KR100860735B1 - ＳＬＥ 치료용의 16/6ｉｄ 항체 유래의 펩티드 - Google Patents

ＳＬＥ 치료용의 16/6ｉｄ 항체 유래의 펩티드 Download PDF

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Abstract

인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체의 중사슬 또는 경사슬에서 발견되는 상보성결정구역(CDR)로 구성되는 또는 내에서 발견되는 서열 또는: 상기 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 및/또는 결실 및/또는 부가로 수득된 서열을 포함하는 12 내지 30 개의 아미노산 잔기의 합성 펩티드, 또는 이의 염 또는 화학적 유도체는 전신성 홍반성 루푸스 관련 반응의 면역조절에 사용할 수 있다.

Description

ＳＬＥ 치료용의 16/6ｉｄ 항체 유래의 펩티드{PEPTIDES FROM THE 16/6id ANTIBODY FOR TREATING SLE}
본 발명은 합성 펩티드, 좀더 구체적으로는, 인간 모노클로날 항-DNA 항체의 상보성결정지역 (CDR) 기재의 합성 펩티드, 이를 함유한 약학적 조성물 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)-관련 반응의 면역조절에서 이들의 용도에 관한 것이다.
약 어: 16/6Id: 인간 16/6Id mAb; CDR: 상보성결정지역; CFA: 완전 프로인트 보조액; hCDR 펩티드: 인간 16/6Id mAb 의 CDR 영역기재의 펩티드; hCDR1: 서열 번호 6 의 인간 펩티드; hCDR3: 서열 번호 7 의 인간 펩티드; 인간 16/6Id mAb: 16/6Id 를 보유한 인간 병원성 항-DNA mAb; ICD: 면역 복합체 침전물; Id: 이디오타입; LNC: 림프절 세포; mAb: 모노클로날 항체; MMP: 매트릭스 메탈로프로틴아제; mCDR1: 서열 번호 1 의 쥐과 펩티드; mCDR3: 서열 번호 3 의 쥐과 펩티드; PBL: 말초혈액 림프구; PBS: 포스페이트-완충 식염수; rev: 역방향 펩티드; SLE: 전신성 홍반성 루푸스; SLEDAI: SLE 질환 활성 지수; TGF-β: 전환성장인자-β; UT: 비처리.
전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 는 DNA 에 대한 항체, 핵 항원에 대한 항체 및 리보뉴클레오단백질에 대한 자가 항체를 포함한 일련의 항체의 존재를 특징으로 하 는 자가면역질환이다. 상기 질환의 진행은 면역 복합체의 침전에 의해 유발되는 조직 및 기관에 대한 손실 및 일반적 임상 증상과 관련이 있다. 기타 자가면역 증상과 유사하게, SLE 의 병인은 유전, 환경, 호르몬 및 면역학적 인자를 수반하는 다인자적이다. SLE 의 예방 또는 치유를 목적으로 하는 특정의 치료법은 없다.
16/6Id 로 불리우는 인간 모노클로날 항-DNA 항체는 공통의 이디오타입을 보유한다 (Shoenfeld 등, 1983). 상기 이디오타입은 SLE 환자에서 임상적 관련을 갖음이 발견되었다. 따라서, 16/6Id 는 활성질환을 가진 SLE 환자의 54% 의 항-DNA 항체 (Isenberg 등, 1984) 및 SLE 환자의 환부 기관 (Isenberg 및 Collins, 1985)에서 발현됨이 발견되었다. 임의의 자발적 자가면역 질환을 발생시키지 않는 근교계의 마우스를 상기 인간 항-DNA 16/6Id mAb 로 면역화시키고, 상기 질환에 대한 인간 및 자발적 쥐과 모델에서의 SLE 의 주 특징을 발생시켰다 (Mendlovic 등, 1988). 따라서, 면역화후, 마우스는 16/6Id 에 특이적인 항체, 16/6Id 를 보유한 항체 및 상이한 핵항원 (dsDNA, ssDNA, Sm, 리보뉴클레오단배질, Ro, La 및 기타)에 대한 항체를 생산하였다. 혈청학적 발견은 백혈구감소증, 증가된 적혈구침강속도, 단백뇨, 신장내 면역 복합체의 풍부 및 사구체의 경화증과 관련이 있었으며 (Mendlovic 등, 1988), 이는 SLE 의 전형적인 증상이다.
실험적 SLE 에 걸린 마우스로부터 유도된 쥐과 항-16/6Id mAb (Ab2) 는 또한 16/6Id (Ab1)와 유사한 마우스에서 실험적 질환 (Mendlovic 등, 1989)을 유도할 수 있었다. 더욱이, 16/6Id 을 발현시키는 쥐과 항-DNA mAb 를 실험적 SLE 에 걸린 마우스로부터 제조하였다. 5G12 로 명명된 항체 Ab3 는 16/6Id 에 특이적인 항 체와 반응하였다. 후자의 항체에 의한 면역화는 인간 16/6Id (Abl) 및 쥐과 항-16/6Id (Ab2) mAbs 로 면역화후 관찰되는 것과 유사한 증상을 가진 실험적 SLE 의 유도를 가져왔다 (Waisman 등, 1993). 이러한 결과는 마우스에서 SLE 의 유도 및 진행에서 16/6Id 네트워크의 중요성을 보여준다.
SLE 와 관련된 자가항체의 발생의 메카니즘을 이해하기 위하여, 본 발명자는 실험적 SLE 이 유도된 C3H.SW 마우스로부터 유도된 다양한 모노클로날 자가항체를 생산하였다. 대체로, 16/6Id 를 보유하거나 이와 반응하는 항체를 유도할 수 있는 모노클로날 자가항체는 병원성인 것으로 밝혀졌고, 따라서 마우스에서 실험적 SLE 를 유도할 수 있다 (Fricke 등, 1990; Sthoeger 등, 1993).
이후, 실험적 SLE 에 걸린 C3H.SW 마우스로부터 분리된, DNA 또는 HeLa 핵 추출물 (NE)에 결합하는 9 개의 자가항체의 가변 (V) 영역을 서열분석하였다 (Waisman 및 Mozes, 1993). 상이한 특이성을 가진 모노클로날 항체를 상이한 자가항체 사이의 연관을 측정하고자 분석하였다. 3 개의 mAb 가 DNA 에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 병원성 항-DNA 항체의 서열 특성을 보이는 것으로 밝혀졌다. 2C4C2 로 명명된, 이러한 mAb 중의 하나는 다른 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스, 즉, (NZB x NZW)F1 로부터 분리된 항-DNA mAb 의 VH 와 동일한 중(H) 사슬 V 영역 유전자 (VH) 를 사용하는 것으로 밝혀졌다. mAb 2C4C2 의 경(L)사슬 V 영역 유전자 (VL) 은 또한 (NZB x NZW)F1 마우스로부터 분리된, 또 하나의 항-DNA mAb 의 VL 과 98% 상동적이다. 5G12-4 및 5G12-6 로 명명된 다른 2 개의 항-DNA mAb 는 mAb 2C4C2 의 것과 이들의 VH 서열을 93% 공유한다. 상기 mAb 의 분석을 기초로 할 때, 실험적 SLE 마우스에서 발견되는 자가항체는 루푸스를 자연 발생시키는 마우스 계로부터 분리된 mAb 에 의해 사용되는 것과 유사한 유전적 원소를 사용하는 것으로 보인다.
T 세포는 실험적 SLE 의 유도 및 발생에서 중요한 역활을 수행한다. 따라서, 16/6Id 에 특이적인 T 세포주 및 클론은 16/6Id 항체에 유사한 동족 수용자에서 실험적 SLE 를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 주의 활성화 세포의 접종후, 마우스는 SLE 에 전형적인 혈청학 및 신장 손실 모두를 발생시켰다 (Fricke 등, 1991).
전술한 바와 같이, 실험적 SLE 마우스로부터 분리되고, DNA 에 결합하며, 16/6Id를 보유하는 것으로 밝혀진 mAb 5G12 는 마우스에서 실험적 SLE 를 유도할 수 있다 (Waisman 등, 1993). 증식에 의해서 mAb 에 특이적으로 반응하는 T 세포는 아마도 이들의 상보성결정구역(CDR)유래의 서열을 나타내는 펩티드와 반응할 것이다. T 세포는 동일한 불변영역을 보유하나 상이한 특이성을 갖는 다른 항체와 반응하지 않기 때문에 상기 항체의 V 영역을 인식하기 매우 쉬울 것이다. 가변 영역내에서, 인식되어질 가장 높은 가능성을 가진 영역은 CDR 이며, 이는 이것이 다양한 항체 사이에서 가장 상이한 영역이기 때문이다. 마우스에서 SLE 를 유도하는 전술한 9 개의 병원성 쥐과 mAb 의 VH 서열의 CDR 영역은 와이즈만 및 모제즈 (Waisman 및 Mozes, 1993)의 도 1 의 박스로 나타내었으며, 여기에서 9 개의 mAb 의 가변성 중사슬 (VH) 에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 유추된 아미노산 서열이 제시되어 있다.
본 출원인의 국제 PCT 특허 공보 No.WO 96/30057 에는 실험적 SLE 마우스로부터 분리된 병원성 mAb 의 CDR 영역 기재의 펩티드, 특히, 5G12 로 명명된 쥐과 mAb 의 VH 사슬의, 각각, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 기재로 한 펩티드 Ia 내지 IIIa, 및 2C4C2 로 명명된 쥐과 mAb 의 VH 사슬의, 각각, CDR1 및 CDR3 영역 기재의 펩티드 IVa 및 Va 가 기재되어 있다. 이러한 펩티드는 실제적으로 하기와 같이 서열 번호 1 내지 서열 번호 5 로 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다:
TGYYMQWVKQSPEKSLEWIG (Ia) [서열 번호 1]
EINPSTGGTTYNQKFKAKAT (IIa) [서열 번호 2]
YYCARFLWEPYAMDYWGQGS (IIIa) [서열 번호 3]
GYNMNWVKQSHGKSLEWIG (IVa) [서열 번호 4]
YYCARSGRYGNYWGQTL (Va) [서열 번호 5]
상기 펩티드, 특히, mCDR1 [서열 번호 1] 및 mCDR3 [서열 번호 3]으로 각각 명명된, 펩티드 Ia 및 IIIa 는 PBS 에 투여하는 경우, 쥐과 또는 인간 기원의 적당한 mCDR 펩티드 또는 전체 항-DNA 16/6Id mAb (Waisman 등, 1997)에 대한 T 세포 감작을 억제할 수 있음이 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 펩티드 mCDR1 및 mCDR3 는 인간 항-DNA 16/6Id mAb 에 의해서 유도되거나 또는 SLE 에 걸리기 쉬운 마우스 (NZB x NZW) F1 또는 MRL/lpr/lpr (Eilat 등, 2000 및 2001) 에서 자연 발생하는 구축된 SLE 를 예방 또는 치료함을 본 발명자에 의해서 추가적으로 밝혀졌다.
발명의 개요
인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체의 CDR 기재의 펩티드는 SLE-관련 반응을 면역조절할 수 있음이 본 발명에 의해서 현재 발견되었다. 따라서, 인간 16/6Id 의 CDR1 및 CDR3 기재의 펩티드를 시험한 결과 쥐과 펩티드 mCDR 1 (서열 번호 1) 및 mCDR3 (서열 번호 3) 또는 전체 인간 항-DNA 16/6Id mAb 로 면역화된 마우스의 림프절 세포 증식을 억제시키고, SLE 환자의 말초혈액 림프구 (PBL) 의 인간 항-DNA 16/6Id mAb 에 대한 증식 반응을 억제하며, 자연적 또는 실험적 SLE 에 걸린 마우스의 병 증상을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
이러한 발견은 병원성 자가항체의 모든 CDR 이 환자의 T 세포에 의해서 동등하게 인식되지 않기 때문에 완전히 기대밖이다. 본 발명자의 실험에서 앞서 밝힌 바와 같이 (Dayan 등, 2000), 항-DNA 자가항체 2C4C2 의 CDR 은 항-DNA 항체 5G12 의 CDR 기재의 펩티드보다 SLE 환자의 T 세포에 의해서 덜 잘 인식되어진다. 더욱이, 전술한 WO 96/30057 에 기재된 쥐과 자가항체의 CDR 기재의 펩티드의 많은 상동체는 이들의 억제 효과에서 효과적이지 않음이 밝혀졌고, 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-DNA 항체의 CDR 기재의 펩티드의 서열에서 발생하는 변형이 효과적인지 예견 또는 시사할 수 없었다. 또한, 인간 항체 기재의 펩티드의 사용은 비인간 항체 기재의 펩티드와 비교하여 인간 용도에 바람직한 것으로 여겨져야 한다.
따라서, 본 발명은 하나의 양태로서, 하기로 이루어진 군으로 부터 선택된 합성 펩티드에 관한 것이다 :
(a) 인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체의 중사슬 또는 경사슬에서 발견되는 상보성결정구역(CDR)으로 이루어진 또는 내에서 발견되는 서열 (이하“hCDR 서열”), 또는: (1) 상이한 아미노산 잔기에 의한 hCDR 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; (ii) hCDR 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실; 및/또는 (iii) hCDR 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득된 서열을 포함하는 12 내지 30 개의 아미노산 잔기의 펩티드, 또는 이의 염 또는 화학적 유도체;
(b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 (a) 의 상기 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
(c) (a) 의 상기 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
(d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
본원에서 “인간 16/6Id mAb”로 지칭되는, 인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체는 마우스에서 SLE 류 질환을 유도할 수 있는 병원성 인간 모노클로날 항-DNA 항체이다.
전술한 바와 같이 hCDR 서열을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드는 본원에서 “hCDR 펩티드”로 지칭된다.
하나의 바람직한 구현예로서, hCDR 펩티드는, 하기와 같이, 실제적으로 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 7 로 나타낸 바와 같은 서열을 갖는, 본원에서 hCDR1 및 hCDR3 로 명명된 펩티드와 같은(이에만 국한되지 않음) 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR, 좀더 바람직하게는 CDR1 또는 CDR3 의 서열을 포함한다 :
GYYWSWIRQPPGKGEEWIG [서열 번호 6]
YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV [서열 번호 7]
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 합성 펩티드 또는 펩티드 중합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 SLE 환자에서 특히 SLE 관련 반응의 조절, 예컨대, MMP-3 및/또는 MMP-9, 및/또는 IL-2 및/또는 IFN- γ활성의 수준을 하향조절, 또는 TGF-β활성의 수준을 상향조절하여 SLE 의 치료 및 이 질환의 임상적 증상의 개선에 특히 유용하다.
