EA017616B1

EA017616B1 - Дифенилкарбоновые кислоты и их производные

Info

Publication number: EA017616B1
Application number: EA201070478A
Authority: EA
Inventors: Чих Юнг Хо
Original assignee: Янссен Фармацевтика, Н.В.
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2013-01-30
Also published as: EP2215044B8; US7897643B2; EA201070478A1; EP2215044B1; WO2009051948A1; JP2011500691A; BRPI0817424A2; CN101861297B; US20090105344A1; CN101861297A; ES2395083T3; KR20100090264A; NI201000058A; DK2215044T3; AU2008312771B2; AU2008312771A1; CO6270313A2; MX2010004261A; ES2395083T8; JP5404634B2

Abstract

Изобретение относится к соединениям с общей формулой I, где R, R, Rи Rявляются описанными здесь веществами и/или их солями, либо сложными эфирами. Изобретение также относится к применению указанных соединений для лечения болезни Альцгеймера и модулирования активности γ-секретазы.

Description

Заявка имеет приоритетное право на преимущества, предоставляемые предварительной заявкой на патент США, серийный №60/980587, поданной 17 октября 2007 г. Вся приведенная в вышеуказанной заявке на патент США информация считается включенной в текст настоящего документа путем отсылки для любых целей.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям с общей формулой I, где К4-К4 являются описанными далее веществами и/или их солями, либо сложными эфирами.

Изобретение также относится к применению указанных соединений для лечения болезни Альцгеймера и модулирования активности γ-секретазы. Настоящая заявка касается рассматриваемого в данный момент подмножества соединений, описанного в заявке \¥О 2006/04555 А1.

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Альцгеймера (БА) - прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся потерей памяти, когнитивными нарушениями и отклонениями в поведении. БА поражает 6-10% популяции в возрасте старше 65 лет и до 50% старше 85 лет, является ведущей причиной деменции и третьей по частоте причиной смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. В настоящее время способы эффективного лечения БА медицине не известны. Общая сумма средств, ежегодно затрачиваемых США в связи с БА, превышает 100 млрд $. Полного понимания этиологии БА в настоящее время не достигнуто, однако известны факторы риска: 1) возраст, 2) семейный анамнез, 3) травмы головы; к числу прочих факторов также относят встречающиеся в окружающей среде токсины и низкий уровень образованности. Специфические нейропатологические поражения, обнаруживаемые в лимбической и остальной коре головного мозга, представляют собой внутриклеточные нейрофибриллярные клубки слипшегося избыточно фосфорилированного тау-белка и внеклеточные отложения фибриллярных скоплений бета-амилоидных пептидов (амилоидных бляшек). Главным компонентом амилоидных бляшек являются бета-амилоидные пептиды (А-бета или АЗ) разной длины. Одна из разновидностей данных пептидов, АЗ1-42-пептид (АЗ-42), считается основной причиной возникновения амилоидных образований. Другой разновидностью является АЗ1-40-пептид (АЗ-40). Бета-амилоид образуется в результате расщепления белка-предшественника - бета-АРР или АРР.

Наследственные, рано проявляющиеся аутосомно-доминантные формы БА связывают с нонсенсмутациями белка - предшественника З-амилоида (З-АРР или АРР) и двух других белков - пресенилина-1 и пресенилина-2. У ряда пациентов поздно проявляющиеся формы БА связывают со специфическим аллелем гена аполипопротеина Е (АроЕ) и в последнее время с мутацией альфа-2-макроглобулина, которая может быть причиной БА по меньшей мере у 30% больных. Несмотря на неоднородность причин, все формы БА имеют схожие патологические проявления. Наиболее эффективным средством для выработки подхода к лечению БА считается генетический анализ. Все известные на данный момент мутации влияют количественно или качественно на образование амилоидогенных пептидов, именуемых АЗ-пептидами (АЗ), в частности АЗ42, и в значительной степени подтверждают гипотезу амилоидного каскада (Ταηζί аиб Вейтат, 2005, Се11 120, 545). Предполагаемая связь между образованием АЗ-пептидов и патологией БА требует дальнейшего изучения механизмов образования АЗ и позволяет с высокой долей уверенности считать ключевой терапевтической задачей снижение уровня АЗ.

Высвобождение АЗ-пептидов достигается модулированием по меньшей мере двух видов протеолитической активности, именуемых расщеплением З- и γ-секретазы в Ν-конце (связь мет-асп) и С-конце (остатки 37-42) АЗ-пептида соответственно. Исследования механизма секреции показывают, что βсекретаза расщепляется первой, вызывая секрецию к-АРРЗ (§З) и удержание связанного с мембраной карбоксил-терминального фрагмента (КТФ) массой 11 кДа. Последний считают ответственным за образование АЗ-пептидов в результате расщепления γ-секретазой. Количество более длинной изоформы АЗ42 избирательно увеличивается у пациентов с определенными мутациями конкретного белка (пресенилина), причем эти мутации связывают с рано проявляющимися наследственными формами болезни Альцгеймера. Поэтому многие исследователи считают АЗ42 главной причиной патогенеза болезни Альцгеймера.

В настоящее время достоверно известно, что активность γ-секретазы обусловлена не одним конкретным белком, но совокупностью нескольких белков.

В основе активности гамма-секретазы лежит мультибелковый комплекс, содержащий не менее четырех компонентов: пресенилин-гетеродимер (ПС), никастрин, арй-1 и реи-2. ПС-гетеродимер состоит из амино- и карбоксил-терминальных фрагментов ПС, образующихся в результате эндопротеолиза белкапредшественника. Два аспартата каталитического центра находятся на границе данного гетеродимера. Недавно было высказано предположение, что никастрин выступает рецептором субстрата гаммасекретазы. Функции остальных компонентов гамма-секретазы неизвестны, однако все они необходимы для ее активности (81ешег, 2004. Сигг. Лййеппег Векеагсй 1(3): 175-181).

Таким образом, несмотря на то что молекулярный механизм второй стадии расщепления до сих пор остается неясным, комплекс γ-секретазы в настоящее время является одной из основных мишеней разра

- 1 017616 батываемых для лечения болезни Альцгеймера соединений.

Исследователями предложены различные способы фармацевтического воздействия на гаммасекретазу при болезни Альцгеймера: от прямого воздействия на каталитический центр до разработки ингибиторов, связывающихся непосредственно с субстратом, и модуляторов активности гаммасекретазы (Мацаих с1 а1., 2004. Итид И18соуету Тобау: Ткетареийс 81га1ед1е5. Уо1ите 1, 1-6). Соответственно, в литературе описаны многочисленные соединения, мишенью которых являются секретазы (Ъатпег, 2004. 8есге1а5е5 ак Шетареибск 1атде18 ίη Аккешет'к бщеаке: ра1еп(5 2000-2004. Ехрей Θρίη. Ткег. Ра!епй 14, 1403-1420).

Недавно данное наблюдение было действительно подтверждено биохимическими исследованиями, показавшими эффективность воздействия некоторых НПВС на γ-секретазу (Уеддеп е1 а1 (2001) №11иге 414, 6860, 212 и УО 01/78721 и И8 2002/0128319; Мойката е1 а1. (2002) 1. Иеигоскет. 83, 1009; Ейкзеп (2003) 1. С11п. 1пуей. 112, 440). Препятствиями для применения НПВС в профилактике или лечении БА могут быть ингибирование ими ферментативной активности циклооксигеназы, потенциально чреватое неблагоприятными побочными эффектами, и недостаточное проникновение в ЦНС (Ретейо е1 а1., 2005, 1. Меб. Скет. 48, 5705-5720).

Таким образом, существует насущная необходимость в новых соединениях, модулирующих активность γ-секретазы и открывающих новые перспективы в лечении болезни Альцгеймера.

Целью настоящего изобретения является создание таких соединений.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к соединениям, показанным в формуле I

где К¹ представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

К² представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

К³ представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

К⁴ представляет собой Н, Е, С1 или СЕ₃;

а также его сольваты, гидраты, сложные эфиры и фармацевтически приемлемые соли.

Данное подмножество соединений проявляет непредвиденно высокую активность и эффективность 1п у1уо. В частности, активность и эффективность повышаются, когда К¹ и К² являются электроноакцепторными группами, например Е, С1 или СЕ₃, и углерод а у карбоксилата замещается втор-бутилом.

Подробное описание изобретения

где К¹ представляет собой Е, С1 или СЕ3;

К² представляет собой Е, С1 или СЕ3;

К³ представляет собой Е, С1 или СЕ3;

К⁴ представляет собой Н, Е, С1 или СЕ3;

Вариантом осуществления изобретения является соединение, где

К¹ представляет собой Е;

К² представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

К³ представляет собой СЕ3;

К⁴ представляет собой Н, Е, С1 или СЕ3;

Другим вариантом осуществления изобретения является соединение, выбранное из группы, состоящей из (К)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты, (8)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты,

2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты,

2-[4'-хлор-5-(3,5-дифторбензилокси)-3'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты,

- 2 017616 а также их сольватов, гидратов, сложных эфиров и фармацевтически приемлемых солей.

Специалист в этой области заметит, что соединения по формуле I могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода в своей структуре. Настоящее изобретение включает в себя формы соединений с одним энантиомером, рацемические смеси и смеси энантиомеров с энантиомерным избытком.

Некоторые соединения по изобретению и/или их соли, либо сложные эфиры могут существовать в различных стереоизомерных формах. Все эти формы включены в объем изобретения.

Ниже приведены примеры солей соединений по изобретению, которые включены в его объем. Список приведенных ниже различных солей не является исчерпывающим и окончательным.

Соединения по изобретению, содержащие одну или несколько кислотных групп, могут быть использованы согласно изобретению, например как их соли щелочных металлов, соли щелочно-земельных металлов или соли аммония. Более частными примерами таких солей являются соли натрия, соли калия, соли кальция, соли магния или соли аммония либо органических аминов, например этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты.

