EA028341B1 - Способ определения активности протеолитического фермента (варианты), устройство для его реализации и способ диагностики - Google Patents

Способ определения активности протеолитического фермента (варианты), устройство для его реализации и способ диагностики Download PDF

Info

Publication number
EA028341B1
EA028341B1 EA201400156A EA201400156A EA028341B1 EA 028341 B1 EA028341 B1 EA 028341B1 EA 201400156 A EA201400156 A EA 201400156A EA 201400156 A EA201400156 A EA 201400156A EA 028341 B1 EA028341 B1 EA 028341B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sample
proteolytic enzyme
distribution
label
spatial
Prior art date
Application number
EA201400156A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201400156A1 (ru
Inventor
Фазоил Иноятович АТАУЛЛАХАНОВ
Наталья Михайловна ДАШКЕВИЧ
Михаил Владимирович ОВАНЕСОВ
Василий Иванович САРБАШ
Михаил Александрович ПАНТЕЛЕЕВ
Сергей Сергеевич КАРАМЗИН
Андрей Юрьевич КОНДРАТОВИЧ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ГемаКор Лабс" (ООО "ГемаКор Лабс")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ГемаКор Лабс" (ООО "ГемаКор Лабс") filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ГемаКор Лабс" (ООО "ГемаКор Лабс")
Publication of EA201400156A1 publication Critical patent/EA201400156A1/ru
Publication of EA028341B1 publication Critical patent/EA028341B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей для определения характеристик системы свертывания крови и ее компонентов. Задачей настоящего изобретения является исследование пространственной динамики факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и оценка роли факторов свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе, что позволяет диагностировать отдельные заболевания и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови. Поставленная задача решена путем создания способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в котором обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему in vitro флуорогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки, регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресцентной метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа "реакция-диффузия-конвекция" с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды. В качестве субстрата может быть добавлен хромогенный или люминесцентный субстраты. Предложено также устройство для реализации указанного способа.

Description

(57) Настоящее изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей для определения характеристик системы свертывания крови и ее компонентов. Задачей настоящего изобретения является исследование пространственной динамики факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и оценка роли факторов свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе, что позволяет диагностировать отдельные заболевания и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови. Поставленная задача решена путем создания способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в котором обеспечивают систему ίη νίίτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему ίη νίίτο флуорогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки, регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресцентной метки для заданных моментов времени пространственновременное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды. В качестве субстрата может быть добавлен хромогенный или люминесцентный субстраты. Предложено также устройство для реализации указанного способа.
Область техники
Настоящее изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей для определения характеристик системы свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии, фармакологии и в фундаментальных биологических исследованиях.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время существует большая проблема исследования динамики сложных биологических систем и происходящих в них процессов, где есть пространственная неоднородность. К таким процессам относятся, в частности, процессы свертывания крови, комплемент, апоптоз, пищеварение, фибринолиз, где ключевую роль играют протеолитические ферменты (протеиназы).
Можно измерить концентрацию таких протеолитических ферментов, если эта величина неизменна во времени и одинакова во всех точках исследуемого образца, с помощью специфического флуорогенного субстрата или хромогенного субстрата. В настоящее время появились способы измерения изменения концентрации во времени, которые используются как для фундаментальных исследований, так и для диагностики нарушений в функционировании соответствующих биологических систем. Для определения нарушения свертывания крови сейчас используется тест генерации тромбина в плазме, раскрытый в основополагающей работе Неткег Н.С., МеИегк 8., Кекке1к Н., Ведши 8. Соийииоик гед1к1гайои оГ 1йтотЪш деиетайои ίη р1акта, йк ике Гот 1йе йе1егш1пайоп οί 1йе 1йтотЪш ро1епПа1. 1 ТЬтошЪ Наеток!. 1993, Ос1. 18; 70 (4): 617-24. Он продемонстрировал много преимуществ по сравнению с традиционными тестами свертывания, но является пространственно однородным, т.е. исследуется гомогенная среда. Это не соответствует ситуации в организме, описанной ниже.
На фиг. 1 схематически представлена пространственная концепция регуляции свертывания крови. Свертывание активируется клетками, экспрессирующими трансмембранный белок тканевый фактор, неферментный кофактор, являющийся фактором свертывания (слева), и распространяется вглубь плазмы. Генерация тромбина регулируется активированным фактором X (фактором Ха, сериновой протеиназой) лимитирующим компонентом протромбиназы. Свертывание около активатора (фаза инициации) определяется исключительно производством фактора Ха внешней теназой - комплексом тканевого фактора и сериновой протеиназы фактора УИа. Однако фактор Ха быстро ингибируется и не может диффундировать далеко от активатора. Поэтому в фазе распространения сгустка он образуется внутренней теназой. Лимитирующий компонент внутренней теназы, фактор свертывания 1Ха, производится внешней теназой. В отличие от фактора Ха, он ингибируется медленно и поэтому диффундирует далеко. При дальнейшем увеличении сгустка дополнительный фактор 1Ха производится фактором Х1а, который, в свою очередь, производится тромбином в петле положительной обратной связи. Формирование сгустка останавливается вследствие действия тромбомодулина: петля отрицательной обратной связи активирует протеин С, который останавливает распространение тромбина, разрушая факторы Уа и УШа (см. Райе1ееу М.А., Оуаиекоу М.У., Кйееу И.А., 8ЫЪеко А.М., 8таипй/е Ε.Ι., Аиаиуеуа Ν.Μ., Вйуйи А.А., 8аепко Е.Ь., А1аи11акйаиоу Ρ.Ι. 8райа1 рторадайои аий 1осай/айои оГ Ъ1оой соади1айои аге геди1а1ей Ъу шйшыс аий рго1еш С райцуаук. текресйуе1у. Вюрйук 1. 2006 Маг 1; 90 (5): 1489-500). Несмотря на то, что отдельные детали этой концепции могут уточняться, ключевая роль процессов диффузии и пространственной неоднородности в свертывании не вызывает сомнений (НоГГтаи М., Моигое Э.М. 3гй. А се11-Ъакей тойе1 оГ йетокйкй. ТйгошЪ Наеток! 2001 1ии; 85 (6): 958-65).
Тромбин - главный фермент системы свертывания крови. Он катализирует основную реакцию превращение фибриногена в фибрин. Кроме того, именно тромбин активирует факторы свертывания У, УШ, VII, XI, XIII, протеин С, тромбоциты, тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза. Тромбина при свертывании образуется в 10-100 раз больше, чем остальных протеиназ, что облегчает его определение.
В реакции, катализируемой тромбином, фибриноген превращается в фибрин, который полимеризуется и тем самым желирует плазму крови.