추가의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 중합체를 유효량으로 SLE 환자에게 투여하는 것을 포함하는 SLE 의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 중합체를 유효량으로 SLE 환자에게 투여하는 것을 포함하는, SLE 환자에서 SLE 관련 반응의 면역 조절, 예컨대, MMP-3 및/또는 MMP-9, 및/또는 IL-2 및/또는 IFN- γ 활성의 수준을 하향조절, 또는 TGF-β활성의 수준을 상향조절하는 면역조절 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 약물로 처리된 환자에서 수득한 혈액 시료내 MMP-3 및/또는 MMP-9 의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여, MMP-3 및/또는 MMP-9 의 감소수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 SLE 환자의 치료에서 약물의 효과의 평가 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 약물로 처리된 환자에서 수득한 혈액 시료내 IL-2 및/또는 IFN- γ의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여, IL-2 및/또는 IFN- γ의 감소수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 SLE 환자의 치료에서 약물의 효과의 평가 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 약물로 처리된 환자에서 수득한 혈액 시료내 TGF-β의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여 TGF-β의 증가수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 SLE 환자의 치료에서 약물의 효과의 평가 방법에 관한 것이다.
효과가 상기의 임의의 방법에 따라 평가되는 약물은, 예컨대, 본 발명에 따른 펩티드 또는 전술한 WO 96/30057 에 기재된 바와 같은 쥐과 펩티드 일 수 있으며, 그러나 이에만 국한되지 않는다.
도 1 은 300 ㎍ hCDR1 의 처리에 의한, 다양한 농도의 16/6Id mAb (0.1-10 ㎍/웰)에 대한, 인간 16/6Id mAb 로 면역화된 마우스의 림프절 세포의 증식 반응의 억제를 보여준다.
도 2 는 50 ㎍ hCDR1 의 처리에 의한, 다양한 농도의 16/6Id mAb (0.1-10 ㎍/웰)에 대한, 인간 16/6Id mAb 로 면역화된 마우스의 림프절 세포의 증식 반응의 억제를 보여준다.
도 3A-C 는 인간 16/6Id mAb 로 면역화 및 hCDR1 로 처리 또는 무관한 펩티드 p259-271 로 처리된 BALB/c 마우스에서의 시토카인 패턴을 보여준다. 도 3A-IFN-γ패턴; 도 3B -TGF-β패턴: 도 3C-IL-10 패턴.
삭제
도 4 는 SLE 환자 및 건강한 대조군의 PBL 의 최적 자극에 필요한 인간 항- DNA 16/6Id mAb 의 농도를 보여준다. PBL 은 다양한 농도 (0.1-40 ㎍/웰)의 16/6Id mAb 로 자극하였다. 최고의 자극 지수를 산출하는 농도를 증식 반응을 촉발시키기에 최적인 것으로 정하였다.
도 5 는 hCDR1 또는 hCDR3 의 존재 또는 부재에서 분열촉진인자(mitogen) 피토헤마글루티닌 (PHA)로 자극된 한 명의 SLE 환자로부터의 PBL 의 증식을 보여준다.
도 6 은 인간 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 또는 쥐과 펩티드 mCDR3 의 존재 또는 부재에서 인간 16/6Id mAb 로 자극된 한 명의 SLE 환자로부터의 PBL 의 증식을 보여준다.
도 7 은 인간 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 또는 쥐과 역방향 펩티드 revmCDR1 및 revmCDR3 의 존재 또는 부재에서 인간 16/6Id mAb 로 자극된 한 명의 SLE 환자로부터의 PBL 의 증식을 보여준다.
도 8 은 hCDR1 또는 hCDR3 의 존재 또는 부재하 인간 16/6Id mAb 로 촉발된 SLE 환자의 PBL 에서 IL-2 분비의 억제를 보여준다.
도 9 는 hCDR1 또는 hCDR3 의 존재 또는 부재하 인간 16/6Id mAb 로 자극된 한명의 대표적 SLE 환자의 PBL 에서의 TGF-β분비의 상향조절을 보여준다.
도 10 은 300 ㎍ hCDR1 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 (대조군으로 사용) 로 처리 또는 비처리된 (NZB x NZW)F1 마우스에서 항-DNA 자가항체 수준을 보여준다.
도 11A-11D 는 5½월령부터 시작하여 PBS (11A, 11B) 또는 100 ㎍ hCDR1 (11C, 11D) 로 처리한 SLE 에 걸리기 쉬운 (NZB x NZW)F1 마우스의 대표적 신장 절편을 보여주는 사진이다. 상기 절편은 9 월령의 죽은 마우스의 것이다. Ig 침전물의 검출을 위하여, 절편을 FITC-공액 염소 항-마우스 IgG (γ사슬 특이적)와 함께 인큐베이션시켰다 (11A, 11C x 100; 11B, 11D x 400).
도 12A-12F 는 PBS (12A, 12B) 또는 300㎍ hCDR1 (12C, 12D), 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 (12E, 12F)로 처리한 SLE 에 걸리기 쉬운 (NZB x NZW)F1 마우스의 대표적 신장 절편을 보여주는 사진이다. 상기 절편은 9 월령의 죽은 마우스의 것이다. 면역 복합체 Ig 침전물의 검출을 위하여, 절편을 FITC-공액 염소 항-마우스 IgG (γ사슬 특이적)와 함께 인큐베이션시켰다 (12A, 12C, 12E x 100; 12B, 12D, 12F x 400).
도 13A-13C 는 hCDR1 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 로 처리 또는 비처리된 SLE 에 걸리기 쉬운 (NZB x NZW)F1 마우스의 비장세포의 Con A 자극 배양물의 상층액에서 ELISA 로 측정시의 시토카인 패턴을 보여준다. 도 13A - IFN-γ패턴; 도 13B - IL-10 패턴; 도 13C - TGF-β패턴.
도 14A-14F 는 PBS (14A, 14B) 또는 200 ㎍ hCDR1 (14C, 14D), 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 (14E, 14F)로 처리된 l6/6Id 유도의 실험적 SLE 을 가진 BALB/c 마우스의 대표적 신장 절편을 보여주는 사진이다. 상기 절편은 9 월령의 죽은 마우스의 것이다. 면역 복합체 Ig 침전물의 검출을 위하여, 절편을 FITC-공액 염소 항-마우스 IgG (γ사슬 특이적)와 함께 인큐베이션시켰다 (14A, 14C, 14E x 100; 14B, 14D, 14F x 400).
도 15A-15E 는 hCDR1 (200 또는 300㎍) 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 로 처리 또는 비처리된 16/6Id 유도의 실험적 SLE 에 걸린 BALB/c 마우스의 l6/6Id 자극 림프절 배양물의 상층액에서 ELISA 로 측정시의 시토카인 패턴을 보여준다. 도 15A - IFN-γ패턴; 도 15B - TNF-α; 도 15C - IL-10 패턴; 도 15D - TGF-β패턴; 도 15E - TGF-β패턴, 16/6Id 촉발 비장 세포의 상층액에서 측정.
도 16A-16F 는 비처리된 SLE 에 걸리기 쉬운 (NZB x NZW)F1 마우스 (16A, 16B) 또는 300㎍ hCDR1 (16C, 16D) 또는 역방향 펩티드 revhCDR1 (16E, 16F) 로 처리된 마우스의 비장세포의 마우스 수용자의 대표적 신장 절편을 보여주는 사진이다. 면역 복합체 Ig 침전물의 검출을 위하여, 절편을 FITC-공액 염소 항-마우스 IgG (γ사슬 특이적) 와 함께 인큐베이션시켰다 (16A, 16C, 16E x 400; 16B, 16D, 16F x 100).
도 17A-17B 는 (NZB x NZW)F1 마우스의 혈청내 MMP-3, MMP-2 및 MMP-9 의 출현의 키네틱을 나타낸다. (NZB x NZW)F1 마우스 (10 마우스/군) 를 지시된 시점에서 출혈시켰다. 각 군의 마우스의 합취된 혈청 (4 ㎕) 을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 MMP-3 발현 수준(도 17A) 또는 겔 자이모그래피를 이용하여 MMP-9 및 MMP-2 활성(도 17B)에 대하여 시험하였다. 결과는 4 개의 유사한 실험을 나타낸다.
도 18A-18B 는 BALB/c 마우스의 혈청내 MMP-3, MMP-2 및 MMP-9 의 출현의 키네틱을 나타낸다. 비면역화 BALB/c 마우스(10 마우스/군) 또는 PBS/CFA (10 마우스/군) 또는 16/6Id (CFA에서; 10 마우스/군)으로 면역화시킨 마우스를 지시된 시점에서 출혈시켰다. 각 군의 마우스의 합취된 혈청 (4 ㎕) 을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 MMP-3 발현 수준(도 18A) 또는 겔 자이모그래피를 이용하여 MMP-9 및 MMP-2 활성(도 18B)에 대하여 시험하였다. 결과는 3 개의 유사한 실험을 대표한다.
도 19A-19C 는 MMP-3 및 MMP-9 에 대한 면역화 BALB/c 마우스의 신장 절편의 면역염색을 나타낸다. 비면역화 BALB/c 마우스 또는 PBS/CFA 또는 16/6Id (CFA에서)으로 면역화된 마우스, (3 마우스/군) 를 16/6Id 으로 추가접종시킨 후 5.5 개월뒤 죽였다. 신장을 제거하고, 이의 5㎛ 의 저온조 절편을 MMP-3 (19A) 및 MMP-9 (19B)에 대하여 면역염색하였다. 블로킹의 효능에 대한 대조의 염색을 수행하였다 (19C).(x200). 결과는 3 개의 유사한 실험을 대표한다.
도 20A-20B 는 mCDR1 로 처리된 (NZB x NZW)F1 마우스 의 혈청내 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 나타낸다. 예방 실험에서, 마우스(10/군) 에게 2 월령에서 시작하여 mCDR1 로 10 주간 매주 피하(s.c.)주사하였다. 결과는 처리가 끝난 후 4 개월뒤 취한 혈청을 나타낸다. 처리 실험에서, 마우스(10/군) 에게 5 월령부터 시작하여 PBS 또는 250㎍/마우스의 mCDR1 를 피하주사하였다. 결과는 처리가 끝난 후 3 주뒤 취한 혈청을 나타낸다. 각 실험 군으로부터 합취한 혈청을 웨스턴 블럿팅 분석으로 MMP-3 수준 (20A) 및 겔 자이모그래피를 이용하여 MMP-9 활성 (20B)에 대하여 시험하였다. UT - 비처리. 결과는 2 개의 유사한 실험을 대표한다.
도 21A-21B 는 mCDR1 로 처리된 16/6Id 면역화 BALB/c 마우스내 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 나타낸다. 예방 실험에서, 마우스 (8/군) 을 mCDR1 (100㎍/마우스)로 정맥내(i.v.)처리하였다. 결과는 처리가 끝난후 4.5 개월간 취한 혈청의 결과이다. 처리 실험에서, 마우스 (8/군) 을 100 ㎍/마우스 mCDR1 로 피하처리하였다. 결과는 처리가 끝난 후 수득한 혈청의 것이다. 각 실험군으로부터 합취한 혈청을 웨스턴 블럿팅 분석으로 MMP-3 수준 (21A) 및 겔 자이모그래피를 이용하여 MMP-9 활성 (21B) 에 대하여 시험하였다. UT-비처리. 결과는 2 개의 유사한 실험의 대표이다.
도 22A-22B 는 실험적 SLE 의 예방 (22A) 또는 처리(22B)을 위해 mCDR1 로 처리된 16/6Id 면역화 BALB/c 마우스의 신장 절편의 MMP-3 및 MMP-9 에 대한 면역염색을 나타낸다. 마우스를 질병 유도 8 개월 뒤 죽여 이의 신장을 제거하였다. 저온조 절편 (5㎛) 을 제조하여 MMP-3, MMP-9 및 면역 복합체 침전물의 존재에 대하여 면역염색하였다 (x 200). (W/O)- 1 차 항체없이 블로킹의 효능에 대한 대조 염색. 결과는 2 개의 유사한 실험을 대표한다.
도 23A-23B 는 hCDR1 로 처리된 (NZB x NZW)F1 마우스의 혈청내 MMP-3 및 MMP-9의 수준을 나타낸다. 처리 실험에서, 마우스 (10/군) 에게 7 월령에서 시작하여 10주간 주 1 회씩 PBS 또는 100 ㎍ 또는 30 ㎍/마우스의 hCDR1 을 피하주사하였다. 결과는 처리중간에서 수합한 혈청을 나타낸다. 각 실험군으로부터 합취한 혈청을 웨스턴 블럿팅 분석으로 MMP-3 수준 (23A) 및 겔 자이모그래피를 이용하여 MMP-9 활성 (23B)에 대하여 시험하였다 . 결과는 2 개의 유사한 실험을 대표한다.
도 24 는 SLE 환자 및 건강한 대조군의 혈청내 MMP-2 및 MMP-9 의 활성을 보여주는 대표적 겔을 나타낸다. 40 명의 SLE 환자 및 25 명의 건강한 대조군의 혈 청 (5㎕)를 겔 자이모그래피로 이들의 MMP-2 또는 MMP-9 활성에 대하여 분석하였다. 도면은 2 개의 군의 혈청 시료의 대표적 결과를 보여준다.
도 25 는 SLE 환자 (검은막대) 및 건강한 대조군 (흰막대)의 혈청에서 MMP-2 및 MMP-9 활성의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. SLE 환자의 36 개의 혈청 시료 및 건강한 대조군의 15 개의 혈청 시료를 특이적 활성 분석 키트를 이용하여 MMP-2 또는 MMP-9 활성에 대하여 시험하였다. 결과는 평균±s.e.m 으로 나타내었다. *P = 0.0302.
도 26A-26B 는 SLE 환자에서 MMP-9 활성 수준 및 질병 활성 지수 (SLEDAI) 를 보여주는 그래프이다. 8 명의 남성 (도 26A) 및 27 명의 여성 (도 26B)의 SLE 환자에서 취한 35 개의 혈청 시료를 특이적 활성 분석 키트를 이용하여 MMP-9 활성에 대하여 시험하였다. 환자의 SLEDAI 에 따른 MMP-9 활성의 분포를 나타내었다. 대시선은 건강한 대조군에서 MMP-9 의 활성을 나타낸다.
도 27A-27B 는 질병의 4-6 년 동안 채취된 2 명의 SLE 환자의 혈청에서 MMP-2 (흰색원) 및 MMP-9 (검은색원) 활성의 패턴을 보여주는 그래프이다. 상기 혈청을 특이적 활성 분석 키트를 이용하여 MMP-2 또는 MMP-9 활성에 대하여 시험하였다. 분석은 이중으로 실시하였다.
본 발명은, 하나의 양태로서, 마우스에서 SLE 류 질환을 유도하는, 병원성 인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체 (본원에서 “인간 항-DNA 16/6Id mAb” 또는 “인간 16/6Id mAb”으로 동정)의 중사슬 또는 경사슬에서 발견되는 CDR 로 이루어 진 또는 내에서 발견되는 서열을 포함하는 합성 펩티드에 관한 것이다.
인간 16/6Id mAb 의 CDR 유래의 본 발명의 합성 펩티드 (본원에서 hCDR 펩티드로 동정)은 바람직하게는 인간 16/6Id mAb 의 중사슬내에서 발견되는 CDR 을 기재로 한다.
