BRPI0916735B1

BRPI0916735B1 - Compostos moduladores de tgr5, composições farmacêuticas compreendendo os mesmos e seus usos

Info

Publication number: BRPI0916735B1
Application number: BRPI0916735-8A
Authority: BR
Inventors: Roberto Pellicciari
Original assignee: Intercept Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2020-07-28
Also published as: CA2732323A1; US9540414B2; EP2324046A2; AU2009276507A1; HK1158212A1; CN105037476A; US20160052956A1; EP2324046B1; BRPI0916735B8; US20110172198A1; AU2009276507B2; WO2010014836A3; HK1217335A1; BRPI0916735A2; CA2732323C; US8796249B2; CN102164940A; WO2010014836A2; EA020310B1; EA201170276A1

Abstract

COMPOSTOS MODULADORES DE TGR5, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS E SEUS USOS A invenção refere-se a compostos de Fórmula A: (A) ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo. Os compostos de Fórmula A são moduladores de TGR5 úteis para o tratamento de doenças. Tais compostos contém uma fração sulfato ou ácido sulfônico que modula TGR5, e composições farmacêuticas contendo tais compostos são úteis em métodos para o tratamento e prevenção de doença.

Description

Campo da Invenção

[0001] A invenção refere-se a compostos contendo uma fração sulfato ou ácido sulfônico que modula TGR5 e composições farmacêuticas contendo tais compostos úteis em métodos para o tratamento e prevenção de doença.

Antecedente da Invenção.

[0002] O receptor TGR5 é um receptor acoplado a proteína G que foi identificado como um receptor de superfície celular que é responsive a ácidos biliares (BAs). A estrutura primária de TGR5 e sua responsividade à ácidos biliares demonstrou ser altamente conservada em TGR5 entre humanos, bovinos, coelhos, ratos e camundongos e, assim, sugere que TGR5 tem funções fisiológicas importantes. TGR5 demonstrou ser amplamente distribuído não somente em tecidos linfóides mas também em outros tecidos. Altos níveis de mRNA de TGR5 foram detectados na placenta, baço e monócitos/macrófagos. Ácidos biliares demonstraram induzir a internalização da proteína de fusão de TGR5 a partir da membrana celular para o citoplasma. Kawamata et al. 2003, J. Bio. Chem., 278, 9435. TGR5 demonstrou ser idêntico ao hGPCR19 reportado por Takeda et al. 2002, FEBS Lett. 520, 97-101.

[0003] TGR5 está associado com o acúmulo intracelular de cAMP, que é amplamente expressa em diversos tipos celulares. Enquanto a ativação deste receptor de membrana é macrófagos diminui a produção de citocina pró-inflamatória (Kawamata, Y.; Fujii, R.; Hosoya, M.; Harada, M.; Yoshida, H.; Miwa, M.; Fukusumi, S.; Habata, Y.; Itoh, T.; Shintani, Y.; Hinuma, S.; Fujisawa, Y.; Fujino, M., A G protein- coupled receptor responsive to bile acids.J. Biol. Chem. 2003, 278, 9435-9440), a estimulação de TGR5 por BAs em adipócitos e miócitos aumenta o gasto energético (Watanabe, M.; Houten, S. M.; Mataki, C; Christoffolete, M. A.; Kim, B. W.; Sato, H.; Messaddeq, N.; Harney, J. W.; Ezaki, 0.; Kodama, T.; Schoonjans, K.; Bianco, A. C; Auwerx, J., Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid hormone activation. Nature. 2006, 439, 484-489). Este último efeito envolve a indução dependente de cAMP de deiodinase iodotironina tipo 2 (D2) que por sua vez, converte localmente T4 em T3, gera atividade aumentada de hormônio da tireoide. Consistente com o papel de TGR5 no controle de metabolismo energético, camundongos fêmeas knock-out de TGR5 apresentam um acúmulo significativo de gordura com ganho de peso corporal quando desafiados com uma dieta rica em gordura, indicando que a falta de TGR5 diminui o gasto energético e induz a obesidade (Maruyama, T.; Tanaka, K.; Suzuki, J.; Miyoshi, H.; Harada, N.; Nakamura, T.; Miyamoto, Y.; Kanatani, A.; Tamai, Y., Targeted disruption of G protein-coupled bile acid receptor 1 (Gpbarl/MBar) in mice. J. Endocrinol. 2006, 191, 197-205).AIém disso, e alinhado com o envolvimento de TGR5 na homeostasia de energia, a ativação de ácido biliar do receptor de membrana tem sido ainda relatado como promotor da produção de peptídeo 1 tipo glucagon (GLP-1) em linhagens de células enteroendócrinas de murino (Katsuma, S.; Hirasawa, A.; Tsujimoto, G., Bile acids promote glucagon-like peptide- 1 secretion through TGR5 in a murine enteroendocrine cell line STC-I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386-390).Com base em todas as observações acima, TGR5 é um alvo atrativo para o tratamento de doença.

[0004] Alguns exemplos de agonistas de TGR5 foram descritos até agora na literatura. Recentemente, derivados de alquila-23-substituída e alquila-6,23-dissubstituídas de ácido quenodesoxicólico, como o ácido 6a-etil-23(S)-metil-quenodeoxicólico mostrado abaixo, foram relatados como agonistas potentes e seletivos de TGR5 (Pellicciari, R.; Sato, H.; Gioiello, A.; Costantino, G.; Macchiarulo, A.; Sadeghpour, B. M.; Giorgi, G.; Schoonjans, K.; Auwerx, J., Nongenomic actions of bile acids. Synthesis and preliminary characterization of 23-and 6,23-alkyl- substituted bile acid derivatives as selective modulators for the g- protein coupled receptor TGR5. J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268).

[0005] Em particular, a metilação da posição C23-(S) de BAs naturais confere uma seletividade marcada para TGR5 sobre a ativação de FXR (farnesóide X receptor), enquanto que a substituição de 6a-alquila aumenta a potência em ambos os receptores. Outros agonistas de TGR5 incluem éster benzílico de ácido 6-metil-2-oxo-4- tiofen-2-il-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidina-5-carboxílico (W0004067008, Takeda Chemical Industries LTD, Japão, 2004) e ácido oleanóico (Sato, H.; Genet, C; Strehle, A.; Thomas, C; Lobstein, A.; Wagner, A.; Mioskowski, C; Auwerx, J.; Saladin, R., Anti-hyperglycemic activity of a TGR5 agonist isolated from Olea europaea. Biochem. And Biophys. Res. Commun. 2007, 362, 793-798; Ito, F.; Hinuma, K.; Kanzaki, N.; Miki, T.; Kawamata, Y.; Oi, S.; Tawaeaishi, T.; Ishichi, Y.; Hirohashi, M. Preparation of aromatic ring- fused cyclic compounds as TGR5 receptor agonists. PN: W02004067008, 2004). Mais recentemente, a primeira síntese de ácido quenodeoxicólico enantiomérico (CDCA) e ácido litocólico (LCA) permitiu avaliar a especificidade da interação de BAs naturais a TGR5 (Katona, B. W.; Cummins, C. L.; Ferguson, A. D.; Li, T.; Schmidt, D. R.; Mangelsdorf, D. J.; Covey, D. F., Synthesis, Characterization, and Receptor Interaction Profiles of Enantiomeric Bile Acids. J. Med. Chem. 2007, 50, 6048-6058).

[0006] Enquanto estas ferramentas químicas forneceram pela primeira vez uma diferenciação farmacológica de efeitos genômicos versus não genômicos de BAs, algumas destas também permitiram desenhar um primeiro estudo de relação estrutura-atividade onde a presença de pocket de ligação acessório em TGR5 desempenha um papel principal na determinação da seletividade do ligante ((Pellicciari, R.; Sato, H.; Gioiello, A.; Costantino, G.; Macchiarulo, A.; Sadeghpour, B. M.; Giorgi, G.; Schoonjans, K.; Auwerx, J., Nongenomic actions of bile acids. Synthesis and preliminary characterization of 23 -and 6,23- alkyl-substituted bile acid derivatives as selective modulators for the g- protein coupled receptor TGR5. J. Med.Chem. 2007, 50, 4265-4268). Neste contexto, a disponibilidade de moduladores de TGR5 mais potentes e seletivos é necessária para identificar ainda características adicionais que afetam a ativação do receptor e caracteriza as ações fisiológicas e farmacológicas deste receptor. Há uma necessidade para o desenvolvimento de moduladores de TGR5 para o tratamento e prevenção de doença. A presente invenção identificou compostos, que contêm uma fração de sulfato ou ácido sulfônico, que modulam TGR5 bem como métodos de uso destes compostos para tratar doença.

Sumário da Invenção

[0007] A presente invenção refere-se a moduladores para TGR5 contendo uma fração sulfato ou ácido sulfônico e seu uso para tratar e prevenir doenças que envolvem a modulação de receptor de TGR5, como doença metabólica, doença inflamatória, doença hepática, doença autoimune, doença cardíaca, câncer, e doença gastrointestinal. A invenção inclui um composto contendo a fórmula A:

[0008] ou um sal, solvato, ou hidrato do mesmo, onde:

[0009] Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; Rs é hidrogênio, alquila não substituída, ou arila; Rs é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou Rs e Rs tomados juntos com os carbonos aos quais estão ligados formam um anel de tamanho de 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSOs' OCOCH3, OPO3H, OPOs2ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32 ou hidrogênio, ou tomados juntos com Rn e Reformam uma carbonila; m é 0, 1 ou 2 ; n ou 0 ou 1; 0 é 0 ou 1; e p é 0 ou 1; desde que (1) quando m + n + o = 3ou4, pé zero, e Rs é hidrogênio, então R4 não é hidrogênio, salvo se R7 é OH; (2) quando m + n + o = 3, pé 1, e Rs e Rs são cada um hidrogênio, então pelo menos um de R2 e R4 não é hidrogênio; e (3) quando m + n + 0 =2, então pelo menos um de Rs e Rs não é hidrogênio.

[00010] Em um aspecto, a invenção inclui um composto contendo a fórmula D:

[00011] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-; R12

[00012] é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32; ou hidrogênio, ou tomados juntos Rn e Ri2 formam uma carbonila, desde que R4 não seja hidrogênio, salvo se R? é OH.

[00013] Em um aspecto, a invenção inclui um composto contendo a fórmula E:

[00014] ou um sal, solvato, ou hidrato conjugado do mesmo, onde: Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio; R2é hidrogênio ou a-hidroxila; R4Ó hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio; R5 é hidrogênio, alquila não substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou Rs e Re tomados juntos com os carbonos aos quais estão ligados formam um anel de tamanho de 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSO3- OCOCH3, OPO3H, OPO32ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSOs', OCOCH3, OPO3H, OPO32’ou hidrogênio, ou tomados juntos Rn e Reformam uma carbonila, desde que pelo menos um de Rs ou Re não seja hidrogênio.

[00015] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Ri é OH. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R7 é H. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2 é H. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R4 é alquila não substituída. Em um aspecto, a invenção inclui um composto selecionado de

[00016] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo. Em um aspecto, a invenção inclui um composto que é um sal farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, a invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00017] Em outro aspecto, a invenção inclui o uso de um composto contendo a fórmula A ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto contendo a fórmula A ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo: onde:

[00018] Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio, Rs é hidrogênio, alquila não substituída, ou arila; Re é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou Rs e Re tomados juntos com os carbonos aos quais estão ligados formam um anel de tamanho de 3, 4, 5, ou 6 átomos; R? é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSO3 OCOCH3, OPO3H, OPO32 ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3; OCOCH3, OPO3H, OPÜ32'ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3; OCOCH3, OPO3H, OPO32; ou hidrogênio, ou tomados juntos Rn e R12 formam uma carbonila;

[00019] m é 0, 1, ou 2; n é 0 ou 1; 0 é 0 ou 1; e p é 0 ou 1, na produção de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença em um sujeito que envolve a modulação de receptor de TGR5.

[00020] Em um aspecto, a invenção inclui 0 uso onde a doença é selecionada de doença metabólica, doença inflamatória, doença hepática, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doença gastrointestinal. Em um aspecto, a invenção inclui 0 uso, onde a doença é selecionada de doença inflamatória e câncer. Em um aspecto, a invenção inclui 0 uso, onde 0 composto ou composição farmacêutica é administrado ao sujeito por via oral, parenteral, intravenosa ou tópica. Em um aspecto, a invenção inclui 0 uso, onde 0 sujeito é um humano.

[00021] A descrição acima estabelece, ao invés, as características mais importantes de forma ampla da presente invenção com 0 objetivo de que a descrição detalhada do mesmo que se segue possa ser entendida e para que as presentes contribuições para a técnica possam ser melhor apreciadas.

[00022] Outros objetos e características da presente invenção ficarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada considerada em conjunto com os exemplos.

Breve Descrição das Figuras

[00023] A Figura 1 é um gráfico que descreve a tensão de superfície plotada contra 0 logaritmo da concentração de 3 A (mM) em NaCI 0,15M.

[00024] A Figura 2 é um gráfico que descreve que a estabilidade metabólica de 2A em fluido pancreático simulado.

[00025] A Figura 3 é um fluxograma de bile para um experimento de infusão duodenal realizado usando 3A. A Figura 4 é um fluxograma de bile para um experimento de infusão femoral realizado usando 3A.

[00026] A Figura 5 é um gráfico que descreve as taxas de secreção versus o tempo em experimentos de infusão femoral e duodenal realizado usando 3A.

[00027] As Figuras 6 e 7 são gráficos que mostram 3A e seu principal metabólito identificado na bile usando espectrômetro de massa em um experimento infusional duodenal. Os dados são relatados como valores de áreas absolutas. A Figura 7 mostra a Figura 6 ampliada.

[00028] A Figura 8 é um gráfico que mostra a evolução de ganho de peso após o tratamento (%) (Exemplo 11).

[00029] A Figura 9 é uma série de gráficos em barras de composição corporal após o tratamento (%) 5 semanas após o tratamento (Exemplo 11). A Figura 10 mostra uma avaliação de homeostase de glicose para o composto 3 A.

[00030] A Figura 10 A apresenta a glicemia 3 semanas após o tratamento. A Figura 10 B apresenta frutosaminas 3 semanas após o tratamento. A Figura 10 C apresenta os resultados de teste de tolerância de glicose 9 semanas após o tratamento.

Descrição da Invenção

[00031] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção estão estabelecidos na descrição abaixo.

[00032] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais são agora descritos. Outras características e vantagens da invenção ficarão aparentes a partir da descrição. Na especificação, formas singulares incluem ainda o plural salvo se o contexto claramente indique de outra forma. Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um especialista na técnica da qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação regerá.

[00033] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula A:

[00034] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogênio; Rs é hidrogênio, alquila não substituída ou arila; R6 é hidrogênio alquila substituída ou não substituída

[00035] ou R5 e R6 tomados juntos com os carbonos aos quais estão ligados formam um anel de 3, 4, 5, ou 6 átomos de tamanho; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSO3- OCOCH3, OPO3H, OPO32ou hidrogênio; R12 é hidroxila, OSO3H, OSOs', OCOCH3, OPO3H, OPOs2' ou hidrogênio, ou tomados juntos Rn e Reformam uma carbonila; m é 0, 1 ou 2 ; n ou 0 ou 1; 0 é 0 ou 1; e p é 0 ou 1.

