EA009465B1 - Синтетические пептиды человека и фармацевтические композиции, содержащие их, для лечения системной красной волчанки - Google Patents
Синтетические пептиды человека и фармацевтические композиции, содержащие их, для лечения системной красной волчанки Download PDFInfo
- Publication number
- EA009465B1 EA009465B1 EA200300939A EA200300939A EA009465B1 EA 009465 B1 EA009465 B1 EA 009465B1 EA 200300939 A EA200300939 A EA 200300939A EA 200300939 A EA200300939 A EA 200300939A EA 009465 B1 EA009465 B1 EA 009465B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- mmp
- mice
- patients
- levels
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 372
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 127
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 91
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 33
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 claims description 167
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 claims description 167
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 139
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 82
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 claims description 77
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 35
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 claims description 29
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 claims description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 24
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 2
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 abstract description 31
- 239000000126 substance Chemical class 0.000 abstract description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 228
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 84
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 60
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 60
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 53
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 50
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 43
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 43
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 32
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 29
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 27
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 27
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 27
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 20
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 19
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 208000031752 chronic bilirubin encephalopathy Diseases 0.000 description 14
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 11
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 238000007804 gelatin zymography Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 108700020831 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 7
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 7
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 7
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 7
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical class CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001181114 Neta Species 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 6
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 6
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 6
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 5
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 5
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 102100030844 Exocyst complex component 1 Human genes 0.000 description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 4
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- -1 salts formed Chemical class 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 4
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- 101710104662 Enterotoxin type C-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100040837 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 101000893710 Homo sapiens Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical class OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000882403 Staphylococcus aureus Enterotoxin type C-2 Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101100012877 Gallus gallus FGFR1 gene Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000827688 Homo sapiens Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000648077 Homo sapiens Syntaxin-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150050115 RABEPK gene Proteins 0.000 description 2
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101100263989 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MTC5 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010058556 Serositis Diseases 0.000 description 2
- 101000882406 Staphylococcus aureus Enterotoxin type C-1 Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXSUFCOOZSGWSW-UHFFFAOYSA-M acetyloxy-(4-aminophenyl)mercury Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=C(N)C=C1 RXSUFCOOZSGWSW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000011101 acute retrobulbar neuritis Diseases 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 230000003429 anti-cardiolipin effect Effects 0.000 description 2
- 230000003460 anti-nuclear Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 101150115874 cek1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000477 gelanolytic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000025160 regulation of secretion Effects 0.000 description 2
- 208000022670 retrobulbar neuritis Diseases 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- WBWUIYCIVXDWHM-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WBWUIYCIVXDWHM-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102100036791 Adhesion G protein-coupled receptor L2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036793 Adhesion G protein-coupled receptor L3 Human genes 0.000 description 1
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 1
- 102000016284 Aggrecans Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000037187 Autoimmune Experimental Neuritis Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 101100325855 Caenorhabditis elegans bec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001035645 Catharacta maccormicki Hemoglobin subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 206010059232 Epileptic psychosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001653 FEMA 3120 Substances 0.000 description 1
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039558 Galectin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100532586 Halobacillus halophilus (strain ATCC 35676 / DSM 2266 / JCM 20832 / KCTC 3685 / LMG 17431 / NBRC 102448 / NCIMB 2269) Sh-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100054892 Homo sapiens ADCY10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000928189 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L2 Proteins 0.000 description 1
- 101000928176 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L3 Proteins 0.000 description 1
- 101001065747 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase LRSAM1 Proteins 0.000 description 1
- 101100172877 Homo sapiens EXOC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001007029 Homo sapiens Keratin, type II cuticular Hb2 Proteins 0.000 description 1
- 101000963987 Homo sapiens SH3 domain-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000628693 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 25 Proteins 0.000 description 1
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 101150000378 IML1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033629 ISF1 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100028339 Keratin, type II cuticular Hb2 Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124761 MMP inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010016160 Matrix Metalloproteinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000422 Matrix Metalloproteinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100172512 Mus musculus Epha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000655384 Mus musculus Testis-expressed protein 9 Proteins 0.000 description 1
- MMOXZBCLCQITDF-UHFFFAOYSA-N N,N-diethyl-m-toluamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(C)=C1 MMOXZBCLCQITDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 101100495393 Rattus norvegicus Ceacam3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100232780 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) IGO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100026737 Serine/threonine-protein kinase 25 Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100025293 Syntaxin-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 101150061135 TBCA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029530 Thyrotropin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000216217 Turkish sheep encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 241001532059 Yucca Species 0.000 description 1
- 235000004552 Yucca aloifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000012044 Yucca brevifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000017049 Yucca glauca Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical class 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010068678 beta Subunit Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229920005605 branched copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000047011 human LRSAM1 Human genes 0.000 description 1
- 102000050887 human SH3BP5 Human genes 0.000 description 1
- 102000050961 human STXBP1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 231100001028 renal lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 101150106357 slc32a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- QBYUNVOYXHFVKC-GBURMNQMSA-N taurolithocholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 QBYUNVOYXHFVKC-GBURMNQMSA-N 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108010005491 trypsin carboxypeptidase peptide inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Синтетические пептиды по крайней мере из 12 и самое большое из 30 аминокислотных остатков, включающие последовательность, состоящую из определяющего комплементарность участка (CDR) или находящуюся в CDR, содержащегося в тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-Id, или последовательность, полученную в результате замещения, и/или деления, и/или присоединения одного или более аминокислотных остатков к указанной последовательности, и соли, химические производные и полимеры указанных пептидов можно использовать для иммуномодуляции ответных реакций, ассоциированных с системной красной волчанкой.
Description
Данное изобретение относится к созданию синтетических пептидов, а точнее синтетических пептидов, базирующихся на последовательности определяющего комплементарность участка (СЭВ) человеческого моноклонального антитела против ДНК, к созданию фармацевтических композиций, содержащих их, и их применению для иммуномодулирования ответных реакций, ассоциированных с системной красной волчанкой (8ЬЕ).
Сокращения
16/6-Ιά: человеческое тАЬ 16/6-Ιά; СЭВ: определяющий комплементарность участок; СЕЛ: полный адъювант Фрейнда; йСЭВ-пептид: пептид, базирующийся на СЭВ-участке человеческого тАЬ 16/6-Ιά; 1ιί.ΌΡ1: человеческий пептид с 8ЕО ΙΌ N0: 6; 11С0В3: человеческий пептид с 8Е0 ΙΌ N0: 7; человеческое тАЬ 16/6-Ιά: человеческое патогенное анти-ДНК-тАЬ, которое несет 16/6-Ιά; Ιί,Ό: отложения иммунных комплексов; Ιά: идиотип; ΕΝΕ: клетки лимфотического узла; тАЬ: моноклональное антитело; ММР: матриксная металлопротеиназа; тСЭВ1: мышиный пептид с 8Е0 ΙΌ N0: 1; тС19В3: мышиный пептид с 8Е0 ΙΌ N0: 3; РВЬ: лимфоциты периферической крови; РВ8: забуференный фосфатом физиологический раствор; теу: обратный пептид; 8ЬЕ: системная красная волчанка; ^ЬЕОАЕ индекс активности заболевания 8ЬЕ; ТОЕ-β: трансформирующий фактор роста β; ИТ: не подвергнутый лечению.
Предпосылки к созданию изобретения
Системная красная волчанка (8ЬЕ) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся продукцией множества аутоантител, включая антитела к ДНК, антитела к ядерным антигенам и антитела к рибонуклеопротеинам. Прогрессирование заболевания ассоциировано с общими клиническими проявлениями и поражением тканей и органов, вызванным отложением иммунных комплексов. Подобно другим аутоиммунным состояниям, этиология 8ЬЕ является мультифакторной, определяющейся генетическими факторами, факторами окружающей среды, гормональными и иммунологическими факторами. Не существует никакой специфической терапии, направленной на предупреждение или лечение 8ЬЕ.
Человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело, называемое 16/6-Ιά, несет общий идиотип (81юепГек е! а1., 1983). Установлено, что идиотип имеет клиническую значимость у больных 8ЬЕ. Так, обнаружено, что 16/6-Ιά экспрессируется на анти-ДНК-антителах у 54% больных 8ЬЕ в активной фазе заболевания (НепЬетд е! а1., 1984) и в пораженных органах больных 8ЬЕ (НепЬетд и СоШпз, 1985). Мыши имбредных линий, у которых не развиваются никакие спонтанные аутоиммунные заболевания, были иммунизованы указанным человеческим анти-ДНК-тАЬ 16/6-Ιά и обнаруживали основные признаки 8ЬЕ у человека, а также в спонтанных мышиных моделях этого заболевания (МеМ1оу1с е! а1., 1988). Таким образом, после иммунизации мыши продуцировали антитела, специфичные к 16/6-Ιά, антитела, которые несут 16/6-Ιά, и антитела, направленные против различных ядерных антигенов (дцДНК, оцДНК, 8т, рибонуклеопротеина, Во, Ьа и других). Серологические показатели были связаны с лейкопенией, повышенной скоростью оседания эритроцитов, протеинурией, множеством иммунных комплексов в почках и склерозом гломерул (МеМ1оу1с е! а1., 1988), которые являются типичными проявлениями 8ЬЕ.
Мышиные анти-16/6-Ш-тАЬ (АЬ2), полученные от мышей с экспериментальной 8ЬЕ, также способны индуцировать экспериментальное заболевание у мышей (МеМ1оу1с е! а1., 1989), подобно 16/6-Ιά (АЬ1). Кроме того, мышиное анти-ДНК-тАЬ, которое экспрессирует 16/6-Ιά, получали от мышей, пораженных экспериментальной 8ЬЕ. Антитело АЬ3, названное 5012, взаимодействовало с антителами, специфичными к 16/6-Ιά. Иммунизация последним антителом приводила к индукции экспериментальной 8ЬЕ с симптомами, подобными наблюдаемым после иммунизации человеческими 16/6-Ιά (АЬ1) и мышиными анти-16/6-Ιά (АЬ2) тАЬ (Уа18тап е! а1., 1993). Описанные результаты демонстрируют важность структуры 16/6-Ιά для индукции и прогрессирования 8ЬЕ у мышей.
Для понимания механизма, посредством которого вырабатываются аутоантитела, ассоциированные с 8ЬЕ, в данном изобретении получали целый ряд моноклональных аутоантител у мышей С3Н.8У, у которых индуцировали экспериментальную 8ЬЕ. Показано, что, как правило, моноклональные аутоантитела, способные вызывать появление антител, которые несут 16/6-Ιά, или взаимодействовать с ними, являются патогенными и, таким образом, способны индуцировать экспериментальную 8ЬЕ у мышей (Ейске е! а1., 1990; 811юедег е! а1., 1993).
Позднее секвенировали вариабельные (V) области девяти аутоантител, которые связываются или с ДНК, или с ядерным экстрактом (NЕ) НеЬа, полученным от мышей С3Н.8ХУ с экспериментальной 8ЬЕ (ХУактап и Мохез, 1993). Анализировали моноклональные антитела с различной специфичностью, чтобы определить связь между разными аутоантителами. Установлено, что три тАЬ связывают ДНК и, как было показано, демонстрируют последовательность, типичную для патогенных анти-ДНК-антител. Показано, что одно из названных тАЬ, обозначенное 2С4С2, утилизирует ген ν-области тяжелой (Н) цепи (νΗ), идентичной νΗ анти-ДНК-тАЬ, полученного от других предрасположенных к волчанке мышей, а именно (№Вх№У)Е1. Ген ν-области легкой (Ъ) цепи (М) тАЬ 2С4С2 имеет 98% гомологии с VI. другого анти-ДНК-тАЬ, также выделенного от мышей (№Вх№У)Е1. Другие два анти-ДНК-тАЬ, обозначенные 5012-4 и 5012-6, имеют 93% гомологии их последовательностей νΗ с последовательностью νΗ тАЬ 2С4С2. На основании данных анализа указанных тАЬ оказалось, что аутоантитела, обнаруженные у
- 1 009465 мышей с экспериментальной 8ЬЕ, утилизируют генетические элементы, подобные элементам, утилизированным шЛЬ, которое получено от линий мышей, у которых спонтанно развивается волчанка.
Т-клетки играют важную роль в индукции и развитии экспериментальной 8ЬЕ. Так, показано, что линии и клоны Т-клеток, специфичные к 16/6-И, индуцируют экспериментальную 8ЬЕ у сингенных реципиентов подобно антителу 16/6-И. Поэтому после инокуляции активированных клеток указанных линий у мышей появлялись серологические признаки и возникало поражение почек, что является типичным для 8ЬЕ (Ейске с1 а1., 1991).
Как описано выше, тАЬ 5012, которое было получено от мышей с экспериментальной 8ЬЕ и которое, как было показано, связывает ДНК и несет 16/6-И, способно индуцировать экспериментальную 8ЬЕ у мышей (Уаыпап с1 а1., 1993). Т-клетки, которые специфически взаимодействуют с тАЬ при пролиферации, возможно, взаимодействуют с пептидами, представляющими последовательности из их определяющих комплементарность участков (СЭК). Имеется большая вероятность того, что Т-клетки распознают У-участки вышеописанных антител, так как они не взаимодействуют с другими антителами, которые содержат такую же константную область, но различаются по специфичности. В вариабельной области участками с наиболее высокой вероятностью распознавания являются СЭК, так как названные участки представляют собой участки, которые больше всего отличаются среди различных антител. Участки СЭК последовательностей УН девяти патогенных мышиных тАЬ, упомянутых выше, которые индуцируют 8ЬЕ у мышей, показаны на фиг. 1 Уаштаи и Мохс5. 1993, на которой представлены полные нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности для вариабельных тяжелых цепей (УН) девяти тАЬ.
В международной патентной публикации РСТ У0 96/30057 заявители описывают пептиды, базирующиеся на СЭК-участках патогенных тАЬ, полученных от мышей с экспериментальной 8ЬЕ, в частности пептиды от 1а до Ша, базирующиеся на участках СЭК1, СЭК2 и СЭК3, соответственно, УН-цепи мышиного тАЬ, названного 5012, и пептиды 1Уа и Уа, базирующиеся на участках СЭК1 и СЭК3, соответственно, УН-цепи мышиного тАЬ, названного 2С4С2. Упомянутые пептиды содержат, в основном, последовательности, которые обозначены 8ЕЦ ГО N0: 1 - 8ЕЦ ГО N0: 5, в виде следующих:
Т 0 Υ Υ М О У У К О 8 Р Е К 8 Ь Е У I 0 (1а) [8ЕЦ ГО N0: 1]
Е I N Р 8 Т 0 0 Т Т Υ N О К Е К А К А Т (11а) [8ЕЦ ГО N0: 2]
Υ Υ С А К Е Ь У Е Р Υ А М Ό Υ У 0 О 0 8 (Ша) [8ЕЦ ГО N0: 3] 0 Υ N М N У У К О 8 Н 0 К 8 Ь Е У I 0 (1Уа) [8ЕЦ ГО N0: 4] Υ Υ С А К 8 0 К Υ 0 N Υ У 0 О Т Ь (Уа) [8ЕЦ ГО N0: 5]
Показано, что приведенные пептиды, и в особенности пептиды 1а и Ша, обозначенные в описании тСГОК1 |8ЕЦ ГО N0: 1] и тСГОК3 [8ЕЦ ГО N0: 3], соответственно, при введении в РВ8 способны ингибировать сенсибилизацию Т-клеток или к соответствующему пептиду тСЭК, или к целой анти-ДНКтАЬ 16/6-И, полученному или от мыши, или человека (Уаыпап с1 а1., 1997). Кроме того, установлено, что пептиды тСЭК1 и тСЭК3 или предупреждают, или лечат уже развившуюся 8ЬЕ, которая или индуцирована человеческим анти-ДНК тАЬ 16/6-И, или возникает спонтанно у предрасположенных к 8ЬЕ мышей (№Вх№У)Е1 или МКЬ/1рг/1рг (ЕПа1 с1 а1., 2000 и 2001).
Краткое изложение изобретения
Согласно данному изобретению в настоящее время установлено, что пептиды, базирующиеся на последовательности СЭК человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-И, способны иммуномодулировать 8ЬЕ-ассоциированные ответные реакции. Так, пептиды, базирующиеся на СЭК1 и СЭК3 16/6-И человека, были протестированы как показано, ингибируют пролиферацию клеток лимфатических узлов мышей, иммунизованных мышиными пептидами тСЭК1 (8ЕЦ ГО N0: 1) и тСЭК3 (8ЕЦ ГО N0: 3) или целым человеческим анти-ДНК-тАЬ 16/6-И, ингибируют пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови (РВЬ) больных 8ЬЕ на человеческое анти-ДНК-тАЬ 16/6-И и уменьшают интенсивность симптомов заболевания у мышей, пораженных спонтанной или экспериментальной 8ЬЕ.
Представленные данные оказались совершенно неожиданными, так как не все СЭК патогенных аутоантител одинаково распознаются Т-клетками больных. Как ранее было показано в лаборатории заявителя (Пауаи с! а1., 2000), СЭК анти-ДНК-аутоантитела 2С4С2 в меньшей степени распознаются Т-клетками больных 8ЬЕ, чем пептиды, базирующиеся на СЭК анти-ДНК-антитела 5012. Кроме того, показано, что большинство аналогов пептидов, базирующихся на СЭК мышиных аутоантител, описанных в вышеупомянутом У0 96/30057, не являются эффективными при ингибировании, и, таким образом, модификации, встречающиеся в последовательностях пептидов, базирующихся на СЭК человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела данного изобретения, не могли быть предсказаны или рассматриваться как эффективные. Кроме того, применение пептидов, базирующихся на антителе человека, следует рассматривать как предпочтительное для человека применение по сравнению с пептидами, базирующимися на последовательности антитела других животных.
Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к синтетическому пептиду, выбранному из группы, состоящей из:
(а) пептида по крайней мере из 12 и самое большое из 30 аминокислотных остатков, содержащего последовательность, состоящую из определяющего комплементарность участка (СЭК) или находящуюся
- 2 009465 в СЭЯ имеющегося в тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-И (в дальнейшем последовательность Ιιί'ΌΕ). или последовательность. полученную: (ί) замещением одного или более аминокислотных остатков последовательности Ιιί'ΌΕ различными аминокислотными остатками; (п) делецией одного или более аминокислотных остатков из последовательности Ιιί'ΌΕ; и/или (ΐϊϊ) присоединением одного или более аминокислотных остатков к последовательности Ιιί'ΌΠ или соли. или химического производного указанного пептида;
(b) двойного синтетического пептида. содержащего два различных типа указанного пептида (а). ковалентно связанных друг с другом или непосредственно. или через короткую связующую цепь;
(c) пептидного полимера. содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (б) пептида (а) или пептидного полимера (с). присоединенного к макромолекулярному носителю.
Человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело 16/6-И. упоминаемое в данном описании как человеческое тАЬ 16/6-И. является патогенным человеческим моноклональным анти-ДНК-антителом. способным индуцировать 8ЬЕ-подобное заболевание у мышей.
Пептид согласно настоящему изобретению. содержащий последовательность Ιιί'ΌΠ которая определена выше. называют в описании пептид Ιιί'ΌΕ.
В одном предпочтительном аспекте пептид Ιιί'ΌΕ включает в себя последовательность СОЯ. более предпочтительно ί.ΌΕ1 или СЭЯ3. тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-И. таких как. но не ограничиваясь указанными. пептиды. обозначенные в описании 1ιί.ΌΕ1 и ЙСОЯ3. по существу. имеющие следующие последовательности. обозначенные. соответственно. 8ЕО ΙΌ N0: 6 и 8Е0 ΙΌ N0: 7:
Υ Υ V 8 V I Я О Ρ Р 6 К 6 Е Е V I 6 |8ЕЕ) ΙΌ N0: 6]
Υ Υ С А Я 6 Ь Ь Я 6 6 V N Ό V Ό Υ Υ 6 Μ Ό V |8ЕЕ) ΙΌ N0: 7]
В другом аспекте в изобретении представляют фармацевтическую композицию. содержащую по крайней мере один синтетический пептид или пептидный полимер настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция особенно полезна для лечения 8ЬЕ и уменьшения интенсивности клинических проявлений заболевания. в особенности посредством модулирования 8ЬЕ-ассоциированных ответов. например снижения уровней активности ММР-3. и/или ММР-9. и/или 1Ь-2. и/или ШЫ-у. или повышения уровня активности Τ6Ε-β у больного 8ЬЕ.
В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения 8ЬЕ. предусматривающему введение больному 8ЬЕ эффективного количества пептида или пептидного полимера изобретения. Кроме того. изобретение относится к способу иммуномодулирования ответных реакций. ассоциированных с 8ЬЕ. например снижения уровней активности ММР-3. и/или ММР-9. и/или 1Ь-2. и/или ГЕЛ-у. или повышения уровня активности Τ6Ε-β у больного 8ЬЕ. предусматривающему введение больному 8ЬЕ эффективного количества пептида или пептидного полимера изобретения.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного 8ЬЕ. который включает определение в различные интервалы времени уровней ММР-3 и/или ММР-9 в образцах крови. полученных от указанного больного. которого лечат указанным лекарственным средством. причем сниженный уровень ММР-3 и/или ММР-9 коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
В другом аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного 8ЬЕ. который включает определение в различные интервалы времени уровня 1Ь-2 и/или ШИ-у в образце крови. полученном от указанного больного. которого лечат указанным лекарственным средством. причем сниженный уровень 1Ь-2 и/или ГЕЛ-у коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
Еще в одном аспекте изобретение относится к способу оценки эффективности лекарственного средства при лечении больного 8ЬЕ. который включает определение в различные интервалы времени уровня Τ6Ε-β в образце крови. полученном от указанного больного. которого лечат указанным лекарственным средством. причем повышенный уровень Τ6Ε-β коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
Лекарственное средство. эффективность которого следует оценивать в соответствии с любым из вышеприведенных способов. может представлять собой. например. пептид настоящего изобретения или мышиный пептид. который описан в вышеупомянутой заявке XV0 96/30057. не ограничиваясь перечисленным.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано ингибирование пролиферативных ответов клеток лимфатических узлов мышей. иммунизованных человеческим тАЬ 16/6-И. на различные концентрации тАЬ 16/6-И (0.1-10 мкг/лунку) при лечении 300 мкг Ιιί'ΌΕΕ
На фиг. 2 показано ингибирование пролиферативных ответов клеток лимфатических узлов мышей. иммунизованных человеческим тАЬ 16/6-И. на различные концентрации тАЬ 16/6-И (0.1-10 мкг/лунку) при лечении 50 мкг Ιιί'ΌΕΕ
На фиг. 3А-С представлен уровень цитокинов у мышей ВАЕВ/с. иммунизованных человеческим тАЬ 16/6-И и подвергнутых воздействию 1ιί.ΌΕ1 или пептидом р259-271. не относящимся к пептидам настоящего изобретения. Фиг. 3А - уровень ЮТ-у; фиг. 3В - уровень Τ6Ε-β; фиг. 3С - уровень ГЬ-10.
- 3 009465
На фиг. 4 представлены концентрации человеческого анти-ДНК тЛЬ 16/6-16, необходимые для оптимального стимулирования РВБ больных 8БЕ и здоровых в качестве контролей. РВБ стимулировали различными концентрациями (0,1-40 мкг/лунку) тАЬ 16/6-16. Концентрацию, дающую наиболее высокий индекс стимулирования, определяли как оптимальную для стимуляции пролиферативного ответа.
На фиг. 5 продемонстрирована пролиферация РВЬ от одного больного 8БЕ, стимулированных митогенным фитогемагглютинином (РНА) в отсутствие или в присутствии Ιιί,ΌΡΙ или ЙСЭК3.
На фиг. 6 продемонстрирована пролиферация РВЬ от одного больного 8БЕ, стимулированных человеческим тАЬ 16/6-16 в отсутствие или в присутствии человеческих пептидов Ιιί,ΌΡΙ или ЙСЭКЗ или мышинного пептида тСЭРЗ.
На фиг. 7 продемонстрирована пролиферация РВЬ от одного больного 8ЬЕ, стимулированных человеческим тАЬ 16/6-16 в отсутствие и в присутствии человеческих пептидов Ιιί',ΌΡ 1 или ЙСЭКЗ или мышинных обратных пептидов геутСБР1 и гсутСЭРЗ.
