EA020310B1 - Модуляторы рецептора tgr5 и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к соединениям формулы Агде значения радикалов определены в описании изобретения. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей вышеуказанное соединение, или его соль, или сольват и фармацевтически приемлемый носитель, и к способу лечения или предупреждения заболевания, связанного с модулированием рецептора TGR5 у субъекта, включающему введение вышеуказанного соединения, или его соли, или сольвата.

Description

где значения радикалов определены в описании изобретения. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей вышеуказанное соединение, или его соль, или сольват и фармацевтически приемлемый носитель, и к способу лечения или предупреждения заболевания, связанного с модулированием рецептора ТОК5 у субъекта, включающему введение вышеуказанного соединения, или его соли, или сольвата.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, содержащим фрагмент серной или сульфоновой кислоты, которые модулируют рецептор ТСВ5, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие соединения, применимым в способах лечения и профилактики ряда заболеваний.

Предпосылки изобретения

ТСВ5 представляет собой рецептор, сопряженный с С-белком, который был идентифицирован, как рецептор, находящийся на поверхности клетки, который реагирует на желчные кислоты (ВА). Было обнаружено, что первичная структура ТСВ5 и его способность реагировать на желчные кислоты, обладают высокой степенью консервативности в ряду рецепторов ТСВ5, принадлежащих человеку, коровам, кроликам, крысам и мышам, и это позволяет предположить, что ТСВ5 обладает важными физиологическими функциями. Было установлено, что рецептор ТСВ5 широко распространен не только в лимфоидных, но также и в других тканях. Высокие уровни мРНК ТСВ5 были найдены в плаценте, селезенке и моноцитах/макрофагах. Было показано, что желчные кислоты вызывают интернализацию слитого белка ТСВ5 из клеточной оболочки в цитоплазму. Катеата1а с1 а1., 2003, 1. Βίο. СНет., 278, 9435. Было установлено, что ТСВ5 идентичен НСРСВ19, о котором сообщалось Такеба и соавторами 2002, ΕΕΒ8 Бей. 520, 97-101.

ТСВ5 связан с внутриклеточным накоплением сАМР, который в значительных количествах вырабатывается в клетках различных типов. Хотя активация обсуждаемого мембранного рецептора в макрофагах снижает выработку провоспалительных цитокинов (Катеата1а, Υ.; Επρί, В.; Нокоуа, М.; Нагаба, М.; ХокИба, Н.; Мпса, М.; Еикикитц 8.; НаЬа1а, Υ.; Еой, Т.; 8Ып1аш, Υ.; Нтита, 8.; Рицката, Υ.; Рицпо, М., А. С. рго1ет-соир1еб гесерЮг гекропыуе ΐο Ы1е ас1бк. 1. Βίο1. СНет. 2003, 278, 9435-9440) стимулирование ТСВ5 действием ВА в адипоцитах и миоцитах увеличивает расход энергии (\Уа1апаЬе М.; Нои1еп 8. М.; Ма1ак1 С.; С’11пк1оГГо1е1е М. А.; К1т, Β. У.; 8а1о Н.; Меккаббец Ν.; Нагпеу 1. У.; Ехакб О.; Кобата Т.; 8с1юоп)апк К.; Е1апсо А. С.; Аи\\егх 1., Рбе ас1бк тбисе епегду ехрепбйиге Ьу рготойпд т1гасе11и1аг 1Нуго1б йогтопе асйуайоп. №11иге. 2006, 439, 484-489). Этот последний эффект включает сАМР-зависимую индукцию йодтиронин дейодиназы 2 типа (Ό2), которая за счет локального превращения Т4 в Т3 вызывает увеличение активности тиреоидного гормона. В соответствии с ролью ТСВ5 в регулировании энергетического метаболизма, самки ТСВ-5-нокаутированных мышей продемонстрировали значительное накопление жира и прирост массы тела, когда их провоцировали кормом с высоким содержанием жира, показывая, что отсутствие ТСВ5 понижает расход энергии и вызывает ожирение (Магиуата Т.; Тапака, К.; 8ихик 1.; М1уокй1 Н.; Нагаба Ν.; №1катига Т.; М1уато1о Υ.; Капа1аш А.; Тата1 Υ., Тагде1еб б1кгирйоп оГ С рго1ет-соир1еб Ы1е ас1б гесерЮг 1 (СрЬаб/МБаг) ш писе. 1. Епбосгшок 2006, 191, 197-205). Помимо этого и в соответствии с участием ТСВ5 в энергетическом гомеостазе, сообщалось, что активация мембранного рецептора под действием жирных кислот способствует выработке глюкагон-подобного пептида 1 (СЬР-1) в линиях энтероэндокринных клеток мышей (Ка1кита, 8. ; Нйакатеа, А.; Ткицто1о, С., Рбе ас1бк ргото1е д1исадоп-йке рер11бе-1 кесгейоп 1йгоидй ТСВ5 ш а тигте еШегоепбосппе се11 1ше 8ТС-1. ΒίοсНет. БюрНук. Век. Соттип. 2005, 329, 386-390). Исходя из всех приведенных выше данных, ТСВ5 является привлекательной мишенью для лечения ряда заболеваний.

До настоящего времени в литературе было описано несколько примеров агонистов рецепторов ТСВ5. Недавно в качестве мощных и селективных агонистов ТСВ5 были описаны 23-алкилзамещенные и 6,23-алкил-дизамещенные производные хенодезоксихолевой кислоты, например, показанная ниже 6αэтил-23(8)-метилхенодезоксихолевая кислота (РеШсшап В.; 8а1о Н.; Сю1е11о А.; Сок1апйпо С.; МассЫаги1о А.; 8абедйроиг В. М.; Сюгд С.; 8сйооп)апк, К.; Аи\\егх 1., Хопдепоиис асбопк оГ Ьбе аабк. 8уп1йек1к апб ргейт1пагу сНагасйпхабоп оГ 23-апб 6,23-а1ку1-киЬк1йи1еб Ь11е ааб бепуайуек ак ке1есйуе тоби1а1огк Гог б1е д-рго1ет соир1еб гесерЮг ТСВ5. 1. Меб. СНет. 2007, 50, 4265-4268).

В частности, метилирование С₂₃-(8) положения природных ВА придает им заметную селективность в отношении способности активировать ТСВ5 по сравнению с активацией ЕХВ (рецептора X фарнезоидов), в то время как замещение алкилом положения 6α увеличивает силу действия на оба рецептора. Другие агонисты ТСВ5 включают бензиловый эфир 6-метил-2-оксо-4-тиофен-2-ил-1,2,3,4тетрагидропиримидин-5-карбоновой кислоты (УО 004067008, Такеба С’НетЮб !пбик(г1ек ЬТБ, 1арап, 2004) и олеанолевую кислоту (8а(о Н.; Сепе1 С.; 81геН1е А.; ТНотак С.; ЬоЬк1ет А.; Уадпег А.; Мюкко\\кк1 С.; Аитеегх 1.; 8а1абт В., Апййурегд1усет1с асбубу оГ а ТСВ5 адошк1 1ко1а1еб Ггот О1еа еигораеа. ΒίοсНет. апб Β^^δ. Век. Соттип. 2007, 362, 793-798; Ιΐο Ε.; Нтита К.; 1<ап/а1б Ν.; М1к1 Т.; Катеата1а, Υ.; Οί 8.; Та\\аеа1к1п Т.; 1кЫсН1 Υ.; НйоНакбб М. Ргерагайоп оГ аготабс ппд-Гикеб сусйс сотроипбк ак ТСВ5 гесерЮг адошк1к. ΡΝ: УО 2004067008, 2004. Позднее, первый синтез энантиомерной хенодезоксихолевой

- 1 020310 кислоты (СБСА) и литохолевой кислоты (ЬСА) дал возможность установить специфичность действия природных ВА на Т6Я5 (Ка1оиа В. Сшшшпк С. Ь.; Регдикои А. Ό.; Ы Т.; 8сйт1б1 Ό. Я.; Маиде1кбогГ, Ό. 1.; Соуеу Ό. Р., 8уи1йе818, С11агас1епха1юп апб Яесер1от 1и1етас1юи РгоГбек оГ Епапботепс Вйе Ас1бк. 1. Меб. Сйет. 2007, 50, 6048-6058).

Хотя указанные химические средства исследования впервые обеспечили фармакологическую дифференциацию геномных и негеномных действий ВА, некоторые из них позволили также провести первые исследования взаимосвязи между структурой и активностью, где наличие дополнительных связывающих карманов в молекуле ТСЯ5 играет ключевую роль в определении селективности по отношению к лигандам (РеШсс1ап Я.; 8а1о Н.; 6ю1е11о А.; Сок1аи1шо 6.; МассЫати1о А.; 8абедйроиг В. М.; 6ютд1 6.; 8сйоои)ап5 К.; Аишегх 1., Иоидеиотк асйоик оГ Ы1е ас1бк. 8уи1йе515 аиб рте11т1иагу с11агас1епха1юп оГ 23-аиб 6,23-а1ку1-8иЬ81йи1еб Ы1е ас1б бепуабуек ак 8е1есбуе тоби1а1от8 Гог 1йе д-ртокш соир1еб тесер1ог Т6Я5. 1. Меб. Сйет. 2007, 50, 4265-4268). В этом контексте возможность использования более мощных и селективных модуляторов ТСЯ5 необходима для дальнейшего выявления дополнительных особенностей, влияющих на активацию рецептора, и описания физиологического и фармакологического действия этого рецептора.

Существует потребность в разработке модуляторов рецептора ТСЯ5 для лечения и профилактики ряда заболеваний. В настоящем изобретении разработаны соединения, содержащие фрагмент серной или сульфоновой кислоты, которые модулируют ТСЯ5, а также способы применения этих соединений для лечения заболеваний.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к модуляторам рецептора ТСЯ5, содержащим фрагмент серной или сульфоновой кислоты, и к их применению для лечения и профилактики заболеваний, при которых происходит модулирование рецептора ТСЯ5, например, метаболических заболеваний, воспалительных заболеваний, заболеваний печени, аутоиммунных заболеваний, сердечных заболеваний, заболеваний почек, рака и заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Изобретение включает соединение, имеющее формулу А:

или его соль, сольват или гидрат, где Я1 означает водород, гидрокси, или незамещенный С1-С₆алкил или галоген; Я₂ означает водород или α-гидрокси; Яд означает водород, α-гидрокси; Я₅ означает водород или незамещенный С₁-С₆алкил; Я₆ означает водород; Я₇ означает водород, замещенный или незамещенный алкил или гидрокси; Я₁₁ означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород; Я12 означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород, или Я11 и Я₁₂ совместно образуют карбонил;

т означает 0, 1 или 2; и означает 0 или 1; о означает 0 или 1; и р означает 0 или 1; при условии, что:

(1) если т+и+о=3 или 4, р означает ноль, и Я₅ является атомом водорода, то Я₄ не является атомом водорода, если Я₇ не является ОН; (2) если т+и+о=3, р означает 1 и каждый из заместителей Я₅ и Яб является атомом водорода, то по меньшей мере один из заместителей Я2 и Я4 не является атомом водорода; и (3) если т+и+о=2, то по меньшей мере один из заместителей Я₅ и Я₆ не является атомом водорода.

В одном из аспектов настоящее изобретение включает соединение, имеющее формулу Ό

или его соль, сольват или гидрат, где Я₁ означает водород, гидрокси, или незамещенный С₁-С₆алкил или галоген; Я₂ означает водород или α-гидрокси; Яд означает этил; Я₇ означает водород, незамещенный С₁-С₆алкил или гидрокси; Я₁₁ означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород; и Я12 означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород.

В одном из аспектов настоящее изобретение включает соединение, имеющее формулу Е:

- 2 020310

или его соль, сольват или гидрат, где Κι означает водород, гидрокси, незамещенный С₁-С₆алкил или галоген; К₂ означает водород или α-гидрокси; Кд означает этил; К₅ означает водород или незамещенный С₁-С₆алкил; Кб означает водород; К₇ означает водород, незамещенный С₁-С₆алкил или гидрокси; К₁₁ означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород и К12 означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород.

В одном из аспектов, настоящее изобретение включает соединение или его соль, сольват или гидрат, где К₁ представляет собой ОН. В одном из аспектов настоящее изобретение включает соединение или его соль, сольват или гидрат, где К₇ представляет собой Н. В одном из аспектов, настоящее изобретение включает соединение или его соль, сольват или гидрат, где К₂ представляет собой Н. В одном из аспектов, настоящее изобретение включает соединение или его соль, сольват или гидрат, где Кд является незамещенным алкилом.

В одном из аспектов изобретение включает соединение, выбранное из

или его соль, сольват или гидрат.

В одном из аспектов настоящее изобретение включает соединение, которое представляет собой фармацевтически приемлемую соль. В одном из аспектов изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую соединение или его соль, сольват или гидрат, а также по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболеваний, при которых имеет место модулирование рецептора ТСК5. включающему введение соединения, имеющего формулу А, или его соли, сольвата или гидрата, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы А или его соль, сольват или гидрат

где

К₁ означает водород, гидрокси или незамещенный С₁-С₆алкил или галоген; К₂ означает водород или αгидрокси; Кд означает этил; К₅ означает водород или незамещенный С₁-С₆алкил; К₆ означает водород; К₇ означает водород или незамещенный С₁-С₆алкил или гидрокси; К₁₁ означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород; К12 означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород;

т означает 0,1 или 2; η означает 0 или 1; о означает 0 или 1 и р означает 0 или 1, для лечения или

- 3 020310 профилактики заболевания у субъекта, при котором имеет место модулирование рецептора ТСВ5.

В одном из аспектов настоящее изобретение включает указанный способ, где заболевание выбрано из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, заболевания печени, аутоиммунного заболевания, сердечного заболевания, заболевания почек, рака и заболевания желудочно-кишечного тракта. В одном из аспектов изобретение включает указанное применение, где заболевание выбрано из воспалительного заболевания и рака. В одном из аспектов изобретение включает указанный способ, где соединение или фармацевтическую композицию вводят субъекту перорально, парентерально, внутривенно или местно. В одном из аспектов изобретение включает указанный способ, где субъект является человеком.

В приведенном выше описании наиболее важные особенности настоящего изобретения изложены до некоторой степени обобщенно, для того, чтобы можно было понять приведенное ниже подробное описание изобретения и чтобы можно было лучше оценить вклад настоящего изобретения в технику. Другие цели и отличительные особенности настоящего изобретения станут ясны из рассмотрения приведенного ниже подробного описания в сочетании с примерами.

Краткое описание иллюстративного материала

Фиг. 1 представляет собой график, на котором изображена зависимость поверхностного натяжения от логарифма концентрации соединения ЗА (мМ) в 0,15М ЫаС1.

Фиг. 2 представляет собой график, на котором изображена метаболическая устойчивость соединения 2А в искусственной панкреатической жидкости.

Фиг. 3 представляет собой график, на котором изображено выделение желчи в эксперименте по дуоденальной инфузии соединения ЗА.

Фиг. 4 представляет собой график, на котором изображено выделение желчи в эксперименте по феморальной инфузии соединения ЗА.

Фиг. 5 представляет собой график, на котором изображена зависимость скоростей секреции от времени в экспериментах по феморальной и дуоденальной инфузии соединения ЗА.

Фиг. 6 и 7 представляют собой графики, на которых показано содержание соединения ЗА и его основного метаболита в желчи, определенное с использованием масс-спектрометрии в эксперименте по дуоденальной инфузии. Данные приведены в виде абсолютных значений площади. Фиг. 7 представляет собой увеличенный фрагмент фиг. 6.

Фиг. 8 представляет собой график, на котором показан прирост массы (%) в зависимости от времени после введения препарата (пример 11).

Фиг. 9 представляет собой группу гистограмм, отображающих изменение со временем массы различных составных частей организма (в %) в результате введения препаратов через 5 недель с начала введения (пример 11).

На фиг. 10 показаны результаты оценки гомеостаза глюкозы для соединения ЗА. На фиг. 10А показана гликемия через З недели после начала введения. На фиг. 10В показано содержание фруктозаминов через З недели после начала введения. На фиг. 10С показаны результаты теста на переносимость глюкозы через 9 недель после начала введения.

Описание изобретения

В приведенном ниже описании изложены детали одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения. В данном разделе описаны способы и материалы, хотя при практическом воплощении или тестировании по настоящему изобретению могут применяться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке. Другие отличительные особенности, цели и преимущества настоящего изобретения будут ясны из приведенного описания. В тексте описания формы единственного числа включают также формы множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Если не определено по-другому, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют значение, в котором их обычно понимает рядовой специалист в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае возникновения противоречий, настоящее описание будет иметь преимущественную силу.

В одном из аспектов, изобретение относится к соединению, имеющему формулу А

или его соли, сольвату или гидрату, где В! означает водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил или галоген; В₂ означает водород или α-гидрокси; В₄ означает водород, замещенный или незамещенный алкил или галоген; В₅ означает водород, незамещенный алкил или арил; В₆ означает водород, незамещенный или замещенный алкил, или В₅ и В₆ совместно с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют цикл, состоящий из З, 4, 5 или 6 атомов; В₇ означает водород, замещенный или

- 4 020310 незамещенный алкил или гидрокси; Иц означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород; К12 означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород, или Иц и И12 совместно образуют карбонил; т означает 0, 1 или 2; η означает 0 или 1; о означает 0 или 1 и р означает 0 или 1.

