CN101861297A - 联苯羧酸及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2007年10月17日提交的美国临时专利申请序列号60/980,587的优先权。上述相关美国专利申请的全部公开内容据此以引用方式并入本文以用于各种目的。
技术领域
本发明涉及由通式I表示的化合物和/或它们的盐或酯，该通式中R1-R4的定义在下文给出。
此外，本发明涉及所述化合物用于治疗阿尔茨海默病的用途及其用于调节γ-分泌酶活性的用途。本专利申请涉及专利申请WO 2006/04555A1中所公开的一类待审化合物的一部分。
发明背景
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退化性疾病，特征为丧失记忆、认知能力和行为稳定性。AD困扰着6％-10％的65岁以上人群，以及高达50％的85岁以上人群。它是导致痴呆的首要原因，并且是继心血管疾病和癌症之后导致死亡的第三大原因。目前还没有针对AD的有效疗法。在美国与AD相关的总费用净额每年超过1000亿美元。
AD的病因并不单一，不过已将其与某些危险因素相关联，包括(1)年龄，(2)家族史，(3)以及头部创伤；其他因素包括环境毒素和低教育水平。边缘和大脑皮层中的特定神经病理学病变包括由过度磷酸化的tau蛋白组成的细胞内神经元纤维缠结，以及β淀粉样肽的原纤维聚集体的细胞外沉积(淀粉样斑块)。淀粉样斑块的主要组分是不同长度的β(A-beta、Abeta或Aβ)淀粉样肽。据信其变体Aβ1-42肽(Abeta-42)为形成淀粉样斑块的主要病原体。另一个变体为Aβ1-40肽(Abeta-40)。β淀粉样肽是前体蛋白、β淀粉样前体蛋白(beta-APP或APP)的蛋白酶解产物。
已将家族性早发型常染色体显性形式的AD与β-淀粉样前体蛋白(β-APP或APP)和早老蛋白1和2中的错义突变关联起来。在一些患者中，迟发型的AD已被关联到载脂蛋白E(ApoE)基因的特定等位基因，并且最近发现的α2-巨球蛋白中的突变可能与至少30％的AD人群有关。尽管存在此异质性，但所有形式的AD均显示出相似的病理学表现。遗传分析已经为AD的合理治疗方法给出了最好线索。所有目前已经发现的突变都会影响称为Abeta肽(Aβ)(尤其是Aβ42)的淀粉样蛋白生成肽的定量或定性产出，并且这些突变为AD的“淀粉样级联假说”(Tanzi and Bertram，2005，Cell 120，545(Tanzi与Bertram，细胞杂志，2005年，第120卷第545页))提供了有力的支持。Aβ肽的产生与AD病理学之间可能存在的关联凸显出需要更好地了解Aβ的产生机制，并且强烈证明了需要在调节Aβ含量方面的治疗方法。
Aβ肽的释放由至少两种蛋白酶解活性进行调节，这两种蛋白酶解活性是指β-分泌酶和γ-分泌酶，分别在Aβ肽的N端(Met-Asp键)和C端(残基37-42)进行切割。在分泌途径中，有证据表明β-分泌酶首先进行切割，导致分泌s-APPβ(sβ)，而保留11kDa的膜结合的羧基端片段(CTF)。据信后者在被γ-分泌酶切割后产生Aβ肽。对于在特定蛋白质(早老蛋白)中携带某些突变的患者，较长的同种型Aβ42的含量呈选择性增加。已将这些突变与早发型家族性阿尔茨海默病相关联。因此，许多研究者认为Aβ42是阿尔茨海默病发病的罪魁祸首。
现已清楚，γ-分泌酶活性不应归于一种特定蛋白，而是事实上与一群不同的蛋白相关。
γ-分泌酶活性存在于多蛋白复合体，该复合体包含至少四种组分：早老蛋白(PS)异型二聚体、nicastrin、aph-1和pen-2。PS异型二聚体由前体蛋白的内切蛋白酶解所产生的氨基和羧基末端PS片段组成。催化部位的两个天冬氨酸盐在此异型二聚体的界面处。最近有人提出nicastrin起到γ-分泌酶底物受体的作用。γ-分泌酶的其他成员的功能还未知，但是它们均为活性所必需(Steiner，2004.Curr.AlzheimerResearch 1(3)：175-181(Steiner，当代阿尔茨海默病研究，2004年，第1卷第3期第175-181页))。
因此，虽然第二切割步骤的分子机制至今仍不明了，但γ-分泌酶复合体已成为寻找阿尔茨海默病治疗化合物的过程中的主要靶标之一。
已提出多种靶向阿尔茨海默病中的γ-分泌酶的策略，包括直接靶向催化部位，开发γ-分泌酶活性的底物特异性抑制剂和调节剂(Marjaux etal.，2004.Drug Discovery Today：Therapeutic Strategies，Volume 1，1-6(Marjaux等人，今日药物开发：治疗策略，2004年，第1卷第1-6页))。因此，有多种以分泌酶作为靶标的化合物已得到描述(Larner，2004.Secretases as therapeutics targets in Alzheimer’s disease：patents 2000-2004.Expert Opin.Ther.Patents 14，1403-1420(Larner，作为阿尔茨海默病中的治疗靶标的分泌酶：专利2000-2004，治疗术专利专家评论，2004年，第14卷第1403-1420页))。
事实上，此发现最近得到了生物化学研究的支持，研究显示了某些非甾体抗炎药(NSAID)对γ-分泌酶的作用(Weggen et al(2001)Nature414，6860，212and WO 01/78721and US 2002/0128319；Morihara et al(2002)J Neurochem.83，1009；Eriksen(2003)J.Clin.Invest.112，440(Weggen等人，自然杂志，2001年，第414卷第6860期第212页以及WO 01/78721和US 2002/0128319；Morihara等人，神经化学杂志，2002年，第83卷第1009页；Eriksen，临床研究杂志，2003年，第112卷第440页))。使用NSAID预防或治疗AD的潜在局限性是它们具有对环加氧酶(Cox)的抑制活性(此活性可以导致不良副作用)以及低中枢神经系统(CNS)渗透性(Peretto et al.，2005，J.Med.Chem.48，5705-5720(Peretto等人，药物化学杂志，2005年，第48卷第5705-5720页))。
因此，强烈需要能调节γ-分泌酶活性，从而为阿尔茨海默病的治疗开辟新途径的新型化合物。
本发明的目的是提供这样的化合物。
发明内容
本发明涉及如式I所示的化合物。
(式I)
其中：
R1为F、Cl或CF3；
R2为F、Cl或CF3；
R3为F、Cl或CF3；
R4为H、F、Cl或CF3；
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
本亚属化合物在效价(potency)和体内效能(efficacy)方面显示了出乎意料的提高。具体地讲，R1和R2为吸电子基团(例如F、Cl，或CF3)时，并且羧酸的α碳被仲丁基取代时，效价和效能出现提高。
具体实施方式
本发明涉及如式I所示的化合物。
(式I)
其中：
R1为F、Cl或CF3；
R2为F、Cl或CF3；
R3为F、Cl或CF3；
R4为H、F、Cl或CF3；
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
在本发明的实施例中：
R1为F；
R2为F、Cl或CF3；
R3为CF3；
R4为H、F、Cl或CF3；
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
本发明的另一个实施例是选自由以下化合物组成的组的化合物：
(R)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
(S)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
2-[4′-氯-5-(3，5-二氟苄氧基)-3′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
本领域技术人员会认识到式I的化合物可以在其结构中具有一个或多个不对称碳原子。意图本发明将化合物的单一对映体形式、外消旋混合物以及存在对映体过量的对映体混合物包括在其范围内。
本发明的一些化合物和/或它们的盐或酯将以不同的立体异构形式存在。所有这些形式均是本发明的主题。
以下所描述的为本文所包括的本发明化合物的示例性盐。以下所指定的不同的盐的列表并不意味着是完整的和限制性的。
含有一个或多个酸性基团的本发明化合物可按照本发明来使用，例如可作为它们的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐来使用。此类盐的更确切例子包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或者与氨或有机胺(例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸)形成的盐。
术语“药用的”是指已被诸如EMEA(欧洲)和/或FDA(美国)的监管机构和/或任何其他国家监管机构批准用于动物、优选地用于人类。