[00036] Em um aspecto a invenção fornece que quando m + n + o = 3 ou 4, p é zero, e Rs é hidrogênio, então R4 não é hidrogênio, salvo se R7 for OH. Em outro aspecto a invenção fornece que quando m + n + 0 = 3 ou 4, p é zero, e Rs não é alquila ou arila não substituída, então R4 não é hidrogênio, salvo se R7 for OH.

[00037] Em um aspecto a invenção fornece que quando m + n + o = ~ o é 1 e Rs e Rs são cada um hidrogénio, então pelo menos um de F>2 e R4 não é hidrogênio.

[00038] Em um aspecto, a invenção fornece que quando m + n + o = 2, e pelo menos um de R5 e R6 não é hidrogênio.

[00039] Em um aspecto, a invenção não inclui os compostos A, B e C:

[00040] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo. Em outro aspecto, a invenção não inclui um composto 6A ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo. Em outro aspecto, a invenção não inclui um composto 7A ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo.

[00041] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula B:

[00042] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2, R4, Rs, e R6, m, n, 0, e p estão descritos acima. Em um aspecto a invenção fornece que quando m + n + o = 3ou4, pé zero, e Rs é hidrogênio, então R4 não é hidrogênio. Em um aspecto a invenção fornece que quando m + n + 0 = 3, p é 1, e Rs e R6 são cada um hidrogênio, então pelo menos um de R2 e R4 não é hidrogênio. Em outro aspecto, a invenção fornece que quando m + n + 0 = 2, então pelo menos um de R5 e Re não é hidrogênio.

[00043] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula C:

[00044] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2, Rs, Re. m, n, o, e p estão descritos acima. Em um aspecto, quando m + n + ° = 2, então pelo menos um de Rs e Re não é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula D:

[00045] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R1, R2, R4, R7, RI1; E R12 estão descritos acima. Em um aspecto, R4 não é hidrogênio.

[00046] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula E:

[00047] ou um sal, solvato, ou hidrato do mesmo, onde: Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; R2 é hidrogênio ou a-hidroxila; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; Rs é hidrogênio, alquila não substituída, ou arila; Re é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída ou Rs e Rs tomados juntos com os carbonos aos quais estão ligados formam um anel de 3, 4, 5, ou 6 átomos de tamanho; R? é hidrogénio, alquila substituída ou não substituída, ou hidróxi; Rn é hidroxila, OSO3H, OSO3; OCOCH3, OPO3H, OPO32‘ ou hidrogênio; e R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, OPO32-ou hidrogénio, ou tomado junto com Rn e Reforma uma carbonila. Em um aspecto, a invenção fornece que pelo menos um de R5 e Re não é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula F:

[00048] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde Rs é alquila ou arila substituída ou não substituída; e R1, R2, R4, Rz, R11 and R12 estão descritos acima.

[00049] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula G:

ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R1, R2, R4, R7’ R11 R12 estão descritos acima.

[00050] Em um aspecto, a invenção fornece um composto contendo a fórmula H:

[00051] ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2, R5, R6, estão descritos acima.

[00052] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde R1 é OH.

[00053] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R7 é H. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R1 é OH e R7 é H.

[00054] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2 é H. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R2 é alfa-OH. Em um aspecto, a invenção fornece um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde R2 é beta-OH.

[00055] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R4 é alquila não substituída. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde R4 é etila. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde R4é metila.

[00056] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rs não é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rs é alquila não substituída. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rs é metila.

[00057] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Re é hidrogênio.

[00058] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rs e Re são ambos hidrogênio.

[00059] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rn é hidroxila. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Ri2 é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde Rn é hidroxila e R12 é hidrogênio.

[00060] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde m é 1. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde m é 2. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde n é 1.

[00061] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde o é 0. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde o é 1. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde p é 1. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde p é 0.

[00062] Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R4 é etila é p é 1. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo, onde R4 é etila e 0 composto contém uma fração sulfonada. Em um aspecto, a invenção fornece um composto ou um sal, solvato ou hidrato do mesmo onde R4 é hidrogênio ou alquila substituída ou não substituída e p é 0.

[00063] Em um aspecto, a invenção fornece um composto selecionado de

[00064] ou um sal, solvato, ou hidrato do mesmo.

[00065] Em um aspecto, a invenção fornece um composto onde o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.

[00066] Em um aspecto, a invenção fornece um sal farmaceuticamente aceitável selecionado de:

[00067] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00068] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um composto ou composição farmacêutica da invenção, na produção de um medicamento para tratar ou prevenir a doença em um sujeito. Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratar ou prevenir doença em um sujeito ao administrar um composto ou composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece uma quantidade terapeuticamente eficiente de um composto ou a composição farmacêutica da invenção é administrada ao sujeito. Em um aspecto, a invenção fornece uma quantidade profilaticamente eficiente de um composto ou a composição farmacêutica da invenção é administrada. Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um composto ou composição farmacêutica da invenção, na produção de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença em um sujeito que envolve a modulação do receptor TGR5. A invenção inclui um método para tratar ou prevenir uma doença que envolve a modulação do receptor TGR5 em um sujeito ao administrar um composto ou composição farmacêutica da invenção.

[00069] Em um aspecto, a invenção fornece o uso, onde a doença é selecionada de doença metabólica, doença inflamatória, doença hepática, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doença gastrointestinal, usando um composto contendo a fórmula A, B, C, D, E, F, ou G. A invenção inclui um método para tratar ou prevenir a doença selecionada a partir de doença metabólica, doença inflamatória, doença hepática, doença autoimune, doença cardíaca, doença renal, câncer e doença gastrointestinal usando um composto de fórmula A, B, C, D, E, F, ou G. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir doença inflamatória ou câncer usando um composto de fórmula A, B, C, D, E, F, ou G.

[00070] Em um aspecto, a invenção fornece para o uso, onde a doença é uma doença metabólica selecionada de obesidade, diabetes, síndrome metabólica, resistência a insulina, hipertensão e dislipidemia. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença metabólica selecionada de obesidade, diabetes, síndrome metabólica, resistência a insulina, hipertensão e dislipidemia.

[00071] Em um aspecto, a invenção fornece o uso, onde a doença é uma doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, rash alérgico e psoríase. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, rash alérgico e psoríase.

[00072] Em um aspecto, a invenção fornece o uso, onde a doença é uma doença autoimune selecionada de artrite reumaóide, esclerose múltipla e diabetes tipo 1. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença autoimune selecionada de artrite reumatoide, esclerose múltipla e diabetes tipo 1.

[00073] Em um aspecto a invenção fornece o uso, onde a doença é uma doença gastrointestinal selecionada de doença de inflamatória intestinal (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (malabsorção) e super crescimento bacteriano. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença gastrointestinal selecionada de doença de inflamatória intestinal (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (malabsorção) e super crescimento bacteriano. Em um aspecto a invenção fornece o uso, onde a doença é doença renal selecionada de neuropatia diabética, insuficiência renal crônica, nefrosclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glomerulopatia de transplante crônica, nefrite intersticial crônica e doença policística renal. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir doença renal selecionada de neuropatia diabética, insuficiência renal crônica, nefrosclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glomerulopatia de transplante crônica, nefrite intersticial crônica e doença policística renal.

[00074] Em um aspecto a invenção fornece o uso, onde a doença é câncer selecionado de câncer colorretal, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, carcinoma de colangio, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulinoma. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir câncer selecionado de câncer colorretal, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, carcinoma de colangio, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulinoma. Em um aspecto, a invenção fornece o uso, onde a doença é uma doença hepática selecionada de esteatopatia não-alcoólica, doença hepática gordurosa não-alcoólica, hepatite virai crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzida por droga, hematocromatose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hipertensão de porta, desnaturação da bile, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência de antitripsina o1, nutrição parenteral total (TPN), colestase associada a TPN e sepse. A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença hepática selecionada de esteatopatia não-alcoólica, doença hepática gordurosa não-alcoólica, hepatite virai crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzida por droga, hematocromatose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hipertensão de porta, desnaturação da bile, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência de antitripsina a1, nutrição parenteral total (TPN), colestase associada a TPN e sepse.

[00075] Em um aspecto, a invenção fornece para o uso, onde a doença cardíaca é selecionada de insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina pectoris, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, infarto, acidente vascular cerebral). A invenção inclui um método de tratar ou prevenir uma doença cardíaca selecionada de insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina pectoris, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, infarto, acidente vascular cerebral).

[00076] Em um aspecto, a doença envolve modulação de receptor TGR5. Em um aspecto, o composto é um agonista de TGR5. Em um aspecto, o composto é um agonista seletivo de TGR5 sobre o ativador FXR. Em um aspecto, o composto é um modulador parcial de FXR. Em um aspecto, o composto é um agonista FXR parcial.

[00077] Em um aspecto, o composto ou composição farmacêutica da invenção é administrado ao sujeito por via oral, parenteral, intravenosa ou tópica. Em um aspecto, o sujeito é um humano. Definições

[00078] Para conveniência, certos termos usados na especificação, exemplos e reivindicações anexadas são colecionados aqui.

[00079] O termo “tratar”, como usado aqui, significa aliviar, diminuir, reduzir, eliminar, modular ou amenizar, ou seja, causar a regressão do estado da doença ou condição. Tratar pode ainda incluir inibir, ou seja, impedir o desenvolvimento de um estado de doença ou condição existente, e aliviar ou amenizar, ou seja, causar a regressão de um estado de doença ou condição existente, por exemplo, quando o estado da doença ou condição pode já estar presente.

[00080] O termo “prevenir”, como usado aqui, significa interromper completamente ou quase completamente um estado de doença ou condição, a partir da ocorrência em um paciente, especialmente quando o paciente ou sujeito é pré-disposto a tal ou em risco de contrair um estado de doença ou condição.

[00081] “Alquila” significa grupos alifáticos, incluindo grupos alquila de cadeia linear (por exemplo, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila), grupos alquila de cadeia ramificada (por exemplo, isopropila, tert-butila, isobutila). Em certas modalidades, uma alquila de cadeia linear ou ramificada tem seis ou menos átomos de carbono em sua estrutura (por exemplo Ce para cadeia linear, Ce-Ce para cadeia ramificada). Em alguns exemplos, uma alquila de cadeia linear ou de cadeia ramificada tem quatro ou menos átomos de carbono em sua estrutura.

[00082] Como usado aqui, “cicloalquila” tem a intenção de incluir grupos de anéis saturados, como ciclopropila, ciclobutila, ou ciclopentila. Cicloalquila C3-8 tem a intenção de incluir grupos cicloalquilas de C3, C4, C5, C6, C7, e C8. O termo “alquila substituída” refere-se a frações alquila contendo um substituinte que substitui um ou mais átomos de hidrogênio em pelo menos um ou mais carbonos da estrutura dôo hidrocarboneto. Tais substituições podem incluir, por exemplo, alquila, alquenila, alquinila, halogênio, hidroxila, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonila, arilcarbonila, alcoxicarbonila, aminocarbonila, alquilaminocarbonila, dialquilaminocarbonila, alquiltiocarbonila, alcoxila, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, e alquiiarilamino), acilamino (incluindo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoil e ureído), amidino, imino, sulfidrila, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfmila, sulfonato, sulfamoila, sulfonamide, nitro, trifluorometila, ciano, azido, heterociclila, alquilarila, ou uma fração aromática ou heteroaromática.

[00083] “Arila” inclui grupos com aromaticidade, incluindo grupos aromáticos de 5 ou 6 membros “não conjugados” ou de anel único que pode incluir de zero a quatro heteroátomos, bem como sistemas “conjugados” ou multicíclicos com pelo menos um anel aromático. Exemplos de grupo arila incluem benzeno, fenila, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirizina, piridazina, e pirimidina e semelhantes. Além disso, o termo “arila” inclui grupos arila multicíclicos, por exemplo, tricíclicos, bicíclicos, por exemplo, naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofeno, metilenedioxifenila, quinolina, isoquinolina, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, ou indolizina. Estes grupos arila contendo heteroátomos na estrutura de anel pode ainda ser referidos como “heterociclos arila”, “heterociclos”, “heteroarilas” ou “heteroaromáticos”. O anel aromático pode ser substituído por pelo menos uma posição de anel como tais substituintes como descrito acima como, por exemplo, halogênio, hidroxila, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonila, alquilaminocarbonila, aralquilaminocarbonila, alquenilaminocarbonila, alquilcarbonila, arilcarbonila, arilquilcarbonila, alquenilcarbonila, alcoxicarbonila, aminocarbonila, alquiltiocarbonila, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino, e alquilarilamino), acilamino (incluindo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoil e ureído), amidino, imino, sulfidrila, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfínil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamide, nitro, trifluorometil, ciano, azido, heterociclila, alquilarila, ou uma fração aromática ou heteroaromática. Grupos arila podem ainda ser fundidos com anéis alicíclicos ou heterocíclicos, que não são aromáticos para formar um sistema multicíclico (por exemplo, tetralina, metilenodioxifenila).

[00084] Salvo se o número de carbonos for de outra forma especificado, “alquila inferior” ‘ inclui um grupo alquila, como definido acima, mas contendo de um a dez, por exemplo, de um a seis, átomos de carbono em sua estrutura.

[00085] O termo “éster” inclui compostos e frações que contêm um carbono ou um heteroátomo ligado a um átomo de oxigênio que está ligado ao carbono de um grupo carbonila. O termo “éster” inclui grupos alcoxicarboxi como metoxicarbonila, etoxicarbonila, propoxicarbonila, butoxicarbonila, pentoxicarbonila, etc. Os grupos alquila, alquenila, ou alquinila são como definidos acima.

[00086] O termo “hidróxi” ou “hidroxila” inclui grupos com um -OH ou —O O termo “halogénio” inclui flúor, bromo, cloro, iodo, etc. O termo “perhalogenado” geralmente refere-se a uma fração onde todos os hidrogénios são substituídos por átomos de halogénio. Um “grupo aniônico”, como usado aqui, refere-se a um grupo que é carregado negativamente em pH fisiológico. Grupos aniônicos incluem carboxilato, sulfato, sulfonato, sulfinato, sulfamato, tetrazolila, fosfato, fosfonato, fosfinato ou fosforotioato, ou equivalentes funcionais dos mesmos. “Equivalentes funcionais” de grupos aniônicos têm a intenção de incluir bioisósteros, por exemplo, bioisósteros de grupos carboxilato. Bioisósteros englobam ambos os equivalentes bioisostéricos clássicos e equivalentes bioisostéricos não clássicos. Bioisósteros clássicos e não clássicos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Silverman, R. B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1992, pp. 19-23). Outro grupo aniônico é um carboxilato.