На фиг. 8 представлено ингибирование секреции 1Б-2 РВЬ больных 8ЬЕ, стимулированных человеческим тАЬ 16/6-16 в отсутствие или в присутствии 1ιί.ΌΡ1 или ЙСЭКЗ.
На фиг. 9 представлено повышение секреции ТСР-β РВЬ одного репрезентативного больного 8ЬЕ, стимулированных человеческим тАЬ 16/6-16 в отсутствие или в присутствии 1ιί.ΌΡ1 или ЙСЭК3.
На фиг. 10 показаны уровни анти-ДНК-аутоантител у мышей (Ы2ВхМ2У)Е1, не подвергнутых лечению или подвергнутых лечению 300 мкг 1ιί.ΌΡ1 или обратным пептидом теукСЭКб (использовали как контроль).
Фиг. 11А-1Ш являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от 8БЕпредрасположенных мышей (К2ВхКЙУ)Е1, которых подвергали воздействию РВ8 (11 А, 11В) или 100 мкг 1ιί.ΌΡ1 (11С, 11Ό), начиная с возраста 5,5 месяцев. Срезы получали от мышей, умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений 1д срезы инкубировали с Р1ТС-конъюгированными антимышиными 1дС козы (специфичные к γ-цепи) (11 А, 11Сх100; 11В, 1Шх400).
Фиг. 12А-12Р являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от 8БЕпредрасположенных мышей (КИВхЫ2У)Е1, которых подвергли воздействию РВ8 (12А, 12В), или 300 мкг 1ιί.ΌΡ1 (12С, 12Ό), или обратного пептида теукСЭКб (12Е, 12Р). Срезы получены от мышей, умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений иммунных комплексов 1д срезы инкубировали с НТС-конъюгированными антимышиными 1дС козы (специфичные к γ-цепи) (12А, 12С, 12Ех100; 12В, 12Ό, 12Рх400).
На фиг. 13А-13С представлен уровень цитокинов, который определяли с помощью ЕБ18А-анализа в супернатантах Соп А-стимулированных культур спленоцитов 8ЬЕ-предрасположенных мышей (ЬИВхКЙУ)Е1, которых не подвергали воздействию или подвергали воздействию ЙСЭК1 или обратным пептидом гсуйСЭКЕ Фиг. 13А - уровень ΙΝΡ-γ; фиг. 13В - уровень 1Б-10; фиг. 13С - уровень ТСР-β.
Фиг. 14А-14Р являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от мышей ВАБВ/е с 16/6-16-индуцированной экспериментальной 8БЕ, подвергнутых воздействию РВ8 (14А, 14В), или 200 мкг 1ιί.ΌΡ1 (14С, 14Ό), или обратного пептида теукСЭКб (14Е, 14Р). Срезы получены от мышей, умерщвленных в возрасте 9 месяцев. Для определения отложений иммунных комплексов 1д срезы инкубировали с Р1ТС-конъюгированными антимышиными 1дС козы (специфичные к γ-цепи) (14А, 14С, 14Ех100; 14В, 14Ό, 14Рх400).
На фиг. 15А-15С представлены уровни цитокинов, которые определяли с помощью ЕБ18А-анализа в супернатантах 16/6-16-стимулированных культур лимфатических узлов мышей ВАБВ/е с 16/6-16-индуцированной экспериментальной 8БЕ, которых не подвергали лечению или подвергали лечению Ιιί,ΌΡ 1 (20С или 300 мкг) или обратным пептидом гсуйСОКБ Фиг. 15А - уровень ΙΝΡ-γ; фиг. 15В - уровень ΊΝΕ-α; фиг. 15С - уровень 1Б-10; фиг. 15Ό - уровень ТСР-β; фиг. 15Е - уровень ТСР-β, определенный в супернатантах 16/6-16-стимулированных клеток селезенки.
Фиг. 16А-16Р являются фотографиями, демонстрирующими характерные почечные срезы от 8БЕпредрасположенных мышей (NΖВхNΖУ)Р1, не подвергнутых лечению (16А, 16В), или мышей-реципиентов спленоцитов мышей, подвергнутых лечению или 300 мкг 1ιί.ΌΡ1 (16С, 16Ό), или обратным пептидом теукСЭКб (16Е, 16Р). Для определения отложений иммунных комплексов 1д срезы инкубировали с НТС-конъюгированными антимышиными 1дС козы (специфичные к γ-цепи) (16А, 16С, 16Ех400; 16В, 16Ό, 16Рх100).
На фиг. 17А-17В изображена динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей (№Вх№У)Р1. У мышей (№Вх№У)Р1 (10 мышей/группу) брали кровь в указанные временные периоды. В объединенных сыворотках (4 мкл) мышей от каждой группы определяли уровни экспрессии ММР-3, используя метод Вестерн-блоттинга (фиг. 17А), или активность ММР-9 и ММР-2, используя гель-зимографию (фиг. 17В). Представлены результаты 4 аналогичных экспериментов.
На фиг. 18А-18В изображена динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей ВАБВ/е. У неиммунизованных мышей ВАБВ/е (10 мышей/группу) или мышей, которых иммунизовали РВ8/СРА (10 мышей/группу) или 16/6-Ι6 (в СРА; 10 мышей/группу), брали кровь в указанные временные периоды. В объединенных сыворотках (4 мкл) мышей от каждой группы определяли уровни экспрессии
- 4 009465
ММР-3, используя метод Вестерн-блоттинга (фиг. 18 А), или активность ММР-9 и ММР-2, используя гелевую зимографию (фиг. 18В). Представлены результаты 3 аналогичных экспериментов.
На фиг. 19А-19С представлено иммуноокрашивание на ММР-3 и ММР-9 почечных срезов иммунизованных мышей ВАЬВ/с. Неиммунизованных мышей ВАЬВ/с или мышей, которых иммунизовали РВ8/СРА или 16/6-16 (в СРА) (3 мыши/группу), умерщвляли через 5,5 месяцев после их реиммунизации 16/6-16. Почки удаляли и их срезы (5 мкм), полученные на криостате, подвергали иммуноокрашиванию на ММР-3 (19А) и ММР-9 (19В). Проводили контрольное окрашивание на эффективность блокирования (19С) (х200). Результаты являются характерными для 3 аналогичных экспериментов.
На фиг. 20А-20В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотках мышей (№Вх№А)Р1, подвергнутых лечению тСИК1. В превентивных экспериментах мышам (10/группу) еженедельно инъецировали подкожно тСИК1 в течение 10 недель, начиная с возраста 2 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 4 месяца после окончания лечения. В лечебных экспериментах мышам (10/группу) подкожно инъецировали или РВ8, или 250 мкг/мышь тСИК1, начиная с возраста 5 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 3 недели после окончания лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали уровни ММР-3 методом Вестерн-блоттинга (20А) и активность ММР-9, используя гелевую зимографию (20В). ИТ - не подвергнутые лечению. Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов.
На фиг. 21А-21В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 у мышей ВАЬВ/с, иммунизованных 16/616, которых подвергали лечению тСПК.1. В профилактических экспериментах мышей (8/группу) подвергали лечению путем внутривенного введения тС.ПК1 (100 мкг/мышь). Представлены результаты исследования сывороток, взятых через 4,5 месяца после окончания лечения. В лечебных экспериментах мышей (8/группу) подвергали лечению путем подкожного введения 100 мкг/мышь тС.ПК1. Представлены результаты исследования сывороток, полученных после окончания лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали ММР-3 методом Вестерн-блоттинга (21А) и активность ММР-9 методом гелевой зимографии (21В). ИТ - не подвергнутые лечению. Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов.
На фиг. 22А-22В представлено иммуноокрашивание на ММР-3 и ММР-9 почечных срезов от мышей ВАЬВ/с, иммунизованных 16/6-16, которых подвергали воздействию шСПК 1 для предупреждения (22А) или лечения (22В) экспериментальной 8ЬЕ. Мышей умерщвляли через 8 месяцев после индукции заболевания и их почки удаляли. Криосрезы (5 мкм) получали на криостате и подвергали иммуноокрашиванию относительно ММР-3, ММР-9 и на присутствие отложений иммунных комплексов (х200). (\ν/ϋ) представляет контрольное окрашивание на эффективность блокирования без первого антитела. Результаты являются характерными для 2 аналогичных экспериментов.
На фиг. 23А-23В представлены уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотках мышей (№Вх№А)Р1, подвергнутых лечению 11С.ПК1. В лечебных экспериментах мышам (10/группу) подкожно инъецировали или РВ8, или 100 мкг, или 30 мкг/мышь ЙСИК1 1 раз в неделю в течение 10 недель, начиная с возраста 7 месяцев. Представлены результаты исследования сывороток, полученных в середине лечения. В объединенных сыворотках от каждой экспериментальной группы исследовали уровни ММР-3 методом Вестернблоттинга (23 А) и активность ММР-9, используя гелевую зимографию (23В). Представлены результаты 2 аналогичных экспериментов.
На фиг. 24 изображен репрезентативный гель, демонстрирующий активность ММР-2 и ММР-9 в сыворотках больных 8ЬЕ и здоровых контролей. В сыворотках (5 мкл) 40 индивидуальных больных 8ЬЕ и 25 здоровых контролей исследовали их активности ММР-2 или ММР-9 методом гелевой зимографии. На фигуре представлены репрезентативные результаты исследования образцов сывороток от двух групп.
На фиг. 25 изображена диаграмма, демонстрирующая количественный анализ активности ММР-2 и ММР-9 в сыворотках больных 8ЬЕ (темные столбцы) и здоровых контролей (белые столбцы). В 36 образцах сывороток больных 8ЬЕ и 15 образцах сывороток здоровых контролей исследовали активность ММР-2 или ММР-9, используя специальные наборы для определения активности. Результаты представлены как средняя величина ± 8.е.т. (средняя квадратичная ошибка) *Р=0,0302.
Фиг. 26А-26В представляют собой графики, показывающие уровни активности ММР-9 и индексы активности заболевания (8ЬЕИА1) у больных 8ЬЕ. В 35 образцах сывороток от 8 мужчин (фиг. 26А) и 27 женщин (фиг. 26В), больных 8ЬЕ, исследовали активность ММР-9 с помощью специального набора для определения активности. Представлено распределение активности ММР-9 у больных согласно 8ЬЕЭА1. Пунктирной точечной линией изображена активность ММР-9 у здоровых доноров.
Фиг. 27А-27В представляют собой графики, показывающие характер изменения активности ММР-2 (белые круги) и ММР-9 (черные круги) в сыворотках двух больных 8ЬЕ, исследованных в течение 4-6 лет заболевания. В сыворотках исследовали активность ММР-2 или ММР-9 с помощью специального набора для определения активности. Исследования проводили в двух повторах.
Подробное описание изобретения
В одном аспекте данное изобретение относится к синтетическим пептидам, содержащим последовательность, состоящую из СИК или находящуюся в СИК, содержащемся в тяжелой или легкой цепи
- 5 009465 патогенного человеческого моноклонального анти-ДНК-антитела 16/6-16 (в дальнейшем определенное как человеческое анти-ДНК-шЛЬ 16/6-16 или человеческое шЛЬ 16/6-16), антитело, которое индуцирует 8ГЕ-подобное заболевание у мышей.
Синтетические пептиды изобретения, полученные на основе СЭК человеческого тАЬ 16/6-16, идентифицированные в описании как пептиды 11СЭК, предпочтительно базируются на СОК, находящемся в тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-16.
Участки СОК последовательностей νΗ человеческого тАЬ Ь6/6-16 включены в фиг. 4А Мартан с! а1., 1995. Участки СОК тяжелых цепей человеческого тАЬ 16/6-16, по существу, имеют следующие последовательности, которые обозначены 8ЕЦ ΙΌ N0: 8 - 8ЕЦ ΙΌ N0: 10:
СОК1: ЕЗСУУИЗ
СЭК2: ΕΙΝΗ3Ο3ΤΝΥΚΤ3ΕΚ3 [ЗЕО Ю N0:8] [ЗЕО Ю N0:9]
СЭКЗ:
СЬЬКССШЮУОУУУСМОУ [5Е0
Пептиды Ιιί'ΌΕ настоящего изобретения содержат по меньшей мере 12 и самое большое 30 амино кислотных остатков и предпочтительно включают последовательность, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 9 и 10, или более предпочтительно последовательности, обнаруженной в указанных 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 9 или 10, или последовательности, полученной посредством: (ί) замещения одного или более аминокислотных остатков последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 9 и 10 различными аминокислотными остатками; (ίί) делеции одного или более аминокислотных остатков из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 9 и 10; или (ίίί) присоединения одного или более аминокислотных остатков к последовательностям 8ЕЦ Ю N0: 8, 9 и 10.
Кроме последовательности Ιιί'ΌΕ, пептиды Ιιί'ΌΕ настоящего изобретения содержат другие аминокислотные остатки, предпочтительно аминокислотные остатки последовательностей человеческого тАЬ 16/6-Ι6, фланкирующих последовательности ЕС ЭК, или последовательностей, полученных в результате замещения одного или более аминокислотных остатков фланкирующих Ιιί'ΌΕ последовательностей различными аминокислотными остатками; в результате делеции одного или более аминокислотных остатков из фланкирующих Ιιί'ΌΕ последовательностей или в результате присоединения одного или более аминокислотных остатков к фланкирующим Ιιί'ΌΕ последовательностям.
Таким образом, в следующем аспекте в данном изобретении предусматривают синтетический пептид, базирующийся на СОК.1 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ι6, при этом указанный участок СОК.1 является, по существу, последовательностью, которая обозначена 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:
(а) пептида, содержащего последовательность, состоящую из или находящуюся в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, или последовательность, полученную посредством: (1) замещения одного или более аминокислотных остатков указанной 8ЕЦ ΙΌ N0: 8 различными аминокислотными остатками; (ίί) делеции одного или более аминокислотных остатков из указанной 8ЕЦ ΙΌ N0: 8; и/или (ίίί) присоединения одного или более аминокислотных остатков к указанной 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, или соли или химического производного указанно го пептида;
(Ь) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ко валентно связанных друг с другом или непосредственно или через короткую связующую цепь;
(с) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (6) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю.
В одном предпочтительном аспекте изобретения пептид, базирующийся на СОК.1 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ι6, является пептидом с последовательностью, по существу, обозначенной 8ЕЦ ΙΌ N0: 11:
Χι У У И 3 И I Х2 0 Хз Ρ Χι Хз С Хб Е И I С [ЗЕО Ю N0:11] где Х1 означает О или ТО; Х2 означает К или К; Х3 означает Р или 8; Х4 означает О или Е; Х5 означает К или Ό; и Х6 означает Е, Ь или 8.
В более предпочтительном аспекте пептид с 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 представляет собой 19-членный пептид, называемый здесь пептид 11С0К1 или просто 11С0К1, последовательности, которая, по существу, обозначена 8ЕЦ ΙΌ N0: 6:
ОУУМЗМ1К0РРСКСЕЕ1Л/1С [ЗЕО Ю N0:6]
В Ιιί'ΌΕ 1 последовательность СУУ\¥8, заключенная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, является последовательностью, за которой следует встречающаяся в природе последовательность СОК.1 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ι6, за исключением того, что остаток природного лейцина (Ь) последовательности тАЬ замещен остатком глутаминовой кислоты (Е) (жирный) в положении 15 пептида Ιιί'ΌΕΕ
В другом аспекте пептид с 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 является аналогом пептида 11С0К1, полученным замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательности пептида 11С0К1, примерами его являются пептиды с последовательностями, которые, по существу, обозначены 8ЕЦ ΙΌ N0: 12 8Е-0 ΙΌ N0: 18 (в которых замещенные или присоединенные аминокислоты изображены жирным шрифтом):
- 6 009465
| с | У | У и | 3 | и | I | в <2 | Р | Р | с | коь | Е | И | I | 0 | [ЗЕ<2 | Ю | N0:12] |
| с | У | У и | 3 | к | I | К <2 | Р | Р | с | коз | Е | И | I | 0 | [3ΕΩ | ю | N0:13] |
| с | У | У и | 3 | и | I | к 0 | Р | Р | 0 | ϋ 3 Е | Е | И | I | 0 | [ЗЕО | ю | N0:14] |
| 0 | У | У м | 3 | и | I | К <2 | Р | Р | 0 | КОЕ | Е | И | I | е | [ЗЕ<2 | ю | N0:15] |
| с | У | У и | 3 | и | I | к 0. | 8 | Р | с | К С Е | Е | N | I | с | [3ΕΩ | иго | N0:16] |
| с | У | У и | 3 | м | I | к 0 | Р | Р | Е | К С Е | Е | М | I | 3 | [ЗЕО | ю | N0:17] |
| т | с | У У | и | 5 | и | I к | <2 | Р | Р | с к с | Е | Е | N | I 3 | [ЗЕО | ю | N0:18] |
| В | следующем | аспекте в изобретении предусматривают синтетический | пептид, | базирующийся на |
СЭК.3 тяжелой цепи человеческого шЛЬ 16/6-Ιά, при этом указанный участок СЭК3 является последовательностью, по существу, обозначенной как 8ЕЦ ГО N0: 10, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:
(a) пептида, содержащего последовательность, состоящую из или находящуюся в 8ЕЦ ГО N0: 10, или последовательность, полученную посредством: (1) замещения одного или более аминокислотных остатков указанной 8ЕЦ ГО N0: 10 различными аминокислотными остатками; (ίί) делеции одного или более аминокислотных остатков из указанной 8ЕЦ ГО N0: 10; и/или (ίίί) присоединения одного или более аминокислотных остатков к указанной 8ЕЦ ГО N0: 10, или соли, или химического производного указанного пептида;
(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ко валентно связанных друг с другом или непосредственно, или через короткую связующую цепь;
(с) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (ά) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю.
В одном предпочтительном аспекте изобретения пептид, базирующийся на СЭК3 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ιά, является пептидом с последовательностью, по существу, обозначенной 8ЕЦ ГО N0: 19:
Υ Υ С А й Х1 Ь Ь Х2 Хз Х4 Х5 Х6 о V ϋ Υ Х7 С Х8 ϋ V [ЗЕ<2 Ю N0:19] где Χι означает О или Р; Х3 означает К или А; Х3 означает О или А; Х4 означает О или А; Х5 означает или А; Х6 означает N или А; Х7 означает Υ или и Х8 означает М или Ц.
В более предпочтительном аспекте пептид с 8ЕЦ ГО N0: 19 является пептидом с 8ЕЦ ГО N0: 1, называемым в описании пептид ЙСЭКЗ или просто 1тС0К3:
УУСАКЗЬЬКЗЗИЫОУОУУЗМОУ [ЗЕ<2 Ю N0:7]
В ЕС1Ж3 последовательность 0ΕΕΝ33Α\0ν0ΥΥΥ3Μ0ν |8ЕЦ ГО N0: 10] участка С0К3 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ιά модифицирована делецией одного из остатков тирозина (Υ), и ей предшествует природная последовательность тАЬ.
В другом аспекте пептид 8ЕЦ ГО N0: 19 является аналогом пептида 11С0К.3, полученным замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательности пептида 11С0К.3, примерами его являются пептиды с последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 20 - 8ЕЦ ГО N0: 27 (в которых замещенные или добавленные аминокислоты обозначены жирным шрифтом):
| У | У | с | А | К | 3 | ь | ь | и | 3 | 3 | и | А | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3ΕΩ | Ю | N0:20] |
| У | У | с | А | К | 3 | Е | ь | к | 3 | 3 | А | N | 0 | V | Ώ | Υ | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3Εζ2 | ΙΌ | N0:21] |
| У | У | с | А | к | 3 | ь | ь | к | 3 | А | и | N | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3ΕΩ | Ю | N0:22] |
| У | У | с | А | я | 3 | ь | ь | к | А | 3 | N | N | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3Ε<2 | Ю | N0:23] |
| У | У | с | А | к | 3 | ь | ь | А | 3 | 3 | М | N | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | Μ | Ό | V | [3Ε<2 | ΙΌ | N0:24] |
| У | У | с | А | к | г | в | ь | к | 3 | 3 | И | N | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3Ε<2 | Ю | N0:25] |
| У | У | с | А | к | 3 | ь | ь | к | 3 | 3 | и | N | ϋ | V | ϋ | Υ | Υ | 3 | ΰ | 0 | V | [3Ε<2 | Ю | N0:26] |
| У | У | с | А | к | 3 | ъ | ь | н | 3 | 3 | и | N | Ό | V | 0 | Υ | 3 | Μ | ϋ | V | [3Ε<2 | Ю | N0:27] |
Еще в одном аспекте в изобретении предусматривают синтетический пептид, базирующийся на СЭК2 тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ιά, при этом указанный участок СЭК2, по существу, представляет собой последовательность, обозначенную 8ЕЦ ГО N0: 9, при этом указанный пептид выбирают из группы, состоящей из:
(а) пептида, содержащего последовательность, состоящую из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 9 или находящуюся в ней, или последовательность, полученную: (ί) замещением одного или более аминокислотных остатков указанной 8ЕЦ ГО N0: 9 различными аминокислотными остатками; (ίί) делецией одного или более аминокислотных остатков из указанной 8ЕЦ ГО N0: 9; и/или (ίίί) присоединением од
- 7 009465 ного или более аминокислотных остатков к указанной 8ЕО ΙΌ N0: 9, или соли, или химического производного указанного пептида;
(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом или непосредственно, или через короткую связующую цепь;
(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (й) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю. Синтетические пептиды данного изобретения содержат 12-30, предпочтительно 17-23, наиболее предпочтительно 19-22 аминокислотных остатка и могут быть получены в результате химического синтеза или с помощью рекомбинантной технологии способами, хорошо известными в данной области.
Если получение описанных выше аналогов осуществляли замещением аминокислотных остатков, оказывается важным, чтобы заместители были выбраны из заместителей, которые кумулятивно не изменяют значительно объем, гиброфобную-гидрофильную характеристику и заряд соответствующих частей незамещенного родительского пептида. Таким образом, гидрофобный остаток можно замещать гидрофильным остатком или наоборот до тех пор, пока общее воздействие значительно не изменяет объем, гиброфобную-гидрофильную характеристику и заряд соответствующего незамещенного родительского пептида.
Данное изобретение также включает химические производные пептида настоящего изобретения. Химическое производное содержит дополнительные химические составляющие, обычно не являющиеся частью пептида, и охватывается настоящим изобретением до тех пор, пока оно сохраняет по крайней мере часть функции пептида, что позволяет примененять его для предотвращения или ингибирования Тклеточных пролиферативных ответов и аутоиммунного заболевания. Например, химическое производное можно получать в результате реакции органического дериватизирующего агента, способного взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками указанного пептида, и такое производное будет сохранять по крайней мере часть функции пептида, чтобы специфически ингибировать пролиферативный ответ и секрецию цитокинов Т-лимфоцитами мышей, которые являются высокоотвечающими на 8ЬЕ-индуцирующие аутоантитела организмами. Среди названных химических производных амиды представляют особый интерес, как амиды карбоксильных групп на С-конце, так и амиды свободных карбоксильных групп остатков аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Большинство таких химических производных и способы их создания хорошо известны в данной области.
Также в объем настоящего изобретения входят соли пептидов и аналогов настоящего изобретения. Используемый в описании термин соли относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп пептидной молекулы. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобного, и соли органических оснований, такие как соли, образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидином, прокаином и тому подобным. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли минеральных кислот, таких как, например, хлористо-водородной кислоты или серной кислоты, и соли органических кислот, таких как, например, уксусной кислоты или щавелевой кислоты. Такие химические производные и соли предпочтительно используют, чтобы модифицировать фармацевтические свойства пептида, когда речь идет о стабильности, растворимости и т. д.
Согласно данному изобретению пептиды ЙСЭК. могут быть выбраны посредством тестирования их потенциала ингибирования пролиферативного ответа Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на 8ЬЕ-индуцирующие аутоантитела. Как только пептид данного изобретения получают, его способность ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на 8ЬЕ-индуцирующие аутоантитела организмами, легко может быть определена любым специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования с использованием тестов, таких как тесты, описанные в заявке. Одним тестом, который может быть легко проведен, является определение способности пептидов ингибировать ίη νίίτο пролиферативные ответные реакции определенных линий или клонов Т-клеток, специфичных к 8ЬЕ-индуцирующим аутоантителам. Линиями и клонами Тклеток могут быть, например, линии и клоны Т-клеток, специфичные к 16/6-1й-тАЬ (Ейске еί а1., 1991), выведенные из иммунизованных клеток лимфатических узлов мышей по ранее описанному способу (Ахе1гой, О. апй Мохех. Е. 1ттипоЬю1оду, 172, 99 (1986)). Клетки подвергают воздействию стимулирующих антител, присутствующих на облученных сингенных клетках селезенки в присутствии обогащенной среды каждые 2 недели. Линии Т-клеток клонируют по стандартному методу предельных разведений. Пролиферативные ответы названных линий и клонов Т-клеток исследуют, например, по способу, описанному в \У0 96/30057, в Материалах и методах в разделе (д).