인간 16/6Id mAb 의 VH 서열의 CDR 영역은 와이즈맨 등의 (1995) 의 도 4A 에 박스로 나타내었다. 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR 영역은 실제적으로 하기와 같이 서열 번호 8 내지 서열 번호 10 으로 나타낸 것과 같은 서열을 갖는다:
CDR1: FSGYYWS [서열 번호 8]
CDR2: EINHSGSTNYKTSLKS [서열 번호 9]
CDR3: GLLRGGWNDVDYYYGMDV [서열 번호 10]
본 발명의 hCDR 펩티드는 12 내지 30 개의 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게는, 서열 번호 8, 9 및 10 으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 동일한 서열, 또는 좀더 바람직하게는 서열 번호 8, 9 또는 10 내에서 발견되는 서열, 또는: (i) 상이한 아미노산 잔기에 의한 서열 번호 8, 9 및 10 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; (ii) 서열 번호 8, 9 및 10 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실; 또는 (iii) 서열 번호 8, 9 및 10 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득되는 서열을 포함한다.
hCDR 서열외, 본 발명의 hCDR 펩티드는 추가로 아미노산 잔기, 바람직하게는 hCDR 서열이 플랭킹된 인간 16/6Id mAb 의 서열 또는, 상이한 아미노산 잔기에 의한 hCDR 플랭킹 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, hCDR 플랭킹 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실 또는 hCDR 플랭킹 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득된 서열의 아미노산 잔기를 포함한다.
따라서, 하나의 구현예로서, 본 발명은 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR1 을 기재로 한 합성 펩티드를 제공하며, 상기 CDR1 영역은 실제적으로 서열 번호 8 로 나타낸 것과 같은 서열의 것이며, 상기 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열 번호 8 의 서열로 이루어진 또는 내에서 발견되는 서열, 또는 (i) 상이한 아미노산 잔기에 의한 서열 번호 8 의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; (ii) 서열 번호 8 로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실; 및/또는 (iii) 서열 번호 8 에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득되는 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이의 염 또는 화학적 유도체;
(b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 (a) 의 상기 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
(c) (a) 의 상기 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
(d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예로서, 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR1 기재의 펩티드는 실제적으로 서열 번호 11 로 나타낸 것과 같은 서열의 펩티드이다:
X1YYWSWIX2QX3PX4X5GX6EWIG [서열 번호 11]
식중, X1 는 G 또는 TG 이고; X2 는 R 또는 K 이며; X3 는 P 또는 S 이고; X4 는 G 또는 E 이며; X5 는 K 또는 D 이고; X6 은 E,L 또는 S 이다.
좀더 바람직한 구현예로서, 서열 번호 11 의 펩티드는 실제적으로 서열 번호 6 로 나타낸 바와 같은 서열의, 본원에서 “hCDR1 펩티드” 또는 단순히 “hCDR1 “로 명명된 19-머 펩티드이다 :
GYYWSWIRQPPGKGEEWIG [서열 번호 6]
hCDR1 에서, 서열 번호 8 내 포함된 서열 GYYWS 는 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR1의 천연 서열이 뒤따르며, 단, mAb 서열의 천연 류신 (L) 잔기는 펩티드 hCDR1 의 위치 15 에서 글루탐산 잔기 (E) (볼드체)로 치환되었다.
또 하나의 구현예로서, 서열 번호 11 의 펩티드는 hCDR1 펩티드의 서열에 아미노산 잔기의 치환 및/또는 부가로 수득된 hCDR1 펩티드의 상동체이며, 이의 예는 실제적으로 서열 번호 12 내지 서열 번호 18 로 나타낸 서열의 펩티드이다 (여기에서 치환 또는 부가된 아미노산은 볼드체로 나타내었다):
GYYWSWIRQPPGKGLEWIG [서열 번호 12]
GYYWSWIRQPPGKGSEWIG [서열 번호 13]
GYYWSWIRQPPGDGEEWIG [서열 번호 14]
GYYWSWIKQPPGKGEEWIG [서열 번호 15]
GYYWSWIRQSPGKGEEWIG [서열 번호 16]
GYYWSWIRQPPEKGEEWIG [서열 번호 17]
TGYYWSWIRQPPGKGEEWIG [서열 번호 18]
추가의 구현예로서, 본 발명은 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR3 기재의 합성 펩티드를 제공하며, 상기 CDR3 영역은 실제적으로 서열 번호 10 로 나타낸 것과 같은 서열이며, 상기 펩티드는 하기로 이루어진 군에서 선택된다 :
(a) 서열 번호 10 의 서열로 이루어진 또는 내에서 발견되는 서열, 또는 (i) 상이한 아미노산 잔기에 의한 서열 번호 10 의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; (ii) 서열 번호 10 으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실; 및/또는 (iii) 서열 번호 10 에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득되는 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이의 염 또는 화학적 유도체;
(b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 (a) 의 상기 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
(c) (a) 의 상기 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
(d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예로서, 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR3 기재의 펩티드는 실제적으로 서열 번호 19 로 나타낸 것과 같은 서열의 펩티드이다:
YYCARX1LLX2X3X4X5X6DVDYX7GX 8DV [서열 번호 19]
식중, X1 는 G 또는 F이고; X2 는 R 또는 A 이며; X3 은 G 또는 A 이고; X4 는 G 또는 A 이며; X5 는 W 또는 A 이고; X6 은 N 또는 A 이며; X7 는 Y 또는 W 이 고; 그리고 X8 은 M 또는 Q 이다
좀더 바람직한 구현예로서, 서열 번호 19 의 펩티드는 서열 번호 7 의, 본원에서 “hCDR3 펩티드” 또는 단순히 “hCDR3”로 명명된 펩티드이다 :
YYCARGLLRGGWNDVDYYGMDV [서열 번호 7]
hCDR3 에서, 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR3 영역의 서열 GLLRGGWNDVDYYYGMDV [서열 번호 10] 을 티로신 (Y) 잔기들중 하나를 결실시켜 변형시키고, mAb 의 천연 서열로 선행시킨다.
또 하나의 구현예로서, 서열 번호 19 의 펩티드는 hCDR3 펩티드의 서열에 아미노산 잔기의 치환 및/또는 부가로 수득한 hCDR3 펩티드의 상동체이며, 이의 예는 서열 서열 번호 20 내지 서열 번호 27 의 펩티드이다 (여기에서 치환 또는 부가된 아미노산은 볼드체로 나타내었다)
YYCARGLLRGGWADVDYYGMDV [서열 번호 20]
YYCARGLLRGGANDVDYYGMDV [서열 번호 21]
YYCARGLLRGAWNDVDYYGMDV [서열 번호 22]
YYCARGLLRAGWNDVDYYGMDV [서열 번호 23]
YYCARGLLAGGWNDVDYYGMDV [서열 번호 24]
YYCARFLLRGGWNDVDYYGMDV [서열 번호 25]
YYCARGLLRGGWNDVDYYGQDV [서열 번호 26]
YYCARGLLRGGWNDVDYWGMDV [서열 번호 27]
또 하나의 구현예로서, 본 발명은 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR2 기재의 합성 펩티드를 제공하며, 상기 CDR2 영역은 실제적으로 서열 번호 9 로 나타낸 바와 같은 서열이며, 상기 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 :
(a) 서열 번호 9 의 서열로 이루어진 또는 내에서 발견되는 서열, 또는 (i) 상이한 아미노산 잔기에 의한 서열 번호 9 의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; (ii) 서열 번호 9 로부터 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실; 및/또는 (iii) 서열 번호 9 에 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가로 수득되는 서열을 포함하는 펩티드, 또는 이의 염 또는 화학적 유도체;
(b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 (a) 의 상기 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
(c) (a) 의 상기 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
(d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
본 발명의 합성 펩티드는 12-30, 바람직하게는 17-23, 가장 바람직하게는 19-22 개의 아미노산 잔기를 가지며, 당해 기술에 주지된 방법으로 화학적 합성 또는 재조합 기술로 제조될 수 있다.
아미노산 잔기의 치환으로 수득된 전술한 바와 같은 상동체를 제조하는 경우에는, 치환은 누적하여 부피, 소수성-친수성 패턴 및 비치환된 모 펩티드의 대응하는 부분의 전하를 실제적으로 변화시키지 않는 치환으로부터 선택하는 것이 중요하다. 따라서, 소수성 잔기는 전체 효과가 부피, 소수성-친수성 패턴 및 비치환된 모 펩티드의 대응하는 부분의 전하를 실제적으로 변화시키지 않는 한, 친수성 잔기로 치환 또는 그 역으로 될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드의 화학적 유도체를 포함한다. “화학적 유도체”는 통상적으로 펩티드의 일부는 아닌 추가의 화학적 부분을 포함하며, T 세포 증식 반응 및 자가면역 질환을 예방 또는 억제시 펩티드의 유용성을 허용하는 펩티드의 기능의 적어도 일부를 보유하는 한 본 발명에 포함된다. 예컨대, 화학적 유도체는 상기 펩티드의 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기성 유도화제의 반응으로부터 발생할 수 있으며, 바람직하게는 SLE 유도성 자가항체에 대한 고 반응자인 마우스의 T 림프구의 시토카인 분비 및 증식 반응을 특별히 억제하는 펩티드의 기능의 적어도 일부를 보유할 것이다. 이러한 화학적 유도체들 중에서, C-말단에서 카르복실기의 아미드 및 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기의 유리 카르복실기의 아미드가 특히 주목된다. 많은 이러한 화학적 유도체 및 이의 제법이 당해기술에 주지되어 있다.
또한 본 발명의 범위에는 본 발명의 펩티드 및 상동체의 염이 포함된다. 본원에서 사용하는, 용어 "염" 은 펩티드 분자의 카르복실기의 염 및 아미노기의 산부가염 모두를 의미한다. 카르복실기의 염은 당해기술에 공지된 방법으로 형성될 수 있고, 무기염, 예컨대, 나트륨, 칼슘, 암모늄, 제2철 또는 아연염 등, 및 아민, 예컨대, 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등과 형성된 것과 같은 유기 염기와의 염이 포함된다. 산부가염에는, 예컨대, 무기산, 예컨대, 염산 또는 황산과의 염 및 예컨대, 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산과의 염이 포함된다. 이러한 화학적 유도체 및 염은 바람직하게는 안정성, 가용성, 등에 관한 한 펩티드의 약학적 성질을 변형시키기 위하여 사용한다.
본 발명에 따른 hCDR 펩티드는 SLE 유도성 자가항체에 고 반응자인 마우스의 T 림프구의 증식 반응을 억제하는데 있어서 이들의 잠재력에 대해 시험하여 선택할 수 있다. 일단 본 발명에 따른 펩티드가 제조되면, SLE 유도성 자가항체에 고 반응자인 마우스의 T 림프구의 증식 반응을 억제하는 이의 능력은 본원 기술된 것과 같은 시험을 이용하여 과도한 실험없이 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 용이하게 실시할 수 있는 하나의 시험은 SLE 유도성 자가항체에 특이적인 특정의 T 세포주 및 클론의 증식 반응을 실험관내에서 억제하는 펩티드의 능력에 대한 것이다. T 세포주 및 클론은, 예컨대, 전술한 방법론 (Axelrod, 0. 및 Mozes, E. Immunobiology, 172, 99 (1986))으로 마우스의 면역화된 림프절 세포로부터 구축된 16/6Id mAb (Fricke 등, 1991)에 특이적인 T 세포주 및 클론이다. 세포를 매 2 주 마다 농축배지의 존재하 조사된 동종 비장 세포상에서 표출되는 자극성 항체에 노출시킨다. T 세포주를 표준 제한 희석 기술로 클로닝시킨다. 상기 T 세포주 및 클론의 증식 반응을, 예컨대, WO 96/30057, 재료 및 방법란, 섹션(g) 에 기재된 방법으로 시험한다.
목적하는 활성을 가진 상동체를 선택하기 위하여 실시할 수 있는 또 하나의 시험은 모 펩티드의 존재하 펩티드 특이적 B 세포에 도움을 제공하는 T 세포주 및 클론의 능력을 억제하는 합성펩티드의 능력에 대한 시험이다. 합성 펩티드는 또한 비오틴화후, 관련 계의 항원 제공 세포상의 MHC 클래스 II 생성물에 직접적으로 결합할 수 있는 이들의 능력에 대하여 시험할 수 있다. 이를 위해, 관련 펩티드 의 N-말단 비오틴화는 수용액에서 과량의 비오틴-N-히드록시숙신이미드와 0℃ 에서 실시한다 (Mozes 등, 1989). 마우스 비장 점착 세포 또는 PBL 점착 세포 (1 x 106/시료) 를 0.1% 소혈청 알부민을 함유하는 PBS (PBS/BSA)에서 비오틴화 펩티드와 함께, 37℃ 에서 20 시간 인큐베이션시킨 후, 4℃ 에서 30 분간 피코에리트린-스트렙타비딘과 함께 인큐베이션시켰다. 각 인큐베이션후, 세포를 상기 용액으로 2 회 세정시켰다. 이후, 세포를 FACScan 를 이용한 유세포분석기로 분석한다. 각각의 분석에서, 최소 5000 개의 세포를 조사한다 (상기 절차를 위해서는, 예컨대, Mozes 등, 1989 참조).
실시할 수 있는 추가의 시험은 SLE 유도성 자가항체에 고 반응자인 마우스의 T 림프구 또는 림프절 세포 또는 T 세포주에 의한 시토카인 분비를 억제하는 펩티드의 능력에 대한 시험이다. 시토카인은 하기와 같이 검출한다 : IL-1 활성을 한쌍의 캡춰 및 검출용 항체를 이용하여 ELISA 로 평가한다 (IL-4, IL-6, IL-10 에 대해서는 하기에 기술된 바와 같이). IL-2 를 IL-2 의존성 CTLL 주를 이용하여 직접적으로 검출하거나 ELISA 로 검출한다. 상층액내 IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ및 TNF-α의 수준을 제조자의 지시에 따라 다양한 시토카인 (Pharmingen, San Diego, Ca., USA)에 대한 항체를 이용하여 ELISA 로 측정한다. 또한, 면역억제 시토카인 TGF-β의 분비의 수준을 상승시키는 펩티드의 능력을 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 로 평가할 수 있다.
상기 하나 이상의 실험관내 시험에서 양성으로 결정된 펩티드는 생체내 활성의 상당한 기대를 제공할 것이다. 그러나, 생체내 시험은 또한 과도한 실험없이 실시할 수 있다. 따라서, 예컨대, 성체 마우스에 -3 또는 0 일에서 후보 펩티드를 주사할 수 있다. 이어서 마우스를 질병 유도성 자가항체 또는 상기 펩티드로 면역화시킨다. 10 일후, 마우스의 림프절 세포를 후보 펩티드의 억제 능력을 발견하기 위하여 면역원으로 증식될 수 있는 이들의 능력에 대하여 시험한다.
또 하나의 상기와 같은 생체내 동물 시험은 전술한 바와 같이 SLE 의 생산을 위한 생체내 쥐과 모델에서 직접적으로 치료 활성을 측정하는 것으로 이루어진다. 펩티드를, 실험적 SLE가 상이한 투여량 및 상이한 시간 스케쥴에서 상이한 경로로 유도되는 마우스에 주사할 수 있다. 더욱이, 처리된 마우스는 주기적으로 시험하여 자가항체 반응 및 SLE 유도성 자가항체에 의해 마우스에서 유도되는 질병 증상에 대한 펩티드의 영향을 측정할 수 있다.
