NO339684B1 - Kolorektal celleprøvetakingsanordning - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår en anordning for å innhente en prøve av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske, et kit som omfatter denne anordning. Fremgangsmåter for kolorektal celleprøvetaking ved anvendelse av anordningen er også beskrevet.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Sporadisk kolorektal cancer (CRC) er en av de mest vanlig forekommende og dødelige av de onkologiske sykdommene som affekterer mennesker i utviklede vestlige land. Den affiserer hovedsakelig mennesker eldre enn 50 år.

Et alvorlig hinder for tidlig diagnostikk av CRC er fravær av tidlig, enkelt identifiserbare kliniske manifestasjoner i de fleste tilfeller. Det er kun i de fremskredne stadier av sykdommen, når større tumorer er blitt dannet, hvilket fører til smerte, blødning og symptomer på obstruksjon, at sykdommen enkelt kan diagnostiseres. Imidlertid er de sene stadier av sykdommen også forbundet med invasive eller metastatiske tumorer. Følgelig vil deteksjon av kolorektale tumorer forut for fremskredne stadier av sykdommen kraftig øke sjansene for vellykket kirurgisk intervensjon og forbedrede overlevelsesrater.

I fravær av tidlig, enkelt identifiserbare kliniske indikasjoner har leting etter egnede CRC-screeningsmetoder fortsatt i tiår. Dessverre er det for tiden ingen CRC-screeningsteknikk som kombinerer lav invasitivitet, enkelthet og lave kostnader med høy sensitivitet og spesifisitet. To metoder for screening av CRC er fleksibel kolonoskopi/sigmoidskopi og fekal okkult blodtesting (FOBT) [Rennert, G. Recent Results Cancer Res. 2003; 163, 248-253, Atkin, W. Scand. J. Gastroenterol. (Suppl.) 2003; 237: 13-16, Walsh, J.M og Terdiman, J.P. JAMA 2003; 289: 1288-1296]. Begge disse fremgangsmåtene har imidlertid betydelige ulemper.

Fleksibel kolonoskopi/sigmoidskopi anses som en nøyaktig og pålitelig diagnostisk prosedyre, den er imidlertid invasiv, kostbar og krever spesialiserte og erfarne spesialister for å utføre prosedyren, hvilket gjør rutinescreening upraktisk. Det samme er tilfellet for nylig introdusert datatomografisk kolonografi (CT-kolonografi, virkelig kolonoskopi).

FOBT er billig og enkel, imidlertid medfører prosedyrene uakseptable høye både falske negative og falske positive resultater. På tross av disse begrensningene er FOBT for tiden den screeningsmetoden som velges.

Alternative metoder for diagnostisering av CRC basert på en direkte indikator for tumortilstedeværelse er blitt undersøkt. En indikator som er identifisert er analyse av eksfolierte kolonocytter. Eksfoliering av kolonocytter (dvs. spontan avskalling av celler fra organiserte epitellag fra slimhinnen i tarmen) er en viktig cellefornyelsesmekanisme i mennesketarmen [Eastwood, G.L. Gastroenterology 1977; 41: 122-125]. Cytologisk analyse av kolonocytter oppnådd fra skylling av kolon eller rektum (dvs. ved utskilling av kolorektal mukosa) ble utført for omtrent 50 år siden [Bader, G.M. og Papanicolau, GN. Cancer 1952; 5: 307-14]. Dette arbeidet viste at morfologisk forskjellige eksfolierte neoplastiske celler kunne påvises hos CRC-pasienter. Imidlertid har fremgangsmåten for å oppnå disse prøvene (en invasiv tarmskyllingsprosedyre) de samme ulempene som sigmoidoskopi/kolonoskopi, og krever detaljert cytologisk analyse av prøven når denne er fremskaffet.

Den rådende tilnærming for å oppnå prøver av eksfolierte epitelceller har vært å isolere disse fra human faeces. Human faeces ble identifisert som en kilde for slike celler, da eksfolierte celler fra kolonepitel kan utskilles i forbindelse med annet fekalt materiale.

Den første tilnærming til å anvende kolonocytter isolert fra human faeces for diagnostikk og forskningshensikter ble startet for ca. 15 år siden av P.P. Nair og hans kollegaer. De hevdet at de var i stand til å gjenvinne tusenvis av "levedyktige" eksfolierte celler fra noen få gram disperger fekalt materiale ved anvendelse av en isoleringsprosedyre basert på tetthets gradientsentrifugering. [Iyengr, V. et al., FASEB J 1991; 5:2856-2859, Albaugh, GP. et al., Int. J. Cancer 1992; 52: 347-350]. Disse ambisiøse mål har imidlertid generert vesentlig tvil basert på den lave sannsynlighet for tilstedeværelse av godt konserverte kolonocytter i et aggressivt anaerobt miljø slik som det som finnes i faeces. Videre var de morfologiske bevisene presentert i deres artikkel fr 1991 ikke overbevisende. P.P. Nair og medlemmene i hans gruppe opprettholdt gyldigheten av sin tilnærming [Nair, P. et al., J. Clin. Gastroenterol. 2003; 36(5 Suppl.) S84-S93], men har ikke utviklet noen praktisk anvendelse basert på resultatet av sine studier.

På tross av mangel på praktisk anvendelse fra P.P. Nair og hans kollegaer er imidlertid anvendelse av human avføring for diagnostisk og forskningshensikter fortsatt et aktivt forskningsområde siden dette ikke er forbundet med noen invasiv intervensjon. Et antall grupper har gjort forsøk på å isolere kolonocyttavledet genetisk materiale (DNA) fra humane avføringsprøver for å utvikle diagnostiske prosedyrer som anvender molekylære biomarkører for malignitet. Mens DNA direkte isolert fra homogenisert faeces kan amplifiseres og analyseres for nærvær av cancerassosiererte genetiske endringer, resulterte fravær av en svært pålitelig enkel molekylær biomarkør for cancer i anvendelse av flere molekylære markører som gjengir et antall genetiske endringer kjent å være tilstede på maligne celler med relativt høy frekvens. Flere tilnærminger foreslår samtidig påvisning av mange mutasjoner i APC, K-ras- og p53-genene kombinert med mikrosatellittmarkøranalyser er blitt beskrevet [Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterology 2000; 199: 1219-1227, Dong, S.M. et al., J. Nati. Cancer Inst. 2001; 93: 858-865, Gengucci, C. et al., Clin. Cancer Res. 2001; 93: 858-865, Traverso, G. et al., N. Engl. J. Med. 2002; 346: 311-320].

Metylerings endringer i fekalt DNA er også ansett som en potentiell diagnostisk markør [Muller, H.M. et al., Lancet 2004; 353: 1283-1285]. Selv om deteksjon av kolorektale tumorer med slike multi-target molekylære analyser synes å være fordelaktig, er fortsatt troverdigheten til disse fremgangsmåtene for screeningshensikter diskuterbare på grunn av den høye kostnad og de relativt komplekse laboratorieprosedyrer som er involvert.

Leting etter CRC-molekylære markører i DNA ekstrahert fra homogeniserte avførings-prøver har overskygget viktigheten av den initielle innsamling/isolering av eksfolierte kolonocytter. Det er imidlertid klart at homogenisert avføring er et vanskelig materiale for ekstrahering av humant DNA. I særdeleshet kan den rikelige mengden av bakterier i faeces interferere med kolonocytt-DNA-gjenvinningsprosedyrer, og rask pattedyr DNA-skade og degradering foregår i nærvær av anaerob bakterieflora i tykktarmen hos mennesket.