В одном из аспектов изобретения, если т+п+о=3 или 4, р означает ноль и И₅ является атомом водорода, то И₄ не является атомом водорода, если И₇ не является группой ОН. В другом аспекте изобретения, если т+п+о=3 или 4, р означает ноль, и И₅ не является незамещенным алкилом или арилом, то И₄ не является атомом водорода, если И₇ не является группой ОН.

В одном из аспектов настоящего изобретения, если т+п+о=3, р означает 1 и каждый из заместителей И₅ и И₆ является атомом водорода, то, по меньшей мере, один из заместителей И₂ и И₄ не является атомом водорода.

В одном из аспектов настоящего изобретения, если т+п+о=2, то по меньшей мере один из заместителей И₅ и И₆ не является атомом водорода.

В одном из аспектов настоящее изобретение не включает соединения А, В и С

или их соли, сольваты или гидраты. В другом аспекте, изобретение не включает соединение 6А или его соль, сольват или гидрат. В другом аспекте, изобретение не включает соединение 7А или его соль, сольват или гидрат.

В одном из аспектов, изобретение относится к соединению, имеющему формулу В

или его соли, сольвату или гидрату, где И₂, И₄ и И₆, т, п, о и р соответствуют данным выше определениям. В одном из аспектов изобретения, если т+п+о=3 или 4, р означает ноль, И₅ является атомом водорода, то И₄ не является атомом водорода. В одном из аспектов настоящего изобретения, если т+п+о=3, р означает 1, и каждый из заместителей И₅ и И₆ является атомом водорода, то по меньшей мере один из заместителей И₂ и И₄ не является атомом водорода. В другом аспекте настоящего изобретения, если т+п+о=2, то по меньшей мере один из заместителей И₅ и И₆ не является атомом водорода.

В одном из аспектов, изобретение относится к соединению, имеющему формулу С

или его соли, сольвату или гидрату, где И₂, И₅, И₆, т, п, о и р соответствуют данным выше определениям. В одном из аспектов изобретения, если т+п+о=2, то по меньшей мере один из заместителей И₅ и Кб не является атомом водорода.

В одном из аспектов, изобретение относится к соединению, имеющему формулу Ό

		^8О3Н
Β-Ι2
	А	(О)

или его соли, сольвату или гидрату, где К₁, И₂, И₄, И₇, Иц и И₁₂ соответствуют данному выше определению. В одном из аспектов, И₄ не является атомом водорода.

- 5 020310

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, имеющему формулу Е

или его соли, сольвату или гидрату, где Κι означает водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил или галоген; К₂ означает водород или α-гидроксил; Ед означает водород, замещенный или незамещенный алкил или галоген; К₅ означает водород, незамещенный алкил или арил; Кб означает водород, незамещенный или замещенный алкил, или К₅ и Кб совместно с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют цикл, состоящий из 3, 4, 5 или 6 атомов; К₇ означает водород, замещенный или незамещенный алкил или гидрокси; К₁₁ означает гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород; и К12 означает гидроксил, Ο8Ο₃Η, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород, или К11 и К₁₂ совместно образуют карбонил. В одном из аспектов изобретения по меньшей мере один из заместителей К₅ или К₆ не является атомом водорода.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, имеющему формулу Е

или его соли, сольвату или гидрату, где К₅ означает незамещенный или замещенный алкил или арил; и К₁, К₂, К₄, К₇, К₁₁ и К₁₂ соответствуют данным выше определениям.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, имеющему формулу С

или его соли, сольвату или гидрату, где К₁, К₂, К₄, К₇, К₁₁ и К₁₂ соответствуют данным выше определениям.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, имеющему формулу Н

или его соли, сольвату или гидрату, где К₂, К₅ и К₆ соответствуют данным выше определениям.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₁ означает ОН.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₇ означает Н.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₁ означает ОН, и К₇ означает Н.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₂ означает Н. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₂ означает альфа-ОН. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₂ означает бета-ОН.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где К₄ представляет собой незамещенный алкил. В одном из аспектов изобретение относится к соединению

- 6 020310 или его соли, сольвату или гидрату, где И₄ представляет собой этил. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₄ представляет собой метил.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₅ не является атомом водорода. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₅ представляет собой незамещенный алкил. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₅ представляет собой метил.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₆ является водородом.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где оба заместителя И₅ и К.₆ являются атомами водорода.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где Иц представляет собой гидроксил. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₁₂ представляет собой водород. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где Иц представляет собой гидроксил и К._|2 является атомом водорода.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где т равно 1. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где т равно 2. В одном из аспектов, изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где η равно 1.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где о равно 0. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где о равно 1.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где р равно 1. В одном из аспектов, изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где р равно 0.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₄ представляет собой этил и р равно 1. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₄ представляет собой этил, и соединение содержит сульфонатный фрагмент. В одном из аспектов изобретение относится к соединению или его соли, сольвату или гидрату, где И₄ представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкил, и р равно 0.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, выбранному из

или его соли, сольвату или гидрату.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению, где соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль.

В одном из аспектов изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли, выбранной из

- 7 020310

В одном из аспектов изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

В одном из аспектов изобретение относится к применению соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для изготовления лекарственных средств, для лечения или профилактики заболевания у субъекта. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики заболевания у субъекта путем введения соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном из аспектов изобретение предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном из аспектов изобретение предусматривает введение субъекту профилактически эффективного количества соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В одном из аспектов изобретение относится к применению соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, при котором имеет место модулирование рецептора ТСВ5. у субъекта. Настоящее изобретение включает способ лечения или профилактики заболевания, при котором имеет место модулирование рецептора ТСВ5. у субъекта, путем введения соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В одном из аспектов изобретение относится к указанному применению, где заболевание выбрано из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, заболевания печени, аутоиммунного заболевания, сердечного заболевания, заболевания почек, рака и заболевания желудочно-кишечного тракта, причем применяемое соединение имеет формулу А, В, С, Ό, Ε, Е или С. Изобретение охватывает способ лечения или профилактики заболевания, выбранного из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, заболевания печени, аутоиммунного заболевания, сердечного заболевания, заболевания почек, рака и заболевания желудочно-кишечного тракта, с применением соединений формул А, В, С, Ό, Ε, Е или С. Изобретение охватывает способ лечения или профилактики воспалительного заболевания или рака с применением соединений формул А, В, С, Ό, Ε, Е или С.

В одном из аспектов изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой метаболическое заболевание, выбранное из ожирения, диабета, метаболического синдрома, невосприимчивости к инсулину, гипертонии и дислипидемии. Изобретение включает способ лечения или профилактики метаболического заболевания, выбранного из ожирения, диабета, метаболического синдрома, невосприимчивости к инсулину, гипертонии и дислипидемии.

В одном из аспектов изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой воспалительное заболевание, выбранное из аллергии, остеоартрита, аппендицита, бронхиальной астмы, панкреатита, аллергической сыпи и псориаза. Изобретение включает способ лечения или профилактики воспалительного заболевания, выбранного из аллергии, остеоартрита, аппендицита, бронхиальной астмы, панкреатита, аллергической сыпи и псориаза.

В одном из аспектов изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, выбранное из ревматоидного артрита, рассеянного склероза и диабета I типа. Изобретение включает способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания, выбранного из ревматоидного артрита, рассеянного склероза и диабета I типа.

- 8 020310

В одном из аспектов, изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой заболевание желудочно-кишечного тракта, выбранное из воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), синдрома короткого кишечника (радиационного колита), микроскопического колита, синдрома раздраженного кишечника (расстройства всасывания в кишечнике) и чрезмерного развития микрофлоры. Изобретение включает способ лечения или профилактики желудочно-кишечного заболевания, выбранного из воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона, язвенного колита), синдрома короткого кишечника (радиационного колита), микроскопического колита, синдрома раздраженного кишечника (расстройства всасывания в кишечнике) и чрезмерного развития микрофлоры.

В одном из аспектов, изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой почечное заболевание, выбранное из диабетической нефропатии, хронической почечной недостаточности, гипертонического нефросклероза, хронического гломерулонефрита, хронической трансплантационной гломерулопатии, хронического интерстициального нефрита и поликистозной болезни почек. Изобретение включает способ лечения или профилактики почечного заболевания, выбранного из диабетической нефропатии, хронической почечной недостаточности, гипертонического нефросклероза, хронического гломерулонефрита, хронической трансплантационной гломерулопатии, хронического интерстициального нефрита и поликистозной болезни почек.

В одном из аспектов, изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой раковое заболевание, выбранное из колоректального рака, рака печени, гепатоклеточной карциномы, холангиокарциномы, рака почек, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака простаты и инсуланомы. Изобретение включает способ лечения или профилактики ракового заболевания, выбранного из колоректального рака, рака печени, гепатоклеточной карциномы, холангиокарциномы, рака почек, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака простаты и инсуланомы.

В одном из аспектов, изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой заболевание печени, выбранное из неалкогольного стеатогепатита, неалкогольного жирового перерождения печени, хронического вирусного гепатита, алкогольных заболеваний печени, лекарственного гепатита, гемохроматоза, первичного билиарного цирроза, первичного склерозирующего холангита, портальной гипертензии, десатурации желчи, болезни Гоше, болезни Вилсона, недостаточности α1антитрипсина, полного парентерального питания (ΤΡΝ), холелитиаза, холелитиаза, связанного с ΤΡΝ, и сепсиса. Изобретение включает способ лечения или профилактики заболевания печени, выбранного из неалкогольного стеатогепатита, неалкогольного жирового перерождения печени, хронического вирусного гепатита, алкогольных заболеваний печени, лекарственного гепатита, гемохроматоза, первичного билиарного цирроза, первичного склерозирующего холангита, портальной гипертензии, десатурации желчи, болезни Гоше, болезни Вилсона, недостаточности αΐ-антитрипсина, полного парентерального питания (ΤΡΝ), холелитиаза, холелитиаза, связанного с ΤΡΝ и сепсиса.

В одном из аспектов изобретение относится к указанному применению, где заболевание представляет собой сердечное заболевание, выбранное из застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, атеросклероза, стенокардии, артериосклероза и цереброваскулярных заболеваний (кровоизлияния, инсульта, цереброваскулярного инфаркта). Изобретение включает способ лечения или профилактики сердечного заболевания, выбранного из застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, атеросклероза, стенокардии, артериосклероза и цереброваскулярных заболеваний (кровоизлияния, инсульта, цереброваскулярного инфаркта).

В одном из аспектов, при заболевании имеет место модулирование активности рецептора ΤΟΚ.5. В одном из аспектов соединение по настоящему изобретению является агонистом рецептора ΤΟΚ.5. В одном из аспектов, соединение является селективным агонистом ΤΟΚ.5, по сравнению с его способностью к активации ГХК В одном из аспектов, соединение является частичным модулятором ГХР. В одном из аспектов соединение является частичным агонистом ГХК

В одном из аспектов, соединение или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят субъекту перорально, парентерально, внутривенно или местно. В одном из аспектов указанный субъект является человеком.

Определения

В целях удобства, в настоящем разделе собраны некоторые термины, применяемые в настоящем описании, примерах и приложенной формуле изобретения.

Термин лечение в настоящем описании означает облегчение, уменьшение, ослабление, устранение, модулирование или улучшение, т.е. относится к действиям, вызывающим регрессию заболевания или болезненного состояния. Кроме того, лечение может включать подавление, т.е. остановку развития существующей болезни или болезненного состояния, и облегчение или улучшение, т.е. регрессию существующего болезненного состояния или заболевания, например, если уже имеется болезненное состояние или заболевание.

Термин профилактика в настоящем описании означает полное или почти полное предотвращение появления у пациента заболевания или болезненного состояния, особенно если пациент или субъект

- 9 020310 предрасположен к этому заболеванию или имеется опасность появления такого заболевания или болезненного состояния.

Термин алкил охватывает насыщенные алифатические группы, в т.ч. алкильные группы с линейной цепью (например, метил, этил, пропил, бутил, фенил, гексил, гептил, окстил, нонил, децил) и алкильные группы с разветвленной цепью (например, изопропил, трет-бутил, изобутил). В некоторых вариантах осуществления, в углеродном скелете алкильных групп с линейными или разветвленными цепями содержится не более шести атомов углерода (т.е. С₁-С₆ для линейных цепей, С₃-С₆ для разветвленных цепей). В некоторых примерах, скелет линейных или разветвленных алкильных групп содержит не более четырех атомов углерода.

В настоящем описании подразумевается, что термин циклоалкил охватывает насыщенные циклические группы, например, циклопропил, циклобутил или циклопентил. Имеется в виду, что термин С_3-8 циклоалкил включает С3, С4, С5, С6, С7 и С8 циклоалкильные группы.

Термин замещенный алкил относится к алкильным фрагментам, в которых у одного или нескольких атомов углерода углеродного скелета имеется заместитель, присутствующий вместо одного или нескольких атомов водорода. В число таких заместителей могут входить, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, циано, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфат, алкилсульфинил, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил, или ароматические или гетероароматические фрагменты.

Термин арил включает группы, обладающие ароматичностью, в т.ч. 5- и 6-членные несопряженные или моноциклические ароматические группы, которые могут включать от нуля до четырех гетероатомов, а также сопряженные или мультициклические системы, по меньшей мере, с одним ароматическим циклом. Примеры арильных групп включают бензол, фенил, пиррол, фуран, тиофен, тиазол, изотиазол, имидазол, триазол, тетразол, пиразол, оксазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиридазин, пиримидин и т.п. Кроме того, термин арил включает мультициклические арильные группы, например, трициклические, бициклические, например, нафталин, бензоксазол, бензодиоксазол, бензотиазол, бензоимидазол, бензотиофен, метилендиоксифенил, хинолин, изохинолин, нафтиридин, индол, бензофуран, пурин, бензофуран, деазапурин или индолизин. Арильные группы, в циклических структурах которых имеются гетероатомы, могут также именоваться арильными гетероциклами, гетероциклами, гетероарилами или гетероароматическими. Ароматический цикл может быть замещен по меньшей мере по одному положению цикла, перечисленными выше заместителями, как, например, галогеном, гидроксилом, алкокси, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилатом, алкилкарбонилом, алкиламинокарбонилом, аралкиламинокарбонилом, алкениламинокарбонилом, алкилкарбонилом, арилкарбонилом, аралкилкарбонилом, алкенилкарбонилом, алкоксикарбонилом, аминокарбонилом, алкилтиокарбонилом, фосфатом, фосфонатом, фосфинатом, циано, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрилом, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилатом, сульфатом, алкилсульфинилом, сульфонатом, сульфамоилом, сульфонамидо, нитро, трифторметилом, циано, азидо, гетероциклилом, алкиларилом или ароматическими или гетероароматическими фрагментами. Кроме того, арильные группы могут быть конденсированными или связанными мостиковой связью с алициклическими или гетероциклическими фрагментами, которые не являются ароматическими, с образованием мультициклической системы (например, тетралина, метилендиоксифенила).

Если число атомов углерода не определено иным образом, низшие алкилы включают определенные выше алкильные группы, содержащие от одного до десяти, например, от одного до шести атомов углерода в углеродном скелете.

Термин сложный эфир охватывает соединения и фрагменты, которые включают атом углерода или гетроатом, связанный с атомом кислорода, который, в свою очередь, связан с углеродом карбонильной группы. Термин сложный эфир охватывает алкоксикарбоксигруппы, например, метоксикарбонил, этоксикарбонил, пропоксикарбонил, бутоксикарбонил, пентоксикарбонил и т.д. Алкильные, алкенильные или алкинильные группы соответствуют данным выше определениям.

Термин гидрокси или гидроксил включает такие группы, как -ОН или -О^-.

Термин галоген включает фтор, бром, хлор, йод и т.д. Термин пергалогензамещенный обычно относится к фрагменту, в котором все атомы водорода заменены атомами галогена.

Термин анионная группа в настоящем описании относится к группе, которая несет отрицательный заряд при физиологических значениях рН. Анионные группы включают карбоксилат, сульфат, сульфо

- 10 020310 нат, сульфинат, сульфамат, тетразолил, фосфат, фосфонат, фосфинат или фосфоротиоат или их функциональные эквиваленты. Имеется в виду, что функциональные эквиваленты анионных групп включают биоизостеры, например, биоизостеры карбоксильной группы. Биоизостеры охватывают как классические биоизостерические эквиваленты, так и неклассические биоизостерические эквиваленты. Классические и неклассические биоизостеры известны в технике (см., например, 811уегшаи, Я.В. Тйе Огдатс СйешИйу οί Эгид Иеыди апб Эгид Άεΐίοη, Аса6еш1с Ргекк, 1пс.: 8аи И1едо, СайГ.. 1992, рр.19-23). Другой анионной группой является карбоксилат.

Термин неустойчивая функциональная группа относится к замещающему фрагменту, который содержит лабильную связь, например, функциональный фрагмент или связь, которые чувствительны к гидролизу или расщеплению в физиологических условиях (например, в водных растворах в нейтральном диапазоне рН). Примеры неустойчивых функциональных групп включают ацетали и кетали.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению, например, соли этих соединений, могут существовать либо в гидратированной, либо в негидратированной (безводной) форме, либо в виде сольватов с молекулами других растворителей. Не ограничивающие примеры гидратов включают моногидраты, дигидраты и т.д. Не ограничивающие примеры сольватов включают сольваты с этанолом, сольваты с ацетоном и т.д.