[00087] O termo “funcionalmente não estável” refere-se a um padrão de substituição que contém um ligante lábil, por exemplo, uma funcionalidade ou ligação que é susceptível a hidrólise ou clivagem sob condições fisiológicas (por exemplo, soluções aquosas na faixa de pH neutro). Exemplos de funcionalidades instáveis incluem acetais e cetais.

[00088] Adicionalmente, os compostos da presente invenção, por exemplo, os sais dos compostos podem existir na forma hidratada ou não hidratada (anidra) ou como solvatos com outras moléculas de solventes. Exemplos não limitantes de hidratos incluem monohidratos, dihidratos, etc. Exemplos não limitantes de solvatos incluem solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.

[00089] “Solvatos” significa formas de adição de solvente que contêm quantidades estequiométricas ou não estequiométricas de solvente. Alguns compostos têm a tendência de prender uma fração molar fixa de moléculas de solventes no estado sólido cristalino, formando assim um solvato. Se o solvente é água o solvato formado é um hidrato, quando o solvente é álcool, o solvato formado é um alcoolato. Hidratos são formados pela combinação de uma ou mais moléculas de água com uma das substâncias nas quais a água retém seu estado molecular como H2O, tal combinação sendo apta a formar um ou mais hidratos. Será observado que a estrutura de alguns dos compostos da invenção inclui átomos de carbonos assimétricos. Deve ser entendido, por sua vez, que os isômeros originados de tal assimetria (por exemplo, todos os enantiômeros e diastereoisômeros) estão incluídos no escopo da invenção, salvo se indicado de outra forma. Tal isômero pode ser obtido de forma substancialmente pura por técnicas clássicas de separação e por síntese estereoquimicamente controlada. Enantiômeros (configurações R- e S- ) são nomeados de acordo com 0 sistema desenvolvido por R. S. Cahn, C. Ingold, e V. Prelog.

[00090] Ainda, as estruturas e outros compostos discutidos nesta aplicação incluem todos os isômeros atrópicos do mesmo. Isômeros atrópicos são um tipo de estereoisômero no qual átomos de dois isômeros são arranjados de forma diferente no espaço. Isômeros atrópicos devem sua existência a uma rotação restrita causada por impedimento de rotação de grupos grandes ao redor de uma ligação central. Tais isômeros atrópicos tipicamente existem como uma mistura, no entanto, como um resultado de avanços recentes em técnicas cromatográficas, tem sido possível separar misturas de dois isômeros atrópicos em casos seletos.

[00091] “Compostos estáveis” e “estrutura estável” têm a intenção de indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento a um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reação em um agente terapêutico eficiente.

[00092] Como usado aqui, o termo “análogo” refere-se a um composto químico que é estruturalmente semelhante a outro, mas difere-se ligeiramente na composição (como em substituição de um átomo por um átomo de um elemento diferente ou na presença de um grupo funcional particular, ou a substituição de um grupo funcional por outro grupo funcional). Assim, um análogo é um composto que é semelhante a ou comparável em função e aparência ao composto de referência. Como definido aqui, o termo “derivado”, por exemplo, no termo “derivados de ácido biliar”, refere-se a compostos que têm em comum uma estrutura central de anel de 4 membros, e são substituídos com vários grupos como descrito aqui.

[00093] Os compostos químicos descritos aqui podem ter centros assimétricos. Compostos da presente invenção contendo um átomo assimetricamente substituído podem ser isolados em formas opticamente ativas ou racêmicas. É bem conhecido na técnica como preparar formas opticamente ativas, como pela resolução de formas racêmicas ou por síntese a partir de materiais de partida opticamente ativos. Muitos isômeros geométricos de olefinas, ligações duplas C=N, e semelhantes podem ainda estar presentes nos compostos descritos aqui, e todos estes isômeros estáveis são contemplados na presente invenção. Isômeros geométricos cis e trans dos compostos da presente invenção estão descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isoméricas separadas. Todas as formas quirais, diastereoméricas, racêmicas e geométricas de uma estrutura são intencionadas, salvo se a forma estereoquímica ou isomérica for especificamente indicada. Todos os processos usados para preparar compostos da presente invenção e intermediários feitos, neste sentido, são, onde apropriado, considerados como parte da presente invenção. Todos os tautômeros dos compostos apresentados ou descritos, onde apropriado, são também considerados como parte da presente invenção.

[00094] O termo “bioisóstero” refere-se a um composto resultante da troca de um átomo ou de um grupo de átomos com outro, semelhante de forma ampla, átomo ou grupo de átomos. A substituição bioisostérica pode ser baseada de forma físico-química ou topológica. Exemplos de bioisósteros de ácido carboxílico incluem sulfonimidas, tetrazóis, sulfonatos e fosfonatos. Vide, por exemplo, Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176 (1996).

[00095] A frase “farmaceuticamente aceitável” é reconhecida na técnica. Em certos aspectos, o termo inclui composições, polímeros e outros materiais e/ou formas de dose que, dentro do escopo do julgamento clínico, soam apropriados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessivos ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável.

[00096] A frase “carreador farmaceuticamente aceitável” é reconhecido na técnica, e inclui, por exemplo, materiais, composições ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, como um líquido ou um preenchedor sólido, diluente, excipiente ou material encapsulante, envolvidos no carreamento ou transporte de qualquer composição de um órgão, ou parte do corpo, a outro órgão, ou parte do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com outros ingredientes de uma composição objeto e não prejudicial ao paciente. Em certas modalidades, um carreador farmaceuticamente aceitável é não-pirogênico. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, como carboximeticelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacante em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras de supositórios; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, como propilenoglicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirógeno; (17) salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool de etila; (20) soluções de tampão fosfato; e (21) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[00097] “Terapia de combinação” (ou “co-terapia”) inclui a administração de um composto da invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime específico de tratamento que tem a intenção de forneecer um efeito benéfico a partir da coação destes agentes terapêuticos (ou seja, compostos da invenção e pelo menos um segundo agente). O efeito benéfico da combinação inclui, entre outros, coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação tipicamente é conduzida por um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias, ou semanas dependendo da combinação selecionada). “Terapia de combinação” pode ter, mas geralmente não tem, a intenção de englobar a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de um regime separado de monoterapia que incidentalmente e arbitrariamente resulta em combinações da presente invenção. “Terapia de combinação” tem a intenção de englobar a administração destes agentes terapêuticos de maneira seqüencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado em um tempo diferente, bem como a administração destes agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de maneira substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser alcançada, por exemplo, ao administrar ao sujeito uma única cápsula contendo uma fração fixa de cada agente terapêutico ou em cápsulas múltiplas ou únicas para cada um dos agentes terapêuticos. A administração substancialmente seqüencial ou simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por uma via apropriada incluindo, entre outros, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares e absorção direta através de tecidos de membrana mucosos. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionado pode ser administrado por injeção intravenosa enquanto outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados por via oral. De forma alternativa, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por via oral ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção intravenosa. A seqüência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é limitadamente crítica.

[00098] “Terapia de combinação” engloba ainda a administração de agentes terapêuticos como descrito acima em outra combinação com outros ingredientes biologicamente ativos e terapias não medicamentosas (por exemplo, cirurgia ou tratamentos mecânicos). Onde a combinação de terapia compreende ainda um tratamento não medicamentoso, o tratamento não medicamentoso pode ser conduzido em qualquer tempo apropriado de modo que o efeito benéfico da coação da combinação dos agentes terapêuticos e do tratamento não medicamentoso seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento não medicamentoso é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou até mesmo semanas.

[00099] Os termos "administração parenteral"e "administrado por via parenteral"como usado aqui se referem aos modos de administração além da administração enteral e tópica, geralmente por injeção e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal e infusão.

[000100] Uma “quantidade terapeuticamente efetiva” de um composto da invenção, ou uma combinação de compostos é uma quantia (quantidade ou concentração) de composto ou compostos. Em uma modalidade, quando uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto é administrada a um sujeito que necessite de tratamento, os sintomas oriundos da doença são imediatamente amenizados ou após a administração do composto uma ou mais vezes. A quantidade de composto a ser administrada a um sujeito dependerá do distúrbio em particular, o modo de administração, compostos co-administrados, se algum, e as características do sujeito, como saúde geral, outras doenças, idade, gênero, genótipo, peso corporal e tolerância a drogas. O especialista na técnica estará apto a determinar a dose apropriada dependendo destes e de outros fatores.

[000101] O termo “quantidade profilaticamente efetiva” significa uma quantia (quantidade ou concentração) de um composto da presente invenção, ou uma combinação de compostos, que é administrada para prevenir ou reduzir o risco de uma doença - em outras palavras, uma quantidade necessária para fornecer um efeito preventivo ou profilático. A quantidade de composto presente a ser administrada a um sujeito dependerá do distúrbio em particular, o modo de administração, compostos co-administrados, se algum, e as características do sujeito, como saúde geral, outras doenças, idade, gênero, genótipo, peso corporal e tolerância a drogas.

[000102] O termo “reduzir o risco de”, como usado aqui, significa diminuir a possibilidade ou probabilidade de uma doença ocorrer em um paciente, especialmente quando o paciente ou sujeito está predisposto a tal ocorrência.

[000103] Um “sal” de um composto da invenção é um produto do composto que contém uma ligação iônica e é tipicamente produzido pela reação do composto com um ácido ou uma base. Um “sal farmaceuticamente aceitável” é um sal apropriado para administração a um sujeito. Como usado aqui, um “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um derivado de um composto revelado onde o composto parente é modificado para sais ácidos ou básicos do mesmo. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de ácidos minerais e orgânicos de resíduos básicos como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos como ácidos carboxílicos; e semelhantes. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais não tóxicos convencionais ou sais de amónio quaternário do composto parente formado, por exemplo, a partir de ácidos não tóxicos inorgânicos ou orgânicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem entre outros, aqueles derivados de ácidos inorgânicos e orgânicos selecionados de 2-acetoxibenzóico, 2- hidroxietano sulfônico, acético, ascórbico, benzenosulfônico, benzóico, bicarbônico, carbônico, cítrico, edético, etanodisulfônico, etanosulfônico, fumárico, glucoheptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabâmico, bromidrato, cloridrato, iodato, hidroximaléico, hidroxinaftóico, isetiônico, láctico, lactobiônico, lauril sulfônico, maléico, málico, mandélico, metanosulfônico, napsílico, nítrico, oxálico, pamóico, pantotênico, fenilacético, fosfórico, poligalacturônico, propiônico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfâmico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, e toluenosulfônico. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto parente que contém uma fração básica ou ácida por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados por reação de um ácido livre ou formas básicas destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico ou em uma mistura de dois; geralmente, meios não aquosos tipo éter, acetato de etila, etanol, isopropanol ou acetonitrila são preferenciais. Listas de sais apropriados são encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, p. 1445 (1990).

[000104] Uma “composição farmacêutica” é uma formulação contendo um composto da invenção em uma forma apropriada pra administração a um sujeito. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é um granel ou forma de dose unitária. A forma de dose unitária é qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, uma cápsula, uma bolsa IV, um comprimido, uma bomba simples em um inalador em aerossol, ou um frasco. A quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, uma formulação de um composto da invenção ou sais do mesmo) em uma dose unitária de composição farmacêutica é uma quantidade eficiente e varia de acordo com o tratamento particular envolvido. Um especialista na técnica apreciará que às vezes é necessário realizar variações de rotina na dose dependendo da idade e condição do paciente. A dose também dependerá da via de administração. Uma variedade de vias é contemplada, incluindo oral, pulmonar, retal, parenteral, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal e semelhantes. Formas de dose para a administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, adesivos e inalantes. Em outra modalidade, o composto ativo é misturado sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável e com qualquer preservativo, tampão ou propulsor que seja necessário.

[000105] O termo “dose rápida” refere-se a formulações de compostos que são formas de dose que se dispersam rapidamente.

[000106] O termo “liberação imediata” é definido como uma liberação de um composto a partir de uma forma de dose em um curto período de tempo, geralmente de até cerca de 60 minutos. O termo “liberação modificada” é definido para incluir liberação retardada, liberação estendida, e liberação pulsada. O termo “liberação pulsada” é definido como uma série de liberações da droga em uma forma de dose. O termo “liberação sustentada” ou “liberação estendida” é liberação contínua de um composto a partir de uma forma de dose por um período prolongado.

[000107] Um “sujeito” inclui mamíferos, por exemplo, humanos, animais de estimação (por exemplo, cães, gatos, pássaros e semelhantes), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelha, porcos, cavalos, galinhas, e semelhantes) e animais de laboratórios (por exemplo, ratos, camundongos, cobaias, pássaros e semelhantes). Tipicamente, o sujeito é humano.

[000108] Compostos da invenção podem incluir ainda pró-drogas ou derivados fisiologicamente equivalentes. Uma “pró-droga” ou “derivado fisiologicamente equivalente” inclui um precursor da droga que é metabolicamente convertido in vivo para produzir a droga ativa. A invenção contempla ainda o uso de pró-drogas que são convertidas in vivo em compostos moduladores de TGR5 usados nos métodos da invenção (vide, por exemplo, R. B. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, Chp. 8). Tais pró-drogas podem ser usadas para alterar a biodistribuição (por exemplo, para permitir compostos que tipicamente não cruzariam a barreira hematoencefálica cruzem a barreira hematoencefálica) ou a farmacocinética do composto modulador de TGR5. Por exemplo, um grupo aniônico, por exemplo, um carboxilato, sulfato ou sulfonato, pode ser esterificado, por exemplo, com um grupo alquila (por exemplo, um grupo metila) ou um grupo fenila, para gera um éster. Quando o éster é administrado a um sujeito, o éster é clivado, enzimaticamente ou não enzimaticamente, de forma redutiva ou hirolítica, para revelar o grupo aniônico. Tal éster pode ser cíclico, por exemplo, sulfato cíclico ou sulfona, ou duas ou mais frações aniônicas podem ser esterificadas através de um grupo ligante. Um grupo aniônico pode ser esterificado com frações (por exemplo, ésteres aciloximetil) que são clivados para revelar um composto intermediário que modula TGR5 que por sua vez se decompõe para gerar o composto ativo que modula TGR5. Em uma modalidade, a pró-droga é uma forma reduzida de um carboxilado, sulfato ou sulfonato, por exemplo, um álcool ou tiol, que é oxidado in vivo para o composto que modula TGR5. Além disso, uma fração aniônica pode ser esterificada para um grupo que é ativamente transportado in vivo, ou que é seletivamente absorvido por órgãos alvos.