Utvikling av metoder basert på isolering av eksfolierte kolonocytter har vært langsom delvis på grunn av den overraskende mangel på kunnskap om celleeksfoliering i tarmen både ved normale fysiologiske tilstander og ved sykdom. Det rådende syn på koloncytt eksfoliering er fortsatt påvirket av en gammel og uprøvet hypotese som antyder "obligatorisk" eksfoliering av nesten alle differensierte kolonocytter ved deres migrering til det luminale epitel fra kolonkryptene (dvs. det antas at det bør være millioner av kolonocytter tilstede i fekalt materiale fordi celleprolifereringshastigheten i kolonepitelet er høy og alle cellene etter hvert eksfolieres). Det er imidlertid blitt klart at programmert celledød eller apoptose in situ er minst like viktig som eksfoliering [Hall, P. A. et al., J. Cell Sei. 1994; 107: 3569-3577, Barkla, D H. og Gibson, P.R. Pathology 1999; 31: 230-238, Ahlquist, D.A et al., Hum. Pathol. 2000; 31: 51-57]. Forholdet mellom disse to hovedmekanismer for cellefjerning fra kolonslimhinnen kan gjennomgå betydelige endringer ved kolorektal neoplasi [Ahlquist, D.A. et al.(supra)]. Faktisk er det nå vist at normale regulatoriske reaksjonsveier som fører cellene til apoptose er kraftig nedregulert i maligne tumorer [Bedi, A. et al., Cancer Res. 1995; 55: 1811-1816, LaCasse, E.C. et al., Oncogene 1998; 17: 3247-3259, Jass. J.R Gastroenterology 2002; 123: 862-876, Oren, M.Cell Death Differ. 2003; 10: 431-442, Boedefeld, W.M. 2nd et al., Ann. Surg. Oncol. 2003; 10: 839-851], hvilket resulterer i et kraftig redusert apoptotisk potensiale i cancerceller. Samtidig er tumorcelleadhesjon kjent å avta kraftig ettersom cancer utvikles [Yamamoto, H. et al., Cancer Res. 1996; 56: 3605-3609, Haier, J. og Nicolson, G L. Dis. Colon Rectum 2001; 44: 876-884, Leeman, M.F. et al., J. Pathol. 2003; 201: 528-534]. Sistnevnte fenomen er viktig ved metastatisk spredning, ved kolorektal neoplasi vil imidlertid kombinert suppresjon av apoptose og reduksjon i intercellulær adhesjon/kommunikasjon øke betydelig endringene i malign celleavskall-ing fra overflaten til voksende tumorer. Dersom dette er tilfellet, bør eksfolierte tumorceller, der noen muligens kan bibeholde sitt proliferative potensial, være forskjellig fra deres normale (ikke-tumor) eksfolierte motstykker ved: i) være mer vanlig på grunn av lettere eksfoliering fra tumoroverflaten; og ii) ha mye større "overlevelses-kapasitet, i særdeleshet på grunn av den høyere motstand mot mangel på oksygen [Graeber, T.G. et al., Nature 1996; 379: 88-91]. Ved eksfoliering kommer disse cellene inn i et relativt godt oksygenert "mukocellulært lag" som adskiller kolon mukosa fra det fekale innholdet i tarmen og beveger seg hele tiden nedover med avføringen [Ahlquist, D.A. et al.(supra)].

Viktigheten til dette mukocellulære lag som gir en grenseflate mellom kolorektal mukosa og fekalt innhold i tarmen har hittil ikke vært forstått. Eksperimentelle studier antyder at DNA av god kvalitet enkelt kan oppnås fra overflaten til rotte-faeces og anvendes for ytterligere amplifisering og genmutasjonsanalyser. [Loktionov, A. og O'Neill, I.K. Int. J. Oncol. 1995; 6: 437-445]. Disse tidlige eksperimenter antyder at DNA ekstrahert fra kolonocytter isolert fra overflaten til human avføring (avføringsoverflaten kan ses på som en fraksjon av mukocellulært lag utskilt med faeces) kan anvendes form molekylære analyser. En fremgangsmåte for isolering av eksfolierte celler fra prøver av hel avføring fra menneske ved å vaske cellene fra overflaten til nedkjølt faeces og samle disse ved immunmagnetisk separasjonsprosedyre er blitt utviklet [Loktionov, A. et al., Clin. Cancer Res. 1998; 4: 337-342]. Selv om arbeid i denne retning initielt ble planlagt for å utvikle en molekylær diagnostisk analyse for CRC, ble det klart at en enkel kvantitativ analyse av kolonocyttavledet DNA fra human avføringsoverflate kunne anvendes for CRC-diagnostikk og screening siden den relative DNA-mengden hos CRC-pasienter var mye høyere sammenlignet med friske individer. Andre forfattere har også rapportert høyere mengden av enten eksfolierte celler [Dutta, S.K. et al., Gastroenterology 1995: 108 (Suppl.): A463] eller DNA [Villa, E. et al., Gastroenterology 1996; 110: 1346-1353] i dispergerte eller homogeniserte avføringsprøver oppnådd fra CRC-pasienter, imidlertid var forskjellene mellom friske personer og cancerpasienter observert i disse studiene ikke store nok til å vurderes som diagnostisk verdifulle. I motsetning var Loktionov et al.(supra) i stand til å vise tilstedeværelse av en påfallende forskjell mellom CRC-pasienter og friske individer ved å anvende en beregningsindeks basert på mengden DNA ekstrahert fra celler isolert fra avføringsoverflaten og avføringsvekten (avførings-DNA-indeks eller

SDNAI).

Den SDNAI-baserte diagnostikkmetoden er beskrevet i US-patent nr. 6.187.546. Selv om teknikken og resultatene i de initielle undersøkelser klart fremhever en svært effektiv, enkel og billig metode for CRC-screening, hadde den flere vesentlige mangler (tydelig vanskeligheter med håndtering av hel avføring og helt umulig å finne en prosedyrestandard), hvilket hindrer kommersialisering og seriøs introdusering til klinisk praksis. Der er også blitt tydelig at relativt små antall av godt konserverte celler kan oppnås fra human avføringsoverflate ved anvendelse av denne teknikken [Bandaletova, et al., APMIS 2002; 110: 239-246]. Disse problemene, vanskelighetene med standardisering som den viktigste, fører til alvorlig bekymring med hensyn på anvendelse av eksfolierte kolonocytter isolert fra avføringsprøver for storskala CRC-screening.

Det er mange bevis som antyder at det mukocellulære lag som dekker human rektal mukosa er spesielt rikt på godt konserverte eksfolierte kolonocytter. I tillegg synes det cellulære innholdet i dette laget hos CRC-pasienter å være mye høyere enn hos friske individer primært på grunn av stor økning i tilstedeværelse av høyt resistente maligne kolonocytter. Hos CRC-pasienter bør derfor tumorceller, som er mye bedre tilpasset autonom eksistens kvantitativt dominere den rektale eksfolierte celleansamling. Flere nye rapporter beskriver distal (for eksempel anal) implantering av vedvarende eksfolierte celler fra fjernede kolorektale tumorer [Jenner, D.C. et al., Dis. Colon Rectum 1998; 41: 1432-1434, Wind, P. et al., Dis. Colon Rectum 2003; 46: 835-836, Abbasakoor, F. et al., Ann. R. Coll. Surg. Engl. 2004; 86: 38-39], hvilket på det sterkeste stadfester denne hypotese.

Direkte tilgang til rektal mukosa er mulig ved rutinemessig rektal fingerundersøkelse der undersøker benytter en finger med hanske. Selv om man kan oppnå kontakt med det rektale mukuocellulære lag ved å anvende denne enkle manipulering, er betydelige tap av materiale og samtidig kontaminering med urelevant skvamøs epitel i analkanalen uunngåelig når fingeren fjernes fra rektum. Utstryk tilberedt fra hanskene som ble anvendt ved rektalundersøkelsen har vist godt konserverte kolonocytter, kombinert med et høyt nivå av kontaminering av celler fra det skvamøse epitel.