Термин фармацевтически приемлемый означает разрешенный регулятивными органами, в частности ЕМЕА (Европа) и/или ΕΌΑ (США), и/или любым другим национальным регулирующим органом, для применения у животных, предпочтительно у человека.

Соответствующие соли соединений по изобретению могут быть получены стандартными способами, известными специалистам в этой области, например путем их сочетания с органическим или неорганическим основанием в растворителе или диспергаторе либо путем катионного обмена с другими солями.

Кроме того, изобретение включает в себя все соли соединений по изобретению, которые в связи с низкой физиологической совместимостью не подходят для непосредственного использования в лекарственных средствах, но могут быть применены, например, в качестве промежуточных компонентов химических реакций, для получения фармацевтически приемлемых солей или изучения возможностей модулирования активности γ-секретазы соединением по изобретению любым доступным способом, в частности анализом ίη νίίτο.

Настоящее изобретение также включает в себя все сольваты соединений по изобретению.

Настоящее изобретение также включает в себя производные/пролекарства (в том числе их соли) соединений по изобретению, содержащие физиологически допустимые расщепляемые группы, метаболизируемые в соединение по изобретению организмом животных, предпочтительно млекопитающих и наиболее предпочтительно человека.

Настоящее изобретение также включает в себя метаболиты соединений по изобретению.

Термин метаболиты означает все молекулы, происходящие из соединений по изобретению в клетке или организме, предпочтительно у млекопитающих.

Предпочтительно термин метаболиты означает молекулы, которые в физиологических условиях отличаются от других молекул, присутствующих в данной клетке или организме.

Структура метаболитов соединений по изобретению будет ясна специалистам в этой области, использующим различные подходящие способы.

Соединения по общей формуле (I) могут быть получены описанными в литературе или аналогичными способами.

В зависимости от обстоятельств каждого отдельного случая для исключения побочных реакций в ходе синтеза соединения, имеющего общую формулу (I), может быть необходима или полезна временная блокировка функциональных групп путем добавления защитных групп с последующей разблокировкой на более позднем этапе синтеза. Возможно также добавление функциональных групп в виде групппредшественников с последующим преобразованием в требуемые функциональные группы на более позднем этапе. Приемлемые методы синтеза, защитные группы и группы-предшественники известны специалистам в этой области.

При необходимости соединения по формуле (I) могут быть очищены стандартными способами очистки, в частности перекристаллизацией или хроматографией. Исходные материалы для получения соединений по формуле (I) имеются в продаже либо могут быть получены описанными в литературе или аналогичными способами.

Они могут быть взяты за основу для получения других соединений по изобретению несколькими способами, хорошо известными специалистам в этой области.

Изобретение также относится к соединениям, предназначенным для использования в качестве лекарственного средства. Данные соединения соответствуют вышеуказанным. Кроме того, при использовании в качестве ЛС изобретение также включает в себя все нижеуказанные варианты его осуществления для этой цели, в частности формулу, применение и комбинацию.

В частности, соединения по изобретению подходят для лечения болезни Альцгеймера.

Применение с этой целью подробно рассматривается далее.

Соединения могут использоваться для модулирования активности γ-секретазы.

- 3 017616

В настоящем документе термин модулирование активности γ-секретазы означает воздействие комплекса γ-секретазы на процесс превращения белка АРР. Предпочтительно он означает такое воздействие, при котором общая скорость превращения АРР остается в целом такой же, как если бы вышеуказанные соединения не применялись, однако относительное количество продуктов превращения изменяется, наиболее предпочтительно таким образом, при котором уровень АЗ42-пептидов сокращается. В частности, могут быть образованы другие разновидности АЗ-пептидов (АЗ-38 и другие разновидности АЗ-пептидов с меньшим количеством аминокислот вместо АЗ-42) или относительное количество продуктов превращения может отличаться (например, изменяется соотношение АЗ-40 и АЗ-42, предпочтительно увеличивается).

Активность гамма-секретазы может быть измерена, например, путем отслеживания превращения АРР, в частности уровней образующихся разновидностей АЗ-пептидов, в особенности уровней АЗ-42 (см. раздел Примеры ниже).

В литературе также описано участие комплекса γ-секретазы в превращении белка семейства Νοίοΐι. Белок семейства ΝοΐεΗ - это сигнальный белок, играющий важную роль в процессах развития (см., например, 8с11\ус15Щ.1111 Р (2004) Сигг. ΒίοΙ. 14, К.129).

Применительно к использованию указанных соединений для модулирования активности γсекретазы в терапевтических целях особенно важным представляется обеспечение их невмешательства в превращение белка семейства ΝοΝίι γ-секретазой, чтобы исключить потенциальные неблагоприятные побочные эффекты.

Таким образом, предпочтительными являются соединения, не воздействующие на превращение белка семейства ΝοΝίι комплексом γ-секретазы.

Применительно к настоящему изобретению термин воздействие на превращение белка семейства ΝοΝίι означает как ингибирование, так и катализ превращения белка семейства ΝοίΟι с той или иной степенью эффективности.

Соединение считается не оказывающим воздействия на превращение белка семейства ΝοΝίι. если вышеуказанная степень меньше 20, предпочтительно меньше 10, более предпочтительно меньше 5 и наиболее предпочтительно меньше 2 согласно результатам соответствующего анализа, описанного в δΐιίιηίζιι е! а1. (2000) Μοί. Се11. ΒίοΙ, 20: 6913, при концентрации 30 цМ.

Подобное модулирование активности γ-секретазы может быть выполнено, в частности, у животных, например млекопитающих. К ним относятся мыши, крысы, морские свинки, обезьяны, собаки, кошки и т.д. Модулирование может быть также выполнено у человека. В одном из вариантов осуществления изобретения модулирование выполняется ίη νίίτο или в культуре клеток. Специалистам в этой области известны несколько способов анализа ίη νίίτο и в культуре клеток.

Примеры анализов, подходящих для измерения образования С-терминальных фрагментов белка АРР в линиях клеток или у трансгенных животных путем вестерн-блоттинга, приведены, в частности, в Уап е! а1., 1999, Ыа!иге 402, 533-537.

Пример анализа γ-секретазы ίη νίίτο описан в ^0-03/008635. В данном анализе приемлемый субстрат пептида сочетают с препаратом γ-секретазы и измеряют способность расщепления субстрата.

Концентрации разных продуктов расщепления γ-секретазы (АЗ-пептидов) могут быть определены различными способами, известными специалистам в этой области. Примерами подобных способов качественного и количественного определения пептидов являются масс-спектрометрия и анализ с помощью антител.

Примеры анализов, подходящих для исследования растворимых АЗ-пептидов в питательной среде для культивирования клеток и биологических жидкостях, приведены, в частности, в \Уап§ е! а1., 1996, 1. Βίο1. С11еш. 271, 31894-31902. В данном анализе иммунопреципитацию АЗ-пептидов специфическими к ним антителами с последующим качественным и количественным определением разновидностей пептидов сочетали с время-пролетной масс-спектрометрией путем матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации.

Примеры способов, подходящих для количественного анализа образования пептидов АЗ-40 и АЗ-42 путем ИФА, приведены, в частности, в Уаккаг е! а1., 1999, 8с1епсе 286, 735-741. Дополнительные наблюдения представлены, например, в Ν. 1ба е! а1. (1996) 1. Βίο1. СТеш. 271, 22908, и М. 1епкеп е! а1. (2000) Μο1. Меб. 6, 291. Подходящие тела поставляются, в частности, компанией Тйе Сепебск ^трапу, 1пс., Швейцария. Наборы антител также поставляются компанией Iηηοдеηе!^ск, Бельгия.

Для данного анализа могут быть, в частности, использованы клетки, эндогенно экспрессирующие комплекс γ-секретазы, и трансфицированные клетки, кратковременно или постоянно экспрессирующие некоторые либо все взаимодействующие компоненты комплекса γ-секретазы. В продаже имеются многочисленные линии клеток, подходящие для подобного анализа; они должны быть известны специалистам в этой области. Особенно эффективны клетки и линии клеток нейронного или глиального происхождения. Кроме того, могут быть использованы клетки и ткани мозга, а также соответствующие гомогенаты и мембранные препараты (Х1а е! а1., 1998, Β^οсйет^кί^у 37, 16465-16471).

- 4 017616

Подобные анализы могут быть выполнены, в частности, для изучения эффективности соединений по изобретению в различных экспериментальных условиях и конфигурациях.

Кроме того, подобные анализы могут осуществляться в рамках функциональных исследований комплекса γ-секретазы.

Например, один или несколько взаимодействующих компонентов (либо немутантного типа, либо с рядом мутаций и/или модификаций) комплекса γ-секретазы животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека, могут быть экспрессированы в линиях клеток с последующим анализом эффективности соединения по изобретению.

Мутантные формы одного или нескольких используемых взаимодействующих компонентов комплекса могут являться мутантными формами, описанными в литературе для некоторых животных, предпочтительно млекопитающих, более предпочтительно человека, или мутантными формами, ранее не описанными для указанных животных.

Модификации взаимодействующих компонентов комплекса γ-секретазы подразумевают как физиологическую модификацию указанных взаимодействующих компонентов, так и другие модификации, описанные в литературе как модификации белков в биологической системе.

Примерами таких модификаций являются гликозилирование, фосфорилирование, пренилирование, миристилирование, фарнезилирование и т. д.

Кроме того, соединения по изобретению могут быть использованы для получения лекарственного средства, модулирующего активность γ-секретазы.

Изобретение также относится к использованию указанных соединений для получения лекарственного средства, модулирующего активность γ-секретазы.

Активность γ-секретазы может быть модулирована разными способами с образованием различающихся качественно и количественно АЗ-пептидов.

Предпочтительно использование соединения для модулирования активности γ-секретазы таким образом, при котором относительное количество образующихся АЗ42-пептидов снижается.

Соответствующие дозировки, способы введения, формулы и т.д. описаны далее.

Изобретение также относится к использованию указанных соединений по изобретению для лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем образования АЗ42-пептидов. К основным заболеваниям, при которых наблюдается повышенный уровень образования и отложения в мозге Αβ-пептидов, относятся болезнь Альцгеймера (БА), церебральная амилоидная ангиопатия, мультиинфарктная деменция, деменция боксеров или болезнь Дауна, предпочтительно БА.

