EA011367B1 - Устройство для взятия проб толстокишечных клеток - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к устройству для взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом устройство содержит элемент для колоректального введения (1), имеющий вводимый дистальный конец (2), проксимальный конец (34) и закрываемую внутреннюю полость (3), гибкую мембрану, имеющую внешнюю поверхность (5) для взятия клеточных проб и внутреннюю поверхность, при этом упомянутая мембрана прикреплена с уплотнением к вводимому дистальному концу упомянутого элемента для введения и вмещена во внутреннюю полость так, что при применении нагнетание давления во внутренней полости по меньшей мере до первого повышенного давления вызывает выталкивание мембраны из дистального конца упомянутого элемента для введения для контакта с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки и изменение давления во внутренней полости до второго пониженного давления вызывает выворачивание мембраны и ее возврат во внутреннюю полость упомянутого элемента для введения. Представлены также описания набора, содержащего упомянутое устройство, и способов взятия проб толстокишечных клеток с использованием упомянутого устройства.

Description

Настоящее изобретение относится к устройству для сбора пробы слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки человека, к набору, содержащему упомянутое устройство, и к способам взятия проб толстокишечных клеток с использованием упомянутого устройства.

Уровень техники изобретения

Спорадический рак ободочной и толстой кишки (СЯС) является одним из наиболее часто встречающихся и смертельных онкологических заболеваний, поражающих людей в развитых западных странах. Данное заболевание, в основном, поражает людей в возрасте старше 50 лет.

Серьезным препятствием ранней диагностики СЯС является отсутствие ранних, легко идентифицируемых клинических проявлений в большинстве случаев. Заболевание легко распознается только на поздних стадиях заболевания, когда образуются крупные опухоли, вызывающие боль, кровотечение и симптомы непроходимости. Однако поздние стадии заболевания связаны также с инвазивными или метастатическими опухолями. Следовательно, обнаружение опухолей ободочной и толстой кишки до поздних стадий заболевания намного повысило бы шансы успешного хирургического вмешательства и общей выживаемости.

Из-за отсутствия ранних, легко идентифицируемых клинических симптомов поиск подходящих способов массового обследования на СЯС продолжали десятилетиями. К сожалению, в настоящее время отсутствует метода массового обследования на СЯС, который сочетает малую инвазивность, простоту и низкую стоимость с высокой чувствительностью и специфичностью. Двумя способами массового обследования на СЯС являются гибкая колоноскопия/сигмоидоскопия и анализ кала на скрытую кровь (РОВТ) [Яепиеп, О. Яесеп! ЯезиИз Сапсег Яез. 2003; 163: 248-253, А1кш, 8сапб. 1. СаЧгоеЩегок (8ирр1.) 2003; 237: 13-16, ХУаШг 1. М. апб ТегФшаи, 1. Р. 1АМА 2003; 289: 1288-1296]. Однако оба данных способа обладают значительными недостатками.

Гибкая колоноскопия/сигмоидоскопия считается точным и надежным диагностическим методом, однако ее инвазивность, стоимость и потребность в высококвалифицированных и опытных специалистах для выполнения процедуры делают непрактичным ее применение для рутинного массового обследования. То же самое относится к недавно внедренной компьютерной томографической колонографии (виртуальной колоноскопии).

Способ РОВТ дешев и прост, однако он дает недопустимо высокие проценты как ложно отрицательных, так и ложно положительных результатов. Несмотря на упомянутые ограничения, РОВТ является в настоящее время способом выбора при массовом обследовании.

Исследовались альтернативные способы диагностики СЯС, основанные на непосредственном индикаторе присутствия опухоли. Одним индикатором, который был выявлен, является анализ слущенных колоноцитов. Отслаивание колоноцитов (т.е. спонтанное отделение клеток от последовательно организованного эпителиального слоя слизистой оболочки толстой кишки) является важным механизмом обновления клеток в человеческой кишке |Ε;·151\\όο6. О. Ь. СаЧгоеЩегсбоду 1977; 41: 122-125]. Цитологический анализ колоноцитов, полученных из смывов с ободочной и толстой кишки (т. е. промыванием слизистой оболочки ободочной и толстой кишки), выполнили около 50 лет назад [Вабег, О. М. апб Рарашсо1аи, О. N. Сапсег 1952; 5: 307-14]. Данная работа показала, что морфологически разные слущенные опухолевые клетки можно определять у пациентов с СЯС. Однако способ получения данных проб (инвазивный метод промывания ободочной и толстой кишки) имел недостатки, аналогичные сигмоидоскопии/колоноскопии, и требовал подробного цитологического анализа пробы после получения.

Превалирующий подход к получению проб слущенных эпителиальных клеток состоял в их отделении от человеческих испражнений. Установлено, что человеческий кал является источником данных клеток, так как слущенные клетки эпителия ободочной и толстой кишки могут выводиться в связи с другими каловыми веществами.

Первые попытки использовать колоноциты, выделенные из человеческого кала, для диагностики и исследований сделал около 15 лет назад П.П. Нейр (Р.Р. №1й) с коллегами. Они заявили, что смогли извлечь тысячи «жизнеспособных» слущенных клеток из нескольких граммов диспергированного калового вещества с использованием метода выделения, основанного на центрифугировании в градиенте плотности [1уепдаг, V. е1 а1., РА8ЕВ 1 1991; 5: 2856-2859, А1Ьаидй, О. Р. е1 а1., 1п1. 1. Сапсег .1992; 52: 347-350]. Однако упомянутые амбициозные заявления вызвали серьезные сомнения из-за низкой вероятности присутствия хорошо сохранившихся колоноцитов в агрессивной анаэробной среде, например, среде, обнаруживаемой в кале. Кроме того, морфологическое подтверждение, представленное в их публикации в 1991 г., было неубедительным. П.П. Нейр и члены его группы настаивали на обоснованности их способа |№й. Р. е1 а1., 1. С1ш. Оа81гоеп1его1. 2003; 36(5 8ирр1.) 884-893], но не сделали никаких дальнейших практических шагов на базе результатов своих исследований.

Однако несмотря на отсутствие практических успехов у П. П. Нейра и его коллег, использование человеческого стула для диагностики и исследований остается областью активных исследований, поскольку это не связано с каким-либо инвазивным вмешательством. Несколько групп предприняли попытки выделения генетического материала (ДНК), происходящего из колоноцитов, из проб человеческого стула для разработки диагностических методов, использующих молекулярные биомаркеры злокачественных

- 1 011367 опухолей. Хотя ДНК, непосредственно выделенную из гомогенизированного кала, можно амплифицировать и проанализировать на наличие сопутствующих раку генетических изменений, отсутствие высоконадежного единственного молекулярного биомаркера рака вызвало применение нескольких молекулярных маркеров, отражающих ряд генетических изменений, как известно, сравнительно часто присутствующих в опухолевых клетках. Появились описания нескольких способов, предлагающих одновременное обнаружение нескольких мутаций в генах АРС, К-гак и р53 в сочетании с анализом микросателлитных маркеров ΙΛΗΙςυίδΙ. Ό. А, е! а1., Сак!гоеп!его1оду 2000; 119: 1219-1227, Эопд, 8. М. е! а1., 1. №111. Сапсег 1пк!. 2001; 93: 858-865, Вепдцссц С. е! а1., Сйп. Сапсег Век. 2001; 93: 858-865, Ттауетке С. е! а1., N. Епд1. 1. Меб. 2002; 346: 311-320]. Изменения метилирования в фекальных ДНК также изучали как возможный диагностических маркер [Ми11ег, Н. М. е! а1., Ьапсе! 2004; 363: 1283-1285]. Хотя обнаружение опухолей ободочной и толстой кишки в молекулярных анализах по нескольким клеткам-мишеням представляется возможным, пригодность данных способов для целей массового обследования остается под вопросом изза высокой стоимости и относительной сложности сопутствующих лабораторных процедур.