또 하나의 생체내 방법은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, SLE 를 자연 발생시키는 마우스, 예컨대, (NZB x NZW)F1 마우스를 치료하는 후보 펩티드 능력을 평가하는 것으로 이루어진다.
따라서, 본원의 실시예에서 실시가능한 것으로 밝혀진 바람직한 구현예외에, 당업자는 또한 과도한 실험없이 본원에 제공된 가이드라인을 따라 실시가능할 추가의 상동체를 결정할 수 있을 것임을 알 수 있다.
또 하나의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 이중 펩티드와 같은 다중 에피토프 단일 펩티드를 제공한다. 하나의 구현예로서, 이중 펩티드는 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR1 (서열 번호 8) 또는 CDR3 (서열 번호 l0) 의 서열을 포함하 는 2 개의 상이한 펩티드와 같은 동일한 CDR 을 기재로 하는 2 개의 상이한 펩티드로 이루어진다.
또 하나의 좀더 바람직한 구현예로서, 이중 펩티드는 인간 16/6Id mAb 의 중사슬의 CDR1 (서열 번호 8)의 서열을 포함하는 하나의 펩티드 및 CDR3 (서열 번호 l0) 의 서열을 포함하는 또 하나의 펩티드와 같은 각각 상이한 CDR 을 기재로 하는 2 개의 상이한 펩티드로 이루어진다.
본 발명에 따른 이중 펩티드는 바람직하게는 2 개의 상이한 펩티드로 이루어지며, 이중 하나는 서열 번호 11 의 펩티드이고, 나머지는 서열 번호 19 의 펩티드이고, 좀더 바람직하게는 하나의 펩티드는 서열 번호 6 및 12-18 로 이루어진 군에서 선택되고, 또 하나의 펩티드는 서열 번호 7 및 20-27 로 이루어진 군에서 선택되며, 가장 바람직하게는 하나의 펩티드는 서열 번호 6 의 펩티드이고, 나머지는 서열 번호 7 의 펩티드이며, 상기 2 개의 상이한 펩티드는 직접적으로 또는 일련의 알라닌 잔기와 같은 짧은 연결 사슬에 의해서 또는 카텝신에 의한 단백질분해를 위한 추정부위에 의해서 상호간 공유결합적으로 연결된다. 상기 부위와 관련하여서는 , 예컨대, U.S.P 5,126,249 및 EP 495049 참조.
또 하나의 바람직한 구현예로서, 본 발명은, 예컨대, 펩티드와 적합한 중합화제, 예컨대, 0.1% 글루타르알데히드를 중합시켜 수득한 (Audibert 등, 1981, Nature 289:593), 펩티드 중합체 형태의 본 발명의 수많은 동일한 또는 상이한 펩티드를 포함하는 다중에피토프 단일 펩티드를 제공한다. 중합체는 바람직하게는 5 - 20 개의 펩티드 잔기, 바람직하게는 서열 번호 6, 7 및 11-27 의 펩티드를 포함할 것이다. 이러한 펩티드 중합체는 또한 펩티드를 가교시키거나 다중 펩티드를 거대분자 담체에 부착시켜 형성시킬 수 있다. 적합한 거대분자 담체는, 예컨대, 단백질, 예컨대 테타누스 독소, 및 선형 또는 분지형의 아미노산의 중합체, 예컨대, L-알라닌, L-글루탐산 및 L-리신의 선형 공중합체 및 L-티로신, L-글루탐산, L-알라닌 및 L-리신의 분지형 공중합체 (T,G)-A-L-, 또는 다중사슬 폴리-DL-알라닌이다 (M. Sela 등, 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:6175). 컨쥬게이트는, 예컨대, 처음에 펩티드와 수용성 카르보디이미드, 예컨대 1-에틸-3-(3’-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드와 커플링시키고, 이어서 문헌 [Muller, G.M. 등, (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:569] 에 기재된 바와 같이 거대분자 담체와 컨쥬게이션시켜 수득한다. 각 컨쥬게이트내 커플링된 펩티드의 내용물은 담체만의 조성물과 비교하여 아미노산 분석으로 측정한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 하나 이상의 활성 펩티드는 적합한 거대분자 담체에 부착되거나 글루타르알데히드의 존재하 중합될 수 있다.
펩티드, 이의 중합체 또는 적당한 거대분자 담체와의 이들의 컨쥬게이트는 이들의 생이용성이 보장되는 형태로 환자에게 투여되며, 이는 상기의 것들이 치료에 적합하도록 만든다. 만일 본 발명의 하나 이상의 펩티드가 현저한 억제 활성을 갖는 것으로 밝혀지면, 이러한 펩티드는 이의 혼합물을 포함하는 제형물로 환자에게 주어질 수 있다.
따라서 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 하나 이상의 합성 펩티드 또는 펩티드 중합체, 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
하나의 바람직한 구현예로서, 약학적 조성물은 하나 이상의 본 발명의 합성 펩티드, 좀더 바람직하게는 펩티드 hCDR1 [서열 번호 6] 및 hCDR3 [서열 번호 7] 및 hCDR1 및 hCDR3 서열에서 아미노산 잔기의 치환 및/또는 부가에 의해 수득되는 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 펩티드, 특히 서열 번호 12 내지 서열 번호 18 및 서열 번호 20 내지 서열 번호 27 의 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
경구, 정맥내, 피하, 관절내, 근육내, 흡입, 비강내, 지주막하, 복강내, 피내, 경피 또는 직장 경로를 포함한 기타 공지의 경로를 포함한 임의의 적합한 투여 경로가 본 발명에 포함된다. 바람직한 구현예로서, 본 발명의 펩티드는 경구, 비강내 도는 피하 경로로 투여된다.
본 발명의 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 목적하는 효과를 생성하기에 충분히 커서, 예컨대, 실험관내 T 세포 증식으로 측정시, SLE 유도성 자가항체에 대한 면역 반응이 실제적으로 방지 또는 억제되어야 하며, 추가로 질병이 현저히 치료되어야 한다. 투여량은 원치않는 교차반응, 일반화 면역억제, 과민 반응 등과 같은 부작용을 일으킬 만큼 커서는 안된다.
SLE 치료에 사용하기에 유효한 본 발명의 펩티드의 투여량은 약 1 ㎍ 내지 1 mg 및 100 mg/kg(체중) 이하의 범위이다.
본 발명의 합성 인간 펩티드는 모든 다른 면역 반응에 영향을 미침이 없이, SLE 환자의 특이적 항원 반응을 억제 또는 억압하는 것을 목표로 한다. 대부분의 진단 환자가 수년동안 치료하여야 할 젊은 여성이고, SLE 에 대하여 현재 허용되고 있는 치료법에는 비특이적이며 다중의 부작용을 갖는 코르티코스테로이드 및/또는 세포독성 약물과 같은 면역억제제의 투여가 수반되기 때문에 이러한 접근법은 극히 중요하다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 중합체를 유효량으로 SLE 환자에게 투여하는 것을 포함하는 전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 바람직한 구현예로서, 이 방법에는 서열 번호 6 의 펩티드를 투여하는 것이 포함된다. 또 하나의 바람직한 구현예로서, 이 방법에는 서열 번호 7 의 펩티드의 투여가 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 중합체를 유효량으로 상기 SLE 환자에게 투여하는 것을 포함하는 SLE 환자에서 SLE-관련 반응의 면역조절 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예로서, 본 방법은 SLE 환자에서 매트릭스 메탈로프로틴아제 (MMP)-3 및/또는 MMP-9 활성의 수준을 하향조절하는 것을 포함한다. 또 하나의 구현예로서, 본 방법은 SLE 환자에서 시토카인 활성의 수준을 면역조절, 특히 SLE 환자에서 IL-2 및/또는 IFN-γ활성의 수준의 하향 조절 및/또는 TGF-β활성의 상향조절을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 서열 번호 6 의 펩티드의 투여를 포함한다. 또 하나의 바람직한 구현예로서, 본 방법은 서열 번호 7 의 펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 약물로 처치된 환자에서 수득한 혈액 시료에서 MMP-3, MMP-9, IL-2, IFN- γ 및/또는 TGF-β의 수준을 상이한 시간 간격에서 측정하여, MMP- 3, MMP-9, IL-2 및/또는 IFN- γ의 감소 수준 또는 TGF-β의 증가 수준을 약물의 효과와 상관시키는 것을 포함하는, SLE 환자의 치료에서의 약물의 효과를 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 특히 SLE 의 치료, 좀더 구체적으로는 SLE 환자에서 MMP-3 및/또는 MMP-9 및/또는 IL-2 및/또는 IFN- γ의 하향 조절 또는 TGF-β 수준의 상향조절과 같은 SLE 환자에서 SLE 관련 반응의 면역조절을 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 중합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 이제 하기의 비제한적 실시예 및 첨부된 도면에서 좀더 상세히 기술될 것이다.
재료 및 방법
마우스. 암컷 (NZB x NZW)F1 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 입수하였다. 6-8 주령의 BALE/c 근교계의 암컷 마우스를 Experimental Animal Unit (The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)에서 입수하였다.
항-DNA 모노클로날 항체. 16/6Id (IgGl/k) 를 보유하는 인간 항-DNA mAb 는 이미 특징화되어 있다 (Shoenfeld 등, 1982; Waisman 등, 1995). mAb 는 배양물에서 생육된 하이브리도마 세포에 의해 분비되었고, 단백질 G-세파로오스 컬럼을 이용하여 정제하였다 (Pharmacia, Fine Chemicals, Uppsala, Sweden).
합성 펩티드. 합성 쥐과 펩티드 mCDR1 (서열 번호 1) 및 mCDR3 (서열 번호 3) 및, 대조군으로 사용하는, 본원에서 각각 revmCDR1 [서열 번호 28], revmCDR3 [서열 번호 29] 및 revhCDR1 [서열 번호 30]으로 동정된, mCDR1 및 mCDR3 의 역순 및 인간 펩티드 hCDR1의 역순으로 합성된 역방향 펩티드는 이미 기재된 바와 같이 (WO 96/30057) 또는 t-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 기술에 대한 생산자의 프로토콜을 이용하여 자동화 합성기 (Applied Biosystems model 430A, Germany)를 이용하여 제조하였다.
역방향 펩티드는 하기 서열을 갖는다:
GIWELSKEPSQKVWQMYYGT revmCDR1[서열 번호 28]
SGQGWYDMAYPEWLFRACYY revmCDR3[서열 번호 29]
GIWEEGKGPPQRIWSWYYG revhCDR1[서열 번호 30]
실험적 SLE 의 유도 및 치료. 실험적 SLE 를 유도하기 위하여, BALB/c 마우스 를 1-2㎍ 의 인간 mAb 16/6Id 로 면역화시키고, 3 주후 추가 접종시켰다. 실험적 SLE 의 예방을 위하여, 마우스에게 면역화와 함께 hCDR1 또는 hCDR3 (실시예 12 에서 대조군 펩티드로서 mCDR1 또는 revmCDR1)을 정맥내 또는 피하 투여하였으며, 이후 5 주간 매주 주사하였다. 임상적 증상이 이미 관찰된 경우, 구축된 질환의 치료는 16/6Id 로 질환 유도후 3½달때 개시하였다. 실시예 12 에서, 마우스에게 100 ㎍/마우스의 투여량으로 mCDR1 또는 revmCDR1 을 10 주간 (i.v. 또는 s.c.)주사하였다.
hCDR1 또는 mCDR1 펩티드를 이용한 (NZB x NZW)F1 마우스에서의 SLE 류 질병의 예방 및 치료. SLE 를 예방하기 위하여, 질병 증상이 관찰되기 전의, 2 월령의 마우스에게 hCDR1 (또는 실시예 12 에서 mCDR1, 250㎍/마우스) 를 10 주간 주 1 회씩 피하주사하였다. 구축된 질병을 치료하기 위해서는, 5-7 월령의 마우스에게 hCDR1 (실시예 12 에서, mCDR1 s.c., 250㎍/마우스)를 10 주간 주 1 회씩 주사하였다.
증식 반응. PBL 을 Ficoll-Hypaque (Pharmacia) 밀도구배 원심분리로 헤파린화 정맥성 혈액으로부터 분리하였다. 모든 분석은 기술된 바와 같이 2 x 105 PBL 을 농축 RPMI-1640 에서 배양시킨 (Dayan 등, 2000) 편평바닥 마이크로티터 플레이트 (Falcon, Becton Dickinson, Oxmard, CA, USA) 에서 3 회 실시하였다. PBL 을 16/6Id 의 농도보다 10 배 이상의 과량의 농도로 다양한 CDR 기재 펩티드를 첨가 또는 첨가없이 다양한 농도 (0.1-40 ㎍/웰) 의 인간 항-DNA 16/6Id mAb 에 노출시켰다. 피토헤마글루티닌 (PHA; 2 ㎍/웰) 을 각 실험에서 배양조건에 대한 대조군으로 사용하였다. 배양물은 7.5% CO2 하 37℃ 에서 6 일간 인큐베이션시켰다. 세포를 회수하기 18 시간 전에, [3H]-티미딘 (0.5 μCi 의 5 Ci/mmol)(Nuclear Research Center, Negev, Israel) 를 모든 배양물에 첨가하였다. 결과는 3 개 배양물 ±SD의 평균 티미딘 혼입 CPM (분당 카운트수) 또는 자극지수 (S.I.; 인간 16/6Id의 최적 농도에서의 평균 CPM 대 배지단독하 평균 CPM 의 비율) 로 표시된다. S.I.≥2 는 양성 반응으로 간주하였다 (Dayan 등, 2000). 50% 이상의 억제 (16/6Id 및 다양한 CDR 기재 펩티드의 존재하 평균 CPM 대 16/6Id 존재하 (CDR 기재 펩티드 비존재) 평균 CPM 의 비율)은 양성으로 간주하였다.
시토카인 생산의 유도. 인간 16/6Id mAb 으로 면역화되고, CDR 기재 펩티드로 처리 또는 비처리된 마우스를 상기 펩티드로 처리중 또는 처리후 상이한 시기에서 죽였다. 비장세포 및 림프절 세포(LNC) 를 회수하여 16/6Id의 존재하 인큐베이션시켰다 (5 x 106/ml). 상층액을 48 및 72 시간뒤 수거하였다.
상층액에서의 시토카인의 평가. 상층액을 배양개시 48 시간후 수거하여 -70℃ 에서 저장하였다. IL-2, IL-10, IFN-γ및 TNF-α 의 측정을 제조자의 지시에 따라, 관련 표준, 캡춰 및 검출용 Abs (Pharmingen)을 이용하여 ELISA 로 수행하였다. TGF-β를 ELISA 로 측정하였다. 간략히는, 플레이트를 재조합 인간 TGF-β1 sRII/Fc 키메라 (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)로 피복하였고, 사용한 2 차 Ab 는 비오틴화 항-인간 TGF-β1 항체 (R & D Systems Inc.)이었다. 사용한 기질 용액은 TMB color Reagent (Helix Diagnostics, West Sacramento, CA)이었으며, 효소 활성을 570- 및 630-nm 필터를 이용하여 평가하였다.