[000109] O termo “modulador de TGR5” significa qualquer composto que interage com o receptor TGR5. A interação não é limitada a um composto que atua como um antagonista, agonista, agonista parcial ou agonista inverso do receptor TGR5. Em um aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um antagonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um agonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um agonista parcial do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção atuam como um agonista inverso do receptor TGR5. O perfil de um ligante, tradicionalmente, endógeno ou sintético, é caracterizado por sua eficácia intrínseca ‘e’ originalmente descrita por Furchgott em 1966. É usado para expressar o grau ao qual os diferentes ligantes produzem respostas biológicas variáveis enquanto ocupam o mesmo número de receptores. Geralmente, o termo “agonista” significa um composto que aumenta a atividade de outra molécula ou sítio receptor. Um agonista, por definição clássica, seja um ortoestérico, alostérico, inverso ou um co-agonista tem uma propriedade de se ligar a um receptor, alterar seu estado de receptor e resultar em uma ação biológica. Conseqüentemente, agonismo é definido como uma propriedade de um agonista ou um ligante de produzir uma ação biológica. Por outro lado, um “antagonista” é essencialmente um agonista com alta afinidade para o mesmo receptor macromolecular, mas com eficácia intrínseca muito pequena ou desprezível e evita estericamente as ações biológicas de um agonista. Como uma propriedade, antagonismo pode ser funcional ou fisiológica, onde um agonista tem uma competição direta para o sítio receptor em efeitos padrões e opostos através de um sistema diferente de receptor-mensageiro no último. Mais especificamente, um agonista TGR5 é um ligante receptor ou composto que se liga a TGR5 e aumenta a concentração de monofosfato de adenosisna cíclica (cAMP) em pelo menos 20% em células que expressam o receptor. Por outro lado, um antagonista de TGR5 podería ser um composto que antgonize ou bloqueie a atividade de um agonista, assim, reduzidndo a concentração de cAMP.

[000110] A presente invenção refere-se a compostos contendo atividade de modulação do receptor TGR5 e seus usos para tratar ou prevenir doenças metabólicas como doença metabólica, inflamatória, hepática, autoimune, cardíaca, renal, câncer e gastrointestinal.

[000111] Alguns compostos representativos da invenção são mostrados abaixo.

[000112] Todas as publicações e documentos de patentes citados aqui estão incorporados para referência como se cada publicação ou documento indicasse especifica e individualmente a serem incorporados aqui por referência. A citação de publicações e documentos de patentes não tem a intenção como uma admissão de que qualquer coisa é pertinente na técnica anterior, nem constitui qualquer admissão aos conteúdos ou datas do mesmo. A invenção sendo agora descrita por meio de descrição escrita, aqueles especialistas na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição anterior e exemplo abaixo são par propósitos unicamente de ilustração e não limitam as reivindicações que seguem.

EXEMPLO 1: Síntese de Moduladores de TGR5

[000113] Os compostos da invenção, e derivados relacionados, podem ser sintetizados por métodos conhecidos por especialistas na técnica. Exemplo 1A: Síntese de sal sódico de 3a,7a,12a-trihidroxi-6a-etil-5p- colan-24-sulfonato (3A)

[000114] Reagentes e condições: a) Et3N, 4-Pirrolidina-Piridina, Ac2O, CH2CI2, 0°C, (2:2a = 70:30); b) Et3N, CICOOEt, THF, NaBH4, 41% de 1 (3:3a = 70:30); c) Ph3P, Br2, Imidazol, CH2CI2, 45% (4:4a = 70:30); d) Na2SO3, EtOH; e) NaOH 5% em H2O, 93%. Rendimento geral: 17%.

[000115] Ácido 3a,7a,12a-triacetoxi-6a-etil-5p-colan-24-óico (2):

[000116] A uma suspensão resfriada (0 °C) e em agitação de 1 (250 mg, 0,572 mmol) em CH2CI2 destilado (5 ml) na presença de 4- Pirrolidina Piridina (9 mg, 0,057 mmol), Et3N destilado (0,78 ml, 5,430 mmol) foi adicionado. Em seguida anidrido acético (0,49 ml, 5,140 mmol) foi adicionado sob gotejamento sob atmosfera de nitrogênio. Após 20’ a solução foi aquecida até temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi acidificado com HCI 3N e extraído com AcOEt (3x15ml). A camada orgânica foi lavada com salmoura (15 ml), seca sob Na2SO4 anidro, e concentrada sob pressão reduzida, para gerar 290 mg de mistura de 2 (70%) e ácido 3a,7a-triacetoxi-7a-hidroxi-6a- etil-5p-colan-24-óico (2a, 30%) como resultado de análise de 1H-NMR. A mistura foi usada para a etapa seguinte sem outra purificação. 1H- NMR (200MHz, CDCh) õ: 0,69 (3H, s, 18-CH3de 2), 0,75 (3H, s, 18- CH3 de 2a), 0,80- 0,88 (m, 9H, m, 19-CH3 + 21-CH3 + CH2CH3 de 2 e 2a), 2,05 (9H, m, 3 x CH3COO- de 2 e de 2a), 3,67 (1H, m, 7-CH-OH de 2a), 4,48 (1H, m, 3-CHOAc de 2 e de 2a), 5,01 (1H, m, 12- CHOAc de 2 e de 2a), 5,12 (1H, m, 7-CHOAc de 2).

[000117] 3a,7a, 12a-triacetoxi-6a-etil-24-hidroxi-5p-colano (3):

[000118] À uma solução de 2 (290 mg, cru da etapa anterior) em THF destilado (35 ml) sob atmosfera de N2, Et3N destilado (0,75 ml, 5,148 mmol) e em seguida etilcloroformiato (0,44 ml, 4,576 mmol) foram adicionados (NOTA: formação de um precipitado branco). Monitorando reação por TLC (éter de petróleo/AcOEt 6:4) a mistura foi agitada por 2 h até que o material de partida foi completamente reagido. NaBH4 (326 mg, 8,580 mmol) foi adicionado sob gotejamento à mistura dissolvido em H2O (3 ml), e a mistura de reação foi agitada durante a noite. H2O (30 ml) e HCI 3N (10 ml) foram adicionados, e a mistura foi extraída com AcOEt (3x20 ml). A camada orgânica foi lavada com salmoura (15 ml), seca sob Na2SO4 anidro, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia rápida em Biotagem TM (coluna: 12+M, de 5% a 55% de AcOEt em éter de petróleo) para gerar 130 mg (-41% de 1) da mistura de 3 (70%) e 3a, 1 2a-triacetoxi-7a,24-dihidroxi-6a-etil-5p-colano (3a, 30%) como resultado de análise de 1H-NMR. A mistura foi usada para a etapa seguinte sem outra purificação.

[000119] 1H-NMR (200MHz, CDCh) õ: 0,66 (3H, m, 18-CH3 de 3 e de 3a), 0,75-0,85 (m, 9H, m, 19- CH3 + 21-CH3 + CH2CH3 de 3 e de 3a), 3,55 (2H, m, 24-CH2OH de 3 e de 3a), 3,67 (m, 1H, , 7-CH-OH de 3a), 4,52 (m, 3-CHOAc de 3 e de 3a), 4,99-5,06 (2H, m, 12- CHOAc de 3 e 3a e 7-CHOAc de 3).

[000120] 3a,7a, 12a-trihidroxi-6a-etil-5p-colan-24-solfonato (3A):

[000121] À uma solução de trifenilfosfino (270 mg, cru da etapa anterior) em CH2CI2 destilado (4 ml) sob atmosfera de N2, bromo (0,02 ml, 0,426 mmol) e imidazol (0,02 ml, 0,426 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada por 10', 3 (130 mg, 0,237 mmol) diluído em CH2CI2 destilado (4 ml) foi então adicionado sob gotejamento, e a mistura foi agitada até que 0 material de partida estivesse totalmente reagido. CH2CI2 (20 ml) foi então adicionado, e a mistura de reação foi lavada com H2O (3x20 ml), salmoura (15 ml), seca em Na2SO4 anidro, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia rápida em Biotagem TM (coluna: 12+M, de 5% a 55% de AcOEt em éter de petróleo) para gerar 65 mg (-45%) como mistura de 4 (70%) e 3a,12a-triacetoxi-7a,24-dihidroxi-6a-eti-5p-colano (4a 30%).

[000122] Esta mistura foi então solubilizada em EtOH (10 ml), Na2SO3 5% em H2O (9 ml) foi adicionado sob gotejamento, e a reação foi agitada a 90° por 12 h. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida, e 0 resíduo resultante foi acidificado com H2O (15 ml) acidificada com HCI 3N e extraída com CH2CI2 (3x15ml). A camada orgânica foi lavada com salmoura (15 ml), seca sob Na2SO4 anidro, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi em seguida tratado com NaOH 5% em H2O (15 ml) e refluxado por 24 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e 0 resíduo foi diluído com H2O (15 ml), lavado com CH2CI2 (2x15 ml), acidificado com HCI 3N e extraído com AcOEt/MeOH 8:2 (3x25 ml). A camada orgânica foi seca sob Na2SO4anidro, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de pressão média (coluna: "RP-18 Lobar B", MeOHZHLO 6:4, 50 psi) para gerar sal sódico de 3a,7a,12a-trihidroxi-6a-etil-5p-colan-24-sulfonato, 3A (47 mg, 93%).

[000123] Mp: >280°C.

[000124] 1H-NMR (400MHz, CD3OD) õ: 0,72 (3H, s, I8-CH3), 0,90 (6H, m, 19-CH3 e CH3CH2), 1,04 (3H, d, J= 6,51 Hz, 21-CH3), 1,89 (1H, m, 23-CH), 2,70 (2H, m, 24- CH2SO3), 3,30 (1H, m, 3-CH), 3,68 (1H, m, 7-CH), 3,98 (1H, m, 12-CH).

[000125] 13C-NMR (100,3MHz, CD3OD) õ: 10,41, 11,41, 16,27, 21,20, 21,84 (2),22,54,26,57,27,14, 28,03, 29,38, 32,71, 34,59, 34,63, 35,05, 35,40, 40,06, 41,40, 41,48, 45,25, 45,85, 46,63, 51,50, 69,58, 71,50, 72,40. Exemplo 1B: Síntese de sal sódico de 3a,7a,23-trihiroxi6a-etill-23(5)- metil-24-nor-5p-colan-23-sulfato (2A)

[000126] Reagente e condições: a) MeOH, ZTSA, us, 30°C, 2h, 97%. b) PhMgBr, THF, refluxo, 12h. c) EtOH, HCI, refluxo, 12h, 84% de 2. d) AC2O, piridina, DMAP, THF, 25°C, 12h, 79%. e) 03, Me2S, CH2CI2, MeOH, -78°C, 20 min, 70%. f) NaBH4, MeOH, THF, 25°C, 12h, 48% (S). g) PyS03, piridina. h) 5% NaOH em MeOH, 43%. Rendimento geral: 9%.

[000127] Metil 3a,7a-dihidroxi-23-metil-6a-etil-5p-colan-24-oato (2)

[000128] À uma solução de 1 (2,0 g, 4,6 mmol) em metanol (150 ml)/p-TSA (0,2 g, 1,05 mmol) foi adicionado e a mistura foi tratada sob ultrassom por 90'. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em CHCh (200 ml) lavado com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2x100 ml), água (100 ml) e salmoura (100 ml). A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro e evaporada até secagem para obter éster de metila de 2 (2,0 g, 97%) como sólido branco.

[000129] 3a,7a-diihidroxi-23-metil-6a-etil-5b- bisnorcolanildifeniletileno (4)

[000130] À uma solução de éster de metila de 2 (1,35g, 3,01 mmol) em THF recentemente destilado (15 ml) foi adicionado fenilmagnesiobrometo (24,1 ml, 1M em THF) e a mistura resultante foi refluxada durante a noite. A solução foi deixada em temperatura ambiente, uma solução de ácido clorídrico 3N (30 ml) foi adicionamento sob gotejamento e a mistura foi agitada para 30 min. A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3x50ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1x100 ml), secas em sulfato de sódio anidro e evaporadas até secagem sob pressão reduzida, para gerar o intermediário 3, que foi usado na seguinte etapa sem outra purificação. O produto cru marrom foi dissolvido em uma mistura de etanol(35 ml) e 12N HCI (1 ml) e a mistura foi refluxada durante a noite. O solvente foi então evaporado a vácuo, o resíduo foi dissolvido em CH2CI2 (100 ml), lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (2x60ml), água (60ml), salmoura (60ml), seco em sulfato de sódio anidro e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia rápida eluindo com CHCh/MeOH 98:2 para obter 0 derivado 4 desejado como sólido branco (1,40 g, 84% de 2).

[000131] 1H-NMR (CDCh) õ:0,7 (3H, s, 18-CH3), 0,85 (3H, d, J= 6,5 Hz, 2I-CH3), 0,88-0,92 (6H, m, 19-CH3+ CH2CH3), 0,97-1,22 (6H, m), 1,23-1,52 (9H, m), 1,57-1,70 (5H, m), 1,78- 1,85 (4H, m), 1,92-1,95 (IH, m), 3,40-3,42 (IH, m, 3-CH), 3,69 (IH, bs, 7-CH), 7,25-7,29 (4H, m, ArH), 7,127,23 (6H, m, ArH).

[000132] 13C-NMR (CDCh) õ: 11.6, 11.7, 17.8, 20.0, 20.6, 22.2, 23.1, 23.6, 28.4, 30.5, 33.12, 33.8, 34.8, 35.4 (2x), 39.4, 39.9, 41.1, 41.6, 42.8, 45.1, 50.4, 56.8, 70.8, 72.3, 125.8, 127.8(4x), 128.6 (4x), 129.8 (2x), 138.8, 143.4.

[000133] 3a-acetoxi-7a-hidroxi-23-metil-6a-etil-5b- bisnorcolanildifeniletileno(5).

[000134] À uma solução de 4 (1,85g, 3,33 mmol) em THF recentemente destilado (15 ml) anidrido acético (0,35 ml, 3,66 mmol), piridina (0,05 ml, 0,66 mmol), 4-di(metilamino)-piridina (28 mg, 0,23 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi diluída com água (70 ml) e extraída com EtOAc (3x50 ml).

[000135] As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2x50 ml), salmoura (50 ml), secas em sulfato de sódio anidro e evaporadas até secagem sob pressão reduzida, para gerar 0 composto 5 acetilado desejado (1,57, 79%) como sólido branco que foi usado na seguinte etapa sem outra purificação.

[000136] 1H-NMR (CDCh) õ:0,65 (3H, s, I8-CH3), 0,85 (3H, d, J= 6,5 Hz, 2I-CH3), 0,87-0,92 (6H, m, 19-CH3+ CH2CH3), 0,95-1,26 (8H, m), 1,30-1,50 (6H, m), 1,52-1,70 (5H, m), 1,75 (3H, s, 24- CH3), 1,79-1,97 (5H, m), 2,01 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,14-2,17 (1H, m), 3,69 (1H, bs, 7- CH), 4,52-4,57 (1H, m, 3-CH), 7,11-7,22 (6H, m, ArH), 7,25-7,29 (4H, m, ArH).