В настоящем документе термин лечение означает все процессы, направленные на замедление, прерывание, приостановку или остановку прогрессирования заболевания, однако необязательно подразумевает полное устранение всех симптомов.

В настоящем документе термин повышенный уровень образования АЗ42-пептидов означает состояние, при котором скорость образования АЗ42-пептидов увеличивается в связи с общей интенсификацией превращения белка АРР или предпочтительно означает состояние, в котором образование Αβ42пептидов увеличивается в связи с изменением процесса превращения АРР по сравнению с АРР немутантного типа и здоровым организмом.

Как указывалось выше, подобный повышенный уровень образования А[)42-пептидов характерен для начальной и поздней стадий болезни Альцгеймера.

Одним из преимуществ соединений или части соединений по настоящему изобретению может являться более эффективное проникновение в ЦНС.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение по изобретению вместе с инертным носителем.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение по изобретению вместе с инертным носителем, где указанный инертный носитель является фармацевтическим носителем.

Термин носитель означает растворитель, формообразующее вещество, вспомогательное вещество или систему доставки, в сочетании с которыми вводится соединение. В качестве подобных фармацевтических носителей могут быть использованы стерильные жидкости, например вода и масла, в том числе нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, в частности арахисовое, соевое, минеральное, кунжутное масло и т.п. При пероральном введении фармацевтической композиции предпочтительным носителем является вода. При в/в введении фармацевтической композиции предпочтигельными носителями являются физиологический раствор и водный раствор декстрозы. При инъекционном введении предпочтительными жидкими носителями являются физиологический раствор, водный раствор декстрозы и раствор глицерина. К фармацевтически приемлемым вспомогательным веществам относятся крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, натрия стеарат, глицеролмоностеарат, тальк, натрия хлорид, молоко сухое обезжиренное, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т. п. При необходимости композиция может также содержать небольшое количество увлажняющих, эмульгирующих или рН-буферных агентов. Данная композиция может иметь форму рас

- 5 017616 творов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, формул замедленного высвобождения и т.п. Композиция может иметь форму суппозиториев, содержащих традиционные связующие вещества и носители, в частности триглицериды. Пероральные формы могут содержать стандартные носители, в частности фармацевтического качества маннит, лактозу, крахмал, магния стеарат, натрия сахарин, целлюлозу, магния карбонат и т.д. Примеры фармацевтически приемлемых носителей приведены в Е.^. Магйи. Яетшд!ои'к Рйагтасеи11са1 8с1еисек. Подобные композиции должны содержать терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, в сочетании с пропорциональным количеством носителя, чем обеспечивается подходящая для надлежащего введения пациенту форма. Формула должна соответствовать способу введения.

Соединения по изобретению и их фармацевтически приемлемые соли, в том числе в сочетании с другими фармацевтически активными соединениями, подходят для лечения или профилактики болезни Альцгеймера и ее симптомов. К подобным дополнительным соединениям относятся ноотропные лекарственные средства, в частности ингибиторы ацетилхолинэстеразы (донепезил, такрин, галантамин, ривастигмин и т.д.), ΝΜΌΑ-антагонисты (мемантин и т.д.), ингибиторы ΡΌΕ4 (Арифло и т.д.) и прочие известные специалистам в этой области препараты, подходящие для лечения или профилактики болезни Альцгеймера. В число подобных соединений также входят снижающие уровень холестерина препараты, в частности статины (симвастатин и т.д.). Данные соединения могут быть введены животным, предпочтительно млекопитающим и особенно человеку, непосредственно в виде отдельных фармацевтических препаратов, в сочетании друг с другом или в виде комбинированных фармацевтических составов.

Известны и могут быть использованы различные системы доставки соединения по изобретению с целью лечения болезни Альцгеймера либо модулирования активности γ-секретазы, в частности инкапсуляция в липосомах, микрочастицах и микрокапсулах.

Если доставка ЛС осуществляется не напрямую в центральную нервную систему, предпочтительно мозг, то предпочтительным является выбор и/или изменение способа введения таким образом, который позволит фармацевтическому соединению эффективно преодолеть гематоэнцефалический барьер.

Способы введения включают, в частности, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный.

Соединения могут быть введены любым удобным способом, включая вливание, болюсное введение, всасывание через эпителий или слизисто-кожные оболочки, а также в сочетании с другими биологически активными веществами.

Введение может быть общим или местным. Кроме того, при необходимости фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены в центральную нервную систему любым подходящим способом, включая внутрижелудочковую и интратекальную инъекции; при внутрижелудочковой инъекции может быть дополнительно использован внутрижелудочковый катетер, в том числе подсоединенный к резервуару, например резервуару Оммайя. Возможно также введение ЛС через легочные пути, в частности посредством ингалятора или небулайзера, при этом ЛС должно содержать аэрозолеобразующий агент.

В другом варианте осуществления изобретения соединение может доставляться в везикулах, в частности в липосомах (Ьаидег (1990) 8с1еисе 249, 1527).

Другим вариантом осуществления изобретения является доставка соединения с помощью системы контролируемого высвобождения. Один из вариантов предусматривает применение помпы (8ейои (1987) СЯС Сгй. ЯеГ. Вютеб. Еид. 14, 201; Висйета1б е! а1. (1980) 8игдегу 88, 507; 8аибек е! а1. (1989) Ν. Еид1. 1. Меб. 321, 574). Другой вариант предполагает применение полимерных материалов (Яаидег апб Реррак (1983) Масгото1. 8ск Яеу. Масгото1. Сйет. 23, 61; Ьеуу е! а1. (1985) 8с1епсе 228, 190; Эиппд е! а1. (1989) Аип. №иго1. 25, 351; Но\гагб е! а1. (1989) 1. №игокигд. 71, 858). Еще одним вариантом является размещение системы контролируемого высвобождения вблизи терапевтической мишени, т. е. мозга, в результате чего требуется лишь малая часть от объема системной дозы (напр., Сообкоп, 1984, в Меб1са1 Аррйсайоик о! Сои1го11еб Яе1еаке, кирга, Уо1. 2, 115). Другие системы контролируемого высвобождения рассмотрены в обзорной публикации Ьаидег (1990, 8с1еисе 249, 1527).

При выборе оптимального способа введения специалист в этой области должен также учесть способы, используемые для других известных ЛС, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера.

К примеру, арисепт/донепезил и когнекс/такрин (все являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы) применяют перорально, аксура/мемантин (NΜ^Α-антагонист) выпускаются как в таблетированной/жидкой форме, так и в виде раствора для в/в ведения.

Кроме того, специалист в этой области должен принимать во внимание имеющиеся данные относительно способов введения препаратов группы НПВС, использованных в клинических исследованиях и других испытаниях, направленных на изучение их эффективности при болезни Альцгеймера.

При выборе дозировки специалист в этой области должен принимать во внимание дозировки, которые были признаны нетоксичными по результатам доклинических и/или клинических исследований и которые могут соответствовать приведенным ранее значениям или отличаться от них.

Конкретная дозировка соединения в формуле будет также зависеть от способа введения, стадии заболевания или нарушения и определяться по усмотрению врача с учетом индивидуальных особенностей

- 6 017616 каждого пациента. Однако для в/в введения оптимальной дозировкой в целом считается 20-500 мкг действующего вещества на кг веса тела. Для интраназального введения в целом оптимальной дозировкой является 0,01-1 мг/кг веса тела. Эффективная дозировка может быть подобрана на основании данных о соотношении дозировки и эффективности, полученных при испытаниях ίη νίίτο или на животных моделях.

Примером животной модели является трансгенный штамм мыши Тд2576, содержащий разновидность белка АРР695, подвергнутую двойной мутации (КМ670/671ХЬ). См., например, патент И85877399 и Ныао е1 а1. (1996) 8с1епсе 274, 99, а также КататаЬауайы Т (2001) I. Хеиго8С1. 21, 372; Етаийсйу е1 а1. (1998) Ат. I. Ра1йо1. 152, 307; [пхаггу е1 а1. (1997) I. Хеитора1йо1. Εχρ. Хеиго1. 56, 965; Ьейтап е1 а1. (2003) ХеигоЬю1. Адшд 24, 645.

Для подбора дозировки, соответствующей выбранному курсу лечения, специалисты в этой области могут использовать существенные данные нескольких проведенных ранее исследований.

Исследования воздействия молекул на активность γ-секретазы описаны в многочисленных публикациях. Примерами подобных исследований являются Ь1т е1 а1. (2001) ХеигоЬю1. Адшд 22, 983; Ь1т е1 а1. (2000) I Хеигоксг 20, 5709; Уеддеп е1 а1. (2001) Ха1иге 414, 212; Епккеп е1 а1. (2003) I С1ш БтсеЧ. 112, 440; Уап е1 а1. (2003) I Хеигока. 23, 7504.

Общее описание синтеза

Следующее общее описание имеет строго информативный характер и ни в коей мере не ограничивает изобретение.

Соединение по формуле I, компоненты К.¹, В², В³ и В⁴ которого соответствуют формуле I, может быть получено путем гидролиза сложного эфира II в стандартной кислой или щелочной среде, включая реакцию с ХаОН, в комбинации с соответствующим растворителем, в частности водой, тетрагидрофураном (ТГФ) и метанолом, при комнатной температуре в течение нескольких часов.

Соединение II, где алкил содержит метил и этил, может быть получено алкилированием соединения III с бензил бромидами, бензил хлоридами, бензил тозилатами или бензил мезилатами в типовых условиях бензилирования, в частности в ДМФ или ТГФ в присутствии основания, например калия карбоната или цезия карбоната при температуре 25-120°С. Соединение II может быть также получено сочетанием соединения III с бензиловым спиртом в условиях реакции Мицунобу, в частности в ТГФ или толуоле в присутствии диэтилового эфира азодикарбоновой кислоты и трифенилфосфина.