SLE 관련 임상 및 병원성 증상의 검출. 단백뇨를 Combistix kit (Ames Division, Bayer Diagnostics, Newbury, U.K.) 를 이용하여 반정량적으로 측정하였다. 백혈구 세포 (WBC, 백혈구감소증)를 1% 아세트산을 포함하는 증류수 (vol/vol)에 헤파린화 혈액을 10 배 희석한후 계수하였다. 면역조직 분석을 위하여, 냉동된 신장 절편 (6 ㎛) 을 고정 및 FITC 공액 염소 Ab 내지 마우스 IgG (γ-사슬 특이적; Sigma) 로 염색시켰다.
ELISA. 항-DNA Ab 를 측정하기 위하여, 96-웰 Maxisorb 마이크로티터 플레이트 (Nunc) 를 메틸화 BSA 또는 폴리L-리신 (Sigma)으로 피복하였다. 이어서, 플레이트를 세정 및 10 ㎍/ml 의 변성 송아지 티무스 DNA (Sigma) 또는 λ-파아지 이중가닥 DNA (Boehringer Mannheim, 5 ㎍/ml)으로 피복하였다. 상이한 희석의 혈청과 인큐베이션시킨 후, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제(Jackson ImmunoResearch)에 공액된 염소 항-마우스 IgG (γ-사슬 특이적) 를 플레이트에 첨가한 후, 기질, 2,2’-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) (Sigma)을 첨가하였다. 결과는 ELISA 리더를 이용하여 판독하였다.
MMP-2 및 MMP-9 의 활성의 측정. MMP 활성을 젤라틴 자이모그래피으로 시험하였다. 상이한 실험군의 개별적 마우스에서 합취된 혈청을 1 mg/ml 젤라틴으로 중합시킨 8% SDS-PAGE 로 분리시켰다. 전기영동후, 겔을 2.5% Triton X-100 에서 30 분간 1 회 세정시켜 SDS 을 제거하고, 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2 및 0.02% (w/v) Brij 35(pH 7.5) 를 포함하는 반응버퍼에서 30 분간 1 회 세정시켰다. 반응 버퍼를 새로운 것으로 바꾸고, 겔을 37℃ 에서 24 시간동안 인큐베이션시켰다. 겔을 0.5% 쿠마시 브릴런트 블루로 염색하여 젤라틴분해 활성을 가시화시켰다.
혈청에서 MMP-3 의 웨스턴 블럿팅 분석. 5 ㎕ 의 각 혈청의 시료를 12 % SDS/PAGE 에 적하하고, 환원조건하 분리하고, 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 블럿을 (0.5 ㎍/ml, 1 hr, 실온) 항-MMP-3 항체 (Oncogene Research Products, MA, USA)로 탐침시키고, 화학발광을 이용하여 전개시켰다.
MMP-3 또는 MMP-9 에 대한 신장 절편의 면역염색. MMP-3 또는 MMP-9 의 면역염색을 위하여, 신장 절편 (5 ㎛) 을 냉 아세톤으로 고정시키고 (5 분, 실온), PBS 에서 2 회 세정시키고, 0.05% Triton X-100 (PBS에 희석)에서 투과성화시키고(1 분, 실온), PBS 에서 2 회 세정시켰다. 특이적 항-MMP 염색을 수득 및 FITC 표지 염소 항-마우스에 의한 면역 복합체 침전물의 염색을 피하기 위하여, 신장 절편을 비표지 염소 항-마우스 IgG+IgM (1% BSA/PBS 에서 1:1 로 희석; (Jackson InimunoResearch Laboratories))로 블록화시키고 (1 시간, 실온), 0.05% Tween 을 포함하는 PBS 로 3 회 세정시켰다. 1% BSA/PBS 에 희석된 모노클로날 항-MMP-9 (1:100; Chemicon Intemational, Inc.) 또는 항-MMP-3 (1:50; Oncogene Research Products) 항체를 실온에서 30분간 첨가하였다. 모든 면역염색 절차를 위하여, 1% BSA/PBS 에 1:30 으로 희석시킨 (30 분, 실온), FITC 표지 염소 항-마우스 IgG+IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories) 를 사용하였다.
통계적 분석. 결과는 평균 ±SD 로 나타내었다. 카이 스퀘어 (chi-square) 윌콕슨(Wilcoxon), 만-휘트니(Mann-Whitney) 및 t-테스트(t-tests)를 통계적 분석을 위해 사용하였다. P≤0.05 를 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 1
인간 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 의 합성
인간 hCDR1 (서열 번호 6) 및 hCDR3 (서열 번호 7) 펩티드를 당분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 본질적으로 하기 문헌에 기재된 바와 같은 t-부틸옥시카르보닐 (t-Boc), 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 기타 알파-아미노산 보호기 공정에 대한 제조자의 프로토콜을 이용하여, 자동화 합성기를 이용하는 화학적 고체상 또는 용액상 합성에 따라 제조하였다 (예를 들어, Peptides: Synthesis, Structure and Applications, B. Gutte 편저, Academic Press, 1995; Peptide Synthesis Protocols, M. Pennington 및 B. Dunn 편저, Humana Press, 1994; Schnolzer M. 등, In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences. Int. J. Pept. Protein Res. 40: 180-193, 1992 참고).
실시예 2
mCDR1 및 mCDR3 으로 면역화시키고 hCDR1 및 hCDR3 을 처리한 마우스의 림프절 세포 (LNC) 증식의 생체 내 억제
인간 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 의 억제 효능을 결정하기 위해, 먼저 쥐과 펩티드 mCDR1 및 mCDR3 으로의 마우스의 생체 내 감작을 억제하는 이들의 능력을 시험하였다.
이를 위해, BALB/c 및 SJL 마우스를 각각 mCDR1 및 mCDR3 으로 면역화시켰다. 면역화 쥐과 펩티드를 뒷다리 족저에서 CFA 피내 주사하였다 (10 ㎍/마우스). 면역화와 동시에, BALB/c 마우스군에 PBS 중의 hCDR1 200 ㎍ 을 피하 (s.c.) 주사하고, SJL 마우스군에 유사하게 hCDR3 을 주사하였다. 면역화 10 일 후, 마우스를 죽이고 이들의 림프절을 회수하여, 세포를 면역화 펩티드로 유도 후 이들의 증식능에 대해 시험하였다. 간단히, 면역화 마우스의 LNC (0.5 ×106/웰) 를 1% 일반 마우스 혈청이 보강된 농축 RPMI-1640 배지 중 상이한 농도 (1-20 ㎍/웰) 의 쥐과 면역화 펩티드의 존재 하에 배양하였다 (3 개씩). 인큐베이션 4 일 후, 3H-티미딘을 추가로 16 시간 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 회수하고 β-카운터로 방사활성을 계수하였다.
표 1A 및 1B 의 결과는 각각 mCDR1 및 mCDR3 로 면역화시키고 hCDR1 및 hCDR3 을 처리한 마우스 LNC 증식의 최대 억제% 를 나타낸다. 억제성 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 을 처리하지 않은 마우스의 LNC 증식을 기준으로 억제를 계산하였다. hCDR1 및 hCDR3 이 면역화 쥐과 CDR 펩티드에 대한 증식 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
mCDR1 에 대한 BALB/c-유래 LNC 증식의 hCDR1 에 의한 억제
억제제 억제%
hCDR1 55%
mCDR3 에 대한 SJL-유래 LNC 증식의 hCDR3 에 의한 억제
억제제 억제%
hCDR3 55%
실시예 3
인간 항-DNA 16/6Id mAb 로 면역화시키고 hCDR1 및 hCDR3 을 처리한 마우스의 LNC 증식의 생체 내 억제
인간 16/6Id 자가항체의 CDR 에 근거하는 펩티드의 억제능을 시험하기 위한 우리의 목적에 따라, 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 이 인간 16/6Id mAb 의 전체 분자에 대한 감작을 억제할 수 있는지 여부를 알아내는 것이 중요하였다. 이를 위해, BALB/c 및 SJL 마우스를 뒷다리 족저에서 CFA 피내로 인간 16/6Id mAb (2 ㎍/마우스) 로 감작하였다. 감작은 BALB/c 마우스군으로의 hCDR1 및 SJL 마우스군으로의 hCDR3 의 200 ㎍/마우스의 PBS 중 s.c. 투여와 동시에 수행되었다. 면역화 10 일 후, 마우스를 죽이고 이들의 LNC 를 상이한 농도 (0.1-10 ㎍/웰) 의 인간 항-DNA 16/6Id mAb 에 대한 이들의 증식능에 대해 시험관 내에서 시험하였다.
상기 실험의 대표 결과를 표 2A 및 2B 에 나타낸다. 결과는 16/6Id mAb 로 면역화시켰지만 펩티드를 처리하지 않은 마우스와 비교하여, 면역화시키고 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 을 처리한 마우스의 림프절 세포의 면역화 인간 16/6Id mAb 에 대한 증식의 최대 억제% 로 나타낸다. 알 수 있듯이, 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 은 둘 다 인간 16/6Id mAb 에 대한 감작을 효과적으로 억제할 수 있었다.
인간 16/6Id mAb 에 대한 BALB/c-유래 LNC 증식의 hCDR1 에 의한 억제
억제제 억제%
hCDR1 88%
인간 16/6Id mAb 에 대한 SJL-유래 LNC 증식의 hCDR3 에 의한 억제
억제제 억제%
hCDR3 68%
추가 실험으로, 인간 16/6Id mAb 로의 면역화와 동시에 10 또는 2 ㎍/마우스만큼 낮은 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 의 비강 투여가 면역화 항체에 대한 림프절 세포의 증식 반응을 100% 가까이 억제함이 나타났다.
또다른 실험에서, BALB/c 마우스를 뒷다리 족저의 피내로, CFA 중 1 ㎍ 의 인간 16/6Id 로 면역화시키고, hCDR1 를 PBS 중 300 ㎍/마우스로 s.c. 주사하거나 추가 처리하지 않았다. 10 일 후, 마우스를 죽이고 이들의 LNC 를 인간 16/6Id 에 대한 시험관 내에서의 이들의 증식능에 대해 시험하였다. 즉, 슬와 LNC (0.5 ×106) 를 다양한 농도 (0.1-10 ㎍/웰) 의 인간 항-DNA 16/6Id mAb 의 존재 하에 인큐베이션하였다. 4 일간의 인큐베이션 후, 3H-티미딘을 최종 18 시간의 인큐베이션 동안 배양물에 첨가하였다. 이어서, 세포를 회수하고 방사활성을 계수하였다.
도 1 은 상기 실험의 결과를 나타내며, hCDR1 이 처리된 마우스의 림프절 세포의 증식 반응을 효과적으로 억제함을 나타낸다. 다양한 농도의 16/6Id mAb 에서 증식의 억제% 는 하기와 같았다: 0.1 ㎍/웰 - 47%; 1 ㎍/웰 - 66%; 5 ㎍/웰 - 76%; 및 10 ㎍/웰 - 62%.
상기와 동일한 실험을 PBS 중 50 ㎍ hCDR1/마우스로 반복하였다. 도 2 는 hCDR1 이 전체 항-DNA 16/6Id 거대분자로의 마우스의 생체 내 감작의 억제에 매우 효과적이며, 50 ㎍ 의 hCDR1 만큼 적은 양으로의 s.c. 주사도 16/6Id 자가항체에 대해 증식하는 림프절 세포의 능력을 유의미하게 억제하는 것을 나타낸다. 다양한 농도의 16/6Id mAb 에서 증식의 억제% 는 하기와 같았다: 0.1 ㎍/웰 - 98%; 1 ㎍/웰 - 76%; 5 ㎍/웰 - 73%; 및 10 ㎍/웰 - 64%.
실시예 4
펩티드 hCDR1 이 시토카인 생성을 면역조절한다.
실시예 3 의 hCDR1 50 ㎍ 을 처리한 BALB/c 마우스의 림프절 세포를 또한 시토카인 생성에 대해 인간 16/6Id mAb 로 자극하고, 시토카인 (INF-γ, TGF-β 및 IL-10) 분비에 대해 상청액을 ELISA 로 시험하였다.
도 3 은 대표 실험의 결과를 나타낸다. hCDR1 은 INF-γ의 생성을 하향조절하고 (도 3A), TGF-β(도 3B) 및 IL-10 (도 3C) 의 분비는 상향조절하는 것을 알 수 있다. 대조군으로서 사용된 펩티드 (p259-271, 근무력증성 펩티드인 것으로 나타났음) 는 INF-γ 및 IL-10 생성에 유의미한 영향을 미치지 않았고, TGF-β의 상향조절에 덜 효과적이었음을 주지해야 한다.
실시예 5
펩티드 hCDR1 및 hCDR3 은 인간 16/6Id mAb 에 대한 SLE 환자의 PBL 증식 반응을 억제한다.
SLE 를 겪는 남성 9 명 (14.5%) 및 여성 53 명 (85.5%) 의 62 명 환자가 연구에 참여하였다. 진단 시 평균 연령은 32.95 ±12.92 (범위 12 - 61) 세였고, 평균 추적조사 기간은 10.98 ±10.76 (범위 1 - 32) 년이었다. 모든 환자는 미국 류마티즘 학회 (American College of Rheumatology, ACR) 의 SLE 에 대해 개정된 진단 기준 (Tan 등, 1982) 의 4 개 이상을 만족시켰다. 환자들은 3 군데의 이스라엘 의료 센터 (Kaplan, Rehovot; Ichilov, Tel Aviv; Asaf-Harofeh, Rishon Lezion) 에서 모집하였다. 질병 활성은 SLEDAI 루푸스 활성 지수 (Bombardier 등, 1992) 에 따라 결정하였다. SLE 환자와 동시에, 36 명의 연령 및 성별이 매치된 건강한 대조 지원자의 대조군을 연구하였다. 연구는 의료 센터의 윤리 위원회 (the Ethical Committee of the Medical Center) 에 의해 허가되었다.
인간 16/6Id mAb 의 CDR1 및 CDR3 에 근거하는 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 이 인간 16/6Id mAb 에 대한 SLE 환자의 PBL 의 특이적 증식 반응을 억제할 수 있는지의 여부를 조사하는 것이 관심사였다. 이를 위해, 먼저 이들의 PBL 이 인간 16/6Id mAb 에 의해 증식하도록 자극될 수 있는 환자 (반응자) 를 동정해야 했다.
따라서, 일련의 62 명의 SLE 환자의 PBL 을 인간 16/6Id 의 존재 하에 배양하고, 이들의 증식 반응 및 IL-2 를 분비하는 능력을 결정하였다. 시험된 총 62 명 중 24 명 (39%) 및 55 명의 SLE 환자 중 23 명 (42%) 의 PBL 이 각각 증식 (SI ≥2, 범위 2 - 5.6) 및 IL-2 분비 (SI ≥2, 범위 2 - 60) 에 대해 반응하였다. SLE 환자군 중 반응자의 빈도가 대조군으로서 시험된 건강한 공여자군에서 관찰되는 것보다 낮았다. 따라서, 총 36 명의 건강한 공여자 중 21 명 (58%) 의 PBL 이 16/6Id 에 대해 증식으로 반응하였다. 증식 정도 (SI 수준) 는 16/6Id 에 반응한 SLE 환자 및 건강한 대조군이 유사하였다. 그러나 도 4 에 나타낸 바와 같이, 대조군 공여자의 PBL 의 16/6Id 에 대한 최적 반응은 SLE 환자와 비교하여 더 높은 농도의 16/6Id 에서 관찰되었다.