[000137] 13C-NMR (CDCh) O: 11,6, 11,8, 17,9, 20,1,20,7, 21,4, 22,2, 23,1, 23,7, 26,6, 28,4, 29,6, 33,1, 34,9, 35,2, 35,5, 39,5, 40,0, 41,2, 41,6, 42,9, 45,1, 50,4, 56,9, 70,7, 74,7, 125,8, 127,8 (4x), 129,5 (4x), 129,8 (2x), 134,0, 138,9, 143,5

[000138] 3a-acetoxi-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colan-23-ona(6)

[000139] Uma solução de 5 (1,35 g, 2,26 mmol) em uma mistura de MeOH seco (15 ml) e CH2CI2 seco (20 ml) mantida a -78 °C foi ozonizada até que a cor azul intensa estivesse persistente por 30 minutos. A ozonização foi então interrompida e a solução azul escura foi limpa com nitrogênio para liberar 0 ozônio dissolvido. Quando a reação não está mais azul, Me2S (0,55 ml, 7,55 mmol) foi adicionado e a solução foi deixada para retornar a temperatura ambiente. O solvente foi então removido sob pressão reduzida e 0 resíduo foi purificado por cromatografia rápida eluindo com EtOAc de 2% a 15% em éter de petróleo, para obter a cetona 6 desejada como um sólido branco (0,7g, 70%).

[000140] 1H-NMR (CDCh) õ: 0,7 (3H, s, I8-CH3), 0,85-0,9 (9H, m, 19-CH3+ 2I-CH3+CH2CH3), 1,04-1,23 (7H, m), 1,29-1,46 (8H, m), 1,58-1,72 (4H, m), 1,78-1,97 (5H, m), 2,00 (3H, s, 3- CHOC(O)CH3), 2,11 (1H, s, 24-CH3), 2,43-2,53 (1H, m), 3,70 (1H, bs, 7-CH), 4,48-4,59 (1H, m, 3-CH).

[000141] 13C-NMR (CDCh) õ: 11,6, 11,8, 19,7, 20,7, 21,5, 22,1, 23,1, 23,7, 26,6, 28,4, 29,6, 30,6, 32,6, 33,1, 35,1,35,5, 39,5, 39,9, 41,1, 42,8, 45,0, 50,5, 50,9, 56,0, 70,7, 74,7, 170,7, 209,3,

[000142] 3a-acetoxi-7a,23(,S)-dihidroxi-6a-etil-5p-colano(7).

[000143] À uma solução de cetona 6 (0,5 g, 1,12 mmol) em THF a 0°C NaBH4 (0,27 g, 7,17 mmol) foi adicionado em uma parte e em seguida MeOH (0,27 ml, 6,76mmol) foi adicionado sob gotejamento. Ao final da adição, a reação foi aquecida até temperatura ambiente e agitada durante a noite. O solvente foi então evaporado até secagem, 0 resíduo foi dissolvido em CH2CI2 e HCI 3N e agitado por 1h. As duas fases foram separadas, e a camada orgânica foi lavada com água, salmoura, seca sob sulfato de sódio anidro e evaporada até secagem sob pressão reduzida. O resíduo oleoso, que consistiu de dois componentes como evidenciado por TLC, foi purificado por cromatografia rápida (éter de petróleo/EtOAc 7:3) para obter primeiramente 3a-acetoxi-7a,23(S)- dihidroxi-6a-etil-5f3-colano 7 (0,225 g, 48%), então o 3a-acetoxi-7a,23(R)-dihidroxi-6a-etil-5f3- colano (0,105 g, 23%) mais polar em uma razão 2:1.

[000144] 1H-NMR (CDCh) õ:0,7 (3H, s, 18-CH3), 0,88-0,91 (6H, m, W-CH3+ CH2CH3), 0,97 (3H, d, J= 6,4 Hz, 21-CH3), 1,04-1,08 (4H, m,), 1,19 (3H, d, J= 6,1, 24-CH3), 1,26-1,56 (12H, m), 1,53-1,71 (5H, m), 1,76-1,96 (4H, m), 2,0 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 3,72 (1H, bs, 7- CH), 3,79-3,95 (1H, m, 23-CH), 4,51-4,59 (1H, m, 3-CH).

[000145] 13C-NMR (CDCh) õ: 11,6, 11,8, 18,5, 20,7, 21,5, 22,1, 23,1, 23,7, 24,8, 26,6, 28,4, 29,6, 32,6, 33,1, 35,1, 35,5, 39,6, 39,9, 41,1, 42,8, 45,0, 45,8, 50,5, 56,7, 65,1, 70,7, 74,7, 170,7.

[000146] Sal sódico de 6a-etil-23(S)metil-3a,7a,23-trihidroxi-24-nor- 5p-colano-23 sulfato (2A).

[000147] À uma suspensão de complexo de sulfurtrioxido de piridina (0,1 g, 0,49 mmol) em piridina seca (5 ml), 0 álcool 7 (0,2g, 0,49 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente sob atmosfera de nitrogênio por 48h após a qual 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em NaOH 5% em MeOH (2ml) e agitado em temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, 0 sólido resultante estava em uma mistura de H2O/CH3OH (1:1) e purificado por cromatografia de fase reversa (coluna RP-18 lobar B) usando uma mistura de CH3OHZH2O (de 5:5 a 8:2) como fase móvel, para obter 0 sulfato desejado, sal sódico de 3a,7a,23-trihidroxi-6a-etil-23(S)-metil- 24-nor-5p-colan-23-sulfato, 2A (0,11 g, 43%).

[000148] 1H-NMR (CD3OD) õ: 0,7 (3H, s,18-CH3), 0,89-0,94 (6H, m, CH3- 19, CH2CH3), 1,01 (3H, d, J= 6,4 Hz, 21-CH3), 1,09-1,29 (4H, m,), 1,32 (3H, d, J= 6,1, 24-CH3), 1,36-1,41 (5H, m), 1,47- 1,61 (6H, m), 1,71-1,89 (9H, m), 2,02-2,05 (1H, m), 3,28-3,35 (1H, m, 3-CH), 3,66 (1H, bs, 7- CH), 4,54-4,58 (1H, m, 23-CH),

[000149] 13C-NMR(CD3OD) Õ: 12,0, 12,3, 19,4, 21,9, 22,4, 23,5, 23,7, 24,6, 29,4, 31,3, 33,5, 34,4, 34,5, 36,6, 36,7, 41,1, 41,5, 43,1, 43,8, 45,5, 46,9, 51,7, 58,1, 71,2, 73,2, 74,8.

EXEMPLO 2: Atividade de TGR5 e FXR in vitro.

[000150] A potência e eficácia dos compostos da invenção no receptor TGR5 foram avaliadas usando ensaios em vitro. A Tabela 1 mostra que os compostos da invenção são pottentes e seletivos para moduladores TGR5. Em alguns aspectos da invenção, os compostos são ambos agonistas de FXR e TGR5. Tabela 1: Potência e Eficácia de Compostos da Invenção em Receptores de FXR e TGR5

[000151] Para uma descrição de um ensaio de ligação de receptor TGR5 in vitro, Vide, por exemplo, Kawamata, J.

[000152] Biol. Chem 2003, Vol. 278 No. 11, p. 9435-9440). A atividade em FXR foi avaliada por transferência de energia de ressonância de florescência (FRET) para recrutamento do peptídeo SRC-1 para FXR humano usando um ELISA isento de célula. Vide, Blanchard et al. WO 00/37077. A atividade de luciferase foi determinada em células de CHO expressando hTGR5 com estabilidade co-transfectado com um vetor de expressão de hTGR5 e gene luciferase repórter dirigido para o elemento responsive a cAMP (CRE). Alguns dos compostos foram ainda submetidos a um ensaio do repórter de luciferase para pontuar para suas capacidades de ativar o receptor FXR de ácido biliar nuclear.

[000153] Os seguintes materiais foram usados, por exemplo, para determinar os dados na Tabela 1 .Plasmídeos

[000154] A Coleção de Gene de Mamíferos de NIH clone MGC:40597 (também chamado pCMVSPORT6/hTGR5 ou pTGR5) e pcDNA3.1(+) foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA). pCRE-Luc e pCMVp foram obtidos de Clontech (Paio Alto, CA). pCMX-hFXR e pCMX-mRXRa foram doados de Dr. David J. Mangelsdorf (Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center). pEcREx7-Luc foi doado do Dr. Richard A. Heyman (X-ceptor Therapeutics, CA).

Cultura de células

[000155] Células de hamster chinês (CHO), células NCI-H716, células Hep3B e células COS1 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Meio de cultura de células, soro e suplementos foram obtidos de Invitrogen ou Sigma-Aldrich. Todas as células CHO foram mantidas em meio mínimo essencial a (a-MEM) complementados com soro bovino fetal (FBS) 10% (v/v) e 100 pM de aminoácidos não essenciais (NEAA). Células NCI-H716 foram mantidas em suspensão em RPMI-1640 complementado com FBS 10% (v/v), HEPES 10 mM e piruvato de sódio 1mM. Células Hep3B foram mantidas em meio Eagles complementado com FBS 10% (v/v) e NEAA 100 pM. As células COS1 foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado com FBS 10% (v/v). Todos os meios de cultura foram complementados com penicilina 100 unidades/ml e 100 pg;mL de sulfato de estreptomicina. As células cresceram a 37°C em uma atmosfera de CO2 5%, passadas a cada 2- 6 dias e plaqueadas recentemente para cada experimento.

Transfecções transientes

[000156] As células CHO foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3,5 x IO4 células/poço, cultivadas por 24h, e em seguida transfectadas com 150ng de plasmídeo de expressão de TGR5 humano (h) (pCMVSPORT6/hTGR5) e 100 ng de plasmídeo de repórter de luciferase dirigido para elemento responsive a cAMP (CRE) (pCRE-Luc) em cada poço usando um reagente Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 6h de incubação, as células foram lavadas uma vez com salina tamponada de fosfato (PBS) e o meio foi trocado para DMEM contendo 0,1% (p/v) de albumina bovina sérica (BSA). Após incubação por outras 18h, as células tratadas por 5h com concentrações diferentes de cada composto em DMEM fresco contendo 0,1% (p/v) de BSA. Após o tratamento, as células foram lisados com 50pl de tampão de lise (Tris- Cl 25 mM (ph 7,6), EDTA 2mM, ditiotreitol 1mM (DTT), glicerol 10% (v/v) e triton X-100 1% (v/v) por um ciclo de descongelamento de freezer e submetido aos ensaios de luciferase como descrito acima.

[000157] As células COS1 foram plaqueados em placas de 96 poços em uma densidade de 2,5 x 104 células/poço em DMEM complementado com tiras de FBS em carvão ativado 10%(v/v), cultivado por 24h, e em seguida transfectado com 25ng de plasmídeo de expressão de hFXR (pCMX-hFXR), 25ng de plasmídeo de expressão de receptor a de retinóide X (RXRa) de camundongo (m) (pCMX-mRXRa), 50ng de plasmídeo repórter (pEcREx7-Luc) e 50ng de pCMVp como controle interno em cada poço, usando o reagente Lipofectamina 2000. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS e tratada com concentrações diferentes de cada composto em DMEM fresco complementado com FBS em tiras de carvão ativado 10% (v/v) por 24h. Após o tratamento, as células foram lisadas com 50pl de tampão de lise por um ciclo de descongelamento e submetida a ambos ensaios de luciferase e p-galactosidase como descrito abaixo. Os valores de luciferase normalizados foram determinados ao dividir a atividade de luciferase pela atividade de p-galactosidase.

Ensaios de luciferase e p-galactosidase

[000158] Para ensaios de luciferase, 20pl de lisado de célula foram misturados com 100 pl de tampão de reação de luciferase [235pM luciferina, 265pM ATP e 135pM coenzima A (CoA)] e a luminescência foi determinada com CentroXS3 LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha). Para ensaios de p-galactosidase, 10 pl de lisado de células foram misturados com 100 pl de Tampão Z [Na2HPÜ4 60 mM , KCI 10 mM , MgSCU 1mM , p-mercaptoetanol 50 mM e o- nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo 0,75mg/ml (ONPG)] e incubado a 37 °C por 0,5-3h. As reações foram interrompidas pela adição de 50 p de tampão de Parada (Na2CÜ31M) e a densidade óptica a 420 nm foi determinada.

[000159] Estabelecimento de células CHO expressando com estabilidade TGR5 humano (células CHO-TGR5).

[000160] As células CHO foram transfectado com 3,8pg de plasmídeo de expressão de hTGR5 (pCMVSPORT6/hTGR5), 3,8pg de plasmídeo repórter luciferase dirigido para CRE (pCRE-Luc) e 0,4pg de plasmídeo de expressão de gene resistente a neomicina [pcDNA3.1(+)] usando Lipofectamina 2000. Os transfectantes foram selecionados com sulfato de G418 400pg/ml e clones únicos cresceram em placas de 96 poços, independentemente. Linhagens de células CHO expressando TGR5 por tratamentos de LCA, seguido por ensaios de luciferase.

Análise de produção de cAMPAs

[000161] Células NCI-H716 foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com Matrigel 0,75mg/ml (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante imediatamente antes do uso, em uma densidade de 6 x 104 células/poço em DMEM complementado com FBS 10% (v/v), penicilina 100 unidades/ml e sulfato de sódio 100 pg/ml e cultivadas por 24 horas, que permitiu a adesão celular ao fundo da placa. As células CHO-TGR5 foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma densidade de 3,5 x 104 células/poço em a-MEM complementado com FBS 10% (v/v), NEAA 100 pM, penicilinal00 unidades/ml e 100 pg de sulfato de estreptomicina e cultivadas por 24h. As células foram lavadas com PBS e o meio foi trocado para o meio de ensaio de cAMP [DMEM contendo BSA 0,1% (p/v) e 3- isobutil-1 -metilxantina 0,5 mM (IBMX)]. Após a incubação por 30 minutos a 37°C, as células foram tratadas com cada composto em meio de ensaio de cAMP fresco por 30 minutos. Após o tratamento, o meio foi descartado e quantidades de cAMP foram determinadas usando um kit de cAMP-Screen (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

[000162] Concentrações efetivas em 50% (EC50) e de eficácia.

[000163] Os ensaios foram realizados em triplicada ou quadruplicada para cada condição. Os valores de EC50 foram determinados por análise probidade. A eficácia foi determinada ao calcular percentagens do valor de LCA 10 pM para o estudo de agonista de TGR5 e o valor de 6a-Et-CDCA 10 pM para o estudo de agonista de FXR, respectivamente. Após subtrair o valor médio da condição basal (tratado com veículo), os valores foram aplicados ao EC50 e/ou determinações de eficácia. O cálculo da EC50 média e a comparação de EC50 entre compostos diferentes foram realizados após a transformação a logaritmos.

Análise estatística

[000164] Análise estatística foi realizada pelo teste-t de Student e p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[000165] Exemplo 3. Atividades metabólicas de compostos da invenção em um modelo de obesidade de camundongo induzida por dieta.

[000166] O objetivo do estudo é definir se os agonistas TGR5 (ácido oleanólico (OA) ou composto da invenção (por exemplo, um “composto teste”)) corrigem o desenvolvimento da obesidade e resistência a insulina associada in vivo. Para testar a possibilidade, o OA/ composto teste são administrados através da administração da alimentação por 16 semanas para camundongo macho C57BL6J que foram previamente submetidos por 10 semanas a dieta altamente gordurosa.