Термин сольваты относится к продуктам присоединения растворителя, которые содержат как стехиометрические, так и нестехиометрические количества растворителя. Некоторые соединения в твердом кристаллическом состоянии имеют тенденцию захватывать молекулы растворителя в определенной мольной пропорции, образуя при этом сольваты. Если растворитель является водой, то образовавшийся сольват представляет собой гидрат, если растворитель является спиртом, то образовавшийся сольват представляет собой алкоголят. Г идраты образуются при соединении одной или нескольких молекул воды с одним из веществ по настоящему изобретению, где вода сохраняет свое молекулярное состояние в виде Н₂О, причем в результате такого соединения возможно образование одного или нескольких гидратов.

Следует отметить, что структура некоторых соединений по настоящему изобретению включает асимметрические атомы углерода. Соответственно, необходимо понимать, что появляющиеся в результате этой асимметрии изомеры (например, все энантиомеры и диастереомеры) включены в объем настоящего изобретения, если не указано иное. Эти изомеры можно получать в практически чистом виде с помощью классических методик разделения, а также с помощью стереохимически управляемого синтеза. Энантиомеры (Я- и 8-конфигурации) именуют по системе правил, разработанных Я.8.Сайи, С.1идо16 и У.Рге1од (Каном, Ингольдом и Прелогом).

Далее, структуры и соединения, описанные в настоящей заявке, включают все атропические изомерные формы. Атропические изомеры представляют собой один из типов стереоизомеров, в которых атомы двух изомеров по-разному расположены в пространстве. Существование атропических изомеров возможно вследствие ограниченного вращения, вызванного затруднением вращения объемных групп вокруг центральной связи. Такие атропические изомеры, как правило, существуют в форме смеси, однако в результате современных достижений в области хроматографии, в некоторых случаях появилась возможность разделять смеси двух атропических изомеров.

Имеется в виду, что термины устойчивое соединение и устойчивая структура указывают на соединение, которое достаточно устойчиво для того, чтобы не разрушаться при выделении из реакционной смеси и очистке до приемлемой степени чистоты, а также при включении в состав эффективного лекарственного препарата.

В настоящем описании термин аналог относится к химическому соединению, которое структурно подобно другому соединению, но незначительно отличается от него по составу и строению (например, заменой одного атома атомом другого элемента, или заменой одной функциональной группы другой функциональной группой). Так, например, аналог представляет собой соединение, которое подобно или сопоставимо с исходным соединением по своему действию и свойствам.

В настоящем описании термин производное, например, в термине производные желчной кислоты относится к соединениям, которые включают общее ядро, состоящее из 4 циклов, и замещены различными группами, описанными в настоящей заявке.

Химические соединения, описанные в настоящей заявке, могут иметь асимметрические центры. Соединения по настоящему изобретению, содержащие асимметрически замещенный атом, могут быть выделены в оптически активных или рацемических формах. В технике хорошо известны способы получения оптически активных форм, например, путем разделения рацемических форм или путем синтеза из оптически активных исходных веществ. Для соединений, описанных в настоящей заявке, может существовать большое число геометрических изомеров за счет наличия олефиновых связей, двойных связей ί.'=Ν и т.п., и все устойчивые изомеры этого типа рассматриваются в настоящем изобретении. Описаны цис- и транс геометрические изомеры соединений по настоящему изобретению и их можно выделить в виде смеси изомеров или в виде отдельных изомерных форм. Имеется в виду, что в изобретение включены все хиральные, диастереомерные, рацемические и геометрические изомерные формы соединений, если нет указания на конкретную стереохимию или изомерную форму. Все способы, применяемые для

- 11 020310 получения соединений по настоящему изобретению, и интермедиаты, получаемые в этих способах, там, где это уместно, рассматриваются в качестве составной части настоящего изобретения. Все таутомеры показанных или описанных соединений, в случаях, когда это уместно, также рассматриваются в качестве составной части настоящего изобретения.

Термин биоизостер относится к соединению, которое образуется при замене атома или группы атомов другими, аналогичными в широком смысле, атомом или группой атомов. Биоизостерическая замена может быть обоснована физико-химически или топологически. Примеры биоизостеров карбоновых кислот включают ацил сульфонимиды, тетразолы, сульфонаты и фосфонаты. См., например, ΡαΙαηί аик Ьа Уо1е, Скет. Неу. 96, 3147-3176 (1996).

Фраза фармацевтически приемлемый признана в технике. В некоторых аспектах этот термин включает композиции, полимеры и другие материалы и/или дозированные формы, которые, согласно обоснованному суждению медицины, подходят для применения в контакте с тканями людей и животных, не вызывая избыточного токсического действия, раздражения, аллергической реакции, или других проблем или осложнений, и соответствуют разумному соотношению польза/риск.

Фраза фармацевтически приемлемый носитель признана в технике и включает, например, фармацевтически приемлемые материалы, композиции или носители, например, жидкие или твердые наполнители, разбавители, растворители или инкапсулирующие вещества, которые принимают участие в переносе или транспортировке любой композиции по настоящему изобретению из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен являться приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции по настоящему изобретению и отсутствия вреда для пациента. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является апирогенным. Некоторые примеры веществ, которые могут применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают:

(1) сахара, например лактозу, глюкозу и сахарозу; (2) крахмалы, например кукурузный крахмал или картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, например натрийкарбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразную камедь трагаканта; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) наполнители, например масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, например масло арахиса, масло хлопчатника, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, например пропиленгликоль; (11) полиолы, например глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, например этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные средства, например гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатные буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических составах.

Комбинированная терапия (или котерапия) включает введение соединения по настоящему изобретению и по меньшей мере одного второго агента в качестве составных частей конкретной схемы лечения, предназначенной для обеспечения благоприятного эффекта от совместного действия этих терапевтических агентов (т.е. соединения по настоящему изобретению и по меньшей мере еще одного второго агента). Благоприятный эффект от применения комбинации включает, не ограничиваясь этим, совместное фармакокинетическое или фармакодинамическое действие, возникающее в результате комбинирования терапевтических агентов. Введение упомянутых терапевтических агентов в составе комбинации, как правило, осуществляют в течение определенного периода времени (обычно измеряемого минутами, часами, днями или неделями, в зависимости от выбранной комбинации). Термин комбинированная терапия может предназначаться, но, как правило, не предназначается, для указания на введение двух или нескольких из этих терапевтических агентов, как частей отдельных схем монотерапии, что случайно и произвольно приводит к комбинациям по настоящему изобретению. Термин комбинированная терапия предназначен для обозначения введения этих терапевтических агентов в определенной последовательности, т.е. когда каждый из терапевтических агентов вводят в отдельный момент времени, а также когда введение этих терапевтических агентов, или по меньшей мере двух из них, осуществляется практически одновременно. Практически одновременное введение можно осуществлять, например, путем введения субъекту одной капсулы, содержащей терапевтические агенты в фиксированном соотношении, или нескольких капсул, по одной для каждого из терапевтических агентов. Последовательное или практически одновременное введение каждого из терапевтических агентов можно выполнять подходящим путем, включая, но, не ограничиваясь этим, пероральное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение и прямую абсорбцию через ткань слизистых оболочек. Терапевтические агенты могут вводиться одним и тем же путем или разными путями. Например, первый терапевтический агент выбранной комбинации может вводиться с помощью внутривенной инъекции, тогда как другой терапевтический агент комбинации может вводиться перорально. С другой стороны, например, все терапевтические агенты можно вводить перорально или все терапевтические агенты можно вводить с помощью внутривенной инъекции. Последовательность, в которой осуществляется введение терапевтических агентов, не имеет решающего значения.

- 12 020310

Термин комбинированная терапия охватывает также введение описанных выше терапевтических агентов в дополнительной комбинации с другими биологически активными ингредиентами и нелекарственными видами лечения (например, хирургией или механическим воздействием). Если комбинированная терапия дополнительно включает нелекарственную форму лечения, это нелекарственное лечение можно проводить в любое подходящее время и так долго, пока не будет достигнут положительный эффект от совместного действия терапевтических агентов и нелекарственного лечения. Например, в соответствующих случаях, положительного эффекта удается добиться при временном исключении применения нелекарственного лечения из схемы введения терапевтического агента, возможно, на несколько дней или даже недель.

Термины парентеральное введение и введенный парентерально в настоящем описании относятся к способам введения, отличающимся от энтерального и местного введения, обычно с помощью инъекции, и эти термины включают, не ограничиваясь перечисленным, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрикапсулярные, интраорбитальные, внутрисердечные, внутрикожные, интраперитонеальные, транстрахеальные, подкожные, подкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные и интрастернальные инъекции и инфузии.

Терапевтически эффективное количество соединения или комбинации соединений по настоящему изобретению представляет собой количество (количество в абсолютном выражении или концентрацию) соединения или соединений. В одном из вариантов осуществления, если терапевтически эффективное количество соединения вводят субъекту при необходимости лечения симптомов заболевания, то облегчение симптомов происходит немедленно, либо после введения соединения еще один или несколько раз. Количество соединения, которое следует вводить субъекту, будет зависеть от конкретного расстройства, способа введения, совместно вводимых соединений, при наличии таковых, а также особенностей субъекта, например, общего состояния здоровья, наличия других заболеваний, возраста, пола, генотипа, массы тела и переносимости лекарственных средств. Специалист в данной области будет способен определить подходящие дозировки в зависимости от этих и других факторов.

Термин профилактически эффективное количество означает количество (абсолютное количество или концентрацию) соединения или комбинации соединений по настоящему изобретению, которое вводят для предупреждения или уменьшения опасности возникновения заболевания - другими словами, количество, необходимое для обеспечения предупредительного или профилактического эффекта. Количество соединения по настоящему изобретению, которое следует ввести субъекту, будет зависеть от конкретного расстройства, способа введения, совместно вводимых соединений, при наличии таковых, а также особенностей субъекта, например, общего состояния здоровья, наличия других заболеваний, возраста, пола, генотипа, массы тела и переносимости лекарственных средств.

Термин уменьшение опасности в настоящем описании означает понижение возможности или вероятности появления заболевания у пациента, в особенности, если субъект или пациент предрасположен к появлению этого заболевания.

Соль соединения по настоящему изобретению представляет собой производное соединения, которое содержит ионную связь, и, как правило, образуется при взаимодействии соединения с кислотой или основанием.

Фармацевтически приемлемая соль является солью, которая подходит для введения субъекту.

В настоящем описании термин фармацевтически приемлемая соль относится к производному раскрытого соединения, в котором исходное соединение модифицировано путем получения его соли с кислотой или основанием. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, не ограничиваясь этим, соли основных групп, например, аминов, с минеральными и органическими кислотами; соли кислотных групп, например, карбоксильных групп со щелочами или органическими основаниями; и т.п. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли исходных соединений, образованные, например, нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Такие обычные нетоксичные соли включают, не ограничиваясь этим, например, соли, полученные из неорганических и органических кислот, выбранных из 2-ацетоксибензойной, 2гидроксиэтансульфоновой, уксусной, аскорбиновой, бензолсульфоновой, бензойной, бикарбоновой, угольной, лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гликолиларсаниловой, гексилрезорциновой, гидрабаминовой, бромисто-водородной, хлористо-водородной, йодисто-водородной, гидроксималеиновой, гидроксинафтойной, изетионовой, молочной, лактобионовой, лаурилсульфоновой, малеиновой, яблочной, миндальной, метансульфоновой, напсиловой, азотной, щавелевой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фосфорной, полигалактуроновой, пропионовой, салициловой, стеариновой, себациновой, янтарной, сульфаминовой, сульфаниловой, серной, дубильной, винной и толуолсульфоновой кислот.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно получить из исходных соединений, которые содержат основной или кислотный фрагмент, с помощью обычных химических методик. Как правило, эти соли можно получить взаимодействием соединений в форме свободных кислот и оснований со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или органи

- 13 020310 ческом растворителе или их смеси; как правило, предпочтительной является неводная среда, например, эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечень подходящих солей приведен в Кетίη§1οη'δ Рйаттасеибса1 8с1епсе8, 18⁴¹¹ еб., Маск РиЫ18Ыпд Сотрапу, Еайоп, РА, И8А, р. 1445 (1990).

Фармацевтическая композиция представляет собой состав, содержащий соединение по настоящему изобретению в форме, подходящей для введения субъекту. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция может находиться в виде нерасфасованной массы или в виде дозированной лекарственной формы. Дозированная лекарственная форма представляет собой любую из целого ряда известных форм, включая, например, капсулу, пакет для внутривенного вливания, таблетку, единичную дозу аэрозольного ингалятора или пузырек. Количество действующего ингредиента (например, состава соединения по настоящему изобретению или его соли) в единице дозированной формы фармацевтической композиции представляет собой эффективное количество, и оно меняется в соответствии с конкретным лечением, в котором применяется эта дозированная форма. Специалист в данной области должен понимать, что иногда необходимо вносить стандартные изменения в дозировку, в зависимости от возраста и состояния пациента. Кроме того, дозировка будет зависеть от пути введения. В изобретении предусмотрен целый ряд путей введения, в т.ч. пероральный, легочный, ректальный, парентеральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, интраназальный и т.п. Дозированные формы для местного или трансдермального введения соединений по настоящему изобретению, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. В другом варианте осуществления, действующее соединение смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем, а также с любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.

Термин флэш-доза (доза моментального действия) относится к составам соединений, которые представляют собой дозированные формы, способные к быстрому диспергированию.

Термин немедленное высвобождение определяется как высвобождение соединения из дозированной формы за относительно короткий период времени, как правило, примерно до 60 мин. Термин модифицированное высвобождение определяется как включающий отсроченное высвобождение, продолжительное высвобождение и импульсное высвобождение. Термин импульсное высвобождение подразумевает последовательность импульсов высвобождения лекарственного средства из дозированной формы. Термин устойчивое высвобождение или продолжительное высвобождение служит для описания непрерывного высвобождения соединения из дозированной формы на протяжении длительного времени.

Термин субъект включает млекопитающих, например людей, животных-компаньонов (например, собак, кошек, птиц и т.п.), сельскохозяйственных животных (например, коров, овец, свиней, лошадей, домашнюю птицу и т.п.), а также лабораторных животных (например, крыс, мышей, морских свинок, птиц и т.п.). Как правило, субъект представляет собой человека.

Соединения по настоящему изобретению также включают пролекарства или физиологически эквивалентные производные. Термины пролекарство или физиологически эквивалентное производное относятся к предшественнику лекарственного средства, который претерпевает метаболическое превращение ίη νίνο с образованием действующего лекарственного средства. Кроме того, в изобретении рассматривается применение пролекарств, которые ίη νίνο претерпевают превращение в модулирующие ТСК5 соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению (см., например, КВ.^Кегтащ 1992, ТНе Отдашс СНетМгу о£ Эгид Эемдо аоб Эгид Ас1юп, Асабетю Рге55. СНр.8). Такие пролекарства могут применяться для изменения биораспределения (например, чтобы дать возможность преодолеть барьер кровь-мозг тем соединениям, которые не могли бы преодолеть его в исходном состоянии) или фармакокинетики ТСК5-модулирующих соединений. Например, анионные группы, такие как карбоксилат, сульфат или сульфонат, могут быть этерифицированы, например, алкильной группой (например, метильной группой) или фенильной группой с получением сложного эфира. При введении субъекту сложного эфира, он претерпевает ферментное или неферментное, восстановительное или гидролитическое расщепление с образованием анионной группы. Этот сложный эфир может быть циклическим, например, циклическим сульфатом или сульфоном, или два или несколько анионных фрагментов могут быть этерифицированы связующей группой. Анионная группа может быть этерифицирована фрагментами (например, ацилоксиметиловыми эфирами), которые отщепляются с образованием интермедиатов ТСК5-модулирующих соединений, которые затем разрушаются с образованием активных ТСК5модулирующих соединений. В одном из вариантов осуществления пролекарство является восстановленной формой карбоксилата, сульфата или сульфоната, например, спиртом или тиолом, которая ίη νίνο претерпевает окисление до ТСК5-модулирующего соединения. Кроме того, анионный фрагмент может быть этерифицирован с образованием группы, которая способствует активному переносу полученного производного ίη νίνο или селективному поглощению его целевыми органами.