Поиск молекулярных маркеров СВС в ДНК, извлеченных из гомогенизированных проб стула, оставил в тени важность первоначального сбора/выделения слущенных колоноцитов. Однако, очевидно, что гомогенизированный стул является материалом, из которого сложно извлечь человеческую ДНК. В частности, множество бактерий в кале может помешать процедурам выделения ДНК, и происходит быстрое повреждение и разложение ДНК млекопитающих в присутствии анаэробной бактериальной флоры толстой кишки.

Разработка способов, основанных на выделении слущенных колоноцитов, продвигалась медленно, частично, из-за поразительной нехватки знаний об отслаивании клеток в кишке как в нормальном физиологическом состоянии, так и в состоянии болезни. Современные взгляды на отслаивание колоноцитов все еще находятся под влиянием старой и недоказанной гипотезы, предполагающей «обязательное» отслаивание почти всех дифференцированных колоноцитов после их миграции в полостной эпителий из кишечных крипт (т.е. предполагается, что в каловом веществе должны присутствовать миллионы колоноцитов, так как скорость размножения клеток толстокишечного эпителия является высокой, и все клетки, в конечном счете, отслаиваются). Однако становится очевидным, что запрограммированная смерть клеток или апоптоз ίη кйи является, по меньшей мере, столь же важным, как отслаивание [На11, Р. А. е! а1., 1. Се11 8с1. 1994; 107: 3569-3577, ВатИа, Ό. Н. апб С1Ькоп, Р. В. Ра1йо1оду 1999; 31: 230-238, АЫцшк!, Ό. А. е! а1., Нит. Ра!йо1. 2000; 31: 51-57]. Взаимосвязь между данными двумя основными механизмами удаления клеток из толстокишечной слизистой оболочки может подвергаться значительным изменениям в неоплазии ободочной и толстой кишки [АЫцшк!, Ό. А. е! а1. (см. выше)]. Действительно, в настоящее время доказано, что нормальные регуляторные пути, приводящие клетки к апоптозу, резко разрегулированы в злокачественных опухолях [Веб1, А. е! а1., Сапсег Век. 1995; 55: 1811-1816, ЬаСакке, Е. С е! а1., Опсодепе 1998; 17: 3247-3259, 1акк, 1. В. Сак!гоеп!его1оду 2002; 123: 862-876, Огеп, М. Се11 Иеа1й ΌίίΒτ. 2003; 10: 431-442, Воебе£е1б, ^. М. 2^пб е! а1., Апп. 8игд. Опсо1. 2003; 10: 839-851], что приводит к значительному ослаблению апоптического потенциала раковых клеток. В то же время, известно, что неспецифическая адгезия опухолевых клеток резко ослабляется по мере прогрессирования рака [Уатато!о, Н. е! а1., Сапсег Век. 1996; 56: 3605-3609, На1ег, 1. апб №со1коп, С. Ь. И1к. Со1оп Вес!ит 2001; 44: 876-884, Ьеетап, М. Е. е! а1., 1. Ра1йо1. 2003; 201: 528-534]. Последнее явление важно с точки диссеминации, однако в неоплазии ободочной и толстой кишки в сочетании с подавлением апоптоза и ослаблением межклеточной адгезии/связи значительно возрастает вероятность отслаивания опухолевых клеток от поверхности растущих опухолей. Если это имеет место, то слущенные опухолевые клетки, часть которых, вероятно, может сохранять пролиферативную способность, должны отличаться от их нормальных (неопухолевых) слущенных аналогов тем, что: ί) являются более многочисленными вследствие их облегченного отслоения с поверхности опухоли и ίί) обладают намного большей «живучестью», в частности, благодаря более высокой резистентности к отсутствию кислорода [СтаеЬет, Т. С. е! а1., №1Шге 1996; 379: 88-91]. После отслоения данные клетки попадают в относительно сильно насыщенный кислородом «слизистоклеточный слой», который отделяет слизистую оболочку ободочной и толстой кишки от калового содержимого кишки, и постоянно движутся в дистальном направлении с потоком кала [АЫцшк!, Ό. А. е! а1. (смотри выше)].

Значение слизисто-клеточного слоя, обеспечивающего поверхность раздела между слизистой оболочкой ободочной и толстой кишки и каловым содержимым кишки, не понимали до последнего времени. Экспериментальные исследования показали, что высококачественные ДНК можно легко получить с поверхности крысиного кала и использовать для дополнительного амплифицирования и анализа генных мутаций [Ьокбопоу, А. апб Ο'№ί11, I. К. 1п!. 1. Опсо1. 1995; 6: 437-445]. По этим начальным экспериментам предположили, что ДНК, извлеченную из колоноцитов, выделенных с поверхности человеческого стула (поверхность стула можно рассматривать как фракцию слизисто-клеточного слоя, выведенного с калом), можно использовать для молекулярного анализа. Разработан способ выделения слущенных клеток из проб необработанного человеческого стула смыванием клеток с поверхности охлажденного кала и сбором их методом иммуномагнитной сепарации [Ьокбопоу, А. е! а1., С1ш. Сапсег Век. 1998; 4: 337-342]. Хотя работа в данном направлении первоначально планировалась в виде разработки молекулярного ди

- 2 011367 агностического анализа на СВС, но выяснилось, что простой количественный анализ ДНК, полученной из колоноцитов с поверхности человеческого стула, можно использовать для диагностики СВС и массового обследования, поскольку относительное содержание ДНК у пациентов с СВС было намного больше, чем у здоровых пациентов. Другие авторы также сообщали о высоких содержаниях либо слущенных клеток [Оиба. 8. К. е! а1., Са51гоеп1его1оду 1995; 108 (8ирр1.): А463], либо ДнК [УШа, Е. е! а1., Са51гоеп1его1оду 1996; 110: 1346-1353] в диспергированных или гомогенизированных пробах стула, полученных от пациентов с СВС, однако различия между здоровыми людьми и раковыми больными, наблюдаемые в упомянутых исследованиях, не были достаточно большими, чтобы считать их достаточными для диагностики. Напротив, Локтионов (Ьокйопоу) с соавторами (см. выше) смог показать существование большого отличия пациентов с СВС от здоровых людей с использованием расчетного показателя, связывающего количество ДНК, извлеченное из клеток, выделенных с поверхности стула, к массе стула (ДНКпоказатель кала или 8ΌΝΑΙ).

Диагностический способ на базе 8ΌΝΑΙ описан в патенте США № 6187546. Хотя методика и результаты описанных в данном патенте начальных испытаний явно выделяют очень эффективный простой и недорогой способ к массовому обследованию на СВС, патент характеризовался рядом существенных недостатков (очевидные сложности обращения с необработанным стулом и особенно важность процедуры стандартизации), не допускающих его широкое применение и серьезное внедрение в клиническую практику. Выяснилось также, что лишь относительное небольшое количество хорошо сохранившихся клеток может быть получено с поверхности человеческого стула с использованием данного метода |Вапба1с1оуа. е! а1., ΑΡΜΙ8 2002; 110: 239-246]. Упомянутые проблемы, из которых решающей является сложность стандартизации, вызывают серьезные сомнения в применении слущенных колоноцитов, выделенных из проб стула, в широкомасштабном массовом обследовании на СВС.

Существует много доказательств, указывающих, что слизисто-клеточный слой, покрывающий слизистую оболочку ободочной и толстой кишки человека, содержит особенно много хорошо сохранившихся слущенных колоноцитов. Кроме того, клеточное содержание данного слоя у пациентов с СВС оказывается намного большим, чем у здоровых людей, в основном, по причине присутствия значительно большего количества высокорезистентных раковых колоноцитов. Поэтому в опухолевых клетках пациентов с СВС, которые намного лучше адаптированы к автономному существованию, должен количественно доминировать пул слущенных клеток с прямой кишки. Ряд недавних сообщений о дистальной (например, анальной) имплантации персистирующих слущенных клеток с удаленных опухолей ободочной и толстой кишки [1епиег. Ό. С. е! а1., Όίδ. Со1оп Вес!ит 1998; 41: 1432-1434, νίηά, Ρ. е! а1., Όίδ. Со1оп Вес!ит 1998; 41: 1432-1434, НЫйет, V. Η. Όί§. 8игд. 2000; 17: 81-83, Нутап, Ν. аиб К1ба, Μ. Όίδ. Со1оп Вес!ит 2003; 46: 835-836, АЬЬакакоог, Е. е! а1., Апи. В. Со11. 8игд. Еид1. 2004; 86: 38-39] надежно подтверждает данную гипотезу.