II - Protocolo

[000167] Em um estudo anterior, OA foi observado como um agonista seletivo para TGR5 que não causou aversão à comida. Os animais tratados com uma dose de 100mg/kg/dia de OA mostraram, no entanto, alguns sinais de toxicidade, enquanto que uma dose menor foi bem tolerada. Portanto, OA é administrado em uma dose de 50 mg/kg/d neste estudo.

[000168] Estudos in vitro identificaram compostos da invenção como potentes e seletivos.

[000169] Ligantes de TGR5. Nenhum problema com toxicidade é esperado com os compostos da invenção, que são administrados em ~50 vezes a concentração inferior.

[000170] Para este estudo, camundongos machos C57BL6J (5 semanas de idade) são divididos em dois grupos: um grupo de 24 (grupo 1, 2 e 3) animais recebeu dieta de ração enquanto que o outro grupo de 24 recebeu uma dieta rica em gordura por um período de 10 semanas (grupos 4, 5 e 6). Os animais foram analisados durante um período de 16 semanas. Cinco grupos de 10 animais são designados como a seguir: 1: dieta de ração. 2: dieta de ração + OA 50 mg/kg/dia 3: dieta de ração + composto teste, por exemplo, 30 mg/kg/d ia 4: dieta rica em gordura 5: dieta rica em gordura + OA 50 mg/kg/dia 6: dieta rica em gordura + composto teste, por exemplo, 30 mg/kg/dia

[000171] Durante o estudo inteiro, o peso corporal e a ingestão de alimentos são monitorados duas vezes por semana.

[000172] Semana-2: A composição corporal é analisada, para todos os grupos, por absorciômetro de raios-X de dois níveis de energia (dexascan).

[000173] Semana-1: Níveis séricos de transaminase, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 h e os camundongos são então submetidos às dietas como indicado (Dia 0).

[000174] Semana-2: Níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 h (Dia 14).

[000175] Semana 4: Tolerância a glicose é determinada ao submeter todos os animais a um teste de tolerância de glicose intraperitoneal (IPGTT). Os animais ficam em jejum por 12 h antes deste teste. O gasto de energia noturno dos grupos 1, 4, 5 e 6 (dieta de ração, dieta rica em gordura e dieta rica em gordura OA/composto teste) é medido por calorimetria indireta.

[000176] Semana 8: Composição de peso corporal é novamente analisada por dexascan para todos os grupos. Níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina são medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 h (Dia 56).

[000177] Semana 9: Atividade circadiana dos grupos 4, 5 e 6 (camundongos alimentados com dieta rica em gordura) é estudada durante um período de 30 h.

[000178] Semana 10: Medida de pressão arterial e ritmo cardíaco são realizados nos gruupso 4, 5 e 6.

[000179] Semana 11: Temperatura retal de todos os animais é medida em temperatura ambiente as 10:00 am.

[000180] A medição da atividade circadiana é realizada nos grupos 1,2, 3 e 4.

[000181] Semana 12: A tolerância a glicose é analisada pela realização de teste de tolerância a glicose intraperitoneal (IPGTT) nos grupos 4, 5 e 6. Durante o IPGTT, o sangue também é coletado para analisar os níveis de insulina. Os animais ficam em jejum por 12 h antes deste teste. As fezes são coletadas em todos os grupos por um período de 24 h e o conteúdo de lipídeos é determinado.

[000182] Semana 16: Teste de frio é realizado em todos os animaais ao medir a temperatura corporal dos animais expostos a 4°C.

[000183] Três dias após, os animais são sacrificados. No sacrifício, o sangue é coletado e analisado para: lipídeos plasmáticos (TC, TG, HDL-C, FFAs);. funções hepáticas (ALAT, ASAT, Pase alcalina, y-GT); glicose e insulina; perfis de lipoproteínas de grupos selecionados de plasma (cromatografia por exclusão de tamanho).

[000184] Fígado, intestino delgado, tecidos adiposos (WAT e BAT), pâncreas, coração e músculo são coletados, pesados e mantidos para análises futuras, incluindo: histologia padrão (coloração HE, coloração de desidrogenase succinato, coloração vermelho-óleo-0 e morfologia celular); conteúdo de lipídio tecidual; microscopia eletrônica em BAT e músculo para analisar mitocôndria; isolamento de RNA para estudos de expressão de genes selecionados envolvidos no metabolismo e homeostasia de energia por RT-PCR quantitativo; extração de proteína para o estudo de modificações pós-translacionais como acetilação de proteínas de interesse (por exemplo, PGC-1a).

III - Procedimentos detalhados A - Procedimento de Animal e dietas Alojamento dos animais e manipulação.

[000185] Os camundongos são mantidos (5 animais/gaiola) em condições específicas de livres de patógenos com um ciclo claro/escuro de 12 h:12h (às 7:00), em um vivário de temperatura (20- 22°C) e umidade controladas de acordo com as especificações da Comunidade Européia. Os animais têm livre acesso à água e alimento. Água potável.

[000186] A composição química da água corrente é regularmente analisada para verificar a ausência de substâncias tóxicas potenciais no Institut d'Hydrologie, ULP, Strasbourg. A água potável é tratada com HCI e HCIO4 para manter um pH entre 5 e 5,5, e a concentração de cloro entre 5 e 6 ppm.

Dieta.

[000187] A dieta padrão em ração de roedores é obtida de UAR e a dieta rica em gordura é obtida de Research Diet. Os camundongos são alimentados com dieta em ração (16% em proteína, 3% em gordura, 5% em fibra, 5% em cinza) ou com dieta rica em gordura (20% em proteína, 20% em carboidrato, 60% em gordura). Ácido oleanólico e 0 composto teste são misturados com a dieta de ração em pó ou com a deita rica em gordura em pó nas seguintes proporções: 0,5g de OA/kg de alimento para 0 tratamento de 50mg/kg/dia e 0,08g de composto testes/kg de alimento para 0 tratamento de 10 mg/kg/dia. Os pellets são então reconstituídos. Os grupos de controle recebem pellets de alimento com 0 composto teste ou OA. Devido à consistência da dieta rica em gordura, nenhuma água é adicionada na mistura com OA. No caso da dieta de ração, que é mais difícil de ser reconstituída, uma quantidade mínima de água é adicionada ao pó para reconstituir os pellets, que são então aerados. Novos lotes de alimentos são preparados semanalmente.

Coleta de sangue

[000188] O sangue é coletado ou do sinus retro-orbital sob anestesia ou da veia caudal.

Anestesia

[000189] Para 0 experimento de varredura por dexa, os animais são anestesiados com uma mistura de cetamina (200 mg/kg)/Xilasina (10 mg/kg) administrada por injeção intraperitoneal. Para a punção venosa, os animais são anestesiados por inalação de um mistura de isoflurano-02.

B- Bioquímica

[000190] Os testes são realizados com uma estação de trabalho de laboratório automatizada Olympus AU-400 usando os reagentes comerciais (Olympus).

Análise de lipídeos e lipoproteínas

[000191] Triglicerídeos séricos, colesterol total e HDL são determinados por ensaios enzimáticos. O conteúdo de colesterol HDL sérico é determinado após a precipitação de lipoproteínas contendo apo B com ácido fosfotungstênico (por exemplo, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). O nível de ácidos graxos livres é determinado com um kit de Wako (por exemplo, Neuss, Alemanha) como especificado pelo fornecedor.

Exploração metabólica e endócrina.

[000192] A concentração de glicose sanguínea é medida por um analisador Precision Q.I.D. (por exemplo, sistema Medisense), usando eletrodos Medisense Precise (por exemplo, Abbot Laboratories, produtos Medisense, Bedford, USA). Este método é validado, por comparação dos valores do analisador Precision Q.I.D com medições clássicas de glicose. O método de Precision Q.I.D. foi escolhido uma vez que requer uma quantidade mínima de sangue e pode, por isso, ser empregado para medições múltiplas como durante um IPGTT. A insulina plasmática (por exemplo, Mercondiaa, Uppsala, Suécia) é determinada por ELISA de acordo com as especificações do fabricante.

C- Testagem metabólica. Perfis de lipoprotein a.

[000193] Os perfis de lipoproteína são obtidos por cromatografia líquida rápida de proteína, permitindo a separação das três principais classes de lipoproteínas VLDL, LDL e HDL. Teste de intolerância a glicose intraperitoneal (IPGTT) - teste de tolerância a glicose oral. IPGTT é realizado em camundongos que são deixados em jejum durante a noite (12h). Os camundongos são injetados via intraperitoneal (IPGTT) com uma solução de glicose 20% em salina estéril (0,9% NaCI) em uma dose de 2g de glicose/kg de peso corporal. O sangue é coletado da veia da cauda, para monitoramento de glicose e insulina, antes e 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150 e 180 min após a administração da solução de glicose. A área incremental da curva de glicose é calculada como uma medida de sensibilidade de insulina, enquanto que os níveis correspondentes de insulina indicam as reservas secretórias de insulina.

Gasto energético

[000194] O gasto energético é avaliado através de calorimetria indireta ao medir o consumo de oxigênio com o aparato Oxymax (por exemplo, Columbus Instrument, Columbus, OH) durante 12h. Este sistema consiste de um circuito aberto com entrada e saída de ar de gaiolas plásticas (um camundongo por gaiola). Os animais têm livre acesso à água e alimento. Um sensor muito preciso de CO2 e O2 mede a diferença nas concentrações de O2 e CO2 nos volumes de ar, 0 que gera uma quantidade de oxigênio consumido em um certo período de tempo em que 0 fluxo de ar que entra na gaiola é constante. Os dados que saem do aparato são processados em um computador conectado, analisados e mostrados em um arquivo de Excel exportável. Os valores são expressos em ml.kg1.Ir1, que é comumente conhecido como VO2.

Determinação de conteúdo de gordura corporal por varredura de Dexa.

[000195] As análises de Dexa são realizados pelo Densitômetro Série PIXIMUS de resolução ultra alta (0,18 x 0,18 mm pixels, GE Medicai Systems, Madison, Wl, USA). A densidade mineral óssea (BMD in g/cm2) e composição corporal são determinadas usando o software PIXIMUS (versão 1.4x, GE Medicai Systems).

Medida de pressão arterial D-Não-invasiva e pulso

[000196] O Sistema de Análise de Pressão Arterial Visitech BP-2000 é um sistema de cutoff de cauda automatizado por um computador que é usado para tomar múltiplas medidas em 4 camundongos acordados simultaneamente sem intervenção do operador. Os camundongos estão contidos em câmeras escuras individuais em uma plataforma aquecida com suas caudas colocadas em uma algema de cauda. O sistema mede a pressão arterial ao determinar a pressão da algema na qual o fluxo sanguíneo para a cauda é eliminado. Um sensor fotoelétrico detecta o pulso do espécime. O sistema gera resultados que mostraram corresponder intimamente com a pressão média intra-arterial medida simultaneamente na artéria carótida. Isto permite valores reprodutíveis de pressão sanguínea sistólica e freqüência cardíaca a ser obtida. Isto requer treinamento dos animais por uma semana no sistema.

E- Atividade circadiana

[000197] A atividade locomotora espontânea é medida usando caixas individuais, cada uma composta de um piso deslizante, uma gaiola destacável, e equipadas com capturadores de infravermelho que permitem a medida da atividade locomotora de caminhar e no fundo. As caixas são ligadas a um computador usando uma interface eletrônica (por exemplo, Imetronic, Pessac, França). Os camundongos são testados por 32 horas para medir se se acostumam ao aparato bem como às atividades noturnas e diurnas. A quantidade de água consumida é medida durante o período de teste usando um licômetro automatizado.

Exemplo 4. Propriedades físico-químicas Solubilidade a Água

[000198] O composto sólido (BA) foi suspenso em 5 ml de HCI 0,1 M. As soluções saturadas, após a incubação por 1 semana, foram filtradas em um filtro Millipore (0,22 ppm) e a concentração de BA é medida por HPLC-ESI-MS/MS usando uma coluna C18 (150 mm x 2 mm i.d., 4 pm) e fases moveis de água contendo ácido acético 15mM ph% e acetonitrila. A velocidade do fluxo foi 150 pl/min. A aquisição em espectrometria de massa foi realizada em modo múltiplo de monitoramento de reação usando a fonte ESI em ionização negativa. A solubilidade em água foi expressa em pmol/litro.

[000199] A solubilidade em água foi medida para as espécies protonadas insolúveis de ácidos biliares carboxilados em um pH 1. Os compostos sulfato e sulfonato 3 A e 2 A são ionizados mesmo em pH baixo e em condições fisiológicas são sempre solúveis em todos os fluidos biológicos. Tabela 2 Propriedades físico-químicas dos análogos estudados e BA de ocorrência natural.

[000200] aWs: a solubilidade de água refere-se a BA como espécies protonadas e, portanto, não avaliado para 3 A, 2 A, TCDCA e TUDCA que são altamente solúveis (hs).

[000201] bCMC: Concentração Micelar Crítica determinada em solução aquosa de NaCI 0,15 M.

[000202] CST CMC: Tensão de Superfície em CMC em solução aquosa de NaCI.

[000203] dl_ogPA: coeficiente de partição 1-octanol-água dos ácidos biliares como espécies ionizadas.

[000204] *: valores da literatura.

Concentração Micelar Crítica (CMC)

[000205] A detergência, ou seja, tendência de formar micelas foi avaliada para moléculas carregadas que são solúveis em água como sal Sódico (2 unidades até o pKa). A concentração micelar crítica (CMC) foi determinada por medições de tensão de superfície (ST) usando um método de pressão de bolha máxima que gerou valores de tensão de superfície ligeiramente afetados pelas impurezas em potencial como são os métodos estatísticos. O tensiômetro foi um Sensadyne 6000 (Chem- Dyne Research Corp., Milwaukee, Wl) equipado com duas sondas de vidro de 0,5 e 4,0 mm de diâmetro conectadas a uma fonte de nitrogênio. A frequência de bolha foi 1 bolha/segundo em água destilada a 26°C (P=2,7 atm) e a calibração foi feita com água duplamente destilada e metanol. A tensão de superfície de sais sódicos de BA em NaCI 0,15M foi medida em várias concentrações dentro da faixa de 0,13-50 mM. Os valores de tensão de superfície foram plotados contra o logaritmo da concentração de sal biliar, as linhas de regressão correspondiam a duas partes da curva (fases monomérica e micelar) foram calculadas usando o método de menores quadrados, e a interseção das linhas foi tomada como o valor de CMC. Do ST vs curvas de concentração, o valor de tensão de superfície em CMC (equilíbrio entre monômeros e espécies de multimeros) foi também calculado gerando informação sobre o poder detergente que está relacionado ao tamanho das micelas com tensão de superfície que diminui a capacidade.

[000206] O CMC foi avaliado por medidas de tensão de superfície em condições de não equilíbrio, ou seja, em condições em que as impurezas afetam ligeiramente os resultados de tensão de superfície (Figura 1). O composto 3 A apresenta uma tensão de superfície alta que diminui a capacidade com um CMC de 2,8 mM. O comportamento de ST vs a concentração sugere a formação de agregado relativamente grande com detergência consistente.