Det er følgelig et stort behov for direkte innsamling av eksfolierte epitelceller fra overflaten til den rektale mukosa uten problemer med tap av materiale og alvorlig kontaminering med andre vevselementer på det stadiet da den celleinnsamlende overflate fjernes fra rektum. Slike celler kan ikke bare anvendes for kvantitativ celle og DNA-analyse, men også undersøkes for tilstedeværelse av ytterligere cancerbiomarkører (for eksempel proteiner) og til slutt vurderes immunhistokjemisk og cytologisk.

US-patent nr. 3.664.328 vedrører en livmorhalskreft-testprøvesamlingsanordning for hjemmebruk. Anordningen omfatter et innføringsrør og en prøvetakingsballong som normalt er kollapset i enden av røret. En manuell sammenleggbar, selvgjenopprettende pære er forbundet med den andre enden av røret. Et lag av prøveoppsamlingsmateriale er montert på ballongen for bevegelse av ballongen fra det indre av røret til en ytre prøvetakingsposisjon og tilbake når pæren er kollapset og frigjort.

US-patent nr. 4.467.816 vedrører en anordning for oppsamling av cellemateriale fra et kroppshulrom som omfatter et føringsrør og en celleprøvetaker som kan trekkes tilbake inn i føringsrøret, som har en fremre del og en bakre del. Celleprøvetakeren har form av en oppblåsbar ballong som kan trekkes tilbake inni seg selv og trekkes over enden av den fremre del av føringsrøret. Anordningen har også et inflasjonshjelpemiddel for innføring av gass til prøvetakeren for å blåse den opp. Et tilbaketrekkingshjelpemiddel, som passerer gjennom føringsrøret og er forbundet med den indre vegg i ballong-type celleprøvetakeren, er tilveiebrakt for tilbaketrekking av celleprøvetakeren inn i føringsrøret.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Ifølge oppfinnelsen frembringes en kolorektal celleprøvetakingsanordning som definert i krav 1.

Anordningen løser vanskelighetene med fingerprøvetaking ved å holde den fleksible membranen innenfor innføringselementet både ved innføring og fjerning slik at det ikke er noe tap av materiale og prøven ikke kontamineres av celler fra andre overflater (for eksempel det skvamøse epitel).

Ved prøvetaking direkte fra den mukosale overflaten, løser anordningen vanskelighetene forbundet med prøvetaking av hel avførings inkludert, det lite hyggelige arbeidet, lave konsentrasjon av celler som oppnås, de høye nivå av kontaminering med faeces materiale (spesielt bakterier) og spesielt metodestandardiseringsproblemene forbundet med slike problemer, for eksempel, stor variasjon i avføringsmengde og konsistens.

Selv om anordningen er invasiv, er den mye mindre invasiv enn anordningene som for tiden anvendes ved kolonoskopi/sigmoidoskopi, og krever ikke utførelse av en fagperson med tilfredsstillende erfaring. Anordningen kan faktisk administreres selv. Det reduserte nivå av invasivitet og fravær av komplikasjonsrisiko vil sannsynligvis føre til bedre mottagelse hos pasienten. Disse fordelene vil i sin tur muliggjøre at flere prøver utføres og til en lavere kostnad.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den fleksible membranen ekspanderbar og konstruert av et elastisk materiale. Helst er den fleksible membranen konstruert av en nitril-, lateks- eller gummibasert substans.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det lukkbare indre hulrom til innføringselementet lukket.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter celleprøvetakings-anordningen ytterligere hjelpemiddel for trykksetting av det indre hulrom, der nevnte hjelpemiddel festes til den proksimale enden av innføringselementet.

Fortrinnsvis er nevnte hjelpemiddel for trykksetting av det indre hulrom festet til celleprøvetakingsanordningen via en ventil (for eksempel en selvtettende ventil) til stede på den proksimale enden av innføringselementet.

Det skal forstås at hjelpemidlene for trykksetting av det indre hulrom kan omfatte et hvilket som helst hjelpemiddel egnet for å tilføre et fluid (for eksempel væske eller gass) til den fleksible membranen. Fortrinnsvis omfatter hjelpemidlene for trykksetting av det indre hulrom en kilde av sammenpresset luft, en sprøyte eller en pumpe (for eksempel bulb).

Fortrinnsvis omfatter hjelpemidlene for trykksetting av det indre hulrom en kilde av sammenpresset luft som omfatter en mekanisk anordning som er i stand til å avlevere en på forhånd definert mengde av et første forhøyet trykk og et andre redusert trykk til celleprøvetakingsanordningen. Denne utførelsesform har den fordel at trykket på innsiden av innføringselementet reguleres nøyaktig og den mekaniske anordningen har den fordel at den kan brukes om igjen uendelig antall ganger sammen med engangs-utstyret for kolorektal celleprøvetaking.

Aller helst omfatter hjelpemidler for trykksetting av det indre hulrom en sprøyte. Anvendelsen av en sprøyte muliggjør både enkel håndtering og at et bestemt volum av luft pumpes inn i den fleksible membranen (fortrinnsvis minst en ti gangers økning i det volum som er til stede i den fleksible membranen). I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er for eksempel en 100 ml sprøyte festet ved den proksimale enden av innføringselementet, stempelet til nevnte sprøyte kan initielt festes til 70-90 ml merket. En på forhånd bestemt mengde av et første forhøyet trykk kan således tilføres ved å presse stempelet maksimalt (for eksempel til 0 ml merket) som vil fylle den fleksible membranen med et luftvolum på 70-90 ml. En på forhånd bestemt mengde av et andre redusert trykk kan deretter tilføres ved å trekke ut stempelet i sprøyten tilbake til sitt maksimale nivå (for eksempel til 100 ml merket), hvilket vil trekke membranen inn i det indre hulrom av innføringselementet. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen vil sprøyten være utstyrt med en eller flere retensjonstrekk (for eksempel låseposisjoner) for å markere stempelposisjonene i sprøyten på hvert stadium under anvendelse (for eksempel en posisjon før innføring, en under innføring og en etter fjerning). Fordelen ved at hjelpemidlene for trykksetting av det indre hulrom er en sprøyte, er at den kolorektale celleprøvetakingsanordningen kan være tilpasset slik at den passer til vanlig tilgjengelig og engangs laboratorie- og sykehusutstyr.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er overflatearealet til den ytre celleprøvetakingsoverflate av den fleksible membran reproduserbart kontrollerbar. Dette muliggjør at et fiksert overflateareal bringes i kontakt med den kolorektale mukosale overflate som skal undersøkes, dermed frembringes en kvantifiserbar samling av et eksfolierte celler som er korrelert med den mengden tilstede på den overflaten av den kolorektale mukosa. Fortrinnsvis er overflatearealet kontrollert ved hjelp av trykksetting av det indre hulrom. Dette muliggjør at et fiksert overflateareal bringe i kontakt med den mukosale overflate som det skal tas prøver av.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen tilpasses innføringselementet til å kobles til et rektaltilgangsrør. Denne utførelsesformen har den fordel at den muliggjør et rektalt tilgangsrør og en obturator, slik som en olivenformet obturator (et forenet rektalt tilgangsrør og obturator kalles felles et proktoskop) innføres først for å åpne det rektale hulrom etterfulgt av fjerning av obturatoren før innføring av prøvetakingsanordningen ifølge oppfinnelsen. Prøvetakingsanordningen kan deretter fortsette å holdes i posisjon med det rektale tilgangsrør for en hvilken som helst tidsperiode som er nødvendig for å oppnå en prøve. Obturatoren plasseres deretter når prøvetakingsanordningen fjernes og obturatoren og det rektale tilgangsrør fjernes sammen.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er innføringselementet utformet for å muliggjøre innføring selv. I en slik utførelsesform innføres innføringselementet sammen med et rektalt tilgangsrør og derfor elimineres behovet for en obturator (for eksempel innføringselementet har en avrundet distal innføringsende). Denne utførelsesform frembringer den fordel at prøvetakingsanordningen ifølge oppfinnelsen kan håndteres selv, for eksempel vil pasientene lett være i stand til å ta prøver av eksfolierte celler fra deres rektale mukosa. I denne utførelsesform er det vurdert at innføringselementet og det rektale tilgangsrør innføres og fjernes samtidig og kun separeres ved fjerning.