Соединение III может быть получено дебензилированием соединения IV при гидрировании в спирте, в частности МеОН или ΕΐΟΗ, в присутствии Ρά-С. Возможны также другие способы дебензилирования, в том числе ВВг₃ в ДХМ, ХаСХ в ДМСО при 120-200°С или ЬгСХ в ДМФ при 120-200°С.

Соединение IV может быть получено алкилированием соединения V с втор-бутил бромидом или втор-бутенил бромидом. Воздействие на соединение V в ТГФ или другом апротонном растворителе основанием, в частности лития бис(трисметилсилил) амидом, натрия бис(трисметилсилил) амидом или ли тия диизопропиламидом при -78°С, с последующим добавлением втор-бутил бромида или втор-бутенил бромида позволяет получить алкилированное соединение IV.

- 7 017616

Соединение V может быть получено из соединения VI путем сочетания с арилбороновой кислотой в условиях реакции Судзуки (водный раствор натрия карбоната в ДМЭ в присутствии Рб(РРИ₃)₄).

Промежуточное соединение VI может быть получено из соединения VII с помощью трифторметансульфонового ангидрида в ДХМ в присутствии одного эквивалента пиридина при 0°С.

он

VII

Промежуточный фенольный эфир VII может быть получен монодебензилированием соединения VIII. Селективное монодебензилирование соединения VIII может достигаться воздействием 1,1 эквивалента основания, в частности натрия гидроксида или калия гидроксида, в растворе этанола или метанола в присутствии катализатора Рб-С в водородной атмосфере (<413,7 кПа (60 фунтов/кв. дюйм)) в качалке Парра. Реакция продолжается до расходования одного эквивалента водорода.

VIII

Промежуточное соединение VIII может быть легко получено путем реакции 3,5-дигидроксифенилуксусной кислоты метилового эфира (имеется в продаже) с бензил бромидом и калия карбонатом в ДМФ при комнатной температуре.

Соединение I имеет хиральный центр а у карбоновой группы и может существовать в виде одного из двух энантиомеров (или их соединения, содержащего либо не содержащего энантиомерный избыток). Показаны энантиомеры Ρι (К-энантиомер) и !Ъ (8-энантиомер). Чистые энантиомеры Р1 и !Ъ могут быть получены хиральным разделением с помощью хиральной колонки. Энантиомеры Р1 и !Ъ могут быть также разделены за счет образования хиральных солей аминов путем фракциональной перекристаллизации. Энантиомеры Р1 и !Ъ могут быть также получены кинетическим разделением рацемата соответствующих сложных эфиров с помощью липазных ферментов, в частности АтапоАк, Атапо Ираке Р8, Атапо Ираке А, Атапо Ираке М, Атапо Ираке Р-15, Атапо Ираке С (Вюса1а1уИск Шс) в водных органических растворителях, в том числе водных растворах ДМФ, ДМСО, трет-бутил-этиловом эфире или водных растворах ТтИоп Х-100.

Оба энантиомера соединения I могут быть получены хиральным синтезом. Соединения Ц и !Ъ могут быть получены удалением вспомогательных хиральных групп из соединений !Ха и !ХЬ соответственно с помощью лития гидроксида в водном растворе ТГФ в присутствии пероксида водорода.

Соединения !Ха и IXЬ могут быть получены сочетанием соединений Ха и ХЬ с бензил бромидами, хлоридами, тозилатами или мезилатами в типовой щелочной среде, в частности в ДМФ или ТГФ в присутствии основания, например калия карбоната либо цезия карбоната, при температуре 25-120°С. Соединения ГХа и !ХЬ могут быть также получены сочетанием соединений Ха и ХЬ с бензиловыми спиртами в условиях реакции Мицунобу, в частности в ТГФ или толуоле в присутствии диэтилового эфира азодикарбоновой кислоты и трифенилфосфина.

- 8 017616

Соединения Ха и ХЬ могут быть получены дебензилированием соединений Х1а и Х1Ь соответственно при гидрировании в спиртовом растворителе, в частности МеОН или Ε1ΘΗ, в присутствии Рб-С.

Соединения Х1а и Х1Ь могут быть получены алкилированием соединений Х11а и Х11Ь соответственно с втор-бутил бромидом или втор-бутенил бромидом. Воздействие на соединения Х11а и Х11Ь в ТГФ или других апротонных растворителях основаниями, в частности лития бис(трисметилсилил) амидом, натрия бис(трисметилсилил) амидом или лития диизопропиламидом при -78°С, с последующим добавлением электрофилов, втор-бутил бромида или втор-бутенил бромида позволяет получить алкилированные соединения Х1а и Х1Ь соответственно.

Соединения Х11а и Х11Ь могут быть получены из общего промежуточного соединения ХШ сочетанием либо с Я-изомером 4-бензил-оксазолидин-она Х1Уа или 8-изомером 4-бензил-оксазолидин-она Х1УЬ по методу Эванса. Промежуточное соединение ХШ может сочетаться с пивалоил хлоридом, оксалил хлоридом или изопропил хлормуравьиной кислотой в ТГФ в присутствии основания, в частности триэтиламина или Ν-метилморфолина, в результате чего получают смешанные ангидриды либо хлориды кислот, которые затем сочетают с солью лития Х1Уа или Х1УЬ в ТГФ. В хиральном синтезе могут быть также использованы другие вспомогательные хиральные группы, в частности псевдоэфедрин в условиях реакции А. Г. Майерса (1. Ат. Сйет.8ое. 1994, 116, 9361-9362). Воздействие на любой из энантиомеров псевдоэфедрина хлоридами карбоновой кислоты или ангидридами позволяет получить амидопроизводное соединение ХУ. Амиды обрабатывают сильным основанием, например лития диизопропиламидом, в присутствии лития хлорида с последующим добавлением алкилирующего агента, в результате чего получают соответствующие алкилированные продукты. Затем вспомогательная хиральная группа может быть удалена кислотным гидролизом для получения требуемых хиральных соединений.

- 9 017616

Промежуточное соединение XIII может быть получено эфирным гидролизом соединения V с основанием в водно-спиртовом растворе, например ЫОН или ΝαΟΗ в водно-метаноловом растворе.

Процедуры синтеза

Все реакции проводили в инертной атмосфере, если не указано иного. ЯМР-спектры определяли на аппарате Вгикег брх400. ЖХ/МС проводили на аппарате Адйеп! 1100 с использованием колонки ΖΟΡВАХ® 8В-С18, 4,6x75 мм, 3,5 микрона по методу А. Скорость потока в колонке устанавливали равной 1 мл/мин, в качестве растворителей использовали воду и ацетонитрил (0,1% ТФУ) при объеме введения 10 мкл. Длины волн составляли 254 и 210 нм. Анализ хиральной чистоты проводили с помощью хиральных колонок.

Сокращения

Ас	Ацетил
ά	Дублет
дхм	Дихлорметан
дмэ	1,2-диметоксиэтан
ДМФ	Ν,Ν-диметилформамид
дмсо	Диметил сульфоксид
э .и.	Энантиомерный избыток
ЭКЕ .	Эквиваленты

Еб	Этил
ЕЪОАс	Этилацетат
Г	Грамм
ч	Час
13СО	Колоночная хроматография на оборудовании Те1ес1упе 13С0
ВЭЖХ	Высокоэффективная жидкостная хроматография
К_гСОз	Калия карбонат
л	Литр
ЖХ/МС	Жидкостная хроматография/масс- спектрометрия
ЛДА	Лития диизопропиламид
М	Молярная масса
ΪΪΙ	Мультиплет
Ме	Метил
МИН .	Минута
моль	Моль
ЯМР	Ядерно-магнитный резонанс
ч	Квартет
ВУ	Время удержания
3	Синглет
насыщ.	Насыщенный
Ъ	Триплет
ТФУ	Трифторуксусная кислота
ТГФ	Тетрагидрофуран

- 10 017616

Примеры

Пример 1. (В)2-[5-(3,5-Дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота

Рацемический синтез и хиральное разделение.

а) (3,5-бис-Бензилоксифенил)уксусной кислоты метиловый эфир

Смесь (3,5-дигидроксифенил)уксусной кислоты метилового эфира (А1бпс1г 70 г, 0,385 моль), бензил бромида (137 мл, 1,16 моль), калия карбоната (160 г, 1,16 моль) и ДМФ (1,5 л) в атмосфере Ν₂ оставляли на ночь при механическом перемешивании и комнатной температуре. Полученную реакционную смесь выливали в ледяную воду объемом 1,5 л при перемешивании. Осадок отделяли фильтрацией и далее промывали гептаном для удаления бензил бромида, в результате чего получали заявленные соединения (123,7 г) в виде бурого твердого остатка, который оставляли высохнуть при комнатной температуре для следующей реакции. ’Н-ЯМР (СОС1₃): δ 3,60 (с, 2Н), 3,71 (с, 3Н), 5,05 (с, 4Н), 6,60 (с, 3Н), 7,35-7,50 (м, 10Н); рассчитано для С₂₃Н₂₂О₄ (М+Н) 363,15, обнаружено 363.

Ь) 3-(Бензилокси-5-гидроксифенил)уксусной кислоты этиловый эфир

Раствор 3,5-(бис-бензилоксифенил)уксусной кислоты метилового эфира (50 г, 1,38 моль) и ΝαΟΗ (6,6 г, 1,65 моль) в 1 л Е1ОН в присутствии 10% Рб-С гидрировали в качалке Парра до расходования одного эквивалента водорода. Смесь окисляли концентрированной НС1, затем удаляли катализатор и растворитель, в результате чего получали масляный осадок. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией с силикагелем (18СО), используя Е1ОАС-гептан в качестве элюента (градиент 10-75% ЕЮАс), в результате чего получали 25 г (65%-ный выход) заявленного соединения (1Ь). ¹Н-ЯМР (СОС1₃): δ 1,15-1,20 (т, 3Н), 3,4 (с, 2Н), 4,05-4,1 (кв., 2Н), 4,9 (с, 2Н), 5,5 (С, 1Н), 6,4 (с, 2Н), 6,5 (с, 1Н), 7,20-7,35 (м, 5Н); рассчитано для С1₇Н1₈О₄ (М+Н) 287,3, обнаружено 287.