Другим тестом, который может быть проведен для того, чтобы выбрать аналоги, характеризующиеся требуемой активностью, является тест на способность синтетических пептидов ингибировать способность линий и клонов Т-клеток обеспечивать помощь пептидспецифическим В-клеткам в присутствии родительского пептида. Синтетические пептиды также могут быть исследованы в отношении их способности связываться непосредственно, после биотинилирования, с продуктами МНС класса ΙΙ на антигенпредставляющих клетках соответствующих штаммов. Для этой цели проводят Ν-концевое биотинилиро
- 8 009465 вание соответствующих пептидов при 0°С с избытком биотин-Ы-гидроксисукцинимида в водном растворе (Μοζθδ е! а1., 1989). Мышиные селезеночные адгезивные клетки или РВЬ-адгезивные клетки (1х106/образец) инкубируют с биотинилированными пептидами в РВ8, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (РВ8/В8А). при 37°С в течение 20 ч с последующей инкубацией с фикоэритринстрептавидином в течение 30 мин при 4°С. После каждой инкубации клетки дважды промывают вышеупомянутым раствором. Затем клетки анализируют методом проточной цитометрии, используя РЛС8еаи. В каждом анализе минимально исследуют 5000 клеток (для вышеописанных способов см., например, Μοζθδ е! а1., 1989).
Другим тестом, который может быть проведен, является исследование способности пептидов ингибировать секрецию цитокинов линией Т-клеток, или Т-лимфоцитами, или клетками лимфатических узлов мышей, которые являются высокоотвечающими на 8ЬЕ-индуцирующие аутоантитела организмами. Цитокины детектируют следующим образом. Активность Ш-1 оценивают методом ЕЬ18А, используя пару ловушек и детектирующие антитела (как описано ниже для 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10). 1Ь-2 определяют непосредственно, используя 1Ь-2-зависимую линию СТЬЕ, или методом ЕЫ8А. Уровни 1Ь-4, 1Ь-6, Ш-10, ΙΝΕ-γ и ΤΝΕ-α в супернатантах определяют методом ЕЫ8А, используя антитела к различным цитокинам (Рйатттдеи, 8аи О1едо, Са., И8А) в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, способность пептидов повышать уровень секреции иммуносупрессивного цитокина ТСЕ-β можно оценивать методом ЕЬ18А, как описано в нижеследующих примерах.
Пептиды, тестирование которых оказалось позитивным в одном или более приведенных здесь тестов ίη νίίτο, обеспечат разумные ожидания активности ίη νίνο. Однако исследования ίη νίνο могут быть также проведены без чрезмерного экспериментирования. Так, например, взрослым мышам можно вводить с инъекцией пептид-кандидат или на -3 день, или на 0 день. Затем мышей иммунизуют индуцирующим заболевание аутоантителом или пептидом. Через 10 дней исследуют клетки лимфатических узлов мышей в отношении их способности пролифелировать в ответ на иммуноген для того, чтобы определить ингибиторную способность кандидата-пептида.
Другой такой тест на животном ίη νίνο заключается в определении терапевтической активности непосредственно на мышиной модели ίη νίνο в отношении продукции 8ЬЕ, как описано выше. Пептиды можно инъецировать мышам, у которых эксперимантальная 8ЬЕ индуцирована различными способами при различных дозировках и разных временных схемах. Кроме того, подвергнутых лечению мышей можно периодически исследовать для того, чтобы определить влияние пептидов на ответные реакции на аутоантитела и проявления заболевания, вызванные у мышей аутоантителами, индуцирующими 8ЬЕ.
Следующий способ ίη νίνο заключается в оценке способности кандидата-пептида оказывать лечебное действие на мышей, у которых спонтанно развивается 8ЬЕ, например мышей (Ы2ВхЫ2А)Е1, как описано в примерах.
Таким образом, можно видеть, что, кроме предпочтительных аспектов, которые показаны как действующие в примерах настоящей заявки, каждый специалист в данной области сможет определить дополнительные аналоги, которые также будут работать, следуя общим указаниям настоящего описания без чрезмерного экспериментирования.
В другом предпочтительном аспекте в данном изобретении представляют мультиэпитопный отдельный пептид, такой как двойной пептид. В одном аспекте двойной пептид состоит из двух различных пептидов, базирующихся на СЭЯ, таких как два разных пептида, включающих последовательность СЭЯ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8) или СЭЯ3 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10) тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ι6.
В другом и более предпочтительном аспекте двойной пептид состоит из двух различных пептидов, каждый из которых базируется на СЭЯ, таких как один пептид, включающий последовательность СЭЯ1 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8), а другой, включающий последовательность СЭЯ3 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10) тяжелой цепи человеческого тАЬ 16/6-Ι6.
Двойной пептид согласно настоящему изобретению предпочтительно состоит из двух различных пептидов, причем один является пептидом с 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11, а другой является пептидом с 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 19, более предпочтительно один пептид выбран из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6 и ΝΟ: 12-18, а второй пептид выбран из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7 и ΝΟ: 20-27, наиболее предпочтительно одним пептид является пептид с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6, а другой пептид является пептидом с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7, при этом два разных пептида являются ковалентно связанными друг с другом или непосредственно, или короткой связующей цепью, такой как участок из остатков аланина, или посредством предполагаемого сайта для протеолитического расщепления катепсином. См. относительно таких сайтов, например, патент США 5126249 и европейский патент 495049.
В другом предпочтительном аспекте в данном изобретении предусматривают мультиэпитопный одиночный пептид, содержащий ряд одинаковых или разных пептидов данного изобретения в виде пептидного полимера, полученного, например, полимеризацией пептидов с помощью соответствующего полимеризирующего агента, такого как 0,1% глутаральдегид (Аи61Ьет1 е! а1., 1981, Ыа!ите 289: 593). Предпочтительно полимер может содержать от 5 до 20 пептидных остатков, предпочтительно пептид с 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6, 7 и 11-27. Такие пептидные полимеры также могут быть образованы поперечным сшиванием
- 9 009465 пептидов или присоединением многочисленных пептидов к макромолекулярным носителям. Подходящими макромолекулярными носителями являются, например, белки, такие как столбнячный анатоксин, и линейные или разветвленные сополимеры аминокислот, такие как линейный сополимер Ь-аланина, Ьглутаминовой кислоты и Ь-лизина, и сополимер с разветвленной цепью Ь-тирозина, Ь-глутаминовой кислоты, Ь-аланина и Ь-лизина (Т,С)-А-Ь-, или многоцепочечный поли-ЭЬ-аланин (М. 8е1а с1 а1., 1955, 1. Ат. Сйет. 8ос. 77: 6175). Конъюгаты получают, например, сначала взаимодействием пептида с водорастворимым карбодиимидом, таким как 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид, а затем проведением сопряжения с макромолекулярным носителем, как описано Ми11ег, С.М. е1 а1. (1982), Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 79: 569. Содержание связанного пептида в каждом конъюгате определяют с помощью аминокислотного анализа по сравнению с составом одного носителя.
Согласно следующему аспекту данного изобретения один или более активных пептидов могут быть присоединены к подходящему макромолекулярному носителю или могут быть полимеризованы в присутствии глутаральдегида.
Пептиды, их полимеры или их конъюгаты с подходящими макромолекулярными носителями вводят пациентам в форме, которая обеспечивает их биодоступность, что делает их пригодными для лечения. Установлено, что, если более одного пептида настоящего изобретения проявляют значительную ингибиторную активность, эти пептиды можно давать пациентам в композиции, содержащей их смесь.
Таким образом, настоящее изобретение еще относится к фармацевтическим композициям, содержащим по крайней мере один синтетический пептид или пептидный полимер согласно настоящему изобретению необязательно с фармацевтически приемлемым носителем.
В одном предпочтительном аспекте фармацевтические композиции содержат по крайней мере один синтетический пептид настоящего изобретения, более предпочтительно пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов 11СГОК1 [8ЕЦ ГО N0: 6] и 11СГОР3 [8ЕЦ ГО N0: 7] и пептидов, полученных замещением и/или присоединением аминокислотных остатков к последовательностям 11СГОР1 и 11СГОР3. в частности пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов с 8ЕЦ ГО N0: 12 - 8ЕЦ ГО N0: 18 и 8ЕС) ГО N0: 20 - 8ЕС) ГО N0: 27.
Любой подходящий способ введения используют в настоящем изобретении, включая пероральный, внутривенный, подкожный, внутрисуставной, внутримышечный, ингаляционный, интраназальный, подоболочечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, чрескожный или другие известные способы, включая энтеральный способ. В предпочтительных аспектах пептиды изобретения вводят пероральным, интраназальным или подкожным способами.
Диапазоны доз для введения композиций данного изобретения должны быть достаточно большими, чтобы вызвать требуемый эффект, в результате которого, например, иммунный ответ на 8ЬЕ-индуцирующие аутоантитела, который определяют по Т-клеточной пролиферации ίη νίίτο, по существу, предотвращается или ингибируется и, кроме того, при этом в значительной степени лечат заболевание. Дозы не должны быть такими большими, чтобы вызвать вредные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, генерализованная иммуносупрессия, анафилактические реакции и тому подобное.
Эффективные дозы пептидов данного изобретения для применения при лечении 8ЬЕ находятся в области приблизительно от 1 мкг до 1 мг и вплоть до 100 мг/кг веса тела.
Синтетические человеческие пептиды настоящего изобретения предназначены для ингибирования или ослабления ответов на специфические антигены у больных 8ЬЕ, не затрагивая все другие иммунные реакции. Такой подход имеет наибольшее значение, так как большинство больных с установленным диагнозом являются молодыми женщинами, которых следует лечить в течение многих лет, а применяемая в настоящее время терапия 8ЬЕ включает введение иммуносупрессивных агентов, таких как кортикостероиды и/или цитотоксические лекарственные средства, которые как являются неспецифическими, так и проявляют многочисленные вредные побочные эффекты.
Далее изобретение также относится к способу лечения системной красной волчанки (8ЬЕ), предусматривающему введение больному 8ЬЕ эффективного количества пептида или пептидного полимера настоящего изобретения. В одном предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с 8Е0 ГО N0: 6. В другом предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с 8ЕЦ ГО N0: 7.
Кроме того, изобретение еще относится к способу иммуномодуляции ответных реакций, ассоциированных с 8ЬЕ, у больных 8ЬЕ, который предусматривает введение указанному больному 8ЬЕ эффективного количества пептида или пептидного полимера настоящего изобретения. В одном аспекте способ предусматривает супрессивную регуляцию уровней активности матриксной металлопротеиназы (ММР)3 и/или ММР-9 у больного 8ЬЕ. В другом аспекте способ предусматривает иммуномодулирование уровня активности цитокинов у больного 8ЬЕ, в частности снижение уровня активности 1Ь-2 и/или ГОИ-у и/или повышение уровня активности ТСЕ-β у больного 8ЬЕ. В одном предпочтительном аспекте способ предусматривает введение пептида с 8ЕЦ ГО N0: 6. В другом предпочтительном аспекте в способе предусматривают введение пептида с 8ЕЦ ГО N0: 7.
В изобретении также представлены способы оценки эффективности лекарственного средства при
- 10 009465 лечении больного ЗБЕ, которые включают определение в различные интервалы времени уровней ММР3, ММР-9, 1Б-2. ΙΡΝ-γ и/или ΤΟΡ-β в образце крови, полученном от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, причем сниженный уровень ММР-3, ММР-9, 1Б-2 и/или ΙΡΝ-γ или повышенный уровень ΤΟΡ-β коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
Кроме того, изобретение относится к применению пептида или пептидного полимера настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции, в частности, для лечения ЗБЕ, точнее для иммуномодулирования ответных реакций, ассоциированных с ЗБЕ, у больного ЗБЕ, такого как ингибирование ММР-3, и/или ММР-9, и/или 1Б-2, и/или ΙΡΝ-γ, или повышения уровня ΤΟΡ-β у больного ЗБЕ.
Далее данное изобретение будет описано более подробно в следующих неограничивающих описание примерах и сопровождающих фигурах.
Примеры
Материалы и методы
Мыши.
Самок мышей (ΝΖΒχΝΖ^)ΡΙ получали из лаборатории Джексона (баекзоп) (Ваг НагЬог, МЕ). Самок мышей ВАБВ/с инбредной линии в возрасте 6-8 недель получали из Отдела экспериментальных животных \Ус1/тапп ЬпзШЩе о£ Зеленее, Кейоуор 1згае1.
Анти-ДНК моноклональное антитело.
Человеческое анти-ДНК-тАЬ, которое имеет 16/6-Ι6 (1дО 1/к), ранее было охарактеризовано (З1лоеп1с1б е1 а1., 1982; Малзтап е1 а1., 1995). МАЬ секретировались клетками гибридомы, которые выращивали в культуре и очищали, используя колонку с протеин-О-сефарозой (РЬагтаела, Еше СЬетлеа1з, иррза1а, Зеебеп).
Синтетические пептиды.
Синтетические мышиные пептиды тСОК1 (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1) и тСБК (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 3), а также используемые в качестве контроля обратные пептиды, которые синтезировали в обратном порядке последовательностей тСЭК1 и тСЭК3 и в обратном порядке последовательности человеческого пептида ЬСОК1, идентифицированные в описании как геутСОК1 [ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 28], геутСЭК3 [ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 29] и геуЬСОК1 [ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 30], соответственно, получали по описанному ранее способу (ΑΌ 96/30057) или с применением автоматического синтезатора (модель 430А Аррйеб Вюзуз1етз, Оегтапу), используя протоколы компании для трет-бутилоксикарбонильного (ΐ-Вое) способа.
Обратные пептиды имели последовательности:
| ИЕЬЗКЕРЗОКУИОМУУОТ | геутС0К1 | [ЗЕО | 10 | N0:28] |
| ОСИУОМАУРЕЙЬЕКАСУУ | геулпСОВЗ | [ЗЕО | Ю | N0:29] |
| ИЕЕЕКСРР0К1ИЗИУУЕ | ΓβνΗΟβΚΙ | [ЗЕО | ю | N0:30] |
Индукция и лечение экспериментальной ЗБЕ.
Для того, чтобы индуцировать экспериментальную ЗБЕ, мышей ВАБВ/е иммунизовали 1-2 мкг человеческого тАЬ 16/6-Ι6 и повторно иммунизовали через 3 недели. Для предупреждения экспериментальной ЗБЕ мышам внутривенно (в.в.) или подкожно (п.к.) вводили ЬСЭЕ1 или ЬСЭЕ3 (тСЭК1 или геутСЭК1 в качестве контрольного пептида в примере 12), одновременно с иммунизацией, а в дальнейшем вводили еженедельно в течение 5 недель. Лечение установленного заболевания начинали через 3,5 месяца после индукции заболевания посредством 16/6-Ι6, когда уже наблюдали клинические проявления. В примере 12 мыши получали 10 еженедельных инъекций (в.в. или п.к.) тСЭК1 или геутСЭК1 в дозе 100 мкг/мышь.
Предупреждение и лечение ЗБЕ-подобного заболевания у мышей (^ВхХХ\У)Е1 пептидом ЬСЭЕ1 или тСОК1.
Для предупреждения ЗБЕ, прежде чем наблюдали проявления заболевания, мышам в возрасте 2 месяцев подкожно инъецировали 1лС’0Е1 (или тСЭК1 в примере 12, 250 мкг/мышь) 1 раз в неделю в течение 10 недель. Для лечения установленного заболевания мышам в возрасте 5-7 месяцев инъецировали ЬСОК1 (в примере 12 тСОК1 подкожно, 250 мкг/мышь) 1 раз в неделю в течение 10 недель.
Пролиферативные ответные реакции.
РВБ получали из гепаринизированной венозной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-хайпакве (РЬагтаела). Все анализы в трех повторах проводили в плоскодонных титрационных микропланшетах ^акоп, Вее1он Олеклпзоп, Οxта^б, СА, иЗА), в которых 2х105 РВБ культивировали в обогащенной среде ΕΕΜΙ-1640, как описано (Эауап е1 а1., 2000). РВБ подвергали действию различных концентраций (0,1-40 мкг/лунку) человеческого анти-ДНК-тАЬ 16/6-Ι6 с и без добавления различных пептидов, базирующихся на СОК, в концентрации по крайней мере 10-кратного избытка по сравнению с концентрацией 16/6-Ι6. В каждом эксперименте использовали фитогемагглютинин (РНА; 2 мкг/лунку) в качестве контроля для культуральных условий в каждом эксперименте. Культуры инкубировали в 7,5% СΟ2 при 37°С в течение 6 дней. За 18 ч до сбора клеток во все культуры добавляли [3Н]тимидин (0,5 мкКи 5 Ки/ммоль) (Бие1еаг КезеагеЬ Сеп1ег, Бедеу, Бгаер. Результаты выражали как среднее включение тимидина в количестве импульсов в минуту (СРМ) от трех культур +ЗЭ (стандартное отклонение) или как индекс стимуляции (8.Ι.; отношение среднего СРМ при оптимальной концентрации
- 11 009465 человеческого 16/6-И к среднему СРМ в присутствии одной среды). 8.1.>2 рассматривали как позитивный ответ (Оауаи с! а1., 2000). Ингибирование (отношение среднего СРМ в присутствии 16/6-И и различных пептидов, базирующихся на СИВ, к среднему СРМ в присутствии 16/6-И и в отсутствие пептида, базирующегося на СИВ) свыше 50% считали положительнымм.
Индукция продукции цитокинов.
Мышей, которых иммунизовали человеческим тЛЬ 16/6-И и или лечили, или не лечили пептидом, базирующимся на СИВ, умерщвляли в различные периоды времени во время или после лечения пептидом. Спленоциты и клетки лимфотических узлов (ЬЫС) собирали и инкубировали (5х106/мл) в присутствии 16/6-И. Супернатанты собирали через 48 и 72 ч.
Оценка цитокинов в супернатантах.
Супернатанты собирали через 48 ч после начала культивирования и хранили при -70°С. Определения 1Ь-2, 1Ь-10, ΙΕΝ-γ и ΤΝΕ-α проводили методом ЕЫ8А, используя подходящие стандарты, ловушку и детектирующие АЬ (Рйаттшдеп) в соответствии с инструкциями производителя. ТСЕ-β определяли методом ЕЫ8А. Вкратце, планшеты покрывали рекомбинатной человеческой ТСЕ-в1-§В11/Ес-химерой (В & Ό 8уйет5 1пс., МшиеароШ, ΜΝ, И8А), а вторым использованным антителом было биотинилированное антитело к ТСЕ-β 1 человека (В & Ό 8у51ет5 1пс.). ТМВ цветной реагент (Не11х О|адпо511С5. \Уе51 8асгатеШо. СА) использовали в качестве раствора субстрата и энзиматическую активность определяли, используя фильтры 570 и 630 нм.
Определение клинических и патологических проявлений, ассоциированных с 8ЬЕ.
Протеинурию определяли полуколичественным методом, используя набор СошЬкйх (Атек Όίνίδίοη, Вауег О1адпо8Йс8, №^Ьшу, и.К.). Лейкоциты (^ВС, относительно лейкопении) считали после 10-кратного разведения гепаринизированной крови дистиллированной водой, содержащей 1% уксусную кислоту (об./об.). Для иммуногистологического анализа замороженные почечные срезы (6 мкм) фиксировали и окрашивали с помощью Е1ТС-конъюгированных АЬ козы к мышиному 1дС (специфические к γ-цепи; 81дта).
ЕБ18А.
Для определения анти-ДНК-АЬ 96-луночные титрационные микропланшеты МахкотЬ (Мшс) покрывали или метилированным В8А, или поли-Ь-лизином (81дта). Затем планшеты промывали и покрывали, или 10 мкг/мл денатурированной ДНК тимуса теленка (81дта), или двухцепочечной ДНК λ-фага (Воейппдет Маппйе1п, 5 мкг/мл). После инкубации с различными разведениями сывороток в планшеты добавляли антимышиные 1дС козы (специфические к γ-цепи), конъюгированные с пероксидазой хрена (Исккоп 1ттипоВе8еатсй), с последующим добавлением субстрата, 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6сульфоновой кислоты) (81дта). Результаты считывали, используя ЕЬ18А-ридер.
Определение активности ММР-2 и ММР-9.
Активность ММР тестировали методом зимографии с желатином. Объединенные сыворотки индивидуальных мышей из различных экспериментальных групп разделяли методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (8% 808-РАСЕ) с полимеризованным желатином, 1 мг/мл. После электрофореза гели промывали 1 раз в течение 30 мин 2,5% Тритоном Х-100, чтобы удалить 8Ώ8, и 1 раз в течение 30 мин реакционным буфером, содержащим 50 мМ Трис-НС1, 200 мМ №С1, 10 мМ СаС12 и 0,02% (мас./об.) Вп] 35 (рН 7,5). Использованный реакционный буфер заменяли на свежий и гели инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Желатинолитическую активность выявляли окрашиванием гелей 0,5% кумасси бриллиантовым голубым.
Анализ ММР-3 в сыворотке методом Вестерн-блоттинга.
Образцы по 5 мкл каждой сыворотки наносили на 12% 8О8/ПААГ, разделяли при восстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозу. Блоты зондировали (0,5 мкг/мл, 1 ч, при комнатной температуре) анти-ММР-3-антителами (Опсодепе Векеатсй Ртобиск, МА, И8А) и проявляли, используя хемилюминесценцию.
Иммуноокрашивание почечных срезов на ММР-3 или ММР-9.
Для иммуноокрашивания ММР-3 или ММР-9 срезы почек (5 мкм) фиксировали холодным ацетоном (5 мин при комнатной температуре), дважды промывали в РВ8, пропитывали (1 мин при комнатной температуре) 0,05% Тритоном Х-100 (разведенным РВ8) и дважды промывали в РВ8. Для того, чтобы получить специфическое анти-ММР-окрашивание и избежать окрашивания отложений иммунных комплексов Е1ТС-меченными антимышиными 1дС козы, срезы почек блокировали (1 ч при комнатной температуре) немечеными антимышиными 1дС+1дМ козы (разведенными 1:1 1% В8А/РВ8; Исккоп 1ттипоВе8еатсй ЬаЬогаФпек) и 3 раза промывали РВ8, содержащим 0,05% Твин. Моноклональные анти-ММР-9 (1:100; Сйепнсоп 1п1етпабопа1, 1пс.) или анти-ММР-3 (1:50; Опсодепе Векеатсй Ргобнс15) антитела, разведенные в 1% В8А/РВ8, добавляли и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Для всех процедур иммуноокрашивания использовали Е1ТС-меченные антимышиные 1дС+1дМ козы Даскюп 1ттипоВе8еагсй ЬаЬогаФпек), разведенные 1:30 в 1% В8А/РВ8 (30 мин при комнатной температуре).
Статистический анализ.
Результаты представлены как среднее +8Э (стандартное отклонение). Для статистического анализа использовали Хи-квадрат, критерии Вилкоксона (^йсохоп), Манна-Уитни (Мапп-^ййпеу) и ΐ-критерии.
- 12 009465
Р<0,05 рассматривали как значимый.
Пример 1. Синтез человеческих пептидов ЬСОК1 и ЬСОКЗ.
Пептиды человека ЬСОК1 (8ЕР ГО N0: 1) и ЬСОКЗ (8ЕР ГО N0: 3) получали по способам, хорошо известным в данной области, например посредством химического твердофазного синтеза или синтеза в сольвентной фазе, применяя автоматический синтезатор и используя протоколы производителя для методик для трет-бутилоксикарбонильной (ΐ-Бос), фторенилметоксикарбонильной (Ешос) или других альфааминокислотных защитных групп, по существу, как описано (см., например, РерЬйез: 8упФез13, 81гис1иге апб .ЛррПсаИопз, ей. Ьу В. Сине, Лсайеш1с Ргезз, 1995; Рерцйе 8уп1Ье+1к РгоЮсоЬ, ей. Ьу М. РепшпШоп апй В. Эипп, Нитапа Ргезз, 1994; 8сЬпокег М. еΐ а1., 1п зйи пеиНаП/аИоп т Вос-сЬеш1зйу зойй рЬазе рерийе зупФез1з. Кар1й, ЬщЬ у1е1й аззетЫу о£ й1£йсий зециепсез. 1пЬ Е РерЬ Ргогёт Кез. 40: 180-193, 1992).