本发明化合物各自的盐可以用常规方法获得，这些方法为本领域技术人员所知，例如通过使这些化合物与有机碱或无机碱在溶剂或分散剂中接触获得，或通过与其他盐进行阳离子交换获得。
此外，本发明包括本发明化合物的所有这样的盐，它们由于生理相容性低而并不正好适合在药物中使用，但它们可以用作(例如)化学反应的中间体或制备可药用的盐的中间体，或者它们可能适于以任何适当的方式(例如任何合适的体外测定法)研究本发明化合物的γ-分泌酶调节活性。
本发明还包括本发明化合物的所有溶剂化物。
本发明还包括本发明化合物的衍生物/前体药物(包括其盐)，这些衍生物/前体药物(包括其盐)包含生理上可耐受的基团和可切割基团，并且在动物中，优选地在哺乳动物中，最优选地在人类中被代谢为本发明化合物。
本发明还包括本发明化合物的代谢物。
术语“代谢物”是指在细胞或生物体中，优选地在哺乳动物中，所有衍生自任何本发明化合物的分子。
优选地，术语“代谢物”是指与在生理条件下在任何此类细胞或生物体中存在的任何分子不同的分子。
通过使用各种适当的方法，本发明化合物的代谢物的结构对于本领域任何技术人员都将是显而易见的。
可以根据文献中公布的方法或以类似的方法制备通式(I)的化合物。
视各个具体情形而定，为了避免在合成通式(I)的化合物过程中出现副反应，有必要或有利的是通过引入保护基团暂时封闭官能团，并在合成后期阶段中对其进行去保护，或者以前体基团的形式引入官能团，并在后期阶段中将它们转化为所需的官能团。适当的合成策略、保护基团和前体基团是本领域技术人员已知的。
如果需要，可以采用常规纯化方法对式(I)的化合物进行纯化，例如重结晶或色谱法。用于制备式(I)的化合物的原料可商购获得，或者可以根据文献所述步骤或类似步骤进行制备。
这些原料可以作为通过本领域技术人员所熟知的一些方法制备本发明的其他化合物的基础。
本发明还涉及用作药物的本发明化合物。这样的化合物如上所定义，且符合药物的定义。下文针对本发明的用途(例如制剂、应用和组合)所描述的实施例也适用于本发明的这个方面。
具体地讲，本发明化合物适用于阿尔茨海默病的治疗。
有关所述用途的详细内容在下文中进一步公开。
该化合物可以用于γ-分泌酶活性的调节。
本文所用的术语“γ-分泌酶活性的调节”是指对γ-分泌酶复合体对APP的加工所产生的作用。优选地，它是指这样一种作用：APP加工的总速率保持基本上如没有应用所述化合物时的总速率，但加工产物的相对数量被改变，更优选地以Aβ42肽的产生量减少的方式改变。例如，可以产生不同的Aβ种类(例如Aβ-38或氨基酸序列较短的其他Aβ肽种类，而不是Aβ-42)，或者产物的相对数量不同(例如，Aβ-40与Aβ-42的比率改变，优选地升高)。
γ-分泌酶活性可以(例如)通过检测APP加工进行测定，例如通过测定生成的Aβ肽种类的含量，最重要的是Aβ-42的含量(参见下文的实例部分)。
之前已证明γ-分泌酶复合体也参与Notch蛋白的加工。Notch是一种信号转导蛋白，其在发育过程中起着决定性的作用(例如SchweisguthF(2004)Curr.Biol.14，R129(Schweisguth F，2004年，当代生物学，第14卷第R129页)中的综述)。
对于所述化合物在治疗中调节γ-分泌酶活性的用途而言，似乎尤其有利的是不干扰γ-分泌酶活性的Notch加工活性，以避免产生可能的不良副作用。
因此，优选不影响γ-分泌酶复合体的Notch加工活性的化合物。
在本发明的涵义内，“对Notch剪切活性的影响”包括Notch加工活性受抑制或活化达某个系数。
如果化合物以30μM的浓度在Shimizu et al(2000)Mol.Cell.Biol，20：6913(Shimizu等人，分子与细胞生物学，2000年，第20卷第6913页)中所述的各个测定中测出，所述系数小于20，优选地小于10，更优选地小于5，最优选地小于2，则该化合物定义为不影响Notch加工活性。
此种γ-分泌酶调节可以(例如)在诸如哺乳动物的动物中进行。示例性哺乳动物为小鼠、大鼠、豚鼠、猴子、狗和猫。该调节也可以在人类中进行。在本发明的具体实施例中，所述调节在体外或细胞培养物中进行。如本领域技术人员所知，有几种体外测定法和细胞培养物测定法可供使用。
可用于通过蛋白印迹分析测定细胞系或转基因动物中C端APP片段的产生的示例性测定法包括(但不限于)Yan et al.，1999，Nature 402，533-537(Yan等人，自然杂志，1999年，第402卷第533-537页)中所描述的那些方法。
体外γ-分泌酶测定法的例子在WO-03/008635中有所描述。在此测定法中，使适当的肽底物与γ-分泌酶制剂接触，然后测定对底物的切割能力。
γ-分泌酶切割的各种产物(Aβ肽)的浓度可以通过本领域技术人员所知的各种方法进行测定。此类方法的例子包括通过质谱法对肽进行测定或通过抗体进行检测。
可用于表征培养细胞介质和生物流体中可溶性Aβ肽谱的示例性测定法包括(但不限于)Wang et al.，1996，J.Biol.Chem.271，31894-31902(Wang等人，生物化学杂志，1996年，第271卷第31894-31902页)中描述的测定法。此测定法融合使用了以特异性抗体进行Aβ肽的免疫沉淀和以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行肽的检测和定量。
可用于通过ELISA测定Aβ-40肽和Aβ-42肽的产生的示例性测定法包括(但不限于)Vassar et al，1999，Science 286，735-741(Vassar等人，科学杂志，1999年，第286卷第735-741页)中所描述的那些方法。更多信息公开于(例如)N.Ida et al.(1996)J.Biol.Chem.271，22908(N.Ida等人，生物化学杂志，1996年，第271卷第22908页)和M.Jensenet al.(2000)Mol.Me d.6，291(M.Jensen等人，分子医学，2000年，第6卷第291页)。适当的抗体可得自(例如)The Genetics Company，Inc.(瑞士)。基于抗体的试剂盒还可得自Innogenetics(比利时)。
可以在此类测定法中使用的细胞包括内源性表达γ-分泌酶复合体的细胞以及瞬时或稳定表达γ-分泌酶复合体的一些或所有相互作用因子(interactor)的转染细胞。适用于此类测定法的许多可用细胞系是技术人员已知的。神经元起源或神经胶质起源的细胞和细胞系尤其适用。此外，还可以使用大脑细胞和组织，及其匀浆和膜制品(Xia et al.，1998，Biochemistry 37，16465-16471(Xia等人，生物化学，1998年，第37卷第16465-16471页))。
可以进行此类测定法来(例如)研究本发明化合物在不同实验条件和配置下的作用。
此外，此类测定法还可以作为对γ-分泌酶复合体的功能研究的一部分来进行。
例如，可以在某些细胞系中表达动物(优选为哺乳动物，更优选为人类)的γ-分泌酶复合体的一种或多种相互作用因子(为野生型形式或带有某些突变和/或修饰)，随后便可研究本发明化合物的作用。
所使用的相互作用因子的突变形式可以是在某些动物(优选为哺乳动物，更优选为人类)中已经描述过的突变形式，也可以是在所述动物中以前还未描述过的突变形式。
γ-分泌酶复合体的相互作用因子的修饰包括所述相互作用因子的任何生理学修饰以及在生物系统中被描述为蛋白质的修饰的其他修饰。
此类修饰的例子包括(但不限于)糖基化、磷酸化、异戊二烯化、十四烷基化和法尼基化。
此外，本发明化合物可以用于制备调节γ-分泌酶活性的药物。
本发明还涉及所述化合物用于制备调节γ-分泌酶活性的药物的用途。
可以通过不同的方式调节γ-分泌酶的活性，即导致产生各种Aβ肽的不同谱图。
优选的是，使用化合物调节γ-分泌酶的活性，导致所产生的Aβ42肽的相对数量减少。
各自的剂量、给药途径、制剂等在下文进一步公开。
本发明还涉及本发明化合物用于治疗与Aβ42产生量提高相关的疾病的用途。伴有Aβ肽产生量提高并沉积于大脑的疾病通常为阿尔茨海默病(AD)、大脑淀粉样血管病、多发梗死性痴呆、拳击员痴呆或唐氏综合症，优选地为AD。
本文所用的术语“治疗”意指所有这样的过程，其中可以是减缓、中断、阻止或遏止疾病的发展，但并不一定表示所有症状的完全消除。
本文所用的术语“Aβ42产生量提高”是指这样一种状况：由于APP加工的总体提高，使Aβ42肽的产率升高，或者优选地是指这样一种状况：由于与野生型APP和非病态情况相比，APP加工谱被修饰，使Aβ42肽的产量提高。
如上文所概述，此类提高的Aβ42含量是发展或罹患阿尔茨海默病的患者的标志。
本发明的化合物或一部分化合物的一个优点可在于它们的中枢神经系统渗透性增强。
此外，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含与惰性载体相混合的本发明化合物。
在一个优选的实施例中，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含与惰性载体相混合的本发明化合物，其中所述的惰性载体为药物载体。