16/6Id 에 반응하는 SLE 환자와 비반응군의 환자의 성별 및 연령 간 차이는 나타나지 않았다. 그러나, PBL 이 16/6Id 에 반응하여 증식하는 환자는 더 짧은 시기 동안 아팠다 (반응자 및 비반응자 사이의 평균은 각각 9.78 ±8.36 대 11.73 ±12.06 년임; P ≤0.036). 표 3 은 SLE 환자의 16/6Id 반응자 및 비반응자군의 임상적 특징을 요약하고 있다. 표에서 알 수 있듯이, 두 군 모두 대 부분의 SLE 관련 임상 증상에 있어 유사하였다. SLE 질병 활성 스코어 (SLEDAI) 및 SLE 진단 기준의 수도 또한 2 개 군에서 유사하였다. 그럼에도 불구하고, 비반응자군과 비교하여, 환자의 반응자군에서 더 빈번한 신경학적 (발작 및 정신이상 둘 다) 및 혈액학적 관여 및 더 낮은 비율의 신장 관여가 나타났다. 그러나 아마도 관련 하위그룹의 적은 환자수로 인해, 상기 차이는 통계학적 유의성에 도달하지 못했다. 또한, 상대적으로 더 적은 반응자 환자가 연구 시에 스테로이드 또는 세포독성제로 처리된 사람들 사이에서 결정되었다. 스테로이드를 투약받지 않은 유의미하게 더 많은 환자들이 비반응자군과 비교하여 16/6Id 에 반응하였음 (54% 대 21%; P=0.023) 을 주목할만 하다.
16/6Id 에 대한 건강한 공여자 PBL 의 증식 반응을 억제하는 CDR 기재 펩티드의 효능은 SLE 환자의 PBL 에 대해 관찰되는 것보다 훨씬 더 낮음을 주목할만 하다 (나타내지 않음).
Figure 112003031673120-pct00001
*임상적 관여는 ACR 개정 기준에 따라 정의되었다. 항핵 항체 (ANA) 및 항-dsDNA 항체를 각각 Hep2 세포 및 크리티디아 루실리애 (Crithidia luciliae) 로 결정하였다. 항인지질 항체 (APLA) 는 하기 분석 중 하나 이상에 의해 정의되었다: 가양성 VDRL, 루푸스 항응집 (LAC) 또는 항-카르디올리핀 (cardiolipin) 항체에 대한 ELISA.
†항말라리아제인 히드록시클로로퀸을 200-400 mg/일의 용량으로 사용하였다; 스테로이드 처리는 1 일 용량 ≥5mg 의 프레드니손으로 정의되었다; 사용된 세포독성제는 시클로포스파미드 (0.75-1.0 g/m2; 매달) 또는 아자티오프린 (100-150 mg/일) 이었다.
‡반응자 및 비반응자 SLE 환자의 2 개 군 사이의 차이에 대한 경향이 관찰되는 파라미터.
인간 16/6Id mAb에 대한 SLE 환자의 PBL 의 증식 반응을 억제하는 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 의 능력을 시험하기 위해, SLE 환자의 PBL (2 ×l05/웰) 을 3 개씩, 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 (50 또는 100 ㎍/웰) 의 존재 또는 부재 하에, 상이한 농도 (0.1-20 ㎍/웰) 의 인간 16/6Id mAb 로 시험관 내에서 자극하였다. 인큐베이션 6 일 후, 3H-티미딘 (5 Ci/mmol 의 0.5 μCi) 을 추가 18 시간의 인큐베이션 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 회수하고, β-카운터를 이용하여 방사활성을 계수하였다. 결과를 3 개 배양물의 분당 평균 카운트수 (cpm) 로 나타내었다. 이어서 자극 지수 (16/6Id 의 최적 농도에서의 평균 cpm 대 16/6Id 가 없을때의 평균 cpm 의 비) 를 계산하였다. 자극 지수 (SI) ≥2 를 양성으로 간주하였다.
전체 62 명의 SLE 환자 중 24 명 (39%) 의 PBL 이 16/6Id mAb 에 대해 증식함을 발견하였다. 16/6Id 자가항체의 전체 분자에 대한 증식 반응을 억제하는 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 의 능력을 19 명의 SLE 환자 반응자의 PBL 상에서 시험하였다.
표 4 는 상기 실험의 결과를 나타낸다. 증식능의 50% 초과 억제를 양성으로 간주하였다. 표는 각각의 펩티드에 대한 최고 양성 억제능을 나타낸다. 인간 hCDR1 및 hCDR3 은 시험한 19 명의 반응자 중 각각 16/19 (84.2%) 및 15/19 (78.9%) 의 PBL 의 증식을 억제함을 알 수 있다. 두 펩티드 모두 시험한 반응자의 18/19 (95%) 의 PBL 증식을 억제했다. 또한 표에서, 억제 정도가 두 펩티드 모두 유사함을 알 수 있다. 따라서, 인간 16/6Id mAb 의 CDR1 및 CDR3 에 근거하는 펩티드가 인간 16/6Id mAb 에 대한 SLE 환자의 PBL 증식의 효율적 억제제인 것으로 결론지을 수 있다.
Figure 112003031673120-pct00002
실시예 6
hCDR1 및 hCDR3 의 억제능의 특이성
hCDR 기재 펩티드의 억제 효과가 SLE 관련 반응에 특이적이라는 것을 입증하는 것이 중요하다. 이를 위해, 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 을 분열촉진인자 (mitogen) 인 피로헤마글루티닌 (PHA, 2 ㎍/ml) 으로 자극한 SLE 환자의 PBL 의 배양물에 첨가하였다. 한 SLE 환자의 PBL 로 수행한 상기 실험의 결과를 도 5 에 나타낸다. 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 은 분열촉진인자 PHA 에 대한 PBL 의 증식 반응을 억제하지 못했고 (cpm 으로 나타냄), 증식 반응은 hCDR1 또는 hCDR3 의 부재 (검은 칼럼) 또는 존재 하에 유사하게 높았다.
또다른 실험에서, SLE 환자의 PBL 배양물을 인간 16/6Id mAb 로 자극한 후, 인간 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 와, 또는 대조군으로서 쥐과 펩티드 mCDR3 과 인큐베이션하였다. 한 SLE 환자의 PBL 로 수행한 상기 실험의 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, 인간 자가항체에 근거한 두 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 이 모두 인간 16/6Id mAb 에 대한 PBL 의 증식 반응을 효과적으로 억제하는 반면, 쥐과 항체의 CDR3 에 근거한 펩티드 mCDR3 는 증식을 억제하지 않았다.
2 개의 추가 대조군 펩티드, 즉 쥐과 mCDR1 및 mCDR3 펩티드의 역방향으로 합성된 펩티드 (revmCDR1 및 revmCDR3) 를 상기 실험에 사용하고, 그 결과를 도 7 에 나타낸다. 2 개의 역방향 펩티드가 인간 16/6Id mAb 에 대한 SLE 환자의 PBL 의 증식 반응을 유의미하게 억제하는데 실패한 반면, 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 은 증식을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있고, 이는 인간 hCDR 기재 펩티드에 의한 증식의 억제가 펩티드 및 SLE 관련 T 세포 반응에 특이적임을 나타낸다.
실시예 7
펩티드 hCDR1 및 hCDR3 의 존재 하의 SLE 환자의 PBL 에 의한 IL-2 분비의 하향조절
hCDR 펩티드가 인간 16/6Id mAb 로의 자극 후 SLE 환자의 PBL 에 의한 IL-2 분비를 억제할 수 있는지 여부를 알아내는 것이 관심사였다. 상기 억제는 또한 인간 CDR 기재 펩티드가 적어도 부분적으로 IL-2 분비의 하향조절에 의해 16/6Id mAb 에 대한 증식 반응을 억제함을 시사한다. 이를 위해, SLE 환자의 PBL 을 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 의 부재 또는 존재 하에 인간 16/6Id mAb 와 인큐베이션하였다. 배양물의 상청액을 인큐베이션 48 시간 후 수집하였다. 상청액 중 IL-2 의 수준 결정을 위한 분석은 CTLL IL-2 의존성 세포주를 이용하여 수행하였다. 간단히, CTLL 세포주의 세포 (2 ×104/웰) 를 24 시간 동안 상이한 상청액의 존재 하에 인큐베이션한 후, 추가 18 시간의 인큐베이션 기간 동안 3H-티미딘을 첨가하였다. 이어서, 세포를 회수하고 β-카운터를 이용하여 방사활성을 계수하였다. 결과는 재조합 인간 IL-2 를 표준물로서 사용하여 계산하였다. 인간 16/6Id 에 의해 자극된 23 명의 반응자의 PBL 의 IL-2 분비를 억제하는 펩티드의 능력을 시험하였다. 표 5 에 요약된 결과는 hCDR1 및 hCDR3 이 각각 21/23 및 19/23 환자의 PBL 에 의한 IL-2 분비를 억제함을 나타낸다. PBL 의 증식 반응의 억제는 CDR 기재 펩티드에 의한 IL-2 억제와 직접 연관되었다. 따라서, IL-2 분비의 억제는 증식 억제가 결정되는 모든 경우에서 관찰되었다.
도 8 에 나타낸 한 SLE 환자의 PBL 에서 수득되는 결과는 (IL-2 의 분비는 pg/ml 로 나타냄) hCDR1 및 hCDR3 둘 다 인간 16/6Id mAb 에 의해 유도되는 SLE 환자의 PBL 에 의한 IL-2 분비를 100% 억제함을 나타낸다.
hCDR1 및 hCDR3 에 의한 IL-2 분비의 억제
펩티드 억제 활성* % 최대 억제%
hCDR1 91 (21/23) 84 ±31
hCDR3 83 (19/23) 78±34
*16/6Id 단독 존재 하의 IL-2 분비를 100% 로 간주하였다. 50% 이상의 억제를 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 8
CDR 기재 펩티드에 의한 면역억제성 시토카인 TGF-β분비의 상향조절
인간 CDR 기재 펩티드가 인간 모노클로날 항-DNA 16/6Id 항체에 대한 증식 반응을 억제하는 기전을 밝히고자 하는 시도에서, 세포 배양물의 상청액 중 면역억제성 시토카인 TGF-β의 수준을 결정하였다. 상기 실험의 배경이 되는 논리는 마우스 CDR 에 근거한 펩티드를 처리 후 자발적으로 {(NZB ×NZW) F1 마우스} 또는 인간 항-DNA 16/6Id mAb 로 유도된 SLE 를 갖는 마우스의 비장세포의 배양물 중 TGF-β수준이 상승되었다는 이전의 발견 (Eilat 등, 2001) 에 근거한다. TGF-β수준의 상승은 처리된 마우스에서 질병 증상의 완화와 연관되었다.
상기 목적을 위해, 펩티드 hCDR1 또는 hCDR3 의 존재 또는 부재 하에 인간 16/6Id mAb 와 48 시간 인큐베이션 후 다양한 SLE 환자의 PBL 배양물로부터 상청액을 제거하였다. TGF-β는 제조자의 지시에 따라 ELISA 로 결정하였다. 간단히, Maxisorb 플레이트 (Nunc) 를 PBS 중에 희석된 (100 ng/ml) 인간 TGFβsRII/Fc 키메라 (R & D Systems) 로 피복하였다. 블로킹 후, 세포 상청액 을 첨가하였다. 18 시간 인큐베이션 후, 검출용 비오틴화 항-인간 TGF-β항체 (R & D Systems) 를 첨가하였다. 사용된 기질 용액은 TMB Colour Reagent (Helix Diagnostics) 였고, 효소 활성은 570 nm 및 630 nm 필터를 이용하여 MRX ELISA 탐독기로 평가하였다. 결과를 표 6 에 요약한다.
도 9 에서의 결과는, 펩티드 hCDR1 및 hCDR3 이 병원성 인간 16/6Id mAb 로 자극된 한 대표 SLE 환자의 PBL 에 의한 TGF-β(pg/ml 로 나타냄) 분비의 유의미한 상향조절을 유도함을 나타낸다.
hCDR1 및 hCDR3 펩티드에 의한 SLE 환자의 PBL 의 16/6Id-유도 자극의 TGF-β분비의 상향조절
펩티드 TGF-β의 상향조절% 최대 상향조절%
hCDR1 100 (19/19) 305 ±221
hCDR3 100 (19/19) 338 ±242
16/6Id 단독 존재 하의 TGF-β의 분비 (평균 636 ±25 pg/ml) 를 100% 로 간주하였다. 16/6Id 단독 존재 하에서의 초과 분비% 로 결과를 나타낸다.
실시예 9
hCDR1 에 의한 마우스에서 SLE 증상의 면역조절: hCDR1 로 (NZB ×NZW) F1 마우스 처치 후 질병 증상의 완화.
상기에 나타낸 바와 같이, 인간 항-DNA 16/6Id mAb 의 CDR 에 근거한 펩티드는 16/6Id mAb 에 대한 림프절 세포의 감작 및 16/6Id mAb 에 대한 SLE 환자의 PBL 의 증식 반응을 유사한 효능으로 억제할 수 있었다. 따라서, 상기 펩티드가 동물 모델에서 SLE 유사 질병을 면역조절할 수 있는지를 밝히는 것이 관심사였다.
구축된 SLE 질병을 처치하기 위한 인간 펩티드의 능력을 평가하기 위한 실험 을 먼저 hCDR1 펩티드로 수행하였다. 이를 위해, 이미 SLE 유사 질병의 증상 (항-dsDNA, 단백뇨 등) 이 관찰되는 경우, SLE 에 걸리기 쉬운 (NZB ×NZW) F1 마우스를 5½ 연령 때에 hCDR1 펩티드로 처리하는 일부 실험을 고안하였다. hCDR1 펩티드를 10 주 동안 매주 PBS 중에서 s.c. 투여하였다. 상이한 용량 (50, 100 및 200 ㎍/마우스) 의 hCDR1 펩티드의 효능을 시험하였다. 대조군에는 담체 PBS 를 주사하였다. 처치로 항-dsDNA 자가항체 역가가 적당히 감소되었다. 따라서, 1:1250 혈청 희석 시에, 각각 PBS 처리한 마우스, 50 ㎍/마우스, 100 ㎍/마우스 및 200 ㎍/마우스 hCDR1 을 처리한 마우스의 혈청 처리 말기에 O.D. 값 0.586 ±0.1, 0.27 ±0.1, 0.37 ±0.1 및 0.29 ±0.1 이 측정되었다.
