EA016734B1

EA016734B1 - СРЕДСТВА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОДУЦИРОВАНИЯ IgA НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS AMYLOVORUS И ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS AMYLOVORUS CP1750 FERM BP-10532

Info

Publication number: EA016734B1
Application number: EA200970614A
Authority: EA
Inventors: Сатоси Хатимура; Хироки Канзато; Сигеру Фудзивара
Original assignee: Калпис Ко., Лтд.
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2012-07-30
Also published as: NZ577767A; CA2673235A1; US8226937B2; CN101668534B; EP2123291A1; EP2123291A4; US20100247575A1; WO2008075685A1; US20110300118A1; EA200970614A1; AU2007335423B2; MX2009006887A; AU2007335423A1; EP2123291B1; AU2007335423A2; KR20090092315A; CN101668534A; JPWO2008075685A1

Abstract

Изобретение относится к бактериям Lactobacillus, которые усиливают функционирование Пейеровых бляшек и стимулируют продуцирование IgA и которые обладают свойствами локализоваться в кишечнике человека, а также к средству для стимуляции продуцирования IgA. В частности, настоящее изобретение относится к средству для стимуляции продуцирования IgA, включающему Lactobacillus amylovorus, особенно Lactobacillus amylovorus CP1750 (FERM BP-10532), в качестве активного ингредиента.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к средству для стимуляции продуцирования 1дА. Конкретно, настоящее изобретение относится к средству для стимуляции продуцирования 1дА, которое эффективно функционирует в кишечнике.

Предшествующий уровень техники

1дА известны как молекулы, присутствующие в слюне, кишечнике, трахее и т.п., которые имеют важное значение в усилении защитных функций слизистой оболочки, таких как блокирование микроорганизмов и аллергенов, проникающих внутрь через слизистую оболочку, такую как слизистая оболочка полости рта или кишечника или им подобная. Дополнительно, 1дА защищает иммунологически незрелый организм новорожденных и хорошо известно, что 1дА из материнского молока используется для иммунологической компенсации в качестве пассивного иммунитета.

С другой стороны, что касается иммуномодуляторных функций молочно-кислых бактерий, за последнее время было несколько сообщений и информация о механизмах и различиях между видами или штаммами, выявляемыми все чаще (Те1зир Нпо1а: №\ν Ροοά 1пбизйу, νοί. 32, Νο. 10, р. 9 (1990)). Однако в данных сообщениях были охвачены не все иммуномодуляторные функции и были обсуждены не все виды молочно-кислых бактерий. Таким образом, была получена только недостаточная информация без понимания общего представления. Частично обсуждались молочно-кислые бактерии, которые стимулируют секрецию 1дА, и, в частности, бактерии из рода В^йάοЬасΐе^^ит, как считается, играют некоторую роль у новорожденных, поскольку в экскрементах новорожденных высока их относительная распространенность. Была попытка совместного культивирования бактерий ΒίΓίάοόαο^πιιιη с клетками Пейеровых бляшек для того, чтобы выбрать бактерии с высокой активностью индуцирования продуцирования 1дА.

Конкретно, сообщалось (1Ρ 02-280059) о наличии штаммов В^йάοЬасΐе^^ит 1οη§ι.ιιη и В^йάοЬасΐе^^ит Ьге^'е, имеющих сильную стимулирующую активность секреции 1дА. Однако известно, что бактерии ΒίΓίάοόαοΚπιιιη слабо представлены в кишечнике взрослого человека и вследствие этого ожидается, что в обычных условиях они едва ли контактируют с клетками Пейеровых бляшек. На самом деле, не было подтверждено, достаточно ли функциональны подобные, отдельно выбранные виды или штаммы в кишечнике человека.