术语“载体”是指据以给予该化合物的稀释剂、助剂、赋形剂或介质。此类药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，包括(但不限于)花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。当药物组合物为口服时，水是优选的载体。当药物组合物为静脉内给予时，盐水和右旋糖水溶液是优选的载体。盐水和右旋糖水溶液以及甘油溶液优选用作注射溶液的液体载体。适当的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇等等。如果需要，组合物也可以包含微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以呈现溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等剂型。组合物可以用传统的粘合剂和载体如三甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准的载体，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适当的药物载体的例子在E.W.Martin所著的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(《Remington的药物科学》)中有所描述。此类组合物将包含治疗有效量的化合物(优选地以纯化的形式)并共混适量的载体，以给患者提供适当的给药形式。制剂应与给药方式相适应。
本发明化合物及其可药用的盐(任选地与其他药用活性化合物组合)适用于治疗或预防阿尔茨海默病或其症状。此类另外的化合物包括认知增强药，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐、他克林、加兰他敏、利伐司替明)、NMDA拮抗剂(例如美金刚)、PDE4抑制剂(例如西洛司特(Ariflo))或本领域技术人员已知的适于治疗或预防阿尔茨海默病的任何其他药物。此类化合物还包括降胆固醇药，例如他汀类药物(例如辛伐他汀)。这些化合物可以单独作为药物、互相混合作为药物或者以药物制剂的形式给予动物，优选为哺乳动物，尤其为人类。
各种递送体系是已知的，可以用于给予本发明的化合物以治疗阿尔茨海默病或调节γ-分泌酶的活性，例如封装在脂质体、微粒和微胶囊中。
如果不直接递送至中枢神经系统(优选为大脑)，有利的是对给药方法进行选择和/或修改，以使得药物化合物能够穿透血脑屏障。
引入方法包括(但不限于)真皮内、肌内、腹膜内、静脉、皮下、鼻内、硬膜外途径以及口服途径。
可以通过任何便利的途径给予化合物，例如通过输注、弹丸式注射、经上皮吸收或经皮肤粘膜内层吸收，还可以连同其他生物活性剂一起给予。
可以全身给予或局部给予。另外，期望的是通过任何适当的途径将本发明的药物组合物引入中枢神经系统，途径包括心室内注射和鞘内注射；可通过例如连接到贮存器(例如奥马耶(Ommaya)贮存器)的心室内导管促进心室内注射。也可以采用肺部给予，例如使用吸入器或喷雾器，以及带有气溶胶化剂的制剂。
在另一个实施例中，化合物可以采用囊泡(具体地讲为脂质体)的形式进行递送(Langer(1990)Science 249，1527(Langer，科学杂志，1990年，第249卷第1527页))。
在又另一个实施例中，化合物可以通过控释体系进行递送。在一个实施例中，可以使用泵(Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14，201；Buchwald et al.(1980)Surgery 88，507；Saudek et al.(1989)N.Engl.J.Med.321，574(Sefton，CRC生物医药工程评论，1987年，第14卷第201页；Buchwald等人，外科杂志，第88卷第507页；Saudek等人，新英格兰医药杂志，1989年，第321卷第574页))。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料(Ranger and Peppas(1983)Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23，61；Levy et al.(1985)Science 228，190；During et al.(1989)Ann.Neurol.25，351；Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71，858(Ranger与Peppas，高分子科学：高分子综述篇，1983年，第23卷第61页；Levy等人，科学杂志，1985年，第228卷第190页；During等人，神经学年鉴，1989年，第25卷第351页；Howard等人，神经外科杂志，1989年，第71卷第858页))。在又另一个实施例中，可以将控释体系放置在治疗靶标(即大脑)近旁，因此仅需要全身性剂量的一小部分(例如Goodson 1984年在Medical Applications of ControlledRelease，Vol.2，115(控制释放的医学应用，第2卷第115页)中所描述)。其他控释体系由Langer在综述(1990，Science 249，1527(科学杂志，1990年，第249卷第1527页))中进行了讨论。
为了选择适当的给药途径，本领域技术人员也会考虑其他已知的抗阿尔茨海默病药物已经选择的给药途径。
例如，安理申/多奈哌齐和康耐视/他克林(均为乙酰胆碱酯酶抑制剂)目前以口服形式服用，Axura/美金刚(NMDA受体拮抗剂)已作为片剂/液体和静脉注射溶液上市。
此外，本领域技术人员还会考虑NSAID家族成员在临床试验中以及在探索它们对阿尔茨海默病的作用的其他研究中的与给药途径有关的可用数据。
为了选择适当的剂量，本领域技术人员会选择这样一种剂量：其在临床前研究和/或临床研究中已经证明为无毒，并可以与预先给定的值相一致，或者可以偏离这些值。
在制剂中要使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病或机能失调的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。然而，静脉给药的适当剂量范围通常为每千克体重约20-500微克的活性化合物。鼻内给药的适当剂量范围通常为约0.01mg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可以从得自体外试验系统或动物模型试验系统的剂量效应曲线推测得到。
示例性动物模型是转基因小鼠品系“Tg2576”，其包含具有双突变KM670/671NL的APP695型。有关参考文献参见(例如)专利US5877399和Hsiao et al.(1996)Science 274，99(Hsiao等人，科学杂志，1996年，第274卷第99页)以及Kawarabayahsi T(2001)J.Neurosci.21，372(Kawarabayahsi T，神经科学杂志，2001年，第21卷第372页)；Frautschyet al.(1998)Am.J.Pathol.152，307(Frautschy等人，美国病理学杂志，1998年，第152卷第307页)；Irizarry et al.(1997)J.Neuropathol.Exp.Neurol.56，965(Irizarry等人，神经病理学期刊，1997年，第56卷第965页)；Lehman et al.(2003)Neurobiol.Aging 24，645(Lehman等人，老化神经生物学杂志，2003年，第24卷第645页)。
来自几个研究的大量资料可以为本领域技术人员所用，这些资料可指导技术人员为选定的治疗方案选择适当的剂量。
已经公布了许多研究，这些研究中描述了分子对γ-分泌酶活性的作用。示例性研究为Lim et al.(2001)Neurobiol.Aging 22，983(Lim等人，老化神经生物学杂志，2001年，第22卷第983页)；Lim et al.(2000)JNeurosci.20，5709(Lim等人，神经科学杂志，2000年，第20卷第5709页)；Weggen et al.(2001)Nature 414，212(Weggen等人，自然杂志，2001年，第414卷第212页)；Eriksen et al.(2003)J Clin Invest.112，440(Eriksen等人，临床研究杂志，2003年，第112卷第440页)；Yan etal.(2003)J Neurosci.23，7504(Yan等人，神经科学杂志，2003年，第23卷第7504页)。
常规合成具体实施方式
以下的一般描述仅用作示例性目的，决非意在限制本发明。
其中R1、R2、R3和R4如式I中所定义的式I化合物(可以通过酯II在标准酸性或碱性水解条件下的水解获得，这些条件包括在室温下与NaOH在适当的溶剂混合物如水、四氢呋喃(THF)和甲醇中反应几个小时。