Исследования свертывания крови представляют большой практический интерес, поскольку не только позволяют диагностировать отдельные заболевания, но и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови.
Появление хромогенных, а затем и флуорогенных субстратов позволило ускорить изучение свертывания крови. Такой синтетический субстрат представляет собой молекулу, которая распознается и разрезается протеолитическим ферментом. Разрез ведет к отщеплению от субстрата сигнальной молекулы, также называемой меткой. Метка либо меняет оптическую плотность раствора (хромогенный или окрашивающий субстрат), либо способна флуоресцировать при освещении (флуорогенный субстрат), либо способна спонтанно испускать свет без внешнего возбуждения (хемилюминесцирующая метка). Субстраты для тромбина можно добавлять непосредственно в плазму и записывать сигнал (оптическую плотность или интенсивность света), получающийся при свертывании. Скорость увеличения сигнала пропорциональна концентрации тромбина. Зависимость тромбина от времени получается из экспериментальной зависимости сигнала от времени путем простого дифференцирования и вычисления концентрации тромбина из скорости расщепления субстрата с помощью калибровочной кривой, полученной путем
- 1 028341 добавления в буфер или исследуемую плазму известных концентраций тромбина или иного калибратора (например, комплекса тромбина и альфа2-макроглобулина).
Из уровня техники известны различные способы и устройства для определения параметров свертывания крови ίη νίΐτο. Однако известные способы и устройства предназначены для работы, как правило, с гомогенными системами, в которых образец крови или плазмы равномерно перемешан с активатором, что существенно отличает данные системы от системы ίη νίνο, являющейся сложной гетерогенной средой.
В существующих модельных системах ίη νίΐτο условия протекания процесса свертывания принципиально отличаются от тех условий, в которых сгусток образуется в живом организме. Известно, что в кровеносной системе человека и животных сгусток образуется не во всем объеме плазмы крови, а строго локально, т.е. в небольшой области повреждения стенки кровеносного сосуда. Свертывание в организме протекает неоднородно. Формирование сгустка происходит в пространстве. Оно запускается внешней теназой на поврежденной стенке сосуда, распространяется с участием протромбиназы на активированных тромбоцитах в объеме плазмы и тормозится реакциями с участием тромбомодулина на здоровом эндотелии. При этом факторы свертывания закономерным образом распределяются в небольшом объеме плазмы, и в нем образуется тромб. Это отражает основные защитные механизмы системы гемостаза поддержание целостности кровеносного русла за счет образования тромба в месте повреждения. Адекватно изучить эти процессы с помощью способов, проводимых в гомогенной среде, невозможно.
Таким образом, в настоящее время существует проблема экспериментального моделирования свертывания крови ίη νίΐτο, в которой желательно наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде. Она существует как для фундаментальных исследований тромбоза и гемостаза, так и для прикладных диагностических и фармакологических задач.
Задача определения изменения концентрации протеолитических ферментов во времени и пространстве, т.е. в различных точках в объеме исследуемого образца, до сих пор не решена.
В последнее время стали использоваться приборы, позволяющие учитывать пространственную неоднородность свертывания. В этих приборах свертывание происходит в кювете, содержащей рекальцифицированную плазму. В качестве активатора используется поверхность с иммобилизованным активатором свертывания, например, тканевым фактором. При контакте с плазмой начинается свертывание, которое затем распространяется вглубь плазмы и которое можно наблюдать по светорассеянию от растущего сгустка.
Из уровня техники известно устройство для исследования характеристик свертываемости крови и ее компонентов (патент КИ 2395812, кл. Ο01Ν 33/49, опубл. 27.07.2010), содержащее термостатируемую камеру, в которую помещена кювета с исследуемым образцом плазмы и активатором свертывания, в качестве которого используется тромбопластин (тканевый фактор свертывания), нанесенный на вставку, которую вставляют в кювету, светодиоды для освещения содержимого кюветы и образующегося у активатора сгустка, цифровую камеру, фиксирующую растущий сгусток, при этом устройство соединено с компьютером для обработки полученных данных.
Указанное устройство позволяет реализовать способ, в котором регистрируется только процесс образования фибринового сгустка, являющегося конечным продуктом работы системы свертывания.
Известны также способ и устройство для мониторинга пространственного образования фибринового сгустка (международная заявка РСТ/СН 2007/000543, кл. Ο01Ν 33/49, опубл. 07.05.2009, номер публикации АО 2009/055940).
Устройство включает кювету, предназначенную для фотометрического анализа, вставку и активатор, термостат, в котором размещается указанная кювета. Активатор свертывания нанесен на нижнюю грань вставки. Активатор свертывания является физиологическим активатором, например, тканевым фактором, или нефизиологическим активатором, например, стеклом. Кювета выполнена из пропускающего свет полистирола.
Известное устройство позволяет осуществлять способ мониторинга образования и/или лизирования фибринового сгустка ίη νίΐτο, который содержит следующие шаги: помещают в кювету один или более образцов плазмы крови в соответствии с количеством лунок, вводят в кювету вставку с активатором и обеспечивают соприкосновение плазмы с активатором свертывания (при образовании сгустка); и регистрируют рост фибринового сгустка как функцию времени и расстояния, или помещают в кювету один или более образцов плазмы крови, содержащих один или более фибриновых сгустков; обеспечивают соприкосновение плазмы с активатором фибринолиза (при лизировании сгустка); и регистрируют лизис фибринового сгустка как функцию времени и расстояния.
Принципиальное преимущество указанного способа и устройства для мониторинга пространственного образования фибринового сгустка состоит в малом объеме требуемой плазмы. С таким небольшим количеством, как 20 мкл (вместо от 300 до 1500 мкл, т.е. в 75 раз меньше, чем в других похожих системах, и в 5 раз меньше, чем минимальное количество плазмы, требуемой для стандартных тестов свертывания), могут быть получены достоверные результаты высокого разрешения. Указанное устройство позволяет реализовать способ, в котором регистрируется только процесс образования фибринового сгустка,
- 2 028341 являющегося конечным продуктом работы системы свертывания.
Недостатками названных выше устройства и способа можно назвать образование при нагреве исследуемых образцов пузырьков газа в кювете в области регистрации, которые искажают сигнал светорассеяния от фибринового сгустка.
А наличие источников освещения только одной длины волны, например, красного света, не позволяет исследовать пространственно-временное распределение флуоресцентных веществ.
Кроме того, описанные способ и устройство не обеспечивают возможность регистрации процесса образования и пространственного распределения отдельных факторов свертывания, таких как 11а, Ха, У11а, Х1а, которые регулируют процесс пространственного роста фибринового сгустка.