7 월령 (NZB ×NZW) F1 마우스를 10 주 동안 매주 PBS 중 300 ㎍ 의 hCDR1 을 s.c. 주사하는 또다른 실험을 수행하였다. hCDR1-처리 마우스의 혈청에서 항-DNA 항체 역가의 약한 감소를 관찰할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 표 7 은 hCDR1 처리가 처리된 마우스의 신장에서 면역 복합체 침전물 (ICD) 의 유의미한 감소 및 단백뇨의 감소를 일으킴을 나타낸다. 표에서의 결과를 ICD 의 강도로 나타낸다 (여기서, 0 = ICD 가 없음; 1 = 중간 정도의 ICD; 2 = 상당한 ICD 및 3 = 상당하고 매우 진한 ICD 임).
7 월령에서 hCDR1 로 처리한 (NZB ×NZW) F1 마우스의 임상 증상
처리 단백뇨 g/L ±SEM 면역 복합체 침전물 ±SEM
비처리 4.80 ±2.56 2.57 ±0.29
hCDR1 300 ㎍/마우스 1.08 ±0.38 1.44 ±0.41 p = 0.035
p 는 마우스의 비처리군과 비교하여 계산하였다.
이어서, 400 ㎍/마우스의 hCDR1 을 이용하여, 펩티드의 용량 증가로 보다 유익한 효과가 얻어질 수 있는지를 알아내기 위한 추가 실험을 수행하였다. 400 ㎍/마우스의 hCDR1 처리는 항 DNA 항체 역가에 더 우수한 효과를 나타내지 않았고, 표 8 에서 알 수 있듯이, 신장 질병 상의 효과는 300 ㎍ 용량 처리 후에 관찰되는 것과 유사하였다.
6 월령에서 hCDR1 로 처리한 (NZB ×NZW) F1 마우스의 임상 증상
처리 단백뇨 g/L ±SEM 면역 복합체 침전물 ±SEM
비처리 4.99 ±2.53 2 ±0.29
hCDR1 400 ㎍/마우스 0.77 ±0.32 1.42 ±0.19 p = 0.05
p 는 마우스의 비처리군과 비교하여 계산하였다.
따라서, 마우스에 7 월령에서 hCDR1 300 ㎍ 을 처리하고, 대조군 펩티드, 즉 역전된 hCDR1 을 사용하는 추가 실험을 수행하였다. 실험의 목적은 임상 증상의 완화에 부가하여, hCDR1 처리가 시토카인 생성을 면역조절하는지를 확인하는 것이었다. 도 10 은 항-DNA 자가항체 수준의 약한 감소를 나타낸다. 표 9 는 상이한 시점에서 측정된 단백뇨를 나타낸다.
7 월령에서 hCDR1 로 처리한 (NZB ×NZW) F1 마우스의 임상 증상
처리 하기 처리 후 단백뇨 g/L ±SEM:
5 7 9
비처리 2.65 ±1.76 3.89 ±2.73 7.55 ±3.95
hCDR1 300 ㎍/마우스 0.61 ±0.23 0.65 ±0.32 1.02 ±0.39 p = 0.05
revhCDR1 300 ㎍/마우스 6.94 ±2.53 6.76 ±2.91 5.99 ±3.08
hCDR1 의 처리 효과는 모든 측정에서 볼 수 있었다. 신장 손상은 (NZB ×NZW) F1 마우스에서 SLE-유사 질병의 주요 증상의 하나이다. hCDR1 펩티드의 10 주간 처리는 신장 질병을 유의미하게 감소시켰다. 50 ㎍ 용량은 100 및 200 ㎍ 용량 보다 신장 질병의 처치에 있어 덜 효과적이었다. 후자의 2 개 용량은 유사하게 효과적이었다.
도 11A-11D 는 100 ㎍ 용량의 hCDR1 을 처리한 마우스의 대표 신장 절편을 나타내는 사진이다. 즉, 9 월령의 마우스를 죽이고 이들의 신장을 제거하여 즉시 액체 질소 중에 냉동하였다. 5 ㎛ 의 냉동 저온조 절편을 공기 건조하고 아세톤 중에 고정시켰다. Ig 침전물의 검출을 위해, 절편을 FITC-공액 염소 항-마우스 IgG (γ-사슬 특이적) 와 인큐베이션하였다. 도 11A 및 11B 는 PBS 처리군 (대조군) 의 마우스의 신장 절편을 보여주는 반면, 도 11C 및 11D 는 100 ㎍ 의 hCDR1 으로 처리한 마우스의 신장 절편을 보여준다. 도에서, 처리로 면역 복합체의 수 뿐만 아니라 이들의 강도도 감소됨을 알 수 있다 (11A, 11C ×100; 11B, 11D ×400).
(NZB ×NZW) F1 마우스군에 이들의 전체 발병이 이미 관찰되는 7 월령에서 hCDR1 을 처리한 경우, 유사한 결과가 수득되었다. 마우스에 10 주 동안 100 ㎍/마우스 또는 300 ㎍/마우스를 처리하였다. 두 용량의 처리로 상술된 결과와 유사하게, 항-DNA 자가항체 역가가 적당히 감소되었다. PBS 처리군과 비교하여 단백뇨의 감소도 측정되었다. 신장 질병은 두 용량으로의 처리 후 완화되었다; 그럼에도 불구하고, 300 ㎍ 용량으로 처리된 마우스군에서 보다 유의미한 효과가 결정되었다. 도 12A-12F 는 각 군의 대표 마우스 신장 절편이며, 여기서 A, B 는 비처리 마우스를 나타내고; C, D 는 hCDR1-처리 마우스의 신장을 나타내고, E, F 는 역방향 hCDR1 을 처리한 마우스의 신장 절편을 나타낸다. A, C, E ×100 및 B, D, F ×400.
도 13A-13C 는 처치 (10 주 동안 s.c. 주사) 말기에 채취된 3 군의 마우스의 비장세포의 Con A-자극 배양물의 상청액 중 ELISA 로 측정된 시토카인 (INF-γ, IL-10 및 TGF-β) 패턴을 나타낸다. INF-γ (도 13A) 및 IL-10 (도 13B, 더 적은 정도) 은 처리 마우스에서 하향조절됨을 알 수 있었다. 비자극 세포의 상청액 중 TGF-β의 분비가 증가됨을 알 수 있다 (도 13C, 좌측). Con A 는 세포가 보다 많은 TGF-β를 분비하도록 유도하지 않았다 (도 13C, 우측).
상기 요약된 결과는, hCDR1 의 장기 처리가 질병 증상을 완화시키고 시토카인 분비를 면역조절한다는 것을 나타낸다.
실시예 10
실험적 SLE 의 유도 후 인간 hCDR1 펩티드로의 BALB/c 마우스 처리
hCDR1 펩티드가 인간 항-DNA 16/6Id mAb 로 마우스에서 유도된 실험적 SLE 를 처치할 수 있는지 여부를 알아내는 것이 관심사였다. 따라서, BALB/c 마우스를 16/6Id 병원성 자가항체로 면역화시키고 추가접종하였다. 추가접종 3.5 달 후 마우스가 이미 질병 증상을 발현시킬 때, 이들을 3 군으로 나누었다. 한 군은 처리하지 않고, 두번째 군은 100 ㎍/마우스의 hCDR1 을 처리하고, 세번째 군은 10 주 동안 300 ㎍/마우스의 hCDR1 펩티드를 처리하였다. 마우스를 질병 증상에 대해 추적조사하였다.
표 10 은 처리 말기의 개별 마우스의 시험에서 수득되는 결과를 나타낸다. 처리에 사용된 두 용량 모두로 모든 측정된 임상 증상 [항-dsDNA 자가항체, 백혈구 수 (WBC) 및 뇨 단백질] 에서 완화가 관찰되었다. 실험 말기 (추가 접종 7 개월 후) 에 죽인 마우스의 신장 분석에서 16/6Id mAb 로 면역화시키고 처리하지 않은 9/10 마우스의 신장에서 면역 복합체 침전물이 나타났다. 대조적으로, 면역 복합체 침전물은 16/6Id mAb 로 면역화시키고 각각 100 ㎍/마우스 및 300 ㎍/마우스의 hCDR1 을 처리한 3/10 및 2/9 마우스의 신장에서만 관찰되었다. 즉, 인간 펩티드 hCDR1 이 구축된 실험적 SLE 를 처치할 수 있음을 나타낸다.
100 ㎍ 또는 300 ㎍ 의 hCDR1 펩티드로 실험적 SLE 에 걸린 BALB/c 마우스의 처리 효과
대조군, 건강한 마우스 평균 ±SD 16/6Id 주사 평균 ±SD 16/6Id 주사 + hCDR1 100㎍ 평균 ±SD 16/6Id 주사 + hCDR1 300㎍ 평균 ±SD
단백뇨 g/l 0.12 ±0.16 0.65 ±0.36 0.3 ±0.02 0.34 ±0.25
WBC/mm3 7440 ±960 3260 ±920 6090 ±2160* 5890 ±2660*
항-dsDNA O.D. (1:50) 0.1 ±0.05 1.1 ±0.6 0.3 ±0.2* 0.55 ±0.3*
*= 16/6Id 주사군과 유의미하게 상이함 (p < 0.05).
또다른 실험에서, BALB/c 마우스를 실험적 SLE 의 유도를 위해 인간 16/6Id 로 면역화시키고 추가접종하였다. 추가접종 2 달 후, 마우스 군을 나누었다 (1 군 당 8 마리 마우스). 마우스를 10 주 동안 200, 300 또는 400 ㎍/마우스로 처리하였다. 마우스를 항체 생성, 백혈구감소증, 단백뇨에 대해 추적조사하고, 처리 말기 2 달 후 죽일때 이들의 신장을 면역 복합체 침전물에 대해 분석하였다. 표 11 에 요약한 결과는 16/6Id 특이적 항체 반응에 대한 처리가 효과 없음을 나타낸다.
Figure 112003031673120-pct00003
그러나, 처리는 항 DNA 항체 역가, 백혈구 감소증, 단백뇨의 수준, 및 더욱 중요하게는 신장 내 면역 복합체 침전물에 영향을 미쳤다. 본 실험의 대조군은 면역화되지 않거나 또는 아예 처리하지 않은 동일한 연령의 BALB/c 마우스이다. 본 실험은 hCDR1 가 실험에서의 SLE 의 처리에 유효하며 투여량 400 ㎍ 의 장점이 나타나지 않을 수 있다는 것을 시사하였다.
따라서, 추가적인 실험은 마우스를 200 및 300 ㎍/마우스로 처리하여 수행하 였다. 대조군 펩티드인 역방향 hCDR1 를 본 실험에서 사용하였다. 본 실험의 목적은, 200 및 300 ㎍ 처리 투여량 사이의 비교 외에도, 처리된 마우스에서의 시토카인 생성에 미치는 처리의 영향을 연구하는 것이다. 60 마리의 BALB/c 마우스를 16/6Id 로 면역화 및 추가접종하였다. 추가접종 후 3 개월째에, 매 주 200 또는 300 ㎍ 의 hCDR1 으로 추가처리하거나 또는 처리하지 않은 군 (군 당 마우스 15 마리) 으로 나누었다. 추가 군에는 300 ㎍ 의 역방향 hCDR1 을 처리하였다. 제 5 군 (대조군) 은 면역화시키지 않았으며, 추가 처리를 하지 않았다. 이어서, 마우스에 질병이 나타나고 항체를 생성하였다. 표 12 에 나타난 바와 같이, 마우스 혈청 중 항 16/6Id 항체 수준 (1:10000 의 희석) 는 군들 사이에서 상이하지 않았다. 표에서 나타난 바와 같이, 200 및 300 ㎍ 로 처리한 것은 모두 항 DNA 항체 수준을 감소시켰다 (혈청을 1:1250 로 희석함). 표 12 는 또한 상이한 마우스 군들에서의 임상 증상을 요약한다. 두 투여량이 모두 백혈구 감소증 및 단백뇨 감소에 유효하지만, 본 실험에서의 200 ㎍ 투여량의 효과는 유의수준에 도달하지 않는다는 것을 알 수 있다 (마우스는 처리 종료 1 개월 후 희생되었다).
Figure 112003031673120-pct00004
도 14 A - F 는 각 군의 한 신장을 나타내며, 여기서 A,B 는 비처리 마우스의 신장을 나타내며; C,D 는 hCDR1 처리 마우스의 신장을 나타내며, E,F 는 역방향 hCDR1 로 처리된 마우스의 신장 절편을 나타낸다. 도면에서 배율은 A,C,E x 100 및 B,D,F x 400.
도 15 A - E 는 16/6Id 로 처리된 마우스의 림프절 배양물의 상층액 중 상이 한 시토카인 수준을 나타낸다. 후자의 시험은 처리 종료 (10 회 처리 주사 후) 시 수행되었다. hCDR1 (두 투여량 모두) 를 사용한 처리군은 INF-γ (도 15A), IL-10 (도 15C) 및 TNF-α (도 15B) 를 하향조절한다는 것을 알 수 있다. 한편, hCDR1 는 TGF-β 의 수준을 상향조절한다.
비장세포가 일반적으로 림프절 세포보다 더 많은 TGF-β를 분비하므로 (도 15D), TGF-β 는 또한 상이한 군들의 마우스의 16/6Id 자극 비장 세포의 상층액에서도 측정된다 (도 15E).
따라서, hCDR1 는 질병 증상을 개선시키며, 유도된 실험적 SLE 에 걸린 마우스에서의 시토카인 생성을 면역학적으로 조정한다.
실시예 11
hCDR1 처리 마우스의 비장세포에 의한 루푸스 증상에서의 유익한 효과의 전이
hCDR1 을 사용하는 질병 증상의 하향조절에 의해 나타나는 치료의 유익한 효과가, 처리된 마우스의 비장 세포에 의해 전이될 수 있는지의 여부를 연구하는 것이 중요하다. 상기 목적을 위해, 완전 (full-blown) 루푸스형 질환을 이미 앓은 8 월령 (NZB x NZW)F1 마우스들을 2 개의 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 군 1 은 처리하지 않았고, 군 2 의 마우스들은 300 ㎍/마우스의 hCDR1 로 3 회 주사 (s.c., 이틀에 한 번) 한 3 월령 (NZB x NZW)F1 마우스의 비장 세포 20 x 106 로 전이시켰다. 모든 비장세포를 복막내 주사하였다. 마우스를, 항 dsDNA 자가 항체 생성, 질환 증상에 대해 시험했고, 세포전이 후 4 주째에 죽였다. hCDR1 처리 마우스 세포의 전이는 항 DNA 항체 수준의 적은 감소를 초래하였다.