Рассматривая в целом молочно-кислые бактерии, нет сообщений, предполагающих взаимосвязь между бактерией ЬасЮЬасШиз и продуцированием 1дА, в частности нет сообщений о попытках сравнить стимулирующую продуцирование 1дА активность среди видов или штаммов Бас^асШ^, которые распространены в кишечнике, где находятся Пейеровы бляшки, имеющие важную роль в кишечном иммунитете и которые имеют высокую локализацию, для того, чтобы найти виды или штаммы, имеющие высокую активность. Что касается кишечной локализации бактерий ЕасЮЬасШиз в человеке, сообщалось о наличии молочно-кислых бактерий БасЮЬасШиз ату1ονο^из (^.ату1ονο^из), относящихся к роду ЬасФЬасШиз, который является преобладающим в человеческой флоре, а также БасЮЬасШиз рагасазец БасЮЬасШиз даззеп и БасЮЬасШиз)ο1ιη3οηίί (Вюзаепсе Μ^οΓΙοη, 22 (3), 75-83, 2003).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет бактерии Бас^асШ^, которые стимулируют продуцирование 1дА посредством усиления функционирования Пейеровых бляшек или им подобным, и средство для стимуляции продуцирования 1дА, содержащее бактериальные клетки ЬасЮЬасШиз в качестве активного ингредиента.

Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что существуют наблюдаемые различия в стимулирующей продуцирование 1дА активности среди видов бактерий ЬасЮЬасШиз посредством определения стимулирующей продуцирование 1дА активности в Пейеровых бляшках для различных штаммов ТасФЬасШиз, посредством использования различных штаммов, существующих или не существующих в кишечном тракте человека (штаммов, происходящих из экскрементов человека или другого происхождения). В частности, было обнаружено, что среди постоянных видов бактерии БасЮЬасШиз в кишечном тракте человека БасЮЬасШиз ату1ονο^из имеет наивысшую индуцирующую продуцирование 1дА активность.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой средство для стимуляции продуцирования 1дА, содержащее клетки ЕасЮЬасШиз ату1ονο^из в качестве активного ингредиента, в частности средство для стимуляции продуцирования 1дА, содержащее БасЮЬасШиз ату1ονο^из СР1750 (РЕЯМ ВР10532), в качестве активного ингредиента.

В соответствии с настоящим изобретением средство для стимуляции продуцирования 1дА может усилить иммунную защиту. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет иммуномодулятор, пищевой продукт или корм (включая питье), в частности ферментированное молоко, диетические пищевые продукты, функциональные пищевые продукты, пищевые продукты для определенного здорового применения, здоровое питье, таблетки или т. п., для усиления иммунной защиты. Средство для стимуляции продуцирования 1дА по настоящему изобретению может усилить защитную функцию слизистой оболочки для того, чтобы предотвратить инвазию пищевых аллергенов и патогенных микроорганизмов, а также аллергенов окружающей среды, таких как пыльца, клещи, домашняя пыль и т.п.

- 1 016734

Краткое описание чертежа

Чертеж представляет собой сравнение между стимулирующей продуцирование 1дА активностью различных бактерий Ьас1оЬасШи8. Контролем являлся РВ8 без бактериальных клеток. Линии показывают среднеквадратическую ошибку.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Настоящее изобретение относится к средству для стимуляции продуцирования 1дА, содержащему в себе клетки бактерий Ьас1оЬасШи8, которое не было известно в плане способности индуцировать 1дА, который активен для предотвращения контактирования слизистой оболочки с антигенными материалами, включая аллергены. Как здесь использовано, средство для стимуляции продуцирования 1дА подразумевает композицию, обладающую активностью в стимуляции продуцирования 1дА. Патент на средство стимуляции продуцирования 1дА настоящего изобретения не ограничен только использованием в качестве медикаментозного средства или добавки для пищевого продукта (включая жидкости). В частности, средство стимуляции продуцирования 1дА содержит в себе в качестве активного ингредиента клетки Ьас1оЬасШи8 ату1оуогиз. которые, как подтвердилось, обладают высокой способностью индукции продуцирования 1дА среди клеток Ьас1оЬасШи8, которые сильно сконцентрированы в кишечном тракте и, как полагают, имеют высокую возможность контакта с иммунокомпетентными тканями в кишечнике. Штаммы Ьас1оЬасШи8 ату1оуогиз, которые могут быть использованы для настоящего изобретения, включают Ьас1оЬасШи8 ату1оуогиз СР1750. Ьас1оЬасШи8 ату1оуогиз СР1750 депонированы в Международном Депозитарии Патентованных Организмов, №1Нопа1 1п81йи1е о! Айуаисей 1пйи51па1 8с1еисе аий Тсс11по1оду (А18Т ТзикиЬа Сеи1га16, 1-1, Нщаз1и 1-сйоте ТзикиЬа-зЫ, 1Ьагак1-кеи 305-8536 1араи) и доступны под депозитарным № РЕЕМ ВР-10532.