Пример 2. 1п у1уо ингибирование пролиферации клеток лимфатических узлов (ΕΝΟ) мышей, иммунизованных шС0К1 и шСОКЗ и подвергнутых лечению ЬСОК1 и ЬСОКЗ.
Для определения ингибиторной эффективности человеческих пептидов ЬСОК1 и ЬСОКЗ сначала тестировали их способность ингибировать ш у1уо сенсибилизацию мышей к мышиным пептидам шС0К1 и шСОКЗ.
Для этой цели мышей ВЛБВ/с и 8ЙЬ иммунизовали шС0К1 и шСОКЗ, соответственно. Иммунизующие мышиные пептиды (10 мкг/мышь) в СЕЛ инъецировали внутрикожно в подошву ступней задних конечностей. Совместно с иммунизацией группам мышей ВЛЬВ/с вводили подкожно (п.к.) 200 мкг ЬСОК1 в РВ8, а группам мышей 8ЙЬ аналогично вводили ЬСОКЗ. Через 10 дней после иммунизации мышей умерщвляли и извлекали их лимфатические узлы, а клетки исследовали в отношении их способности пролиферировать после стимулирования иммунизующими пептидами. Кратко, Ь-ХС иммунизованных мышей (0,5х10б/лунку) культивировали (в трех повторах) в присутствии различных концентраций (120 мкг/лунку) мышиных иммунизующих пептидов в обогащенной среде КРМ1-1640, дополненной 1% нормальной мышиной сывороткой. После 4 дней инкубации добавляли 3Н-тимидин и инкубировали в течение дополнительных 1б ч. Затем клетки собирали и считали радиоактивность, используя β-счетчик.
Результаты в табл. 1Л и 1В представляют максимальный % ингибирования пролиферации Ь-Ν С мышей, иммунизованных шС0К1 и шСОКЗ и подвергнутых лечению ЬСОК1 и ЬСОКЗ, соответственно. Ингибирование рассчитывали, базируясь на пролиферации Ь-ХС мышей, которых не лечили ингибиторными пептидами ЬСОК1 и ЬСОКЗ. Можно видеть, что ЬСОК1 и ЬСОКЗ оказались способыми ингибировать пролиферативные ответные реакции на иммунизующие мышиные пептиды СОК.
Таблица 1А
Ингибирование посредством ЬСОК1 шСОК1-индуцированной пролиферации ΕΝΟ полученных от мышей ВАЬВ/с
| Ингибитор | % Ингибирования |
| ЬСОК! | 55% |
Таблица 1 В
Ингибирование посредством ЬСОКЗ шСОКЗ-индуцированной пролиферации ΕΝΟ полученных от мышей 8ЙЬ
| Ингибитор | % Ингибирования |
| ЬСОКЗ | 55% |
Пример З. 1п у1уо ингибирование пролиферации Ь-ХС мышей, иммунизованных человеческим антиДНК-шЛЬ 16/6-1Й и подвергнутых лечению ЬСОК1 и ЬСОКЗ.
Так как целью работы было исследование ингибиторной способности пептидов, базирующихся на последовательности СОК человеческого аутоантитела с 16/6-1 й, оказалось важным выяснить, способны ли пептиды ЬСОК1 и ЬСОКЗ ингибировать сенсибилизацию к целой молекуле человеческого шЛЬ 16/61й. С этой целью мышей ВЛБВ/с и 8ЙЬ примировали человеческим шЛЬ 16/6-1Й (2 мкг/мышь) в СЕЛ внутрикожно в подошвы ступней задних конечностей. Примирование производили одновременно с подкожным введением 200 мкг/мышь ЬСОК1 в РВ8 группам мышей ВЛЬВ/с и ЬСОКЗ-мышам 81Б. Через 10 дней после иммунизации мышей умерщвляли и ш уйго исследовали способность их Ь-ХС пролиферировать на различные концентрации (0,1-10 мкг/лунку) человеческого анти-ДНК-шЛЬ 16/6-1Й.
Характерные результаты описанных экспериментов представлены в табл. 2А и 2В. Результаты представляли как максимальный % ингибирования пролиферации на иммунизующие человеческие шЛЬ 16/6-1Й клеток лимфатических узлов мышей, иммунизованных и подвергнутых леченнию пептидами ЬСОК1 и ЬСОКЗ, по сравнению с мышами, которых иммунизовали 16/6-1й-шЛЬ, но не лечили пептидами. Как можно видеть, оба пептида ЬСОК1 и ЬСОКЗ оказались способными эффективно ингибировать сенсибилизацию к человеческому шЛЬ 16/6-1Й.
- 1З 009465
Таблица 2 А
Ингибирование посредством ЬСОК.1 индуцированной человеческим тАЬ 16/6-Ιά пролиферации ЬАС, полученных от мышей ВАЬБ/с
| Ингибитор | % Ингибирования |
| ЕСбЕ! | 88% |
Таблица 2В
Ингибирование посредством ЬСОК.3 индуцированной человеческим тАЬ 16/6-Ιά пролиферации ЬАС, полученных от мышей 8!Ь.
| Ингибитор | % Ингибирования |
| ЬСбКЗ | 68% |
Дальнейшие эксперименты продемонстрировали, что назальное введение 10 или даже 2 мкг/мышь пептида ЬСОК.1 или ЬСЭК3 одновременно с иммунизацией человеческим тАЬ 16/6-Ιά ингибировало вплоть до 100% пролиферативных ответных реакций клеток лимфатических узлов на иммунизующее антитело.
В другом эксперименте мышей ВАЬВ/с иммунизовали 1 мкг человеческого 16/6-Ιά в СТА внутрикожно в подошвы ступней задних конечностей и или вводили подкожно 300 мкг/мышь ЬСОК.1 в РВ8, или в дальнейшем не лечили. Через 10 дней мышей умерщвляли, а их ЬАС исследовали в отношении их способности пролиферировать в ответ на человеческие 16/6-Ιά ίη νότο. Так, подколенные ЬАС (0,5х106) инкубировали в присутствии различных концентраций (0,1-10 мкг/лунку) человеческих анти-ДНК-тАЬ 16/6-Ιά. В конце 4 дня инкубации в культуры добавляли 3Н-тимидин и инкубировали в течение последних 18 ч инкубации. Затем клетки собирали и считали радиоактивность.
На фиг. 1 представлены результаты описанных экспериментов и показано, что ЬСЭК1 эффективно ингибировал пролиферативные ответные реакции клеток лимфатических узлов подвергнутых лечению мышей. % ингибирования пролиферации на различные концентрации 16/6-М-тАЬ оказался следующим: 0,1 мкг/лунку - 47%; 1 мкг/лунку - 66%; 5 мкг/лунку - 76% и 10 мкг/лунку - 62%.
Такой же эксперимент, как вышеописанный, повторяли с 50 мкг ЬСОК_1/мышь в РВ8. На фиг. 2 показано, что ЬСОК. 1 оказался очень эффективным при ингибировании ίη νίνο сенсибилизации мышей к целой анти-ДНК-16/6-М-макромолекуле и даже подкожное введение 50 мкг ЬСОК.1 значительно ингибировало способность клеток лимфатических узлов пролиферировать на 16/6-Ιά-аутоантитела. % ингибирования пролиферации на различные концентрации 16/6-М-тАЬ оказался следующим: 0,1 мкг/лунку 98%; 1 мкг/лунку - 76%; 5 мкг/лунку - 73% и 10 мкг/лунку - 64%.
Пример 4. Пептид ЬСЭК.1 иммуномодулирует продукцию цитокинов.
Клетки лимфатических узлов мышей ВАЬВ/с, подвергнутых лечению 50 мкг ЬСЭК1 примера 3, также стимулировали человеческим тАЬ 16/6-Ιά, чтобы вызвать продукцию цитокинов, и в супернатантах исследовали секрецию цитокинов (ΙΝΕ-γ, ТСТ-β и РЬ-10) методом ЕЫ8А.
На фиг. 3 представлены результаты характерного эксперимента. Можно видеть, что ЬСЭК1 ингибировал продукцию ΙΝΕ-γ (фиг. 3А) и активировал секрецию ТСЕ-β (фиг. 3В) и ЕЪ-10 (фиг. 3С). Следует отметить, что пептид, который использовали в качестве контроля (р259-271, который, как было показано, является миастеногенным пептидом), по существу, не оказывал влияния на продукцию ΙΝΕ-γ и ΙΠ-10 и был менее эффективным в активировании ТСТ-β.
Пример 5. Пептиды ЬСОК1 и ЬСЭК3 ингибируют пролиферативный ответ РВБ больных 8ЬЕ на человеческие тАЬ 16/6-Ιά.
пациента, 9 мужчин (14,5%) и 53 женщины (85,5%), с 8ЬЕ участвовали в данном эксперименте. Средний возраст при установлении диагноза составлял 32,95±12,92 года (диапазон 12-61), а средний период наблюдения составлял 10,98±10,76 лет (диапазон 1-32). Все пациенты соответствовали по крайней мере 4 установленным диагностическим критериям для 8Ь-Е Атепсап Со11еде КЬеита!о1оду (АСК) (Тап е! а1., 1982). Пациентов комплектовали из трех медицинских центров Израиля (Кар1ап, КеЬоуо!; Ε-Ηίίον, Те1 Λνίν; АзаР-НагоРеЬ, ΚίδΗοη Ρόζιοπ). Активность заболевания определяли в соответствии с индексом активности волчанки 8^Е^АI (ВотЬаМ1ег е! а1., 1992). Контрольную группу из 36 здоровых волонтеров, подобранных по полу и возрасту, исследовали одновременно с больными 8Ь-Е. Исследование одобрено Комитетом по этике Медицинского центра.
Оказалось интересным исследовать, способны ли пептиды ЬСЭК1 и ЬСЭК3, которые базируются на последовательности СЭК1 и СЭК3 человеческого тАЬ 16/6-Ιά, ингибировать специфические пролиферативные ответные реакции РВЬ больных 8ЬЕ на человеческий тАЬ 16/6-Ιά. Для этой цели сначала идентифицировали пациентов, РВЬ которых могут быть стимулированы к пролиферации посредством человеческого тАЬ 16/6-Ιά (респондеры).
- 14 009465
Поэтому РБЬ от 62 наблюдаемых больных 8БЕ культивировали в присутствии человеческого 16/61й и определяли их пролиферативные ответы и способность секретировать 1Б-2. РБЬ от 24 из протестированных 62 (39%) и 23 из протестированных 55 (42%) больных 8ГГ отвечали пролиферацией (8Ι>2, диапазон 2-5,6) и секрецией 1Б-2 (8Ι>2, диапазон 2-60), соответственно. Частота респондеров в группе больных 8ГГ оказалась ниже, чем частота респондеров, наблюдаемая в группе здоровых доноров, которых тестировали в качестве контрольных субъектов. Так, РБЬ от 21 из протестированных 36 (58%) здоровых доноров отвечали пролиферацией на 16/6-1Й. Степень пролиферации (уровни 8Ι) оказалась схожей для больных 8БЕ и для здоровых контролей, которые отвечали на 16/6-1Й. Однако, как показано на фиг. 4, оптимальную ответную реакцию РБЬ здоровых доноров на 16/6-1Й наблюдали при более высоких концентрациях 16/6-1Й по сравнению с РБЬ больных 8БЕ.
Никаких различий не удалось продемонстрировать в зависимости от пола и возраста между больными 8БЕ, которые отвечали на 16/6-1Й, и группой больных, которые не проявляли ответной реакции. Однако больные, РБЬ которых пролиферировали в ответ на 16/6-1Й, оказались пациентами, которые болели в течение более короткого периода времени (среднее значение 9,78+8,36 против 11,73+12,06 лет для респондеров и нереспондеров, соответственно, Р<0,036). В табл. 3 суммированы клинические характеристики групп больных 8ЬЕ-(16/6-1й-респондеров) и нереспондеров. Как можно видеть из таблицы, обе группы оказались похожими по многим клиническим проявлениям, связанным с 8БЕ. Показатель активности заболевания 8БЕ (8БЕПА1) и количество диагностических критериев 8БЕ также были подобными для двух групп. Тем не менее, более высокую частоту неврологических (как эпилептических припадков, так и психозов) и гематологических поражений и более низкую степень поражений почек отмечали у группы больных-респондеров по сравнению с группой нереспондеров. Однако, вероятно, из-за низкого количества больных в соответствующих подгруппах вышеупомянутые различия не достигали статистической значимости. Кроме того, относительно меньше пациентов-респондеров обнаружили среди пациентов, подвергнутых лечению стероидами или цитотоксическими агентами во время исследования. Заслуживает внимания то, что значительно больше пациентов, которые никогда не получали стероиды, отвечали на 16/6-1Й по сравнению с группой нереспондеров (54% против 21%; Р=0,023).
Заслуживает внимания то, что способность пептидов, базирующихся на СЭК, ингибировать пролиферативные ответные реакции РБЬ здоровых доноров на 16/6-1Й оказалась значительно ниже, чем способность, наблюдаемая для РБЬ больных 8БЕ (не показано).
Таблица 3
Клиническая и лабораторная характеристика больных 8БЕ
А. Диагностические критерии*.______________________________________________
| Все пациенты | Респондеры | Нереспондеры | |
| Количество пациентов (%) | 62 (100) | 24 (39) | 38 (61) |
| Сыпь на щеках | 19/62 (30,1) | 8/24 (33,3) | 11/38 (29) |
| Дисковидная сыпь | 9/62 (15) | 3/24 (12,5) | 6/38 (16) |
| Светочуветвитель ность | 21/62 (34) | 9/24 (37,5) | 12/38 (32) |
| Язвы слизистой оболочки | 17/62 (27,4) | 8/24 (33,3) | 9/38 (23,7) |
| Артрит | 46/62 (74,2) | 19/24 (79,2) | 27/38 (71) |
| Серозит | 14/62 (22,6) | 5/24 (20,8) | 9/38 (23,7) |
| Неврологические нарушения*** | 5/62 (8,1) | 4/24 (16,7) | 1/38 (2,7) |
| Почечные нарушения*** | 24/62 (38,8) | 7/24 (29,2) | 17/38 (44,8) |
| Гематологические нарушения*** | 44/62 (71) | 19/24 (79,2) | 25/38 (65,8) |
| ΑΝΑ | 61/62 (98,4) | 24/24 (100) | 37/38 (92,1) |
| а-дцДНК | 54/62 (87,1) | 19/24 (79,2) | 35/38 (92,1) |
| АРЬА | 35/62 (56,5) | 12/24 (50,0) | 23/38 (60,53) |
- 15 009465
В. Активность заболевания.
| Показатель ЗЬЕЭА! | 6,65±5,12 | 7,29±1,06 | 6,24±0,84 |
| Число диагностических критериев АСК | 5,44±1,39 | 5,54±0,33 | 5,34±0,2 |
С. Общепринятая терапия*
| ЦЗАЮЗ | 17/62 (27,4) | 6/24 (25) | 11/38 (29) |
| Противомалярийная | 37/62 (59,7) | 15/24 (62,5) | 22/38 (57,9) |
| Стероиды*** | 33/62 (53,2) | 11/24 (45,8) | 22/38 (57,9) |
| Цитотоксическая*** | 10/62 (16,1) | 2/24 (8,3) | 8/38 (21) |
*Клиническое поражение определяли согласно установленным критериям АСК. Антинуклеарные антитела (АХА) и анти-дцДНК-антитела определяли посредством клеток Нер2 и Сп1Ы61а 1исШае, соответственно. Антифосфолипидные антитела (АРЕ А) выявляли как реактивность в одном или более из следующих исследований: ошибочно положительного УОКЬ, волчаночного антикоагулянта (ЬАС) или ЕЬ18А для антикардиолипиновых антител.
** Противомалярийный агент, гидроксихлорохин, использовали в дозе 200-400 мг/день; стероидную терапию определяли как ежедневную дозу >5 мг преднизона; используемыми цитотоксическими агентами были циклофосфамид (0,75-1,0 г/м2, ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/день).
*** Параметры, для которых наблюдали тенденцию к различиям между двумя группами больных 8ЕЕ-респондеров и нереспондеров.
Для исследования способности пептидов ЬСЭК1 и ЬСЭК3 ингибировать пролиферативный ответ РВЕ больных 8ЕЕ на человеческое тАЬ 16/6-16, РВЕ (2х105/лунку) больных 8ЕЕ стимулировали ίπ νίΐΐΌ с тремя повторами различными концентрациями (0,1-20 мкг/лунку) человеческого тАЬ 16/6-16 в отсутствие или в присутствии пептидов ЬСЭК1 и ЬСОКЭ (или 50 или 100 мкг/лунку). После 6 дней инкубации в каждую лунку добавляли 3Н-тимидин (0,5 мкКи 5 Ки/ммоль) и инкубировали дополнительные 18 ч. Затем клетки собирали и радиоактивность считали, используя β-счетчик. Результаты представляли как среднее количество импульсов в минуту (срт) из культур от трех экспериментов. Затем рассчитывали индекс стимулирования (отношение среднего срт при оптимальной концентрации 16/6-16 к среднему срт без 16/6-16). Индекс стимулирования (81)>2 считали позитивным.
Обнаружено, что РВЕ от 24 из всех 62 (39%) больных 8ЕЕ давали пролифериративный ответ на 16/6-16-тАЬ. Способность пептидов ЬСЭК1 и ЬСЭК3 ингибировать пролиферативные ответные реакции на целую молекулу 16/6-16-аутоантител тестировали на РВЕ от 19 респондеров-больных 8ЕЕ.
В табл. 4 представлены результаты описанных экспериментов. Ингибирование свыше 50% пролиферативной способности считали позитивным. В таблице представлена наивысшая позитивная ингибиторная способность для каждого пептида. Можно видеть, что человеческие ЬСЭК1 и ЬСЭК3 ингибировали пролиферацию РВЕ 16/19 (84,2%) и 15/19 (78,9%), соответственно, из 19 протестированных респондеров. Оба пептида ингибировали пролиферацию РВЕ 18/19 (95%) протестированных респондеров. Также из таблицы видно, что величины ингибирования были подобными для обоих пептидов. Таким образом, можно заключить, что пептиды, базирующиеся на последовательности СЭК1 и СЭК3 человеческого тАЬ 16/6-16, являются эффективными ингибиторами пролиферации РВЕ больных 8ЕЕ в ответ на человеческий тАЬ 16/6-16.
- 16 009465
Таблица 4
Ингибирование пролиферации РБЬ больных 8БЕ пептидами ЬСОК.1 и ИСЭКЗ
| Номер | Инициалы | Процент ингибирования | |
| ЪСЫН | НсЗгЗ | ||
| 1. | В.Ь. | 62 | <50 |
| 2. | Μ.ϋ. | 70 | 75 |
| 3. | т.ь. | 69 | <50 |
| 4. | Ζ.ϋ. | <50 | <50 |
| 5. | Ν.Ν. | 88,5 | 87,5 |
| б. | 8.3. | 80 | 80 |
| 7. | З.Н. | 76 | 70,4 |
| 8. | 3.ϋ. | 58 | 56 |
| 9. | Α.Ν. | 69,5 | 65 |
| 10. | ΐ. σ. | 68,2 | 71,8 |
| 11. | ь. σ. | <50 | 72 |
| 12. | У.Ь. | 82 | 86 |
| 13. | м.з. | 63 | 64 |
| 14. | ϋ.5. | 56 | 74 |
| 15. | Ζ.Α. | 63 | 69 |
| 16. | в.м. | <50 | 68 |
| 17. | 5.Ν. | 70,5 | 77,8 |
| 18. | С.М. | 51,5 | <50 |
| 19. | ν. σ. | 63 | 60,8 |
| Среднее ± | 68,12±9,57 | 71,82±8,44 |
Пример 6. Специфичность ингибиторной способности ЬСОК.1 и ИСЭКЗ.
Оказалось важным продемонстрировать, что ингибиторное действие пептидов, базирующихся на НСОК., является специфичным относительно ответных реакций, ассоциированных с 8ЬЕ. Для этой цели пептиды ЬСОК.1 или ИСЭКЗ добавляли к культурам РБЬ больных 8БЕ, которых стимулировали митогенным фитогемагглютинином (РНА, 2 мкг/мл). Результаты такого эксперимента, проведенного с РБЬ одного больного 8БЕ, представлены на фиг. 5. Пептиды ЬСОК.1 и ЬСОК.3 не могли ингибировать пролиферативные ответы (выраженные в срт) РБЬ на митогенный РНА, а пролиферативные ответные реакции были одинаково высокими в отсутствие (черные столбцы) или в присутствии или ЬСОК.1, или ЬСОК.3.
В другом эксперименте культуры РБЬ больных 8БЕ стимулировали человеческим тАЬ 16/6-16, а затем инкубировали с человеческими пептидами ЬСОК.1 или НСЭБЗ или с мышиным пептидом тСЭБЗ в качестве контроля. Результаты такого эксперимента, проведенного с РБЬ одного больного 8БЕ, представлены на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, в то время, как оба пептида ЬСОК.1 и НСЭКЗ, базирующихся на последовательности человеческого аутоантитела, эффективно ингибировали пролиферативные ответы РБЬ на человеческое тАЬ 16/6-16, пептид тСОК.1, базирующийся на СЭВЗ мышиного антитела, не ингибировал пролиферацию.
В описываемых экспериментах использовали два дополнительных контрольных пептида, а именно пептиды, синтезированные в обратном порядке последовательности мышиных пептидов тСОК.1 и тСЭКЗ (ге\'тСОК4 и ге\'тСОКЗ), и результаты представлены на фиг. 7. Можно видеть, что два обратных пептида не могли значительно ингибировать пролиферативные ответные реакции РБЬ больного 8БЕ на человеческое тАЬ 16/6-16, в то время, как пептиды ЬСОК.1 и НСЭБЗ эффективно ингибировали пролиферацию, демонстрируя, что ингибирование пролиферации человеческими пептидами, базирующимися на ЬСОК., является специфическим к пептидам и к 8БЕ-ассоциированным ответным реакциям Т-клеток.
Пример 7. Супрессивная регуляция секреции 1И-2 РБЬ больных 8БЕ в присутствии пептидов 11С1Ж1 и 11С1Ж3.
Оказалось интересным установить, способны ли пептиды ЬСОК. ингибировать секрецию 1И-2 РБЬ больных 8БЕ после стимулирования человеческим тАЬ 16/6-16. Такое ингибирование также может означать, что человеческие пептиды, базирующиеся на СЭВ, ингибируют пролиферативные ответные реак
- 17 009465 ции на 16/6-Iά-тАЬ, по крайней мере, частично в результате супрессивной регуляции секреции ΙΕ-2. Для этой цели РВЬ больных 8ЬЕ инкубировали с человеческими тАЬ 16/6-Ιά в отсутствие или в присутствии ЬСЭВ1 или ЬСЭВ3. Супернатанты культур собирали после 48 ч инкубации. Проводили исследования, чтобы установить уровни ΙΕ-2 в супернатантах, используя ΙΕ-2-зависимую линию СТЬЬ. Кратко, клетки линии СТЬЬ (2х104/лунку) инкубировали в присутствии различных супернатантов в течение 24 ч с последующим добавлением 3Н-тимидина и инкубировали в течение дополнительных 18 ч. Затем клетки собирали и радиоактивность считали, используя β-счетчик. Результаты вычисляли на основании рекомбинантного ГЬ-2 человека, использованного в качестве стандарта. Исследовали способность пептидов ингибировать секрецию ГЬ-2 РВЬ от 23 респондеров, стимулированных человеческим 16/6-Ιά. Суммированные в табл. 5 результаты показывают, что ЬСЭВ1 и ЬСЭВ3 ингибировали секрецию ГЬ-2 РВЬ пациентов 21/23 и 19/23, соответственно. Ингибирование пролиферативных ответных реакций РВЬ прямо коррелировало с ингибированием ГЬ-2 пептидами, базирующимися на СЭВ. Таким образом, ингибирование секреции ГЬ-2 наблюдали во всех случаях, где определяли ингибирование пролиферации.