其中烷基包括甲基和乙基的化合物II，可以通过化合物III与苄基溴、苄基氯、甲苯磺酸苄酯或甲磺酸苄酯在典型苄基化条件下(例如在存在碱如碳酸钾或碳酸铯的二甲基甲酰胺(DMF)或四氢呋喃(THF)中，温度范围25-120摄氏度)的烷基化反应制得。化合物II也可以通过化合物III与苄醇在Mitsnobu条件下(例如在存在偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦的THF或甲苯中)的反应获得。
化合物III可以通过使化合物IV在醇(例如MeOH或EtOH)中在Pd-C存在下进行氢化使其去苄基化来制备。去苄基化也可以采用其他方法实现，例如BBr3在DCM中、NaCN在DMSO/120-200℃中或LiCN在DMF/120-200℃中。
化合物IV可以由化合物V与仲丁基溴或仲丁烯基溴的烷基化反应制备而得。将化合物V在THF或另一种非质子溶剂中用碱(例如双-(三甲基甲硅烷基)氨基锂、双-(三甲基甲硅烷基)氨基钠或二异丙基氨基锂)在-78℃下进行处理，然后通过仲丁基溴或仲丁烯基溴的加成，得到烷基化的化合物IV。
化合物V可以由化合物VI通过与芳基硼酸在Suzuki条件(碳酸钠水溶液，DME中，Pd(PPh3)4存在下)下的偶合反应制备而得。
中间体化合物VI可以由化合物VII与三氟甲磺酸酐在DCM中在一当量吡啶存在下在0℃下反应制备而得。
中间体酚酯VII可以由化合物VIII的单去苄基化制备而得。化合物VIII的选择性单去苄基化可以通过在Parr摇动器中用1.1当量的碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)在乙醇或甲醇溶液中在Pd-C催化剂存在下在氢气氛条件(＜60psi)下处理来实现。让该反应进行到一当量的氢消耗完为止。
中间体VIII可以容易地由3，5-二羟苯基乙酸甲酯(可商购获得)与苄基溴和碳酸钾在DMF中在室温下反应而制备而得。
化合物I在羧基＞α位具有手性中心，可以以二种对映体之一(或其混合物，其中可以存在或不存在对映体过量)的形式存在。示出了对映体Ia(R对映体)和Ib(S对映体)。纯对映体Ia和Ib可通过采用手性柱进行手性分离而获得。对映体Ia和Ib也可以通过拆分进行分离，此拆分由分级重结晶形成手性胺盐来进行。对映体Ia和Ib也可以由相应酯的外消旋物的动力学拆分获得，此动力学拆分是采用脂肪酶(例如AmanoAk、Amano脂肪酶PS、Amano脂肪酶A、Amano脂肪酶M、Amano脂肪酶F-15、Amano脂肪酶G(得自Biocatalytics Inc))在含水有机溶剂(例如含水DMF、DMSO、叔丁基乙基醚或Triton X-100水溶液)中进行。
化合物I的两种对映体都可以通过手性合成来制备。化合物Ia和Ib可以通过用氢氧化锂在含水THF中在过氧化氢存在下将手性辅助基团分别从化合物IXa和IXb中移除而获得。
化合物IXa和IXb可以通过化合物Xa和Xb与苄基溴、苄基氯或甲苯磺酸苄酯或甲磺酸苄酯在典型碱性条件下(例如在DMF或THF中在碱(例如碳酸钾或碳酸铯)存在下，温度范围25-120摄氏度)进行偶合获得。化合物IXa和IXb也可以通过化合物Xa和Xb与苄基醇在Mitsnobu条件下(例如在THF或甲苯中在偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦存在下)的偶合反应获得。
化合物Xa和Xb可以通过化合物XIa和XIb分别进行去苄基化而获得，所述去苄基化是通过在醇溶剂(例如MeOH或EtOH)中在Pd-C存在下进行氢化而实现。
化合物XIa和XIb可以分别通过化合物XIIa和XIIb与仲丁基溴或仲丁烯基溴的烷基化反应制备得到。将化合物XIIa和XIIb在THF或其他非质子溶剂中用碱(例如双-(三甲基甲硅烷基)氨基锂、双-(三甲基甲硅烷基)氨基钠或二异丙基氨基锂)在-78℃下进行处理，然后通过亲电体(仲丁基溴或仲丁烯基溴)的加成，分别得到烷基化的化合物XIa和XIb。
化合物XIIa和XIIb可以由普通中间体XIII通过与4-苄基-噁唑烷酮的R异构体XIVa或4-苄基-噁唑烷酮的S异构体XIVb以Evans法进行偶合制备而得。可使中间体XIII在THF中在碱(例如三乙胺或N-甲基吗啉)存在下与三甲基乙酰氯、乙二酰氯或氯甲酸异丙酯进行反应，得到混合的酸酐或酰基氯，然后使混合的酸酐或酰基氯与XIVa或XIVb的锂盐在THF中进行反应。在手性合成中也可以使用其他手性辅助基团，例如经由A.G.Myers条件(J.Am.Chem.Soc.1994，116，9361-9362(美国化学会会志，1994年，第116卷第9361-9362页))获得的伪麻黄碱。用羧酰氯或羧酸酐处理伪麻黄碱的两种对映体中的任何一个将得到酰胺衍生物XV。用强碱(例如二异丙基氨基锂)在氯化锂存在下处理酰胺，然后通过烷基化剂的加成以产生相应的烷基化产物。然后可以采用酸水解的方式移除手性辅助基团，从而得到手性目标化合物。
中间体化合物XIII可以通过用碱在醇水溶液中，例如用LiOH或NaOH在甲醇水溶液中，将化合物V进行酯水解来获得。
合成工艺
所有的反应均在惰性气氛下进行，除非另有指明。NMR波谱由Bruker dpx400测定获得。方法A的LCMS在安捷伦1100上实施，采用
SB-C18，4.6×75mm，3.5微米色谱柱。色谱柱流速为1ml/min，所用溶剂为水和乙腈(0.1％TFA)，进样体积为10μl。波长为254和210nm。手性纯度分析采用手性色谱柱进行。
缩写
| Ac | 乙酰基 |
| d | 双峰 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DME | 1，2-二甲氧基乙烷 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| DMSO | 二甲亚砜 |
| e.e. | 对映体过量 |
| Ac | 乙酰基 |
| Eq | 当量 |
| Et | 乙基 |
| EtOAc | 乙酸乙酯 |
| g | 克 |
| h | 小时 |
| ISCO | Telydyne ISCO色谱法 |
| HPLC | 高效液相色谱法 |
| K2CO3 | 碳酸钾 |
| l | 升 |
| LCMS | 液相色谱-质谱 |
| LDA | 二异丙基氨基锂 |
| M | 摩尔 |
| m | 多重峰 |
| Me | 甲基 |
| min | 分钟 |
| mol | 摩尔 |
| NMR | 核磁共振 |
| q | 四重峰 |
| RT | 保留时间 |
| s | 单峰 |
| Ac | 乙酰基 |
| sat | 饱和的 |
| t | 三重峰 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| THF | 四氢呋喃 |
实例
实例1
(R)2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
外消旋合成和手性分离
a)(3，5-二苄氧基苯基)-乙酸甲酯
使(3，5-二羟基苯基)-乙酸甲酯(得自Aldrich，70g，0.385摩尔)、苄基溴(137mL，1.16摩尔)、碳酸钾(160g，1.16摩尔)和DMF(1.5L)的混合物在N2中室温下机械搅拌过夜。将所得反应混合物在搅拌下倒入1.5L的冰水混合物中。
过滤获得沉淀，随即使用庚烷对其进行洗涤以去除苄基溴，得到棕色固体形式的标题化合物(123.7g)，将此固体风干后用于下一步反应。1H-NMR(CDCl3)：δ3.60(s，2H)，3.71(s，3H)，5.05(s，4H)，6.60(s，3H)，7.35-7.50(m，10H)；C23H22O4(M+H)的计算值为363.15，测定值为363。
b)(3-苄氧基-5-羟基苯基)-乙酸乙酯
取3，5-二苄氧基苯基)-乙酸甲酯50克(1.38摩尔)与NaOH(6.6g，1.65摩尔)溶于1L的EtOH(存在有10％的Pd-C)中制成溶液，将此溶液置于Parr摇动器中进行氢化，直到一当量的氢消耗完为止。用浓HCl对此混合物进行酸化，然后去除催化剂和溶剂，得到油残留物。粗产物通过ISCO硅胶柱色谱法(ISCO)进行纯化，使用EtOAC-庚烷作为洗脱液(洗脱梯度为10％到75％的EtOAc)，纯化后获得25克(收率为65％)的标题化合物(1b)。1H-NMR(CDCl3)：δ1.15-1.20(t，3H)，3.4-(s，2H)，4.05-4.1(q，2H)，4.9(s，2H)，5.5(s，1H)，6.4(s，2H)，6.5(s，1H)，7.207.35(m，5H)；C17H18O4(M+H)的计算值为287.3，测定值为287。
c)(3-苄氧基-5-三氟甲磺酰氧基-苯基)-乙酸乙酯
将吡啶(62.5mL，0.78mol)加入到3-(苄氧基-5-羟基苯基)-乙酸乙酯(74.4g，0.26mol)的二氯甲烷(700mL)溶液中。将此混合物冷却至0℃。向此冷却溶液中加入三氟甲磺酸酐(65.6mL，0.39mol)，加入时间为1.5h，保持内部温度在5℃以下，再在0℃下搅拌0.5h。将此反应混合物倒入1N HCl(420mL)与湿冰(105g)的混合物中，并搅拌0.5h。用二氯甲烷(2×100mL)萃取水层。将各级分混合，用水(2×100mL)、饱和的NaHCO3水溶液(2×100mL)和盐水(2×100mL)进行洗涤。对有机相进行干燥(MgSO4)，并在真空中浓缩获得微红色液体(108g)，此液体无需进一步纯化就继续进行下一步骤。