В целом, 1дА сильно продуцируется тканями слизистой оболочки, такими как Пейеровы бляшки, причем 1дА представляют собой антитела, часто встречающиеся в секреторных жидкостях из трахеи или кишечника, в слюне и в начальном материнском молоке. Пейеровы бляшки представляют собой ткань, которая находится в слизистой оболочке кишечника млекопитающих, включая человека, и которая содержит в себе большое количество 1дА-продуцирующих клеток. Авторы изобретения культивировали Пейеровы бляшки в присутствии различных бактерий Ьас1оЬасШи8, которые наблюдаются во флоре кишечника человека, или различных бактерий Ьас1оЬасШи8, которые не находятся или редко находятся во флоре кишечника человека, и тестировали продуцирование 1дА Пейеровых бляшек для того, чтобы продемонстрировать, что имелась заметная разница в активности стимуляции продуцирования 1дА, и обнаружили, что Ь.ату1оуоги8 имели особенно высокую активность стимуляции продуцирования 1дА среди видов Ьас1оЬасШи8, которые являются преобладающими во флоре кишечника человека. Можно подтвердить, что данные штаммы Ь.ату1оуоги8 могут быть использованы для настоящего изобретения посредством совместного культивирования клеток Пейеровых бляшек в присутствии различных штаммов Ь.ату1оуоги8.

Активность стимуляции продуцирования 1дА на клетках Пейеровых бляшек может быть определена следующим образом. Бактерии, например бактерии Ьас1оЬасШи8, могут быть культивированы в обычно используемых среде и условиях, например в среде МВБ (Эйсо) при приблизительно 37-45°С в течение 12-19 ч, извлечены посредством центрифугирования, а затем полученные клетки могут быть отмыты дистиллированной водой или соответствующим буфером, таким как РВ8, простерилизованы нагреванием при 100°С (в течение, например, 10 мин) для того, чтобы сохранить их для дальнейшего определения. Клетки Пейеровых бляшек могут быть получены из кишечника мышей. Кишечник мышей можно поместить в подходящую для Пейеровых бляшек среду, такую как среда ЕРМ1, и перемешивать при приблизительно 37°С в течение приблизительно 1 ч, пока клетки не станут диссоциированными. Полученную в результате клеточную суспензию можно пропустить через сито для того, чтобы удалить нежелательный дебрис, а затем полученные в результате клетки могут быть отмыты соответствующей средой, такой как РЕМ1, для того, чтобы получить препарат клеток Пейеровых бляшек. Полученные клетки Пейеровых бляшек помещают в 96-луночные плашки, содержащие соответствующую среду, например среду ЕРМ1, дополненную 5% РС8, приблизительно 5х10⁵ клеток/лунку, и вышеуказанные клетки бактерий добавляют при приблизительно 10 мкг/мл, далее плашки могут быть культивированы при 37°С в течение приблизительно 7 дней в атмосфере 5% СО₂ для получения супернатанта.

Количество 1дА в полученном супернатанте может быть определено общепринятыми техниками, такими как ЕЫ8А. Например, соответствующим образом разбавленные антимышиные 1дА антитела могут быть добавлены в качестве первичных антител в плашку ЕЫ8А при приблизительно 50 мкл, плашки могут быть оставлены на ночь при 4°С для сенсибилизации. Лунки промывают РВ8-твин раствором перед добавлением 100 мкл 1% В8А/РВ8-твин раствора в каждую лунку и плашки оставляют на 2 ч при комнатной температуре для блокировки. Лунки промывали и 50 мкл стандарта 1дА или соответствующим образом растворенного образца добавляли в лунки, плашки оставляли на 2 ч при комнатной температуре. После промывания лунок 50 мкл вторичных антител, таких как биотинилированный антимышиный 1дА, разбавленных 1% В8А-РВ8-твин раствором, добавляли в лунки и плашки оставляли на 2 ч при комнатной температуре. После промывания лунок РВ8-твин раствором 50 мкл щелочного раствора фосфатазы, разбавленного 1% В8А-РВ8-твин раствором, добавляют в лунки и плашки оставляют на 1 ч при

- 2 016734 комнатной температуре. После промывания лунок РВ8-твин раствором 50 мкл двунатриевого 4нитрофенилфосфата, растворенного в диэтаноламин-НС1 буфере при 1 мкг/мл, добавили в лунки для проявления, для того чтобы определить количество продуцированного 1дА в каждой лунке посредством измерения абсорбции при 405 нм.