Результаты, полученные с РВЬ одного больного 8ЬЕ, представленные на фиг. 8 (секрецию ГЬ-2 выражали в пг/мл), показали, что как ЬСЭВ1, так и ЬСЭВ3 ингибировали на 100% секрецию ГЬ-2 РВЬ больного 8ЬЕ, стимулированного человеческим тАЬ 16/6-Ιά.
Таблица 5
Ингибирование секреции !Ь-2 посредством ЬСЭВ1 и ЬСЭВ3
| Пептид | Ингибиторная активность*, % | Максимальное ингибирование, % |
| ПСОК1 | 91 (21/23) | 84±31 |
| ЬСЭКЗ | 83 (19/23) | 78±34 |
* Секрецию ГЬ-2 в присутствии одного 16/6-Ιά рассматривали как 100%. Ингибирование на 50% или более рассматривали как значимое.
Пример 8. Активация секреции иммуносупрессивного цитокина ТСЕ-β пептидами, базирующимися на СЭВ.
В попытке пролить свет на механизмы, посредством которых пептиды, базирующиеся на последовательности СЭВ, ингибируют пролиферативные ответные реакции на человеческое моноклональное анти-ДНК-антитело 16/6-Ιά, определяли уровни иммуносупрессивного цитокина ТСЕ-β в супернатантах клеточных культур. Рациональное обоснование этих экспериментов базируется на предварительных данных о повышенных уровнях ТСЕ-β в культурах спленоцитов мышей с 8ЬЕ, или индуцированной человеческим анти-ДНК-тАЬ 16/6-Ιά, или спонтанной {мыши (NΖВхNΖУ)Е1}, после лечения пептидами, базирующимися на последовательности СОВ мыши (Е11а1 е! а1., 2000). Повышение уровней ТСЕ-β коррелировало со снижением интенсивности проявлений заболевания у подвергнутых лечению мышей.
Для этой цели супернатанты удаляли из культур РВЬ разных больных 8ЬЕ после 48 ч инкубации с человеческим тАЬ 16/6-Ιά в отсутствие или в присутствии пептидов ЬСЭВ1 или ЬСЭВ3. ТОЕ-β определяли методом ЕЫ8А согласно инструкциям производителя. Вкратце, планшеты Мах1зогЬ (^ипс) покрывали рекомбинантной человеческой ТСТ^ВЛ/Ес-химерой (В & Ώ 8уз1етз), разведеннсй РВ8 (100 нг/мл). После блокирования добавляли клеточный супернатант. После 18 ч инкубации добавляли детектирующие биотинилированные античеловеческие ТСЕ^-антитела (В & Ώ 8уз1етз). Используемый раствор субстрата представлял собой цветной реагент ТМВ (Нейх П1адпо811сз), а энзиматическую активность оценивали с помощью ридера МВХ ЕЫ8А, используя фильтры 570 и 630 нм. Результаты суммированы в табл. 6.
Результаты, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что пептиды ЬСЭВ1 и НС0В3 стимулировали значительное повышение уровня регуляции секреции ТСЕ-β (выраженную в пг/мл) РВЬ от одного репрезентативного больного 8ЬЕ, которые стимулировали патогенным человеческим тАЬ 16/6-Ιά.
Таблица 6
Повышение секреции ТСЕ-β РВЬ больных 8ЬЕ после 16/6-М-индуцированной стимуляции пептидами ЬСЭВ1 и ЬСЭВ3
| Пептид | Повышение ТСГ-β, % | Максимальное повышение, % | |
| ΓϋϋΒΙ | 100 | (19/19) | 305±221 |
| НСОВЗ | 100 | (19/19) | 338±242 |
- 18 009465
Секрецию Τ6Ρ-β в присутствии одного 16/6-Ι6 (среднее значение 636±25 пг/мл) рассматривали как 100%. Результаты выражали как процент секреции свыше секреции в присутствии одного 16/6-Ι6.
Пример 9. Иммуномодуляция симптомов 8ЬЕ у мышей посредством ИСОЯ'1: уменьшение интенсивности проявлений заболевания после лечения мышей (NΖВxNΖV)Е1 с помощью ИСОЯ'1.
Как было показано выше. пептиды. базирующиеся на последовательности СЭЯ человеческого антиДНК-тАЬ 16/6-Ι6. были способны ингибировать сенсибилизацию клеток лимфатических узлов к 16/6-Ι6тАЬ и пролиферативные ответные реакции РВЬ больных 8ЬЕ на 16/6Лб-тАЬ с одинаковой эффективностью. Таким образом. оказалось целесообразным установить. могут ли названные пептиды иммуномодулировать 8ТЕ-подобное заболевание на животных моделях.
Эксперименты. имеющие целью выяснение способности человеческих пептидов лечить установленное заболевание 8ЬЕ. проводили сначала с пептидом ИСЭЯ!. Для этой цели были предназначены несколько экспериментов. в которых предрасположенных к 8ЬЕ мышей (NΖВxNΖV)Е1 в возрасте 5.5 месяцев лечили пептидом ИСОЯ'1. когда уже наблюдали проявления 8ТЕ-подобного заболевания (антидцДНК. протеинурию и т.д.). Пептид ИСОЯ'1 вводили в РВ8 подкожно еженедельно в течение 10 недель. Исследовали эффективность различных доз (50. 100 и 200 мкг/мышь) пептида ЙСПЯ1. Контрольным группам вводили носитель - РВ8. Лечение приводило к умеренному снижению титров анти-дцДНК-аутоантител. Таким образом. при разведениях сывороток 1:1250 в конце лечения были определены значения Θ.ϋ. 0.586±0.1. 0.27±0.1. 0.37±0.1 и 0.29±0.1 для сывороток обработанных РВ8 мышей. мышей. подвергнутых лечению 50 мкг/мышь. 100 мкг/мышь и 200 мкг/мышь ИСОЯ'1. соответственно.
Проведен другой эксперимент. в котором мышей (NΖВxNΖV)Е1 в возрасте 7 месяцев лечили еженедельно в течение 10 недель 300 мкг ЙСПЯ1. который вводили подкожно в РВ8. Слабое снижение титров анти-ДНК-антител можно было наблюдать в сыворотках мышей. подвергнутых лечению ИС0Я1. Тем не менее. в табл. 7 показано. что лечение ИСОЯ'1 приводило к снижению протеинурии и к значительному уменьшению отложений иммунных комплексов ДСП) в почках подвергнутых лечению мышей. Результаты в таблице отражают интенсивность ΙΟΩ. где 0=отсутствию ΙΟΩ; 1=умеренному ΙΟΩ; 2=тяжелому ΙΟΩ и 3=тяжелому и очень интенсивному ΙΟΩ.
Таблица 7 Клинические проявления у мышей (NΖВxNΖV)Е1. подвергнутых лечению ИСЭЯ!. в возрасте 7 месяцев
| Лечение | Протеинурия, г/л ± ЗЕМ | Отложения иммучных комплексов ± ЗЕМ |
| Не подвергнутые лечению | 4,80±2,56 | 2,57±0,29 |
| ΗΟϋΚΙ 300 мкг/мышь | 1,08±0,38 | 1,44+0,41 р=0,035 |
р вычисляли по сравнению с не подвергнутой лечению группой мышей.
Затем проводили дополнительный эксперимент. используя 400 мкг/мышь ИСЭЯ!. чтобы установить. можно ли достигнуть более благоприятного действия в результате увеличения дозы пептида. Лечение 400 мкг/мышь ИСЭЯ! не оказывало большего воздействия на титры анти-ДНК-антител. и. как можно видеть из табл. 8. влияние на заболевание почек оказалось подобным влиянию. наблюдаемому после лечения дозой 300 мкг.
Таблица 8 Клинические проявления у мышей (NΖВxNΖV)Е1. подвергнутых лечению ИСЭЯ!. в возрасте 6 месяцев
| Лечение | Протеинурия, г/л ± ЗЕМ | Отложения иммунных комплексов ± ЗЕМ |
| Не подвергнутые лечению | 4,99±2,53 | 2±0,29 |
| НСОК1 400 мкг/мышь | 0,77±0,32 | 1,42±0,19 р=0,05 |
р вычисляли по сравнению с не подвергнутой лечению группой мышей.
Поэтому проводили дополнительный эксперимент. при котором мышей лечили 300 мкг ИСОЯ'1 в возрасте 7 месяцев и использовали контрольный пептид. а именно обратный ИСОЯ'1. Цель эксперимента заключалась в выяснении. модулирует ли лечение ИСЭЯ! продукцию цитокинов в дополнение к снижению интенсивности клинических проявлений. На фиг. 10 продемонстрировано умеренное снижение уровней анти-ДНК-аутоантител. В табл. 9 показан уровень протеинурии. определенный в различные периоды времени.
- 19 009465
Таблица 9
Клинические проявления у мышей (ΝΖβχΝΖΑ)Γ1, подвергнутых лечению ЬСЭЯ1, в возрасте 7 месяцев
| Лечение | Протеинурия г/л ± 5ЕМ | ||
| 5 | После лечения №: 7 | 9 | |
| Не | |||
| подвергнутые | 2,65±1,76 | 3,8 9±2,73 | 7,55±3,95 |
| лечению | |||
| ЕСОК1 300 мкг/мышь | 0,61±0,23 | 0,65±0,32 | 1,02±0,39 р=0,05 |
| ΓθνΕΟΟΚΙ 300 мкг/мышь | 6,94±2,53 | 6,76±2,91 | 5,99±3,08 |
Эффект лечения ЬСЭЯ1 можно видеть по всем параметрам. Поражение почек является одним из главных проявлений ЗЬЕ-подобного заболевания у мышей (ΝΖβχΝΖΑ)Γ1. Десятинедельное лечение пептидом ЬСЭЯ1 значительно уменьшало поражение почек. При лечении заболевания почек доза 50 мкг оказалась менее эффективной, чем дозы 100 и 200 мкг. Последние две дозы были одинаково эффективными.
Фиг. 11А-11Э являются фотографиями, изображающими репрезентативные срезы почек мышей, подвергнутых лечению дозой 100 мкг ЬСЭЯ1. Так, мышей в возрасте 9 месяцев умерщвляли, а их почки удаляли и немедленно замораживали в жидком азоте. Замороженные, сделанные на криостате срезы, 5 мкм, высушивали на воздухе и фиксировали в ацетоне. Для определения отложений Ι§ срезы инкубировали с НТС-конъгированными антимышиными Ι§Ο козы (специфичными к γ-цепи). На фиг. 11А и 11В представлены срезы почек мыши из группы, обработанной РВ8 (контроль), тогда как на фиг. 11С и 11Ό представлены срезы почек мыши, подвергнутых лечению 100 мкг ЬСЭЯ1. На фигурах можно видеть, что лечение снижало количество иммунных комплексов, а также их интенсивность (11 А, 11Сх100; 11В, 11Όχ400).
Подобные результаты получали, если группы мышей (ΝΖβχΝΖΑ)ΡΊ лечили ЬСЭЯ1 в возрасте 7 месяцев, когда уже наблюдали их вполне проявившееся заболевание. Мышей лечили в течение 10 недель или 100 мкг/мышь, или 300 мкг/мышь. Лечение обеими дозами приводило к умеренному снижению титров антиДНК-аутоантител, подобно вышеописанным результатам. Также определяли снижение протеинурии по сравнению с группой, подвергнутой воздействию РВ8. После лечения обеими дозами происходило снижение интенсивности заболевания почек; однако, более значительный эффект наблюдали в группе мышей, подвергнутых лечению дозой 300 мкг. На фиг. 12А-12Е изображены характерные срезы почек из каждой группы, где А, В представляют не подвергнутую лечению мышь; С, Ό представляют почки мыши, подвергнутой лечению ЬСЭЯ1, и Е, Е - срез почки мыши, подвергнутый воздействию обратного ЬСЭЯ1. А, С, Ех100 и В, Ό, Ех400.
На фиг. 13А-13С показан уровень цитокинов (ΙΝΕ-γ, ΙΕ-10 и ΤΟΕ-β), который определяли методом ЕБКА в супернатантах Εοη А-стимулированных культур спленоцитов мышей из 3 групп, взятых в конце лечения (10 недель подкожных инъекций). Можно видеть, что уровни ΙΝΕ-γ (фиг. 13 А) и ΙΕ-10 (фиг. 13В, в меньшей степени) снижались у подвергнутых лечению мышей. Повышенную секрецию ΤΟΕ-β можно было наблюдать в супернатантах не стимулированных клеток (фиг. 13 С, левый). Εοη А не стимулировал клетки к большей секреции ΤΟΕ-β (фиг. 13С, правый).
Суммированные выше результаты указывают, что продолжительное лечение НСОЯ1 снижает интенсивность проявлений заболевания и иммуномодулирует секрецию цитокинов.
Пример 10. Лечение мышей ВАБВ/е человеческим пептидом ЬСЭЯ1 после индукции экспериментальной 8БЕ.
Оказалось интересным выяснить, способен ли пептид ЬСЭЯ1 вылечивать экспериментальную 8БЕ, индуцированную у мышей человеческим анти-ДНК-тАЬ 16/6-Ι6. Поэтому мышей ВАБВ/е иммунизовали и проводили повторную иммунизацию патогенными 16/6-Й-аутоантителами. Через 3,5 месяца после повторной иммунизации, когда у мышей уже появлялись симптомы заболевания, мышей делили на 3 группы. Одну группу не лечили, вторую группу лечили 100 мкг/мышь ЬСЭЯ1 и третью группу лечили 300 мкг/мышь пептида НСОЯ1 в течение 10 недель. Следили за проявлениями заболевания у мышей.
В табл. 10 представлены результаты, полученные при тестировании индивидуальных мышей в конце лечения. Наблюдали снижение интенсивности для всех определенных клинических показателей в случае обеих доз, использованных для лечения [анти-дцДНК-аутоантитела, количество лейкоцитов (АВС) и белок мочи]. Анализ почек мышей, умерщвленных в конце эксперимента (7 месяцев после бустер-инъекций) продемонстрировал отложения иммунных комплексов в почках 9/10 мышей, которых иммунизировали
- 20 009465 посредством 16/6-И-шАЬ и не подвергали лечению. В противоположность этому, отложения иммунных комплексов обнаружили в почках только 3/10 и 2/9 мышей, которых иммунизировали посредством 16/61й-шАЬ и подвергали лечению 100 и 300 мкг/мышь НСОК1, соответственно. Таким образом, показано, что человеческий пептид НСОК1 способен излечивать вполне развившуюся экспериментальную 8БЕ.
Таблица 10
Эффект лечения пептидом ЬСЭК.!, 100 или 300 мкг, мышей ВАБВ/С, пораженных экспериментальной 8БЕ
| Контрольные здоровые мыши, Среднее 1 3ϋ | Введение 16/6-М, Среднее ±30 | Введение 16/6— М + 5СОВ1 100 мкг, Среднее 1 30 | Введение 16/6-Ιά + ЕСОВ1 300 мкг, Среднее 1 3ϋ | |
| Протеинурия г/л | 0,12+0,16 | 0,6510,36 | 0,310,02 | 0,3410,25 |
| ИВС/мм3 | 74401960 | 32601920 | 609012160* | 589012660* |
| Анти-,л,ι тДНК Ο.ϋ.(1:50) | 0,1+0,05 | 1,110,6 | 0,310,2* | 0,5510,3* |
*=значительно отличаются (р<0,05) от группы, которой вводили 16/6-И.
В другом эксперименте мышей ВАБВ/с иммунизировали и проводили бустер-иммунизацию человеческими 16/6-И для индукции экспериментальной 8БЕ. Через 2 месяца после бустер-иммунизации мышей разделяли на 2 группы (8 мышей на группу). Мышей лечили 200, 300 или 400 мкг/мышь в течение 10 недель. У мышей наблюдали за продукцией антител, лейкопенией, протеинурией, а после умерщвления мышей через 2 месяца после окончания лечения в их почках исследовали отложения иммунных комплексов. Результаты, суммированные в табл. 11, не показали никакого влияния лечения на 16/6-1й-специфический антительный ответ.
Таблица 11 Влияние лечения мышей ВАБВ/с, пораженных экспериментальной 8БЕ, 200, 300 или 400 мкг пептида НСОК1
| КУб-И Среднее! | 16/6-И+ НС1Ж1 200 мкг/мышь Среднее 18Ώ | 166-И+ К'ОБП 300 мкг/мышь Среднее+8Ώ | 166-И+ ЬСББП 400мкг/мышь Среднее ±8ϋ | Контроль Среднее ±80 | |
| Протеинурия, г/л | 0,510,34 | 0,1310,16 р=0,0131 | 0,1610,16 р=0,0209 | 0,1110,15 р=0,0070 | 0,0310,09 р=0,0002 |
| УВС/мЧ | 28711205 | 5625+1659 р=0,0047 | 4677+1508 р=0,0209 | 4012+1421 р=0,0760 | 72801352 р=0,0001 |
| Интенсивность ΚΌ в почках | 1,86+0,38 | 0,5710,97 р=0,0189 | 0,7510,71 р=0,0047 | 0,7110,76 р--О,ОО55 | 0 |
| Анти-дцДНК антитела в разведении 1:1250 | 1,1610,37 | 0,6910,39 р=0,0189 | 0,4510,24 р=0,0003 | 0,8+0,39 р=0,0603 | 0,02910,025 р=0,0001 |
| Анти-16/6-1 ¢1 антитела в разведении 1:1000 | 2,5510,09 | 2,710,12 | 2,810,11 | 2,7510,1 | 0 |
Однако лечение оказывало влияние на титры анти-ДНК-антител, лейкопению, уровни протеинурии
- 21 009465 и, что более важно, на отложения иммунных комплексов в почках. Контрольной группой в эксперименте были мыши ВАБВ/с того же самого возраста, что и мыши, которых не иммунизовали или не лечили вообще. Описанный эксперимент означает, что РСОК1 эффективен при лечении экспериментальной 8БЕ и что не наблюдается никаких преимуществ дозы 400 мкг.
Поэтому проводили дополнительный эксперимент, в котором мышей лечили 200 и 300 мкг/мышь. Использованным в данном эксперименте контрольным пептидом был обратный РСОК1. Цель этого эксперимента, кроме сравнения между 200 и 300 мкг дозами лечения, заключалась в изучении влияния лечения на продукцию цитокинов у подвергнутых лечению мышей. 60 мышей БАББ/с иммунизовали и реиммунизовали посредством 16/6-14. Через 3 месяца после реиммунизации мышей разделяли на группы (15 мышей на группу), которые или в дальнейшем не лечили, или еженедельно лечили 200 или 300 мкг РСОК1. Дополнительную группу лечили 300 мкг обратного РСОК1. Пятую группу (контроль) не иммунизовали и в дальнейшем не лечили. Наблюдали за продукцией антител и проявлениями заболевания у мышей. Как видно из табл. 12, уровни анти-16/6-14-антител (в разведении 1:10000) в сыворотках мышей не отличались между группами. Как можно видеть из таблицы, лечение как 200, так и 300 мкг снижало уровни анти-ДНК-антител (сыворотки разводили 1:1250). В табл. 12 также суммированы клинические параметры различных групп мышей. Можно видеть, что, хотя обе дозы оказались эффективными в отношении снижения лейкопении и протеинурии, эффект дозы 200 мкг в описанном эксперименте не достигал значимых величин (мышей умерщвляли через месяц после окончания лечения).
Таблица12
Влияние лечения мышей ВАЬВ/с, пораженных экспериментальной 8БЕ, 200 или 300 мкг РСОК1 или 300 мкг ге\±С’1)1\1
| 16/6-14 Среднее+8Э | 16/6-14+ ЬСОК.1 200 мкг/мышь Среднее ±81) | 16/644+ ΜΌΚΙ 300мкг/мышь Среднее ±8ϋ | 16/6-14+ КМ1С1Ж1 300 мкг/мышь Среднее ±80 | Кошроль Среднее+8Ό | |
| Протеинурия, г/л | 0,58+0,34 | 0,17+0,15 р=0,0366 | 0,085+0,01 р=0,0088 | 0,810,3 р>0,5 | 0,031+0,09 |
| \¥ВС/мм3 | 2800+300 | 4900+800 р-0,004 | 58001300 р=0,004 | 41801831 р=0,0079 | 7900+400 |
| Интенсивность 1СБ в почках | 1,6+0,55 | 1+0,63 р-0,0887 | 0,510,5 р=0,0152 | 0,85+0,75 р-0,0628 | 0 |
| Анти- ДЦДНК антитела в разведении 1:1250 | 0,47+0,3 | 0,23+0,1 р-0,0234 | 0,210,1 р—0,0145 | 0,3510,3 р-0,343 | 0,002+0,002 |
| Анти-16/6-14 антитела в разведении 1:10000 | 0,89+0,1 | 0,96+0,2 | 0,9310,1 | 0,9510,13 | 0 |
На фиг. 14А-Р представлены по одной почке из каждой группы, где на А, В представлена почка не подвергнутой лечению мыши; на С, Ό представлена почка мыши, подвергнутой лечению РСОК1, и на Е, Р представлен срез почки мыши, подвергнутой воздействию обратного РСОК1. Фиг. А, С, Ех100 и В, Ό, Рх400.
На фиг. 15 А-Е показаны уровни различных цитокинов в супернатантах культур лимфатических узлов, стимулированных 16/6-14. Последние исследования проводили в конце лечения (после 10 лечебных инъекций). Можно видеть, что лечение РСОК1 (обе дозы) ингибировало ΙΝΡ-γ (фиг. 15 А), ГБ-10 (фиг. 15С) и ΤΝΡ-α (фиг. 15В). С другой стороны, РСОК1 повышал уровни ТОР-β. Так как спленоциты обычно секретируют больше ТОР-β (фиг. 15Ό), чем клетки лимфатических узлов, ТОР-β также определяли в супернатантах 16/6-14-стимулированных клеток селезенки мышей различных групп (фиг. 15Е).
Таким образом, РСОК1 снижает интенсивность симптомов заболевания и иммуномодулирует про
- 22 009465 дукцию цитокинов у мышей, пораженных индуцированной экспериментальной 8ЬЕ.
Пример 11. Перенос благоприятных воздействий на симптомы волчанки спленоцитами мышей, подвергнутых лечению ИСЕЖ1.
Оказалось важным исследовать, возможен ли перенос клетками селезенки подвергнутых лечению мышей благоприятных воздействий лечения НС 1)111, которые проявляются подавлением симптомов заболевания. Для этой цели проводили эксперимент, в котором 8-месячных мышей (\ΖΒχ\Ζ\λ’)Ι'Ί, которые уже страдали полностью проявившимся заболеванием, подобным волчанке, делили на 2 группы. Группу 1 не лечили, а мышам группы 2 переносили 20χ106 клеток селезенки 3-месячных мышей (\ΖΒχ\Ζ\·\’)Ι;1, которым 3 раза вводили (подкожно, через день) 300 мкг/мышь НСОКЛ. Все спленоциты вводили внутрибрюшинно. У мышей исследовали продукцию анти-дцДНК-аутоантител, проявления заболевания и мышей умерщвляли через 4 недели после переноса клеток. Перенос клеток мышей, подвергнутых лечению ИС1Ж1, вызывал умеренное снижение уровней анти-ДНК-антител.
В табл. 13 показано, что перенос спленоцитов мышей, подвергнутых лечению ЙСОК1, приводил к значительно более низкой протеинурии и к уменьшению иммунных комплексов в почках.
Таблица 13
Клиническое проявление волчанки у мышей-реципиентов клеток селезенки мышей, подвергнутых лечению ИСЕЖ1
| № группы | Лечение | Протеинурия, т/л ± ЗЮ | 1.С.О. ± ЗЕМ |
| 1 | Не подвергнутые лечению | 15,07±4,92 | 2,25±0,47 |
20*106 клеток 0,97±0,67 0,75±0,47 селезенки от р=0,05 р=0,05
| 2 | 20*106 клеток селезенки от мышей, подвергнутых лечению ИС0К.1 | 0, 97±0,67 р=0,05 | 0,75±0,47 р=0,05 |
Значения р вычисляли по сравнению с дг1 (группа 1) не подвергнутых лечению мышей.
Эксперимент повторяли несколько раз, используя гс\'11С1)1К 1 в качестве контроля. Результаты оказались подобными результатам первого эксперимента, а именно перенос клеток подвергнутых лечению мышей оказывал небольшое влияние на титры анти-ДНК-антител и значительно влиял на протеинурию и поражение почек. Клинические показатели характерного эксперимента представлены в табл. 14.