Прямой доступ к слизистой оболочке прямой кишки возможен при рутинном пальцевом ректальном исследовании пальцем исследователя в перчатке. Однако, несмотря на достижимость контакта со слизисто-клеточным слоем прямой кишки при использовании данной простой манипуляции, значительные потери материала и одновременное загрязнение посторонним плоским эпителием анального канала являются неизбежными при извлечении пальца из прямой кишки. Мазки, приготовленные с перчаток, использованных для ректального исследования, показали хорошо сохранившиеся колоноциты в сочетании с сильным загрязнением клетками плоского эпителия.

Следовательно, существует настоятельная потребность в непосредственном отборе слущенных эпителиальных клеток с поверхности слизистой оболочки прямой кишки без проблем потери материала и серьезного загрязнения другими тканевыми элементами на стадии извлечения собирающей клетки поверхности из прямой кишки. Данные клетки можно не только использовать для количественного клеточного и ДНК-анализа, но также исследовать на присутствие дополнительных раковых биомаркеров (например, белков) и, в конечном счете, оценивать иммунологическими гистохимическими и цитологическими методами.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения, предлагается устройство для взятия проб толстокишечных клеток, содержащее элемент для колоректального введения, имеющий вводимый дистальный конец, проксимальный конец и закрываемую внутреннюю полость;

гибкую мембрану, имеющую внешнюю поверхность для взятия клеточных проб и внутреннюю поверхность, при этом упомянутая мембрана прикреплена с уплотнением к вводимому дистальному концу упомянутого элемента для введения и вмещена во внутреннюю полость;

так, что при применении нагнетание давления во внутренней полости до, по меньшей мере, первого повышенного давления вызывает выталкивание мембраны из дистального конца упомянутого элемента для введения, для контактирования с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки, и изменение давления во внутренней полости до второго пониженного давления вызывает выворачивание мембраны и ее возврат во внутреннюю полость упомянутого элемента для введения.

Устройство устраняет сложности пальцевого взятия проб удерживанием гибкой мембраны внутри

- 3 011367 элемента для введения, как при введении, так и при извлечении, и поэтому нет потерь материала, и проба не загрязняется клетками с других поверхностей (например, плоским эпителием).

Благодаря непосредственному взятию проб с поверхности слизистой оболочки устройство устраняет сложности, связанные с взятием проб необработанного стула, включая неприятный характер работы, низкую концентрацию получаемых клеток, высокие концентрации загрязнения каловыми веществами (особенно, бактериями), и, особенно, сложности стандартизации способа, связанные с упомянутыми проблемами, например, значительной изменчивостью объемов и консистенции стула.

Хотя устройство является инвазивным, оно намного менее инвазивно, чем устройства, применяемые в настоящее время для колоноскопии/сигмоидоскопии, и не требует работы с ним высококвалифицированного и хорошо обученного оператора. Устройство может быть даже самостоятельно вводимым. Сниженная степень инвазивности и отсутствие риска осложнений очевидно должны привести к большей приемлемости для пациентов. Данные преимущества должны, в свою очередь, обеспечивать возможность выполнения большего взятия проб и при меньших затратах.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гибкая мембрана является растягиваемой и изготовлена из упругого материала. В более предпочтительном варианте гибкая мембрана изготовлена из вещества на основе нитрила, латекса или каучука.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, закрываемая внутренняя полость элемента для введения является закрытой.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, устройство для взятия клеточных проб дополнительно содержит средство для нагнетания давления во внутренней полости, при этом упомянутое средство прикреплено к проксимальному концу элемента для введения.

В предпочтительном варианте, упомянутое средство для нагнетания давления во внутренней полости прикреплено к устройству для взятия клеточных проб через клапан (например, самоуплотняющийся клапан), находящийся на проксимальном конце элемента для введения.

Очевидно, что средство для нагнетания давления во внутренней полости может содержать любое средство, пригодное для подачи текучей среды (например, жидкости или газа) к гибкой мембране. В предпочтительном варианте, средство для нагнетания давления во внутренней полости содержит источник сжатого воздуха, шприц или насос (например, баллон).

Средство для нагнетания давления во внутренней полости предпочтительно содержит источник сжатого воздуха, который содержит механическое устройство, способное обеспечивать заданную величину первого повышенного давления и второго пониженного давления в устройстве для взятия клеточных проб. Данный вариант осуществления обладает преимуществом точного регулирования давления внутри элемента для введения, и механическое устройство обладает преимуществом возможности многократного применения с неограниченным числом одноразовых устройств для взятия проб толстокишечных клеток.

В более предпочтительном варианте, средство для нагнетания давления во внутренней полости содержит шприц. Применение шприца допускает как простую работу, так и закачивание постоянного объема воздуха к гибкой мембране (предпочтительно, по меньшей мере, десятикратное увеличение объема воздуха, присутствующего в гибкой мембране). Например, в варианте осуществления изобретения, в котором 100-мл шприц присоединен на проксимальном конце элемента для введения, плунжер упомянутого шприца можно сначала установить на отметку 70-90 мл. Поэтому первое повышенное давление заданной величины можно создать продвижением плунжера на максимальную длину (например, до 0-мл отметки), что должно наполнить гибкую мембрану объемом 70-90 мл воздуха. После этого можно впоследствии создать второе пониженное давление заданной величины оттягиванием плунжера шприца назад до его максимальной длины (например, до 100-мл отметки), что должно втянуть мембрану во внутреннюю полость элемента для введения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, шприц будет поставляться по меньшей мере с одним фиксирующим конструктивным элементом (например, местами защелок) для разметки положений плунжера шприца на каждой стадии во время применения (например, одного положения перед введением, одного во время введения и одного после извлечения). Преимущество использования шприца в качестве средства для нагнетания давления во внутренней полости состоит в том, что устройство для взятия проб толстокишечных клеток может быть выполнено с возможностью установки на широко доступное и одноразовое лабораторное и больничное оборудование. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, площадь внешней поверхности для взятия клеточных проб упомянутой гибкой мембраны можно воспроизводимо регулировать. Благодаря этому в контакт с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки, с которой отбирают пробу, можно приводить постоянную площадь поверхности, что обеспечивает поддающийся измерению сбор слущенных клеток, находящийся в определенном отношении с количеством, присутствующем на поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки. В предпочтительном варианте, площадь поверхности регулируется средством для нагнетания внутренней полости. Благодаря этому в контакт с поверхностью слизистой оболочки, с которой отбирают пробу, можно приводить постоянную площадь поверхности.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, элемент для введения выполнен с возможностью зацепления с трубкой для ректального доступа. Данный вариант осуществления обладает