Ifølge oppfinnelsen danner den fleksible membranen en beholder når denne holdes innenfor det indre hulrom av nevnte innføringselement, slik at fluid kan tilføres. Denne utførelsesform ifølge oppfinnelsen vil muliggjøre at reagenser kan tilsettes prøvetakingsanordningen etter at en prøve er tatt uten behov for overføring av prøven til en separat beholder, for dermed å miste noe av materialet fra prøven.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen forsynes det indre hulrom av innføringselementet med adhesjonsmidler. Denne utførelsesform ifølge oppfinnelsen har den effekt av å dra den fleksible membranen mot veggen av det indre hulrom i innføringselementet med en gang en prøve er tatt og påføring av det andre reduserte trykket har dratt den fleksible membranen inn i det indre hulrom av innføringsele-mentet. Dette trekk har den fordel at det gir en stabil beholder når denne fylles med væske.

Ifølge oppfinnelsen tilpasses innføringselementet til å kobles med et forseglingsmiddel for å forsegle nevnte beholder. Dette gjør det mulig at prøvetakingsanordningen, inneholdende prøven, kan lagres og transporteres før ytterligere analyser utføres på prøven.

Fortrinnsvis er forseglingsmidlet en gjenget kork. En gjenget kork har den fordel at forsegling av karet forhindrer tap av prøve og også muliggjør uttak for ytterligere analyser.

I utførelsesformen er celleprøvetakingsanordningen omfatter hjelpemidler for trykksetting av det indre hulrom er nevnte hjelpemidler fortrinnsvis avtakbare fra innføringselementet. Dette har den fordel av å konvertere prøvetakingsanordningen til en kompakt analysevial som hensiktsmessig kan transporteres og lagres sammen med andre kompakte analyseampuller for videre screeningsreaksjoner.

I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen frembringes et kit for å innsamle en prøve fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske, som omfatter en kolorektal celleprøvetakingsanordning som definert her i dokumentet og et rektalt tilgangsrør og eventuelt en obturator.

Anvendelsen av et rektalt tilgangsrør gir både en mer komfortabel innføring av prøvetakingsanordningen, og forhindrer kontakt mellom prøvetakingsanordningen og andre overflater enn den mukosale overflate som det skal prøver fra. Anvendelsen av en obturator i tillegg til det rektale tilgangsrør, kan lette ubehaget ved innføring av det rektale tilgangsrør.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan kittet i tillegg omfatte et smøre-middel, slik som en smøregele (for eksempel K-Y gelé). Denne har den fordel at den gir mindre ubehag under innføring av obturatoren eller celleprøvetakingsanordningen ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen frigjøres obturatoren fra det rektale tilgangsrør etter innføring av den sammensatte obturator og rektale tilgangsrør i det rektale hulrom.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter kittet ytterligere forseg-lingsmidler, slik som en gjenget kork, for å koble denne til innføringselementet.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter kittet ytterligere en eller flere reagenser, slik som en buffer. Anvendelsen av en buffer muliggjør bearbeiding av prøven før ytterligere analyser.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan bufferen være tilstede i den gjengede korken (for eksempel som en blisterinnpakning) slik at festing av korken til innføringselementet frigir bufferen inn i beholderen (for eksempel ved å stikke hull på blisterlommen) for å suspendere cellene som er tilstede på prøvetakingsoverflaten av den fleksible membranen før ytterligere analyse.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er bufferen en cellelyseringsbuffer som har den fordel at den utfører et nøkkeltrinn før DNA-ekstrahering. I en alternativ foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er bufferen et cellekonserveringsmedium som har den fordel at den muliggjør forbedrede cellecytologiske, biokjemiske og immunhistokjemiske analyser på den resulterende celleprøven. Fortrinnsvis er celle-konserveringsmediet tilsatt en eller flere cellekulturkomponenter (for eksempel næringsstoffer og antibiotika).

Det vil forstås av fagpersoner innen teknikken at enhver anordning eller kit tidligere beskrevet er egnet for prøvetaking av eksfoliert epitelvev (for eksempel kolonocytter) fra human kolorektal mukosa-overflate.

Det beskrives også en fremgangsmåte for kvantitativ prøvetaking av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosa-overflate hos et menneske uten å kontaminere prøven ved å komme i kontakt med andre kroppsoverflater omfattende trinnene: bringe en prøvetakingsanordning omfattende en isolert celleprøvetakingsoverflate i nærhet til den kolorektale mukosale overflate som skal tas prøver av, uten på forhånd å komme i kontakt med andre kroppsoverflater;

bringe celleprøvetakingsoverflaten i kontakt med den kolorektale mukosa-overflaten slik at en prøve oppnås fra den mukosale overflate; og

fjerne prøvetakingsanordningen og prøven fra den umiddelbare nærhet til mukosa-overflaten uten at den isolerte celleprøvetakingsoverflaten eller prøven kommer i kontakt med noen annen kroppsoverflate.

Denne fremgangsmåten omfatter nøkkeltrinnene for direkte prøvetaking av eksfolierte celler fra en mukosa-overflate, og sikrer at prøven ikke kontamineres av at celleprøve- takingsmembranen kommer i kontakt med andre kroppsoverflater. Kontaminering unngås ved å isolere prøvetakingsoverflaten, hvormed isolering kan defineres som adskillelse av prøvetakingsoverflaten før denne bringes i kontakt med den kolorektale mukosale overflate eller etter prøveinnsamling av cellene fra den kolorektale mukosale overflate.

Det beskrives også en fremgangsmåte for prøvetaking av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske, omfattende trinnene: innføring av en kolorektal celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen til det rektale hulrom og bringe nevnte anordning i umiddelbar nærhet til en kolorektal mukosal overflate uten at den ytre, celleprøvetakingsoverflate av den fleksible membranen kommer i kontakt med andre kroppsoverflater;

trykksetting av det indre hulrom til minst et første forhøyet trykk slik at den fleksible membranen presses ut fra den distale enden av prøvetakingsanordningen;

bringe den kolorektale mukosale overflate i kontakt med den ytre, celleprøvetakingsoverflaten av nevnte membran slik at en prøve av eksfolierte celler oppnås fra den kolorektale mukosale overflate;

påføre et andre redusert trykk til det indre hulrom slik at den fleksible membranen trekkes tilbake og prøven som er til stede på celleprøvetakingsoverflaten til membranen returnerer til det indre hulrom av celleprøvetakingsanordningen; og fjerning av celleprøvetakingsanordningen fra den umiddelbare nærhet til den kolorektale mukosale overflaten og fjerne nevnte anordning fra det rektale hulrom uten at membranen eller prøven kommer i kontakt med andre kroppsoverflater.

Det skal forstås at celleprøvetakingsanordningen ytterligere kan kreve et rektalt tilføringsrør enten alene eller sammen med en obturator.

Følgelig kan fremgangsmåten ytterligere omfatte trinnene:

innføring av en kombinert kolorektal celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen og et rektalt tilføringsrør i det rektale hulrom; og

fjerning av nevnte prøvetakingsanordning og prøve fra det rektale tilgangsrør.

Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte trinnene:

innføring av et kombinert rektalt tilgangsrør og en obturator i det rektale hulrom; fjerning av obturatoren fra det rektale tilgangsrør før innføring av prøvetakings-anordningen;

fjerning av prøvetakingsanordningen og prøven;

gjeninnsette obturatoren via det rektale tilgangsrør; og

fjerne det kombinerte rektale tilgangsrør og obturatoren fra det rektale hulrom.

Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å ta prøver av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske, omfattende trinnene: innføring av et rektalt tilgangsrør og en obturator i det rektale hulrom via analkanalen; fjerning av obturatoren fra det rektale tilgangsrør;

innføring av en kolorektal celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen i det rektale hulrom via det rektale tilgangsrør, uten at den fleksible membranen i prøvetakings-anordningen kommer i kontakt med annen kroppsoverflate;

trykksetting av det indre hulrom til minst et første forhøyet trykk slik at den fleksible membranen presses ut fra den distale enden av prøvetakingsanordningen;

bringe den kolorektale mukosale overflate i kontakt med den ytre celleprøvetakings-overflate av nevnte membran;

oppnå en prøve av eksfolierte celler fra den kolorektale mukosale overflate;

påføre et andre redusert trykk til det indre hulrom slik at den fleksible membranen trekkes tilbake og prøven som er til stede på celleprøvetakingsoverflaten av membranen returnerer til det indre hulrom av celleprøvetakingsanordningen;

fjerning av celleprøvetakingsanordningen fra det rektale hulrom via det rektale tilgangsrør uten at den fleksible membranen i prøvetakingsanordningen kommer i kontakt med annen kroppsoverflate;

gjeninnsette obturatoren via det rektale tilgangsrør; og

fjerning av det rektale tilgangsrør og obturatoren fra rektum via analkanalen.

Det skal forstås at mens det rektale tilgangsrør fortsatt er innført i rektalhulrommet, kan en ytterligere celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen introduseres i rektalhulrommet. For eksempel kan den første celleprøvetakingsanordningen introduseres som omfatter en cellelysebuffer for å muliggjøre DNA-ekstraksjon og analyse (for eksempel kvantifisering) av en hvilken som helst innsamlet prøve, deretter kan en andre celleprøvetakingsanordning introduseres som omfatter et cellekonserveringsmedium for muliggjøre cytologiske, biokjemiske og immunhistokjemiske analyser av en hvilken som helst innsamlet celle.

Det er også beskrevet en prøvetakingsanordning for å innsamle en prøve fra en mukosal overflate lokalisert i et rektalt hulrom hos et individ, omfattende: et hovedsakelig sylindrisk legeme, som har et åpent hulrom i den distale enden og et lukkbart hulrom i den proksimale enden;

en fleksibel membran som holdes inne i det hovedsakelig sylindriske legemet som danner en forsegling som separerer det åpne distale hulrom fra det lukkbare proksimale hulrom; der de to overflatene av membranen er den proksimale overflate og den distale overflate; og

hjelpemidler for inflasjon og deflasjon, der

hjelpemidlene for inflasjon øker det indre fluidtrykket i det lukkbare proksimale hulrom som, når dette er lukket, medfører at membranen presses ut av den distale enden av det hovedsakelig sylindriske legemet inntil den distale overflaten av membranen kommer i kontakt med den mukosale overflaten som det skal prøver av; og hjelpemidler for deflasjon kan øke fluidtrykket i det lukkede proksimale hulrom, hvilket medfører at membranen trekkes tilbake slik at membranen holdes inne i det vesentlig sylindriske legemet etter at den distale overflaten til membranen har vært i kontakt med den mukosale overflate som det skal prøver av.

Deflasjonshjelpemidlet kan være en ventil. Denne utførelsesformen ifølge oppfinnelsen vil være særlig egnet for anvendelse sammen med en elastisk membran der det indre trykk i det lukkbare proksimale hulrom er større enn det på utsiden av hulrommet.

Deflasjonshjelpemidlet kan omfatte en sprøyte tilkoblet ventilen.

Det frembringes en fremgangsmåte for å ta prøver av eksfolierte celler fra en mukosal overflate lokalisert i det rektale hulrom hos et menneske, omfattende trinnene: bringe en prøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen i umiddelbar nærhet til en mukosal overflate uten at prøvetakingsmembranen kommer i kontakt med annen kroppsoverflate;

øke det indre trykk i det lukkbare proksimale hulrom slik at den fleksible membran presses ut av den distale ende av prøvetakingsanordningen;

bringe den mukosale overflaten i kontakt med den distale overflaten til membranen slik at en prøve av eksfolierte celler oppnås fra den mukosale overflaten;

redusere det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom slik at den fleksible membranen trekkes tilbake og den og prøven holdes innenfor det åpne distale hulrom; og

fjerne anordningen og prøven fra den umiddelbare nærhet til den mukosale overflate uten at membranen eller prøven kommer i kontakt med annen kroppsoverflate.

Fremgangsmåten kan omfatte trinnene: tilkobling av en kilde for sammenpresset luft til ventilen, og økning av det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom ved åpning av ventilen; eller

tilkobling av en sprøyte til ventilen og økning av det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom ved innføring av stempelet.

Fremgangsmåten kan omfatte trinnene: redusering av det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom ved å åpne ventilen; eller redusere det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom ved å dra ut stempelet.

Fremgangsmåten kan omfatte trinnene: tilsetting av en cellelysebuffer eller et cellekonserveringsmedium til det åpne distale hulrom av prøvetakingsanordningen; og lukke det åpne distale hulrom i prøvetakingsanordningen.

Det frembringes videre en fremgangsmåte for å ta prøver av eksfolierte celler fra en mukosal overflate lokalisert i det rektale hulrom hos et menneske, omfattende trinnene: innføring av et rektalt tilgangsrør og en obturator i det rektale hulrom via analkanalen; fjerning av obturatoren fra det rektale tilgangsrør;

innføring av en prøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen i det rektale hulrom via det rektale tilgangsrør, uten at den fleksible membranen i prøvetakingsanordningen kommer i kontakt med annen kroppsoverflate;

koble prøvetakingsanordningen til et hjelpemiddel for inflasjon;

øke det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom slik at den fleksible membran presses ut av den distale ende i prøvetakingsanordningen;

bringe den rektale mukosa i kontakt med et bestemt overflateareal av prøvetakings-overflaten;

oppnå en prøve av eksfolierte celler fra rektalmukosaoverflaten;

redusere det indre trykk i det lukkede proksimale hulrom slik at den fleksible membranen trekkes tilbake og den og prøven holdes innenfor det åpne distale hulrom; fjerning av prøvetakingsanordningen fra det rektale hulrom via det rektale tilgangsrør uten at den fleksible membranen i prøvetakingsanordningen kommer i kontakt med annen kroppsoverflate;

gjeninnsette obturatoren via det rektale tilgangsrør;

fjerne det rektale tilgangsrør og obturatoren fra det rektale hulrom via analkanalen; tilsette en cellelysebuffer eller cellekonserveringsmedium til det åpne distale hulrom; og forsegle det åpne distale hulrom av prøvetakingsanordningen.

