば液滴剤またはスプレーの形態で鼻腔内投与されてもよい。

【００２８】錠剤、丸剤、カプセル剤などは更に、トラガカントゴム、アラビアゴム、コー
ンスターチまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムのような賦形剤
、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸のような崩壊剤、ステアリ
ン酸マグネシウムのような滑沢剤、スクロース、ラクトースまたはサッカリンの
ような甘味剤を含有し得る。投薬単位の形態がカプセルであるとき、該カプセル
は上記種類の物質に加えて、脂肪油のような液体担体を含有し得る。

【００２９】コーティングとしてまたは投薬単位の物理的形態を変更するために種々の別の
物質が存在してもよい。例えば、錠剤をシェラック、糖または双方によってコー
ティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、有効成分に加えて、甘味
剤としてスクロース、保存剤としてメチル及びプロピルパラベン、色素、チェリ
ーもしくはオレンジフレーバーのような香味剤を含有し得る。

【００３０】また、式Ｉの化合物を非経口投与してもよい。これらの活性化合物の溶液また
は懸濁液はヒドロキシ−プロピルセルロースのような界面活性剤と適宜混合した
水中で調製できる。分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそ
れらの油中混合物中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下ではこれらの調
製物が微生物の繁殖を防止する保存剤を含有している。

【００３１】注射用の適当な医薬形態としては、無菌の水溶液または水性懸濁液及び無菌の
注射用溶液または懸濁液を用時調製し得る無菌粉末がある。いずれの場合にも、
この形態には、無菌であること、及び、注射容易性が維持される程度に流動性で
あることが要求される。この形態は、製造及び保存の条件下で安定であり、細菌
類及び真菌類のような微生物の汚染作用から防御されていなければならない。担
体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン
グリコール及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適当な混合物及び植物
油を含む溶媒または分散媒体でよい。

【００３２】薬理学的に有効な量は体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ／日／ｋｇ−１，００
０ｍｇ／日／ｋｇの範囲である。有効用量の本発明化合物を哺乳動物、特にヒト
に与えるために任意の適当な投与経路を使用し得る。例えば、経口、直腸内、局
所、非経口、眼内、肺内、鼻腔内などの投与を使用し得る。剤形としては、錠剤
、トローチ剤、分散液剤、懸濁液剤、溶液剤、カプセル剤、クリーム、軟膏、エ
アゾールなどがある。好ましくは式Ｉの化合物を経口投与する。使用される有効
成分の有効用量は、使用される特定化合物、投与方式、治療される障害、治療さ
れる障害の重篤度次第で増減される。このような投薬量は当業者が容易に確認し
得る。

【００３３】以下の実施例は本発明の代表例であるが、本発明がこれらの実施例に全く限定
されないことを理解されたい。

【００３４】実施例１−１１環状ペプチドの合成ｐ−メトキシベンズヒドリルアミン樹脂上のペプチジル鎖の延長は４３１Ａ
ＡＢＩペプチドシンセサイザーで行った。製造業者から提供されたプロトコルを
応用して、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）のアミノ酸のヒドロキシベンゾトリ
アゾールエステルを結合させた。ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）
基を半永久的アルファ−アミノ保護基として使用したが、側鎖保護基は、アルギ
ニンにはトシル、ヒスチジンにはベンジルオキシメチル、リシンにはフルオレニ
ルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アスパラギン酸にはフルエレニルメチ
ル（Ｆｍ）であった。シンセサイザーによる鎖の形成は、Ｎ−末端残基のアセチ
ル化によって終了した。ペプチジル樹脂を容器に移し、ＮＭＰ中の２０％ピペリ
ジンによって手動操作でＦｍｏｃ基及びＦｍ基を除去した（室温で２０分間）。

【００３５】環化のためには、ペプチジル樹脂を十分に洗浄し、次いでＮＭＰ中の５倍の過
剰量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｃ）及び６倍の過剰量のジイソプロ
ピルエチル−アミンと共に一夜撹拌した。Ｋａｉｓｅｒ試験で陰性が観察される
まで処理手順を繰り返した。ペプチジル樹脂をＮＭＰ及びメタノールで洗浄し、
乾燥し、スカベンジャーとしてアニソール（またはｐ−クレゾール）の存在下の
液体フッ化水素（９：１容量／容量％）を使用して処理した。０℃で１時間維持
した後、真空下でフッ化水素を除去し、樹脂をエーテルで洗浄し、氷酢酸で抽出
し、抽出物を凍結乾燥した。未精製のペプチドを、全自動Ｗｉｓｐ７１２イン
ゼクター及び９９１ホトダイオードアレイデテクタの付いたＷａｔｅｒｓ６０
０Ｅシステムに接続したＣ１８Ｖｙｄａｃカラム上の分析用逆相高圧液体クロ
マトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）によって分析した。３０分で０−１００％バ
ッファＡの標準勾配系（Ｇ１）、及び、３０分で２０−８０％バッファＢの勾配
系を分析に使用した。バッファＡは水中に０．１％のトリフルオロ酢酸であり、
バッファＢはアセトニトリル中に０．１％のトリフルオロ酢酸であった。ＨＰＬ
Ｃプロフィルを２１０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。半分取Ｃ１８ＲＰＷ
ａｔｅｒｓカラムの付いたＷａｔｅｒｓＤｅｌａｔａＰｒｅｐ４００００
システムで分取的分離を行った。水及びアセトニトリルの上記溶媒系を６０分で
２０−８０％のバッファＢ（Ｇ３）の勾配で分離に使用した。