- 4 011367 преимуществом возможности сначала ввода трубки для ректального доступа и обтуратора, например, оливообразного обтуратора (сочетание трубки для ректального доступа и обтуратора обычно называют проктоскопом) в открытую ректальную полость, затем извлечения обтуратора перед введением устройства для взятия проб в соответствии с изобретением. Затем устройство для взятия проб можно оставить зафиксированным в рабочем положении с трубкой для ректального доступа на любой период времени, который требуется для получения пробы. Затем обтуратор устанавливают обратно после того, как извлекут устройство для взятия проб, и обтуратор и трубку для ректального доступа извлекают совместно.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, элемент для введения выполнен с возможностью самостоятельного введения. В данном варианте осуществления, элемент для введения вводят вместе с трубкой для ректального доступа, и поэтому исключена потребность в обтураторе (например, элемент для введения имеет скругленный вводимый дистальный конец). Данный вариант осуществления обеспечивает преимущество, состоящее в том, что устройство для взятия проб в соответствии с изобретением может быть самостоятельно вводимым, например, пациенты смогут легко брать пробы слущенных клеток со слизистой оболочки своей прямой кишки. Предполагается, что в данном варианте осуществления элемент для введения и трубку для ректального доступа вводят и выводят совместно и разделяют только после вывода.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гибкая мембрана образует резервуар во время ее удерживания во внутренней полости упомянутого элемента для введения, так что можно добавлять текучую среду. Данный вариант осуществления изобретения позволил бы вводить реагенты в устройство для взятия проб уже после взятия пробы, без необходимости переноса пробы в отдельный резервуар и, тем самым, без какой-либо потери материала из пробы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, внутренняя полость элемента для введения снабжена адгезивным средством. Данный вариант осуществления изобретения действует посредством притягивания гибкой мембраны к стенкам внутренней полости элемента для введения сразу после того, как проба получена, и создание второго пониженного давления втянуло гибкую мембрану во внутреннюю полость элемента для введения. Данная характеристика обладает преимуществом обеспечения стабильного резервуара при наполнении жидкостью.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, элемент для введения выполнен с возможностью зацепления с уплотняющим средством для плотного закрывания упомянутого резервуара. Это должно обеспечивать хранение и транспортировку содержащего пробу устройства для взятия проб до выполнения дальнейших анализов пробы.

Уплотняющее средство предпочтительно является резьбовым колпачком. Резьбовой колпачок дает преимущество уплотнения резервуара для исключения потери пробы, а также может сниматься для дополнительного анализа.

В варианте осуществления, в котором устройство для взятия клеточных проб содержит средство для нагнетания давления во внутренней полости, при этом, упомянутое средство предпочтительно является отсоединяемым от элемента для введения. Это дает преимущество превращения устройства для взятия проб в компактную аналитическую ампулу, которую можно удобно транспортировать и хранить вместе со многими другими аналитическими ампулами для последующих реакций массового обследования.

В соответствии со вторым аспектом изобретения, предлагается набор для взятия пробы с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом набор содержит вышеописанное устройство взятия проб толстокишечных клеток и трубку для ректального доступа, и, опционно, обтуратор.

Применение трубки для ректального доступа обеспечивает более удобное введение устройства для взятия проб и предотвращает контакт между устройством для взятия проб и любой поверхностью, кроме поверхности слизистой оболочки, с которой следует взять пробу. Применение обтуратора дополнительно к трубке для ректального доступа может уменьшить дискомфорт от введения трубки для ректального доступа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения набор может дополнительно содержать смазку, например, смазывающий вазелин (например, вазелин К-Υ). Это дает преимущество обеспечения большего комфорта при введении обтуратора или устройства для взятия клеточных проб в соответствии с изобретением.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения обтуратор выводят из зацепления с трубкой для ректального доступа после введения соединенных обтуратора и трубки для ректального доступа в ректальную полость.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит уплотняющее средство, например, резьбовой колпачок, для зацепления с элементом для введения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит по меньшей мере один реагент, например, буфер. Применение буфера допускает подготовку пробы перед дальнейшим анализом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения буфер может находиться в резьбовом

- 5 011367 колпачке (например, в виде блистерной упаковки), так что крепление колпачка к элементу для введения выпускает буфер в резервуар (например, прокалыванием блистерной упаковки) для суспендирования клеток, присутствующих на пробоотборной поверхности гибкой мембраны перед дальнейшим анализом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения буфер является буфером для лизиса клеток, который обладает преимуществом обеспечения основного этапа перед извлечением ДНК. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления изобретения буфер является консервирующей клетки средой, которая обладает преимуществом обеспечения возможности усовершенствованных цитологического, биохимического и иммунологического гистохимического анализов результирующей клеточной пробы. Консервирующая клетки среда предпочтительно дополнена по меньшей мере одним культуральноклеточным компонентом (например, нутриентами и антибиотиками).

Кроме того, специалистам в данной области техники будет очевидно, что любые из вышеописанных устройств или наборов пригодны для взятия проб слущенной эпителиальной ткани (например, колоноцитов) с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки человека.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предлагается способ взятия количественных проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека без загрязнения пробы из-за контакта с другими поверхностями тела, при этом способ содержит следующие этапы:

приближают устройство для взятия проб, содержащее изолированную поверхность для взятия клеточных проб, к поверхности слизистой ободочной и толстой кишки, с которой отбирают пробу, без контактирования до этого с любой другой поверхностью тела;

приводят поверхность для взятия клеточных проб в контакт с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки так, что получают пробу с поверхности слизистой оболочки; и отводят устройство для взятия проб и пробу от поверхности слизистой оболочки без приведения изолированной поверхности для взятия клеточных проб или пробы в контакт с любой другой поверхностью тела.

Данный способ включает в себя основные этапы непосредственного взятия пробы слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки и обеспечивает, чтобы проба не загрязнялась контактами мембраны для взятия клеточных проб с другими поверхностями тела. Загрязнение исключается изолированием пробоотборной поверхности, при этом изолирование можно определить как изолирование или отделение пробоотборной поверхности до приведения ее в контакт с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки или после сбора клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки.

В соответствии с четвертым аспектом изобретения предлагается способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом способ содержит следующие этапы:

вводят устройство для взятия проб толстокишечных клеток в соответствии с изобретением в ректальную полость и приближают упомянутое устройство к поверхности слизистой ободочной и толстой кишки без контактирования до этого внешней поверхности для взятия клеточных проб гибкой мембраны с любой другой поверхностью тела;

нагнетают давление во внутренней полости до, по меньшей мере, первого повышенного давления, так что гибкая мембрана выталкивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются поверхности слизистой ободочной и толстой кишки внешней поверхностью для взятия клеточных проб упомянутой мембраны для получения пробы слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки;

создают второе пониженное давление во внутренней полости, так что гибкая мембрана выворачивается, и проба, присутствующая на поверхности для взятия клеточных проб упомянутой мембраны, возвращается во внутреннюю полость устройства для взятия клеточных проб; и отводят устройство для взятия клеточных проб от поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки и выводят упомянутое устройство из ректальной полости без приведения мембраны или пробы в контакт с любой другой поверхностью тела.

Очевидно, что устройство для взятия клеточных проб может дополнительно нуждаться в трубке для ректального доступа, причем либо в одной данной трубке, либо вместе с обтуратором.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно содержит следующие этапы:

вводят соединенные устройство для взятия проб толстокишечных клеток в соответствии с изобретением и трубку для ректального доступа в ректальную полость; и выводят упомянутое устройство для взятия проб и пробу из трубки для ректального доступа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно содержит следующие этапы:

вводят соединенные трубку для ректального доступа и обтуратор в ректальную полость;

выводят обтуратор из трубки для ректального доступа до введения устройства для взятия проб; выводят устройство для взятия проб и пробу;

вставляют обратно обтуратор через трубку для ректального доступа и

- 6 011367 выводят соединенные трубку для ректального доступа и обтуратор из ректальной полости.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предлагается способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом способ содержит следующие этапы:

вводят трубку для ректального доступа и обтуратор в ректальную полость через анальный канал; выводят обтуратор из трубки для ректального доступа;

вводят устройство для взятия проб толстокишечных клеток в соответствии с изобретением в ректальную полость через трубку для ректального доступа, без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с любой другой поверхностью тела;

нагнетают давление во внутренней полости до, по меньшей мере, первого повышенного давления, так что гибкая мембрана выталкивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются поверхности слизистой ободочной и толстой кишки внешней поверхностью для взятия клеточных проб упомянутой мембраны;

получают пробу слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки; создают второе пониженное давление во внутренней полости, так что гибкая мембрана выворачивается, и проба, присутствующая на поверхности для взятия клеточных проб упомянутой мембраны, возвращается во внутреннюю полость устройства для взятия клеточных проб;

выводят устройство для взятия клеточных проб из ректальной полости через трубку для ректального доступа, без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с какой-либо поверхностью тела;

вставляют обратно обтуратор через трубку для ректального доступа; и выводят трубку для ректального доступа и обтуратор из прямой кишки через анальный канал.