с) (3-Бензилокси-5-трифторметансульфонилоксифенил)уксусной кислоты этиловый эфир

В раствор 3-(бензилокси-5-гидроксифенил)уксусной кислоты этилового эфира (74,4 г, 0,26 моль) в дихлорметане (700 мл) добавляли пиридин (62,5 мл, 0,78 моль). Смесь охлаждали до 0°С. В данный охлажденный раствор добавляли трифторметансульфоновый ангидрид (65,6 мл, 0,39 моль) в течение 1,5 ч, при этом поддерживали внутреннюю температуру ниже 5°С и перемешивали дополнительные 0,5 ч при 0°С. Данную реакционную смесь выливали в смесь 1Ν НС1 (420 мл) и льда с водой (105 г) и перемешивали 0,5 ч. Водный слой экстрагировали дихлорметаном (2x100 мл). Объединенные фракции промывали водой (2x100 мл), насыщенным водным раствором NаНСΟ₃ (2x100 мл) и солевым раствором (2x100 мл). Органическую фракцию (Мд8О₄) высушивали и концентрировали ίη уасио, в результате чего получали красноватую жидкость (108 г), которую передавали на следующую стадию процесса без дополнительной очистки. Рассчитано для С1₈Н₁₇Б₃О₆8 (М+Н) 419,07, обнаружено 419,1.

б) (5-Бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)уксусной кислоты этиловый эфир

Смесь (3-бензилокси-5-трифторметансульфонилоксифенил)уксусной кислоты этилового эфира (108 г, 0,26 моль), 4-(трифторметил)фенилбороновой кислоты (55,6 г, 0,29 моль), 1,2-диметоксиэтана (1,1 л) и водного раствора Ыа₂СО₃ (2 М, 129 мл, 0,26 моль) механически перемешивали в атмосфере Ν₂ при комнатной температуре 10 мин. В данную систему добавляли Рб(Рй₃)₄ (480 мг, 0,42 ммоль) и нагревали до

- 11 017616 рефлюкса (95°С) в течение 2,5 ч. Красно-бурую смесь разбавляли ЕЮАс (0,5 л) и промывали насыщенным водным раствором ЫаНСОз (3x200 мл) и солевым раствором (2x200 мл). Органическую фракцию высушивали (Ка₂8О₄) и концентрировали под вакуумом. Неочищенную смесь очищали колоночной хроматографией 18СО, в результате чего получали (5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)уксусной кислоты этиловый эфир (107 г, 100%). Ή-ЯМР (СОС1₃): δ 1,26 (т, 3Н), 3,66 (с, 2Н), 4,17 (кв., 2Н), 5,12 (с, 2Н), 6,99 (с, 1Н), 7,12 (с, 2Н), 7,34-7,49 (м, 5Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для С₂₄Н₂₁Е₃О₃ (М+Н) 415,14, обнаружено 415,2.

е) 2-(5-Бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпента-4-еновой кислоты этиловый эфир

В раствор соединения 16 (4,9 г, 11,8 ммоль) в ТГФ (50 мл) при -78°С по капле добавляли Εί|Ν(8ίΜο₃)₂| (1Ν в ТГФ, 14,2 мл, 14,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при -78°С, затем по капле добавляли 3-бром-2-метилпропен (1,25 мл, 12,4 ммоль). Раствор медленно нагревали до -35°С и перемешивали при -35°С в течение 0,5 ч. Реакцию гасили насыщенным раствором ΝΠ₄Ο и экстрагировали ЕЮАс. Органические экстракты высушивали (№₂8О₄), концентрировали и очищали колоночной хроматографией, в результате чего получали соединение 1е (5,1 г, 92%) в виде прозрачного масла. ΉЯМР (400 МГц, хлороформ-0) δ частей на миллион 1,19-1,29 (м, 3Н), 1,74 (с, 3Н), 2,47 (м, 1Н), 2,85 (м, 1Н), 3,83 (м, 1Н), 4,11 (м, 2Н), 4,72 (с, 1Н), 4,77 (с, 1Н), 5,12 (с, 2Н), 7,03 (с, 1Н), 7,10 (с, 1Н), 7,15 (с, 1Н), 7,35-7,48 (м, 5Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для С₂₈Н₂₇Г₃О₃ (М+Н) 469,19, обнаружено 469.

1) 2-(5-Гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентановой кислоты этиловый эфир

Смесь соединения 1е (5,1 г, 10,9 ммоль), 10% Р6-С (500 мг) в ЕЮН (50 мл) гидрировали в атмосфере Н₂ (275,8 кПа (40 фунтов на кв. дюйм)) в качалке Парра в течение 20 ч. Полученную реакционную смесь фильтровали через целит, фильтрат концентрировали, в результате чего получали соединение 11 (4,2 г, 100%) в виде прозрачного масла. Ή-ЯМР (300 МГц, хлороформ-0) δ частей на миллион 0,92 (д, 1=6,6 Гц, 6Н), 1,25 (м, 3Н), 1,49-1,61 (м, 1Н), 1,65-1,70 (м, 1Н), 1,95-2,05 (м, 1Н), 3,67 (т, 1=7,7 Гц, 1Н), 4,10-4,29 (м, 2Н), 6,91 (с, 1Н), 6,97 (т, 1=2,0 Гц, 1Н), 7,08 (с, 1Н), 7,65 (с, 4Н); рассчитано для С₂1Н₂₃Г₃О₃(М+Н) 381,16, обнаружено 381.

д) 2-[5-(3,5-Дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота.

В раствор соединения 11 (4 г, 10 ммоль) в ДМФ добавляли цезия карбонат (г, 15 ммоль) и затем 3,5дифторбензилбромид. Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре 18 ч, затем гасили водой. Водный раствор экстрагировали ЕЮАс. Органический слой промывали, высушивали и испаряли, в результате чего получали осадок (5 г). Затем неочищенный продукт оставляли в 1Ν КОН в МеОН (3 экв.) при комнатной температуре на ночь. Раствор окисляли конц. НС1, затем экстрагировали ЕЮАс. Далее органический слой промывали водой, высушивали над №1₂8О₄ и испаряли в роторном испарителе, в результате чего получали неочищенный продукт. Неочищенный продукт растирали с гептаном, в результате чего получали 4,3 г (91%-ный выход) продукта (Я) и (8).

Рацемическую смесь подвергали хиральному разделению в колонке СЫга1рак АО с применением метанола и ацетонитрила, а также 0,1% муравьиной кислоты в качестве элюента, в результате чего получали (Я)-энантиомер, соединение 1, и (8)-энантиомер, соединение 2, соответственно.

При этом обнаружили, что (Я)-энантиомер повернут на -27,29 градуса в МеОН, а (8)-энантиомер повернут на +25,2 градуса в МеОН. Абсолютные стереохимические центры были определены путем кор реляции с нижеописанными синтетическими материалами.

Хиральный синтез (Я) 2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты.

11) (5-Бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)уксусная кислота

- 12 017616

В раствор (5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)уксусной кислоты этилового эфира (120 г, 0,29 моль) в ТГФ (1,2 л) добавляли воду (240 мл), ЫОН-Н^О (16 г, 0,32 моль) и полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 16 ч. Раствор фильтровали и концентрировали под вакуумом для удаления ТГФ. Полученную густую жидкость окисляли до рН 2 добавлением 2Ν водного раствора НС1 и белую суспензию механически перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Влажный белый продукт восстанавливали после фильтрации и растворяли в ЕЮЛс (500 мл). Органический слой отделяли от воды, высушивали (Мд8О4) и концентрировали под вакуумом, в результате чего получали (5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил-уксусную кислоту (105 г, 94%). ¹Н-ЯМР (^6-ДМСО): δ 3,64 (с, 2Н), 5,18 (с, 2Н), 7,02 (с, 1Н), 7,24 (д, 2Н), 7,34-7,50 (м, 5Н), 7,81 (д, 2Н), 7,89 (д, 2Н), 12,25 (ушир.с, 0,6Н); рассчитано для С22Н17Е3О3 (М+Н) 387,11, обнаружено 387,1.

1) 4-Бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)ацетил]оксазолидин-2-он

В механически перемешанный раствор (5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)уксусной кислоты (20 г, 52 ммоль) в ТГФ (104 мл) при -78^ОС добавляли Ν-метила морфолин (ΝΜΜ) (6,3 мл, 57 ммоль) и триметилацетила хлорид (7,0 мл, 57 ммоль), при этом внутреннюю температуру поддерживали ниже -70ОС. Данную смесь перемешивали при -78ОС 15 мин и при 0ОС 1 ч. Белый твердый остаток фильтровали, в результате чего получали ангидрид в фильтрате, который снова охлаждали до -78ОС. В помещенный в отдельную колбу раствор (В)-(+)-4-бензил-2-оксазолидин-она (9,6 г, 54,4 ммоль) в ТГФ (109 мл) при -78ОС добавляли пВиЫ (1,6 М в гексанах, 34 мл, 54,4 моль) по капле, при этом внутреннюю температуру поддерживали ниже -70ОС и перемешивали при -78ОС 45 мин. Данную обогащенную металлом хиральную вспомогательную смесь через канюлю сочетали с ангидридом при -78ОС и нагревали до 0ОС 1,5 ч. Полученную смесь далее перемешивали при 0ОС 30 минут и гасили добавлением избыточного насыщенного водного раствора КЩСк Раствор разбавляли ЕЮЛс (200 мл) и органическую фазу промывали насыщенным водным раствором ЛаНСО3 (3x100 мл) и солевым раствором (2x100мл). Раствор высушивали над Мд8О| и растворитель отсасывали. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией с силикагелем 18СО, в результате чего получали 20,3 г (72%) 4-бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'трифторметилбифенил-3-ил)ацетил]оксазолидин-2-она в виде белого твердого остатка. *Н-ЯМР (СБС^): δ 2,76 (дд, 1Н), 3,26 (дд, 1Н), 4,19 (м, 2Н), 4,35 (кв., 2Н), 4,69 (м, 1Н), 5,13 (с, 2Н), 7,04-7,46 (м, 13Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для Сз2Н26ΕзNО4 (М+Н) 546,18, обнаружено 546,3.