Штамм СР1750 (РЕКМ ВР-10532), который определяли такими способами и который является лучшим в активности в стимуляции продуцирования 1§А в Пейеровых бляшках, имел особенно высокое сродство к кишечному тракту человека и вследствие этого ожидалось, что он покажет очень высокую активностью в стимуляции продуцирования 1дА в кишечнике человека, и был особенно предпочтительным в качестве активного ингредиента средства для стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением.

Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что молочно-кислые бактерии, локализованные в кишечнике человека, в частности виды или штаммы Ьас1оЬасШи8, являются превосходящими в общей активности, включая адъювантную активность, за счет стимуляции продуцирования 1дА, от продуцирующих антитела клеток в Пейеровых бляшках и дополнительного неспецифичного воздействия на 1дА-продуцирующие клетки до повышенного продуцирования 1дА, чтобы более эффективно процессировать антигены.

Штаммы Ьас1оЬасШи8, которые, как подтвердилось, обладают активностью в стимуляции продуцирования 1дА в Пейеровых бляшках, например СР1750 (РЕКМ ВР-10532), могут быть использованы в качестве активного ингредиента средства для стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением в любых формах, включая живые клетки, убитые клетки, гомогенизированные клетки, клеточный лизат и измельченные клетки, при условии, что они не теряют активность в стимуляции продуцирования 1дА. Таким образом, если не указано другое, клетки Ь.ату1оуош8 включают живые клетки, убитые клетки, гомогенизированные клетки, клеточный лизат, измельченные клетки и любые другие формы. В частности, культивированные живые клетки и лиофилизированные клетки клеток Ь.ату1оуоги8 будут ценны с точки зрения пригодности к использованию. Если необходимо, активность в стимуляции продуцирования 1дА Пейеровыми бляшками любых из данных форм может быть подтверждена вышеупомянутыми способами.

Когда средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве медицинского средства, в дополнение к клеткам Ь.ату1оуош8 средство может содержать в себе другие медицинские средства и фармацевтически доступные общеприменимые вспомогательные средства и добавки. Лекарственная форма может представлять собой форму таблетки, порошка, пилюли, гранулы, капсулы, покрытой сахаром таблетки или сиропа, которые могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами. Средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением может быть добавлено к различным пищевым продуктам (включая питье) или корму, в частности к ферментированному молоку, диетическим пищевым продуктам, функциональным пищевым продуктам, пищевым продуктам для определенного здорового применения, здоровому питью или таблетке. Для любой из данных форм целевое потребление средства стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением представляет собой 20 мг (в пересчете на сухую массу) или более в день в виде массы клеток (сухой массы) (приблизительно 10¹⁰ клеток: количество клеток может быть подсчитано с помощью счетчика Культера или ему подобного). В качестве альтернативы предпочтительно принимать внутрь приблизительно 100 г в день с ферментированным молоком или ферментированным бульоном. В силу того, что активный ингредиент настоящего изобретения Ь.ату1оуоги8 представляет собой молочно-кислые бактерии, находящиеся в тонком кишечнике человека, потребление большого количества средства стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением не должно послужить причиной нежелательных побочных эффектов. Средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением вследствие этого является пригодным для пищевых продуктов человека. А именно, средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением подходит для использования в качестве пищевого продукта или добавления в пищевой продукт в неизменном виде.

Хотя Ь.ату1оуош8, использованная в настоящем изобретении, может быть культивирована в среде и условиях культивирования, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, с целью получения препарата для применения человеком, такого как медицинское средство, пищевой продукт или питье для человека, предпочтительно использовать среду, которая не является вредной для человека, например среду, приготовленную только из пищевых ингредиентов.