Наиболее близким аналогом к заявленному способу и устройству можно рассматривать устройство и способ, раскрытые в статье Кондратовича А.Ю., Похилко А.В. и Атауллаханова Ф.И. Пространственно-временная динамика факторов контактной активации свертывания крови, 2002 г. (КопФайэуюй Α.Υ., Рокййко А.У., А1аи11акйаиоу Ρ.Ι. 8райо1етрога1 йуиат1С8 оГ соШас! асйуайои ГасЮгх оГ Ыоой еоади1айои. ВюсЫт Вюрйуз Ас1а. 2002 1аи 15; 1569 (1-3): 86-104).
Для реализации упомянутого способа используют бедную тромбоцитами плазму. Определение распределения фактора Х1а и калликреина исследуемого образца плазмы осуществляют, регистрируя излучение в синей области спектра 7-амино-4-метилкумарина (АМС), образующегося в результате расщепления флуорогенных субстратов, специфичных для данных факторов.
Предварительно к каждому исследуемому образцу плазмы добавлялся субстрат и образец перемешивался при 37°С, рН среды поддерживался равным 7,4 при указанной температуре.
На фиг. 2 схематично показано устройство, используемое для реализации способа. Устройство содержит емкость 1, изготовленную из полистирола, содержащую исследуемый образец плазмы крови 2. К плазме 2 добавляли субстрат. Конец 5 стеклянной капиллярной трубки служил активатором свертывания.
Устройство содержит также источник освещения 6, представляющий собой ртутную лампу, термостат 7, стеклянный фильтр 8, полупрозрачное зеркало 9, цифровую камеру 10, флуоресцентную пластиковую наклейку 12, устройство подключали к компьютеру 11.
Активация факторов свертывания изучалось в двумерной (плоской) среде, т.е. в тонком слое неперемешанной плазмы.
Емкость 1 помещали в термостат 7 при температуре 37°С, и быстро опускали в нее активатор, чтобы конец 5 трубки погрузился в плазму.
Фактор свертывания, активируемый контактом со стеклом, расщеплял субстрат, что приводило к образованию АМС. Флуоресценцию АМС записывали следующим образом. Образец плазмы освещали излучением источника освещения 6, отраженным от полупрозрачного зеркала 9. Фильтры 8 блокировали видимую часть спектра. Флуоресценция АМС записывалась цифровой камерой 10, установленной позади полупрозрачного зеркала. Записанное поле обзора составило 9x6,5 мм. Синий канал КОВ выходного сигнала камеры охватывал весь диапазон флуоресценции АМС. Данные изображения непрерывно передавались в компьютер 11, и отображались на мониторе, а также сохранялись с заданными интервалами. Кусочек флуоресцирующего пластика 12 был закреплен под термостатом 7, чтобы его изображение было всегда в поле зрения камеры, оно использовалось для калибровок и учета колебаний в освещении.
При анализе изображений выбирали радиальный луч с началом в центре активатора. При помощи специального программного обеспечения определялось пространственно-временное распределение концентрации АМС вдоль этого луча (фиг. 3), а на его основе восстанавливалось пространственновременное распределение концентрации фактора свертывания.
К недостаткам указанного способа можно отнести возможность измерения только факторов контактной активации (а именно факторов Х1а, Х11а, калликреина), с плохой возможностью различения между вкладами этих факторов в сигнал, без возможности измерения пространственной динамики процесса свертывания, т.е. образования фибринового сгустка.
К недостаткам устройства можно отнести: неудобство используемой емкости для высокопроизводительных исследований; использование нестабильного освещения с помощью ртутной лампы, не позволяющего производить точные измерения, образование пузырьков газа в области регистрации процесса при нагреве исследуемых образцов, которые искажают сигнал флуоресценции.
Известный способ не позволяет моделировать системы ίη уйго, приближенные по своим физиологическим свойствам к системам ίη У1уо, а также проводить более точную диагностику нарушений в системе свертывания крови.
Кроме того, способ не позволяет полноценно исследовать пространственную динамику факторов свертывания, в первую очередь, тромбина, в процессе роста фибринового сгустка, и не обеспечивает возможность оценки роли фактора свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе.
Таким образом, для более качественного определения характеристик свертывания крови и ее компонентов имеется потребность в усовершенствовании имеющихся способов и приборов.
- 3 028341
Краткое изложение существа изобретения
Задачей настоящего изобретения является исследование пространственной динамики факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и оценка роли факторов свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе, что позволит диагностировать отдельные заболевания и оценить активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови.
Технический результат, который может быть получен при реализации заявляемого решения, заключается в повышении чувствительности способа к нарушениям как плазменного, так и тромбоцитарного звеньев свертывания крови.
Поставленная задача решена путем создания способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в котором: обеспечивают систему ίη νίίτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему ίη νίίτο флуорогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки, регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресцентной метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
Поставленная задача может быть также решена путем создания второго варианта способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента, в котором: обеспечивают систему ίη νίίτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему ίη νίίτο хромогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени светом с длиной волны его значительного поглощения меткой, регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение поглощения света меткой в образце, получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений поглощения света меткой для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузияконвекция с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
Поставленная задача может быть также решена путем создания третьего варианта способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента, в котором: обеспечивают систему ίη νίίτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему ίη νίίτο люминисцентный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала люминесценции метки в образце, получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений сигналов люминисценции метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
А также тем, что в систему ίη νίίτο дополнительно помещают активирующий агент, который вызывает изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента.
А также тем, что в качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена, клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика.
А также тем, что дополнительно освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени и регистрируют пространственные характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации,
А также тем, что субстрат добавляют в виде раствора в образец исследуемой среды.
А также тем, что субстрат наносят в лиофилизированной форме на стенки системы ίη νίίτο до размещения в ней образца исследуемой среды.
А также тем, что освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту.
А также тем, что используют в качестве образца цельную кровь или плазму, выбранную из группы,
- 4 028341 состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
А также тем, что обеспечивают стабильную температуру по всему объему исследуемого образца, предпочтительно 37°С.
А также тем, что обеспечивают стабильное давление по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному.
А также тем, что обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно с диапазоном 7,2-7,4.
Исследуемый протеолитический фермент может образовываться в исследуемой среде из своего предшественника в результате протекания биохимических процессов, а также может постепенно разрушаться в исследуемой среде в результате протекающих в среде биохимических процессов.
Визуализируют пространственное распределение метки и образовавшегося сгустка предпочтительно в заданные моменты времени.
Регистрируют светорассеяние от образца среды предпочтительно по методу темного поля.
Регистрируют излучение метки предпочтительно методом флуоресцентной микроскопии.