ц) 4-Бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метил-пента-4-еноил]оксазолидин2-он

В бесцветный раствор 4-бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)ацетил]оксазолидин-2-она (6,0 г, 11,00 ммоль) в сухом ТГФ (22 мл) при -78ОС добавляли натрия гексаметилдисилазид (ЛаНМО8) (1М в растворе ТГФ, 12,11 мл, 12,11 ммоль) по капле, при этом внутреннюю температуру поддерживали ниже -75ОС. Полученный красный раствор перемешивали при -78ОС 30 мин. Далее в него добавляли 3-бром-2-метилпропен (4,44 мл, 44 ммоль), при этом температуру поддерживали ниже -75ОС. Незадолго до завершения добавления реакционная смесь приобретала зеленый цвет. В этот момент ванну с сухим льдом быстро заменяли на ванну с ледяной водой и завершали добавление. Реакционную смесь перемешивали при 0ОС дополнительные 30 мин и гасили насыщенным водным раствором ЛНдС1. Систему разбавляли ЕЮЛС (100 мл), органическую фазу промывали насыщенным водным раствором ЛаНСО3 (3x50 мл) и высушивали (Мд8ОД Растворитель отсасывали и неочищенную смесь очищали колоночной хроматографией с силикагелем 18СО, в результате чего получали 4-бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпента-4-еноил]оксазолидин-2-он (6,3 г, 95%). *Н-ЯМР (СБС^): δ 1,80 (с, 3Н), 2,46 (дд, 1Н), 2,75 (дд, 1Н), 3,05 (дд, 1Н), 3,32 (дд, 1Н), 4,08 (м, 2Н), 4,59 (м, 1Н), 4,80 (д, 2Н), 5,13 (с, 2Н), 5,48 (дд, 1Н), 7,11 (д, 2Н), 7,21-7,49 (м, 11Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для С36Н32р3ЛО4 (М+Н) 600,23, обнаружено 600,3.

к) 4-Бензил-3-[2-(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентаноил]оксазолидин-2-он

- 13 017616

СЕз

В раствор 4-бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпента-4-еноил]оксазолидин-2-она (6,7 г, 11,2 ммоль) в МеОН (150 мл) добавляли 10% Ρά-С (670 мг, 10 об.%). Черную суспензию гидрировали при 310,3-310,3 кПа (45-45 фунтов на кв. дюйм) в течение ночи. Смесь фильтровали через целит и растворитель отсасывали, в результате чего получали относительно чистый 4-бензил-3-[2(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентаноил]оксазолидин-2-он (5,4 г, 93%).

’Н-ЯМР (СОС1з): δ 0,94 (д, 3Н), 0,98 (д, 3Н), 1,54 (м, 1Н), 1,74 (м, 1Н), 2,12 (м, 1Н), 2,79 (дд, 1Н), 3,36 (дд, 1Н), 4,11 (м, 2Н), 4,62 (м, 1Н), 5,25 (т, 1Н), 6,97 (м, 2Н), 7,21-7,37 (м, 6Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для С₂₉Н₂₈Е₃ЫО₄ (М+Н) 512,20, обнаружено 512,3.

1) 4-Бензил-3-{2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-он

СЕз

В раствор 4-бензил-3-[2-(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентаноил]оксазолидин-2-она (18,77 г, 36,73 ммоль) в ацетонитриле (184 мл) при 0°С добавляли 1-бромметил-3,5-дифторбензол (7,13 мл, 55,10 ммоль) и С§₂СО₃ (23,94 г, 73,46 ммоль) частями в течение 5 мин. Полученную белую суспензию перемешивали при комнатной температуре 2 ч. Белый твердый остаток фильтровали и растворитель отсасывали, в результате чего получали относительно чистый 4-бензил-3-{2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-он.

т) 2-[5-(3,5-Дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота

В раствор 4-бензил-3-{2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-она (23,40 г, 36,73 ммоль) в ТГФ (180 мл) добавляли воду (60 мл). Систему охлаждали до 0°С. В данный охлажденный раствор добавляли ЫОН-Н₂О (1,54 г, 36,73 ммоль) и 30% Н₂О₂(16,65 мл, 146,92 ммоль) по капле, при этом внутреннюю температуру поддерживали ниже 5°С. Полученный мутноватый раствор перемешивали при 0°С 20 мин. Избыток Н₂О₂ гасили 1,5 М водного раствора №ь8О₃ (97,9 мл, 146,92 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре 15 мин. Органический растворитель отсасывали. Полученную жидкость окисляли до рН 2 добавлением 1 N водного раствора НС1. Водный слой экстрагировали ЕЮАс (3х 200 мл), высушивали над Мд§О₄ и концентрировали под вакуумом, в результате чего получали неочищенную смесь, которую затем очищали колоночной хроматографией с силикагелем ЕСО. в результате чего получали (К)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановую кислоту (12,25 г, 70%). 'Н-ЯМР (СЭС1₃): δ 0,93 (д, 6Н), 1,51 (м, 1Н), 1,72 (м, 1Н), 1,98 (м, 1Н), 3,72 (т, 1Н), 5,09 (с, 2Н), 6,76 (м, 1Н), 6,98 (м, 3Н), 7,07 (т, 1Н), 7,17 (с, 1Н), 7,66 (м, 4Н); рассчитано для С₂₆Н₂₃Е₅О₃ (М+Н) 479,45, обнаружено 479,2.

Пример 2. (8)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота

а) 4-Бензил-3-[2-(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентаноил]оксазолидин-2-он

- 14 017616

Заявленное соединение получали из 4-бензил-3-[2-(5-бензилокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4метилпента-4-ноил]оксазолидин-2-она методом синтеза, описанным в примере 1, части к). 'Н-ЯМР (СИС1₃): δ 0,94 (д, 3Η), 0,98 (д, 3Η), 1,54 (м, 1Н), 1,74 (м, 1Н), 2,12 (м, 1Н), 2,79 (дд, 1Н), 3,36 (дд, 1Н), 4,11 (м, 2Н), 4,62 (м, 1Н), 5,25 (т, 1Н), 6,97 (м, 2Н), 7,21-7,37 (м, 6Н), 7,67 (с, 4Н); рассчитано для ^₉Η₂₈Ρ₃ΝΘ₄ (Μ+Η) 512,20, обнаружено 512,3.

Ь) 4-Бензил-3-{2-[5-(3,5-дифтор-бензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил} оксазолидин-2-он

В раствор 4-бензил-3-[2-(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метилпентаноил]оксазолидин-2-она (0,400 г, 0,78 ммоль) в ацетонитриле (3 мл) при комнатной температуре добавляли 1бромметил-3,5-дифтор-бензол (0,243 г, 1,17 ммоль) и С§₂СО₃ (0,508 г, 1,56 ммоль). Полученную белую суспензию перемешивали 1 ч. Белый твердый остаток фильтровали и растворитель отсасывали, в результате чего получали относительно чистый 4-бензил-3-{2-[5-(3,5-дифтор-бензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-он.

с) 2-[5-(3,5-Дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота

В раствор 4-бензил-3-{2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-она (0,425 г, 0,67 ммоль) в ТГФ (10 мл) добавляли воду (3,5 мл). Систему охлаждали до 0°С. В данный охлажденный раствор добавляли ΕίΟΗ·Η₂Ο (0,028 г, 0,67 ммоль) и 30% Н₂О₂ (304 мл, 2,68 ммоль) по капле, при этом внутреннюю температуру поддерживали ниже 5°С. Полученный мутноватый раствор перемешивали при 0°С 20 мин. Избыток Н₂О₂ гасили 1,5 М водного раствора №ь8О₃(1,79 мл, 2,68 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. Органический растворитель отсасывали. Полученную жидкость окисляли до рН 2 добавлением 1Ν водного раствора ΗС1. Водный слой экстрагировали ЕЮАс (3х 25 мл) и высушивали (Мд8О₄). Смесь концентрировали под вакуумом, в результате чего получали неочищенную смесь, которую далее очищали колоночной хроматографией с силикагелем 18СО, в результате чего получали (8)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановую кислоту (0,295 г, 92%). 'Η-ЯМР (СИС1₃): δ 0,93 (д, 6Н), 1,51 (м, 1Н), 1,72 (м, 1Н), 1,98 (м, 1Н), 3,72 (т, 1Н), 5,09 (с, 2Н), 6,76 (м, 1Н), 6,98 (м, 3Η), 7,07 (т, 1Н), 7,17 (с, 1Н), 7,66 (м, 4Н); рассчитано для С₂6Η₂₃Ε5Ο₃ (Μ+Η) 479,45, обнаружено 479,2.

Пример 3. (Я)-2-[5-(4-Фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота

а) 4-Бензил-3-{2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентаноил}оксазолидин-2-он

- 15 017616

В раствор 4-бензил-3-[2-(5-гидрокси-4'-трифторметилбифенил-3-ил)-4-метиллентаноил]оксазолидин-2-она (полученный способом, описанным в примере 1, части к) (0,400 г, 0,7 8 ммоль) в ацетонитриле (3,9 мл) добавляли 1-бромметил-4-фтор-2-трифторметилбензол (0,181 мл, 1,17 ммоль) и С^СОз (0,508 г, 1,56 ммоль). Полученную белую суспензию перемешивали при комнатной температуре 1 ч. Белый твердый остаток фильтровали и растворитель отсасывали, в результате чего получали относительно чистый 4-бензил-3-{2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметил-бифенил-3-ил]-4-метилпентаноил} оксазолидин-2-он.