Очевидно, что, пока трубка для ректального доступа остается введенной в ректальную полость, можно ввести дополнительное устройство для взятия клеточных проб в соответствии с изобретением в ректальную полость. Например, можно ввести первое устройство для взятия клеточных проб, которое содержит буфер для лизиса клеток, чтобы создать возможность извлечения и анализа (например, количественного) ДНК любых взятых в пробе клеток. После этого можно ввести второе устройство для взятия клеточных проб, которое содержит консервирующую клетки среду, чтобы создать возможность цитологического, биохимического и иммунологического гистохимического анализов любых взятых в пробе клеток.

В соответствии с альтернативным аспектом изобретения предлагается устройство для взятия проб для сбора пробы с поверхности слизистой оболочки, расположенной в ректальной полости обследуемого, при этом устройство содержит по существу, цилиндрический корпус, который имеет открытую полость на дистальном конце и закрываемую полость на проксимальном конце;

гибкую мембрану, вмещенную в, по существу, цилиндрический корпус, которая образует уплотнение, отделяющее открытую дистальную полость от закрываемой проксимальной полости; при этом двумя поверхностями мембраны являются проксимальная поверхность и дистальная поверхность; и средства для накачивания и откачивания, при этом средство для накачивания может повышать внутреннее давление текучей среды в закрываемой проксимальной полости в закрытом состоянии и, тем самым, вынуждает мембрану выворачиваться из дистального конца, по существу, цилиндрического корпуса, пока дистальная поверхность мембраны не коснется поверхности слизистой оболочки, с которой отбирают пробу; и средство для откачивания может понижать давление текучей среды в закрываемой проксимальной полости и, тем самым, вынуждает мембрану выворачиваться так, что мембрана вмещается в, по существу, цилиндрический корпус после того, как дистальная поверхность мембраны коснулась поверхности слизистой оболочки, с которой отбирают пробу.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения средство для откачивания представляет собой клапан. Данный вариант осуществления изобретения был бы особенно подходящим для применения с упругой мембраной, когда внутреннее давление в закрываемой проксимальной полости больше, чем снаружи полости.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения средство для откачивания содержит шприц, соединенный с клапаном.

В соответствии со вторым альтернативным аспектом изобретения, предлагается способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки, расположенной в ректальной полости обследуемого, при этом способ содержит следующие этапы:

приближают устройство для взятия проб в соответствии с изобретением к поверхности слизистой оболочки без контактирования до этого пробоотборной мембраны с любой другой поверхностью тела;

повышают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости, так что гибкая мембрана выворачивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются поверхности слизистой оболочки дистальной поверхностью мембраны, чтобы получить пробу слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки;

- 7 011367 понижают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости, так что гибкая мембрана выворачивается обратно, и данная мембрана и проба вмещаются в открытую дистальную полость; и отводят устройство и пробу от поверхности слизистой оболочки без приведения мембраны или пробы в контакт с любой другой поверхностью тела.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ содержит следующие этапы: прикрепляют источник сжатого воздуха к клапану и повышают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости открыванием клапана или прикрепляют шприц к клапану и повышают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости введением плунжера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ содержит следующие этапы: понижают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости открыванием клапана; или понижают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости отведением плунжера.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ содержит следующие этапы: вводят буфер для лизиса клеток или консервирующую клетки среду в открытую дистальную полость устройства для взятия проб; и плотно закрывают открытую дистальную полость устройства для взятия проб.

В соответствии с третьим альтернативным аспектом изобретения предлагается способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки, расположенной в ректальной полости обследуемого человека, при этом способ содержит следующие этапы:

вводят трубку для ректального доступа и обтуратор в ректальную полость через анальный канал;

выводят обтуратор из трубки для ректального доступа; вводят устройство для взятия проб в соответствии с изобретением в ректальную полость через трубку для ректального доступа, без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с любой другой поверхностью тела;

подсоединяют устройство для взятия проб к средству для накачивания;

повышают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости, так что гибкая мембрана выворачивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются ректальной слизистой оболочки пробоотборной поверхностью с постоянной площадью поверхности;

получают пробу слущенных клеток с поверхности ректальной слизистой оболочки;

понижают внутреннее давление в закрытой проксимальной полости, так что гибкая мембрана выворачивается обратно, и данная мембрана и проба вмещаются в открытую дистальную полость;

выводят устройство для взятия проб из ректальной полости через трубку для ректального доступа, без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с любой поверхностью тела;

вставляют обратно обтуратор через трубку для ректального доступа;

выводят трубку для ректального доступа и обтуратор из ректальной полости через анальный канал;

вводят буфер для лизиса клеток или консервирующую клетки среду в открытую дистальную полость; и плотно закрывают открытую дистальную полость устройства для взятия проб.

В соответствии с четвертым альтернативным аспектом изобретения предлагается способ массового обследования и диагностики на рак ободочной и толстой кишки, при этом способ содержит любой из вышеописанных способов и дополнительно содержит этапы, состоящие в том, что извлекают собранную пробу из устройства для взятия проб и выполняют анализ пробы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения анализ выбирают из количественного определения ДНК, извлечения ДНК с последующим ее количественным определением и возможным молекулярным анализом, цитологическим/цитохимическим исследованием и биохимическими пробами. Следует отметить, что точность массового обследования любым из упомянутых способов будет повышаться при обеспечении пробы с низкими концентрациями загрязняющих примесей и высокой концентрацией клеток, отбираемых с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки, подлежащей взятию пробы.

Краткое описание чертежей

Ниже представлено описание изобретения только для примера, со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых фиг. 1 - сечение устройства для взятия клеточных проб в соответствии с изобретением;

фиг. 2 - схематичное представление устройства для взятия клеточных проб в соответствии с изобретением, в котором нагнетательное средство содержит шприц;

фиг. 3 - схематичное представление устройства для взятия клеточных проб в соответствии с изобретением, в котором средство для нагнетания давления содержит источник сжатого воздуха;

фиг. 4 представляет компоненты, необходимые для взятия пробы слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека;

фиг. 5 - пример способа взятия пробы слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека с использованием любого из устройств, изображенных на фиг. 1-4;

фиг. 6 - пример этапов, которые могут следовать за способом, изображенным на фиг. 5.

- 8 011367

Подробное описание изобретения

Описание вариантов осуществления взятия клеточных проб

Устройство для взятия клеточных проб, показанное на фиг. 1, выполнено с возможностью введения в ректальную полость. Устройство содержит, по существу, цилиндрический элемент 1 для введения с внутренней полостью 3, закрытой на вводимом дистальным конце 2 гибкой и упругой мембраной 4, которая прикреплена с уплотнением к элементу 1 на дистальном конце 2. В положении, показанном на фиг. 1, мембрана 4 вмещена в полость 3 и выполнена с возможностью выталкивания из полости 3, когда в полости 3 нагнетают давление средством 7 (более подробно изображенным на фиг. 2). Мембрана 4 содержит поверхность 5 для взятия клеточных проб, которая в исходном положении, показанном на фиг. 1, является внутренней поверхностью, но, когда мембрана выталкивается, является внешней поверхностью, и противолежащую поверхность 6, которая в исходном положении является внешней поверхностью, но которая становится внутренней поверхностью, когда мембрана выталкивается. Мембрана выполнена из вещества на основе нитрила, латекса или каучука. На проксимальном конце 34 полость 3 закрыта самоуплотняющимся клапаном 18, который выполнен с возможностью присоединения к нему нагнетательного средства 7.

Вариант осуществления изобретения, в котором средство 7 для нагнетания давления во внутренней полости является встроенным шприцом, показан на фиг. 2, на которой схематично показаны также этапы, необходимые для взятия пробы слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека (фиг. 2Ά-2Ό).