【００３６】幾つかの化合物［式Ｉ、式中のｍ＝ｎ＝１、ｐ＝ｑ＝０］の場合、ペプチジル
樹脂を容器に移し、Ｎ−メチルピロリドン中の６倍の過剰量の無水コハク酸及び
６倍の過剰量のジイソプロピルエチルアミンと共に、Ｋａｉｓｅｒ試験で陰性が
観察されるまで撹拌し、次いでＮ−メチルピロリドン及びメタノールによって十
分に洗浄した。その後、Ｆｍｏｃ基の除去、環化、脱保護、樹脂からのペプチド
開裂、粗生成物の精製を上記同様に行った。

【００３７】クロマトグラフィー的に均質の化合物をアミノ酸解析及びエレクトロスプレー
質量分析法によって分析した。正確な質量をエレクトロスプレー質量分析法（Ｈ
ｅｗｌｅｔＰａｃｋａｒｄシリーズＭＳＤ質量分析計）によって同定した。上
記の全体手順で製造された化合物の例及びそれらの分析データを表１及び表２に
示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】

【表４】

【００４０】実施例２５競合的結合アッセイ本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を受容体結合アッセイで評価した。未精
製の膜調製物はヒトのＭＣ３、ＭＣ４及びＭＣ５受容体を発現しているチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞から得られた。ＣａＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２の欠失した
リン酸塩緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ，ＵＳＡ）で細胞を洗浄し、次いで酵素非含有解
離媒体（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ，Ｌａｖｅｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ．ＵＳ
Ａ）で単離した。細胞を２８００×ｇで１０分間ペレット化し、５μｇ／ｍｌの
ロイペプチン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン及
び２５μｇ／ｍｌのペファブロック（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
）を加えた膜バッファ（２０ｍＭのトリス，ｐＨ７．２、５ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸）に再浮遊させた。低速ガラスホモジナイザー中のモーター駆動テフ
ロン（登録商標）被覆乳棒を使用して１０ストロークで細胞を再浮遊させた。得
られた細胞浮遊液を４℃、４１００×ｇで２０分間遠心した。プロテアーゼイン
ヒビターを加えた新しい膜バッファにペレットを再浮遊させ、アリコートに分け
、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。得られた未精製の膜を滴定し
て結合試験に必要な最適レベルを決定した。

【００４１】結合反応物（総容量＝２５０μｌ）はＭＢＢ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．２
、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＣｌ_２）、０．１％のウシ血清アルブミン
、ヒトのＭＣ３、ＭＣ４またはＭＣ５受容体を発現している細胞から調製した未
精製膜、２００ｐＭの［１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，
ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｓ，ＩＬ，ＵＳＡ）及びジメチルスルホキシド
に溶解した漸増濃度の未標識被験化合物（最終濃度＝２％）を含んでいた。反応
物を振盪しないで１時間インキュベートし、次いで９６−ウェルのフィルタープ
レート（Ｐａｃｋａｒｄ）で濾過し、１％のポリエチレンイミンに予浸した。フ
ィルターをＴＮＥバッファ（５０ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、５ｍＭのエチレン
ジアミン四酢酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で３回洗浄し、乾燥し、Ｔｏｐｃｏｕ
ｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）中でＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ
−２０を使用してカウントした。２μｍの未標識ＮＤＰ−α−ＭＳＨ（Ｐｅｎｉ
ｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で非特異的結合を測定した。
結合データをＧｒａｐｈＰａｄ曲線適合ソフトウェア（ＰＲＩＳＭ，ＳａｎＤ
ｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析し、以下の表に示す。独立の３つの実
験によって活性ペプチドを評価した。