C18H17F3O6S(M+H)的计算值为419.07，测量值为419.1。
d)(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸乙酯
机械搅拌(3-苄氧基-5-三氟甲磺酰氧基-苯基)-乙酸乙酯(108g，0.26mol)、4-(三氟甲基)苯基硼酸(55.6g，0.29mol))、1，2-二甲氧基乙烷(1.1L)和Na2CO3水溶液(2M，129mL，0.26mol)的混合物，同时在室温下通入N210min。向此体系中添加Pd(Ph3)4(480mg，0.42mmol)并加热回流(95℃)2.5h。用EtOAc(0.5L)稀释此红棕色混合物，并用饱和的NaHCO3水溶液(3×200mL)和盐水(2×200mL)进行洗涤。干燥(Na2SO4)有机级分，并在真空中浓缩。粗混合物由ISCO柱色谱法进行纯化，以获得(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸乙酯(107g，100％)。
1H-NMR(CDCl3)：
1.26(t，3H)，3.66(s，2H)，4.17(q，2H)，5.12(s，2H)，6.99(s，1H)，7.12(s，2H)，7.34-7.49(m，5H)，7.67(s，4H)；C24H21F3O3(M+H)的计算值为415.14，测量值为415.2。
e)2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯酸乙酯
在-78℃的温度下，向化合物1d(4.9g，11.8毫摩尔)的THF(50mL)溶液中逐滴加入Li[N(SiMe3)2](1N，溶于THF中，14.2mL，14.2毫摩尔)。在-78℃下搅拌反应混合物1h，然后逐滴加入3-溴-2-甲基丙烯(1.25mL，12.4毫摩尔)。将此溶液缓慢加热至-35℃，并在-35℃下搅拌0.5h。用NH4Cl饱和溶液猝灭反应，然后用EtOAc进行萃取。使有机萃取物干燥(Na2SO4)、浓缩，并采用柱色谱法进行纯化，获得透明油状的化合物1e(5.1g，92％)，1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-D)δppm 1.19-1.29(m，3H)，1.74(s，3H)，2.47(m，1H)，2.85(m，1H)，3.83(m，1H)，4.11(m，2H)，4.72(s，1H)，4.77(s，1H)，5.12(s，2H)，7.03(s，1H)，7.10(s，1H)，7.15(s，1H)，7.35-7.48(m，5H)，7.67(s，4H)；C28H27F3O3(M+H)的计算值为469.19，测量值为469。
f)2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酸乙酯
将化合物1e(5.1g，10.9毫摩尔)、Pd/C(500mg)于EtOH(50mL)中的10％溶液的混合物在Parr摇动器中在H2(40psi)下氢化20h。所得反应混合物用硅藻土进行过滤，浓缩滤液获得透明油状的化合物1f(4.2g，100％)，1H NMR(300MHz，CHLOROFORM-D)δppm 0.92(d，J＝6.6Hz，6H)，1.25(m，3H)，1.49-1.61(m，1H)，1.65-1.70(m，1H)，1.95-2.05(m，1H)，3.67(t，J＝7.7Hz，1H)，4.10-4.29(m，2H)，6.91(s，1H)，6.97(t，J＝2.0Hz，1H)，7.08(s，1H)，7.65(s，4H)；C21H23F3O3(M+H)的计算值为381.16，测量值为381。
g)2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
向化合物1f(4g，10毫摩尔)的DMF溶液中加入碳酸铯(4.9g，15毫摩尔)，然后加入3，5-二氟苄基溴。所得溶液在室温下搅拌18h，然后用水进行猝灭。用EtOAc萃取水溶液。洗涤、干燥有机层，并蒸发获得残留物(5g)。然后将该粗品溶于1N KOH的MeOH(3当量)溶液中，在室温下过夜。用浓HCl酸化该溶液，然后用EtOAc进行萃取。然后用水洗涤有机层，用Na2SO4干燥后，于旋转蒸发器上蒸发，获得粗产物。将粗产物用庚烷研磨，得到4.3g(收率91％)的(R)和(S)产物。
外消旋的混合物通过Chiralpak AD色谱柱进行手性分离，采用甲醇和含有0.1％甲酸的乙腈作为洗脱液，手性分离后分别获得(R)对映体(化合物1)和(S)对映体(化合物2)。
测量发现(R)对映体在MeOH中具有-27.29度的旋光度，(S)对映体在MeOH中具有+25.2度的旋光度。绝对立体化学中心通过与以下所述合成材料的对比进行指定。
(R)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸的手性合成
h)5-苄氧基-4’-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸
向(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸乙酯(120g，0.29mol)的THF(1.2L)溶液中加入水(240mL)、LiOH.H2O(16g，0.32mol)，将所得混合物在室温下搅拌16h。过滤该溶液并在真空中浓缩除去THF。加入2N的HCl水溶液，将所得粘稠液体酸化至pH2，然后在室温下机械搅拌此白色悬浮液1h。过滤后，回收潮湿白色产物，然后将其溶解在EtOAc(500mL)中。将有机层与水分离，干燥(MgSO4)并在真空中浓缩，获得(5-苄氧基-4’-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸(105g，94％)。
1H-NMR(d6-DMSO)：δ3.64(s，2H)，5.18(s，2H)，7.02(s，1H)，7.24(d，2H)，7.34-7.50(m，5H)，7.81(d，2H)，7.89(d，2H)，12.25(bs，0.6H)；C22H17F3O3(M+H)的计算值为387.11，测量值为387.1。
i)4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酰基]-噁唑烷-2-
酮
向-78℃下的机械搅拌的(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酸(20g，52mmol)的THF(104mL)溶液中加入N-甲基吗啉(NMM)(6.3mL，57mmol)和三甲基乙酰氯(7.0mL，57mmol)，并保持内部温度在-70℃以下。在-78℃下搅拌此混合物15分钟，然后在0℃下搅拌1h。过滤去除白色固体，获得滤液中的酸酐，将此滤液冷却回-78℃。在单独的烧瓶中，向-78℃温度下的(R)-(+)-4-苄基-2-噁唑烷酮(9.6g，54.4mmol)的THF(109mL)溶液中逐滴加入nBuLi(1.6M，溶于己烷中，34mL，54.4mol)，保持内部温度在-70℃以下，并在-78℃下搅拌45min。将该金属化的手性辅剂通过插管导入到-78℃下的酸酐，然后在1.5h时间里升温到0℃。进一步在0℃下搅拌所得混合物30分钟，通过加入过量的饱和NH4Cl水溶液进行猝灭。用EtOAc(200mL)稀释该溶液，并采用饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)和盐水(2×100mL)洗涤有机相。用MgSO4干燥该溶液，并在真空中除去溶剂。由ISCO硅胶柱色谱法纯化粗料，产出20.3g(72％)白色固体状的4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酰基]-噁唑烷-2-酮。
1H-NMR(CDCl3)：δ2.76(dd，1H)，3.26(dd，1H)，4.19(m，2H)，4.35(q，2H)，4.69(m，1H)，5.13(s，2H)，7.04-7.46(m，13H)，7.67(s，4H)；C32H26F3NO4(M+H)的计算值为546.18，测量值为546.3。
j)4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯酰]-噁
唑烷-2-酮