Coeficiente de partição octanol/água

[000207] Uma vez que os análogos sulfatos e sulfonatos são sempre ionizados em todos os valores de pH, o coeficiente de partição octanol/água foi medido para todas as moléculas na forma ionizada.

[000208] O coeficiente de octanol/água (log P) foi avaliado usando um procedimento de agitação em frasco convencional. Os experimentos foram conduzidos em uma solução tamponada de sal biliar 0,1 mM em pH 8 com tampão fosfato 0,1 M para garantir a ionização completa de BA, os valores de log P para o BA na forma ionizada, não para as espécies protonadas, e a concentração inicial de cada BA foi abaixo de próprio valor de CMC. O tampão aquoso foi previamente pré-saturado com 1-octanol, 3 ml de 1-octanol pré- saturado com água e em seguida adicionado e as amostras foram deixadas para equilibrar por 2 semanas sob condição de agitação em temperatura ambiente. Após centrifugação, as duas fases foram cuidadosamente separadas. A concentração de BA na fase aquosa foi medida com HPLC-ESI-MS/MS usando coluna C18 (150mm x 2mm Ld., 4pm) e, como fases móveis, água contendo ácido acético 15 mM pH 5 e acetonitrila. A velocidade de fluxo foi de 150 pal/min e a coluna foi mantida a 45°C. A aquisição em espectrometria de massa foi realizada em modo múltiplo de monitoramento de reação usando a fonte ESI em ionização negativa.

[000209] O coeficiente de partição 1-octanol/água foi calculado para as espécies ionizadas para facilitar a comparação entre os ácidos biliares carboxila e sulfato uma vez que este último não protona mesmo em valores de pH muito baixos. Ligação a albumina

[000210] A extensão da ligação a albumina foi avaliada por diálise de equilíbrio em uma razão fixa BA-albumina. BA foi dissolvido em uma concentração de 100 pM em solução salina - soro bovino fetal 5% (pH 7,2) e deixada em repouso por 24h a 25°C. Dois mililitros desta solução foram dialisadas em sacos de celulosa contendo um peso molecular de corte de 12-14.000 contra 25 ml de solução salina. O sistema foi equilibrado por agitação mecânica suave por 72 h a 25°C. As concentrações de BA da solução dialisada (correspondente à fração livre não ligada) e a solução de partida foram determinadas com HPLC-ESI-MS/MS nas mesmas condições da análise anterior. O percentual de ligação de albumina foi calculada a partir da concentração inicial de BA e a partir da concentração não ligada na fração dialisada. Os dados são relatados na Tabela 2. Todos estes compostos nunca menos apresentaram uma ligação de albumina compatível com uma absorção hepática relativamente rápida, de forma semelhante à ocorrência natural de BA. Conseqüentemente, cinéticas diferentes (mais lenta) da absorção hepática são esperadas. Exemplo 5. Estabilidade metabólica in vitro em cultura de fezes humanas. Estabilidade para bactérias intestinais 7 a-dehidroxilação.

[000211] Fezes humanas frescas homogeneizadas (500 mg) foram transferidas em frascos estéreis para os quais 5 ml_ de meio glicose e carne picada esterilizado (Scott Lab., Fiskville, RI) foi adicionado. BA foi então adicionado a uma concentração final de 0,05 mM. Os frascos foram incubados a 37°C em 0, 1, 2, 4, 8 e 24 h após a adição de BA, a reação foi interrompida com 150 pL de KOH 30%. As amostras foram centrifugadas a 3500 rpm por 10 min; do sobrenadante o BA foi isolado por extração em fase sólida C-18 e analisado por TLC e HPLC- ES- MS/MS.

[000212] Cromatografia de camada fina (TLC), utilizando placas de sílica gel de 0,25 mm de espessura (Merck, Darmstat, Alemanha), foi empregada no primeiro teste de triagem. O sistema de solvente usado par aa separação de BA conjugado foi composto de ácido propiônico/acetato de isoamila/água/N-propanol (3:4:1:2, v/v/v/v; solvente I), e o do BA não conjugado foi ácido acético/tetracloreto de carbono/éter isopropila/acetato de isoamila/água/N-propanol/benzeno (1:4:6:8:2:2, v/v/v/v/v/v; solvente II). BA separado foi revelado com solução etanólica de ácido fosfomolíbdico 5%. Todos os análogos estudados são muito estáveis quando incubados em culturas de fezes humanas e mesmo após 24 horas mais do que 85% dos compostos podem ser recuperados de forma não modificada como relatado na Fig. 2. Por outro lado, o análogo natural de referência CDCA apresenta um tempo de meia-vida de quase uma hora e após 8 horas de incubação é quase completamente metabolizado (7-dehidroxilado) para formar ácido litocólico. Após ainda longo tempo de incubação para todos os 6 análogos, a 7 dehidroxilação e a formação de um derivado 7 oxo é praticamente abolida.

Estabilidade de cadeias laterais.

[000213] De acordo com os primeiros resultados a cadeia lateral não é modificada pelas atividades enzimáticas de bactérias intestinais. Estes dados sugerem que a presença de grupo etila na posição 6 protege o grupo 7 hidroxila contra a oxidação ou remoção por impedimento estérico. Além disso, todos os análogos são muito estáveis ainda para metabolismo de cadeia lateral. A ligação éster de cadeia lateral do análogo sulfato 2 A é bastante estável na cultura de fezes humanas. O análogo sulfonato 3 A é também muito estável. Nenhum metabólito menor foi encontrado por HPLC-ES-MS/MS. Estes dados sugerem que no conteúdo do intestino inferior na presença de bactérias anaeróbicas, estes análogos são estáveis. Exemplo 6. Estabilidade metabólica in vitro em fluido duodenal/pancreático simulado (especificação USP)

[000214] O estudo foi realizado para 2 A uma vez que este contém uma ligação éster na cadeia lateral e o objetivo era justamente verificar a estabilidade na presença de enzimas tipo estearase presentes no suco duodenal e pancreático. O fluido pancreático simulado foi preparado por dissolução de 10 g/L de Pancreatina (Sigma P8096: pancreatina de pâncreas de porco, atividade 1X, especificações USP) em tampão fosfato 0,05 M, pH 7,2 ± 0,1. Em seguida, alíquotas de 4 ml_ do fluido pancreático simulado foram adicionadas de 50 pM do BA estudado e incubados para diferentes tempos (0, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min) a 37°C. Após a incubação, um alíquota de 2 ml_ de cada solução foi adicionada com 2 ml_ de NaOH 0.1 M e submetida à extração de ácidos biliares por SPE e análise por cromatografia de camada fina e espectrometria de massa como descrito acima. A Figura 2 mostra a estabilidade metabólica de 2A em fluido pancreático simulado. Óleo de oliva foi usado como uma referência como relatado no protocolo USP. O composto é muito estável (vide Fig. 2) e a ligação éster (sulfato) em 2A não é hidrolisada por estearase pancreáticas sugerindo uma alta estabilidade no conteúdo duodenal e do intestino superior humano. Exemplo 7. Secreção biliar e metabolismo do Composto 3A em fístula biliar de rato após administração duodenal (id) e femoral (iv)

[000215] Objetivo e Justificativa. A modificação estrutural de novos análogos poderia afetar suas absorções hepáticas, transportes hepáticos e secreção e absorção intestinal. Portanto, o conhecimento da secreção biliar após ambas administração iv e id junto dom o metabolismo é um ponto chave na seleção do candidato para estudos adicionais.

[000216] Para avaliar o modo e eficiência da absorção intestinal, os análogos foram administrados ambos via intravenosa (infusão femoral) e oral (infusão duodenal) na mesma dose e suas velocidades de secreção biliar foram avaliadas no modelo de fístula biliar de rato. As diferenças na área sob a curva da secreção biliar vs tempo entre administração iv e id por causa de sua absorção intestinal e gera informação sobre sua biodisponibilidade.

Efeito colerético - Infusão duodenal

[000217] O modelo de fístula biliar de rato foi desenvolvido nas instalações do Lab da Universidade de Bologna. O composto 3A foi administrado em uma dose de 1 pmol/kg/min (infusão de 1 hora) a um grupo de ratos via infusão duodenal (id). O rato teve uma fístula biliar para coletar amostras de bile em diferentes tempos antes e durante a infusão. Para o experimento de infusão duodenal, 3 ratos (250±10 g) foram tratados. Amostras de bile foram coletadas a cada 15 minutos por quatro horas. Além disso, 3 ratos de controle foram tratados com solução salina sob as mesmas condições para tempos e amostragem (ratos de controle duodenal).

[000218] A Figura 3 mostra fluxo biliar durante coleta de amostra (um animal). A infusão duodenal inicial após 30 min da coleção de bile basal e continua por uma hora. O composto 3 A apresenta um efeito colerético moderado.

Infusão intravenosa

[000219] Para o experimento de infusão femoral, 3 ratos foram tratados. A Figura 4 mostra o fluxo biliar durante o estudo. A infusão femoral incia após 75 minutos do estado de equilíbrio e continua por 60 min. Amostras de bile foram coletadas a cada 15 minutos por quatro horas. Além disso, 3 ratos de controle foram tratados com solução salina sob as mesmas condições para tempos e amostragem (ratos de controle femoral).

[000220] O composto 3 A apresenta um efeito colerético moderado e semalhante ao obtido no experimento id.

Secreção biliar dos análogos administrados

[000221] Amostras de bile coletadas durante os experimentos iv e id foram analisadas para determinar a secreção biliar dos análogos administrados e seus metabolites.

[000222] Análise de HPLC-ES-MS/MS. Soluções estoque de cada composto em metanol a 1 mmol/L (com exceção de UPF 1212 a 350 pmol/L) foram prepradas e soluções de trabalho foram preparadas ao diluir volumes apropriados da solução primária. Metanol e acetonitrila foi de grau de pureza para HPLC. Amónia foi 30% e ácido acético foi 99,8%. Todos os reagentes foram obtidos de Carlo Erba Reagents. Água grau HPLC foi preparada por sistema Milli-Q.

Preparação da amostra

[000223] Amostras de bile de rato foram trazidas à temperatura ambiente, brevemente agitadas e diluídas 1:100 v/v (amostras de bile de duodeno ou infusão) e 1:100 ou 1:200 v/v (amostras de bile de infusão femoral) com tampão de acetato de amónia 15 mM (pH = 5,0):acetonitrila = 70:30 (v/v).

[000224] A solução final foi transferida em frascos de auto- amostradores, e 10 pL foram injetados em uma coluna cromatográfica. Método HPLC- ESI-MS/MS

[000225] Amostras de bile de rato foram analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (HPLC- MS/MS) usando fonte de eletrospray (ESI) em modo de ionização negativa. Para cromatografia líquida foi usado um módulo de separação Waters Alliance 2695 acoplado com auto-amostrador. O auto-amostrador foi mantido a 7°C. A separação foi realizada em uma coluna C18 Synergi Hydro- RP (150x2,0mm i.d., 4 pm de tamanho de partícula), protegida por um SecurityGuard ODS 4x2,Omm i.d. pré- coluna, ambos fornecidos por Phenomenex. O analito foi eluído usando tampão de acetato de amónia 15 mM (pH = 5,00) como fase móvel A e acetonitrila como fase móvel B. A fase móvel B foi aumentada de 30% a 64% em 10 min, em seguida para 100% em 10 min, e mantida constante por 10 min. A velocidade de fluxo foi de 150 pL/min e a coluna foi mantida a 45°C. O efluente da coluna foi introduzido na fonte ESI conectada a um espectrômetro de massa quádruplo triplo (Quattro-LC, Micromass) operando em Monitoramento Múltiplo de Reação (MRM), modo de aquisição. O nitrogênio foi usado como gás nebulizador a uma taxa de fluxo de 90 L/h como gás de dessolvatação a 930 L/h. Bloqueio de fonte de íon e temperatura de dessolvação foram ajustadas respectivamente para 80°C e 180°C. O voltagem de capilaridade foi 3,0 kV. Softare MassLynx versão 4.0 foi usado para aquisição e processamento dos dados. Além disso, usando espectrometria de massa experimentos de configuração tanto MS único quanto MS/MS tandem foram realizados para identificar metabólitos. Quantificação

[000226] Uma curva de calibração de 5 pontos foi preparada diariamente e injetada em duplicada. Amostras de calibração foram obtidas na faixa de concentração 0,1 a 25 pmol/L preparadas na fase móvel. Parâmetros lineares de curva de calibração foram obtidos a partir do plot da área do pico do analito versus a concentração linear usando uma análise de regressão de menores quadrados (peso = 1/x2). Coeficientes de correlação foram > 0,989. Farmacocinética (secreção biliar) dos análogos administrados: comparação iv versus id

[000227] Os dados referem-se à velocidade de secreção do análogo recuperado na bile como após infusão duodenal e femoral em uma dose de 1 pmol/kg/min. Metabólitos principais e secundários são relatados posteriormente. A Tabela 3 mostra a concentração e valores de secreção do composto 3A obtidos a partir de amostras de bile de rato coletadas durante a infusão duodenal (1 h variando de 75 a 135 min).

[000228] A Tabela 4 mostra a concentração e valores de secreção do composto 3A obtidos a partir de amostras de bile de rato coletadas durante a infusão femoral (1 h variando de 75 a 135 min).

Tabela 3

Tabela 4.

[000229] A secreção biliar do composto 3 A (análogo sulfonado) após administração iv é muito eficiente e o composto é quase completamente recuperado na bile. O perfil cinético indica que o análogo é eficientemente absorvido pelo fígado e secretado na bile quase como sem metabolismo hepático (Fig. 5). Por outro lado após administração id a recuperação na bile é muito menor do que a recuperação após administração iv sugerindo que o composto é fracamente absorvido pelo intestino (Fig. 5). De acordo com as propriedades físico-químicas, este composto é fracamente absorvido por mecanismo de difusão passiva (baixo LogP = 0,71) e o mecanismo ativo não parece estar envolvido. A presença de três grupos hidroxila confere à molécula, por um lado, absorção hepática eficiente e secretada na bile, mas por outro lado fracamente absorvida pelo intestino.

Exemplo 8. Metabolismo hepático

[000230] Para uma triagem preliminar, a busca por possíveis metabólitos tem sido realizada com base em compostos esperados de acordo com os experimentos anteriores e os dados e à estrutura e propriedades físico-químicas dos análogos estudados.

[000231] O composto 3 A não é metabolizado pelo fígado ou pelo intestino e uma vez absorvido pelo fígado é secretado na bile de forma não modificada com uma cinética rápida em um tempo de residência hepática baixo. Quando administrado via id é fracamente absorvido pelo intestino e ainda neste caso não é metabolizado. Devido à sua hidrofilicidade relativamente alta (baixo LogP) e à presença do grupo sulfonato e três hidroxilas, o composto 3 A é polar suficiente para ser secretado na bile como tal mas muito polar para ser absorvido por mecanismo passivo pelo intestino;. A Figura 6 mostra o composto 3A e seu principal metabólito identificado na bile usando espectrômetro de massa em um experimento. Os dados são relatados como valores de áreas absolutas. A Figura 7 é mostra a Figura 6 em zoom.