Термин модулятор ТСК5 относится к любому соединению, которое взаимодействует с рецептором ТСК5. Это взаимодействие не ограничено действием соединения в качестве антагониста, агониста, частичного агониста или обратного агониста рецептора ТСК5. В одном из аспектов соединения по на

- 14 020310 стоящему изобретению действуют как антагонисты рецептора ТСР5. В другом аспекте, соединения по настоящему изобретению действуют как агонисты рецептора ТСР5. В следующем аспекте, соединения по настоящему изобретению действуют как частичные агонисты рецептора ТСР5. В еще одном аспекте, соединения по настоящему изобретению действуют как обратные агонисты рецептора ТСР5. Профиль лиганда, обычно эндогенного или синтетического, характеризуется его собственной эффективностью 'е', первоначально описанной Ферчготтом в 1966 г. Этот параметр используется для выражения степени изменения биологических реакций, которую вызывают те или иные лиганды при связывании с одинаковым количеством рецепторов. Термин агонист в основном относится к соединению, которое усиливает активность другой молекулы или сайта рецептора. По классическому определению, агонист, независимо от того, является ли он ортостерическим, аллостерическим, обратным или коагонистом, обладает способностью связываться с рецептором, изменять состояние рецептора и вызывать биологическое действие. Следовательно, агонизм определяется как способность агониста или лиганда вызывать биологическое действие. В противоположность этому, антагонист, по существу, является агонистом с высоким сродством к той же макромолекуле рецептора, но с очень небольшой или пренебрежимо малой собственной эффективностью, за счет чего он стерически препятствует биологическому действию агониста. Если говорить об антагонизме, как о свойстве, то он может быть функциональным или физиологическим, где антагонист участвует в непосредственной конкуренции за сайт рецептора в первом случае, и осуществляет противодействие через другую систему рецептор-мессенджер во втором случае. Более конкретно, агонист ТСР5 является лигандом рецептора или соединением, которое связывается с ТСР5, и увеличивает концентрацию циклического аденозина монофосфата (сАМР) в клетках, экспрессирующих этот рецептор по меньшей мере на 20%. Напротив, антагонист ТСР5 мог бы представлять собой соединение, которое противодействует активности агониста или блокирует ее, вызывая тем самым уменьшение концентрации сАМР.

Настоящее изобретение относится к соединениям, обладающим модулирующим действием на рецептор ТСР5, и к их применению для лечения и профилактики заболеваний, например, метаболических, воспалительных, заболеваний печени, аутоиммунных, сердечных, почечных, раковых и заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Некоторые типовые примеры соединений по настоящему изобретению показаны ниже.

- 15 020310

Соединение №	Структура
2А			μ/Ρ	—ОЗОуМа*
	а	1	(Α'ΌΗ \
ЗА		а	ЛГ	5Оз Ыа*
	НО'>	Л н	X?
4А	С	ч		ХозН
	НО''	ЧТ™ 'ч
6А		а	Ж	ЗОзН
	X	а н	X
7А		ч	ж	ЧозН
	НСУ'	4 н	X
ЗА				О
			2	0-8-О-Н \ θ
	но1'4	\
9А			он у-л/	•Ь/ 2О'\ н
	но'Л	Чгон \

Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены в заявку с помощью ссылок, как если бы в отношении каждой из этих публикаций или документов было конкретно и индивидуально указано, что она включена в заявку с помощью ссылки. Ссылки на публикации и патентные документы не подразумевают признание того, что любой из них принадлежит к известному уровню техники, и не являются каким-либо допущением в отношении содержания или даты указанных публикаций и документов. Поскольку в настоящей заявке изобретение раскрывается в форме письменного описания, специалист в данной области техники должен понять, что изобретение может быть воплощено на практике в виде многочисленных вариантов осуществления, и что предшествующее описание и приведенные далее примеры служат иллюстративным целям, а не ограничивают изложенную ниже по тексту формулу изобретения.

Пример 1. Синтез модуляторов ТСИ5

Соединения по настоящему изобретению и связанные с ними производные можно синтезировать с использованием методик, известных специалисту в данной области техники.

- 16 020310

Пример 1А. Синтез За,7а,12а-тригидрокси-6а-этил-5в-холан-24-сульфоната натрия (ЗА)

Реагенты и условия:

a) ΕρΝ. 4-пирролидин-пиридин, Ас₂О, СН₂С1₂, 0°С, (2:2а=70:З0);

b) Ε^Ν, С1СООЕ1, ТГФ, Ν;·ιΒΗ₄, 41% относительно соединения 1 (З:За=70:З0);

c) РЕ_ЗР, Вг₂, имидазол, СН₂С1₂, 45% (2:2а=70:З0);

Ц) №1₂8О_З, ЕЮН;

е) ΝαΟΗ 5% в Н₂О, 9З%. Общий выход 17%.

За,7а,12а-триацетокси-6а-этил-5в-холан-24-овая кислота (2).

К охлажденной до 0°С суспензии соединения 1 (250 мг, 0,572 ммоль) в перегнанном СН₂С1₂ (5 мл) в присутствии 4-пирролидин-пиридина (9 мг, 0,057 ммоль) при перемешивании добавляли перегнанный Ε^Ν (0,78 мл, 5,4З0 ммоль). Затем по каплям в атмосфере азота добавляли уксусный ангидрид (0,49 мл, 5,140 ммоль). Через 20 мин температуру раствора повышали до комнатной и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток подкисляли Зн НС1 и экстрагировали ЛеОЕ1 (Зх15 мл). Органический слой промывали насыщенным раствором соли (15 мл), высушивали над безводным №₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении, получая 290 мг смеси соединения 2 (70%) и За,7а-триацетокси-7а-гидрокси-6а-этил-5в-холан-24-овой кислоты (2а, З0%) по данным спектроскопии ¹Н ЯМР. Полученную смесь использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

¹Н ЯМР (200 МГц, СЭСЕ) δ: 0,69 (ЗН, с, 18-СН_З соед. 2), 0,75 (ЗН, с, 18-Н_З соед.2а), 0,80-0,88 (м, 9Н, м, 19-СН_З + 21-СН_З + СН₂СН_З соед. 2 и 2а), 2,05 (9Н, м, ЗхСН_ЗСОО- соед. 2 и соед.2а), З,67 (1Н, м, 7СН-ОН соед.2а), 4,48 (1Н, м, З-СНОАс соед.2 и соед. 2а), 5,01 (1Н, м, 12-СНОАс соед.2 и соед.2а), 5,12 (1Н, м, 7-СНОАс соед.2).

З α,7α, 12а-триацетокси-6а-этил-24-гидрокси-5 β -холан (З).

К раствору соединения 2 (290 мг неочищенного продукта предыдущей стадии) в перегнанном ТГФ (З5 мл) в атмосфере Ν₂ добавляли перегнанный Εΐ^Ν (0,75 мл, 5,148 ммоль) и затем этилхлорформиат (0,44 мл, 4,576 ммоль) (примечание: образование белого осадка). Наблюдая за ходом реакции с помощью ТСХ (петролейный эфир/ЛсОЕ1 6:4), перемешивали полученную смесь в течение 2 ч, пока исходное соединение полностью не вступало в реакцию. Затем к смеси по каплям добавляли №1ВН₄ (З26 мг, 8,580 ммоль), растворенный в Н₂О (З мл), и перемешивали реакционную смесь в течение ночи. Добавляли Н₂О (З0 мл) и Зн НС1 (10 мл) и экстрагировали смесь ЕЮАс (Зх20 мл). Органический слой промывали насыщенным раствором соли (15 мл), высушивали над безводным №₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении.

Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на ВЮадеТМ (колонка: 12+М, градиент АсОЕ1 в петролейном эфире от 5% до 55%), получая 1З0 мг (~41%, исходя из соединения 1) смеси соединения З (70%) и За,12а-триацетокси-7а,24-дигидрокси-6а-этил-5в-холана (За, З0%) по данным спектроскопии ¹Н ЯМР. Полученную смесь использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

¹Н ЯМР (200 МГц, СЭС1_З) δ: 0,66 (ЗН, м, 18-СН_З соед. З и соед. За), 0,75-0,85 (м, 9Н, м, 19-СН_З + 21СН_З + СН₂СН_З соед.З и соед. За), З,55 (2Н, м, 24-СН₂ОН соед. З и соед. За), З,67 (м, 1Н, 7-СН-ОН соед. За), 4,52 (м, З-СНОАс соед. З и соед. За), 4,99-5,06 (2Н, м, 12-СНОАс соед.З и За и 7-СНОАс соед.З).

За,7а,12а-тригидрокси-6а-этил-5в-холан-24-сульфонат натрия (ЗА).

К раствору трифенилфосфина (270 мг) в перегнанном СН₂С1₂ (4 мл) в атмосфере Ν₂ добавляли бром (0,02 мл, 0,426 ммоль) и имидазол (0,02 мл, 0,426 ммоль), и перемешивали смесь в течение 10 мин. Затем по каплям добавляли соединение З (1З0 мг, 0,2З7 ммоль), смешанное с перегнанным СН₂С1₂ (4 мл), и смесь перемешивали до тех пор, пока исходное соединение полностью не вступало в реакцию. Затем добавляли СН₂С1₂ (20 мл) и промывали реакционную смесь Н₂О (Зх20 мл), насыщенным раствором соли (15 мл), высушивали над безводным №1₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на ВЮадеТМ (колонка: 12+М, градиент АсОЕ1 в петролейном эфире от 5 до 55%), получая 65 мг (~45%) смеси соединения 4 (70%) и За,12а-триацетокси-7а,24

- 17 020310 дигидрокси-6а-этил-5в-холана (4а, 30%).

После этого растворяли полученную смесь в Ε1ΟΗ (10 мл), по каплям добавляли 5% раствор Να₂8Ο₃ в Н₂О (9 мл) и перемешивали реакционную смесь при 90°С в течение 12 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток разбавляли Н₂О (15 мл), подкисляли 3н НС1 и экстрагировали СН₂С1₂ (3x15 мл).

Органический слой промывали насыщенным раствором соли (15 мл), высушивали над безводным Να₂8Ο₄ и концентрировали при пониженном давлении. Затем полученный остаток обрабатывали 5% раствором ΝαΟΗ в Η₂Ο (15 мл) и кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток разбавляли Η₂Ο (15 мл), промывали СН₂С1₂ (2x15 мл), подкисляли 3н НС1 и экстрагировали смесью ΛοΟΕί/ΜοΟΗ 8:2 (3x25 мл). Органический слой высушивали над безводным Να₂8Ο₄ и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали с помощью хроматографии среднего давления (колонка: ВР-1 8 ЬоЬат В, МеОН/Н₂О 6:4 50 фунтов/кв.дюйм), получая 3а,7а,12а-тригидрокси-6а-этил-5в-холан-24-сульфонат натрия, 3А (47 мг, 93%).

Т.пл.: >280°С

Ή ЯМР (400 МГц, (ΊΓΟΙ)) δ:0,72 (3Н, с, 18-СН₃), 0,90 (6Н, м, 19-СН₃ и СН₃СН₂), 1,04 (3Н, д, 1=6,51 Гц, 21-СН₃), 1,89 (1Н, м, 23-СН), 2,70 (2Н, м, 24-СН₂СО₃), 3,30 (1Н, м, 3-СН), 3,68 (1Н, м, 7-СН), 3,98 (1Н, м, 12-СН).

¹³С ЯМР (100,3 МГц, (ΊΓΟΙ)) δ: 10,41, 11,41, 16,27, 21,20, 21,84 (2), 22,54, 26,57, 27,14, 28,03, 29,38, 32,71, 34,59, 34,63, 35,05, 35,40, 40,06, 41,40, 41,48, 45,25, 45,85, 46,63, 51,50, 69,58, 71,50, 72,40.

Пример 1В.

Синтез 3а,7а,23-тригидрокси-6а-этил-23(8)-метил-24-нор-5в-холан-23-сульфата натрия (2А)

Реагенты и условия:

a) ΜβΟΗ, р-Т§а, ультразвук, 30°С, 2 ч, 97%;

b) РЬМдВт, ТГФ, кипячение, 12 ч;

c) ΕΐΟΗ, ΗΟ1, кипячение с обратным холодильником, 12 ч, 84% исходя из соед.2;

б) Ас₂О, пиридин, ΌΜΑΡ, ТГФ, 25°С, 12 ч, 79%;

е) О₃, Ме₂8, №₂Ο₂, МеОН, -78°С, 20 мин, 70%;

ί) Ν1Β1 Г, МеОН, ТГФ, 25°С, 12 ч, 48% (8);

д) Ρу8Ο₃, пиридин;

11) 5% ΝαΟΗ в МеОН, 43%; Общий выход: 9%.

Метил 3а,7а-дигидрокси-23-метил-6а-этил-5в-холан-24-оат (2).

К раствору соединения 1 (2,0 г, 4,6 ммоль) в метаноле (150 мл) добавляли п-толуолсульфоновую кислоту (0,2 г, 1,05 ммоль) и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 90 мин. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, остаток растворяли в СИС1₃ (200 мл), промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2x100 мл), водой (100 мл) и насыщенным раствором соли (100 мл). Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали досуха, получая метиловый эфир 2 (2,0 г, 97%) в виде твердого вещества белого цвета.

3а,7а-дигидрокси-23-метил-6а-этил-5в-биснорхоланилдифенилэтилен (4).

К раствору метилового эфира 2 (1,35 г, 3,01 ммоль) в свежеперегнанном ТГФ (15 мл) добавляли фенилмагнийбромид (24,1 мл, 1М в ТГФ) и полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Раствору давали остыть до комнатной температуры, по каплям добавляли 3н хлористоводородную кислоту (30 мл) и перемешивали полученную смесь в течение 30 мин. Отделяли органическую фазу и водную фазу экстрагировали ΕιΟΑο (3x50 мл). Объединенные органические соли промывали насыщенным раствором соли (1x100 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали досуха при пониженном давлении, получая интермедиат 3, который использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. Полученный коричневый продукт растворяли в смеси этанола (35 мл) и 12н ΗΟ1 (1 мл) и кипятили эту смесь в течение ночи. Затем растворитель выпаривали в вакууме, остаток растворяли в СИ₂С1₂ (100 мл), промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2x60 мл), водой (60

- 18 020310 мл), насыщенным раствором соли (60 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией, элюируя смесью СНС1₃/МеОН и получая желаемое производное 4 в виде белого твердого вещества (1,40 г, 84%, исходя из соединения 2).

^!Н ЯМР (СПС1₃) δ: 0,7 (3Н, с, 18-СН₃), 0,85 (3Н, д, 1=6,5 Гц, 21-СН₃), 0,88-0,92 (6Н, м, 19-СН₃ + СН₂СН₃), 0,97-1,22 (6Н, м), 1,23-1,52 (9Н, м), 1,57-1,70 (5Н, м), 1,78-1,85 (4Н, м), 1,92-1,95 (1Н, м), 3,403,42 (1Н, м, 3-СН), 3,69 (1Н, ушир.с, 7-СН), 7,25-7,29 (4Н, м, АгН), 7,127,23 (6Н, м, АгН).

¹³С ЯМР (СОС1₃) δ: 11,6, 11,7, 17,8, 20,0, 20,6, 22,2, 23,1, 23,6, 28,4, 30,5, 33,12, 33,8, 34,8, 35,4(2х),

39.4, 39,9, 41,1, 41,6, 42,8, 45,1, 50,4, 56,8, 70,8, 72,3, 125,8, 127,8(4х), 128,6(4х), 129,8(2х), 138,8, 143,4.

а-ацетокси-7 а-гидрокси-23-метил-6а-этил-5 β -биснорхоланилдифенилэтилен (5)

К раствору соединения 4 (1,85 г, 3,33 ммоль) в свежеперегнанном ТГФ (15 мл) добавляли уксусный ангидрид (0,35 мл, 3,66 ммоль), пиридин (0,05 мл, 0,66 ммоль), 4-ди(метиламино)пиридин (28 мг, 0,23 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь перегоняли с водой (70 мл) и экстрагировали ЕЮАс (3x50 мл). Объединенные органические слои промывали водой (2x50 мл), насыщенным раствором соли (50 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали досуха при пониженном давлении, получая желаемое ацетилированное соединение 5 (1,57 г, 79%) в виде твердого вещества белого цвета, которое использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

^!Н ЯМР (СБС1₃) δ: 0,65 (3Н, с, 18-СН₃), 0,85 (3Н, д, 1=6,5 Гц, 21-СН₃), 0,87-0,92 (6Н, м, 19-СН₃ + СН₂СН₃), 0,95-1,26 (8Н, м), 1,30-1,50 (6Н, м), 1,52-1,70 (5Н, м), 1,75 (3Н, с, 24-СН₃), 1,79-1,97 (5Н, м), 2,01 (3Н, с, 3-СНОС (О) СН₃), 2,14-2,17 (1Н, м), 3,69 (1Н, ушир.с, 7-СН), 4,52-4,57 (1Н, м, 3-СН), 7,11-7,22 (6Н, м, АгН), 7,25-7,29 (4Н, м, АгН).

¹³С ЯМР (СБС1₃) δ: 11,6, 11,8, 17,9, 20,1, 20,7, 21,4, 22,2, 23,1, 23,7, 26,6, 28,4, 29,6, 33,1, 34,9, 35,2,

35.5, 39,5, 40,0, 41,2, 41,6, 42,9, 45,1, 50,4, 56,9, 70,7, 74,7, 125,8, 127,8(4х), 129,5(4х), 129,8(2х), 134,0, 138,9, 143,5.

а-ацетокси-7 а-гидрокси-6а-этил-5 β -холан-23-он (6)

Раствор соединения 5 (1,35 г, 2,26 ммоль) в смеси сухого МеОН (15 мл) и сухого СН₂С1₂ (20 мл) при -78°С подвергали озонированию до тех пор, пока темно-синий цвет раствора не сохранялся в течение 30 мин. Затем озонирование прекращали и темно-синий раствор продували азотом для удаления растворенного озона. Когда реакционная смесь потеряла синий цвет, добавляли Ме₂8 (0,55 мл, 7,55 ммоль) и давали раствору нагреться до комнатной температуры. Затем удаляли растворитель при пониженном давлении и остаток очищали флэш-хроматографией, элюируя градиентом ЕЮАс в петролейном эфире от 2 до 15%, и получая желаемый кетон 6 в виде белого твердого вещества (0,7 г, 70%).