Таблица 14
Клиническое проявление волчанки у мышей-реципиентов клеток селезенки мышей, подвергнутых лечению НС0К1
| № группы | Лечение | Протеинурия, г/л ± ЗЕМ | Ι.Ο.ϋ. ± ЗЕМ |
| 1 | Не подвергнутые лечению | 10,9±3,05 | 2,3±0,26 |
| 2 | 20*106 клеток селезенки от мышей, подвергнутых лечению ИСОК1 | 2, 91±1,6 р=0,0402 | 1,33±0,35 р=0,034 |
| 3 | 20*106 клеток селезенки от мышей, подвергнутых лечению ΓθνΗΟϋΗΙ | 5,38±2,34 р=0,0931 | 1,7±0,23 р=0,065 |
- 23 009465
Значения р вычисляли по сравнению с дг1 не подвергнутых лечению мышей.
Можно видеть, что подавляющее действие лечения посредством ЙСЭК1 может быть перенесено клетками селезенки подвергнутых лечению мышей.
На фиг. 16А-Е изображены срезы почек мышей группы 1 (А, В - не подвергнутые лечению мыши), группы 2 (С, Ό - реципиенты спленоцитов 2-месячных мышей, подвергнутых лечению ЙСЭК1) и группы 3 (Е, Е - реципиенты спленоцитов 2-месячных мышей, подвергнутых лечению гетйСЭК1). А, С, Ех400; В, Ό, Ех100.
Результаты вышеприведенных экспериментов указывают, что эффекты ЙСЭК1, снижающие интенсивность проявлений заболевания, могут быть перенесены иммуноцитами здоровых мышей, которых лечили ЙСЭК1.
Пример 12. Ингибирование ММР-3 и ММР-9 мышиными пептидами тСЭК.
Матриксные металлопротеиназы (ММР) (81нпд1е1оп еί а1., 1996; Сое1х1 еί а1., 1996; Маххота еί а1., 1998) составляют семейство цинксодержащих эндопротеиназ, которые играют важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса в здоровых тканях, а также участвуют в патологических процессах. Они обладают общими структурными доменами, но отличаются по субстратной специфичности, клеточному происхождению и индуцибельности.
ММР синтезируются в виде зимогенподобных латентных предшественников и впоследствии превращаются в активные формы. ММР-2 и ММР-9, которые обе являются желатиназами, могут деградировать коллаген IV типа, денатурированные коллагены, коллагены V, VII, Х и XII типов, витронектин, аггрекан, галектин-3 и эластин. ММР-2 является наиболее широко распространенной ММР. Она продуцируется целым рядом клеток, и ее уровень часто повышается в метастазах злокачественных опухолей.
С точки зрения белковой и доменной структуры, ММР-9 является самым большим и наиболее сложным представителем, идентифицированным до сих пор. Экспрессия ММР-9 характеризуется сложной регуляцией путем устойчивого контроля на уровнях генной транскрипции и белковой секреции медиаторов воспаления (таких, как цитокины, хемокины, эйкосаноиды) и путем действия тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ИМЯ). Кроме того, активность ММР-9 модулируется в результате активации про-ММР-9, компонентами системы активации плазминогена или другими ММР (Снейех еί а1., 1996).
Вовлечение ММР в аутоиммунные заболевания было продемонстрировано при различных аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (Охепс! еί а1., 1999) и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит его животной модели (ЕАЕ) (СуЬек еί а1., 1994), ревматоидный артрит (Кеуъхег еί а1., 1999), синдром Гийена-Барре (Сгеапде еί а1., 1999), экспериментальный булезный пемфигоид (Ь1ц еί а1., 1998) и экспериментальный аутоиммунный неврит (Нцдйек еί а1., 1998). Описано, что сывороточные уровни ММР-3 и ТГМР-2 у больных волчаночным нефритом значительно выше, чем их уровни у здоровых контролей, но не наблюдали корреляции с активностью заболевания Дискет, 1999; Кеуъхег еί а1., 1999).
Возможное значение большинства активностей ММР в воспалительных ответных реакциях было подсказано ингибиторным действием ингибиторов ММР на некоторых животных моделях аутоиммунных заболеваний. Специфическое ингибирование ММР ίη νί\Ό подавляет отек, патологическую тканевую пролиферацию и поражение специальных тканевых структур при некоторых воспалительных и аутоиммунных заболеваниях (СуЬек еί а1., 1994; Уа11асе еί а1., 1999; Сотгау еί а1., 1995).
Согласно данному изобретению показано, что уровни ММР-3 и ММР-9 повышены как в сыворотках, так и в почках мышей, пораженных или спонтанной, или индуцированной экспериментальной 8ЬЕ. Также было продемонстрировано, что лечение 8ЬЕ-пораженных мышей мышиными пептидами, базирующимися на СЭК, которые уменьшают интенсивность проявлений волчанки у мышей, снижало уровни ММР-3 и ММР-9 в сыворотке и почках подвергнутых лечению мышей, а также вызывало уменьшение интенсивности симптомов заболевания. Полагают, что такие же эффекты будут присущи человеческим пептидам ЙСЭК изобретения.
Пример 12(1). Динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей (ΝΖΒχΝΖν)Ε1.
В первую очередь, исследовали, связано ли развитие спонтанной 8ЬЕ у мышей (ΝΖΒχΝΖν)Ε1 с изменениями в уровнях ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в их сыворотках. Так, следили за уровнями последних у мышей, начиная с возраста 2 месяцев, прежде чем наблюдали симптомы заболевания, до возраста 8 месяцев, когда мыши страдали от вполне развившегося заболевания. Результаты представлены на фиг. 17. Как можно видеть на фиг. 17А, в сыворотках 2-месячных мышей как уровень формы ММР-3 с М.м. 34 кД, так и уровень формы с М.м. 40 кД являлись очень низкими, что показано методом Вестерн-блоттинга. Уровни всех форм постепенно повышались к возрасту 8 месяцев, последнему исследованному временному периоду. Аналогично, на фиг. 17В показано, что активность ММР-9, которую оценивали методом гелевой зимографии, была низкой в возрасте 2 месяцев и постепенно возрастала в сыворотках мышей при прогрессировании заболевания до возраста 8 месяцев. На фиг. 17В также видно, что уровни ММР-2 значительно не изменялись с прогрессированием заболевания.
Пример 12(ίί). Динамика появления ММР-3, ММР-2 и ММР-9 в сыворотках мышей ВАЬВ/с, которых иммунизовали 16/6-И.
Предварительные результаты из лаборатории заявителя показали, что 8ЬЕ можно индуцировать у мышей ВАЬВ/с после иммунизации 16/6-Тй (Менй1отю еί а1., 1988; ХУаИтап еί а1., 1993). Поэтому каза
- 24 009465 лось интересным исследовать, похожа ли индуцированная модель 8ЬЕ на модель (NΖВхNΖУ)Р1 в отношении изменений в ММР-3 и ММР-9. Таким образом, в указанных экспериментальных моделях 8ЬЕ следили за уровнями ММР-3 и ММР-9. Результаты, представленные на фиг. 18, указывают, что уровни ММР-3 (все изоформы) повышались через 10 дней после повторной иммунизации (4,5 недель после иммунизации) и оказались выше, чем у контрольных неиммунизованных или СРА-иммунизованных мышей ВАЬВ/с того же возраста (фиг. 18 А). Во всех группах уровни ММР-3 повышались в процессе старения, однако, уровни ММР-3 у 16/6-16-иммунизованных мышей были всегда выше, чем в контрольных группах. В противоположность этому, никаких индуцированных изменений в активности ММР-9 невозможно было определить до тех пор, пока не прошло 2 месяца после повторной иммунизации (фиг. 18В). Более высокую активность ММР-9 у 16/6-16-иммунизованных мышей, чем у неиммунизованных мышей, можно было наблюдать приблизительно 4 месяца после повторной иммунизации.
Пример 12(ίίί). Специфическая активация ММР-3 и ММР-9 в срезах почек мышей ВАЬВ/с, которых иммунизовали 16/6-Ι6.
Так как иммунизация мышей ВАЬВ/с посредством 16/6-Ι6 приводила к клиническим проявлениям, характеризующим 8ЬЕ, включая поражение почек (Меп61оую е1 а1., 1988; Уа15тап е1 а1., 1993), и так как описано, что поражение почек у мышей (№Вх№У)Р1 связано с повышением уровней ММР-3 и ММР-9 (№катига е1 а1., 1993), следили за экспрессией указанных ферментов в почках мышей ВАЬВ/с, которых иммунизовали 16/6-Ι6. В качестве контролей использовали мышей, которых иммунизовали СРА, и подобранных по возрасту неиммунизованных мышей. Обеим контрольным группам вводили РВ8 в момент проведения повторной иммунизации. Через 2 месяца и через 5 месяцев после повторной иммунизации 16/6-Ι6 проводили иммуноокрашивание срезов почек мышей в отношении ММР-3 или ММР-9. На фиг. 19 представлена иммуногистология почек, взятых через 5 месяцев после повторной иммунизации. Как можно видеть на фигуре, иммунизация мышей СРА активировала экспрессию как ММР-3 (19А), так и ММР-9 (19В) в почках, в гломерулах и в окружающей ткани. Однако иммунизация 16/6-Ι6 в СРА еще значительно повышала уровни экспрессии указанных двух ММР. Описанное повышение наблюдали уже через 2 месяца после повторной иммунизации 16/6-Ι6 (данные не представлены). Также показаны неспецифические фоновые уровни окрашивания (19С).
Пример 12(ίν). Мышиный пептид тСЭВ 1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках мышей (№Вх№У)Р1.
Так как удалось показать, что уровни ММР-3 и ММР-9 повышались в обеих экспериментальных моделях 8ЬЕ, целесообразно было исследовать, сопровождается ли уменьшение интенсивности клинических симптомов 8ЬЕ, наблюдаемое после лечения пептидом тСЭВ1 (Е11а1 е1 а1., 2000; Е11а1 е1 а1., 2001), снижением уровней ММР-3 и ММР-9. Так, мышей (ΝΖβκΝΖ^ΙΡΤ, у которых спонтанно развивалось 8ЬЕ-подобное заболевание, в возрасте 2 месяцев (прежде, чем наблюдали клинические проявления) лечили еженедельным введением им подкожно тСЭВ1 в РВ8 (250 мкг/мышь) в течение 10 недель. Этот профилактический протокол приводил к уменьшению интенсивности всех клинических симптомов (ЕПа1 е1 а1., 2000). Как можно видеть на фиг. 20, имеется снижение в двух более низких зонах ММР-3 (20А) и в активности ММР-9 (20В) в сыворотке. Описанное снижение связано с уменьшением клинических проявлений (ЕПа1 е1 а1., 2000). Как видно на фиг. 20 А, форма ММР-3 с М.м. 45 кД не затрагивалась.
Также представлялось интересным исследовать, способен ли пептид тСЭВ 1 подавлять повышенные уровни ММР-3 и активность ММР-9. С этой целью следили за уровнями ММР-3 и активностью ММР-9 в сыворотках мышей (ΝΖβκΝΖ^ΙΡΤ, которых лечили тСЭКТ во время, когда уже наблюдали симптомы заболевания. В качестве контрольного пептида использовали обратный тСЭКГ. Как можно видеть (фиг. 20, справа), лечение больных мышей тСЭКТ, но не геутСЭВЕ специфически снижало уровни ММР-3 (20А) и подавляло активность ММР-9 (20В) в сыворотках.
Пример 12(ν). Пептид тСЭВ1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках мышей, иммунизованных 16/6-Ι6.
Как было показано, активность ММР-9 повышается в обеих экспериментальных моделях 8ЬЕ [(NΖВхNΖУ)Р1 и 16/6-16-индуцированной]. Так как показано, что пептид тСЭЮ уменьшает интенсивность заболевания в обеих моделях и снижает уровни ММР-3 и активность ММР-9 в сыворотках подвергнутых лечению мышей (NΖВхNΖУ)Р1, в дальнейшем следили за влиянием лечения на указанные ферменты в сыворотках мышей ВАЬВ/с, иммунизованных 16/6-Ι6. На фиг. 21 представлены результаты профилактического и лечебного экспериментов. На фигуре показано, что на описанной экспериментальной модели тСЭКТ также может супрессивно регулировать ММР-3 и ММР-9. Подавление уровней ММР-3 и активности ММР-9 наблюдали как в отношении профилактического, так и лечебного протоколов. Так, введение тСЭКТ ίη νίνο, или на стадии индукции заболевания, или на стадии вполне развившегося заболевания может снижать уровни ММР-3 (21А) и ММР-9 (21В). Описанное снижение было специфическим, так как лечение обратным тСЭВ1 не оказывало влияния на ММР-3 или активность ММР-9 (не представлено). Предварительные результаты с использованием системы определения активности ММР-9 (от Атег5Йат-Ркагтас1а Вю1ес11. ИК Ь1тйе6, Епд1ап6) показали, что активность в сыворотках от неиммунизованных мышей ВАЬВ/с являлась сопоставимой с 7 нг/мл чистой активной ММР-9. Иммуни
- 25 009465 зация 16/6-16 повышает активность до 16 нг/мл, а лечение пептидом тСЬЫ подавляет ее почти до нормальных уровней (8,5 нг/мл).
Пример 12(νί). Влияние лечения пептидом тСЬЫ на уровни ММР-3 и ММР-9 в срезах почек мышей ВАЬВ/с, иммунизованных 16/6-16.
Так как было показано, что ММР-3 и ММР-9 повышаются в почках мышей с индуцированной экспериментальной 8ЬЕ, оказалось интересным исследовать влияние лечения пептидом тСЬЫ на экспрессию ММР в почках подвергнутых лечению мышей. На фиг. 22 показано, что как в профилактическом (фиг. 22 А), так и в лечебном (фиг. 22В) экспериментах тСЬШ снижал уровни экспрессии как ММР-3, так и ММР-9 в почках подвергнутых лечению мышей. Снижение уровней ММР наблюдали как в гломерулах, так и в интерстициальной ткани. Наблюдаемое снижение экспрессии ММР коррелировало со снижением окрашивания отложений иммунных комплексов при использовании анти-1д (фиг. 22В).
Вследствие наблюдаемого вовлечения ММР-3 и ММР-9 в патогенез 8ЬЕ исследовали, способен ли человеческий пептид НСЬК1 снижать уровни последних в соответствии с уменьшением интенсивности симптомов заболевания. Для этой цели в объединенных сыворотках групп мышей (ΝΖβχΝΖν)Ρ1, которых лечили НСЬК1 подкожным введением 100 или 300 мкг/мышь 1 раз в неделю в течение 10 недель, определяли уровни ММР в различные периоды во время лечения. На фиг. 23 представлены результаты эксперимента, в котором мышей лечили, начиная с возраста 7 месяцев, когда наблюдали все клинические проявления. Результаты относятся к сывороткам, собранным в середине лечения, после 5 инъекций ЬСОК.1. Результаты, представленные на фиг. 23, показывают, что лечение мышей 300 мкг НСЭК1 подавляет уровни ММР-3 и активность ММР-9. Полученные результаты согласуются со значительным уменьшением интенсивности проявлений заболевания после лечения ЬСОК.1.
Обсуждение
Вышеприведенные результаты показывают, что как ММР-3, так и ММР-9 повышаются в сыворотках и почках мышиных моделей 8ЬЕ. Мышиный пептид тСЬЫ может супрессивно регулировать уровни ММР-9 и ММР-3 как в сыворотках, так и в почках мышей, пораженных 8ЬЕ. Продемонстрировано, что в спонтанной модели 8ЬЕ активация как ММР-9, так и ММР-3 в сыворотке происходит в первые 3,5 месяца. В индуцированной модели повышение уровня ММР-3 в сыворотках происходит очень рано (через 10 дней после бустер-иммунизации 16/6-16), тогда как повышение активности ММР-9 имело место приблизительно на 3-4 месяца позднее. На основании результатов, полученных на 16/6-16-индуцированной модели, позволившей проследить процесс с первых стадий заболеваия, по-видимому, ММР-3 вовлечена в индукцию заболевания, в то время, как ММР-9 участвует в прогрессии заболевания.
Полученные результаты, свидетельствующие о повышении ММР-3 в мышиных моделях 8ЬЕ, согласуются с результатами, демонстрирующими, что ММР-3 значительно повышена в сыворотках больных 8ЬЕ (Ко!а_)1та е! а1., 1998) и что количество транскриптов ММР-3 существенно возрастало с прогрессированием нефрита у мышей (ΝΖβχΝΖΑ)Π (№1катига е! а1., 1993). Взятые вместе, полученные результаты позволяют предположить, что ММР-3 может участвовать в развитии поражения гломерул при волчаночном нефрите.
Полученные результаты показывают, что как в индуцированной, так и спонтанной моделях 8ЬЕ уровни ММР-2 в сыворотках значительно не повышались с прогрессированием заболевания. Полученные результаты сопоставимы с результатами, сообщенными ранее Дискет, 1999), что уровни ММР-2 не возрастали при 8ЬЕ. Соответственно, названный фермент не модулировался при лечении пептидом, базирующимся на СОК! (данные не представлены). ММР-2 секретировалась коститутивно, и уровни ее также не изменялись при других патологических состояниях (подобных ретробульбарному невриту и рассеянному склерозу), тогда как уровни ММР-9 повышались по сравнению со здоровыми контролями (Сг)Ье18 е! а1., 1992; Раетеп е! а1., 1994).
Интересно, что пептид тСЭК.1, который специфически и непосредственно оказывает влияние на Тклеточные ответные реакции, ассоциированные с 8ЬЕ, может супрессивно регулировать уровни ММР-3 и ММР-9, которые уже активированы (лечебный протокол), а также предупреждает их повышение (профилактический протокол).
Активность ММР-9 в сыворотках не описывалась ни у больных 8ЬЕ, ни в животных моделях 8ЬЕ. Впервые показано, что имеется корреляция между 8ЬЕ и ММР-9, и продемонстрировано, что ММР-9 повышается в сыворотках и почках мышей, пораженных 8ЬЕ. Хотя повышение в сыворотках происходит относительно поздно (около 4 месяца после повторной иммунизации), повышение ММР-9 в почках наблюдали на ранних стадиях после индукции заболевания (2 месяца) (данные не представлены). Кроме того, в изобретении впервые показано, что пептиды, которые уменьшают интенсивность симптомов 8ЬЕ у мышей (тСЬЫ и НСОКк как показано выше), также подавляют ММР-9 как в сыворотках, так и в почках. Последние данные также подтверждаются предварительными результатами, полученными при использовании системы определения активности ММР-9, которые показали, что иммунизация 16/6-16 повышает активность ММР-9, тогда как лечение пептидом, базирующимся на СЭК.1, подавляет ее активность у иммунизованных мышей.
Также в изобретении впервые показано, что ММР-3 и ММР-9 отличаются по динамике их индукции
- 26 009465 в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний, что, в частности, продемонстривано в описании для 8ЬЕ. Это может указывать на различные роли описанных выше ММР в патогенезе заболевания. Представленные результаты демонстрируют, что пептиды, которые иммуномодулируют Т-клеточные ответные реакции, ассоциированные с 8ЬЕ, супрессивно регулируют проявления заболевания, могут контролировать секрецию (хотя не обязательно самими Т-клетками) названных ММР в сыворотках и почках. Полученные результаты указывают, что ММР-З и ММР-9 играют роль в патогенезе 8ЬЕ и могут служить заместителями маркеров прогрессирования заболевания, с одной стороны, и снижения интенсивности заболевания в результате данного лечения, с другой стороны.
Пример 1З. Активность ММР-9 (но не ММР-2) повышается в сыворотках больных 8ЬЕ.
В данном примере определяли уровни ММР-9 и ММР-2 в сыворотках 40 больных 8ЬЕ и продемонстрировали, что активность ММР-9, а не ММР-2, значительно повышается в сыворотках больных 8ЬЕ по сравнению со здоровыми контролями. Высокая активность ММР-9 коррелировала с наличием дисковидной сыпи, феномена Рейно, пневмонии, язв слизистой и присутствием антифосфолипидных антител (ЛРЬЛ). Кроме того, повышенные уровни ММР-9 коррелировали с активностью 8ЬЕ в группе пациентов-мужчин.
Материалы и методы
Пациенты.
пациентов, З2 женщины и 8 мужчин, с 8ЬЕ участвовали в данном исследовании. Все пациенты соответствовали по крайней мере четырем из установленных диагностических критериев Лшеггсаи Со11еде о£ Кйеитаΐ^8т (ЛСК) для диагностики 8ЬЕ (\Ушс11ек1ег. 1996). 25 здоровых волонтеров, подобранных по полу и возрасту, служили в качестве контрольной группы в проводимом исследовании. Средний возраст пациентов при постановке диагноза составлял 29±9,7 (диапазон 15-48) лет, и средний период наблюдения за заболеванием составлял 11±10 (диапазон 1-З2) лет. Активность заболевания определяли в соответствии с индексом активности волчанки 8ЬЕПЛ1 (ВошЪагйхег еΐ а1., 1992) и по индексу В1ЬЛС (Нау еΐ а1., 199З). Исследование одобрено комитетом по этике Медицинского центра Каплана (Кар1ап), КейоуоЦ 1згае1.
Измерение активности ММР-2 и ММР-9 с помощью наборов для определения активности.
Активности ММР-2 и ММР-9 измеряли с помощью наборов для определения активности ММР-2 и ММР-9 Вюйик (Лшетякаш Рйагшааа Вю1ес11. ИК Ышйей, ЦК) в соответствии с инструкциями производителя. Сыворотки разводили 1:100 и 1:З2 для определения активностей ММР-2 и ММР-9, соответственно. Соответствующие стандарты добавляли в каждую пробу. Для измерения общего содержания ММР проводили активацию проформ ММР, используя ацетат п-аминофениловой ртути (АРМА).
Определение активностей ММР-2 и ММР-9 методом гелевой зимографии.
Активности ММР-2 и ММР-9 тестировали методом гелевой зимографии. Образец сыворотки 5 мкл разделяли с помощью электрофореза в 8% 8Э8-ПААГ, с полимеризованным желатином 1 мг/мл. Гели промывали 1 раз в течение З0 мин в 2,5% Тритоне Х-100, чтобы удалить 8Ό8, и 1 раз в течение З0 мин в реакционном буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1, 200 мМ №С1, 10 мМ СаС12 и 0,02% (мас./об.) Вгу З5 (рН 7,5). Использованный реакционный буфер заменяли на свежий буфер и гели инкубировали при З7°С в течение 24 ч. Желатинолитическую активность визуализировали окрашиванием гелей 0,5% кумасси бриллиантовым голубым и количественно определяли денситометрией.
Статистические анализы.
Данные оценивали, используя Хи-квадрат или критерий точной вероятности Фишера, несвязанные ΐ-критерии и двусторонние Р-значения. Также использовали коэффициенты корреляции Пирсона, Спирмена и мультивариантные анализы.
Пример 1З(1). Активность ММР-9, а не ММР-2, повышается при 8ЬЕ.
Как описано выше, показано, что ММР-9 вовлечена в развитие некоторых аутоиммунных заболеваний, а также в животных моделях 8ЬЕ. Таким образом, представлялось интересным исследовать, повышается ли также ММР-9 в сыворотках больных 8ЬЕ. Для этой цели исследовали сыворотки 40 больных 8ЬЕ и 25 здоровых контролей методом гелевой зимографии, с помощью которой можно выявить активности как ММР-9, так и ММР-2. Репрезентативный гель представлен на фиг. 24. Как можно видеть на данной фигуре, уровни ММР-9 повышаются в сыворотках больных 8ЬЕ по сравнению со здоровыми контролями. Денситометрический анализ зимограмм сывороток 40 больных 8ЬЕ и 25 здоровых контролей показал, что средняя активность ММР-9 для больных 8ЬЕ составляла 109±5,6 денситометрических единиц, а для здоровых контролей 76,5±4,2 денситометрических единиц (Р=0,0001). Величины активности выше 85 денситометрических единиц (среднее из здоровых контролей + 2 з.е. (стандартные ошибки)) рассматривали как высокие. Результаты показали высокие уровни активности ММР-9 у 68% больных 8ЬЕ. Только З% здоровых контролей проявляли высокую активность ММР-9 (Р=0,001). Денситометрический анализ уровней ММР-2 в тех же образцах сывороток показал, что различия в активности ММР-2 между сыворотками больных 8ЬЕ и здоровых контролей не были значимыми. Так, величины 109±7 и 12З±5 (денситометрические единицы средней активности ± з.е.) были определены для здоровых контролей и больных 8ЬЕ, соответственно (Р=0,05З1). Кроме того, для количественного определения уровней активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке использовали наборы для анализа активности.