На фиг. 2 А представлено устройство для взятия клеточных проб до введения в ректальную полость. Шприц 7 прикреплен к элементу 1 для введения, по существу, аналогичному тому, который показан на фиг. 1. Шприц содержит плунжер 23, который движется с уплотнением вдоль цилиндра 32 шприца 7 для изменения объема во внутренней камере 33 шприца 7. Плунжер 23 шприца 7 устанавливают так, чтобы в камере 33 шприца 7 находилось 70 мл сжатого воздуха.

На фиг. 2В представлено устройство для взятия клеточных проб после введения в ректальную полость. Плунжер 23 шприца полностью нажат, что вызывает расширение гибкой мембраны 4 до объема 70 мл. Затем расширенная гибкая мембрана 4 касается поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека, так что любые слущенные клетки переносятся на внешнюю поверхность гибкой мембраны 4.

На фиг. 2С представлено устройство для взятия клеточных проб после того, как взята проба слущенных клеток, и до выведения из ректальной полости. Плунжер 23 шприца 7 отводят назад, так что в камере шприца 7 оказывается 80 мл воздуха. В связи с этим, внутри камеры создается пониженное давление, которое вызывает втягивание гибкой мембраны 4 обратно во внутреннюю полость элемента 1 для введения и плотное прилипание к боковым стенкам элемента 1 для введения. Величина пониженного давления может быть предварительно количественно задана присутствием двух защелкивающихся фиксирующих конструктивных элементов 24 (лишь один из которых показан на фиг. 2С). Защелкивающиеся конструктивные элементы 24 представляют собой рычажки, находящиеся на плунжере 23 шприца 7, которые размещаются в отверстиях на цилиндре 32 шприца 7. Назначение защелкивающихся конструктивных элементов 24 состоит в предотвращении извлечения плунжера 23 из шприца 7.

На фиг. 2Ό представлено устройство для взятия клеточных проб после выведения из ректальной полости и до анализа клеток. Вводимый дистальный конец элемента 1 для введения снабжен резьбой, которая выполнена с возможностью установки резьбовой колпачковой гайки 8 диаметром 20 мм. Колпачок 8 может содержать блистерную упаковку, содержащую буфер, так что, после навертывания колпачковой гайки 8 на элемент 1 для введения, буфер выпускается в резервуар, образованный откаченной гибкой мембраной 4. После того, как колпачковую гайку 8 навертывают на элемент 1 для введения, шприц 7 может быть отсоединен от элемента 1 для введения, чтобы обеспечить превращение элемента 1 для введения в компактную аналитическую ампулу, которую, вместе с множеством других ампул, можно упаковывать и отправлять в лабораторию для анализа клеток.

Вариант осуществления изобретения, в котором средство для нагнетания внутренней полости 7 является источником сжатого воздуха, показан на фиг. 3. На данной фигуре схематично показано механическое устройство 9, которое представляет собой насос, работающий от электродвигателя (не показанного) и способный многократно создавать уровни первого повышенного давления и, вслед за ним, второго пониженного давления после срабатывания пускового 14 элемента. Механическое устройство 9 допускает крепление к элементу 1 для введения, по существу, как показано на фиг. 1 и 2, при помощи защелкивающегося базирующего элемента 16, имеющегося на механическом устройстве 9, который взаимодействует с установочной втулкой 17 на элементе 1 для введения. На элементе 1 для введения расположен самоуплотняющийся клапан 18 для обеспечения сохранения давления внутри элемента 1 для введения после отсоединения от механического устройства 9. Элемент 1 для введения содержит лепестки 19, которые предназначены для зацепления с проктоскопом, и содержит резьбу 20 на вводимом дистальном конце для установки резьбового колпачка 8, содержащего блистерную упаковку 21, содержащую буфер. Механическое устройство 9 предназначено для питания от батарейки и может подзаряжаться от источника питания через зарядное гнездо 12. Механическое устройство 9 содержит впускной воздушный

- 9 011367 фильтр 25, обрезиненную рукоятку 13, а также содержит двухпозиционный переключатель 15 и светоизлучающие диоды 10 и 11, которые указывают, когда устройство 9 находится в готовности, и когда завершен цикл приложения первого и второго давлений.

Во время применения, пользователь удерживает механическое устройство 9 за обрезиненный захват рукоятки 13 пистолетного типа и соединяет устройство 9 с элементом 1 для введения. Затем элемент для введения вводят в ректальную полость, в которой он зацепляется с проктоскопом с помощью лепестков 19, что дает возможность повышенной точности повторения введения. Первое повышенное давление создается пользователем посредством нажатия пускового 14 элемента, что вызывает втягивание воздуха в механическое устройство 9 через впускной воздушный фильтр 25, который затем сжимается и вызывает выталкивание гибкой мембраны из дистального конца элемента 1 для введения для приведения ее в контакт с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки. Затем создается второе пониженное давление нажатием пользователем пускового 14 элемента второй раз, что вызывает возврат гибкой мембраны обратно во внутреннюю полость элемента 1 для введения. После завершения взятия клеточной пробы, элемент 1 для введения отцепляют от проктоскопа, и механическое устройство 9 отсоединяют от элемента 1 для введения, и давление внутри элемента 1 для введения сохраняется посредством самоуплотняющегося клапана 18. Затем резьбовой колпачок 8, содержащий блистерную упаковку 21, содержащую буфер, можно навернуть на резьбу 20 на элементе 1 для введения, что вызывает выпускание буфера в резервуар, образованный откаченной гибкой мембраной. Затем механическое устройство 9 можно повторно использовать соединением со следующим элементом 1 для введения.

Компоненты, необходимые для контактного метода взятия клеточных проб

Компоненты, необходимые для взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека, показаны на фиг. 4.

ί) Доступ к слизистой оболочке прямой кишки можно получить с помощью трубки 29 для ректального доступа, которая может быть модификацией существующего инструмента для ректального исследования (например, ректоскопа 22). Трубка 29 для ректального доступа состоит из жесткой трубки (с рукояткой), оборудованной обтуратором 30, обеспечивающим оливообразный наконечник и непрерывную поверхность, облегчающую введение трубки 29 для ректального доступа через анальный канал в прямую кишку.

ίί) Устройство 1 для взятия клеточных проб, показанное на фиг. 4, является, по существу, аналогичным тому, которое показано на фиг. 1, и имеет внешний диаметр, совместимый с внутренним диаметром трубки для ректального доступа, т.е. в пределах 15-20 мм.

ϊϊΐ) Источник 7 сжатого воздуха служит для обеспечения средства для нагнетания давления во внутренней полости. Средство 7 для нагнетания может содержать шприц (как показано на фиг. 2), воздушный насос (как показано на фиг. 3) или миниконтейнер (минибаллон) сжатого воздуха. Давление воздуха внутри устройства для взятия клеточных проб можно ограничивать/регулировать либо использованием фиксированного объема воздуха (простым техническим решением со шприцом), либо достижением постоянного уровня давления воздуха (для этой цели потребовался бы прецизионный клапан).

ίν) Сосуд или пробирка со специальным буфером 35 (для разных целей следует применять разные буферы, например, для извлечения ДНК или РНК или выделения/сепарации клеток для последующего анализа).

ν) Герметичный колпачок 8 для устройства для взятия клеточных проб (необходимый для проведения реакций лизиса клеток/белков, если выполняется немедленное извлечение ДНК или РНК, для процедур выделения клеток и, особенно, хранения/транспортировки материала, если его не используют сразу, например, для транспортировки из операционной/клиники в лабораторию).

Компоненты, необходимые для процедур, могут быть разработаны для применения в виде одноразового набора, который должен содержать все перечисленные компоненты, за исключением источника сжатого воздуха, который можно использовать многократно.

Описание контактного метода взятия клеточных проб (ректальные манипуляции)

На фиг. 5 представлен пример контактного метода взятия клеточных проб для взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека с использованием любого из устройств, показанных на фиг. 1-4. Данная процедура является простой, и для ее выполнения не требуется специальной подготовки оператора по проктологии или эндоскопии. Данная процедура может выполняться любым квалифицированным медицинским специалистом (общепрактикующим врачом (СР), медсестрой и т.п.) в местном хирургическом отделении или на дому у пациента, или данная процедура может быть даже выполнена самостоятельно пациентом.