^!Н ЯМР (ϋϋα₃) δ: 0,7 (3Н, с, 18-СН₃), 0,85-0,9 (9Н, м, 19-СН₃ + 21-СН₃ + СН₂СН₃), 1,04-1,23 (7Н, м), 1,29-1,46 (8Н, м), 1,58-1,72 (4Н, м), 1,78-1,97 (5Н, м), 2,00 (3Н, с, 3-СНОС(О)СН₃), 2,11 (1Н, с, 24СН₃), 2,43-2,53 (1Н, м), 3,70 (1Н, ушир.с, 7-СН), 4,48-4,59 (1Н, м, 3-СН).

¹³С ЯМР (ϋϋα₃) δ: 11,6, 11,8, 19,7, 20,7, 21,5, 22,1, 23,1, 23,7, 26,6, 28,4, 29,6, 30,6, 32,6, 33,1, 35,1,

35.5, 39,5, 39,9, 41,1, 42,8, 45,0, 50,5, 50,9, 56,0, 70,7, 74,7, 170,7, 209,3.

3а-ацетокси-7а, 23 (8) -дигидрокси-6а-этил-5в-холан (7)

К перемешиваемому раствору кетона 6 (0,5 г, 1,12 ммоль) в ТГФ при 0°С одной порцией добавляли ЫаВН₄ (0,27 г, 7,17 ммоль) и затем по каплям добавляли МеОН (0,27 мл, 6,7 ммоль). По окончании добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Затем выпаривали растворитель досуха, растворяли остаток в СН₂С1₂ и 3н НС1 и перемешивали в течение 1 ч. Разделяли две фазы, органический слой промывали водой, насыщенным раствором соли, высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали досуха при пониженном давлении. Маслянистый остаток, который по данным ТСХ состоял из двух компонентов, очищали флэш-хроматографией (петролейный эфир/ЕЮАс 7:3), получая в качестве первой фракции 3а-ацетокси-7а,23(8)-дигидрокси-6а-этил-5вхолан 7 (0,225 г, 48%) и затем более полярный 3а-ацетокси-7а,23(И)-дигидрокси-6а-этил-5в-холан (0,105 г, 23%) в соотношении 2:1.

^!Н ЯМР (СБС1₃) δ: 0,7 (3Н, с, 18-СН₃), 0,88-0,91 (6Н, м, 19-СН₃ + СН₂СН₃), 0,97 (3Н, д, 1=6,4 Гц, 21СН₃), 1,04-1,08 (4Н, м,), 1,19 (3Н, д, 1=6,1 Гц, 24-СН₃), 1,26-1,56 (12Н, м), 1,53-1,71 (5Н, м), 1,76-1,96 (4Н, м), 2,0 (3Н, с, 3-СНОС (О) СН₃), 3,72 (1Н, ушир.с, 7-СН), 3,79-3,95 (1Н, м, 23-СН), 4,51-4,59 (1Н, м, 3СН).

¹³С ЯМР (СПС1₃) δ: 11,8, 18,5, 20,7, 21,5, 22,1, 23,1, 23,7, 24,8, 26,6, 28,4, 29,6, 32,6, 33,1, 35,1, 35,5,

39.6, 39,9, 41,1, 42,8, 45,0, 45,8, 50,5, 56,7, 65,1, 70,7, 74,7, 170,7.

6а-этил-23(8) метил-3а,7а,23-тригидрокси-24-нор-5в-холан-23-сульфат натрия (2А)

К суспензии комплекса триоксида серы и пиридина (0,1 г, 0,49 ммоль) в сухом пиридине (5 мл) добавляли спирт 7 (0,2 г, 0,49 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 48 ч, после чего выпаривали растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяли в 5% растворе №1ОН в МеОН (2 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении, полученное твердое вещество смешивали с Н₂О/СН₃ОН (1:1) и очищали хроматографией на обращенной фазе (колонка КР-18 1оЬаг В), используя в

- 19 020310 качестве подвижной фазы смесь СН₃ОН/Н₂О (от 5:5 до 8:2) и получая желаемый сульфат, а именно 3α,7α, 23-тригидрокси-6а-этил-23 (8) -метил-24-нор-5в-холан-23-сульфат натрия 2А (0,11 г, 43%).

Ή ЯМР (СБ₃ОБ) δ: 0,7 (3Н, с,18-СН₃), 0,89-0,94 (6Н, м, СН₃-19, СН₂СН₃), 1,01 (3Н, д, 1=6,4 Гц, 21СН₃), 1,09-1,29 (4Н, м), 1,32 (3Н, д, 1=6,1, 24-СН₃), 1,36-1,41 (5Н, м), 1,47-1,61 (6Н, м), 1,71-1,89 (9Н, м), 2,02-2,05 (1Н, м), 3,28-3,35 (1Н, м, 3-СН), 3,66 (1Н, ушир.с, 7-СН), 4,54-4,58 (1Н, м, 23-СН).

¹³С ЯМР (СБ₃ОБ) δ: 12,0, 12,3, 19,4, 21,9, 22,4, 23,5, 23,7, 24,6, 29,4, 31,3, 33,5, 34,4, 34,5, 36,6, 36,7, 41,1, 41,5, 43,1, 43,8, 45,5, 46,9, 51,7, 58,1, 71,2, 73,2, 74,8.

Пример 2. Исследование активности соединений по настоящему изобретению в отношении рецепторов ТСК5 и РХК ίη νίίΓΟ

Оценивали силу и эффективность действия соединений по настоящему изобретению на рецептор ТСК5 с использованием анализов ίη νίίτο. Данные табл. 1 показывают, что соединения по настоящему изобретению являются мощными и селективными модуляторами рецептора ТСК5. В некоторых аспектах настоящего изобретения, соединения являются двойными агонистами рецепторов РХК и ТСК5.

Таблица 1. Сила и эффективность действия соединений по настоящему изобретению на рецепторы

РХК и ТСК5

	Анализ А1рЪазсгееп	ЕДЕТ (сАМР) Ν0Ι-Η716	Анализ трансактивации	ЕБЕТ-сАМР клеток НЕН293 с избыточной экспрессией ТС&5
Соединение	нгхв	НТСК5	НТСК5	РТСР5
(контроль-	(СЦСА=8-25	(ЪСА=4-8	(ЬСА=1-6	(ЬСА=0,3-5
ный	мкМ)	мкМ)	мкМ)	мкМ)
стандарт)	ЕСбо (мкМ)	ЕС5о (мкМ)	ЕС53 (мкМ)	ЕСбо (мкМ)
2А	0,145+0,05	1,6±0,3	1,2 (ЬСА=6,2)	0,025 (ЪСА=0,3)
ЗА	7+3	0,7±0,2	0, 6 (ЪСА=6,2)	0,011 (ЬСА=0,3)

Соед. №		Химическое строение	Т6В5 ЕС50	ТСК5 эффективность
6А	ДМС2008 37	он Ζ-4Ε7 503Н НО'· п	1,00 мкМ	103
7А	ДМС2008 41	на’<^Ь-у'''он	5,02 мкМ	109

Для ознакомления с описанием анализа связывания рецептора ТСК5 ίη νίίτο см., например, Ка^атаЩ 1. ΒίοΙ. С’Нет 2003, Уо1.278 № 11, рр.9435-9440. Действие соединений на рецептор РХК исследовали по флуоресцентному резонансному переносу энергии (РКЕТ) при связывании пептида 8КС-1 с человеческим РХК, применяя бесклеточный анализ ЕЫ8А. См., В1апсйагй с1 а1., \ХО 00/37077. Активность люциферазы определяли в клетках СНО, устойчиво экспрессирующих 11ТСВ5. или транзиторно котрансфецированных вектором экспрессии НТСК5 и репортерным геном люциферазы, активируемым сАМРреспонсивным элементом (СКЕ). Некоторые соединения подвергали анализу с использованием репортерной люциферазы, для определения их способности активировать ядерный рецептор желчных кислот РХК.

Для получения данных, приведенных в табл. 1, использовались, например, следующие материалы и методики.

Плазмиды

Клон ΝΙΗ Маттайап Сепе Со11сс11оп (коллекции генов млекопитающих национального института здоровья) МСС:40597 (именуемый также рСМУ8РОКТ6/йТСК5 или рТСК5) и рс^NА3.1(+) получали от ИщЦгсщеп (СагкЬай, СА). рСКЕ-Ьис и рСМУв получали от ОоШесН (Ра1о Α1ίο, СА). рСМХ-НРХК и рСМХ-тКХКа были любезно представлены доктором Όηνίά ТМапдеРбогГ (Но\\агб Нидйек Мейюа1 Ιηδΐϊ

- 20 020310

ЦПе, КипегкПу о£ Техак 8ои111\\'ек1еегп Ме61са1 СеШег). Плазмида рЕсИЕх7 была любезно предоставлена доктором К1сЕаг6 А. Неутап (Х-серЮг ТЬетареийск, СА).

Клеточные культуры

Клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки ЫС1-Н716, клетки НерЗВ и клетки СО81 получали от Атепсап Туре СиНиге Со11ес1юп (Американской коллекции типовых культур) (Мапаккак, УА). Среды для клеточных культур, сыворотки и добавки приобретали у [птПгодеп или 81дта-А16псЬ. Все клетки СНО содержали в минимальной эссенциальной среде α (α-МЕМ) с добавкой 10% (объем/объем) сыворотки телят (ЕВ8) и 100 мкМ заменимых аминокислот (ЫЕАА). Клетки ЫС1-Н716 содержали в виде суспензии в среде ИРМ1-1640 с добавкой 10% (объем/объем) ЕВ8, 10 мМ НЕРЕ8 и 1 мМ пирувата натрия. Клетки НерЗВ содержали в среде Игла, с добавкой 10% (объем/объем) ЕВ8 и 100 мкМ ΝΕΛΛ. Клетки СО81 содержали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ИМЕМ), с добавкой 10% (объем/объем) ЕВ8. Во все среды для клеточных культур вводили добавки 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата. Клетки выращивали при 37°С в атмосфере с 5% СО₂, которую меняли каждые 2-6 дней, и для каждого эксперимента в планшеты помещали свежие порции клеток.

Транзиторные трансфекции

Клетки СНО помещали в 96-луночные планшеты при плотности размещения 3,5 х10⁴ клеток/лунка, культивировали в течение 24 ч и затем трансфецировали каждую лунку 150 нг человеческой (11) экспрессионной плазмиды (рСМУ8РОКТ6/НТСК5) и 100 нг репортерной плазмиды люциферазы, активируемой сАМР-респонсивным элементом (СИЕ), с использованием реагента Е1роГес1атте 2000 ([птИгодеп), согласно инструкциям производителя. После 6 ч инкубирования, клетки один раз промывали фосфатносолевым буфером (РВ8) и заменяли среду на ИМЕМ, содержащую 0,1% (мас./об.) альбумина бычьей сыворотки (В8А). После инкубирования в течение еще 18 ч, клетки в течение 5 ч обрабатывали каждым из тестируемых соединений в различных концентрациях в свежей среде ИМЕМ, содержащей 0,1% (мас./об.) В8А. После этой обработки проводили лизис клеток в 50 мкл буфера для лизиса (25 мМ Тпк-С1 (рН 7,6), 2 мМ ЕИТА, 1 мМ дитиотрейтол (ИТТ), 10% (об./об.) глицерина и 1% (об./об.) 1п1оп Х-100) при помощи цикла замораживание-оттаивание, и полученный продукт исследовали на содержание люциферазы, как описано ниже.

Клетки СО81 помещали в 96-луночные планшеты при плотности размещения 2,5х10⁴ клеток/лунка в среду ИМЕМ с добавлением 10% (об./об.) ЕВ8, очищенной на активированном угле, культивировали в течение 24 ч и затем содержимое каждой ячейки трансфецировали 25 нг экспрессионной плазмиды ЬЕХК (рСМХ-ЬЕХВ), 25 нг экспрессионной плазмиды мышиного (т) α рецептора ретиноидов X (РХИа) (рСМХ-тИХИа), 50 нг репортерной плазмиды (рЕсКЕ7-Ьис) и 50 нг рСМУв в качестве внутреннего контроля, используя реагент ЕлроГесШтте 2000. Через 24 ч клетки дважды промывали РВ8 и обрабатывали тестируемыми соединениями в различных концентрациях в свежей среде ИМЕМ с добавкой 10% (объем/объем) ЕВ8, очищенной на активированном угле, в течение 24 ч. После обработки клетки подвергали лизису в 50 мкл буфера для лизиса осуществляя цикл замораживания-оттаивания, и подвергали анализам на люциферазу и β-галактозидазу, как описано ниже. Нормализованные значения концентрации люциферазы вычисляли делением активности люциферазы на активность β-галактозидазы.

Определение содержания люциферазы и β-галактозидазы

Для определения содержания люциферазы, 20 мкл клеточного лизата смешивали со 100 мкл буфера для анализа люциферазы [235 мкМ люциферина, 265 мкМ АТР и 135 мкМ кофермент А (СоА)] и измеряли люминесценцию с помощью прибора Сеп1гоХ8 ИВ960 (ВейЕоИ ТесНгкИодюк, Ваб #16Ьа6, Оеттапу).

Для определения содержания β-галактозидазы, 10 мкл клеточного лизата смешивали со 100 мкл ВиГГег Ζ [60 мМ №₂НРО₄, 10 мМ КС1, 1 мм Мд8О₄, 50 мМ β-меркаптоэтанол и 0,75 мг/мл о-нитрофенилβ-И-галактопиранозид (О№О)] и инкубировали при 37°С в течение 0,5-3 ч. Реакции прерывали добавлением 50 мкл стоп-буфера (1М №-ьСО₃) и определяли оптическую плотность при 420 нм.

Получение клеток СНО, устойчиво экспрессирующих человеческий ТСК5 (клеток СНО-ТСК5)

Клетки СНО трансфецировали 3,8 мкг экспрессионной плазмиды 11ТСР5 (рСМУ8РОКТ6/ЬТОВ5), 3,8 мкг СИЕ-активируемой репортерной плазмиды люциферазы (рСРЕ-Ьис) и 0,4 мкг экспрессионной плазмиды гена устойчивости к неомицину [рс^NА3.1(+)] с использованием Е1роГес1атте 2000. Трансфецированные клетки отбирали с помощью 400 мкг/мл сульфата 0418 и отдельные клоны независимо выращивали в 96-луночном планшете. Отбирали линии клеток СНО, экспрессирующие ТОК5, обрабатывая клетки ЬСА (литохолевой кислотой), с последующим анализом люциферазы.

Исследование продуцирования сАМР

Клетки N0-4716 помещали в 96-луночные планшеты, непосредственно перед использованием покрытые 0,75 мг/мл Ма1пде1 (ВИ Вюксюпсек) согласно инструкции производителя, при плотности 6х10⁴ клеток/лунка в среде ИМЕМ с добавками 10% (об./об.) ЕВ8, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, и культивировали в течение 24 ч, что привело к адгезии клеток к дну планшета. Клетки СНО-ТОК5 помещали в 96-луночный планшет при плотности 3,5 х10⁴ клеток/лунка в среде αМЕМ с добавками 10% (об./об.) ЕВ8, 100 мкМ №АА, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг стрептомицина

- 21 020310 сульфата и культивировали в течение 24 ч. Клетки дважды промывали РВ8 и заменяли среду на среду для анализа сАМР [ΌΜΕΜ, содержащую 0,1% (мас./об.) В8Л и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (ΙΒΜΧ)]. После инкубирования в течение 30 мин при 37°С обрабатывали клетки каждым из тестируемых соединений в свежей среде для анализа сАМР в течение 30 мин. После обработки среду удаляли и определяли количество сАМР с использованием сАМР-8стееп Κίΐ (Λρρίίβό Вюкуйетк, Еойет Ску, СА), согласно инструкциям производителя.

Определение 50% эффективных концентраций (ЕС50) и эффективности

Для каждых условий анализы проводили в трех или четырех экземплярах. Значения ЕС50 определяли с помощью пробит-анализа. Эффективность определяли путем вычисления процентного отношения полученных значений к значениям для 10 мкМ ЬСА при исследовании агонистов ТСИ5, к значениям для 10 мкМ 6а-Е1-СЭСА при исследовании агонистов ΕΧΚ, соответственно. После вычитания средних значений для базовых условий (при обработке носителем), полученные значения применяли для определения ЕС50 и/или эффективности. Вычисления средних значений ЕС50 и сравнение значений ЕС50 для различных соединений выполняли после преобразования в логарифмическую форму.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием ΐ-критерия Стьюдента и рассматривали значения р<0,05 в качестве статистически значимых.

Пример 3. Метаболическая активность соединений по настоящему изобретению в мышиной модели ожирения, вызванного рационом питания

Цель настоящего исследования заключается в определении того, могут ли агонисты ТСИ5 (олеанолевая кислота (ОА) или соединения по настоящему изобретению (например, тестируемые соединения)) корректировать развитие ожирения и связанную с ним невосприимчивость к инсулину ίη νίνο. Для исследования этого вопроса ОА/Тестируемое соединение вводили вместе с пищей в течение 16 недель самцам мышей С57ВЬ61, которых до этого в течение 10 недель содержали на корме с большим количеством жиров.