Ь.ату1оуоги8, использованная в настоящем изобретении, может быть культивирована в соответствии с условиями культивирования и в среде, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Между тем, для того чтобы получить препарат, употребляемый человеком, такой как медицинское средство, пищевой продукт и питье для человека, предпочтительно использовать среду, которая не является вредной для человека. Примером подобной среды является среда, полученная только из пищевых компонентов. Например, используя полусинтетическую среду (независимо от ее типа), полученную только из пищевых компонентов, Ь.ату1оуоги8 культивируют в диапазоне от 37 до 45°С в течение от 12 до 18 ч и центрифугируют для того, чтобы извлечь клетки бактерий. Вслед за этим, могут быть получены

- 3 016734 извлеченные клетки, которые отмывают стерилизованной водой посредством центрифугирования (с повторным отмыванием в случае необходимости) для того, чтобы получить клетки Ь.ату1оуоги8, используемые в качестве активного ингредиента средства стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением. Клетки, полученные таким образом, замораживают непосредственно или, в случае необходимости, замораживают с добавлением наполнителя, такого как декстрин, лиофилизируя клетки для того, чтобы получить сырье для пищевого продукта, содержащего живые клетки. С другой стороны, бактериальные клетки, которые отмывают стерильной водой, а затем стерилизуют нагреванием, замораживают непосредственно или, в случае необходимости, замораживают с добавлением наполнителя, такого как декстрин. Затем, посредством выполнения сушки вымораживанием или сушки распылением может быть получено пищевое сырье, содержащее мертвые клетки. В варианте осуществления, где изобретение существует в виде самих клеток или в виде клеток, добавленных в пищевые продукты, различные пищевые продукты или медицинские средства предпочтительно получают так, чтобы в день потреблялось 20 мг или более (в пересчете на сухую массу) клеток.

С другой стороны, ферментированное молоко, ферментированный бульон или смешанный ферментированный бульон могут быть получены посредством добавления культуры Ь.ату1оуоги8, культивированной в первоначальной среде, в овощной сок, фруктовый сок, солодовую вытяжку, рисовую воду, молоко или смесь этих соков при нескольких процентах, например от 3 до 6%, ферментирования смеси при 37-45°С и охлаждения смеси при окончательной степени кислотности 0,85 и более. При необходимости, к полученному продукту могут быть добавлены подсластитель и/или ароматическая добавка для того, чтобы подобрать вкусовые характеристики, полученный в результате продукт может быть использован непосредственно в качестве детского питания или может быть дополнительно стерилизован для того, чтобы получить продукт, имеющий повышенный срок годности. Для подобного ферментированного продукта предпочтительно, чтобы ферментированный продукт был употребляем перорально в количестве приблизительно 100 г/день. Предпочтительно приблизительно 10¹⁰ клеток Ь.ату1оуоги8 включены в 100 г подобного ферментированного продукта.

Когда клетки Пейеровых бляшек культивируют со средством стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением, количество продуцированного 1дА в культурном растворе значительно увеличивается (см. пример). В целом, продуцирование 1дА часто наблюдают в клетках ткани слизистой оболочки, причем считается, что средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением обладает функцией стимуляции продуцирования 1дА не только в клетках Пейеровых бляшек, но также в других тканях слизистой оболочки. В связи с этим, когда средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением потребляют перорально, продуцирование 1дА будет систематически стимулироваться в системе слизистой оболочки, а также в слизистой оболочке кишечных трактов; кроме того, защитная система слизистой оболочки систематически усиливается и блокируется проникновение аллергенов через слизистую оболочку, в целом, давая возможность подавления натиска аллергенов, включая пищевые аллергены. Например, средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением стимулирует продуцирование 1дА в полости рта, подавляя, таким образом, периодонтальные бактерии, и, таким образом, может быть использовано для улучшения и предотвращения периодонтальных болезней. Это в высшей степени надежно, так как средство стимуляции продуцирования 1дА в соответствии с настоящим изобретением почти не имеет или не имеет побочных эффектов. К тому же, так как средство стимуляции продуцирования 1дА, включая клетки СР1750 в качестве активного ингредиента, имеет особенно высокое сродство кишечным трактам человека, считается, что активность стимуляции продуцирования 1дА является особенно высокой.

Примеры

Пример 1.

1) Получение клеток молочно-кислых бактерий.