Det frembringes en fremgangsmåte for å screene og diagnostisere kolorektal cancer som omfatter en hvilken som helst fremgangsmåte beskrevet ovenfor og ytterligere omfattende gjenvinning av den innsamlede prøve fra prøvetakingsanordningen og utføring av analysen på prøven.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er analysen utvalgt fra DNA-kvantifisering, DNA-ekstraksjon etterfulgt av kvantifisering og eventuelt molekylære analyser, cytologisk/cytokjemisk undersøkelse og biokjemiske tester. Det skal også bemerkes at nøyaktigheten av screeningen ved en hvilken som helst av disse fremgangsmåtene vil forbedres ved frembringelse av en prøve med lavt nivå av kontaminering og høy konsentrasjon av celler tatt fra den kolorektale mukosale overflaten som skal undersøkes.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved hjelp av eksempler med henvisning til de følgende figurer, der:

Fig. 1 viser et tverrsnitt av en celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen,

Fig. 2 viser en skjematisk tegning av en celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen der hjelpemidlet for å trykksette omfatter en sprøyte, Fig. 3 viser en skjematisk tegning av en celleprøvetakingsanordning ifølge oppfinnelsen der hjelpemidlet for å trykksette omfatter en kilde av sammenpresset luft, Fig. 4 viser komponentene som er nødvendig for å ta prøve av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske, Fig. 5 viser et eksempel på en fremgangsmåte for å ta prøver av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflaten hos et menneske ved anvendelse av en hvilken som helst av anordningene vist i fig. 1-4, Fig. 6 viser et eksempel på trinnene som kan etterfølge fremgangsmåten vist i fig. 5.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Beskrivelse av celleprøvetakingsutførelsesformer

Celleprøvetakingsanordningen i fig. 1 er utformet for innføring i et rektalt hulrom. Anordningen omfatter et vesentlig sylindrisk innføringselement 1 med et indre hulrom 3, lukket i den distale innføringsenden 2 med en fleksibel og elastisk membran 4 som er forseglet tilkoblet til element 1 ved den distale ende 2.1 posisjonen vist i fig. 1 er membranen 4 holdt innenfor hulrom 3 og er tilpasset til å trenge ut av hulrom 3 når hulrom 3 trykksettes ved hjelp av 7 (vist i større detalj i fig. 2). Membranen 4 har en I celleprøvetakingsoverflate 5 som i hvileposisjonen vist i fig. 1 er den indre overflate, men når membranen presses ut er den ytre overflate, og en motsatt overflate 6 som i hvileposisjon er den ytre overflate, men som blir den indre overflate når membranen presses ut. Membranen er laget av nitril, lateks eller gummibasert substans. I den proksimale enden 34 er hulrommet 3 lukket med en selvforseglende ventil 18, til hvilken trykksettingsutstyret 7 tilpasses og tilkobles.

Utførelsesformen ifølge oppfinnelsen der hjelpemidlet for trykksetting av det indre hulrom 7 er en integrert sprøyte vises i fig. 2, hvilket skjematisk også viser trinnene nødvendig for å ta prøver av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske (fig. 2A-2D). Fig. 2A viser en celleprøvetakingsanordning før innføring i et rektalt hulrom. Sprøyten 7 festes til innføringselement 1 hovedsakelig som beskrevet i fig. 1. Sprøyten har et stempel 23 som tett glir langs sylinderen 32 av sprøyten 7 for å endre volumet i et indre kammer 33 av sprøyten 7. Stempelet 23 i sprøyten 7 er satt slik at 70 ml luft er til stede i kammeret 33 av sprøyten 7. Fig. 2B viser en celleprøvetakingsanordning når denne er innført i et rektalt hulrom. Stempelet 23 i sprøyten er fullstendig sammenpresset, hvilket medfører at den fleksible membranen 4 blåses opp til et volum på 70 ml. Denne oppblåste fleksible membran 4 bringes dermed i kontakt med den kolorektale mukosale overflaten til individet slik at eksfolierte celler overføres til den ytre overflaten av den fleksible membran 4. Fig. 2C viser en celleprøvetakingsanordning når eksfolierte celler er innsamlet og før denne fjernes fra et rektalt hulrom. Stempelet 23 i sprøyte 7 er trukket tilbake til at 80 ml luft er til stede i kammeret i sprøyte 7. Dette danner derfor et redusert trykk i kammeret som medfører at den fleksible membran 4 trekkes tilbake inn i det indre hulrom av innføringselement 1 og festes bestemt til sideveggene av innføringselement 1. Størrelsen på det reduserte trykket kan være forhåndsbestemt ved tilstedeværelse av to hurtigtilpasningsretensjonstrekk 24 (kun en er vist i fig. 2C). Hurtigtilpasningstrekkene 24 er innretninger til stede på stempel 23 av sprøyte 7 som passer inn i hullene på sylinderen 32 i sprøyten 7. Hensikten med disse hurtigtilpasningstrekkene 24 er å forhindre tilbaketrekking av stempelet 23 fra sprøyten 7.

Fig. 2D viser en celleprøvetakingsanordning etter fjerning fra det rektale hulrom og før celleanalyse. Den distale innføringsende av innføringselement 1 er utstyrt med gjenger som er tilpasset en 20 ml diameter gjenget skrukork 8. Korken 8 kan ha en blisterpakke inneholdende en buffer slik at ved å skru kork 8 til innføringselement 1 frigis bufferen til beholderen dannet av den deflaterte fleksible membran 4. Etter at kork 8 er blitt skrudd på innføringselement 1, kan sprøyte 7 fjernes fra innføringselement 1 for å muliggjøre at innføringselement 1 kan overføres til en kompakt analyseampulle som, sammen med mange andre ampuller, kan pakkes og sendes til et laboratorium for celleanalyse.

Utførelsesformen ifølge oppfinnelsen der hjelpemidlene for trykksetting av det indre hulrom 7 er en kilde av sammenpresset luft er vist i fig. 3. Denne figuren viser

skjematisk en mekanisk anordning 9 som er en pumpe som drives av en elektrisk motor (ikke vist) som er i stand til å levere gjentatte doser av et første forhøyet trykk etterfulgt av et andre redusert trykk ved aktivering av utløser 14. Den mekaniske anordning 9 er i stand til å kobles til et innføringselement 1 hovedsakelig som beskrevet i fig. 1 og 2 ved en klikktilpasningsanordning 16 tilstede på den mekaniske anordning 9 som opereres sammen med en hake 17 på innføringselement 1. En selvlukkende ventil 18 er til stede på innføringselement 1 for å sikre at trykket bibeholdes i innføringselement 1 ved frakobling av den mekaniske anordning 9. Innføringselementet 1 omfatter vingene 19 som er utformet for å tilkoble et protoskop og gjenger 20 ved den distale innføringsende for å ta i mot en gjenget kork 8 som har en blisterpakke 21 inneholdende buffer. Den mekaniske anordning 9 har til hensikt å være batteridrevet og kan lades ved en strømforsyning via en oppladerplugg 12. Den mekaniske anordningen 9 omfatter et luftinntaksfilter 25, et gummiert håndtak 13 og også en på-av-bryter 15 og en lysemitt-erende diode 10 og 11 som indikerer når anordning 9 er klar og når syklusen for første og andre trykkpåføring er fullstendig.

Ved bruk holder brukeren den mekaniske anordningen 9 med det gummierte pistoltype-håndgrep 13 og fester anordningen 9 til et innføringselement 1. Innføringselementet innføres deretter i rektalhulrommet der det kobles til et protoskop ved anvendelse av vingene 19 som muliggjør en forbedret penetreringsensartethet. Et første forhøyet trykk påføres ved at brukeren trykker avløser 14 som medfører at luft trekkes inn i den mekaniske anordning 9 gjennom luftinntaksfilteret 25 som deretter sammenpresser og medfører at den fleksible membranen presses ut av den distale enden av innførings-element 1 for å bringe denne i kontakt med den kolorektale mukosale overflate. Et andre redusert trykk påføres deretter av brukeren ved å trykke avløser 14 en andre gang som medfører at den fleksible membranen returnerer til det indre hulrom av innførings-element 1. Med en gang prøvetakingen er avsluttet, frakobles innføringselement 1 fra protoskopet og den mekaniske anordning 9 frakobles innføringselement 1 og trykket i innføringselement 1 opprettholdes ved den selvlukkende ventil 18. En gjenget kork 8 med en bufferinneholdende blisterpakke 21 kan deretter skrus på gjengen 20 på innfør-ingselement 1, hvilket medfører at buffer frigis i beholderen dannet av den deflaterte fleksible membran. Den mekaniske anordning 9 kan brukes om igjen ved å feste denne til andre innføringselement 1.