Регистрацию распределения светорассеяния и излучения метки в образце среды, в том числе, осуществляют посредством конфокальной микроскопии, обеспечивающей перефокусировку оптической системы и системы освещения/облучения в заданные моменты времени.
Поставленная задача решена также путем создания устройства определения пространственновременного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, содержащего: систему ίη νίΐΓΟ, которая включает кювету для размещения образца исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника, и флуорогенного, или хромогенного, или люминесцентного субстрата, средство для освещения образца исследуемой среды в заданные моменты времени, средство регистрации пространственного распределения сигнала метки, образовавшейся при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, в заданные моменты времени, средство управления средствами освещения и регистрации. А также тем, что оно содержит активирующее средство для размещения и ввода в кювету активатора процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента.
А также тем, что оно содержит средство для обеспечения стабильной температуры в образце исследуемой среды, предпочтительно 37°С.
А также тем, что оно содержит средство обеспечения стабильного давления по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенного по отношению к атмосферному.
А также тем, что оно содержит средство для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра по методу темного поля.
А также тем, что средство управления средствами освещения и регистрации выполнено с возможностью регулирования времени включения/выключения, интенсивности освещения и синхронизации работы средств освещения и регистрации между собой.
А также тем, что оно соединено с вычислительным средством, выполненным с возможностью осуществления расчета пространственного распределения активности протеолитического фермента во времени, или включает указанное вычислительное средство.
Поставленная задача решена также путем создания способа диагностики нарушений системы гемостаза посредством регистрации пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента (фактора свертывания) в гетерогенной системе ίη νίΐτο, заключающегося в том, что используют в качестве исследуемого образца компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта, обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения по меньшей мере одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания, регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды, оценивают состояние системы гемостаза по отклонению пространственно-временного распределения протеолитического фермента от нормального.
А также тем, что дополнительно в заданные моменты времени освещают исследуемый образец и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка
- 5 028341 в образце среды методом темного поля.
А также тем, что в качестве фактора свертывания исследуют протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор УПа, фактор Ка, фактор XIIа, фактор XIа, плазмин.
А также тем, что используют по меньшей мере один параметр пространственно-временного распределения тромбина или фибрина, для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
Предложенный способ позволяет моделировать системы ίη νΐίτο, приближенные по своим физиологическим свойствам к системам ίη νίνο, а также проводить более точную диагностику нарушений в системе свертывания крови.
Полученный в результате исследования пространственно-временной массив данных, т.е. пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента, используется для расчета в каждой точке скорости изменения активности протеолитического фермента в пространстве и во времени, по которому судят о статусе состояния системы свертывания крови в образце, делают вывод о состоянии системы свертывания у пациента посредством сравнения со здоровыми донорами, оценивают эффективность терапии, подбирают оптимальную индивидуальную дозу лекарственного препарата, определяют механизм действия лекарственного препарата, осуществляют скрининг химических веществ в процессе разработки лекарственных препаратов, получают информацию о механизме работы системы свертывания, изучают патогенез и этиологию заболеваний системы крови, исследуют пространственную динамику факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка, обеспечивают возможность оценки роли фактора свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе.
Предложенный способ позволяет надежно диагностировать гиперкоагулянтные состояния на ранних стадиях, когда все прочие тесты их не чувствуют. Впервые в медицинской практике это дает возможность с высокой степенью точности выявлять склонность пациентов к широкому кругу патологий, включая гиперкоагуляционный синдром различной этиологии, геморрагии, тромбозы, инфаркты и инсульты, изучать патогенез заболеваний, осуществлять мониторинг классических препаратов и лекарств нового поколения, включая шунтирующие антигемофилические средства.
Предложенное устройство позволяет реализовать заявленный способ и обеспечить более точное определение пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе.
Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, где на фиг. 1 схематически представлена пространственная концепция регуляции свертывания крови; на фиг. 2 представлена схема известного из уровня техники устройства для определения пространственной динамики факторов свертывания;
на фиг. 3 представлены типичные зависимости концентрации АМС от расстояния и от времени, получаемые при исследовании пространственно-временного распределения фактора свертывания Х1а; активатор свертывания расположен в начале координат;
на фиг. 4 представлена схема устройства для определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, согласно изобретению;
на фиг. 5а-Ь представлена визуализация пространственной динамики образования фибринового сгустка (а) и флуорофора (Ь) согласно изобретению;
на фиг. 6а-Ь представлен пример пространственно-временной динамики образования фибринового сгустка (а) и концентрации протеолитического фермента (тромбина) (Ь) в системе ш νΐίτο, полученный при помощи устройства согласно изобретению; активатор свертывания расположен в начале координат.
Описание вариантов воплощения изобретения
Первый вариант выполнения способа.
Согласно изобретению предложен способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, который осуществляется следующим образом.
Используют систему ίη νΐίτο, в которую помещают образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник.
Погружают в систему ίη νΐίτο флуорогенный субстрат.
При взаимодействии протеолитического фермента с флуорогенным субстратом происходит расщепление субстрата с отделением от него метки - флуорофора.
- 6 028341
Освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени возбуждающим излучением для возбуждения сигнала флуоресценции метки, в заданные моменты времени одновременно с освещением регистрируют пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце.
В дополнение к регистрации пространственного распределения сигнала метки в образце возможно в заданные моменты времени освещать образец исследуемой среды и регистрировать оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации. Тем самым регистрировать пространственное распределение фибрина.
Из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресценции метки для заданных моментов времени получают пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
Длина волны освещения подбирается в соответствии со спектром возбуждения метки (флуорофора). Длина волны освещения подбирается так, чтобы обеспечить максимальное отношение сигнал/шум, в частности, при исследовании системы свертывания сигнал - светорассеяние фибринового сгустка, шум светорассеяние плазмы и остальных элементов системы ίη νίίτο.
При проведении тестов в систему ίη νίίτο можно добавить активирующий агент, который вызовет изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента. В качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности носителя тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена, клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика.
Возможен вариант выполнения изобретения, когда исследуемый протеолитический фермент образуется непосредственно в исследуемой среде из своего предшественника в результате протекания биохимических процессов. Возможен также вариант, в котором исследуемый протеолитический фермент постепенно разрушается в исследуемой среде в результате протекающих в среде биохимических процессов.
Регистрацию пространственного распределения светорассеяния и излучения метки в образце возможно осуществлять посредством конфокальной микроскопии, обеспечивающей перефокусировку оптической системы и системы освещения/облучения в заданные моменты времени либо методом флуоресцентной микроскопии.
Далее визуализируют пространственное распределение метки и образовавшегося сгустка в заданные моменты времени.