На фиг. 5А схематично представлено сечение анатомического строение прямой кишки 28 человека, анального канала 26 и слизисто-клеточного слоя 27 ободочной и толстой кишки. Следует отметить, что любой контакт устройства для взятия клеточных проб с плоским эпителием анального канала может приводить как к потере материала, так и к загрязнению пробы плоским эпителием анального канала.

Процедура начинается с введения напоминающей ректоскоп трубки 29 для ректального доступа вместе с обтуратором 30 в требуемое место в прямой кишке 28 (фиг. 5В). Можно применить смазку, подходящую для процедуры введения, для ее облегчения и ослабления дискомфорта пациента, который мо- 10 011367 жет быть создан на данном начальном этапе процедуры.

После того, как трубка 29 для ректального введения введена (фиг. 5С), и обтуратор 30 выведен, достигается непосредственный доступ к слизистой оболочке прямой кишки, и открывается слизистоклеточный слой 27.

Элемент 1 для введения вводят в трубку 29 для ректального доступа так, чтобы верхняя кромка элемента для введения располагалась непосредственно над кромкой трубки для ректального доступа (фиг. 5Ό).

Нагнетают первое повышенное давление, которое раздувает пробоотборную гибкую мембрану для приведения мембраны в контакт со слизисто-клеточным слоем 27 ободочной и толстой кишки, чтобы обеспечить контактное взятие клеточной пробы (фиг. 5Е). Устройство оставляют в данном положении на, приблизительно 10-15 с для достижения более надежной адгезии слущенных клеток и материалов клеточного происхождения из слизисто-клеточного слоя к пробоотборной мембране.

На фиг. 5Е показано создание второго пониженного давления, которое откачивает гибкую мембрану и вызывает ее возврат в исходное положение вместе с материалом 31, собранным на внешней поверхности для взятия клеточной пробы.

Элемент 1 для введения выводят из трубки 29 для ректального доступа и берут для дальнейших манипуляций и анализов. Обтуратор 30 (можно применить новый, повторно смазанный обтуратор) повторно вставляют в трубку 29 для ректального доступа, и трубку 29 выводят из прямой кишки 28 (см. фиг. 50). Полная процедура (манипуляции ректального обследования) должна занимать не более пары минут.

Обработка собранных клеток

На фиг. 6 представлен пример этапов, которые могут следовать за способом, изображенным выше на фиг. 5А-50, и которые следует выполнять сразу после сбора клеток во избежание высыхания мембраны для взятия клеточной пробы. На этапе (а) показано устройство 1 для взятия клеточных проб со слущенными клетками 31 на гибкой мембране для взятия клеточной пробы после сбора клеток. Верхний отсек устройства для взятия клеточных проб наполняют фиксированным объемом специфического буфера 35, который растворяет или суспендирует слущенные клетки (этап (Ь)). Для процедур извлечения ДНК или РНК можно использовать разные буферы для лизиса клеток или консервирующие клетки среды, а для задач, требующих выделения клеток, следует применять специальные буферы/среды. Устройство для взятия клеточных проб подготовлено для транспортировки или хранения проб благодаря герметичному закрыванию надежным резьбовым колпачком 8 (этап (с)), но следует понимать, что, когда резьбовой колпачок содержит блистерную упаковку с буфером, то этап (Ь) можно не выполнять. Затем устройство можно хранить или транспортировать для дополнительных последующих процедур массового обследования/диагностики и/или в научных целях (этап (б)).

Анализ проб

Следует подчеркнуть, что способ обеспечивает намного более высокую степень стандартизации по сравнению с другими существующими способами. Применение стандартного устройства со стандартным давлением/объемом воздуха, стандартной площадью накачиваемой пробоотборной мембраны (площадь контакта со слизисто-клеточным слоем прямой кишки может изменяться, но это изменение является ничтожным по сравнению с другими способами получения слущенных клеток, например, способами, основанными на манипулировании со стулом) и стандартным объемом буфера, вводимого после процедуры взятия клеточной пробы, создает очень выгодные условия для сравнительного анализа либо количеств клеток, либо количеств веществ клеточного происхождения (например, ДНК).

(а) Анализ проб с целью массового обследования на рак ободочной и толстой кишки.

Обследование на рак ободочной и толстой кишки предполагает массовое обследование из групп населения (определенного возраста), не имеющих жалоб, на выявление бессимптомных (в большинстве случаев - ранних) случаев заболевания, своевременное лечение которых может снизить смертность, обусловленную заболеванием. Одним обязательным требованием к способу является его одновременная применимость к тысячам/миллионам людей.

ί) Если существуют ясные указания на значительно повышенные количества колоноцитов и происходящей из колоноцитов ДНК в слизисто-клеточном слое прямой кишки пациентов с раком ободочной и толстой кишки по сравнению с лицами, не имеющими опухолей, то очень вероятно, что способ непосредственного взятия проб слущенных колоноцитов или материалов, происходящих из колоноцитов, может обеспечить простой скрининг-тест на рак ободочной и толстой кишки на основе непосредственного количественного определения ДНК, извлекаемой из клеток. В данном способе исходным буфером, применяемым сразу после взятия клеточной пробы, должен быть буфер для лизиса клеток, подходящий для выбранной процедуры извлечения ДНК. Введение буфера должно обеспечить эффективный лизис клеток и консервацию ДНК-содержащего материала во время транспортировки в специализированную лабораторию и (возможно) некоторого периода хранения. Способ извлечения ДНК следует подбирать с учетом его применимости для высокопроизводительного анализа, т.е. данный способ должен быть совместимым с многоканальными роботизированными системами манипулирования жидкостями. Точные значения количеств ДНК, определяющие «положительный», «отрицательный» и «сомнительный» результаты теста, должны быть установлены в ходе клинических испытаний.

- 11 011367 ίί) Аналогичные начальные этапы извлечения ДНК можно применить для анализа молекулярных маркеров рака ободочной и толстой кишки. Клетки, отбираемые в пробу контактным способом, должны обеспечить ДНК намного более высокого качества, чем применяемые в настоящее время технологии извлечения ДНК из проб стула. Амплификацию данной ДНК посредством РСК. (полимеразно-цепьевой реакции) можно выполнить без точного количественного определения ее количества. Молекулярный анализ по нескольким клеткам-мишеням считается возможным вариантом для массового обследования на рак ободочной и толстой кишки, однако он может быть более затратным по времени и стоимости по сравнению с непосредственным количественным анализом. В то же время, ДНК, извлеченную для непосредственного количественного определения, безусловно, можно использовать для амплификации посредством РСК при дополнительном диагностическом анализе в количественно «положительном» или «сомнительном» случаях.

ϊϊΐ) При необходимости специфического выделения колоноцитов из клеток других типов можно применить способы разделения (например, иммуномагнитное разделение или разделение в градиенте плотности), чтобы обеспечить высокую чистоту клеточной популяции колоноцитов для анализа. Для данной цели можно применить некоторые консервирующие клетки среды, содержащие антибиотики (невозможно исключить присутствие какого-то количества бактерий в отобранном материале) и муколитические средства. Затем выделенные колоноциты можно использовать для разнообразных анализов, например, извлечения и количественного определения ДНК, извлечения ДНК с последующей амплификацией посредством РСК, молекулярного и биохимического анализа маркеров рака, цитологической/цитохимической оценки и непосредственного счета клеток (сомнительные с точки зрения массового обследования из-за низкой скорости и высокой стоимости).

(Ь) Диагностика рака ободочной и толстой кишки.

Диагностическое применение тестов сфокусировано на лицах, предъявляющих некоторые конкретные жалобы или уже выявленных в качестве больных по состоянию. Намеченные группы пациентов намного меньше, чем группы, предполагаемые к массовому обследованию.

ί) Непосредственное количественное определение ДНК можно применить к лицам, предъявляющим жалобы, указывающие на возможные заболевания ободочной и толстой кишки.