向-78℃温度下的4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-乙酰基]-噁唑烷-2-酮(6.0g，11.00mmol)于干燥THF(22mL)中的无色溶液逐滴加入六甲基二硅基氨基钠(NaHMDS)(1M，THF溶液，12.11mL，12.11mmol)，保持内部温度在-75℃以下。在-78℃下搅拌所得红色溶液30分钟。向此溶液中加入3-溴-2-甲基丙烯(4.44mL，44mmol)，保持温度在-75℃以下。当加成反应接近完成时，反应混合物将变成绿色。此时，迅速移去干冰浴，并更换为冰水浴，加成反应完成。再在0℃下搅拌反应混合物30min，用饱和NH4Cl水溶液进行猝灭。用EtOAC(100mL)稀释该体系，使用饱和NaHCO3水溶液(3×50mL)洗涤有机相，并对有机相进行干燥(MgSO4)。在真空中除去溶剂，用ISCO硅胶柱对粗混合物进行纯化，获得4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯酰]-噁唑烷-2-酮(6.3g，95％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ1.80(s，3H)，2.46(dd，1H)，2.75(dd，1H)，3.05(dd，1H)，3.32(dd，1H)，4.08(m，2H)，4.59(m，1H)，4.80(d，2H)，5.13(s，2H)，5.48(dd，1H)，7.11(d，2H)，7.21-7.49(m，11H)，7.67(s，4H)；C36H32F3NO4(M+H)的计算值为600.23，测量值为600.3。
k)4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷
-2-酮
向4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯酰]-噁唑烷-2-酮(6.7g，11.2mmol)的MeOH(150mL)溶液中加入10％Pd/C(670mg，10重量％)。此黑色悬浮液在45-45psi压力下氢化过夜。使用硅藻土过滤该混合物，并在真空中除去溶剂，获得相对较纯的4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷-2-酮(5.4g，93％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ0.94(d，3H)，0.98(d，3H)，1.54(m，1H)，1.74(m，1H)，2.12(m，1H)，2.79(dd，1H)，3.36(dd，1H)，4.11(m，2H)，4.62(m，1H)，5.25(t，1H)，6.97(m，2H)，7.21-7.37(m，6H)，7.67(s，4H)；C29H28F3NO4(M+H)的计算值为512.20，测量值为512.3。
l)4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊
酰基}-噁唑烷-2-酮
在5分钟内，向0℃下的4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷-2-酮(18.77g，36.73mmol)的乙腈(184mL)溶液中分批加入1-溴甲基-3，5-二氟代苯(7.13mL，55.10mmol)和Cs2CO3(23.94g，73.46mmol)。在室温下搅拌所得白色悬浮液2h。过滤去除白色固体，并在真空中除去溶剂，获得相对较纯的4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮。
m)2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
向4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮(23.40g，36.73mmol)的THF(180mL)溶液中加入水(60mL)。将此体系冷却至0℃。向此冷却溶液中逐滴加入LiOH.H2O(1.54g，36.73mmol)和30％H2O2(16.65mL，146.92mmol)，保持内部温度在5℃以下。在0℃下，搅拌所得浑浊溶液20min。加入1.5M的Na2SO3水溶液(97.9mL，146.92mmol)猝灭过量的H2O2，然后在室温下搅拌15min。在真空中去除有机溶剂。加入1N的HCl水溶液，将所得液体酸化至pH2。用EtOAc(3×200mL)萃取水层，通过MgSO4干燥，并在真空中浓缩，获得粗混合物，该粗混合物由ISCO硅胶柱色谱法进行纯化，产得(R)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸(12.25g，70％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ0.93(d，6H)，1.51(m，1H)，1.72(m，1H)，1.98(m，1H)，3.72(t，1H)，5.09(s，2H)，6.76(m，1H)，6.98(m，3H)，7.07(t，1H)，7.17(s，1H)，7.66(m，4H)；C26H23F5O3(M+H)的计算值为479.45，测量值为479.2。
实例2
(S)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
a)4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷
-2-酮
标题化合物由4-苄基-3-[2-(5-苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基-4-戊烯酰]-噁唑烷-2-酮按照与实例1中(k)部分相同的合成工艺制备而得。0.94
1H-NMR(CDCl3)：δ0.94(d，3H)，0.98(d，3H)，1.54(m，1H)，1.74(m，1H)，2.12(m，1H)，2.79(dd，1H)，3.36(dd，1H)，4.11(m，2H)，4.62(m，1H)，5.25(t，1H)，6.97(m，2H)，7.21-7.37(m，6H)，7.67(s，4H)；C29H28F3NO4(M+H)的计算值为512.20，测量值为512.3。
b)4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊
酰基}-噁唑烷-2-酮
向室温下的4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷-2-酮(0.400g，0.78mmol)的乙腈(3mL)溶液中加入1-溴甲基-3，5-二氟代苯(0.243g，1.17mmol)和Cs2CO3(0.508g，1.56mmol)。搅拌所得白色悬浮液1h。过滤去除白色固体，并在真空中除去溶剂，获得相对较纯的4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮。
c)2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
向4-苄基-3-{2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮(0.425g，0.67mmol)的THF(10mL)溶液中加入水(3.5mL)。将该体系冷却至0℃。向此冷却溶液中逐滴加入LiOH.H2O(0.028g，0.67mmol)和30％H2O2(304mL，2.68mmol)，保持内部温度在5℃以下。在0℃下，搅拌所得浑浊溶液20min。加入1.5M的Na2SO3水溶液(1.79mL，2.68mmol)猝灭过量的H2O2，然后在室温下搅拌5min。在真空中中去除有机溶剂。加入1N的HCl水溶液，将所得液体酸化至pH2。用EtOAc(3×25mL)萃取水层，并将其干燥(MgSO4)。在真空中浓缩该混合物以获得粗混合物，该粗混合物由ISCO硅胶柱色谱法进行纯化，产得(S)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸(0.295g，92％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ0.93(d，6H)，1.51(m，1H)，1.72(m，1H)，1.98(m，1H)，3.72(t，1H)，5.09(s，2H)，6.76(m，1H)，6.98(m，3H)，7.07(t，1H)，7.17(s，1H)，7.66(m，4H)；C26H23F5O3(M+H)的计算值为479.45，测量值为479.2。
实例3
(R)-2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊
酸
a)4-苄基-3-{2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-
基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮
向4-苄基-3-[2-(5-羟基-4′-三氟甲基联苯-3-基)-4-甲基戊酰基]-噁唑烷-2-酮(如实例1的(k)步骤中所制备)(0.400g，0.78mmol)的乙腈(3.9mL)溶液中加入1-溴甲基-4-氟-2-三氟甲基苯(0.181mL，1.17mmol)和Cs2CO3(0.508g，1.56mmol)。在室温下搅拌所得白色悬浮液1h。过滤去除白色固体，并在真空中除去溶剂，获得相对较纯的4-苄基-3-{2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮。