Светорассеяние от образца среды регистрируют по методу темного поля.
Второй вариант выполнения способа
Второй вариант выполнения отличается от первого варианта тем, что в качестве субстрата используют хромогенный субстрат.
При взаимодействии протеолитического фермента с хромогенным субстратом происходит расщепление субстрата с отделением от него метки - хромофора. Система освещается светом с длиной волны, на которой происходит значительное поглощение излучения хромофором. В заданные моменты времени регистрируют изменение пространственного распределения цвета исследуемой среды. По изменению пространственного распределения цвета в образце определяют пространственное распределение хромофора в образце. Из этого распределения хромофора получают пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузияконвекция с учетом связывания хромофора в среде с компонентами среды.
В заданные моменты времени освещают образец исследуемой среды и регистрируют фотокамерой оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации.
Третий вариант осуществления способа
Третий вариант выполнения способа отличается от первого варианта тем, что в качестве субстрата используют субстрат, который при взаимодействии с протеолитическим ферментом расщепляется с образованием продукта, обладающего хемилюминесценцией. В заданные моменты времени регистрируют пространственное распределение интенсивности люминесценции в образце. Из этого распределения получают пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом связывания люминофора в среде.
В заданные моменты времени освещают образец исследуемой среды и регистрируют фотокамерой оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации.
В каждом из вариантов осуществления способа обеспечивают одинаковую температуру по всему объему системы ίη νίίτο, предпочтительно 37°С, для чего систему термостатируют. Для избежания появ- 7 028341 ления пузырьков воздуха, выделяющихся из образца среды, поддерживают давление в системе ίη νίΐτο, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному. Обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно с диапазоном 7,2-7,4.
Возможно добавлять субстрат в образец исследуемой среды в виде раствора или наносить субстрат в лиофилизированной форме на стенки системы ίη νίΐτο до размещения образца исследуемой среды.
Освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту. Причем освещение осуществляют после установления стабильной температуры в образце.
Для осуществления любого из вариантов указанного способа приготавливают смесь, состоящую из исследуемого образца, ингибитора контактной фазы, хлорида кальция, субстрата, специфичного к исследуемому фактору свертывания.
В качестве образца используют, в частности, цельную кровь либо плазму, выбранную из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
В качестве фактора свертывания определяют, в частности, тромбин.
Согласно изобретению предложен также способ диагностики нарушений системы гемостаза посредством регистрации пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента (фактора свертывания) в гетерогенной системе ίη νίΐτο, заключающийся в том, что в качестве образца используют компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта.
Обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения по меньшей мере одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания.
Регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце.
Поддерживают стабильную температуру образца с точностью до 1° в диапазоне температур 2545°С. Стабилизируют рН образца до диапазона 7,2-7,4.
Получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды, на его основе рассчитывают пространственновременное распределение концентрации фактора свертывания во времени.
Оценивают состояние системы гемостаза по отклонению пространственно-временного распределения протеолитического фермента от нормального.
Дополнительно в заданные моменты времени освещают исследуемый образец, и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка в образце среды для визуализации образовавшегося фибринового сгустка.
В качестве фактора свертывания исследуется протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор У11а, фактор 1Ха, фактор Х11а, фактор Х1а, плазмин.
Используют по меньшей мере один параметр пространственно-временного распределения тромбина или фибрина для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
Для реализации указанного способа (его вариантов выполнения) определения пространственновременного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе предлагается устройство, содержащее систему ίη νίΐτο, которая включает кювету 20 (фиг. 4) для размещения образца 21 исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника. Кювета 20 имеет определенные геометрические размеры и форму, в основе которой лежит прямоугольник. Кювета выполнена из пластика.
Для снижения конвективных потоков (чем тоньше слой, тем быстрее затухает движение жидкости) и обеспечения быстрого прогрева, толщина слоя образца должна быть минимальной. Для повышения уровня сигнала - максимальной. Оптимальная толщина лежит в пределах 0,1-1,5 мм.
Устройство содержит также средство 22, предназначенное для размещения и ввода в кювету активатора 23 процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента.
- 8 028341
Устройство снабжено также средством 24 для обеспечения одинаковой температуры в системе ίη νίίτο. Устройство позволяет обеспечить различные виды термостатирования, включая водяное термостатирование и воздушное термостатирование, а также для термостатирования может использоваться гель, но при этом следует учитывать, что среда должна быть прозрачна для излучения. В описываемом варианте термостатирование - водяное. При термостатировании поддерживается температура в пределах 2545°С с точностью в 1°С. Устройство снабжено также средством (не показано) поддержания давления в системе ίη νίίτο, указанное средство предназначено для поддержания постоянного воздушного давления в пространстве, окружающем исследуемый образец среды (совместно со средством 24 для поддержания одинаковой температуры они образуют блок 25 термостатирования и давления). Указанное средство поддерживает избыточное атмосферное давление от 0,2 до 0,5 атм, что предотвращает образование пузырей газа в исследуемом образце. Образование пузырей связано с уменьшением растворимости содержащихся в образце растворенных газов. Обычно это явление связано с нагревом образца. Пузыри приводят к локальным искажениям как с точки зрения повышения нефизиологичности окружения, т.е. ухода от моделируемых условий, так и с точки зрения расчета распределения ферментов.
Устройство содержит средство 26 для освещения образца 21 исследуемой среды в заданные моменты времени возбуждающим излучением для возбуждения сигнала флуоресценции метки в случае добавления к образцу флуорогенного субстрата или светом с длиной волны его значительного поглощения меткой в случае добавления к образцу хромогенного субстрата. Средство 26 обеспечивает подачу излучения перпендикулярно стенке кюветы 20 через окно в термостате 24. В качестве средства 26 для освещения используют источники УФ-излучения, например, светодиоды УФ-спектра. Устройство также содержит средство 27 для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра, которое обеспечивает подачу излучения под углом к стенке кюветы 20 и зеркало 28, направляющее излучение в блок регистрации 32, а также фильтр 29 возбуждения и фильтр 30 эмиссии, обеспечивающие выделение сигнала флуоресценции метки, при этом излучение средств освещения не должно вызывать локального нагрева образца. Совокупность средств с 26 по 30 образует блок 31 освещения.
Устройство включает также блок 32 регистрации пространственного распределения сигнала флуоресценции метки/светорассеяния (или поглощения меткой-хромофором) в образце исследуемой среды и в заданные моменты времени. Блок 32 регистрации содержит средства получения изображения с различной глубины образца, содержащие оптическую систему 33 для фокусировки оптики и диафрагмы (не показаны). Интенсивность свечения зависит от концентрации метки, в свою очередь, определяющейся активностью исследуемого протеолитического фермента. Излучение от метки проходит перпендикулярно стенке кюветы 20 через зеркало 28, прозрачное для этого спектра излучения, и через оптическую систему 33 попадает в средство регистрации 34, которое может представлять собой цифровую фотокамеру.