ίί) Извлечение ДНК с последующими амплификацией посредством РСК и молекулярным анализом может быть полезным как для подтверждения первичного диагноза, так и для усовершенствованных диагностических процедур (оценка агрессивности рака, чувствительности к хемотерапии метастатических опухолей, прогнозирования и т.д.).

ϊϊΐ) Выделение клеток можно использовать, как для дополнительного молекулярного/биохимического анализа, так и для цитологического исследования (опухолевые клетки со специфичными морфологическими признаками можно легко выявлять среди слущенных колоноцитов пациентов с СКС).

Claims (23)

1. Устройство для взятия проб толстокишечных клеток, содержащее элемент для колоректального введения, имеющий вводимый дистальный конец, проксимальный конец и закрываемую внутреннюю полость;

гибкую мембрану, имеющую внешнюю поверхность для взятия клеточных проб и внутреннюю поверхность, при этом упомянутая мембрана прикреплена с уплотнением к вводимому дистальному концу упомянутого элемента для введения и вмещена во внутреннюю полость;

средство для нагнетания давления, выполненное с возможностью нагнетания давления во внутренней полости по меньшей мере до первого повышенного давления, которое вызывает выталкивание мембраны из дистального конца упомянутого элемента для введения для контактирования с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки, и понижения давления во внутренней полости до второго пониженного давления таким образом, что величина понижения давления больше величины повышения давления, что вызывает выворачивание мембраны и ее возврат во внутреннюю полость упомянутого элемента для введения.

2. Устройство по п.1, в котором гибкая мембрана является упругой и изготовлена из вещества на основе нитрила, латекса или каучука.

3. Устройство по п.1 или 2, в котором закрываемая внутренняя полость элемента для введения закрыта.

4. Устройство по любому из предшествующих пунктов, в котором средство для нагнетания давления во внутренней полости прикреплено к проксимальному концу элемента для введения.

5. Устройство по п.4, в котором упомянутое средство для нагнетания давления во внутренней полости прикреплено к клапану, такому как самоуплотняющийся клапан, имеющемуся на проксимальном конце элемента для введения.

6. Устройство по п.4 или 5, в котором упомянутое средство для нагнетания давления во внутренней полости содержит источник сжатого воздуха или шприц.

- 12 011367

7. Устройство по любому из предшествующих пунктов, в котором элемент для введения выполнен с возможностью зацепления с трубкой для ректального доступа.

8. Устройство по любому из предшествующих пунктов, в котором гибкая мембрана образует резервуар во время ее удерживания во внутренней полости упомянутого элемента для введения, так что можно добавлять текучую среду.

9. Устройство по любому из предшествующих пунктов, в котором внутренняя полость элемента для введения снабжена адгезивным средством.

10. Устройство по любому из предшествующих пунктов, в котором элемент для введения выполнен с возможностью зацепления с таким уплотняющим средством, как резьбовой колпачок, для уплотнения упомянутого резервуара.

11. Устройство по любому из пп.4-10, в котором упомянутое средство для нагнетания давления во внутренней полости является отсоединяемым от элемента для введения.

12. Набор для взятия пробы с поверхности слизистой ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом набор содержит устройство для взятия проб толстокишечных клеток по любому из пп.1-11 и трубку для ректального доступа, и, опционно, обтуратор.

13. Набор по п.12, который дополнительно содержит такую смазку, как смазывающий вазелин.

14. Набор по п.12 или 13, который дополнительно содержит такое уплотняющее средство, как резьбовой колпачок, для зацепления с элементом для введения.

15. Набор по любому из пп.12-14, который дополнительно содержит по меньшей мере один такой реагент, как буфер для лизиса клеток или консервирующую клетки среду.

16. Набор по п.15, в котором упомянутый по меньшей мере один реагент находится в резьбовом колпачке в форме блистерной упаковки.

17. Способ взятия количественных проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека без загрязнения пробы из-за контакта с другими поверхностями тела, при этом способ содержит следующие этапы:

приближают устройство для взятия проб, содержащее изолированную поверхность для взятия клеточных проб, к поверхности слизистой ободочной и толстой кишки, с которой отбирают пробу, без контактирования до этого с любой другой поверхностью тела;

приводят поверхность для взятия клеточных проб в контакт с поверхностью слизистой ободочной и толстой кишки так, что получают пробу с поверхности слизистой оболочки; и отводят устройство для взятия проб и пробу от поверхности слизистой оболочки без приведения изолированной поверхности для взятия клеточных проб или пробы в контакт с любой другой поверхностью тела.

18. Способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки обследуемого человека, при этом способ содержит следующие этапы:

вводят устройство для взятия проб толстокишечных клеток по любому из пп.1-11 в ректальную полость и приближают упомянутое устройство к поверхности слизистой ободочной и толстой кишки без контактирования до этого внешней поверхности для взятия клеточных проб гибкой мембраны с любой другой поверхностью тела;

нагнетают давление во внутренней полости по меньшей мере до первого повышенного давления, так что гибкая мембрана выталкивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются поверхности слизистой ободочной и толстой кишки внешней поверхностью для взятия клеточных проб упомянутой мембраны для получения пробы слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки;

создают второе пониженное давление во внутренней полости, так что гибкая мембрана выворачивается и проба, присутствующая на поверхности для взятия клеточных проб упомянутой мембраны, возвращается во внутреннюю полость устройства для взятия клеточных проб; и отводят устройство для взятия клеточных проб от поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки и выводят упомянутое устройство из ректальной полости без приведения мембраны или пробы в контакт с любой другой поверхностью тела.

19. Способ по п.18, который дополнительно содержит следующие этапы:

вводят соединенные устройство для взятия проб толстокишечных клеток по любому из пп.1-11 и трубку для ректального доступа в ректальную полость; и выводят упомянутое устройство для взятия проб и пробу из трубки для ректального доступа.

20. Способ по п.18, который дополнительно содержит следующие этапы:

вводят соединенные трубку для ректального доступа и обтуратор в ректальную полость;

выводят обтуратор из трубки для ректального доступа до введения устройства для взятия проб по любому из пп.1-15;

выводят устройство для взятия проб и пробу;

вставляют обратно обтуратор через трубку для ректального доступа и выводят соединенные трубку для ректального доступа и обтуратор из ректальной полости.

21. Способ взятия проб слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой

- 13 011367 кишки обследуемого человека, при этом способ содержит следующие этапы:

вводят трубку для ректального доступа и обтуратор в ректальную полость через анальный канал;

выводят обтуратор из трубки для ректального доступа;

вводят устройство для взятия проб толстокишечных клеток по любому из пп.1-11 в ректальную полость через трубку для ректального доступа, без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с любой другой поверхностью тела;

нагнетают давление во внутренней полости по меньшей мере до первого повышенного давления, так что гибкая мембрана выталкивается из дистального конца устройства для взятия проб;

касаются поверхности слизистой ободочной и толстой кишки внешней поверхностью для взятия клеточных проб упомянутой мембраны;

получают пробу слущенных клеток с поверхности слизистой оболочки ободочной и толстой кишки;

создают второе пониженное давление во внутренней полости, так что гибкая мембрана выворачивается и проба, присутствующая на поверхности для взятия клеточных проб упомянутой мембраны, возвращается во внутреннюю полость устройства для взятия клеточных проб;

выводят устройство для взятия клеточных проб из ректальной полости через трубку для ректального доступа без приведения гибкой мембраны устройства для взятия проб в контакт с какой-либо поверхностью тела;

вставляют обратно обтуратор через трубку для ректального доступа и выводят трубку для ректального доступа и обтуратор из прямой кишки через анальный канал.

22. Способ массового обследования и диагностики на рак ободочной и толстой кишки, при этом способ содержит любой способ взятия проб по любому из пп.17-21 и дополнительно содержит этапы, состоящие в том, что извлекают собранную пробу из устройства для взятия проб и выполняют диагностический анализ пробы.

23. Способ по п.22, в котором упомянутый анализ выбирают из количественного определения ДНК, извлечения ДНК с последующим ее количественным определением и возможным молекулярным анализом, цитологическим/цитохимическим исследованием и биохимическими пробами.