【００４２】

【表５】

【００４３】実施例２６ｃＡＭＰアッセイヒトのメラノコルチン受容体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞
をカルシウム−及びマグネシウム−非含有のＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）で洗浄し、酵素非含有解離バッファ（Ｓ−０１４−Ｂ，Ｓｐｅｃｉ
ａｌｔｙＭｅｄｉａ）と共に５分間インキュベーションすることによって組織
培養瓶から単離した。細胞を遠心によって収集し、１０ｍＭの４−（２−ヒドロ
キシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）バッファ，ｐＨ
７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのグルタミン及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清
アルブミンを加えたアールの平衡塩類溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）に１−５×１０^６細胞／ｍｌの濃度に再浮遊させた。その後、細胞をカウン
トし、細胞浮遊液をホスホジエステラーゼ阻害剤である３−イソブチル−１−メ
チルキサンチン（０．６ｍＭ以下の濃度）で処理した。

【００４４】被験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１０^−３−１０^−８Ｍ）に溶
解し、バッファで希釈し、０．１容の溶液を０．９容の細胞浮遊液（１−５×１
０^５細胞）に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。室温で４５分間維
持した後、１００℃で５分間インキュベーションすることによって細胞を溶解し
、蓄積されたｃＡＭＰを遊離させた。Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）のｃＡＭＰ検出用アッセイキット（ＲＰＡ５５６）によ
って細胞溶解液のアリコート中のｃＡＭＰの蓄積を測定した。被験化合物に応じ
て産生されたｃＡＭＰの量を、１００％アゴニストであると定義されたα−ＭＳ
Ｈに応じて産生されたｃＡＭＰの量に比較した。全部の活性ペプチドを独立の３
つの実験で特性決定した。

【００４５】機能性アンタゴニズムを検定するために、被験化合物の非存在下及び幾つかの
濃度の被験化合物の存在下のα−ＭＳＨ用量−応答曲線を作成し、ｃＡＭＰを測
定した。α−ＭＳＨ添加の１５分前に被験化合物をプレインキュベートした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/54 7/54 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA07 BA01 BA09 BA10 BA16 BA28 CA59 DC50 MA01 NA14 ZA051 ZA061 ZA081 ZA151 ZA161 ZA661 ZB111 ZB261 ZC202 ZC422 ZC541 4H045 AA10 AA30 BA13 BA14 BA31 EA20 FA34 FA58 FA59 FA60 FA61 GA01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉ：【化１】〔式中、Ｄはアミノ酸がＤ−アミノ酸であることを表し、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは独立に０または１であり、但し、ｐが１のときはｑが
１であるかまたはｎ＋ｍが１であり、ｐが０のときはｑが０でｍ及びｎの各々が
１であり、ｓは１−４の整数であり、Ｒ^１及びＲ^２の各々は水素であるか、または、Ｒ^１とＲ^２とが一緒にメチレン
を表すか、または、Ｒ^１とＲ^２とが一緒に結合を表し、Ｒ^３は、Ｈ、Ａｃ、ＮｌｅまたはＮ−Ａｃ−Ｎｌｅを表し、但し、Ｒ^３がＮ−
Ａｃ−Ｎｌｅのとき、ｒは０であり、Ｒ^４は、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２または４−イミダゾリルを表し、Ｒ^５は、１−もしくは２−ナフチル、３−ベンゾチエニル、または、ハロゲン
、Ｃ_１−４アルキル及びＣ_１−４アルコキシから選択された基で置換されていて
もよいフェニルから選択され、Ｒ^６は、−（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２また
は−（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２から選択され、Ｒ^７は、３−インドリル、１−もしくは２−ナフチルを表すか、または、ハロ
ゲンで置換されていてもよいフェニルを表す〕を有している化合物またはその塩
。
【請求項２】ｒが０であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】ｐ及びｑの各々が０であることを特徴とする請求項１に記載
の化合物。
【請求項４】ｓが３または４であることを特徴とする請求項１に記載の化
合物。
【請求項５】ｒ、ｐ及びｑの各々が０であり、ｓが３または４であり、ｍ
＋ｎが２であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項６】Ｒ^１及びＲ^２の各々が水素であることを特徴とする請求項１
に記載の化合物。
【請求項７】式Ｉａ：【化２】〔式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びｓは請求項１の定義と同義であり、Ｒ^５は、２−ナフチル、ベンゾチエニル、及び、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシもしくはハロゲンで置換されていてもよい４−置換フェニルから選択
され、Ｒ^７は、３−インドリル、２−ナフチルまたは４−ハロフェニルを表す〕を有
している請求項１に記載の化合物。
【請求項８】【表１】から成るグループから選択された請求項１に記載の化合物。
【請求項９】【表２】から成るグループから選択された請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】薬理学的に有効な量の請求項１に記載の化合物をヒトに投
与することから成るヒトの悪液質、食欲不振または貪食症の予防または治療方法
。
【請求項１１】薬理学的に有効な量の請求項１に記載の化合物を動物に投
与することから成る動物の成長促進方法。
【請求項１２】請求項１に記載の化合物と医薬として許容される担体とか
ら成る医薬組成物。