Устройство содержит средство управления средствами облучения/освещения, выполненное в виде процессора (не показан), обеспечивающего управление временем включения/выключения, интенсивностью и длительностью облучения/освещения, и синхронизацией функционирования средств облучения/освещения и средств регистрации (не показано).
Вычислительное средство (не показано) обеспечивает расчет пространственного распределения активности протеолитического фермента во времени.
К средству управления подключено также средство визуализации формирующегося/распадающегося сгустка методом темного поля и средство визуализации пространственного изображения образования/разрушения метки субстрата (флуорофора/хромофора) (не показаны).
Работа устройства и осуществление способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе рассматривается далее на неисчерпывающем примере осуществления. Материалы
Для проведения исследования использовались следующие реагенты: фосфатидилсерин и фосфатидилхолин; 7-амино-4-метилкумарин (АМС); Ζ-Гли-Гли-Арг-АМС/ингибитор фактора Х11а, например, КТИ, или любой другой подходящий ингибитор; антагонист гликопротеина 1ГЬ-111а.
Сбор крови и приготовление плазмы
Образцы нормальной плазмы были получены из свежесобранной человеческой крови здоровых доноров. Кровь собирали в 3,8% цитрата натрия (рН 5,5) в соотношении 9:1 по объему. Кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1600 д, а затем супернатант дополнительно центрифугировали в течение 5 мин при 10000 д для получения плазмы без тромбоцитов, супернатант затем был заморожен и хранился при температуре -70°С. Перед каждым тестом образцы оттаивали на водяной бане.
Для приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы, кровь центрифугировалась при 100 д в течение 8 мин. Концентрация тромбоцитов доводилась до 250000 кл/мкл разбавлением плазмой без тромбоцитов. Для стабилизации рН в плазму добавили 28 мМ Нерек (рН 7,4).
Коммерчески доступные плазмы, дефицитные по отдельным факторам свертывания, размораживали и далее обрабатывали с использованием Нерек для стабилизации рН, аналогично плазме, обогащенной тромбоцитами.
- 9 028341
Подготовка активатора
Как указывалось ранее, свертывание активировалось с использованием активатора в виде монослоя тканевого фактора (ТР), иммобилизованного на пластиковой поверхности. Активаторы хранились при температуре от 4 до 8°С.
Проведение теста
Рассмотрим пространственный рост сгустка в различных образцах исследуемой среды.
A) Пространственный рост сгустка в свободной от тромбоцитов плазме
Приготовленная как указано выше плазма была дополнена ингибитором, например, ингибитором трипсина из кукурузы (0,2 мг/мл), 10 мкМ липидных везикул (фосфатидилсерин/фосфатидилхолин, в молярном соотношении 20/80). Субстрат Ζ-Гли-Гли-Арг-АМС (800 мкМ) был добавлен для мониторинга формирования тромбина. Приготовленный образец инкубировали в течение 10 мин при 37°С, а затем дополняли солью Са, в частности СаС12 (20 мМ). Исследуемый образец помещали в экспериментальную кювету и инициировали образование сгустка активатором с поверхностью, покрытой тканевым фактором, путем приведения ее в контакт с подготовленным образцом плазмы.
Тесты проводили с помощью специально разработанной системы видеомикроскопии, что позволяло наблюдать пространственное распространение или рост фибринового сгустка и протеолитического фермента, в частности, тромбина, одновременно. Поддерживали температуру в камере на уровне 37°С и освещение осуществляли посредством красного (625 нм) и ультрафиолетового (365 нм) светодиодов. Рост сгустка детектировали по светорассеянию образца при освещении красным светом (фиг. 5, а), а сигнал флуоресценции АМС (фиг. 5, Ь) возбуждали ультрафиолетовыми светодиодами. Многополосный эмиссионный фильтр использовали для разделения рассеяния красного света, излучения АМС и излучения для возбуждения. Флуоресценцию и рассеяние красного света, проходящего через оптическую систему, детектировали цифровой ПЗС камерой. Изображения в красном и синем свете получали последовательно, обычно от одного до четырех раз в минуту. Чтобы устранить выгорание АМС, светодиоды синхронизировали с камерой и они включались только на время экспозиции, т.е. около 0,5 с.
B) Пространственный рост сгустка в обогащенной тромбоцитами плазме
Чтобы предотвратить ретракцию сгустка использовали 25 мкг/мл антагониста гликопротеина 11Ь/111а. Также были проведены тесты на 0,5% низкотемпературном агарозном геле, так как в некоторых случаях даже большая концентрация антагониста полностью не ингибирует ретракцию.
Подготовку образцов выполняли, как описано выше, за исключением того, что вместо свободной от тромбоцитов плазмы использовали обогащенную тромбоцитами плазму. После рекальцификации плазма предварительно нагревалась до 42°С в течение 2 мин. Агарозный раствор добавляли и смесь инкубировали в экспериментальной кювете в течение 3 мин для образования геля. Затем тест проводили, как описано выше.
Обработка данных
Обработка изображения
Изображения в красном и УФ-свете были первично обработаны одинаковым образом. Для получения профилей светорассеяния (фиг. 6, а) или флуоресценции АМС, для каждого кадра была измерена интенсивность света в соответствующем диапазоне вдоль линии, перпендикулярной к поверхности активатора. Значения были усреднены для 150-300 линий.
Скорость роста сгустка рассчитывалась по движению точки полумаксимальной интенсивности на профилях светорассеяния. Начальная скорость роста определялась как тангенс угла наклона линеаризованного участка диаграммы зависимости размера сгустка от времени в первые 10 мин роста сгустка. Стационарная скорость рассчитывается таким же образом, через 40 мин роста сгустка, когда граница сгустка оказывается так далеко от активатора, что его влияние на рост сгустка становится незначительным.
Профили интенсивности флуоресценции АМС переводятся в профили его концентрации посредством калибровки. Профиль калибровки интенсивности рассчитан в рамках равномерного распределения с известной концентрацией АМС в той же плазме. АМС концентрация в каждой точке (С,) была рассчитана следующим образом:
С, = 'со/ где I! - интенсивность флуоресценции, 1Ьдг - интенсивность фона, 1са1 - интенсивность флуоресценции с известной концентрацией АМС, все в одной и той же точке кадра, Сса1 - калибровочная концентрация АМС.
Расчет концентрации тромбина
Концентрация тромбина (фиг. 6, Ь) рассчитывалась по одномерному распределению АМС путем решения обратной задачи для следующего уравнения реакция - диффузия.