ΙΙ. Протокол эксперимента

В предшествующих исследованиях было установлено, что ОА является селективным агонистом ТСИ5, не вызывающим отвращения к пище. Однако животные, которым вводили ОА в дозировке 100 мг/кг/день, продемонстрировали некоторые признаки токсического действия, в то время как более низкие дозировки переносились хорошо. Поэтому в настоящем исследовании вводили ОА в дозировке 50 мг/кг/день.

Исследования ίη νίίτο показали, что соединения по настоящему изобретению являются мощными и селективными лигандами ТСИ5. Не ожидалось никаких проблем с токсичностью при введении соединений по настоящему изобретению в концентрации, которая примерно в 50 раз ниже, чем в указанных исследованиях.

Для проведения первого исследования 48 самцов мышей С57ВЬ61 (в возрасте 5 недель) разбивали на две группы: одна группа из 24 животных (группы 1, 2 и 3) получала обычный корм, тогда как другая группа из 24 животных получала корм с высоким содержанием жиров в течение 10 недель (группы 4, 5 и 6). После этого животные в течение 16 недель принимали участие в исследовании. Животным, разбитым на пять групп по десять особей, назначали следующие рационы питания:

1: обычная пища;

2: обычная пища + ОА 50 мг/кг/день;

3: обычная пища + тестируемое соединение, например, 30 мг/кг/день;

4: пища с высоким содержание жира;

5: пища с высоким содержание жира + ОА 50 мг/кг/день;

6: пища с высоким содержание жира + тестируемое соединение, например, 30 мг/кг/день;

На протяжении всего исследования дважды в неделю определяли массу тела и количество принятой пищи.

Неделя 2: Во всех группах определяли соотношение массовый состав организма с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (Эехаксап).

Неделя 1: Во всех группах после голодания в течение 12 ч проводили измерение уровней трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, НЭЬ-С, ЬПЬ-С и инсулина в сыворотке, после чего начинали давать мышам описанный выше корм (день 0).

Неделя 2: Во всех группах после голодания в течение 12 ч проводили измерение уровней трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, НЭЬ-С, ЬПЬ-С и инсулина в сыворотке (день 14).

Неделя 4: Определяли переносимость глюкозы, подвергая всех животных интраперитонеальному тесту на переносимость глюкозы (1РСТТ). Перед тестом животных заставляли голодать в течение 12 ч. С помощью непрямой калориметрии определяли ночной расход энергии животных в группах 1, 4, 5 и 6 (обычная пища, пища с высоким содержанием жиров и пища с высоким содержанием жиров ОА/тестируемое соединение).

Неделя 8 : Повторно определяли массовый состав организма животных во всех группах с помощью

- 22 020310

Бехаксаи. Во всех группах после голодания в течение 12 ч проводили измерение уровней трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, НБЬ-С, ЬБЬ-С и инсулина в сыворотке (день 56).

Неделя 9: В течение 30 ч исследовали циркадную активность животных в группах 4, 5 и 6 (мыши, получавшие пищу с высоким содержанием жиров).

Неделя 10: Осуществляли измерение кровяного давления и частоты сердечных сокращений у животных групп 4, 5 и 6.

Неделя 11: У всех животных измеряли ректальную температуру в 10:00 утра.

Проводили исследование циркадной активности животных в группах 1, 2, 3 и 4.

Неделя 12: Определяли переносимость глюкозы в группах 4, 5 и 6, подвергая животных интраперитонеальному тесту на переносимость глюкозы (1РСТТ). Во время 1РСТТ также отбирали кровь для определения уровней инсулина. Перед этими тестами животных заставляли голодать в течение 12 ч.

Собирали кал животных во всех группах в течение 24 ч и определяли в нем содержание липидов.

Неделя 16: Проводили испытание всех животных холодом, измеряя температуру тела животных при внешней температуре 4°С.

Через три дня животных умерщвляли. При умерщвлении собирали кровь и анализировали на: содержание липидов в плазме (ТС, ТС, НБЬ-С, РРА); функции печени (АЬАТ, А8АТ, щелочная фаза, γСТ); глюкозу и инсулин; профили липопротеинов плазмы отдельных групп (эксклюзионная хроматография).

Печень, тонкий кишечник, жировые ткани (\УАТ и ВАТ), поджелудочную железу, сердце и мышцы извлекали из организма, взвешивали и сохраняли для проведения дополнительных анализов, которые включали: стандартную гистологию (окрашивание НЕ, окрашивание сукцинат дегидрогеназой, окрашивание масляным красным-О и клеточную морфологию); определение содержания липидов в тканях; электронную микроскопию ВАТ и мышечной ткани для исследования митохондрий; выделение РНК для исследования экспрессии отдельных генов, принимающих участие в метаболизме и энергетическом гомеостазе с помощью количественной ЯТ-РСЯ; выделение белка для исследования пост-трансляционных модификаций, например ацетилирования определенных белков (например, РСС-1а).

III. Подробное описание методик

А-Содержание и питание животных Размещение и содержание животных

Мышей размещали в виварии в группах (5 животных в клетке) в условиях отсутствия патогенных микроорганизмов, при цикле свет-темнота 12 ч: 12 ч (включение света в 7:00 утра), при контролируемой температуре (20-22°С) и влажности, согласно правилам Евросоюза. Животным обеспечивали неограниченный доступ к воде и пище.

Питьевая вода

Химический состав водопроводной воды регулярно анализировали в ^Ши! б'Нубго1од1е, ИРЬ, 81гакЬоигд с целью проверки отсутствия потенциально токсичных веществ. Питьевую воду обрабатывали НС1 и НС1О₄ для поддержания рН в диапазоне 5-5,5 и концентрации хлора 5-6 ч./млн.

Рацион питания

Стандартный корм для грызунов получали от ЬАК. и корм с высоким содержанием жиров получали от ЯекеагсЬ Б1е1. Мышам давали либо обычный корм (16% белка, 3% жира, 5% клетчатки, 5% минеральных веществ), либо корм с высоким содержанием жиров (20% белка, 20% углеводородов, 60% жира). Олеанолевую кислоту и тестируемые соединения смешивали либо с обычным кормом в форме порошка, либо с порошкообразным кормом с высоким содержанием жиров в следующих соотношениях: 0,5 г ОА/кг корма для введения 50 мг/кг/день и 0,08 г тестируемого соединения/кг корма для введения 10 мг/кг/день. Затем порошкообразный корм вновь превращали в гранулы. Животным контрольной группы давали гранулированный корм без добавления тестируемого соединения или ОА. Благодаря консистенции корма с высоким содержанием жиров, при его смешивании с ОА воду не добавляли. В случае обычного корма, которые труднее превращался в гранулы, к порошку добавляли минимальное количество воды для повторного получения гранул, которые затем высушивали на воздухе. Новые порции корма готовили еженедельно.

Отбор образцов крови

Кровь отбирали под анестезией из ретроорбитального синуса или из хвостовой вены.

Анестезия

Для экспериментов по двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии животных подвергали анестезии смесью кетамин (200 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг), которую вводили с помощью интраперитонеальной инъекции.

Для осуществления пункций вен, животных анестезировали вдыханием смеси изофлуран-О₂.

В-Биохимия

Тесты проводили на автоматизированной лабораторной рабочей станции О1утрик АИ-400 с использованием коммерческих реагентов (О1утрик).

- 23 020310

Анализ липидов и липопротеинов

Содержание триглицеридов в сыворотке, общее и содержание НОЬ холестерина (высокой плотности), определяли с применением ферментных анализов. Содержание НОЬ холестерина в сыворотке определяли после осаждения апо В-содержащих липопротеинов фосфовольфрамовой кислотой/Мд (например, Коске П1адиок1тск, Маппксип. Сеттаиу). Содержание свободных жирных кислот определяли с применением набора от \Уако (например, №икк, Сеттаиу) согласно указаниям производителя.

Метаболические и эндокринные исследования

Концентрацию глюкозы в крови измеряли анализатором Ргесыоп Ο.Ι.Ό. (например, Мей1кепке кук1ет), используя электроды МеФкеике Ртес18 (например, ЛЬЬо1 ЬаЬотаФпек, МеШкенке ргойнсК ВейГогй, И8А). Достоверность методики подтверждали путем сравнения значений, полученных с помощью анализатора Ртес1к1ои Ο.Ι.Ό., с результатами измерения глюкозы по классической методике. Применяли методику Ртес1к1ои Ο.Ι.Ό, поскольку для нее требуется минимальное количество крови и, следовательно, ее можно использовать для многократных измерений, например, во время ΙΡΟΓΤ. Уровни инсулина в плазме (например, МетсоФа, Иррка1а, 8чейен) определяли с помощью ЕЫ8Л, согласно указаниям производителя.

С - Исследование метаболизма

Профили липопротеинов

Профили липопротеинов получали с помощью жидкостной экспресс-хроматографии белков, разделяя липопротеины на три основных класса УкПЕ ЬВЬ и НОЬ.

Интраперитонеальный тест на переносимость глюкозы (ΙΡΟΓΤ) - пероральный тест на переносимость глюкозы

ΙΡ^ΤΤ проводили у мышей, голодавших в течение ночи (12 ч). Мышам осуществляли интраперитонеальную инъекцию (ΙΡΟΓΤ) 20% раствора глюкозы в стерильном физиологическом растворе (0,9% №101) в дозировке 2 г глюкозы/кг массы тела. Отбирали кровь из хвостовой вены для определения содержания глюкозы и инсулина, до введения раствора глюкозы, а также через 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 мин после введения. Вычисляли приращения площади под кривой содержания глюкозы, как показатель чувствительности к инсулину, в то время, как соответствующие уровни инсулина указывали на резервы секреции инсулина.

Расход энергии

Расход энергии оценивали с помощью непрямой калориметрии, измеряя потребление кислорода устройством Охутах (например, Со1итЫа 1пк1гитеп1к, Со1итЬик, ОН) в течение 12 ч. Система состояла из открытого контура с воздухом, входящим в пластиковую клетку и выходящим из нее (в клетке находилась одна мышь). Животным разрешали свободный доступ к пище и воде. Высокоточные сенсоры СО₂ и О₂ измеряли разницу концентраций СО₂ и О₂ во входящих и выходящих объемах воздуха, что позволяло определить количество потребленного кислорода за определенный период времени, при условии, что поток воздуха, входящего в клетку, остается постоянным. Поступающие из устройства данные обрабатывались в присоединенном компьютере, анализировались и представлялись в виде экспортируемого файла Ехсе1. Значения были выражены в единицах мл · кг^-1 · ч^-1, которые хорошо известны как УО₂.

Определение содержания жиров в организме с помощью Беха сканирования

Анализ Веха выполняли на денситометре с ультравысоким разрешением ΡIXIМυ8 8епек (пиксели 0,18x0,18 мм, СЕ Мейюа1 8ук1етк, Майкоп, ^Ι, ϋδΑ). Минеральную плотность кости (ВМО в г/см²) и состав организма определяли с применением программного обеспечения ΡIXIМυ8 (версия 1,4 х, СЕ Мей1са1 8ук1етк).

Ό - Неинвазивное измерение кровяного давления и пульса

Система анализа У1кйес11 ΒΡ-2000 В1оой Егеккиге Лиа1ук1к 8ук1ет является компьютеризированной системой, которая позволяет одновременно измерять различные параметры жизнедеятельности 4 бодрствующих мышей без вмешательства оператора с помощью специальной манжеты, надетой на хвост. Мышей помещали в индивидуальные темные камеры на подогреваемую платформу и хвосты животных продевали через хвостовую манжету. Система измеряла кровяное давление путем определения давления манжеты, при котором прекращался кровоток в хвосте. Фотоэлектрический сенсор определял пульс особи. Было показано, что результаты, которые выдавала описываемая система, хорошо соответствовали данным по среднему внутриартериальному давлению, которое одновременно измеряли в сонной артерии. Это позволяло получать воспроизводимые значения систолического кровяного давления и частоты сердцебиения. Для получения результатов была необходима тренировка животных в системе в течение одной недели.

Е - Циркадная активность

Измеряли спонтанную двигательную активность, используя индивидуальные боксы, каждый из которых состоял из выдвижного пола, съемной клетки и был снабжен инфракрасными датчиками захвата, которые позволяли измерять активность передвижений животного и количество вставаний на задние лапы. Боксы связывали с компьютером с использованием электронного интерфейса (например, ИпеКошс, Ρеккас, Етаисе). Мышей тестировали в течение 32 ч для того, чтобы измерить адаптацию к аппаратуре, а

- 24 020310 также дневную и ночную активность. Количество воды, выпитой за время тестирования, измеряли с использованием автоматизированного ликометра.

Пример Д. Физико-химические свойства

Растворимость в воде

Твердые соединения (ВА желчные кислоты) суспендировали в 5 мл 0,1М НС1. После инкубирования в течение 1 недели, полученные насыщенные растворы фильтровали через фильтр М1Шроге (0,22 мкм) и измеряли концентрацию ВА с помощью ВЭЖХ-Е81-МС/МС, используя колонку С18 (150 мм х 2 мм ί.ά., Д мкм) и, в качестве подвижной фазы, воду, содержащую 15 мМ уксусную кислоту с рН 5 и ацетонитрил. Скорость потока составляла 150 мкл/мин. Регистрацию данных масс-спектрометрии проводили в режиме мониторинга множественных реакций, используя источник Е81 в режиме отрицательной ионизации. Растворимость в воде выражали в мкмоль/л.

Растворимость в воде измеряли для малорастворимых протонированных частиц карбоксилированных желчных кислот при рН1. Сульфаты и сульфонаты, такие как 3А и 2А, ионизированы даже при низких значениях рН, и в физиологических условиях всегда растворимы во всех биологических жидких средах.

Таблица 2. Физико-химические свойства исследованных природных желчных кислот и их аналогов

Желчная кислота	ИЗ1” (мкМ)	СМС“” 0,15М Ыа+ (мкМ)	СФ дин/см	Ьод₽л	Связывание альбумина<е> %
СОСА	32	3,2	45,5	2,2	93
и оса	7,5	6,0	50,5	2,2	94
СА	273*	11*	-	1,1*	50*
ТСБСА	высокая	3,0*	-	0,9*	70*
тиосА	высокая	2,2*	-	1,1*	67*
бмиосд	28*	4,2*		1,3*	80*
ЗА	высокая	2,8	43,4	0,7	81
2А	высокая	нет данных	нет данных	2,3	97

''\ν₃: данные по растворимости в воде относятся к ВА в форме протонированных частиц и, следовательно, эти данные не получали для 3А, 2А, ТСЭСЛ и ТиЭСЛ, которые имеют высокую растворимость (высокая).

^ЬСМС : критическая концентрация мицеллообразования, определенная в 0,15М водном растворе ЫаС1.

^С8Т_СМС: поверхностное натяжение при СМС в 0,15М водном растворе ЫаС1.

''ЬодРд: коэффициент распределения 1-октанол-вода исследованных желчных кислот в форме ионизированных частиц.

*: значения, взятые из литературы.

Критическая концентрация мицеллообразования (СМС)

Оценивали поверхностно-активные свойства, т.е. склонность к образованию мицелл, для заряженных молекул, которые растворимы в воде в виде натриевых солей (повышение рК_а на 2 единицы). Критическую концентрацию мицеллообразования (СМС) определяли путем измерения поверхностного натяжения (8Т), используя методику максимального давления в пузырьке, позволяющую получить значения поверхностного натяжения, на которые, в отличие от статических методик, лишь незначительно влияют возможные примеси. Использовали тензиометр 8епзайупе 6000 (Сйет-Иупе Кекеагсй Согр., М11аикее, VI), снабженный двумя стеклянными датчиками диаметром 0,5 и Д мм, соединенными с источником азота. Частота образования пузырьков в дистиллированной воде при 26°С составляла 1 пузырек в секунду (Р=2,7 атм) и калибровку проводили с использованием дважды дистиллированной воды и метанола. Поверхностное натяжение растворов натриевых солей ВА в 0,15М ЫаС1 измеряли при различных концентрациях в диапазоне 0,13-50 мМ. Наносили на график зависимость значения поверхностного натяжения от логарифма концентрации соли желчной кислоты; регрессионные линии, соответствующие двум частям кривой (мономерной и мицеллярной фазам), рассчитывали с применением метода наименьших квадратов и точку пересечения этих линий принимали за значение СМС. Кроме того, из кривых зависимости 8Т от концентрации вычисляли значение поверхностного натяжения при СМС (равновесии между мономерными и мицеллярными частицами), получая информацию о поверхностной активности, которая связана с размером мицелл в сочетании со способностью понижать поверхностное натяжение.

СМС определяли путем измерения поверхностного натяжения в неравновесных условиях, т.е. в условиях, при которых загрязнения незначительно влияют на полученные результаты (фиг. 1). Соединение

- 25 020310

3А демонстрирует высокую способность уменьшать поверхностное натяжение, при СМС 2,8 мМ. Вид зависимости §Т от концентрации позволяет сделать предположение об образовании относительно крупных агрегатов с соответствующей поверхностной активностью.