Ь) 2-[5-(4-Фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая ки слота

В раствор 4-бензил-3-{2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4метилпентаноил}оксазолидин-2-она (0,535 г, 0,78 ммоль) в ТГФ (9 мл) добавляли воду (3 мл). Систему охлаждали до 0°С. В данный охлажденный раствор добавляли ЫОН-Н^О (33 мг, 0,78 ммоль) и 30% Н2О2 (0,354 мл, 3,12 ммоль), затем перемешивали при 0°С 20 мин. Избыток Н2О2 гасили 1,5 М водного раствора Ыа2§О3 (2,08 мл, 3,12 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. Органический растворитель отсасывали. Полученную жидкость окисляли до рН 2 добавлением 1Ν водного раствора НС1.

Водный слой экстрагировали ЕЮАс (3x50 мл) и высушивали (М§8Од). Смесь концентрировали под вакуумом, в результате чего получали неочищенную смесь, которую далее очищали колоночной хроматографией с силикагелем КСО, в результате чего получали (К)-2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановую кислоту (310 мг). *Н-ЯМР (СБСУ: δ 0,92 (д, 6Н), 1,52 (м, 1Н), 1,71 (м, 1Н), 1,99 (м, 1Н), 3,73 (т, 1Н), 5,27 (с, 2Н), 6,98 (ушир.с, 1Н), 7,06 (ушир.с, 1Н), 7,17 (ушир.с, 1Н), 7,29 (м, 1Н), 7,42 (м, 1Н), 7,68 (м, 5Н); рассчитано для С27Н23Е7О3 (М+Н) 529,46, обнаружено 529,2.

Пример 4. 2-[4'-Хлор-5-(3,5-дифтор-2-бензилокси)-3'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентано вая кислота

Раствор 2М ЛДА в ТГФ-гептанэтилбензоле (21,5 мл, 43,0 ммоль) добавляли по капле в течение 12 мин в перемешанный раствор (3,5-бис-бензилоксифенил)уксусной кислоты метилового эфира (полученный способом, описанным в примере 1, части а) (13,0 г, 35,9 ммоль) в ТГФ (80 мл) при -78°С в азотной атмосфере. Температуру поддерживали ниже -70°С дополнительные 50 мин, затем за один раз добавляли 3-бром-2-метилпропен (4,0 мл, 39,7 ммоль) и реакционную смесь нагревали до 0°С. Через 2 ч смесь концентрировали под вакуумом, разбавляли насыщенным водным раствором N4^1 (100 мл) и экстрагиро

- 16 017616 вали ЕЮАс (100 мл). Органический слой промывали солевым раствором (100 мл), высушивали (Мд§О₄), концентрировали под вакуумом и очищали флеш-хроматографией (двуокись кремния, 0-10% ЕЮАс в петролейном эфире), в результате чего получали заявленное соединение в виде желтого масла (14,1 г, 94%). Ή-ЯМР (400 МГц, СПС1₃): δ 7,42-7,25 (м, 10Н), 6,58 (с, 2 Н), 6,52 (с, 1Н), 5,02 (с, 4Н), 4,74 (с, 1Н), 4,66 (с, 1Н), 3,74 (т, 1Н), 3,64 (с, 3Н), 2,79 (дд, 1Н), 2,38 (дд, 1Н), 1,70 (с, 3Н).

Ь) 2-(3-Бензилокси-5-гидроксифенил)-4-метилпентановой кислоты этиловый эфир

В смесь промежуточного соединения 4а (20 г, 48 ммоль), ЫаОН (2,3 г, 57 ммоль) в ЕЮН (500 мл) добавляли 10% Ρά-С (0,5 г) на активированном угле в атмосфере Ν₂, смесь гидрировали при 275,8 кПа (40 фунтов на кв. дюйм) 30 мин - при этом ЖК/МС показывала, что исходный материал израсходован. Катализатор фильтровали, ЕЮН испаряли. Колоночная хроматография (0-40% ЕЮАс/гептан) показывала 11,8 г (75%-ный выход) бесцветного масла, состоящего из метилового и этилового эфиров и сложного эфира с неослабленными двойными связями. МН⁺ 341 (этиловый эфир с неослабленными двойными связями); 343 (этиловый эфир с ослабленной изопропиловой частью); 327 (метиловый эфир с неослабленными двойными связями).

с) 2-[3-Бензилокси-5-(3,5-дифторбензилокси)фенил]-4-метилпентановой кислоты этиловый эфир

Раствор этилового эфира (смешанного с метиловым эфиром) 4Ь (5 г, 15 ммоль), К₂СО₃ (4,1 г, 30 ммоль) и 3,5-дифторбензилбромида (2,9 мл, 22 ммоль) в ДМФ (70 мл) нагревали до 80°С один час. ДМФ отсасывали и неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (0-30% ЕЮАс/гептан), в результате чего получали 4,5 г продукта (66%-ный выход). МН⁺ 453,1 и другие молекулярные ионы (метиловый эфир и соответствующие олефины).

ά) 2- [3 -(3,5 - Дифторбензилокси)-5-трифторметансульфонилоксифенил]-4-метилпентановой кислоты этиловый эфир

В раствор промежуточного соединения 4с (4,5 г, 10 ммоль) в МеОН (100 мл) добавляли 10% Ρά-С (0,45 г) на активированном угле в атмосфере Ν₂; смесь гидрировали при 137,9 кПа (20 фунтов на кв. дюйм) два часа. Катализатор фильтровали, МеОН испаряли. Колоночная хроматография (0-50% ЕЮАс/гептан) показывала 3,0 г фенола в виде бесцветного масла, который растворяли в 50 мл ДХМ и охлаждали до 0°С. Добавляли пиридин (2 мл, 40 ммоль) и трифторметансульфоновой кислоты ангидрид (2 мл, 12 ммоль).

Раствор перемешивали при 0°С один час перед выливанием в раствор 1Ν НС1 (20 мл), экстрагировали ДХМ (200 мл) и промывали водным раствором №1НС.’О₃/М1С.’1. Слой ДХМ высушивали над Мд₂8О₄и испаряли, в результате чего получали 4,0 г желтого масла (78% за две стадии). МН⁺ 511,2.

е) 2-[4'-хлор-5-(3,5-дифторбензилокси)-3'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты этиловый эфир

Раствор 3-СР₃-4-С1-бензолбороновой кислоты (3,6 г, 16 ммоль), триафлата 4ά (4 г, 7,8 ммоль), (ΡΡ1ι₃).·ιΡά (0,5 г, 0,4 ммоль), К₂СО₃ (2,2 г, 16 ммоль), в толуоле/ЕЮН/Н₂О (20/10/5 мл) помещали в герме

- 17 017616 тичную реакционную пробирку и нагревали до 80°С один час. Затем добавляли ЕЮАс (200 мл) и промывали солевым раствором. Слой ЕЮАс высушивали над Мд₂8О₄ и испаряли. Колоночная хроматография (0-20%/ЕЮАс/гексан) показывала 3,05 г бесцветного масла (74%). МН⁺ 541,3.

ί) 2-[4'-Хлор-5-(3,5-дифтор-2-бензилокси)-3'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановая кислота.

Раствор промежуточного соединения 4е (3 г, 5,5 ммоль), 1Х ХаОН (16 мл) в ТГФ/МеОН (50/50 мл) перемешивали при комнатной температуре один день. Раствор концентрировали и добавляли ЕЮАс (500 мл). После промывания 1Х НС1 и солевым раствором слой ЕЮАс высушивали над Мд₂8О₄ и испаряли. Колоночная хроматография (0-30%/ЕЮАс/гексан) показывала 2,7 г белого твердого остатка (71%). Затем твердый остаток растворяли в ЕЮАс (100 мл), добавляли в 1Х ХаОН (5,26 мл, 5 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре 10 мин. Далее растворитель отсасывали и получали соединение в виде его соли натрия. МН⁺ 513,2 (вершина со слабой связью). 'Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОЭ): δ 0,94 (д, 6Н, 1=6,51 Гц), δ 1,5-1,67 (м, 2Н), δ 1,9-2,0 (м, 1Н), δ 3,67 (т, 1Н, 1=7,85 Гц), δ5,2 (с, 2Н), δ 6,89 (м, 1Н), δ 7,1 (м, 4Н), δ7,27 (с, 1Н), δ 7,68 (д, 1Н, 1=8,42 Гц), δ 7,85 (м, 1Н), δ 7,97 (д, 1Н, 1=2,0 Гц).

Определение воздействия соединений по изобретению на циклооксигеназу-1 и циклооксигеназу-2 (Сох-1, Сох-2)

Ингибирование циклооксигеназы-1 и циклооксигеназы-2 определяли с помощью набора для анализа ингибитора Со1опте!пс Сох, выпускаемого компанией Саутап Сйетка1 Сотрапу, Анн-Арбор, штат Мичиган, США (№ по кат. 760111), в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 1. Изобретения показывает ингибирование <50% при 100 мкМ.

Скрининг соединений по изобретению для модулирования активности γ-секретазы

Скрининг проводили с использованием культуры клеток 8КХВЕ2, содержащих белок АРР695 немутантного типа, выращенной в ЭМЕМ/ХИТ-смеси Р12 (НАМ), выпускаемой компанией С1Ьсо (№ по кат. 31330-38) и содержащей 5% сыворотки/Ре и 1% неосновных аминокислот.

Клетки культивировали практически до конфлюентности.

Скрининг проводили по способу, описанному в Сйгоп е! а1. (1997) Ха!иге МеЛсте 3: 67.

Структура		ЕС50 в анализе клеток ИТАРР Ά542 (мкМ)
Л /	Соединение 1	0,525
Л А О СР_Э	Соединение 2	1,123
к/уСРз Лч.	Соединение 3	0,316
Лег, С1	Соединение 4	0,19

Для сравнения:

- 18 017616 не содержащее ни выбранных значений В¹ и В², ни втор-бутиловой группы, в вышеуказанном анализе клеток \νΤΛΡΡ показало 1С₅₀ 2,5 мкМ.

Демонстрация эффективности ΐη νίνο

Снижающие уровень АЗ42 агенты по изобретению могут быть использованы для лечения БА у млекопитающих, в частности человека, а также эффективны в животных моделях, в частности у мыши, крысы и морской свинки. При этом наличие диагноза БА или генетической предрасположенности к БА у млекопитающего не является обязательным условием - его гены могут быть модифицированы таким образом, при котором в его организме вырабатывается и со временем накапливается избыток АЗ по аналогии с пораженным БА мозгом человека.