Ниже описаны использованные виды и штаммы:

Ь.гйатиокш А (Ьас1оЬасШи8 тйатпокш штамм А);

Ь.теи1ег1 А (Ьас1оЬасШи8 теи1ег1 штамм А);

Ь.р1ап1агит А (Ъас1оЬасШи8 р1аи1агит штамм А);

Ь.ратаса8е1 А (Ьас1оЬасШи8 рагаса§е1 штамм А); Ь.ратаса8е1 В (Ьас1оЬасШи8 рагаса§е1 штамм В);

Ьдойпкопй А (Ьас1оЬасШи8 )о11п5опп штамм А); Ьдойпкопй В (Ьас1оЬасШи8 )о11П5опп штамм В); Ь.дайпатит А (Ьас1оЬасШи8 дайпатит штамм А);

Нда^еп А (Ьас1оЬасШи8 даккеп штамм А);

Ь.да^еп В (Ьас1оЬасШи8 даккеп штамм В);

НГегтеШит А (Ъас1оЬасШи8 ГегтеШит штамм А);

Ь.стщраШк А (Ьас1оЬасШи8 стщраШк штамм А);

Ь.Ьисйпеп А (Ьас1оЬасШи8 Ьисйпеп штамм А);

Ь.ату1оуош8 СР1750 (Ьас1оЬасШи8 ату1оуоти8 СР1750);

Ь.ас1борЫ1и8 А (Ьас1оЬасШи8 ас1борЫ1и8 штамм А).

- 4 016734

Ь.ату1оуоги§ СР1750 представлял собой штамм, который был произвольно выбран из нашего типового набора Ь.ату1оуоги8. Данные виды и штаммы Ьас1оЬасШи8 культивировали в указанном порядке в 100 мл среды МВ8 (Эйсо ЬаЬога1опе8) при 37°С в течение 18 ч, затем клетки промывали и лиофилизировали. После лиофилизации для каждого штамма получили приблизительно 10¹¹ высушенных клеток (приблизительно 100 мг). Аликвоты лиофилизированных клеток, которые были использованы для следующих экспериментов, суспендировали в РВ8 и стерилизовали нагреванием при 100°С в течение 10 мин.

2) Культивирование клеток Пейеровых бляшек в присутствии клеток бактерий Ьас1оЬасШи8.

У ВАЬВ/с мышей удалили кишечники и иссекли Пейеровы бляшки. Коллагеназу растворили в 5% ЕС8-КРМ1 при 1 мг/мл, в который поместили иссеченные Пейеровы бляшки, а затем взбалтывали при 37°С в течение 1 ч. После диссоциации клеток клеточную суспензию пропустили через сито для того, чтобы удалить дебрис, а клетки промыли КРМ1 для того, чтобы получить клетки Пейеровых бляшек. Клетки Пейеровых бляшек посеяли в 96-луночные плашки, содержащие 5% РС8-ВРМ1 при 5х10⁵ клеток/лунку. Клеточную суспензию, полученную в 1), которую культивировали в РС8-КРМ1 при 37°С в 5% СО₂, добавили при 10 мкг/мл (сухой массы клеток) и после культивирования в течение 7 дней извлекли культурный супернатант.

3) Определение продуцирования 1дА клетками Пейеровых бляшек.

Количество 1дА в культурном супернатанте, полученном в 3), определяли посредством ЕЬ18А. Первичные антитела (козий антимышиный 1дА, 2утеб ЬаЬогаФпек) были тысячекратно разбавлены 0,1 М раствором №1₂НРО.-|. 50 мкл раствора антител добавили в плашку ЕЫ8А и провели сенсибилизацию, оставив плашку на ночь при 4°С. Лунки промыли РВ8-твином, затем в каждую лунку добавили 100 мкл 1% раствора В8А/РВ8-твина и оставили при комнатной температуре на 2 ч для того, чтобы блокировать лунки. Лунки промыли, затем при 50 мкл добавили в лунки стандарт 1дА (1дА: очищенный 1дА миеломы мыши, Ζν теб ЬаЬога1ог1е8) или соответствующим образом разбавленные образцы и оставили при комнатной температуре на 2 ч. Лунки промыли, затем в лунки добавили 50 мкл вторичных антител (1дА; биотинилированный антимышиный клон 1дА; С10-1, ВО Рйагтшдеи) и оставили при комнатной температуре на 2 ч. Лунки промыли РВ8-твином и затем добавили 50 мкл 4-нитрофенил двунатриевого фосфата (Токуо Ка§е1 Коидуои), растворенного в буфере диэтаноламин-НС1 (рН 8,9) при 1 мг/мл для проявления, и определили абсорбцию при 405 нм. Количество продуцированного 1дА показали на графике, используя в качестве базы данные стандарта 1дА (чертеж).