Коэффициент распределения октанол/вода

Поскольку сульфатные и сульфонатные производные всегда ионизированы при всех значениях рН, коэффициент распределения октанол/вода для всех молекул измеряли в ионизированной форме. Коэффициент распределения 1-октанол/вода (ЬодР) измеряли с использованием обычной методики со встряхиваемой колбой. Эксперимент проводили для 0,1 мМ растворов солей желчных кислот при рН 8 с добавкой 0,1М фосфатного буфера для гарантии полной ионизации ВА; значения 1од Р соответствовали ВА в ионизированной форме, а не протонированным частицам, и исходные концентрации каждой ВА были ниже ее собственного значения СМС. Водный буфер предварительно насыщали 1-октанолом, 5 мл 1октанола предварительно насыщали водой, затем добавляли к буферу и оставляли образцы для достижения равновесия на 2 недели при постоянном перемешивании при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно разделяли фазы. Концентрацию ВА в водной фазе измеряли ВЭЖХ-Е81МС/МС, используя колонку С18 (150 мм х 2 мм ί.ά., 4 мкМ) и воду, содержащую 15 мкМ уксусную кислоту, с рН 5 и ацетонитрил, в качестве подвижной фазы. Расход потока составлял 150 мкл/мин и температуру колонки поддерживали на уровне 45°С. Регистрацию данных масс-спектрометрии проводили в режиме мониторинга множественных реакций, используя источник Е81 в режиме отрицательной ионизации.

Коэффициент распределения 1-октанол/вода вычисляли для ионизированных частиц, чтобы облегчить сравнение карбоксил- и сульфатзамещенных желчных кислот, поскольку последние не протонируются даже при очень низких значениях рН.

Связывание альбумина

Степень связывания альбумина оценивали с помощью равновесного диализа при фиксированном соотношении ВА-альбумин. ВА растворяли в концентрации 100 мкМ в физиологическом растворе (рН 7,2), содержащем 5% альбумина бычьей сыворотки, и оставляли стоять в течение 24 ч при 25°С. Два миллилитра этого раствора подвергали диализу в мешочках из целлюлозы, которые имели отсечку по молекулярной массе 12-14000, помещенных в 25 мл физиологического раствора. Систему приводили в равновесие осторожным механическим встряхиванием в течение 72 ч при 25°С. Концентрации ВА в диализированном растворе (соответствующие свободной несвязанной фракции) и в исходном растворе определяли с помощью ВЭЖХ-Е81-МС/МС, в тех же условиях, что и в предыдущем исследовании. Рассчитывали связывание альбумина в процентах, исходя из исходной концентрации ВА и концентрации несвязанной ВА в диализированной фракции. Данные приведены в табл. 2. Ни одно из соединений не демонстрирует связывания с альбумином, достаточного для относительно быстрого поглощения печенью, подобно природным ВА. Соответственно, ожидается другая (более медленная) кинетика их поглощения печенью.

Пример 5. Исследование метаболической устойчивости при действии бактериальных культур человеческого стула

Устойчивость к действию кишечных бактерий.

7а-дегидроксилирование

Гомогенизированные образцы свежего человеческого стула (500 мг) помещали в стерильные флаконы, в которые добавляли 5 мл стерилизованной среды на основе измельченного мяса и глюкозы (8соН ЬаЬ., ЕщкуШе, Н1). Затем добавляли ВА до конечной концентрации 0,05 мМ. После этого флаконы инкубировали при 37°С; затем через 0, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после добавления ВА, реакции прекращали добавлением 150 мкл 30% КОН. Образцы центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин; из супернатанта выделяли ВА с помощью С-18 твердофазной экстракции, и анализировали их с помощью ТСХ и ВЭЖХЕ8-МС/МС.

В качестве первого скринингового теста применяли тонкослойную хроматографию (ТСХ), в которой использовали пластины с силикагелем толщиной 0,25 мм (Мегск, Иагтйаф Оегталу). Система растворителей, которую использовали для разделения конъюгированных ВА, состояла из пропионовой кислоты/изоамилацетата/воды/н-пропанола (3:4:1:2, все соотношения объемные; растворитель I), и система для неконъюгированных ВА состояла из уксусной кислоты/четыреххлористого углерода/изопропилового эфира/изоамилацетата/воды/н-пропанола/бензола (1:4:6:8:2:2, все соотношения объемные; растворитель II). Пятна разделенных ВА проявляли 5% раствором фосфомолибденовой кислоты в этаноле.

Все исследованные аналоги желчных кислот проявляли высокую устойчивость при инкубировании с бактериальными культурами человеческого стула, и даже через 24 ч более 85% соединений удалось выделить в неизменном виде, как показано на фиг. 2. В противоположность этому контрольный природный аналог СИСА продемонстрировал время полужизни лишь один час, и после восьми часов инкубирования был почти полностью метаболизирован (претерпел 7-дегидроксилирование) с образованием литохолевой кислоты. В случае всех 6-этилзамещенных аналогов после столь же продолжительного периода инкубирования, 7-дегидроксилирование и промежуточное образование 7-оксопроизводного практически отсутствовало.

- 26 020310

Устойчивость боковых цепей

Согласно результатам первого эксперимента, боковые цепи не подвергаются изменениям при действии ферментов кишечных бактерий. Эти данные дают основание предположить, что наличие этильной группы в 6-м положении защищает гидроксильную группу в положении 7 от окисления или элиминирования за счет пространственных препятствий. Кроме того, все изученные аналоги проявляют значительную устойчивость к метаболизму боковых цепей. Сложноэфирная связь боковой цепи сульфатного аналога 2А полностью стабильна в культурах человеческого стула. Сульфонатный аналог ЗА также очень стабилен. При исследовании способом ВЭЖХ-Е8-МС/МС было обнаружено отсутствие второстепенных метаболитов. Эти данные дают возможность предположить, что в среде нижнего отдела кишечника в присутствии анаэробных бактерий, аналоги желчных кислот по настоящему изобретению являются стабильными.

Пример 6. Метаболическая устойчивость в искусственной дуоденальной/панкреатической жидкости (по спецификации И8Р) ίη νίΐτο

Это исследование выполняли для соединения 2А, поскольку в боковой цепи его молекулы содержится сложноэфирная связь, и цель исследования заключалась в подтверждении устойчивости в присутствии ферментов эстераз, которые находятся в соке двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железы. Искусственную панкреатическую жидкость готовили растворением 10 г/л Раисгеайи (81дта Р8096: панкреатин свиных поджелудочных желез, активность 1х по спецификации И8Р) в 0,05М фосфатном буфере, рН 7,2±0,1. Затем к 4-мл аликвотам искусственной панкреатической жидкости добавляли 50 пМ исследуемой ВА и инкубировали в течение различных периодов времени (0, 30, 60, 90, 120, 180 и 240 мин) при 37°С. После инкубирования к 2-мл аликвоте каждого раствора добавляли 2 мл 0,1М №ЮН. желчные кислоты экстрагировали 8РЕ и анализировали с помощью тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии, как описано выше. На фиг. 2 показана устойчивость соединения 2А к метаболизму в искусственной панкреатической жидкости. Согласно указаниям протокола И8Р в качестве контроля использовали оливковое масло. Соединение оказалось очень устойчивым (см. фиг. 2) и сложноэфирная связь (сульфата) в соединении 2А не подвергалась гидролизу панкреатическими эстеразами, что позволяет сделать вывод о высокой устойчивости в среде содержимого двенадцатиперстной кишки и верхнего отдела кишечника человека.

Пример 7. Секреция с желчью и метаболизм соединения 3А в организме крысы с желчной фистулой после дуоденального (ίά) и феморального (ίν) введения

Цель и обоснование эксперимента

Структурная модификация новых аналогов желчных кислот могла бы повлиять на их поглощение печенью, печеночный транспорт и секрецию, и абсорбцию в кишечнике. Следовательно, сведения о секреции с желчью после ίν и ίά введения, а также о метаболизме, являются ключевым моментом в отборе кандидатов для дальнейших исследований.

Для оценки пути и эффективности кишечной абсорбции, аналоги желчных кислот по настоящему изобретению вводили как внутривенно (феморальная инфузия), так и перорально (дуоденальная инфузия) в одинаковых дозах и определяли скорость их секреции с желчью в модели крысы с желчной фистулой. Разница в площадях под кривыми зависимости секреции с желчью от времени для ίν и ίά введения является мерой кишечной абсорбции и дает информацию о биодоступности.

Желчегонный эффект Дуоденальная инфузия

Модель крысы с желчной фистулой была разработана в отделе содействия лабораторным исследованиям иитуегкйу о£ Во1одиа (университета г. Болоньи). Соединение ЗА вводили крысам в дозировке 1 мкмоль/кг/мин (1-часовая инфузия) путем дуоденальной инфузии (ίά). У крыс имелась желчная фистула для отбора образцов желчи в различные моменты времени до и во время инфузии. В экспериментах по дуоденальной инфузии были задействованы три крысы (250±10 г). Образцы желчи отбирали каждые 15 мин в течение четырех часов. Помимо этого 3 контрольным животным вводили физиологический раствор при тех же временных параметрах и условиях отбора образцов (контрольные крысы в эксперименте по дуоденальной инфузии).

На фиг. 3 показаны объемы желчи, выделяющейся во время отбора образцов (для одного животного). Дуоденальную инфузию начинали через 30 мин после первого отбора желчи и проводили ее в течение одного часа. Соединение 3А продемонстрировало умеренный желчегонный эффект.

Внутривенная инфузия

В эксперименте по феморальной инфузии были задействованы 3 крысы. На фиг. 4 показаны объемы желчи, выделявшейся во время исследования. Феморальную инфузию начинали через 75 мин после достижения равновесного состояния и продолжали в течение 60 мин. Образцы желчи отбирали каждые 15 мин в течение четырех часов. Помимо этого трем крысам вводили физиологический раствор при тех же временных параметрах и условиях отбора образцов (контрольные крысы в эксперименте по феморальной инфузии).

Соединение 3А продемонстрировало умеренный желчегонный эффект, подобный тому, который

- 27 020310 был получен в 1б эксперименте.

Секреция введенных аналогов желчных кислот с желчью

Образцы желчи, собранные во время ίν и 1б экспериментов, анализировали для определения секреции с желчью введенных аналогов желчных кислот и их метаболитов.

Анализ ВЭЖХ-Е8-МС/МС. Готовили концентрированные растворы каждого из соединений в метаноле в концентрации 1 ммоль/л (за исключением ИРЕ 1212 в концентрации 350 мкмоль/л) и затем готовили рабочие растворы, разбавляя соответствующие количества исходного раствора. Метанол и ацетонитрил имели степень чистоты для ВЭЖХ. Использовали раствор аммиака с концентрацией 30 и 99,8% уксусную кислоту. Все реагенты получали от ί.';·π1ο ЕгЬа КеаденК Воду с чистотой, достаточной для ВЭЖХ, получали с помощью системы МПИ-р.

Приготовление образцов

Температуру образцов крысиной желчи доводили до комнатной, быстро перемешивали и разбавляли в объемном отношении 1:100 (образцы желчи из экспериментов по дуоденальной инфузии), и 1:100 или 1:200 (образцы желчи из эксперимента по феморальной инфузии), смесью 15 мМ буферный раствор ацетата аммония (рН 5,0):ацетонитрил=70:30 (об./об.). Конечный раствор переносили во флаконы автозагрузчика образцов и вводили в хроматографическую колонку 10 мкл раствора.

Методика ВЭЖХ-Е81-МС/МС

Образцы крысиной желчи анализировали при помощи жидкостной хроматографии с последующим масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС/МС) в котором использовалась ионизация электрораспылением (Е81) в режиме отрицательной ионизации. Для жидкостной хроматографии использовали разделительный модуль \Уа1ег5 АШаосе 2695 совместно с автозагрузчиком образцов. Температуру в автозагрузчике поддерживали на уровне 7°С. Разделение проводили на колонке 8унегд| Нубго-КР С_!8 (150x2,0 мм 1. б., размер частиц 4 мкм), защищенной предколонкой 8есшт1у Сиагб ОИ8 4x2,0 мм 1.б., обе колонки фирмы РНе^п-юнех. Анализируемые образцы элюировали с использованием 15 мМ буферного раствора ацетата аммония (рН=5,00) в качестве подвижной фазы А и ацетонитрила в качестве подвижной фазы В. Долю подвижной фазы В повышали с 30 до 64% в течение 10 мин, затем до 100% течение 10 мин и оставляли на этом уровне в течение еще 10 мин. Скорость потока составляла 150 мкл/мин и температуру колонки поддерживали на уровне 45°С. Выходящий из колонки поток вводили в Е81 источник ионов, соединенный с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Риайго-ЬС, Мюготакк), работающим в режиме мониторинга множественных реакций (МКМ). Азот использовали в качестве распыляющего газа при скорости потока 90 л/ч и для удаления растворителя при скорости потока 930 л/ч. Температуры блока источника ионов и блока удаления растворителя были установлены на уровне 80 и 180°С соответственно. Напряжение на капилляре составляло 3,0 кВ. Для сбора и обработки данных использовали программу Ма^Еуих версии 4,0. Кроме того, для идентификации метаболитов эксперименты по массспектрометрии проводили как в одиночной конфигурации МС, так и в тандемной конфигурации МС/МС.

Получение количественных данных

Ежедневно строили калибровочную кривую по 5 точкам, причем данные для каждой точки получали в результате двукратного введения образца. Образцы для калибровки готовили в диапазоне концентраций 0,1-25 мкмоль/л, используя в качестве растворителя подвижную фазу. Параметры линейной калибровочной кривой получали из графика зависимости площади под кривой анализируемого вещества от его концентрации с использованием регрессионного анализа по методу наименьших квадратов (взвешивание по 1/х²). Коэффициенты корреляции составляли >0,989.

Фармакокинетика (секреция с желчью) введенных аналогов желчных кислот: сравнение ΐν и 1й введения

Приведенные ниже данные относятся к скорости секреции аналогов желчных кислот в неизменном состоянии выходимых вместе с желчью после дуоденальной и феморальной инфузии в дозировке 1 мкмоль/кг/мин. Позже будут приведены данные по основным и второстепенным метаболитам. В табл. 3 показаны концентрации соединения 3А и величины секреции, полученные для образцов крысиной желчи, отобранных во время дуоденальной инфузии (1 ч с 75-й до 135 мин). В табл. 4 показаны концентрации соединения 3А и величины секреции, полученные для образцов крысиной желчи, отобранных во время феморальной инфузии (1 ч с 75-й до 135 мин).

- 28 020310

Таблица 3

Время (мин)	ЗА
концентрация (ммоль/л)	секреция (мкмоль/кт/мин)
90	п.с!.ь	_а
120	0,37	0, 026
150	0,90	0,079
180	1,3	0, 101
210	0,95	0,061
240	0,70	0,043
270	0,58	0, 039
300	0,51	0,029

а: не вычислялась;

Ь: η.ά.; не обнаружена.

Таблица 4

Время (мин)	ЗА
концентр ация (ммоль/л)	секреция (мкмоль/кг/мин)
75	п.а.ь
90	2,6	0, 105
120	7,3	0,588
150	7,5	0,463
180	6, 2	0,363
210	3,4	0,247
240	1	0,045

а: не вычислялась;

Ь: η.ά.; не обнаружена.

Секреция соединения ЗА (сульфонированного аналога желчной кислоты) с желчью после ίν введения происходит очень эффективно, и соединение почти полностью поступает в желчь в неизменном виде. Кинетический профиль показывает, что данный аналог эффективно поглощается печенью и секретируется в желчь почти в исходном состоянии, не претерпевая метаболизма в печени (фиг. 5). В противоположность этому, после ίά введения выделение соединения с желчью оказывается значительно меньшим, чем после ίν введения, и это дает основание предположить, что соединение плохо абсорбируется в кишечнике (фиг. 5). В соответствии со своими физико-химическим свойствами, это соединение плохо абсорбируется при действии механизма пассивной диффузии (низкое значение 1одР=0,71), и активный механизм, по-видимому, не задействован в данном случае. Наличие в молекуле трех гидроксильных групп приводит к тому, что молекула с одной стороны эффективно поглощается печенью и секретируется в желчь, но с другой стороны плохо абсорбируется кишечником.

Пример 8. Метаболизм в печени

Для предварительного скрининга осуществляли поиск возможных метаболитов, исходя из соединений, образование которых ожидалось согласно предыдущим экспериментам и данным, и в соответствии со структурой и физико-химическим свойствами изученных аналогов.

Соединение ЗА не претерпевало метаболизма в печени или в кишечнике, и при поглощении печенью секретировалось в желчь в неизменном виде и с высокой скоростью, что приводило к незначительному времени пребывания в печени. При введении с помощью ίά, соединение плохо абсорбировалось кишечником, и в этом случае также не подвергалось метаболическим превращениям. Вследствие относительно высокой гидрофильности (низкого значения ЬодР) и присутствия сульфонатной группы и трех гидроксильных групп, соединение ЗА достаточно полярно для того, чтобы претерпевать секрецию в желчь в неизменном виде, но слишком полярно для поглощения кишечником при действии пассивных механизмов. На фиг. 6 показано содержание в желчи соединения ЗА и его основного метаболита по данным масс-спектрометрии в эксперименте с дуоденальной инфузией. Приведенные данные представляют собой абсолютные значения площадей под кривыми. На фиг. 7 показан увеличенный фрагмент фиг. 6.

Пример 9. Ιη νίίτο исследование токсического действия соединений на клетки НерС2

Цитотоксичность соединений по настоящему изобретению оценивали с использованием стандартных методик, известных в технике. Конкретно, цитотоксичность оценивали с использованием клеток НерС2. наблюдали за уменьшением содержания АТР и определяли значения ЕС50. Оба соединения ЗА и 2А продемонстрировали значения ЕС50>1000 мМ.