Снижающие уровень З42 агенты могут быть введены в любой стандартной форме любым стандартным способом. В частности, снижающие уровень АЗ42 агенты могут иметь форму жидкости, таблетки или капсулы, вводимые перорально либо в инъекциях. Снижающие уровень З42 агенты могут быть введены в любой дозировке, достаточной для существенного уменьшения уровней АЗ42 в крови, плазме крови, сыворотке, спинномозговой жидкости (СМЖ) или мозге.

Для определения эффективности введения значительного количества снижающего уровень АЗ42 агента ίη νίνο используют нетрансгенных грызунов, в частности мышей или крыс. Кроме того, могут быть использованы мыши Тд2576 двух-трехмесячного возраста с экспрессированным белком АРР6 95 шведского варианта или разработанная д-ром Фредом ван Лейвеном (К.и. Йенсен. Бельгия) и коллегами модель трансгенной мыши с нейрон-специфической экспрессией клинически мутантного человеческого белка -предшественника амилоида [У7171] (Моесйагк е! а1., 1999 ί. Βίο1. Сйет. 274, 6483). Молодые трансгенные мыши имеют высокие уровни АЗ в мозге, однако заметные отложения АЗ у них отсутствуют. В возрасте приблизительно 6-8 месяцев у трансгенных мышей начинает проявляться спонтанное прогрессирующее накопление З-амилоида (АЗ) в мозге, в итоге приводящее к образованию амилоидных бляшек в основании гиппокампа, гиппокампе и коре головного мозга. Получающих снижающий уровень АЗ42 агент животных обследуют и сравнивают с особями, не получающими агент или получающими только вспомогательное вещество, при этом уровень растворимого АЗ42 и общий уровень АЗ в мозге определяют стандартными способами, например ИФА. Периоды лечения могут продолжаться несколько часов или дней и корректируются по результатам уменьшения уровня АЗ42, после того как установлена временная шкала проявления эффекта.

Предложенный в настоящем документе типовой протокол для измерения уменьшения уровня АЗ42 ίη νίνο является лишь одной из многочисленных разновидностей методики, предназначенной для эффективного количественного определения АЗ. Например, снижающие уровень АЗ42 соединения в виде свободных кислот или солей натрия могут быть смешаны с 5% 8о1и1о1 в воде или 20% гидроксипропил З циклодекстрина. В данной композиции снижающие уровень АЗ42 агенты вводят в виде однократной пероральной дозы либо любым другим приемлемым способом, например за три-четыре часа до забоя (время определяется эмпирически) и анализа, или же вводятся курсом на протяжении нескольких дней, при этом животных забивают через три-четыре часа после ввода последней дозы.

Мышей подвергают анестезии смесью кеталара (кетамина), ромпуна (2%-ного ксилазина) и атропина (2:1:1) и транскардиальной инфузией физиологического раствора при 4°С вымывают кровь. При заборе собирают кровь. Сбор крови осуществляют через сделанное под анестезией отверстие в сердце в обработанные ЭДТА сосуды. Кровь центрифугируют при 4000 г и 4°С 5 мин, собирают плазму и сверхбыстро замораживают для последующего анализа. Мозг удаляют из черепа, задний мозг отделяют от переднего разрезом в коронарной/фронтальной плоскости. Мозжечок удаляют и сохраняют для количественного анализа уровней испытываемых соединений. Передний мозг разделяют на равные левое и правое полушария сагиттальным разрезом по центру.

Оба полушария немедленно погружают в жидкий азот и хранят при -70°С до гомогенизации для биохимического анализа.

Мозги мышей ресуспендируют в 10 объемах 0,4%-ного ДЭА (диэтиламина)/50 мМ ΝηΟΊ рН 10 (для нетрансгенных животных) или 0,1%-ного СНАР8 в трис-солевом буферном растворе (для трансгенных животных), содержащем ингибиторы протеазы (Восйе-11948699) на грамм ткани, например на 0,158 г мозга добавляют 1,58 мл 0,4%-ного ДЭА. Все образцы разрушают ультразвуком в течение 30 секунд на льду при 30%-ном уровне мощности. Гомогенаты центрифугируют при 355000хг 30 мин. Полученный в результате центрифугирования верхний слой переливают в свежие пробирки для последующей очистки или немедленного анализа.

Полученный верхний слой очищают в колонках обратной фазы ГЛБ νηΧΓ Оаык ^а1егк Согр., Милфорд, штат Массачусетс), чтобы удалить неспецифический иммунореактивный материал из лизатов мозга перед последующим качественным определением АЗ. С помощью вакуумной камеры все растворы пропускают через колонки с приблизительной скоростью 1 мл в минуту, при этом вакуумметрическое давление в течение процедуры поддерживают на соответствующем уровне. Колонки предварительно обрабатывают 1 мл 100%-ного МеОН, затем уравновешивают 1 мл Н2О. Не подвергнутые нейтрализации

- 19 017616 лизаты мозга загружают в колонки. Затем загруженные образцы дважды промывают: первый раз 1 мл 5%-ного МеОН, второй - 1 мл 30%-ного МеОН. В завершение АЗ экстрагируют из колонок в стеклянные пробирки 100x30 мм с раствором 90%-ного МеОН с 2% ΝΗ₄ΟΗ. Далее элюат перемещают в пробирки 1,5 мл и концентрируют в концентраторе 8рееб Уас при высокой температуре 2 ч. Затем концентрированный Αβ ресуспендируют в питательной среде иНгаСиЬТиКЕ Оепега1 Ригроке 8егит-Егее Мебшт (СатЬгех Согр., Уокерсвилл, штат Мэриленд) с добавлением ингибиторов протеазы в соответствии с рекомендацией производителя.

Для количественного определения Λβ42 в растворенной фракции гомогенатов мозга используют имеющиеся в продаже наборы для иммуноферментного анализа (ИФА) (1ппо1ек1® β-амилоид,· _1-42) производства компании 1пподепейс8 И.У., Гент, Бельгия). ИФА Αβ42 в целом проводят в соответствии с протоколом производителя. В течение короткого времени эталон (раствор синтетического Αβ1-42) и образцы подготавливают на 96-луночном планшете с полипропиленовым покрытием, входящим в набор (Иипс-1ттипо Мах18огр, Α/8 Иипс, Дания). Эталонные растворы с окончательными концентрациями 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 и 15,6 пг/мл и образцы подготавливают во входящем в комплект ИФА растворителе для образцов до окончательного объема 60 мкл. Образцы, эталоны и заготовки (50 мкл) добавляют на планшет с антителами к АЗ42 (антитело избирательно распознает С-терминальный конец антигена). Планшет инкубируют в течение ночи при 4°С, в результате чего получают комплекс антитело амилоид. После инкубирования и последующей промывки добавляют селективное антитело к АЗ (биотинилированное антитело, например биотинилированный 408 (Соуапсе Кекеагск Ргобис18, Дедхэм, штат Массачусетс) и инкубируют не менее 1 ч, в результате чего получают комплекс антитело - амилоид антитело. После инкубирования и соответствующей промывки добавляют конъюгат стрептавидин пероксидаза, затем спустя 30 мин добавляют смесь ТМБ/пероксида, в результате чего субстрат преобразовывают в окрашенное вещество. Данную реакцию останавливают добавлением серной кислоты (1М) и измеряют интенсивность цвета путем фотометрии с помощью ИФА-анализатора с 450-нм фильтром. Количество АЗ в образцах определяют сравнением поглощательной способности со стандартной кривой, полученной с синтетическим Αβ1-42. Для анализа также могут быть использованы реагенты Р1егсе 0иап1В1и Е1иогодешс Регох1баке 8иЬк1га1е и Эе1ес1юп при соблюдении инструкций производителя (Р1егсе Согр., Рокфорд, штат Иллинойс).

В данной модели успешным считается снижение уровня АЗ42 хотя бы на 20% по сравнению с животными, не получавшими агент.

Данные ΐη νίνο

Пероральная доза 30 мг/кг во временной точке 4 ч

- 20 017616

Для сравнения:

сг₃ потребовалось введение в дозировке 100 мг/кг 2 р/сут для снижения уровня Άβ42 в плазме у мыши на 40%.

Вышеуказанная спецификация разъясняет лишь общие принципы настоящего изобретения и содержит примеры для иллюстрации, при этом следует понимать, что изобретение включает в себя все типовые вариации, адаптации и/или модификации, включенные в следующие формулы изобретения и их эквиваленты.

Все указанные в вышеприведенной спецификации публикации полностью включаются в настоящий документ путем отсылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы I где В¹ представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

В² представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

В³ представляет собой Е, С1 или СЕ₃;

В⁴ представляет собой Н, Е, С1 или СЕ₃;

или его фармацевтически приемлемые соли.
2. Соединение по п.1, где

В¹ представляет собой Е;

В³ представляет собой СЕ3;

или его фармацевтически приемлемые соли.
3. Соединение по п.2, выбранное из группы, состоящей из (В)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты, (8)-2-[5-(3,5-дифторбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты, 2-[5-(4-фтор-2-трифторметилбензилокси)-4'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты,

2-[4'-хлор-5-(3,5-дифторбензилокси)-3'-трифторметилбифенил-3-ил]-4-метилпентановой кислоты, а также их фармацевтически приемлемых солей.
4. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства.
5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для приготовления лекарственного средства, модулирующего активность γ-секретазы.
6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем образования Άβ42-пептидов.
7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Альцгеймера.
8. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-3 и инертный носитель.
9. Способ лечения млекопитающего путем модулирования активности γ-секретазы, включающий введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
10. Способ лечения млекопитающего от заболевания, связанного с повышенным уровнем образования Αβ42-пептидов у млекопитающего, включающий введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.
11. Способ лечения болезни Альцгеймера у млекопитающего, включающий введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.