Komponenter nødvendig for berørings-avtrykk celleprøvetakingsteknikk

Komponentene nødvendig for prøvetaking av eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske er vist i fig. 4.

i) Tilgang til rektal mukosa kan oppnås ved anvendelse av et rektalt tilgangsrør 29, som kan være en modifisering av et eksisterende instrument for rektal undersøkelse (for eksempel rektoskop 22). Det rektale tilgangsrør 29 består av et fast rør (med et håndgrep) utstyrt med en obturator 30 som frembringer en ende med olivenfasong og en uhindret overflate som letter innføring av det rektale tilgangsrør 29 gjennom analkanalen til rektum.

ii) Celleprøvetakingsanordningen 1 vist i fig. 4 er vesentlig som beskrevet i fig 1 og har en ytre diameter som er i samsvar med den indre diameteren av det rektale tilgangsrør, dvs. i området 5-20 mm.

iii) En kilde for sammenpresset luft 7 fungerer for å frembringe et hjelpemiddel for trykksetting av det indre hulrom. Hjelpemidler for trykksetting 7 kan omfatte en sprøyte (som beskrevet i fig. 2), en luftpumpe (som beskrevet i fig. 3) eller en sammenpresset luft minibeholder (minisylinder). Luftrykket på innsiden av

celleprøvetakingsanordningen kan begrenses, kontrolleres ved enten å anvende et fiksert

luftvolum (enkel sprøyteløsning) eller ved å nå et bestemt luftrykksnivå (en presisjons ventil vil være nødvendig for dette formål).

iv) En flaske eller et rør med en spesifikk buffer 35 (ulike buffere bør anvendes for ulike hensikter, slik som DNA- eller RNA-ekstraksjon eller celleisolering/separering for ytterligere analyser).

v) Et hermetisk deksel 8 for celleprøvetakingsanordningen (nødvendig for celle/ proteinlysereaksjoner dersom umiddelbar DNA- eller RNA-ekstraksjon utføres, for celleisoleringsprosedyrer og, spesielt for lagring/transport av materialet dersom det ikke anvendes umiddelbart, for eksempel transportering fra operasjonssal/sykehus til laboratoriet).

Komponentene nødvendig for prosedyren kan utvikles for å anvendes som et engangs-utstyr, som bør inkludere alle de opplistede bestanddeler med unntak av kilden for sammenpresset luft, som kan benyttes gjentatte ganger.

Beskrivelse av berørings-avtrykkscelleprøvetakingsteknikken (rektale manipuleringer) Fig. 5 viser et eksempel på berørings-avtrykkscelleprøvetakingsteknikken for å innsamle eksfolierte celler fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske ved anvendelse av en hvilken som helst av anordningene vist i fig. 1-4. Denne prosedyre er enkel og ingen spesiell trening i proktologi eller endoskopi er nødvendig for personen som skal utføre dette. Den kan bli utført av et hvilken som helst kvalifisert medisinsk personale (GP, sykepleier etc.) ved et lokalt sykehus eller pasientens hjem, eller den kan administreres av pasienten selv. Fig. 5A illustrerer skjematisk et tverrsnitt av anatomien ved human rektum 28, analkanalen 26 og kolorektalt mukocellulært lag 27. Det skal bemerkes at enhver kontakt mellom celleprøvetakingsanordningen og skvamøst epitel i analkanalen kan resultere både i tap av materiale og kontaminering av prøven med skvamøst epitel fra analkanalen.

Prosedyren starter med introduksjon av et rektoskoplignende rektalt tilgangsrør 29 med en obturator 30 plassert i rektum 28 (fig. 5B). Et hensiktsmessig smøremiddel kan anvendes for innføringsprosedyren for å lette denne og for å minske pasientens ubehag, som kan forårsakes av dette initielle trinnet i prosedyren.

Når det rektale tilgangsrør 29 er innført (fig. 5C) og obturatoren 30 er fjernet, oppnås direkte tilgang til rektalt mukosa og det mukocellulære laget 27 åpnes.

Innføringselementet 1 innføres i det rektale tilgangsrør 29 slik at den øvre kanten av innføringselementet er lokalisert rett ovenfor kanten av det rektale tilgangsrør (fig. 5D).

Et første forhøyet trykk påføres som blåser opp den fleksible innsamlingsmembranen for å oppnå kontakt mellom membranen og det rektale mukocellulære lag 27 for å utføre berørings-avtrykkscelleprøvetakingen (fig. 5E). Anordningen etterlates i denne posisjon i omtrent 10-15 sekunder for å oppnå bedre festing av eksfolierte celler og celleavledet materiale fra det mukocellulære lag til innsamlingsmembranen.

Fig. 5F viser påføring av et andre redusert trykk som slipper ut trykket i den fleksible membranen og medfører at denne returnerer til sin opprinnelige posisjon med innsamlet materiale 31 på den ytre celleinnsamlende overflate.

Innføringselement 1 fjernes fra det rektale tilgangsrør 29 og benyttes for ytterligere manipuleringer og analyser. Obturatoren 30 (en nysmurt kan anvendes) installeres på nytt i det rektale tilgangsrør 29, og røret 29 fjernes fra rektum 28 (se fig. 5G). Den fullstendige prosedyren (rektale manipuleringer) bør ikke ta mer enn et par minutter.

Bearbeiding av innsamlede celler

Fig. 6 viser et eksempel på de trinn som kan etterfølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor for fig. 5A-5G, hvilket bør avsluttes umiddelbart etter celleinnsamling for å unngå tørking av celleinnsamlingsmembranen. Trinn (a) viser celleinnsamlingsanordningen 1 med eksfolierte celler 31 på den celleinnsamlende fleksible membran etter celleinnsamling. Det øverste rommet i celleinnsamlingsanordningen fylles med et bestemt volum av en spesifikk buffer 35 som lyserer eller suspenderer de eksfolierte celler (trinn b)). Ulike cellelysebuffere eller cellekonserveringsmedier kan anvendes for DNA- eller RNA-ekstraheringsprosedyrer, spesialbuffere/medier bør anvendes for applikasjoner som krever celleisolering. Celleprøvetakingsanordningen tilberedes for prøvetransport eller lagring ved å være hermetisk lukket med en sikker gjenget kork 8 (trinn c)), men det skal forstås at når den gjengede korken har en bufferinneholdende blisterpakke, da kan trinn (b) utelates. Anordningen kan deretter lagres eller transporteres for videre prosedyrer for screening/diagnostikk og/eller forskningshensikter (trinn (d)).

Analyser av prøvene

Det skal understrekes at teknikken frembringe en mye høyere grad av standardisering sammenlignet med andre eksisterende metoder. Anvendelsen av en standard anordning med standard lufttrykk/volum, standard areal på den oppblåste innsamlingsmembran (kontaktareal med det rektale mukocellulære lag kan variere, men denne variasjonen er neglisjerbar sammenlignet med andre måter å oppnå eksfolierte celler, for eksempel ved avføringsbaserte teknikker) og standardmengden buffer som tilsettes etter celleinn-samlingsprosedyren medfører svært gunstige betingelser for komparative analyser av enten celleantall eller mengder celleavledet materiale (for eksempel DNA).