На фиг. 25 показано, что активность ММР-9 в сыворотках больных 8ЬЕ повышена в З раза по сравнению
- 27 009465 с сыворотками здоровых доноров, и это повышение является статистически значимым (Р=0,0302). В противоположность этому, различия в уровнях ММР-2 между двумя группами не являются значимыми (Р=0,1254).
Так как заявители, а также другие исследователи (ЕЬШага е! а1., 1998 и 1999) определяли высокие уровни ММР-9 в сыворотках больных с хроническим поражением почек, не связанным с ЗБЕ (например, сахарный диабет, гипертензия), вероятно, обусловленные удержанием фермента, анализировали корреляцию между уровнями ММР-9 и функцией почек в группе тестируемых больных ЗБЕ. Никакой корреляции не наблюдали между уровнями креатинина и уровнями ММР-9 (г2=0,01), указывая, что повышенные уровни ММР-9 у больных ЗБЕ не являются результатом удержания фермента, обусловленного почечной недостаточностью.
Пример 13(ίί). Корреляция активности ММР-9 с клиническими и лабораторными параметрами.
Повышение уровней активности ММР-9 в сыворотках больных ЗБЕ заставило проследить за возможной корреляцией между клиническими и лабораторными параметрами и сывороточными уровнями ММР-9. Статистический анализ (Хи-квадрат или критерии точной вероятности Фишера) проводили при исследовании ряда пациентов с высокими и нормальными уровнями ММР-9 для каждого клинического симптома (табл. 15), а также принимая во внимание фактические уровни средней активности ММР-9 для пациентов, у которых присутствует или отсутствует определенный клинический симптом. Результаты оказались подобными в обоих анализах. Заслуживает внимания то, что для всех клинических симптомов процент больных с повышенными уровнями ММР-9 был значительно выше, чем процент в группе здоровых доноров. Уровни ММР-9 не коррелировали с полом, продолжительностью заболевания или периодом от его начала (Реагзоп, Зреагтап).
В табл. 15 показаны клинические и лабораторные показатели больных ЗБЕ в соответствии с их уровнями активности ММР-9 (более низкие или одинаковые со здоровыми контролями = нормальным). Высокие уровни ММР-9 значительно коррелировали с наличием феномена Рейно (Р=0,0138) и АРБА (Р=0,041). Строгую корреляцию можно было наблюдать с пневмонией, дисковидной сыпью, неврологическими нарушениями и язвами слизистой. Однако количество пациентов с последними проявлениями слишком небольшое, чтобы проводить статистический анализ. Мультивариантный анализ выявил, что феномен Рейно и низкие уровни комплемента (С3, С4) положительно коррелировали с высокими уровнями ММР-9 (Р=0,0001 и 0,0137, соответственно). В противоположность этому, светочувствительность, артрит и гематологические нарушения отрицательно коррелировали с уровнями активности ММР-9 (Р=0,0381, 0,0014 и 0,0065, соответственно).
Таблица 15
Клинические показатели больных ЗБЕ с высокими и нормальными активностями ММР-9 в соответствии с их уровнями ММР-9
| Уровни ММР-9 (%) | |||
| Высокий | Нормальный | ||
| Количество пациентов (%) | 40 (100) | 27 (68) | 13 (32) |
| Светочувствительность | 13 | 8 (62) | 5 (38) |
| Язвы слизистой | 9 | 8 (89) | 1 (11) |
| Сыпь на щеках | 9 | 7 (78) | 2 (22) |
| Дисковидная сыпь | 5 | 5 (100) | 0 (0) |
| Феномен Рейно | 8 | 8 (100) | 0 (0) |
| Васкулит | 18 | 14 (78) | 4 (22) |
| Артрит | 31 | 21 (68) | 10 (32) |
| Серозит | 9 | 7 (78) | 2 (22) |
| Пневмония | 4 | 4 (100) | 0 (0) |
| Неврологические нарушения | 4 | 4 (100) | 0 (0) |
| Почечные поражения | 16 | 11 (69) | 5 (31) |
| Гематологические нарушения | 29 | 18 (62) | 11 (38) |
| ΑΝΑ | 40 | 27 (68) | 13 (32) |
| а-дцДНК | 36 | 24 (67) | 12 (33) |
| АРЬА | 25 | 20 (80) | 5 (20) |
Низкий комплемент (СЗ, С4) 30 21 (70) 9 (30)
- 28 009465
Клиническое поражение определяли в соответствии с установленными критериями АСК (^псИеЛег, 1996). Антинуклеарные антитела (А№А) и анти-дцДНК-антитела определяли, используя клетки Нер2 и Сг11И1Н1а 1исШае, соответственно. Антифосфолипидные антитела (АРБА) определяли как реактивность в случае одного или более из следующих анализов: ложнопозитивного νϋΚ, волчаночного антикоагулянта (БАС) или анализа-ЕЫ8А для антикардиолипиновых антител.
Также оценивали возможную корреляцию между 8ΕΕΏΛΙ и активностью ММР-9 у пациентов мужчин (фиг. 26А) и женщин (фиг. 26В). Интересно, что коэффициент корреляции был значимым и позитивным для мужчин (г2=0,6333), но незначимым и отрицательным для женщин (г2=0,0571). Подобные результаты получали, используя систему оценки ВГЕАО. Таким образом, положительный коэффициент корреляции между активностью ММР-9 и показателями ВША С наблюдали для мужчин (г2=0,6442) и незначимый коэффициент - для женщин.
Также представляло интерес определить, существует ли корреляция между применением пациентами различных лечебных терапий и активностью ММР-9. Как можно видеть из табл. 16(А), не существует значимой корреляции между текущим лечением пациентов и активностью ММР-9. Однако, когда просматривали лечение пациентов за любой период во время течения их заболевания (табл. 16(В)), обнаружили, что высокие уровни ММР-9 являются ассоциированными с применением цитотоксических агентов (82%).
Таблица 16
Способы лечения больных 8ЬЕ согласно их уровням ММР-9
| Общее количество пациентов | Уровни ММР-9 (%) | ||
| Высокие | Нормальные | ||
| А. Текущее лечение | |||
| Цитотоксические агенты | 8 | б (75) | 2 (25) |
| Стероиды | 23 | 17 (74) | б (26) |
| Антималярийные агенты | 21 | 14 (67) | 7 (33) |
| Ν3ΑΙϋ | 7 | 5 (71) | 2 (29) |
| В. Лечение на протяжении прослеживаемого периода | |||
| Цитотоксические агенты | 17 | 14 (82) | 3 (18) |
| Стероиды | 29 | 19 (66) | 19 (34) |
| Антималярийные агенты | 26 | 16 (62) | 10 (38) |
| Ν5ΑΙΌ | 18 | 12 (67) | 6 (33) |
Антималярийный агент, гидроксихлорохин, использовали в дозе 200-400 мг/день. Стероидную терапию устанавливали в виде ежедневной дозы >5 мг преднизона. Использованным цитотоксическим агентом был циклофосфамид (0,5-1 г/м2 ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/день).
Пример 13 (ίίί). Изменения в активности ММР-9 в образцах сывороток, полученных от индивидуальных больных 8ЬЕ в различные периоды времени.
Так как активность заболевания изменялась с течением времени, определяли уровни активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке индивидуальных пациентов, у которых брали образцы в течение 4-6 лет наблюдения. Исследовали сыворотки 9 пациентов, взятые в различные временные периоды. Уровни ММР-2 значительно не различались между пациентами и здоровыми контролями. У 5 из 9 исследованных пациентов можно было наблюдать изменения в активности ММР-9 в образцах сывороток индивидуальных пациентов в зависимости от времени. Результаты от 2 репрезентативных больных 8ЬЕ представлены на фиг. 27. Как можно видеть, активность ММР-9, а не активность ММР-2, изменялась в зависимости от времени у тех же самых больных. Наблюдаемые изменения не были связаны с индексом активности заболевания, который определяли по системам или 8^Е^АI, или ВТЬАО. Изменения в активности
- 29 009465
ММР-9 не были установлены в сыворотках 5 здоровых доноров, у которых брали образцы в различные временные периоды (данные не представлены). У 4 других больных 8ЬЕ не наблюдали существенных изменений в активности ММР-9 или ММР-2 в зависимости от времени, а уровни активности ММР-9 оставались или высокими, или низкими в зависимости от индивидуального пациента.
Обсуждение
Данное изучение впервые демонстирует участие ММР-9 в 8ЬЕ у человека. Показано, что активность ММР-9, но не ММР-2, значительно повышена в сыворотках 68% больных 8ЬЕ по сравнению со здоровыми контролями. Высокие уровни ММР-9 коррелировали с феноменом Рейно, пневмонией, неврологическими нарушениями, дисковидной сыпью и присутствием АРЕА. Изменения в активности ММР-9 наблюдали в сыворотке тех же самых больных в различные периоды заболевания. Уровни активности ММР-9 не коррелировали с индексом активности заболевания ^ЬЕПАр ВЛАС) у пациентовженщин, но коррелировали с активностью 8ЬЕ в группе пациентов-мужчин.
Представленное исследование показывает, что уровни активности ММР-2 значительно не повышались в сыворотках больных 8ЬЕ. Полученные результаты сопоставимы с результатами, описанными ранее (Иискег, 1999), что уровни ММР-2 не увеличивались при 8ЬЕ. Также уровни ММР-2 оказались конститутивными и не изменялись при других патологических состояниях (подобные ретробульбарному невриту и рассеянному склерозу), при которых уровни ММР-9 увеличивались относительно здоровых контролей (ОуЬе1з е! а1., 1992; Раетеп е! а1., 1994).
Высказано предположение об участии дополнительной ММР, а именно ММР-3, в патогенезе 8ЬЕ, так как она значительно увеличивалась в сыворотках больных 8ЬЕ (КоЕунпа е! а1., 1998). Частота обнаружения больных 8ЬЕ с повышенной активностью ММР-9 (68%), представленная в данном примере, напоминает частоту, описанную (Ко!а_рта е! а1., 1998) для высоких уровней ММР-3 у больных 8ЬЕ (76%) и ВА (82%). Кроме того, показано, что число транскриптов ММР-3 значительно увеличивается при прогрессировании нефрита у мышей (№Вх№У)Е1 (№-1катига е! а1., 1993).
Происхождение повышенных ММР в сыворотках больных 8ЬЕ не известно. Показано, что ММР-9 секретируется клетками периферической крови, такими как Т-клетки, нейтрофилы и макрофаги (для ознакомления см. Сое1х1 е! а1., 1996). Тот факт, что не обнаружена корреляция между уровнями активности ММР-9 и количеством клеток периферической крови у пациентов, может означать, что ММР-9 не секретируется иммунными клетками периферической крови, а, скорее, секретируется пораженными 8ЬЕ органами, подобными почкам или легким/плевре. Наблюдение, что все больные 8ЬЕ с пневмонией показывают высокие уровни активности ММР-9, может означать, что пораженное легкое является источником высоких уровней ММР-9. Кроме того, ассоциация между цитотоксическим лечением, которое олицетворяет тяжесть недостаточности органа, связанную с 8ЬЕ, и высокими уровнями ММР-9 в сыворотках также может служить подтверждением представления о том, что пораженные органы являются источником активности ММР-9 у больных 8ЬЕ. Однако еще существует вероятность, что меньшее количество лимфоцитов периферической крови секретирует более высокие уровни активности ММР-9.
Показано, что ТОЕ-α и ГС-1 играют важную роль в патогенезе 8ЬЕ как в заболевании человека ГОеап е! а1., 2000), так и в мышиных моделях (8еда1 е! а1., 1997; ТНеоГ11орои1о8 е! а1., 1999; Е11а! е! а1., 2001). В нескольких системах показано, что названные цитокины индуцируют продукцию ММР-9 (0иеάеζ е! а1., 1996), и, следовательно, возможно, что индукция последних ММР является частью патогенного действия названных цитокинов при 8ЬЕ. Описано, что ММР-9, которая секретируется спонтанно моноцитами периферической крови здоровых индивидуумов, активировалась при экспозиции с Т№-а и ГО-1 β (8агеп е! а1., 1996). Кроме того, ММР как Т-клеток, так и макрофагов способствуют секреции Т№α посредством расщепления мембраносвязанной формы (Оеаппд е! а1., 1994). Таким образом, приведенные примеры демонстрируют взаимные регуляторные эффекты ММР на провоспалительные цитокины и наоборот. Однако тот факт, что в сыворотках некоторых пациентов уровни активности ММР-9 оставались в нормальных пределах во время наблюдаемого периода, тогда как высокие уровни активности ММР-9 определяли в сыворотках большинства пациентов, может означать вовлечение генетических факторов в регуляцию последней.
Представленные в описании результаты указывают, что ММР-9 может играть роль в патогенезе 8ЬЕ и что определение уровней активности названных металлопротеиназ в плазме/сыворотке может предоставить важную информацию, когда осуществляют непрерывный контроль пациентов, подвергнутых лечению лекарственными средствами, которые являются помехой для активности ММР-9.
Список литературы
ВотЬаЛ1ег, С., 01аάтап, Ό.Ό., иго^!!/, М.В. е! а1. ОепуаНоп оГ (Не 8^Е^АI. А άί^-ι^ асйуйу нкех Гог 1ири8 райеп!з. Аг1Ьп!18 ВНеит. 35: 630-40 (1992).
Соигау, Ι.Ο., ГА. ^акеНеИ, В.Н. Вго^п, В.Е. Маггоп, Ь. 8еки!, В.Ь. С1агк, О. МсСеесНап, ηιιά К.М. Соппо11у. ГОнЫНоп оГ сагШаде аЫ Ьопе άе8ί^исί^оп ш афиуагИ агйгкз ш Ле га! Ьу а та1пх те1а11орго!етазе 1пЬ1Ь1!ог. ί. Ехр. Меά. 182, 449 (1995).
Сгеапде, А., 8Наг8Наг,Т., Р^скепаик, Т., СНгкЮу С., Рогоп, Е., Вар1ае1, Г-С. ηΐ'ΐά ОНегагЛ, В.К. Ма1пх те!а11орго!ета8е-9 18 ^пс^еа8еά ηΐ'ΐά согге1а!ез \νί11ι зеуегку т ОшИат-Вагге зугкгот. №иго1о§у 53: 1683- 30 009465
1691 (1999).
Ьауап. Μ.. 8еда1. Я.. 8!1юедег. Ζ.. Аактап. А.. Вгок1. N.. Е1кауат. 0.. Е11а1. Е.. Епбкт. Μ. апб Мохс5. Е. Iттиηе гекропке о£ 8ЬЕ рабеп!к !о рерббек Ьакеб оп Не сотр1етеп1агку бе!спштпд гедкпк о£ а раНодепк апН-ОНА топос1опа1 апбЬобу. 1. С1т. Iттиηο1. 20. 187 (2000).
Эеап. 6.8.. Τу^^с11-Ρ^^сс. 1.. Сга\\'1еу. Е. с! а1. Сукктек апб кукктк 1ирик егу!11С1па!окик. Апп. Я1еит. Όίκ. 59: 243-51 (2000).
ЕЫНага. Ι.. ^-11^111111171. Τ.. 8Ытаба. N. с! а1. [псгеакеб р1акта те1а11орго1еи1аке-9 сопсепбабопк ргесебе беуе1ортеп1 о£ 1пкгоа1Ьшшпипа ш поп-тки1т-берепбеп! б1аЬе!ек те11Пик. Ат. 1. К1бпеу Ык. 32: 544-50 (1998).
ЕЫЬага. Ι.. №катига. Τ.. ИкЫуата. С. с! а1. ЕГГСс! о£ ога1 абкогЬеп! А8ГО120 оп р1акта 1пе!а11орго!етаке9 апб кегит бккие 1пН1Ь11ог оГ 1пе!а11орго!етаке-1 сопсеп!га!юпк ш сИгопк гепа1 Габиге. КерНгоп 83: 169 (1999).
Е11а1. Е.. Ζω^Γ. Н.. Юкка. А. апб Мохек. Е. Ргеуепбоп оГ кукктк 1ирик егуЛета1окик-11ке бкеаке ш (ЖВ/Ж\А)Е1 тке Ьу 1геа11пц \νί!1ι СОЯ1- апб СОЯ3-Ьакеб рерббек оГ а раНодешс аи!оапбЬобу. 1. С1т. Iттиηο1. 20. 268 (2000).
Е11а1. Е.. Ьауап. Μ.. Ζί^α. Н. апб Мохек. Е. Не тесНашкт Ьу \\!пс11 а рерббе Ьакеб оп Фе сотр1етеп1агНу бе!епшшпд гец1оп-1 оГ а раНодешс апи-ЭкА аиЮапбЬобу ате1юга1ек ехреп1пеп!а1 8ЬЕ. Ргос. N16. Асаб. 8ск И.8.А.. 98. 1148 (2001).
Ебске. Н.. 0Геп. Ό.. Μеηб1ον^с. 8.. 8НоепГе1б. Υ.. Вектег. Я.. 8рег1шд. 1. апб Μοζсκ. Е. Нбисбоп оГ ехреп1пеп!а1 кукктк 1ирик егу!11С1па!окик ш тке Ьу пптишхабоп \νί!1ι а топос1опа1 апб-Ьа аиЮапбЬобу. Ιη!. Ιππη^Ε 2. 225 (1990).
Егкке. Н.. Μеηб1ον^с. 8.. В1апк. Μ.. 8НоепГе1б. Υ.. Веп-Вакка!. Μ. апб Μοζсκ. Е. Iб^οΐурс кресШс Τ-сеП 1тек шбисшд ехрептеп!а1 кук!етк 1ирик егу!11С1па!окик ш тке. Iттиηο1οду. 73. 421 (1991).
6еаппд. А.1.Н.. Веске!!. Р.. С11пк!обои1ои. Μ. с! а1. Ргосекктд оГ !итоиг песгокк Гас!ог а1рНа ргесигког Ьу тйаЛоргоктакек. №!иге 370: 555-7 (1994).
6уЬе1к. К.. Μι-ιππό. 8.. Саг!оп. Н. с! а1. 6е1абпаке т Не сегеЬгокрша1 £1шб о Г ра!1еп!к \νί!1ι ти1бр1е кскгокк апб о!1сг 1п£1аттакгу пеиго1одка1 бкогбегк. 1. Nси^ο^ттиηο1. 41: 29-34 (1992).
6уЬе1к. К.. Я.Е. 6а1агбу. апб Ь. 8!еттап. Яеуегка1 о£ ехрептеп!а1 аи!о1ттипе епсерНактуеНик \νί!1ι а 11убгохата!е 1пЫЬ1!ог о£ та!пх те!а11орго!е1пакек. 1. С1т. Икек!. 94: 2177-82 (1994).
6ое!х1. Е.1.. Вапба. Μ.Ι. апб Ьерреб. Ό. Μ;ι!πχ те!а11орго!етакек т пптипбу. 1. ^типок 156: 1-4 (1996).
6иебех. Ь.. Ыт. Μ.8. апб 8!е!1ег-8!еуепкоп. ν.6. Τ1κ го1е о£ те!а11орго!етакек апб !11с1г тЫЬбогк т Нета!о1од1са1 бкогбегк. Сп!. Ясу. 0псодепекк 7: 205-225 (1996).
Нау. Е.М.. Васоп. Р.А.. 6огбоп. С. е! а1. Τ1κ ВША6 шбех: а ге11аЬ1е апб уаИб ткбитеШ £ог теакигшд с1шка1 бкеаке асбубу т кукктк 1ирик егу!11С1па!окик. 0.1. Μеб. 86: 447-58 (1993).
НидНек. РМ.. 6.ΜΑ \Ае11к. Ι.Μ. С1етеп1к. ЛЭ. 6еагшд. Еб. ЯебГогб. Μ. Оаукк. К.1. 8ιηί!1ι. Я.А. НидНек. Μ.Ο. Вго\уп. апб Ε.Μ. Μι1Εγ. Μ;ι!πχ те!а11орго!е1паке ехргекккп бигшд ехрептеп1а1 пеигкк. Вгат. 121. 481 (1998).
кепЬегд. О.А.. 8коепГе1б. Υ.. Μι-Ηι-ιω. ΜΕ.. ЯаисН. 1.. ЯекЫт. Μ.. 8к11аг. В.Ь. апб 8с11\уаг!х. Я.8. Лη!^-^NЛ апбЬобу 1бк1урек ίη кукктк 1ирик егу!11С1па!окик. Ьапсе!. 2. 417 (1984).
кепЬегд. Э.А. апб СоШпк. С. Оексбоп о£ сгокк-геасбуе 3116-0^ апбЬобу 1бк1урек о£ гепа1 бккие-Ьоипб 1ттипод1оЬи1тк 1гот 1ирик рабепк. 1. С1т. куск!. 76. 287 (1985).
Кеукхег. 6.. Ι. ЬатЬт. Я. №де1. С. Кеуккег. Μ. Кеуккег. Е. 6готпка-Ые. 1. Егапх. 6.Я. Вигтеккг. апб К. 1ипд. С1гси1абпд 1еуе1к о£ та!пх те!а11орго!етакек ΜΜΡ-3 апб ΜΜΡ-1. бккие шЫЬког о£ те!а11орго!етакек 1 ^ШРИ). апб ΜΜΡ-1/ΤIΜΡ-1 сотр1ех ίη гкеитабс бкеаке. Соггс1а!юп \νί!1ι сйшса1 асбубу о£ г11еита!о1б агНпбк уегкик о!1сг киггода!е тагкегк. 1. \Ак\\'1а!о1. 26. 251 (1999).
Ко!а)1та. Ь.. Ао!кика. 8.. Еирташ. Μ.. 0каνа-Τака!κи^^. Μ.. Ктоккка. Μ.. 8ит1уа. Μ. апб 0Ьа!а. К. Ιпсгеакеб 1схс1к о£ та!пх тс!а11орго!с1пакс-3 ίη кега £гот рабепк νί!1 асбуе 1ирик пербпбк. С1т. Ехр. Ябеит. 16: 409-415 (1998).
Ьш. Ζ.. 8Ыр1еу. Ι.Μ.. VII. Т.Н.. Ζ^ι.!. X.. Όιηζ. Ь.А.. АегЬ. Ζ. апб 8ешог. РМ. 6е1абпаке В-бебскп! тке аге гекк1ап1 !о ехребтеп1а1 Ьи11оик РетрЫдо1б. 1. Ехр. Μеб. 188: 475-482 (1998).
Μη^υη. Ι.. Ко!га. Ь.Р.. Еббтап. Я. апб ΜοЬаκЬе^у. 8. Μι!πχ те!а11орго!ешакск: к!гис!игек. еуо1ибоп апб бгуегкШсабоп. ЕакеЬ. 1. 12: 1075-1095 (1998).
Μеηб1ον^с. 8.. Вгоске. 8.. 81юспГс1б. Υ.. Веп-Вакка!. Μ.. ΜеκНο^е^. А.. Вактег. Я. апб Μοζеκ. Е. йбисбоп о£ а кук!етк 1ирик егу!11ета!окик-11кс бкеаке ίη тке Ьу а соттоп китап 3116-0^ 1бк1уре. Ргос. N111. Асаб. 8е1. И.8.А. 85. 2260 (1988).
Μеηб1ον^с. 8.. Епске. Н.. 8^π&16. Υ.. апб Μοζеκ. Е. Τке го1е о£ апб-1бю!урк апбЬобкк ίη Не шбисбоп о£ ехрептеп1а1 кук!етк 1ирик сгу!11ста!окик ίη тке. Еиг. 1. Iттиηο1. 19. 729 (1989).
Μοζеκ. Е.. Ьауап. Μ.. Ζ^πι-ιη. Е.. Вгоске. 8.. Ьк1Н. А. апб Рсс1!. Ι. Ьисс! Ьтбтд о£ а туак!11ста дгахк ге1а!еб еркоре !о Μ№ с1акк ΙΙ то1еси1ек оп 1Мпд шиппс апбдеп-ргекепбпд се11к. ЕΜВ0 1. 8. 4049 (1989).