b)2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
向4-苄基-3-{2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酰基}-噁唑烷-2-酮(0.535g，0.78mmol)的THF(9mL)溶液中加入水(3mL)。将此体系冷却至0℃。向此冷却溶液中加入LiOH.H2O(33mg，0.78mmol)和30％H2O2(0.354mL，3.12mmol)，并在0℃下搅拌20min。加入1.5M的Na2SO3水溶液(2.08mL，3.12mmol)猝灭过量的H2O2，然后在室温下搅拌5min。在真空中去除有机溶剂。加入1N的HCl水溶液，将所得液体酸化至pH2。用EtOAc(3×50mL)萃取水层，并将其干燥(MgSO4)。在真空中浓缩此混合物以获得粗混合物，该粗混合物由ISCO硅胶柱色谱法进行纯化，产得(R)-2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸(310mg)。
1H-NMR(CDCl3)：δ0.92(d，6H)，1.52(m，1H)，1.71(m，1H)，1.99(m，1H)，3.73(t，1H)，5.27(s，2H)，6.98(bs，1H)，7.06(bs，1H)，7.17(bs，1H)，7.29(m，1H)，7.42(m，1H)，7.68(m，5H)；C27H23F7O3(M+H)的计算值为529.46，测量值为529.2。
实例4
2-[4′-氯-5-(3，5-二氟-2-苄氧基)-3′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
a)2-(3，5-双苄氧基苯基)-4-甲基-4-戊烯酸甲酯
在-78℃下，在氮气氛中，在12min内，向LDA于THF-庚烷-乙苯(21.5mL，43.0mmol)中的2M溶液中逐滴加入搅拌下的(3，5-双苄氧基苯基)乙酸甲酯(已在实例1的步骤(a)中制备)(13.0g，35.9mmol)于THF(80mL)中的溶液。将温度保持在-70℃以下再持续50min，然后一次加入3-溴-2-甲基丙烯(4.0mL，39.7mmol)，并将反应混合物升温至0℃。2h后，在真空中浓缩该混合物，用饱和的NH4Cl水溶液(100mL)进行稀释，并用EtOAc(100mL)萃取。用盐水(100mL)洗涤有机层，并将其干燥(MgSO4)，在真空中浓缩，然后采用快速色谱法(二氧化硅，0-10％EtOAc的石油醚溶液)进行纯化，得到黄色油状的标题产物(14.1g，94％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.42-7.25(m，10H)，6.58(s，2H)，6.52(s，1H)，5.02(s，4H)，4.74(s，1H)，4.66(s，1H)，3.74(t，1H)，3.64(s，3H)，2.79(dd，1H)，2.38(dd，1H)，1.70(s，3H)。
b)2-(3-苄氧基-5-羟基苯基)-4-甲基戊酸乙酯
在N2下，向中间体4a(20g，48mmol)、NaOH(2.3g，57mmol)于EtOH(500mL)中的混合物加入0.5g Pd-C(10％担载在活性炭上)，使该混合物在40psi压力下氢化30min，此时LC/MS指示原料已消耗完。滤出催化剂并蒸发EtOH。通过柱色谱法(0-40％EtOAc/庚烷)得到了11.8g(收率75％)的无色油状物，为甲酯和乙酯以及未还原双键酯的混合物。MH+341(具有未还原双键的乙酯)；343(具有还原的异丙基支链的乙酯)；327(具有未还原双键的甲酯)。
c)2-[3-苄氧基-5-(3，5-二氟苄氧基)-苯基]-4-甲基戊酸乙酯
将乙酯(与甲酯混合)4b(5g，15mmol)、K2CO3(4.1g，30mmol)和3，5-二氟苄基溴(2.9mL，22mmol)于DMF(70mL)中的溶液加热至80℃，保持一小时。由真空除去DMF，所得粗产物由柱色谱法(0-30％EtOAc/庚烷)进行纯化，获得4.5g产物(收率66％)。MH+453.1和其他分子离子(甲酯以及相应的烯烃)。
d)2-[3-(3，5-二氟苄氧基)-5-三氟甲磺酰氧基-苯基]-4-甲基戊酸乙酯
在N2下，向中间体4c(4.5g，10mmol)的MeOH(100mL)溶液中加入0.45g Pd-C(10％担载在活性炭上)，使该混合物在20psi的压力下进行氢化2小时。滤出催化剂，并蒸发掉MeOH。通过柱色谱法(0-50％EtOAc/庚烷)得到了3.0g无色油状的苯酚，将其溶解于50mL的DCM中，并冷却至0℃。加入吡啶(2mL，40mmol)和三氟甲磺酸酐(2mL，12mmol)。在0℃下搅拌此溶液一小时，然后将其倒入1N HCl溶液中(20mL)，用DCM(200mL)萃取，并用NaHCO3/NaCl水溶液洗涤。将DCM层用Mg2SO4干燥并蒸发，获得4.0g黄色油状物(两个步骤收率78％)。MH+511.2
e)2-[4′-氯-5-(3，5-二氟苄氧基)-3′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸乙
酯
将3-CF3-4-Cl-苯硼酸(3.6g，16mmol)、三氟甲磺酸盐4d(4g，7.8mmol)、(PPh3)4Pd(0.5g，0.4mmol)、K2CO3(2.2g，16mmol)溶于甲苯/EtOH/H2O(20/10/5mL)中制成溶液，将此溶液置于密封的反应管中，并加热至80℃，保持一小时。加入EtOAc(200mL)并用盐水洗涤。将EtOAc层用Mg2SO4干燥并蒸发。使用柱色谱法(0-20％/EtOAc/己烷)获得3.05g无色油状物(74％)。MH+541.3
f)2-[4′-氯-5-(3，5-二氟-2-苄氧基)-3′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸
将中间体4e(3g，5.5mmol)、1N NaOH(16mL)溶于THF/MeOH(50/50mL)中制成溶液，在室温下搅拌此溶液一天。浓缩该溶液，然后加入EtOAc(500mL)。用1N HCl和盐水洗涤之后，将EtOAc层用Mg2SO4干燥并蒸发。通过柱色谱法(0-30％/EtOAc/己烷)获得2.7g白色固体(71％)。随后将此固体溶解于EtOAc(100mL)中，并加入到1NNaOH(5.26mL，5mmol)中，在室温下搅拌10min。然后真空除去溶剂，获得钠盐形式的化合物。MH+513.2(弱峰)。1H NMR(300MHz，CD3OD)：δ0.94(d，6H，J＝6.51Hz)，δ1.5-1.67(m，2H)，δ1.9-2.0(m，1H)，δ3.67(t，1H，J＝7.85Hz)，δ5.2(s，2H)，δ6.89(m，1H)，δ7.1(m，4H)，δ7.27(s，1H)，δ7.68(d，1H，J＝8.42Hz)，δ7.85(m，1H)，δ7.97(d，1H，J＝2.0Hz)。
本发明化合物对环加氧酶-1和环加氧酶-2(Cox-1、CoX-2)的作用 的测定。
采用Cayman Chemical Company(Ann Arbor，MI，USA.)提供的环加氧酶抑制剂比色筛选分析法(商品目录号760111)，按照制造商说明书测定对Cox-1和Cox-2的抑制作用。
本发明的实例1在100μM下显示出＜50％的抑制作用。
本发明化合物的γ-分泌酶调节活性的筛选
采用生长于DMEM/NUT-mix F12(HAM)中的携带有野生型APP695的SKNBE2细胞实施筛选，其中DMEM/NUT-mix F12(HAM)由Gibco提供(商品目录号31330-38)，其含有5％血清/Fe，补充有1％的非必需氨基酸。
细胞生长至接近铺满状态。
采用如Citron et al(1997)Nature Medicine 3：67(Citron等人，自然医学杂志，1997年，第3卷第67页)中所描述的测定法进行筛选。
比较起来，
(其特征既没有选定的R1值和R2值，也没有仲丁基)在上述WTAPP细胞测定中显示出2.5μM的IC50。
体内效能的证明
本发明的Aβ42降低剂可以用于治疗哺乳动物(例如人类)的AD，或者在动物模型(例如(但不限于)小鼠、大鼠或豚鼠)中显示效能。该哺乳动物可能没有诊断出患有AD，或可能不具有AD的遗传倾向，但是可以进行转基因，使得其以类似于患有AD的人类所表现出的方式过度生产并最终沉积Aβ。
可以通过使用任何标准方法，将Aβ42降低剂以任何标准形式给予。例如(但不限于)，Aβ42降低剂可以采用以口服或注射方式给予的液体、片剂或胶囊剂等剂型。Aβ42降低剂可以采用足以使血液、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)或大脑中Aβ42含量显著降低的任何剂量进行给予。