( a) Analyse av prøver i den hensikt å screene for kolorektal cancer

Screening for kolorektal cancer medfører brede, populasjonsbaserte (aldersbestemte) vurderinger av individer som ikke klager for å få asymptomatiske (i de fleste tilfeller - tidlige) tilfeller av sykdommen, behandlet i tide da mortaliteten kan reduseres. En nødvendig forutsetning for fremgangsmåten er dens samtidige anvendbarhet for tusener/ millioner av mennesker.

i) Gitt at det er sterke indikasjoner på betydelig høyere mengder av kolonocytter og kolonocyttavledet DNA i det rektale mukocellulære lag hos kolorektale cancerpasienter sammenlignet med tumorfrie individer, er det svært sannsynlig at teknikken for direkte prøvetaking av eksfolierte kolonocytter og kolonocyttavledet materiale kan frembringe en enkel screeningtest for kolorektal cancer basert på den direkte kvantifisering av mengden DNA ekstrahert fra cellene. For denne tilnærmingen bør den initielle buffer som anvendes rett etter celleprøvetakingen være en cellelysebuffer anvendt for den utvalgte DNA-ekstraksjonsprosedyren. Tilsetning av bufferen bør frembringe en effektiv cellelyse og konservering av det DNA-inneholdende materialet under transport til et bestemt laboratorium og (muligens) for en lagringsperiode. DNA-ekstraherings-metoden bør velges på bakgrunn av dens anvendelighet for å analysere mange prøver, dvs. den bør være kompatibel med robotsystemer for multikanal væskehåndtering. Eksakte verdier for DNA-mengder som definerer "positive", "negative" og "tvilsomme" resultater fra testen bør bestemmes i kliniske studier.

ii) Tilsvarende initielle trinn for DNA-ekstrahering kan anvendes for analysen av molekylære markører for kolorektal cancer. Celler innsamlet ved berørings-avtrykks prosedyren bør frembringe en mye bedre kvalitet på DNA sammenlignet med de for tiden anvendte klinikker for DNA-ekstrahering fra avføringsprøver. PCR-amplifisering av dette DNA kan utføres uten presis kvantifisering av dens mengde. Multi-target molekylære analyser anses som en mulighet ved kolorektal cancerscreening, den kan imidlertid være mer tidskrevende og kostbar sammenlignet med direkte kvantitativ analyse. Samtidig kan DNA ekstrahert fra direkte kvantifisering med sikkerhet anvendes for PCR-amplifisering ved ytterligere diagnostiske analyser for kvantitative "positive" eller "tvilsomme" tilfeller.

iii) Ved behov for spesifikk isolering av kolonocytter fra andre celletyper, kan separeringsmetoder (for eksempel immunmagnetisk eller tetthetsgradientseparering) anvendes for å oppnå en høyere renhet av kolonocyttcellepopulasjonen for analysen. I denne hensikt kan cellekonserveringsmedier inneholdende antibiotika (noen bakterier tilstede i det innsamlede materialet er umulig å unngå) og mukolyttiske midler anvendes. Isolerte kolonocytter kan deretter anvendes for ulike typer analyser slik som DNA-ekstraksjon og -kvantifisering, DNA-ekstraksjon etterfulgt av PCR-amplifisering, cancermolekylære og biokjemiske markøranalyser, cytologisk/cytokjemisk vurdering, og direkte celletelling (tvilsom ved screening på grunn av lav hastighet og høye kostnader).

( b) Kolorektal cancerdiagnostikk

Diagnostisk anvendelse av tester fokuseres på individer som har noen bestemte plager eller allerede er identifisert til å lide av en tilstand. Målgrupper av pasienter er mye mindre enn de som forventes ved screeningshensikter.

i) Direkte DNA-kvantifisering kan utføres på individer som har plager som indikerer mulige kolorektale tilstander.

ii) DNA-ekstraksjon etterfulgt av PCR-amplifisering og molekylære analyser kan anvendes både for å bekrefte den initielle diagnose og for avanserte diagnostiske prosedyrer (vurdering av canceraggressivitet, sensitivitet overfor kjemoterapi for metastatiske tumorer, prognoser etc).

iii) Celleisolering kan anvendes både for videre molekylære/biokjemiske analyser og cytologiske undersøkelser (tumorceller med spesielle morfologiske trekk) kan lett finnes blant eksfolierte kolonocytter hos CRC-pasienter.

Claims (15)

1. Kolorektal celleprøvetakingsanordning som omfatter: et kolorektalt innføringselement (1) som har en distal innføringsende (2), en proksimal ende (34) og et lukkbart indre hulrom (3); en fleksibel membran (4) med en ytre, celleinnsamlingsoverflate (5) og en indre overflate, der nevnte membran er forseglet til den distale innføringsende av nevnte innføringselement og når den holdes inni det indre hulrom dannes en beholder med celleinnsamlingsoverflaten på innsiden av denne, beholderen er åpen mot innføringsenden av innføringselementet; slik at, ved anvendelse, vil trykksetting av det indre hulrom til minst et første forhøyet trykk medføre at membranen presses ut av den distale ende i nevnte innføringselement for å opprette kontakt med den kolorektale mukosale overflaten og trykksetting av det indre hulrom til et andre redusert trykk medfører at membranen trekkes tilbake og returnerer til det indre hulrom i nevnte innføringselement;karakterisert vedat anordningen videre omfatter hjelpemidler (8) for å forsegle innføringsenden for å danne et lukket hulrom plassert inni det indre hulrom i innføringselementet og definert ved celleinnsamlingsoverflaten av den fleksible membranen og forseglingsmidlet.

2. Anordning ifølge krav 1,karakterisert vedat den fleksible membran er elastisk og konstruert av en nitril, lateks eller gummibasert substans.

3. Anordning ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det lukkbare indre hulrom i innføringselementet er lukket.

4. Anordning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter hjelpemidler (7) for trykksetting av det indre hulrom, der hjelpemidlet er festet til den proksimale ende av innføringselementet.

5. Anordning ifølge krav 4, karakterisert vedat hjelpemidlet for trykksetting av det indre hulrom er festet til en ventil (18), slik som en selvlukkende ventil, til stede ved den proksimale ende av innføringselementet.

6. Anordning ifølge krav 4 eller 5, karakterisert vedat hjelpemidlet for trykksetting av det indre hulrom omfatter en kilde av sammenpresset luft eller en sprøyte.

7. Anordning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat innføringselementet er tilpasset bruk sammen med et rektalt tilgangsrør.

8. Anordning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat fluid kan tilføres til det lukkede hulrom dannet av den fleksible membran og forseglingsmidlet.

9. Anordning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det indre hulrom i innføringselementet er utstyrt med adhesjonsmidler.

10. Anordning ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat forseglingsmidlet er en gjenget kork.

11. Anordning ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 10,karakterisert vedat nevnte hjelpemidler for trykksetting av det indre hulrom er avtakbart fra innføringselementet.

12. Kit for å innsamle en prøve fra en kolorektal mukosal overflate hos et menneske,karakterisert vedat det omfatter en kolorektal celle-prøvetakingsanordning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, og et rektalt tilgangsrør (29) og eventuelt en obturator.

13. Kit ifølge krav 12,karakterisert vedat det ytterligere omfatter et smøremiddel, slik som en smøregelé.

14. Kit ifølge et hvilket som helst av kravene 12 eller 13,karakterisert vedat det ytterligere omfatter en eller flere reagenser, slik som en cellelysebuffer (35) eller et cellekonserveringsmedium.

15. Kit ifølge krav 14,karakterisert vedat nevnte ene eller flere reagenser er til stede i den gjengede korken som en blisterpakke (21).