Nакати^а. Т.. Ι. ЕЫИага. 8. 0каба. Τ. Τакакаκк^. Μ. Υашашοΐο. Υ. Τοш^ηο. апб Н. Ко1бе. 6епе ехргекккп о£ 1пе!а11орго!етакек апб !11еи 1пЬ1Ь1!ог ίη гепа1 бккие о£ №\ν Ζеа1аηб В1аск/\А1и!с Е1 тке. С1т. 8ск 85: 295-301 (1993).
- 31 009465
Охепск V., Ь. В1па1б1, Ν. Τе1евйονа, Ό. МаИ^кшк, Р. КМвак, М. КоиауепНо'хет апб Н. Ыпк. Ме(а11орго(етавев апб 1Пе1г Рввие 1пЫЬ11огв ш тиШр1е вскговк. 1. АШопптип. 12, 297 (1999).
Раетеп, Ь., О1ввоп, Т., 8обегв1гот, М., Vап Оатте, 1., апб Орбепаккег, С. Еνа1иаί^οп оГ декРпавев апб 1Ь-6 т (Не сегеЬговрта1 £1шб оГ рабепк \\а(Н ор11с пеипбв, тиШр1е вскговк апб о(Нег шПаттакгу пеиго1од1са1 бкеаве. Еиг. 1. №иго1. 1: 55-63 (1994).
8агеп, Р., Уе1див, Н.С., Кονапеп, Р.Т. ΊΝΕ-ο. апб ΙΗ-1 β ве1ес(Н'е1у шбисе ехргеввюп оГ 92-кЭа декРпаве Ьу 1штап тасгорНадев. 1. 1ттипо1. 157: 4159-65 (1996).
8еда1, В., Вегтав, В.Ь., Оауап, М. е( а1. Ктебсв оГ суЮкпче ргобисбоп т ехрептеп(а1 вув(етк 1ирив егу(Нета(овив: Игхокетеп( оГ Т Не1рег се11 1/Т Не1рег се11 2-(уре сукктев т бкеаве. 1. 1ттипо1. 158: 300916 (1997).
8Шпд1е1оп, ν.Ό. Нобдев, Ό.Ε, Впск, Р., апб Саетвкп, Т.Е. Со11адепавев: а кеу епхуте ш со11адеп (игпо\'ег. ВюсНет. Се11. Вю1. 74: 759-775 (1996).
8НоепГе1б, Υ., кепЬегд, О.А., Ваиск, 1., Мабаю, М.Р., 8(о11аг, ВГО., апб 8скетаг17, В.8. 1б1о!ур1с сговвгеасРоп оГ топос1опа1 Нитап 1ирив апРЬобкв. 1. Ехр. Меб. 158, 718 (1983).
8НоепЕе1б, Υ., Нви-Ьт, 8.С., СаЬпек, ЕЕ., 811Ьегвкш, Ь.Е., Еипе, В.С., Еипе, В., 8(о11аг, ВГО., апб 8сНтаг12, В.8. РгобисРоп оГ аи(оапРЬобкв Ьу Нитап-Нитап НуЬпботав. 1. С1т. бкевР 70: 205-208 (1982).
81боедег, ΖΜ., ТаПако^'вку, В., ВепШбкН, Ζ., апб Мохев, Е. Мопос1опа1 апРсагбюНрт апРЬобкв бегкеб Ггот тке \νί(1ι ехрептеп(а1 вув(етк 1ирив егу(Нета(овив: сНагас(епхаРоп апб (Не тбисРоп оГ а весопбагу апРрНоврНо1|р|б вупбготе. 1. С1ш. 1ттипо1. 13, 127 (1993).
Тап, Е.М., СоНеп, А.8., Е. Е1, Та1а1 Ν., \УтсНев(ег В.1. ТНе 1982 ге\авеб сп(егк Гог (Не с1аввШсабоп оГ вув(етк 1ирив егу(Нета(овив. Аг(Нг111в ВНеит. 25:1271-77 (1982)
ТНеоП1ороп1ов Ά.Ν., Ьа^воп, В.В. Титог песговк Гас(ог апб о(Нег су (ок ί пев т типпе 1ирив. Апп. ВНеит. Ок. 58 вирр1.: 149-55 (1999).
Лактат А., апб Мохев, Е. Vа^^аЬ1е гедюп весщепсев оГ аи(оапрЬобкв Ггот тке \νί(1ι ехрептеп(а1 вувктк 1ирив егу(Нета(овив. Еиг. 1. 1ттипо1. 23, 1566 (1993).
Лактат А., Мепб^к, 8., Етх, Р.Е, Ζ^пде^, Н., МевНогег, А., апб Мохев, Е. ТНе го1е оГ (Не 16/61б 1бю1уре пе(\\'огк ш (Не тбисРоп апб тат(св(аРопв оГ вув(етк 1ирив егу(Нета(овив. 1п1. 1ттипо1. 5, 1293 (1993).
Лактат А., 8НоепГе1б, Υ., В1апк, М., Етх, Р.1. апб Мохев, Е. ТНе раИодешс Нитап топос1опа1 апрОкА (На( шбисев ехрептеп(а1 вув(етк 1ирив егу(Нета(овив ш тке к епсобеб Ьу а V/ депе ведшей. 1п1. 1ттипо1. 1, 689 (1995).
Лактат А., Етх, Р.Е, 1вгае11, Е,. ЕНаР Е. Кошп-Уактап, 8., Ζ^пде^, Н., Оауап, М. апб Мохев, Е. Моби1абоп оГ тигте вув(етк 1ирив егу(Нета(овив \\1(Н рерРбев Ьавеб оп сотр1етеп1ап1у бекгтшшд гедюпв оГ а раШодешс апР-ОНА топос1опа1 апбЬобу. Ргос. Νη6. Асаб. 8ск И.8.А. 94, 4 620 (1997).
Уа11асе, С.В., В.А. УНккп, М.В. 81ап1огб, С.М.А. Уе11в, А.ЕН. Сеаппд, апб ЕМ. С1етепк. ТНе тарах те(а11орго(етаве шЫЬНог ВВ-1101 рпетепк ехрептеп(а1 аиЮпитипе и\'еогеРшРв (ЕАИ). СНп. Ехр. 1ттипо1. 118, 364 1999).
\УтсНев(ег ВЕ 8ув(етк 1ирив ег^-(Нета(овпв раИодепевк. 1п: Коортап У.Е, еб. ВигатдНат. А1аЬата: \УП1кт апб Убктв, рр.1361-91 (1996).
Ζυ^Ι^η 8. 1псгеавеб вегит в(готе1увт-1 1еуе1в т вув(етк 1ирив егу(Нета(овив: 1аск оГ согге1абоп \\а(Н бкеаве ас(На(у. 1. ВНеита(о1. 26, 78 (1999).
Claims (36)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Синтетический пептид, выбранный из группы, состоящей из:(a) пептида по крайней мере из 19 и максимально из 22 аминокислотных остатков, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 11 и 8ЕЦ ΙΌ NО: 19 или амида, или соли указанного пептида;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом либо непосредственно, либо через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (б) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю.
- 2. Синтетический пептид по п.1, выбранный из группы, состоящей из:(a) пептида, состоящего из последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 11;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два различных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом либо непосредственно, либо через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (б) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю.
- 3. Синтетический пептид по п.2, состоящий из пептида 8ЕЦ ΙΌ NО: 11.
- 4. Синтетический пептид по п.3, выбранный из пептидов, состоящих из последовательностей 8ЕЦΙΌ 12 - 81%) ΙΌ 18.
- 5. Пептид, состоящий из последовательности 8Е% ΙΌ NО: 6, или его соль.- 32 009465
- 6. Пептид по п.5, состоящий из пептида 8Еф ГО N0: 6, амидированного на С-конце.
- 7. Синтетический пептид по п.1, выбранный из группы, состоящей из:(a) пептида, состоящего из 8Еф ΙΌ N0: 19;(b) двойного синтетического пептида, содержащего два разных типа указанного пептида (а), ковалентно связанных друг с другом либо непосредственно, либо через короткую связующую цепь;(c) пептидного полимера, содержащего множество последовательностей указанного пептида (а); и (ά) пептида (а) или пептидного полимера (с), присоединенного к макромолекулярному носителю.
- 8. Синтетический пептид по п.7, состоящий из 8Еф ГО N0: 19.
- 9. Синтетический пептид по п.7, выбранный из пептидов, состоящих из последовательностей 8Еф ГО N0: 20 - 8ЕО ГО N0: 27.
- 10. Пептид, состоящий из последовательности 8Еф ГО N0: 7, или его соль.
- 11. Пептид по п.10, состоящий из пептида 8Еф ГО N0: 7, амидированного на С-конце.
- 12. Двойной синтетический пептид по п.1, где пептид по п.3 ковалентно связан с пептидом по п.8 либо непосредственно, либо через короткую связующую цепь.
- 13. Двойной синтетический пептид по п.10, в котором пептид 8Еф ГО N0: 11 ковалентно связан непосредственно с пептидом 8Еф ГО N0: 19.
- 14. Двойной синтетический пептид, где пептид 8Еф ГО N0: 6 ковалентно связан с пептидом 8Еф ГО N0: 7.
- 15. Пептидный полимер по п.1, который содержит множество идентичных последовательностей, выбранных из последовательностей 8Еф ГО N0: 6, 7 и 11-27.
- 16. Фармацевтическая композиция, содержащая по крайней мере один синтетический пептид или пептидный полимер по любому одному из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 17. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид последовательности 8Еф ГО N0: 6 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 18. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид последовательности 8Еф ГО N0: 6, амидированный на С-конце, и фармацевтически приемлемый носитель.
- 19. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид последовательности 8Еф ГО N0: 7 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 20. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид последовательности 8Еф ГО N0: 7, амидированный на С-конце, и фармацевтически приемлемый носитель.
- 21. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп.16-20 для лечения системной красной волчанки.
- 22. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп.16-21, адаптированная для перорального, внутривенного, подкожного, внутрисуставного, внутримышечного, ингаляционного, интраназального, подоболочечного, внутрибрюшинного, внутрикожного, чрезкожного или энтерального введения.
- 23. Фармацевтическая композиция по п.22 для интраназального введения.
- 24. Применение пептида или пептидного полимера или его соли по любому из пп.1-15 для получения фармацевтической композиции для лечения системной красной волчанки (8ЬЕ).
- 25. Применение по п.24 пептида 8Еф ГО N0: 6 или его соли, необязательно амидированного на Сконце.
- 26. Применение по п.24 пептида 8Еф ГО N0: 7 или его соли, необязательно амидированного на Сконце.
- 27. Применение пептида или пептидного полимера по любому из пп.1-15 для получения фармацевтической композиции для лечения системной красной волчанки (8ЬЕ) путем иммуномодулирования 8ЬЕ-связанного ответа у пациента с 8ЬЕ.
- 28. Применение по п.27, где иммуномодуляция включает ингибирование уровней активности матриксной металлопротеиназы ММР-3 и/или ММР-9 у пациентов с 8ЬЕ.
- 29. Применение по п.27, где иммуномодуляция касается уровней активностей цитокинов у пациентов с 8ЬЕ.
- 30. Применение по п.29, где иммуномодулирование включает ингибирование уровней активности ΙΕ-2 и/или ΙΕ^γ у пациентов с 8ЬЕ.
- 31. Применение по п.29, где иммуномодуляция включает активацию уровней активностей ТСЕ-β у пациентов с 8ЬЕ.
- 32. Применение по любому из пп.27-31, где пептид состоит из 8Еф ГО N0: 6.
- 33. Применение по любому из пп.27-31, где пептид состоит из 8Еф ГО N0: 7.
- 34. Способ оценки эффективности лекарственного средства, содержащего пептид или пептидный полимер по любому из пп.1-15, при лечении больного 8ЬЕ, включающий определение в различные интервалы времени уровней ММР-3 и/или ММР-9 в образцах крови указанного больного, получающего лечение указанным лекарственным средством, при этом сниженный уровень ММР-3 и/или ММР-9 коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
- 35. Способ оценки эффективности лекарственного средства, содержащего пептид или пептидный- 33 009465 полимер по любому из пп.1-15, при лечении больного 8ЬЕ, который включает определение в различные интервалы времени уровней ΙΕ-2 и/или №N-7 в образцах крови указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, при этом сниженный уровень 1Ь-2 и/или №N-7 коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
- 36. Способ оценки эффективности лекарственного средства, содержащего пептид или пептидный полимер по любому из пп.1-15, при лечении больного 8ЬЕ, который включает определение в различные интервалы времени уровней ТСЕ-β в образцах крови, полученных от указанного больного, которого лечат указанным лекарственным средством, при этом повышенный уровень ТСЕ-β коррелирует с эффективностью лекарственного средства.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL14164701A IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| PCT/IL2002/000148 WO2002067848A2 (en) | 2001-02-26 | 2002-02-26 | PEPTIDES FROM THE 16/6id ANTIBODY FOR TREATING SLE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200300939A1 EA200300939A1 (ru) | 2004-12-30 |
| EA009465B1 true EA009465B1 (ru) | 2007-12-28 |
Family
ID=11075174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200300939A EA009465B1 (ru) | 2001-02-26 | 2002-02-26 | Синтетические пептиды человека и фармацевтические композиции, содержащие их, для лечения системной красной волчанки |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040127408A1 (ru) |
| EP (1) | EP1370575B1 (ru) |
| JP (1) | JP4316886B2 (ru) |
| KR (1) | KR100860735B1 (ru) |
| CN (1) | CN1309733C (ru) |
| AT (1) | ATE346094T1 (ru) |
| AU (1) | AU2002233618B2 (ru) |
| BR (1) | BR0207586A (ru) |
| CA (1) | CA2439051C (ru) |
| CR (1) | CR7058A (ru) |
| CU (1) | CU23276B7 (ru) |
| DE (1) | DE60216243T2 (ru) |
| DK (1) | DK1370575T3 (ru) |
| EA (1) | EA009465B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP034743A (ru) |
| ES (1) | ES2275832T3 (ru) |
| HK (1) | HK1059790A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20030667A2 (ru) |
| HU (1) | HU230372B1 (ru) |
| IL (3) | IL141647A0 (ru) |
| IS (1) | IS6908A (ru) |
| MX (1) | MXPA03007622A (ru) |
| NO (1) | NO331820B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ527499A (ru) |
| PL (1) | PL373520A1 (ru) |
| PT (1) | PT1370575E (ru) |
| SI (1) | SI1370575T1 (ru) |
| WO (1) | WO2002067848A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200305874B (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002033377A2 (en) * | 2000-09-20 | 2002-04-25 | Surromed, Inc. | Biological markers for evaluating therapeutic treatment of inflammatory and autoimmune disorders |
| IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| US7294687B2 (en) * | 2003-01-14 | 2007-11-13 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Parenteral formulations of a peptide for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| AU2004206842A1 (en) * | 2003-01-14 | 2004-08-05 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Parenteral formulations of peptides for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| KR101135244B1 (ko) | 2007-11-29 | 2012-04-24 | 한미사이언스 주식회사 | 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물 |
| US8263084B2 (en) * | 2003-11-13 | 2012-09-11 | Hanmi Science Co., Ltd | Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate |
| WO2008144041A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | The Ohio State University Research Foundation | Hepcidins as biomarkers for impending lupus nephritis flare |
| JP2009019027A (ja) | 2007-07-16 | 2009-01-29 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体 |
| KR20140088837A (ko) | 2013-01-03 | 2014-07-11 | 한미약품 주식회사 | Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 |
| US10316075B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-11 | Oregon Health & Science University | Recombinant polypeptides comprising MHC class II α1 domains |
| CN110139659B (zh) * | 2017-01-05 | 2023-07-28 | 耶达研究及发展有限公司 | 用于治疗干燥综合征的肽 |
| CN112143707A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-29 | 广东先康达生物科技有限公司 | 一种治疗自身免疫细胞的免疫细胞及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030057A1 (en) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| RU2127599C1 (ru) * | 1994-06-08 | 1999-03-20 | Ниармедик, Лтд. | Композиция для профилактики и лечения спида, или системной красной волчанки, или связанных с ними нарушений |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US127408A (en) * | 1872-06-04 | Improvement in tooth-powders or dentifrices | ||
| US8634A (en) * | 1852-01-06 | Wool-pickina machine | ||
| JPS60184098A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Suntory Ltd | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| US6407079B1 (en) * | 1985-07-03 | 2002-06-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Pharmaceutical compositions containing drugs which are instable or sparingly soluble in water and methods for their preparation |
| US5997856A (en) * | 1988-10-05 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins |
| US5126249A (en) | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US6066621A (en) * | 1989-12-10 | 2000-05-23 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides for the treatment of myasthenia gravis |
| IL92629A0 (en) * | 1989-12-10 | 1990-08-31 | Yeda Res & Dev | Direct binding of t-cell epitopes to mhc gene products on intact living antigen presenting cells and the use thereof for identifying epitopes causing autoimmune diseases and pharmaceutical compositions for treating such diseases |
| US5376645A (en) | 1990-01-23 | 1994-12-27 | University Of Kansas | Derivatives of cyclodextrins exhibiting enhanced aqueous solubility and the use thereof |
| KR0166088B1 (ko) | 1990-01-23 | 1999-01-15 | . | 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도 |
| GB9017008D0 (en) | 1990-08-02 | 1990-09-19 | Erba Carlo Spa | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor |
| US6096878A (en) * | 1993-05-10 | 2000-08-01 | Japan Tobacco Inc. | Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same |
| US5646131A (en) * | 1994-02-22 | 1997-07-08 | The Arab Company For Drug Industries And Medical Applicances (Acdima) | Method for solubilizing drugs using cyclodextrins and carboxylic acids |
| US6613536B1 (en) | 1995-03-28 | 2003-09-02 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| US20020054872A1 (en) | 1997-03-20 | 2002-05-09 | Yaakov Naparstek | Peptides for the treatment of systemic lupus erythematosus and methods of treating systemic lupus erythematosus |
| IL120503A0 (en) | 1997-03-20 | 1997-07-13 | Hadasit Med Res Service | Peptides for the treatment of systemic lupus erythematosis and pharmaceutical compositions containing them |
| WO1999031066A1 (en) * | 1997-12-18 | 1999-06-24 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Pyridones as src family sh2 domain inhibitors |
| KR100261262B1 (ko) * | 1998-02-03 | 2000-08-01 | 윤종용 | 반도체 습식 설비의 구조 및 이의 로트 로딩/언로딩 방법 |
| US6415877B1 (en) * | 1998-07-15 | 2002-07-09 | Deep Vision Llc | Subsea wellbore drilling system for reducing bottom hole pressure |
| AU2002220265A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-15 | University Of Vermont And State Agricultural College | Compositions for inhibiting grb7 |
| IL141647A0 (en) | 2001-02-26 | 2002-03-10 | Yeda Res & Dev | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| AU2004206842A1 (en) | 2003-01-14 | 2004-08-05 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Parenteral formulations of peptides for the treatment of systemic lupus erythematosus |
| US7294687B2 (en) | 2003-01-14 | 2007-11-13 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Parenteral formulations of a peptide for the treatment of systemic lupus erythematosus |
-
2001
- 2001-02-26 IL IL14164701A patent/IL141647A0/xx unknown
-
2002
- 2002-02-26 SI SI200230463T patent/SI1370575T1/sl unknown
- 2002-02-26 AU AU2002233618A patent/AU2002233618B2/en not_active Expired
- 2002-02-26 DK DK02700553T patent/DK1370575T3/da active
- 2002-02-26 US US10/468,924 patent/US20040127408A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-26 DE DE60216243T patent/DE60216243T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 CA CA002439051A patent/CA2439051C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 ES ES02700553T patent/ES2275832T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 IL IL15755002A patent/IL157550A0/xx unknown
- 2002-02-26 WO PCT/IL2002/000148 patent/WO2002067848A2/en active Search and Examination
- 2002-02-26 AT AT02700553T patent/ATE346094T1/de active
- 2002-02-26 BR BRPI0207586-5A patent/BR0207586A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-26 EP EP02700553A patent/EP1370575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-26 CN CNB028087127A patent/CN1309733C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-26 HU HU0600778A patent/HU230372B1/hu unknown
- 2002-02-26 PL PL02373520A patent/PL373520A1/xx unknown
- 2002-02-26 EA EA200300939A patent/EA009465B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-26 NZ NZ527499A patent/NZ527499A/xx unknown
- 2002-02-26 MX MXPA03007622A patent/MXPA03007622A/es active IP Right Grant
- 2002-02-26 KR KR1020037011235A patent/KR100860735B1/ko active IP Right Grant
- 2002-02-26 PT PT02700553T patent/PT1370575E/pt unknown
- 2002-02-26 JP JP2002567220A patent/JP4316886B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-07-30 ZA ZA2003/05874A patent/ZA200305874B/en unknown
- 2003-08-11 IS IS6908A patent/IS6908A/is unknown
- 2003-08-20 CU CU20030184A patent/CU23276B7/es not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 NO NO20033718A patent/NO331820B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-22 CR CR7058A patent/CR7058A/es unknown
- 2003-08-22 EC EC2003004743A patent/ECSP034743A/es unknown
- 2003-08-22 HR HR20030667A patent/HRP20030667A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2003-08-24 IL IL157550A patent/IL157550A/en active IP Right Grant
-
2004
- 2004-04-14 HK HK04102596A patent/HK1059790A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-20 US US11/894,472 patent/US7858738B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2127599C1 (ru) * | 1994-06-08 | 1999-03-20 | Ниармедик, Лтд. | Композиция для профилактики и лечения спида, или системной красной волчанки, или связанных с ними нарушений |
| WO1996030057A1 (en) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EILATERAN. The mechanism by which a peptide based on complementarity-determining region-1 of a pathogenic anti-DNA auto-Ab ameliorates experimental systemic lupus crythematosus. Procceding of the national Academy of sciences of the USA, 2001, 98 (3), 1148-1153. Chem. abstr., ACS STN, No 134:265053. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2739505T3 (es) | Anticuerpos contra la metaloproteinasa 9 de la matriz | |
| AU2017216508B2 (en) | Antibodies to matrix metalloproteinase 9 | |
| US7858738B2 (en) | Synthetic human peptides and pharmaceutical compositions comprising them for the treatment of systemic lupus erythematosus | |
| EP3539984A1 (en) | Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r) | |
| BRPI0906550B1 (pt) | Anticorpo anti-tigit, usos de um anticorpo anti-tigit e métodos in vitro para estimular a interação de cd226-pvr e/ou a interação de cd96-pvr, para aumentar ou estimular a proliferação de uma célula t ou a liberação de citocinas proinflamatórias por uma célula dendrítica, para aumentar ou estimular a resposta imune de célula t e para aumentar ou estimular a produção de citocinas proinflamatórias por uma célula dendrítica | |
| BR112019018950A2 (pt) | métodos para tratamento de doenças e distúrbios mediados por complemento | |
| EA025245B1 (ru) | Антитела против cd100 и способы их применения | |
| PT2625199T (pt) | Métodos de tratamento de psoríase usando antagonistas de il-17 | |
| BR112020006434A2 (pt) | anticorpos anti-transtirretina | |
| KR20120105429A (ko) | 염증 치료 방법 | |
| US20220144965A1 (en) | Anti-cd38 antibodies and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of autoantibody-mediated autoimmune disease | |
| AU2002233618A1 (en) | Peptides from the 16/6Id antibody for treating SLE | |
| CA2650718A1 (en) | Methods for the treatment of muscular dystrophy associated with dysferlin-deficiency | |
| TW201506039A (zh) | 新穎抗人類ｔｗｅａｋ抗體 | |
| CN118525034A (zh) | 犬白介素-31受体αI的犬源化抗体 | |
| JP2019089840A (ja) | コロニー刺激因子１受容体（ｃｓｆ１ｒ）を結合させる抗体を用いて状態を治療する方法 | |
| OA19469A (en) | Compositions and methods of inhibiting MASP-3 for the treatment of various deseases and disorders. | |
| JP2017125040A (ja) | コロニー刺激因子１受容体（ｃｓｆ１ｒ）を結合させる抗体を用いて状態を治療する方法 | |
| US20130089496A1 (en) | Tumor targeted antibodies and method for using the same | |
| BR112016029734B1 (pt) | Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste e uso do mesmo, composição farmacêutica e método para detecção de níveis de expressão de il-21 em uma amostra |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MK4A | Patent expired |
Designated state(s): RU |