- 29 020310

Соединение	Цитотоксичность в отношении клеток ЕС50(мкМ)по уменьшению содержания	НерС2 АТР
Стауроспорин	15
Тамоксифен	47
ЪСА	84
СОСА	650
июсА	>1000
СА	>1000
ЗА	>1000
2А	>1000

Пример 10. Исследование селективности в отношении ядерных рецепторов (ΝΚ)

Селективность соединений по настоящему изобретению оценивали с применением известных в технике аналитических методик.

Конкретно применялись следующие методики анализа:

ЕХК и ЬХК: рекрутинг коактиватора (А1рЬа§сгееп);

ТСК5: уровень сАМР в линиях кишечных клеток человека (N0-4716);

РХК: конкурентный анализ связывания лигандов (анализ связывания);

САК: рекрутинг коактиватора (ЬапЛаксгееп).

Соединение (контр, стандарт)	РХК (СЛСА=10-20 мкМ) ЕС50 (мкМ)	ТСК5 (ЬСА=4-8 мкМ) ЕС50 (мкМ)	ΙΛΒα (Т0901317=0,0 8 мкМ) ЕС50 (мкМ)	РХК (ЗК12183—0,013 мкМ) ЕС50 (нкМ)	САК (С1ТСО»0,005 мкМ) БС5О (мкМ)	РРАК5 (0,004 мкН) ВС50 (мкМ)	УБК (0,005 мкМ) ЕС50 (мкМ)
СОСА	20	30	нет	>250	>250	нет	нет
			активности			активности	активности
ЪСА	нет	4-8	нет	23	нет	нет	нет
	активности		активности		активности	активности	активности
СА	нет	30	нет	нет	нет	нет	нет
	активности		активности	активности	активности	активности	активности
иосА	>150	нет	нет	>250	>250	нет	нет
		активности	активности			активности	активности
2А	0,14	1/ 6	нет	21	84	нет	нет
			активности			активности	активности
ЗА	7	0,7	нет	150	>250	нет	нет
			активности			активности	активности

Пример 11. Метаболическая активность соединения 3А в мышиной модели ожирения, вызванного рационом питания

Цель исследования заключалась в определении терапевтической эффективности соединения 3А в мышиной модели ожирения, вызванного рационом питания. Соединение 3А вводили с пищей в течение 16 недель самцам мышей С57ВЬ61, которых перед этим содержали на рационе с высоким содержанием жиров в течение 10 недель.

Для проведения исследования самцов мышей С57ВБ61 (в возрасте 5 недель) разбивали на две группы: одна группа животных получала обычный корм, чтобы контролировать начало ожирения, другая группа животных получала корм с высоким содержанием жиров. Соединение 3А тестировали на животных, которые получали корм с высоким содержанием жиров (ΗΕΌ). Затем животных исследовали в течение 13 недель. При этом животных разбивали на следующие группы:

1: обычный корм;

2: корм с высоким содержанием жиров;

3: корм с высоким содержанием жиров + соединение 3А.

На протяжении всего исследования дважды в неделю осуществляли мониторинг массы тела и количества принятой пищи. Период времени для того, чтобы вызвать ожирение, составлял 10 недель. В конце этих 10 недель анализировали массовый состав организма с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (Оехаксап) и измеряли уровни трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, ΗΌΌ-С, ЬПЬ-С и инсулина в сыворотке.

Через 1 неделю: осуществляли введение соединений.

Через 3 недели: отбирали кровь. Во всех группах после голодания в течение 12 ч проводили измерение уровней трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, ΗΌΕ-С, ЬПЬ-С и инсулина в сыворотке.

Через 2 недели: повторно определяли массовый состав организма животных во всех группах с по

- 30 020310 мощью Эеха8сап.

Через 2 недели: измеряли ночной расход энергии с помощью непрямой калориметрии и актиметрии.

Через 2 недели: определяли переносимость глюкозы, подвергая всех животных интраперитонеальному тесту на переносимость глюкозы (1РСТТ). Перед тестом животных заставляли голодать в течение 12 ч.

Через 2 недели: животных умерщвляли. При умерщвлении собирали кровь и анализировали на: содержание липидов в плазме (ТС, ТС, НОЬ-С, РРА); функции печени (АЬАТ, А8АТ, щелочная фаза, γСТ); глюкозу и инсулин; профили липопротеинов отдельных групп плазмы (эксклюзионная хроматография).

Печень, тонкий кишечник, жировые ткани (\УАТ и ВАТ), поджелудочную железу, сердце и мышцы извлекали из организма, взвешивали и сохраняли для проведения дополнительных анализов, которые включали: стандартную гистологию (окрашивание НЕ, окрашивание сукцинат дегидрогеназой, окрашивание масляным красным-О и клеточную морфологию); определение содержания липидов в тканях; электронную микроскопию ВАТ и мышечной ткани для исследования митохондрий; выделение РНК для исследования экспрессии отдельных генов, принимающих участие в метаболизме и энергетическом гомеостазе с помощью количественной РТ-РСВ; выделение белка для исследования пост-трансляционных модификаций, например, ацетилирования определенных белков (например, РСС-1а).

III. Подробное описание методик

А-Содержание и питание животных

Размещение и содержание животных

Мышей размещали в виварии в группах (5 животных в клетке) в специальных условиях отсутствия патогенных микроорганизмов, при цикле свет-темнота 12 ч: 12 ч (включение света в 7:00 утра), при контролируемой температуре (20-22°С) и влажности, согласно правилам Евросоюза. Животным обеспечивали неограниченный доступ к воде и пище.

Питьевая вода

Химический состав водопроводной воды регулярно анализировали в 1п81йи! й'Нуйго1од1е, ИРЬ, 81га8Ьоигд с целью проверки отсутствия потенциально токсичных веществ. Питьевую воду обрабатывали НС1 и НС1О₄ для поддержания рН в диапазоне 5-5,5 и концентрации хлора 5-6 ч./млн.

Рацион питания

Стандартный корм для грызунов получали от ИАВ и корм с высоким содержанием жиров получали от Ве8еагсй Э1е1. Мышам давали либо обычный корм (16% белка, З% жира, 5% клетчатки, 5% минеральных веществ), либо корм с высоким содержанием жиров (20% белка, 20% углеводородов, 60% жира). Соединение ЗА смешивали с порошкообразным кормом с высоким содержанием жиров. Затем порошкообразный корм вновь превращали в гранулы. Животным контрольной группы давали гранулированный корм без добавления соединения ЗА. В случае обычного корма, которые труднее превращается в гранулы, к порошку добавляли минимальное количество вводы для повторного получения гранул, которые затем высушивали на воздухе. Новые порции корма готовили еженедельно.

Отбор образцов крови

Кровь отбирали под анестезией из ретроорбитального синуса или из хвостовой вены.

Анестезия

Для экспериментов по Йеха сканированию (двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии) животных подвергали анестезии смесью кетамин (200 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг), которую вводили с помощью интраперитонеальной инъекции.

Для осуществления пункций вен, животных анестезировали вдыханием смеси изофлуран-О₂.

В - Биохимия

Тесты проводили на автоматизированной лабораторной рабочей станции О1утри8 АИ-400 с использованием коммерческих реагентов (О1утри8).

Анализ липидов и липопротеинов

Содержание триглицеридов в сыворотке, общее и содержание НОЬ холестерина, определяли с применением ферментных анализов. Содержание НОЬ холестерина в сыворотке определяли после осаждения апо В-содержащих липопротеинов фосфовольфрамовой кислотой/Мд (например, РосНе П1адпо811с8, Маипйет, Сегтапу).

Содержание свободных жирных кислот определяли с применением набора от \Уако (например, №и88, Сегтапу) согласно указаниям производителя.

Метаболические и эндокринные исследования

Концентрацию глюкозы в крови измеряли анализатором РгесШоп Ο.Ι.Ό. (например, Мей18еп8е 8у81ет), используя электроды Мей18еп8е Ргес18 (например, АЬЬо! ЬаЬога1опе8, Мей18еп8е ргойис18, ВейГогй, И8А). Достоверность методики подтверждали путем сравнения значений, полученных с помощью анализатора Ргес18юп Ο.Ι.Ό., с результатами измерения глюкозы по классической методике. Методика Ргес181оп Ο.ΙΌ была выбрана по причине того, что для нее требуется минимальное количество крови и, следова

- З1 020310 тельно, ее можно использовать для многократных измерений, например, во время 1РСТТ. Уровни инсулина в плазме (например, Мегсоб1а, Иррка1а, 8^ебеи) определяли с помощью ЕЫ8А, согласно указаниям производителя.

С - Исследование метаболизма

Профили липопротеинов

Профили липопротеинов получали с помощью жидкостной экспресс-хроматографии белков, разделяя липопротеины на три основных класса УЬБЬ, ЬБЬ и НБЬ.

Интраперитонеальный тест на переносимость глюкозы (1РСТТ) - пероральный тест на переносимость глюкозы

1РСТТ проводили у мышей, голодавших в течение ночи (12 ч). Мышам осуществляли интраперитонеальную инъекцию (1РСТТ) 20% раствора глюкозы в стерильном физиологическом растворе (0,9% №1С1) в дозировке 2 г глюкозы/кг массы тела. Отбирали кровь из хвостовой вены для мониторинга содержания глюкозы и инсулина до введения раствора глюкозы и через 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 мин после введения. Вычисляли приращения площади под кривой содержания глюкозы, как показатель чувствительности к инсулину, в то время, как соответствующие уровни инсулина указывали на резервы секреции инсулина.

Расход энергии

Расход энергии оценивали с помощью непрямой калориметрии, измеряя потребление кислорода устройством Охутах (например, Со1итЫа 1ик1гитеи1к, Со1итЬик, ОН) в течение 12 ч. Система состояла из открытого контура с воздухом, входящим в пластиковую клетку и выходящим из нее (в клетке находилась одна мышь). Животным разрешали свободный доступ к пище и воде. Высокоточные сенсоры СО2 и О2 измеряли разницу концентраций О2 и СО2 во входящих и выходящих объемах воздуха, что позволяло определить количество потребленного кислорода за определенный период времени, при условии, что поток входящего в клетку воздуха остается постоянным. Поступающие из устройства данные обрабатывались в присоединенном компьютере, анализировались и представлялись в виде экспортируемого файла Ехсе1. Значения были выражены в единицах мл-кг^-1-ч^-1, которые хорошо известны как УО₂.

Определение содержания жиров в организме с помощью Беха сканирования

Анализы Беха выполняли на денситометре с ультравысоким разрешением Р1Х1МИ8 8епек (пиксели 0,18x0,18 мм, СЕ Мебюа1 8ук1етк, Мабйои, ^1, И8А). Минеральную плотность кости (ВМБ в г/см²) и состав организма определяли с применением программного обеспечения Р1Х1МИ8 (версия 1.4х, СЕ Меб1са1 8ук1етк).

Б-Неинвазивное измерение кровяного давления и пульса

Система анализа УКИесй ВР-2000 В1ооб Ргеккиге Аиа1ук1к 8ук1ет является компьютеризированной системой, которая позволяет одновременно измерять различные параметры жизнедеятельности 4 бодрствующих мышей без вмешательства оператора с помощью специальной манжеты, надетой на хвост. Мышей помещали в индивидуальные темные камеры на подогреваемую платформу и хвосты животных продевали через хвостовую манжету. Система измеряла кровяное давление путем определения давления манжеты при котором прекращался кровоток в хвосте. Фотоэлектрический сенсор определял пульс особи. Было показано, что результаты, которые генерировала описываемая система, хорошо соответствовали данным по среднему внутриартериальному давлению, которое одновременно измеряли в сонной артерии. Это позволяло получать воспроизводимые значения систолического кровяного давления и частоты сердцебиения. Для получения результатов была необходима тренировка животных в системе в течение одной недели.

Е - Циркадная активность

Измеряли спонтанную двигательную активность, используя индивидуальные боксы, каждый из которых состоял из выдвижного пола, съемной клетки и был снабжен инфракрасными датчиками захвата, которые позволяли измерять активность передвижений животного и количество вставаний на задние лапы. Боксы связывали с компьютером с использованием электронного интерфейса (например, 1те1гошс, Реккас, Егаисе). Мышей тестировали в течение 32 ч для того, чтобы измерить адаптацию к аппаратуре, а также ночную и дневную активность. Количество воды, выпитой за время тестирования, измеряли с использованием автоматизированного ликометра.

Результаты описанных исследований показаны на фиг. 8, 9 и 10. На фиг. 8 показано изменение со временем прироста массы тела после начала введения соединения 3А (%). На графике показана зависимость прироста массы в % (0, 5, 10, 15, 20, 25) от времени (0-9 недель). Прирост массы тела у мышей, получавших жирный корм вместе с соединением 3А, ослаблялся. На фиг. 9 показано изменение со временем массового состава организма (в %) в результате введения соединения 3А в течение 5 недель с начала введения. Графики отображают прирост массы в % и приведены для жировой ткани, нежировой ткани и жидких сред организма. Соединение 3А уменьшает прирост массы жировой ткани при рационе с высоким содержанием жиров (НЕБ). На фиг. 10 приведены данные по гомеостазу глюкозы для соединения 3А. На фиг. 10А изображена гликемия через три недели с начала введения соединения 3А. Конкретно, фиг. 10А представляет собой гистограмму, отображающую сравнение трех групп мышей (ось х):

- 32 020310 мышей на НГО, которым вводили соединение 3А (первый бар), мышей на НЕИ (второй бар) и мышей на обычном корме (третий бар) и результаты измерения содержания глюкозы после голодания (ось у) в моль/л (значения по оси 10, 12, 1Д, 16, 18, 20 и 22). На фиг. 10В показаны уровни фруктозаминов через три недели после начала введения. Конкретно, фиг. 10В представляет собой гистограмму, отображающую сравнение трех групп мышей (ось х): мышей на НЕИ, которым вводили соединение 3А (первый бар), мышей на НЕИ (второй бар) и мышей на обычном корме (третий бар) и результаты измерения содержания глюкозаминов (ось у) в микромолях (значения по оси 170, 175, 180, 185, 195, 200, 205 и 210. На фиг. 10С показаны результаты теста на переносимость глюкозы через 9 недель с начала введения соединения 3А. Конкретно, фиг. 10С представляет собой гистограмму, отображающую сравнение трех групп мышей: мышей на НЕИ, которым вводили соединение 3А, мышей на НЕИ и мышей на обычном корме. Ось у отображает содержание глюкозы в мг/дл (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, Д00, Д50, 500), и ось х отображает время в минутах 0, 30, 60, 90, 120, 150 и 180.

Другие варианты осуществления

Хотя настоящее изобретении было изложено в виде детального описания конкретных вариантов осуществления, предшествующее описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом приложенной формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации настоящего изобретения входят в объем следующей далее по тексту формулы изобретения. Специалисты в данной области техники поймут, что в форму и детали настоящего изобретения могут быть внесены изменения без выхода за пределы его объема, определенного приложенной формулой изобретения.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (Ό) или его соль или сольват, где

   К! представляет собой водород, гидрокси, незамещенный С1-С₆алкил или галоген;

   К₂ представляет собой водород или α-гидрокси;

   Кд представляет собой этил;

   К₇ представляет собой водород, незамещенный С1-С₆алкил или гидрокси;

   К_п представляет собой гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН3, ОРО3Н, ОРО3^2- или водород и К12 представляет собой гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород.
2. 2. Соединение формулы Е или его соль или сольват конъюгата, где

   К! представляет собой водород, гидрокси, незамещенный С1-С₆алкил или галоген;

   К₂ представляет собой водород или α-гидроксил;

   Кд представляет собой этил;

   К₅ представляет собой водород или незамещенный С1-С₆алкил;

   К6 представляет собой водород;

   К₇ представляет собой водород, незамещенный С1-С₆алкил или гидрокси;

   Кп представляет собой гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород и

   К1₂ представляет собой гидроксил, О8О₃Н, О8О₃ ^-, ОСОСН₃, ОРО₃Н, ОРО₃ ^2- или водород.
3. 3. Соединение по п.1 или 2 или его соль, или сольват, где К11 представляет собой гидроксил и К12 представляет собой водород.

   Д. Соединение по любому из пп.1-3, или его соль, или сольват, где К! представляет собой группу ОН.
4. 5. Соединение по любому из пп.1-Д, или его соль, или сольват, где К₇ представляет собой Н.
5. 6. Соединение по любому из пп.1-5, или его соль, или сольват, где К₂ представляет собой Н.
6. 7. Соединение, выбранное из

   - 33 020310 или его соль или сольват.
7. 8. Соединение по любому из пп.1-7, где указанное соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль.
8. 9. Соединение по п.8, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой
9. 10. Соединение по п.8, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой
10. 11. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-10, или его соль, или сольват и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
11. 12. Способ лечения или предупреждения заболевания, связанного с модулированием рецептора ТСР5 у субъекта, включающий введение соединения по любому из пп.1-9, или его соли, или сольвата.
12. 13. Способ по п.12, где заболевание выбрано из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, заболевания печени, аутоиммунного заболевания, сердечного заболевания, заболевания почек, рака и заболевания желудочно-кишечного тракта.
13. 14. Способ по п.13, где заболевание выбрано из воспалительного заболевания и рака.
14. 15. Способ по любому из пп.12-14, где соединение, или его соль, или сольват вводят субъекту перорально, парентерально, внутривенно или местно.
15. 16. Способ по любому из пп.12-15, где субъект является человеком.