- 10 028341
где АМС, δ и 11а являются концентрациями АМС, флуорогенного субстрата и тромбина соответственно, Эдмс - коэффициент диффузии АМС; Кт, кса1 являются константами реакции расщепления субстрата тромбином, следующей кинетике Михаэлиса.
Коэффициент диффузии АМС был измерен экспериментально путем фиттинга измеренных профилей диффузии к теоретическим.
Обратная задача для распределения концентрации тромбина является некорректной, поэтому экспериментальный шум и даже небольшие искажения профилей АМС приводят к отсутствию ее решения. Для преодоления этого были использованы численные алгоритмы для снижения шума и уровня искажения сигнала АМС.
Искажения АМС сигнала происходят из-за возбуждения рассеяния света на фибриновом сгустке. Интенсивность флуоресценции увеличивается внутри сгустка. Это увеличение пропорционально АМС концентрации и плотности сгустка. Чтобы преодолеть это и рассчитать реальную концентрацию АМС, была использована следующая формула.
АЛ/Сииь;, — ЛМСгв[ + (к± + к2 АМСгвв() где АМСУ181Ые - концентрация АМС, полученная путем калибрования, АМСгеа1 - реальная концентрация АМС, С1о1 - интенсивность рассеянного фибрином света, коэффициенты к!, к2, к3 были измерены экспериментально.
Для снижения шума были использованы следующие алгоритмы вычисления производных:
д2(ЛМС] у [ЛАГС)(х +) * Ау) - 2 [ЛМЗКУ)+[ЯА/С](ж - ί * &χ,ί) а/ (ηδχ)2 где Δΐ - время между кадрами, обычно 1 мин; Дх - размер пикселя (4,3 мкм); значения I и 1 выбраны оптимальными для максимального снижения шума при минимальном искажении сигнала. Обычно выбирались I = 3 и I = 40, при этом суммирование могло начинаться со значений ί и р больших единицы.

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, заключающийся в том, что обеспечивают систему ίη νίΐτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора и геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник; добавляют в систему ίη νίΐτο флуорогенный субстрат, специфичный для определяемого протеолитического фермента, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата упомянутым протеолитическим ферментом; освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки; регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце; получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресценции метки для заданных моментов времени пространственновременное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
  2. 2. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, заключающийся в том, что обеспечивают систему ίη νίΐτο, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора и геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник; добавляют в систему ίη νίΐτο хромогенный субстрат, специфичный для определяемого протеолитического фермента, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата упомянутым протеолитическим ферментом; освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени светом с длиной волны его значительного поглощения меткой; регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение поглощения света меткой в образце; получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений поглощения света меткой для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
    - 11 028341
  3. 3. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, заключающийся в том, что обеспечивают систему ίη уйго, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора и геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник; добавляют в систему ίη уйго люминесцентный субстрат с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом; регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала люминесценции метки в образце; получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений сигналов люминесценции метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором дополнительно в систему ίη уйго помещают активирующий агент, который вызывает изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента.
  5. 5. Способ по п.4, в котором в качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности подложки тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена, клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-3, в котором дополнительно освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени и регистрируют пространственные характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в исследуемом образце и их комбинации.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-3, в котором субстрат добавляют в виде раствора в образец исследуемой среды.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-3, в котором наносят субстрат в лиофилизированной форме на стенки системы ίη уйго до размещения в ней образца исследуемой среды.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-3, в котором в качестве исследуемой среды используют плазму крови, выбранную из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-3, в котором освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-3, в котором обеспечивают стабильную температуру по всему объему исследуемого образца, предпочтительно 37°С.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-3, в котором обеспечивают стабильное давление по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-3, в котором обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно в диапазоне 7,2-7,4.
  14. 14. Устройство определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе с использованием способа по пп.1, 2 или 3, содержащее систему ίη уйго, которая включает кювету для размещения образца исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора и геля, распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника, и флуорогенного, или хромогенного, или люминесцентного субстрата, специфичного для определяемого протеолитического фермента; средство обеспечения стабильного давления по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенного, по отношению к атмосферному, средство для освещения образца исследуемой среды в заданные моменты времени; средство для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра по методу темного поля; средство регистрации пространственного распределения сигнала метки, образовавшейся при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, в заданные моменты времени; средство управления средствами освещения и регистрации.
  15. 15. Устройство по п.14, которое содержит активирующее средство для размещения и ввода в кювету активатора процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента.
  16. 16. Устройство по п.14, которое содержит средство для обеспечения стабильной температуры в образце исследуемой среды, предпочтительно 37°С.
  17. 17. Устройство по п.14, в котором средство управления средствами освещения и регистрации выполнено с возможностью регулирования времени включения/выключения, интенсивности освещения и синхронизации работы средств освещения и регистрации между собой.
  18. 18. Устройство по п.14, которое соединено с вычислительным средством, выполненным с возможностью осуществления расчета пространственного распределения активности протеолитического фер- 12 028341 мента во времени, или включает указанное вычислительное средство.
  19. 19. Способ диагностики нарушений системы гемостаза посредством регистрации пространственновременного распределения активности протеолитического фермента (фактора свертывания) способом по пп.1, 2 или 3 в гетерогенной системе ΐη νΐίΓο, заключающийся в том, что используют в качестве исследуемого образца компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта; обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения по меньшей мере одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания; регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце; получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа реакция-диффузия-конвекция с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды; оценивают состояние системы гемостаза по отклонению пространственно-временного распределения протеолитического фермента от нормального.
  20. 20. Способ по п.19, в котором дополнительно в заданные моменты времени освещают содержимое кюветы и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка в образце среды для регистрации образовавшегося фибринового сгустка методом темного поля.
  21. 21. Способ по п.19, в котором в качестве фактора свертывания исследуют протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор У11а, фактор 1Ха, фактор Х11а, фактор Х1а, плазмин.