为确定Aβ42降低的急性给予是否会降低体内的Aβ42含量，采用了非转基因的啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。或者，可以使用两到三个月大的Tg2576小鼠，此小鼠表达含有“Swedish”变体的APP695，或者使用由Fred Van Leuven博士(K.U.Leuven，比利时)及其同事建立的转基因小鼠模型，此模型具有人类淀粉样前体蛋白的临床突变型[V717I]的神经元特异性表达(Moechars et al.，1999J.Biol.Chem.274，6483(Moechars等人，生物化学杂志，1999年，第274卷第6483页))。幼龄转基因小鼠大脑中具有高含量的Aβ，但没有可检测的Aβ沉积。在大约6-8月龄时，转基因小鼠的大脑中开始呈现出自发的、进行性β-淀粉样(Aβ)累积，最终在下托区、海马体和皮质中生成淀粉样斑块。将对用Aβ42降低剂治疗的动物进行检查，并与未治疗的动物或使用介质治疗的动物进行比较，采用标准技术(例如，使用ELISA法)对大脑中可溶性Aβ42和总Aβ的含量进行定量。治疗周期可以从几小时到几天不等，一旦可以确立开始起作用的时间进程，将根据Aβ42降低的结果调整治疗周期。
文中显示了体内测定Aβ42降低的典型方案，但这仅是可以用于优化可检测的Aβ的含量的多种变型中的一种。例如，将游离酸或钠盐形式的降Aβ42的化合物配制于5％solutol水溶液，或20％的羟丙基β环糊精。在(例如)处死动物(由经验确定)进行分析前三到四小时，将Aβ42降低剂作为单一口服剂量给予或者通过任何可接受的给药途径给予，或作为另外一种选择，可以在数天的疗程中给药，并在给予最终剂量三到四小时后处死动物。
用氯胺酮(克他命)、隆朋(安耐宁2％)和阿托品的混合物(2∶1∶1)麻醉小鼠，并使用生理血清在4℃经心脏灌注。在处死时收集血液。在麻醉期间用EDTA处理过的收集管通过心穿刺术进行血液收集。使血液在4℃、4000g条件下离心5分钟，回收血浆，然后将其快速冻结，用于后续分析。将大脑从脑壳中取出，并在冠/额状面上剖切分离前脑和后脑。取出小脑并保留用于试验化合物含量的定量分析。通过正中矢状面剖切将前脑均匀地分成左半球和右半球。
立即将两个半球浸入液氮中并在-70℃保存，直到均化用于生物化学检测分析。
将小鼠大脑重悬于10体积的含蛋白酶抑制剂(Roche-11948699)的0.4％DEA(二乙胺)/50mM NaCl pH10(用于非转基因动物)中或0.1％CHAPS的TBS溶液(用于转基因动物)中，其中所述体积按组织克数计算，例如对于0.158g大脑而言，加入1.58ml的0.4％DEA。所有样品在冰上以30％的功率输出超声处理30秒钟。使匀浆在355,000×g下离心30min。随后将所得高速上清液转移至新管中，用于后续的纯化或立即进行检测分析。
所得上清液用Water Oasis HLB反相柱(Waters Corp.(Milford，MA))进行纯化，以便在后续的Aβ检测前，将非特异免疫反应性物质从大脑溶解物中去除。采用真空歧管使所有溶液以每分钟大约1mL的速度通过柱，因此在整个过程中真空压应相应地进行调节。用1mL的100％MeOH对柱进行预调理，然后用1mL的H2O进行平衡。将非中和的大脑溶解物加载到柱上。然后使用1mL的5％MeOH对加载的样品进行两次第一冲洗，再用1mL的30％MeOH进行第二冲洗。最后，用90％MeOH与2％NH4OH相配的溶液将Aβ从柱上洗脱到100×30mm的玻璃管中。然后将洗脱液转移至1.5mL管中，并在加速真空浓缩器(speed-vacconcentrator)中以高温浓缩约2小时。然后将浓缩的Aβ重悬于UltraCULTURE通用无血清培养基(Cambrex Corp.(Walkersville，MD))中，培养基中有根据制造商的建议加入的蛋白酶抑制剂。
使用商购的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(
β-淀粉样肽(1-42)(
β-Amyloid(1-42))，Innogenetics N.V.(Ghent，Belgium比利时))，对大脑匀浆的可溶部分中Aβ42的数量进行定量。基本上根据制造商的方案进行Aβ42ELISA。简单地说，在随试剂盒一起提供的96-孔聚丙烯预涂布板(Nunc-Immuno MaxiSorp，A/S Nunc(Denmark丹麦))上制备标准品(合成Aβ1-42的稀释液)和样品。最终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6pg/ml的标准品稀释液以及样品在样品稀释剂(随ELISA试剂盒一起提供)中制备，最终体积为60μl。将样品、标准品和空白(50μl)加入到抗Aβ42涂布板上(捕捉抗体能选择性识别抗原的C端)。可使板在4℃中温育过夜，以便形成抗体-淀粉样肽复合体。在此温育步骤和后续的洗涤步骤之后，加入选择性抗Aβ抗体缀合物(生物素酰化的检测抗体，例如生物素酰化的4G8(Covance ResearchProducts(Dedham，MA)))并温育最少1小时，以使得形成抗体-淀粉样肽-抗体复合物。在温育步骤和适当的洗涤步骤之后，加入链霉亲和素-过氧化物酶缀合物，30分钟后加入TMB/过氧化物混合物，使得底物转化成有色产物。加入硫酸(1M)终止该反应，然后使用带有450nm滤光片的酶标仪(ELISA-reader)通过光度测定法测定颜色强度。通过将吸光度与用合成的Aβ1-42所作标准曲线进行对比，对样品中Aβ的含量进行定量。或者，可以根据制造商说明书(Pierce Corp.(Rockford，Il))，使用PierceQuantBlu过氧化物酶荧光底物和检测试剂(Pierce QuantBlu FluorogenicPeroxidase Substrate and Detection reagents)进行检测。
与未治疗的动物相比，在此类模型中Aβ42降低至少20％将是有利的。
体内数据
在第4小时时间点口服30mg/kg
比较起来，
需要服用100mg/kg(每日2次)的剂量，才能将小鼠体内的Aβ42血浆含量降低40％。
虽然上述说明书以提供实例用于说明目的方式教示了本发明的原理，但应当理解本发明的实施涵盖了落入如下权利要求和它们的等同物范围内的所有常见变型形式、修改和/或修饰形式。
在上述说明书中所公开的所有出版物据此以引用方式全文并入本文。
Claims (14)
1.式I的化合物：
(式I)
其中：
R1为F、Cl或CF3；
R2为F、Cl或CF3；
R3为F、Cl或CF3；
R4为H、F、Cl或CF3；
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R1为F；
R3为CF3；
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
3.根据权利要求2所述的化合物，其选自由以下化合物组成的组：
(R)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
(S)-2-[5-(3，5-二氟苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
2-[5-(4-氟-2-三氟甲基苄氧基)-4′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
2-[4′-氯-5-(3，5-二氟苄氧基)-3′-三氟甲基联苯-3-基]-4-甲基戊酸、
及其溶剂化物、水合物、酯和可药用的盐。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物，其用作药物。
5.根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物用于制备调节γ-分泌酶的药物的用途。
6.根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物用于制备治疗与Aβ42产生量提高相关的疾病的药物的用途。
7.根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物的用途。
8.药物组合物，其包含与惰性载体相混合的根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物。
9.制备药物的方法，其包括以下步骤：
a)制备根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物；以及
b)配制包含所述化合物的药物。
10.治疗哺乳动物以调节γ-分泌酶的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物给予所述哺乳动物。
11.治疗哺乳动物中与Aβ42产生量提高相关的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物给予所述哺乳动物。
12.治疗哺乳动物中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至3中任何一项所述的化合物给予所述哺乳动物。
13.根据权利要求1所述的化合物，其为基本上纯的碱。
14.根据权利要求1所述的化合物，其为分离的形式。
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