Среди штаммов Ь.геи1ег1 А, Б.Ьисйпеп А, Ь.ату1оуоги8 СР1750 и Е.ас1борЫ1и8 А (чертеж), которые показали относительно высокую активность стимуляции продуцирования 1дА, Ь.геи1ег1 А, Б.Ьисйпеп А и Ь.ас1борЫ1и8 А, представляли собой виды и штаммы, которые в норме не наблюдаются в кишечнике человека, в то время как Е.ату1оуоги8, включая штамм СР1750, как показано, является молочно-кислой бактерией, которая находится в кишечнике человека и является доминирующей в кишечной флоре человека.

4) Бактериальные особенности Ь.ату1оуоги8 СР1750.

Чтобы определить особенности Ь.ату1оуоги8 СР1750 усвоения углеводов, использовали имеющийся в продаже набор для идентификации бактерий (Ар150СН: Вютепеих, Ргобис! Ыо. 50307). Результаты показаны в таблице.

- 5 016734

Углевод	Усвоение*
глицерин	-
эритрит	-
ϋ-арабиноза	-
Ь-арабиноза	-
Рибоза	-
О-ксилоза	-
Ь-ксилоза	-
Адонит	-
бета-метил-О-ксилозид	-
галактоза	+
глюкоза	+
фруктоза	+
манноза	+
сорбоза	-
рамноза	-
дульцит	-
инозит	-
маннит
сорбит	-
альфа-метил-О-маннозид	-
альфа-метил-О-глюкозид	-
Ν-ацетилглюкозамид	+
амигдалин	-
арбутин	-
эскулин	-
салицин	-
целлобиоза	+
мальтоза	+
лактоза	+
мелибиоза	-
сахароза	+
трегалоза	-
Инулин	-
мелезитоза	-
раффиноза	+
крахмал	+
гликоген	-
ксилит	-
гентиобиоза	+
ϋ-тураноза	-
ϋ-ликсоза	-
ϋ-тагатоза	-
ϋ-фукоза	-
Ь-фукоза	-
ϋ-арабит	-
Ь-арабит	-
глюконат	-
2-кетоглюконат	-
5-кетоглюконат	-

* + показывает положительный результат усвоения, - показывает отрицательный результат усвоения.

Ь.ашу1оуоги8 СР1750 показывает хороший рост даже при 45°С.

- 6 016734

Список литературных источников.

1. ΙΡ 02-280059 А.

2. Νο\ν Εοοά 1пди81гу, νοί. 32, Νο. 10, р. 9 (1990).

3. Βίοδοίβηοβ Μΐοτοΐίοτα, νοί. 22, Νο. 3, р. 75-83 (2003).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Средство для стимуляции продуцирования 1дА, включающее клетки ЕаскЛасИкь ату1ονο^и8 в качестве активного ингредиента.
2. Средство по п.1, где Ьас^ЬасШиз ату1ονο^и8 представляет собой штамм ЕаскЛасЛш ату1ονο^и8 СР1750 ΕΕΚΜ ВР-10532.
3. Средство п.1 или 2, содержащее 10¹⁰ или более клеток на 20 мг средства в пересчете на сухую массу.
4. Средство по п.1, представляющее собой ферментированный продукт, содержащий клетки Бас!»ЬасШиз ату1ονο^и8.
5. Средство по п.4, где Ьас^ЬасШиз ату1ονο^и8 представляет собой Ьас^ЬасШиз ату1ονο^и8 СР1750 ΕΕΚΜ ВР-10532.
6. Средство по п.4 или 5, содержащее 10¹⁰ или более клеток на 100 г продукта.
7. Средство по любому из пп.1-6, добавляемое к продуктам питания.
8. Штамм бактерий ЕаскЛасИкь ату1ονο^и8 СР1750 ΕΕΚΜ ВР-10532 для стимуляции продуцирования 1дА.