  22. 22. Способ по п.19, в котором используют по меньшей мере один параметр пространственновременного распределения тромбина или фибрина для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
EA201400156A 2011-07-26 2012-07-16 Способ определения активности протеолитического фермента (варианты), устройство для его реализации и способ диагностики EA028341B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011131293/10A RU2518247C2 (ru) 2011-07-26 2011-07-26 Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе
PCT/RU2012/000570 WO2013015717A2 (ru) 2011-07-26 2012-07-16 Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201400156A1 EA201400156A1 (ru) 2014-08-29
EA028341B1 true EA028341B1 (ru) 2017-11-30

Family

ID=47601696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400156A EA028341B1 (ru) 2011-07-26 2012-07-16 Способ определения активности протеолитического фермента (варианты), устройство для его реализации и способ диагностики

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9938563B2 (ru)
EP (1) EP2752495B8 (ru)
JP (1) JP2014521952A (ru)
CN (1) CN103998620A (ru)
CA (1) CA2842594C (ru)
EA (1) EA028341B1 (ru)
RU (1) RU2518247C2 (ru)
WO (1) WO2013015717A2 (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105738378A (zh) * 2016-02-23 2016-07-06 上海航天动力科技工程有限公司 一种多功能自显像着色渗透剂及其应用
US11237178B2 (en) * 2016-11-30 2022-02-01 Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu <<Hemacore Labs>> Device for monitoring the spatial and temporal dynamics of thrombin
RU2657294C1 (ru) * 2016-12-15 2018-06-13 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) Устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo
JP7273631B2 (ja) * 2019-06-26 2023-05-15 株式会社日立製作所 検体性状識別装置、検体性状識別方法及び検体搬送システム
EP4270010A1 (en) * 2020-12-28 2023-11-01 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Method for evaluating blood coagulation performance, and method for inspecting risk of thrombosis
CN114465969B (zh) * 2021-12-23 2023-07-04 珠海格力电器股份有限公司 通讯消息组的管理方法、装置、设备和存储介质

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5059525A (en) * 1984-11-19 1991-10-22 Boehringer Mannheim Gmbh Dry reagent for blood coagulation tests
WO1993010261A1 (en) * 1991-11-13 1993-05-27 Dahlbaeck Bjoern Method for the diagnosis of blood coagulation disorders
US5339830A (en) * 1992-01-21 1994-08-23 Blake Joseph W Iii Blood coagulation test system
WO2009098313A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Synapse B.V. Time-course measurement of enzymatic activity corrected for impacts of disturbances relating to the reaction of the enzyme with a substrate

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1159448T3 (da) * 1999-03-04 2004-08-09 Synapse Bv Bestemmelse af biologisk aktive former af proteolytiske enzymer
EP2405019A1 (en) * 2001-09-10 2012-01-11 Meso Scale Technologies LLC Methods, reagents, kits and apparatus for protein function analysis
ES2291661T3 (es) * 2002-05-01 2008-03-01 Synapse B.V. Prueba de diagnostico para la determinacion de la concentracion de actividad proteolitica transitoria en medios biologicos compuestos.
EP1717588A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-02 Synapse B.V. Measuring thrombin activity in whole blood
WO2007073597A1 (en) * 2005-12-27 2007-07-05 Mcmaster University Enzyme measurement assay using a modified substrate comprising a substrate attached to a macromolecule via a spacer
JP5461175B2 (ja) * 2006-06-06 2014-04-02 トロームビノスコープ ベスローテン フェンノートシャップ 生体媒質中で酵素活性を決定する方法
WO2009055940A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Verano Financial Ltd. Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
RU2395812C2 (ru) 2008-11-14 2010-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские инновации" Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5059525A (en) * 1984-11-19 1991-10-22 Boehringer Mannheim Gmbh Dry reagent for blood coagulation tests
WO1993010261A1 (en) * 1991-11-13 1993-05-27 Dahlbaeck Bjoern Method for the diagnosis of blood coagulation disorders
US5339830A (en) * 1992-01-21 1994-08-23 Blake Joseph W Iii Blood coagulation test system
WO2009098313A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Synapse B.V. Time-course measurement of enzymatic activity corrected for impacts of disturbances relating to the reaction of the enzyme with a substrate

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FADEEVA O.A. et al. "Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts. Biochemistry (Moscow), 2010 Jun, Vol. 75, no. 6, pp. 734-43, in particular, p. 736-737 *
KONDRATOVICH A.Y. et al. Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochimica et Biophysica Ada., 2002, 1569(1-3):86-104, p. 86-92 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2518247C2 (ru) 2014-06-10
CA2842594A1 (en) 2013-01-31
WO2013015717A2 (ru) 2013-01-31
WO2013015717A3 (ru) 2013-04-11
EA201400156A1 (ru) 2014-08-29
EP2752495B1 (en) 2020-03-25
EP2752495B8 (en) 2020-04-29
CN103998620A (zh) 2014-08-20
US9938563B2 (en) 2018-04-10
RU2011131293A (ru) 2013-02-10
WO2013015717A8 (ru) 2014-02-20
JP2014521952A (ja) 2014-08-28
EP2752495A4 (en) 2015-04-15
US20140227726A1 (en) 2014-08-14
CA2842594C (en) 2020-01-07
EP2752495A2 (en) 2014-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2752495B1 (en) Method for determining the activity of a proteolytic enzyme (variants), device for the implementation of same and diagnostic method
CA2879601C (en) Device for monitoring spatial coagulation of blood and of components thereof
CN109884289A (zh) 低样本容量的凝血检测
Lichtenbeld et al. Perfusion of single tumor microvessels: application to vascular permeability measurement
EP2029768B1 (en) Method of determining thrombin activity in plasma
BR112014031509B1 (pt) Para a determinação simultânea in vitro em tempo real do curso da atividade da enzima proteolítica e da resistência do coágulo de fibrina, reômetro rotativo e uso de um reômetro rotativo
CA2911873C (en) Means and methods for universal calibration of anti-factor xa tests
CN1650170A (zh) 用于测定复合生物介质中瞬时蛋白水解活性浓度的诊断测试
EP2087131B1 (en) Method for measuring the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media containing cells
WO2010094694A1 (en) Assays to predict cardiotoxicity
RU123166U1 (ru) Устройство мониторинга постранственного свертывания крови и ее компонентов
Koltsova et al. Determination of fibrin clot growth and spatial thrombin propagation in the presence of different types of phospholipid surfaces
RU2660706C1 (ru) Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК)
EA026282B1 (ru) Способ определения функционального состояния системы гемостаза
ES2857686T3 (es) Dispositivo para monitorizar la dinámica espacial y temporal de trombina
RU177920U1 (ru) Устройство мониторинга пространственно-временной динамики тромбина
RU2786591C2 (ru) Способ определения показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину
Pütz Imaging Microphysiometry of 2D and 3D Tissue Models: Method Development and Application
Jain Examination of a system for the mechanistic study of tumor cell-platelet interactions under well-defined flow conditions
Novikov et al. Correlation between erythrocyte sedimentation rate (ESR) dynamics and blood luminescence studied using of opto-electronic devices
Priezzhev et al. Assessment of whole blood structure and dynamics in vitro and in vivo by laser light scattering
WO2013105833A2 (ko) 트롬빈 생성 측정 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM

QB4A Registration of a licence in a contracting state