Exemplo 9. Toxicidade in vitro do composto em célula HepG2

[000232] Os compostos da invenção foram avaliados para citotoxicidade usando métodos padrões conhecidos na técnica. Especificamente, a citotoxicidade foi avaliada usando células HEPG2 e monitoramento da diminuição de ATP e determinando o valor EC50. Ambos os compostos 3 A e 2A mostraram um EC50 > 1000 mM.

Exemplo 10. Ensaios de Seletividade NR

[000233] A seletividade dos compostos da invenção foi avaliada usando métodos de ensaio conhecidos na técnica. Especificamente, os seguintes ensaios foram usados:

[000234] FXR e LXR: Recrutamento de co-ativador (alfascreen);

[000235] TGR5: nível de cAMP em linhagem de células intestinais humanas (NCI-H716);

[000236] PXR: Ensaio de Competição de Ligantes (Ensaio de Ligação)

[000237] CAR: Recrutamento de Coativador (Lantascreen)

[000238] Exemplo 11. Atividade metabólica do composto 3A em um modelo de obesidade de camundongo induzida por dieta.

[000239] O objetivo do estudo foi avaliar a potência terapêutica do composto 3 A em um modelo de obesidade de camundongo induzida por dieta. O composto 3A foi administrado através da administração da alimentação por 16 semanas para camundongos machos C57BL6J que foram previamente submetidos por 10 semanas a dieta rica em gordura.

II - Protocolo

[000240] O composto 3 A foi administrado para este estudo. Para este estudo, camundongos machos C57BL6J (5 semanas de idade) são divididos em 2 grupos: um grupo de animais recebeu dieta de ração para controlar o início da obesidade, um grupo de animais recebeu uma dieta rica em gordura. O composto 3 A foi testado nos animais que receberam a dieta rica em gordura (HFD). Os animais são então analisados durante o período de 13 semanas. Os grupos são os seguintes: 1: dieta de ração 2: dieta rica em gordura 3: dieta rica em gordura + 3 A

[000241] Durante o estudo inteiro, o peso corporal e a ingestão de alimentos foram monitorados duas vezes por semana. O período para o início da obesidade foi de 10 semanas. Ao final de 10 semanas, a composição corporal foi analisada usando absorciômetro de raios-X de dois níveis de energia (dexascan) e os níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina foram medidos.

[000242] Após 1 semana: O composto foi administrado.

[000243] Após 3 semanas: Coleta de sangue Níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina foram medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 h.

[000244] Após 2 semanas: Composição de peso corporal foi novamente analisada por dexascan para todos os grupos.

[000245] Após 2 semanas: Gasto energético noturno foi medido por calorimetria indireta e actimetria.

[000246] Após 2 semanas: Tolerância a glicose foi determinada ao submeter todos os animais a um teste de tolerância de glicose intraperitoneal (IPGTT). Os animais ficaram em jejum por 12 h antes deste teste.

[000247] Após 2 semanas: Os animais foram sacrificados. No sacrifício, o sangue foi coletado e analisado para: lipídeos plasmáticos (TC, TG, HDL-C, FFAs);. funções hepáticas (ALAT, ASAT, Pase alcalina, y-GT); glicose e insulina; perfis de lipoproteínas de grupos selecionados de plasma (cromatografia por exclusão de tamanho).

[000248] Fígado, intestino delgado, tecidos adiposos (WAT e BAT), pâncreas, coração e músculo foram coletados, pesados e mantidos para análises futuras, incluindo: histologia padrão (coloração HE, coloração de desidrogenase succinato, coloração vermelho-óleo-0 e morfologia celular); conteúdo de lipídio tecidual; microscopia eletrônica em BAT e músculo para analisar mitocôndria; isolamento de RNA para estudos de expressão de genes selecionados envolvidos no metabolismo e homeostasia de energia por RT-PCR quantitativo; extração de proteína para o estudo de modificações pós-translacionais como acetilação de proteínas de interesse (por exemplo, PGC-1a).

III - Procedimentos detalhados A - Procedimento de animais e dietas. Alojamento de animais e manipulação

[000249] Os camundongos foram agrupados (5 animal/gaiola) em condições livres de patógenos com um ciclo claro-escuro de 12h:12h (às 7:00), em um vivário de temperatura (20-22°C) e umidade controladas de acordo com as especificações da Comunidade Européia. Os animais tiveram livre acesso à água e alimento.

Água potável

[000250] A composição química da água corrente é regularmente analisada para verificar a ausência de substâncias tóxicas potenciais no Institut d'Hydrologie, ULP, Strasbourg. A água potável é tratada com HCI e HCIO4 para manter um pH entre 5 e 5,5, e a concentração de cloro entre 5 e 6 ppm.

Dieta

[000251] A dieta padrão de ração de roedores foi obtida de UAR e a dieta rica em gordura foi obtida de Research Diet. Os camundongos foram alimentados com dieta em ração (16% em proteína, 3% em gordura, 5% em fibra, 5% em cinza) ou com dieta rica em gordura (20% em proteína, 20% em carboidrato, 60% em gordura). O composto 3 A foi misturado com a dieta rica em gordura em pó. Os pellets foram então reconstituídos. O grupo controle HFD recebeu pellets sem o composto 3 A. No caso da dieta de ração, que é mais difícil de ser reconstituída, uma quantidade mínima de água é adicionada ao pó para reconstituir os pellets, que são então aerados. Novos lotes de alimentos foram preparados semanalmente.

Coleta de sangue

[000252] O sangue foi coletado ou do sinus retro-orbital sob anestesia ou da veia caudal.

Anestesia

[000253] Para o experimento de varredura por dexa, os animais foram anestesiados com uma mistura de cetamina (200 mg/kg)/Xilasina (10 mg/kg) administrada por injeção intraperitoneal. Para a punção venosa, os animais foram anestesiados por inalação de um mistura de isoflurano-02.

B- Bioquímica

[000254] Os testes foram realizados com uma estação de trabalho de laboratório automatizada Olympus AU-400 usando os reagentes comerciais (Olympus).

Análise de lipídeos e lipoproteínas

[000255] Triglicerídeos séricos, colesterol total e HDL foram determinados por ensaios enzimáticos. O conteúdo de colesterol HDL sérico foi determinado após a precipitação de lipoproteínas contendo apo B com ácido fosfotungstênico/Mg (por exemplo, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). O nível de ácidos graxos livres foi determinado com um kit de Wako (por exemplo, Neuss, Alemanha) como especificado pelo fornecedor.

Exploração metabólica e endócrina

[000256] A concentração de glicose sanguínea foi medida por um analisador Precision Q.I.D. (por exemplo, sistema Medisense), usando eletrodos Medisense Precise (por exemplo, Abbot Laboratories, produtos Medisense, Bedford, USA). Este método foi validado, por comparação dos valores do analisador Precision Q.I.D com medições clássicas de glicose. O método de Precision Q.I.D. foi escolhido uma vez que requer uma quantidade mínima de sangue e pode, por isso, ser empregado para medições múltiplas como durante um IPGTT. A insulina plasmática (por exemplo, Mercondiaa, Uppsala, Suécia) foi determinada por ELISA de acordo com as especificações do fabricante.

C- Testagem metabólica. Perfis de lipoproteína

[000257] Os perfis de lipoproteína foram obtidos por cromatografia líquida rápida de proteína, permitindo a separação das três principais classes de lipoproteínas VLDL, LDL e HDL. Teste de intolerância a glicose intraperitoneal (IPGTT) - teste de tolerância a glicose oral. IPGTT foi realizado em camundongos que foram deixados em jejum durante a noite (12h). Os camundongos foram injetados via intraperitoneal (IPGTT) com uma solução de glicose 20% em salina estéril (0,9% NaCI) em uma dose de 2g de glicose/kg de peso corporal. O sangue foi coletado da veia da cauda, para monitoramento de glicose e insulina, antes e 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150 e 180 min após a administração da solução de glicose. A área incremental da curva de glicose foi calculada como uma medida de sensibilidade de insulina, enquanto que os níveis correspondentes de insulina indicam as reservas secretórias de insulina.

Gasto energético.

[000258] O gasto energético foi avaliado através de calorimetria indireta ao medir o consumo de oxigênio com o aparato Oxymax (por exemplo, Columbus Instrument, Columbus, OH) durante 12h. Este sistema consiste de um circuito aberto com entrada e saída de ar de gaiolas plásticas (um camundongo por gaiola). Os animais tiveram livre acesso à água e alimento. Um sensor muito preciso de CO2 e O2 mede a diferença nas concentrações de O2 e CO2 nos volumes de ar, 0 que gera uma quantidade de oxigênio consumido em um certo período de tempo em que 0 fluxo de ar que entra na gaiola é constante. Os dados que saem do aparato foram processados em um computador conectado, analisados e mostrados em um arquivo de Excel exportável. Os valores foram expressos em ml.kg-1.IT1,que é comumente conhecido como VO2.

Determinação de conteúdo de gordura corporal por varredura de Dexa.

[000259] As análises de Dexa foram realizadas pelo Densitômetro Série PIXIMUS de ultra alta resolução (0,18 x 0,18 mm pixels, GE Medicai Systems, Madison, Wl, USA). A densidade mineral óssea (BMD in g/cm2) e composição corporal foram determinadas usando 0 software PIXIMUS (versão 1.4x, GE Medicai Systems).

Medida de pressão arterial D-Não-invasiva e pulso

[000260] O Sistema de Análise de Pressão Arterial Visitech BP-2000 é um sistema de cutoff de cauda automatizado por um computador que é usado para tomar múltiplas medidas em 4 camundongos acordados simultaneamente sem intervenção do operador. Os camundongos foram contidos em câmeras escuras individuais em uma plataforma aquecida com suas caudas colocadas em uma algema de cauda. O sistema mede a pressão arterial ao determinar a pressão da algema na qual 0 fluxo sanguíneo para a cauda é eliminado. Um sensor fotoelétrico detecta 0 pulso do espécime. O sistema gera resultados que mostraram corresponder intimamente com a pressão média intra-arterial medida simultaneamente na artéria carótida. Isto permite valores reprodutíveis de pressão sanguínea sistólica e freqüência cardíaca a ser obtida. Isto requer treinamento dos animais por uma semana no sistema.

E- Atividade circadiana

[000261] A atividade locomotora espontânea foi medida usando caixas individuais, cada uma composta de um piso deslizante, uma gaiola destacável, e equipadas com capturadores de infravermelho que permitem a medida da atividade locomotora de caminhar e no fundo. As caixas foram ligadas a um computador usando uma interface eletrônica (por exemplo, Imetronic, Pessac, França). Os camundongos foram testados por 32 horas para medir se se acostumam ao aparato bem como às atividades noturnas e diurnas. A quantidade de água consumida foi medida durante o período de teste usando um licômetro automatizado.

[000262] Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 8, 9 e 10. A Figura 8 mostra a evolução de ganho de peso após tratamento (%). O gráfico mostra o % de ganho de peso (0, 5, 10, 15, 20, 25) versus tempo (0-9 semanas). O ganho de peso corporal é moderado nos camundongos alimentados com HF tratados com o composto 3 A. A Figura 9 mostra a evolução da composição corporal após o tratamento (%) 5 semanas após o tratamento. Os gráficos com % de ganho de peso são mostrados para medicas de massa gorda, massa magra e fluido corporal. O composto 3 A reduz o ganho de peso sob HFD. A Figura 10 mostra uma avaliação da homeostasia de glicose para o composto 3 A. A Figura 10 A mostra a glicemia 3 semanas após o tratamento. Especificamente, a Figura 10 A é um gráfico em barras que compara 3 grupos de camundongos (eixo-x): camundongos em HFD administrados com o composto 3A (primeira barra), camundongos em HFD (segunda barra), e camundongos em dieta de ração (terceira barra) e suas glicemias de jejum (eixo y) mmol/l em 10, 12, 14, 16, 18, 20, e 22. Figura 10B mostra frutosaminas 3 semanas após o tratamento. Especificamente, a Figura 10 B é um gráfico em barras que compara 3 grupos de camundongos (eixo-x): camundongos em HFD administrados com o composto 3A (primeira barra), camundongos em HFD (segunda barra), e camundongos em dieta de ração (terceira barra) e suas frutaminases (eixo y) micromol em 170, 175, 180, 185, 195, 200, 205 e 210. A Figura 10C mostra os resultados de teste de tolerância a glicose 9 semanas após o tratamento. Especificamente, a Figura 10 C é um gráfico em barras que compara 3 grupos de camundongos: camundongos em HFD administrados com o composto 3 A, camundongos em uma HFD, e camundongos em uma dieta de ração. O eixo y mostra a quantidade em mg/dL (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500) e o eixo x mostra o tempo em minutos 0, 30, 60, 90, 120, 150, e 180.

Outras Modalidades

[000263] Enquanto a invenção foi descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição acima tem a intenção de ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo e pelas reivindicações anexadas. Outros aspectos, vanategens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir. Deve ser entendido pelos especialistas na técnica que várias modificações na forma e detalhes podem ser feitas na mesma sem afastar-se do escopo da invenção incluído pelas reivindicações anexadas.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula D:

ou um sal do mesmo, em que: Ri é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não substituída, ou halogénio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é etila; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não substituída ou hidróxi; Rn é hidróxi, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H, ou OPO32- ou hidrogênio; e R12 é hidroxila, OSO3H, OSO3; OCOCH3, OPO3H, OPOs2' ou hidrogênio, ou tomados juntos com Rn e Reformam uma carbonila.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que Rn é hidróxi.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que Ri é OH.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que R? é H.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que R2 é H.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado entre

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.

8. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou um sal do mesmo e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Uso de um composto ou um sal do mesmo ou composição farmacêutica, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratar ou prevenir uma doença em um sujeito, em que a referida doença é selecionada do grupo que consiste em uma doença metabólica selecionada de obesidade, diabetes, síndrome metabólica, resistência a insulina, hipertensão e dislipidemia, doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, rash alérgico e psoríase, doença hepática selecionada de esteatopatia não-alcoólica, doença hepática gordurosa não-alcoólica, hepatite viral crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzida por droga, hematocromatose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hipertensão de porta, desnaturação da bile, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência de antitripsina a1, nutrição parenteral total (TPN), colestase associada a TPN e sepse, uma doença autoimune selecionada de artrite reumatoide, esclerose múltipla e diabetes tipo 1, uma doença cardíaca selecionada de insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina pectoris, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, infarto, acidente vascular cerebral), uma doença renal selecionada de neuropatia diabética, insuficiência renal crônica, nefrosclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glomerulopatia de transplante crônica, nefrite intersticial crônica e doença policística renal, câncer selecionado de câncer colorretal, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, carcinoma de colangio, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulinoma e uma doença gastrointestinal selecionada de doença de inflamatória intestinal (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (malabsorção) e super crescimento bacteriano.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada de doença inflamatória selecionada de alergia, osteoartrite, apendicite, asma brônquica, pancreatite, rash alérgico e psoríase e câncer selecionado de câncer colorretal, câncer hepático, carcinoma hepatocelular, carcinoma de colangio, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, e insulinoma.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.