표 13 은 hCDR1 처리 마우스의 비장세포의 전이가 단백뇨의 유의미한 저감 및 신장에서의 면역 복합체 감소를 초래한다는 것을 나타낸다.
hCDR1 으로 처리된 마우스 비장 세포의 마우스 수용자에서의 루푸스의 임상 증상
군 번호 처리 단백뇨 g/L ±SEM I.C.D. ±SEM
1 비처리 15.07 ±4.92 2.25 ±0.47
2 hCDR1 처리 마우스로부터의 비장 세포 20 ×106 0.97 ±0.67 p = 0.05 0.75 ±0.47 p = 0.05
p 값은 비처리 마우스의 grl 에 비교하여 계산되었다.
revhCDR1 를 대조군으로 사용하여 여러 번 더 실험을 반복하였다. 결과는 첫번째 실험의 것과 유사했는데, 즉, 처리된 마우스의 세포 전이는 항 DNA 항체 역가에 약간 영향을 미쳤고, 단백뇨 및 신장 손상에는 유의미하게 영향을 미쳤다. 대표적인 실험의 임상 증상을 표 14 에 나타냈다.
hCDR1 으로 처리된 마우스 비장 세포의 마우스 수용자에서의 루푸스 임상 증상
군 번호 처리 단백뇨 g/L ±SEM I.C.D. ±SEM
1 비처리 10.9 ±3.05 2.3 ±0.26
2 hCDR1 처리 마우스로부터의 비장 세포 20 ×106 2.91 ±1.6 p = 0.0402 1.33 ±0.35 p = 0.034
3 revhCDR1 처리 마우스로부터의 비장 세포 20 ×106 5.38 ±2.34 p = 0.0931 1.7 ±0.23 p = 0.065
p 값은 비처리 마우스의 grl 과 비교해 계산되었다.
hCDR1 를 사용한 처리의 하향조절 효과는 처리된 마우스의 비장 세포에 의해 전이될 수 있음을 알 수 있다.
도 16 A - F 는 군 1 (A, B - 비처리 마우스), 군 2 (C, D - hCDR1 으로 처리된 2 월령 마우스의 비장세포 수용체) 및 군 3 (E, F - revhCDR1 으로 처리된 2 월령 마우스의 비장세포 수용체) 의 마우스의 신장 절편을 나타낸다. A,C,E x 400; B,D,F x 100.
상기 실험의 결과는 hCDR1 의 질환 증상의 개선 효과가 hCDR1 로 처리한 건강한 마우스의 면역세포에 의해 전이될 수 있음을 나타낸다.
실시예 12
쥐과 mCDR 펩티드에 의한 MMP-3 및 MMP-9 의 하향조절.
매트릭스 메탈로프로틴아제 (MMP) (Shingleton 등, 1996; Goetzl 등, 1996; Massova 등, 1998) 는 정상 조직에서의 세포외 기질의 리모델링에서 중요한 역할을 하며, 또한 병리학적 진행에 기여하는 아연 함유 엔도프로테나아제 (endoproteinase) 의 한 패밀리를 구성한다. 이들은 구조적인 도메인을 공유하나, 기질 특이성, 세포 원 및 유도능 (inducibility) 이 상이하다.
MMP 는 전효소형 잠재 전구물질 (zymogen-like latent precursor) 로서 합성되며, 후속적으로 활성 형태로 전환된다. MMP-2 및 MIMP-9 는, 모두 젤라티나아제 (gelatinase) 로서, 타입 IV 콜라겐, 변성된 콜라겐, 타입 V, VII, X 및 XII 콜라겐, 비트로넥틴, 아그레칸 (aggrecan), 갈렉틴-3 (galectin-3) 및 엘라스틴을 분해할 수 있다. MMP-2 는 가장 널리 발현되는 MMP 이다. 이는 각종 세포에서 생성되며, 종종 악성 종양 전이에서 상승된다.
단백질 및 도메인 구조의 측면에서, MMP-9 는 이제까지 동정된 것중 가장 크 며, 가장 복잡한 종류이다. MMP-9 증상은 유전자 전사 및 단백질 분비 염증 매개체 (예컨대 시토카인, 케모카인, 에이코사노이드) 수준, 및 메탈로프로틴아제의 조직 저해제 (TIMI) 작용의 엄격한 제어를 이용하는 복잡한 조절을 특징으로 한다. 또한, MMP-9 활성은 플라스미노겐 활성화 시스템 또는 기타 MMP 의 구성요소에 의한 프로 MMP-9 의 활성화에 의해 변화된다 (Guedez 등, 1996).
자가면역 질환에서의 MMP 의 관련성은 각종 자가면역 질환, 예컨대 다발성 경화증 (Ozenci 등, 1999) 및 그의 동물 모델 실험의 자가면역 뇌척수염 (EAE) (Gijbels 등, 1994), 류마티스형 관절염 (Keyszer 등, 1999), 길레인 바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) (Creange 등, 1999), 실험에서의 유천포창 (Liu 등, 1998) 및 실험에서의 자가면역 신경염 (Hughes 등, 1998) 에서 증명되었다. 낭창성 신염 환자에서의 MMP-3 및 TIMP-2 의 혈청 수준은 건강한 대조군의 것보다 유의미하게 더 높은 것으로 보고되었으나, 질환 활성과의 연관성은 언급되지 않았다 (Zucker, 1999; Keyszer 등, 1999).
염증 응답성에서의 MMP 의 다수의 활성의 잠재적인 중요성은, 자가면역 질환의 각종 동물 모델에서의 MMP 저해제의 저해 효과에 의해 시사되었다. 생체 내 MMP 의 특이적인 저해는 부종, 병소 조직 분화, 및 각종 염증 및 자가면역 질환에서의 분화된 조직 구조의 손상을 억제한다 (Gijbels 등, 1994; Wallace 등, 1999; Conway 등, 1995).
본 발명에 따르면, 자발성이거나 또는 유도된 실험에서의 SLE 로 처리된 마우스의 신장 및 혈청 모두에서 MMP-3 및 MMP-9 의 수준이 상승됨을 보였다. 또한, SLE 처리 마우스를 CDR 기재 쥐과 펩티드로 처리하면, 마우스에서의 루푸스 증상을 개선하여, 처리된 마우스의 혈청 및 신장에서의 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 감소시키며, 또한 질환 증상의 개선을 초래한다는 것을 증명하였다. 동일한 효과가 본 발명의 인간 hCDR 펩티드에 의해 나타날 것으로 예상된다.
실시예 12(i)
(NZBxNZW)F1 마우스의 혈청 중 MMP-3, MMP-2 및 MMP-9 출현의 키네틱.
우선, (NZB x NZW)F1 마우스 중의 자발성 SLE 의 발생이 그의 혈청 중 MMP-3, MMP-2 및 MMP-9 의 수준 변화와 연관있는지를 검증하였다. 이어서, 질환 증상이 관찰되기 전, 2 월령에서 출발하여, 마우스가 질환을 앓게된 8 월령에 이를때까지 후자들의 수준을 추적하였다. 결과를 도 17 에 나타냈다. 도 17A 에서 나타난 바와 같이, 2 월령 마우스 혈청 중의 MMP-3 의 34 kd 및 40 kd 형태는 웨스턴 블럿팅 분석에서 매우 적게 검출된다. 모든 형태의 수준이 시험 종말점인 8 월령으로 갈수록 점진적으로 상승된다. 유사하게, 도 17B 는, 겔 자이모그래피 (gel zymography) 로 평가된 MMP-9 활성이 2 월령에서 낮으며, 8 월령이 될 때까지 질환의 진행에 따라 마우스의 혈청중에서 점진적으로 상승한다는 것을 보여준다. 또한, 도 17B 에서 MMP2 의 수준은 질환의 진행에 따라 유의미하게 변화하지 않음을 알 수 있다.
실시예 12(ii)
16/6Id 로 면역화된 BALB/c 마우스 혈청 중 MMP-3, MMP-2 및 MMP-9 출현의 키네틱.
본 연구실의 선행 결과들은 SLE 이 16/6Id 로 면역화된 BALB/c 마우스에서 유도될 수 있음을 나타냈다 (Mendlovic 등, 1988; Waisman 등, 1993). 따라서, SLE 의 유도 모델이 MMP-3 및 MMP-9 의 변화에 대해 (NZB x NZW)F1 모델과 유사한지의 여부에 관심을 가졌다. 따라서, SLE 의 상기 실험 모델에서 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 고찰하였다. 도 18 에 나타낸 결과는 MMP-3 (모든 동종체) 의 수준이 추가접종 (4.5 주 후의 면역화) 10 일 후 상승함을 나타내며, 동일한 연령의 비면역화 대조군 또는 CFA 면역화 BALB/c 마우스보다 더 높음을 나타냈다 (도 18A). MMP-3 의 수준은 모든 군에서 연령과 함께 상승하나, 후자는 언제나 16/6Id 면역화 마우스에서 대조군에 비해 더 높았다. 대조적으로, 추가접종 2 개월 후까지 MMP-9 활성에서의 변화 유도가 검출되지 않았다 (도 18B). 비면역화 마우스보다 더 높은 16/6Id 면역화 마우스에서의 MMP-9 의 활성은 추가면역 약 4 개월 후 관찰될 수 있다.
실시예 12(iii)
16/6Id 로 면역화된 BALB/c 의 신장 절편에서의 MMP-3 및 MMP-9 의 특이적인 상향조절.
BALB/c 마우스를 16/6Id 로 면역화하는 것은 신장 손상을 포함하는 SLE 의 임상 증상 특징을 유도하며 (Mendlovic 등, 1988; Waisman 등, 1993), (NZB x NZW)F1 마우스에서의 신장 손상이 MMP-3 및 MMP-9 의 수준 상승과 연관된 것으로 보고되었으므로 (Nakamura 등, 7 1993), 16/6Id 로 면역화된 BALB/c 마우스의 신장에서 상기 효소들의 발현을 고찰하였다. 대조군으로서, CFA 로 면역화된 마우스 및 연령이 상응하는 비면역화 마우스를 사용하였다. 두 대조군은 모두 추가접종시에 PBS 를 주사하였다. 16/6Id 를 사용한 추가접종 후 2 개월 및 5 개월째에, 마우스의 신장 절편을 MMP-3 또는 MMP-9 에 대해 면역조직학적으로 염색하였다. 도 19 는 추가접종 후 5 개월째에 취한 신장의 면역조직학적 특성을 나타낸다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, CFA 를 사용한 마우스의 면역화는 사구체 및 주변 조직에서 신장의 MMP-3 (19A) 및 MMP-9 (19B) 의 발현을 모두 상향조절하였다. 그럼에도 불구하고, CFA 중 16/6Id 를 사용하는 면역화는 추가적으로 상기 두 가지 MMP 의 발현 수준을 유의미하게 상승시켰다. 상기 상승은 이미 16/6Id 를 사용한 추가접종 후 2 개월 째에 관찰되었다 (데이타를 제시하지 않음). 염색의 비특이적인 배경 수준을 또한 나타냈다 (19C).
실시예 12 (iv)
쥐과 mCDR1 펩티드가 (NZB x NZW)F1 마우스의 혈청 중 MMP-3 의 수준 및 MMP-9 의 활성을 하향조절한다.
SLE 의 두 실험 모델에서 MMP-3 및 MMP-9 의 수준이 상승됨을 보였으므로, mCDR1 펩티드를 사용한 처치 후 관찰되는 SLE 의 임상 병후에서의 개선 (Eilat 등, 2000; Ellat 등, 2001) 이, MMP-3 및 MMP-9 의 수준의 감소와 동반되는지의 여부에 관심을 가졌다. 따라서, 2 월령의 (NZB x NZW)F1 마우스 (임상 증상이 관찰되기 전) 에 매주 PBS 중 mCDR1 (250 ㎍/마우스) 를 s.c. 로 10 주 동안 주사하여 SLE 류 질환이 자연 발생하도록 처리하였다. 상기 예방 프로토콜은 모든 임상 병후의 개선을 야기하였다 (Eilat 등, 2000). 도 20 에서 알 수 있는 바와 같이, 혈청 중 MMP-3 (20A) 및 MMP-9 활성 (20B) 의 2 개의 하부 밴드에서 감소가 있다. 상기 감소는 임상 증상에서의 감소와 연관되어 있다 (Eilat 등, 2000). 도 20A 에서 나타난 바와 같이, MMP-3 의 45 kd 형태는 영향을 받지 않았다.
또한, mCDR1 펩티드가 상승된 MMP-3 의 수준 및 MMP-9 의 활성을 하향조절할수 있는지의 여부를 밝히는 것에 관심을 가졌다. 따라서, 질환 증상이 이미 관찰된 시점에 mCDR1 으로 처리된 (NZB x NZW)F1 마우스의 혈청 중 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 고찰하였다. 대조군 펩티드로서, 역방향 mCDR1 을 사용하였다. 나타난 바와 같이 (도 20, 우측), 병든 마우스를 revmCDR1 가 아닌 mCDR1 를 사용한 처리는, 특이적으로 혈청 중 MMP-3 의 수준 (20A) 및 MMP-9 의 활성 (20B) 을 하향조절하였다.
실시예 12(v)
mCDR1 펩티드는 16/6Id 면역화 마우스의 혈청 중 MMP-3 의 수준 및 MMP-9 의 활성을 하향조절한다.
증명한 바와 같이, MMP-9 의 활성은 SLE 의 두 가지 실험 모델 [(NZB x NZW)F1 및 16/6Id 유도] 에서 상승한다. 두 모델에서 모두 mCDR1 펩티드가 질환을 개선시키며 처리된 (NZB x NZW)F1 마우스의 혈청 중 MMP-3 수준 및 MMP-9 활성을 하향조절하는 것으로 나타났으므로, 16/6Id 면역화 BALB/c 마우스의 혈청 중 상기 효소들에 대한 처리 효과를 고찰하였다. 도 21 는 본 발명 및 처리 실험의 결과를 나타낸다. 도면은 mCDR1 이 본 실험 모델에서도 MMP-3 및 MMP-9 를 하향조절할 수 있음을 보여준다. MMP-3 수준 및 MMP-9 활성의 하향조절은 예방 및 치료 프로토콜 두가지에서 모두 관찰되었다. 따라서, mCDR1 의 생체내 투여는, 질병 유도 단계 또는 완전한 질병 단계에서 모두 MMP-3 (21A) 및 MMP-9 (21B) 의 수준을 감소시킬 수 있다. 상기 감소는, 역방향 mCDR1 가 MMP-3 또는 MMP-9 활성에 영향을 미치지 않으므로 (나타내지 않음), 특이적이었다. MMP-9 활성 검정 시스템 (Amersham-Pharmacia Biotech UK Limited, England) 을 사용한 예비 결과는 면역화된 BALB/c 마우스로부터의 혈청의 활성이 7 ng/ml 의 순수한 활성 MMP 와 비견된다는 것을 보여준다. 16/6Id 를 사용한 면역화는 활성을 16 ng/ml 까지 상승시키며, mCDR1 펩티드를 사용한 처리는 거의 정상 수준 (8.5 ng/ml) 로까지 하향조절한다.
실시예 12 (vi)
16/6Id 면역화 BALB/c 마우스의 신장 절편에서의 MMP-3 및 MMP-9 수준에 대한 mCDR1 펩티드 처리 효과.
유도 실험에서의 SLE 마우스의 신장에서 MMP-3 및 MMP-9 는 상승되므로, 처리된 마우스의 신장에서 후자의 MMP 의 발현에 대한 mCDR1 펩티드 처리 효과를 고찰하는 것에 관심을 가졌다. 도 22 는 예방 (도 22A) 및 치료 (도 22B) 실험에서 모두, mCDR1 가 처리된 마우스의 신장에서 MMP-3 및 MMP-9 의 발현 수준을 모두 하향조절하는 것을 나타낸다. MMP 수준의 감소는 사구체 및 간질 모두에서 관찰되었다. MMP 발현에서 관찰된 감소는 항 Ig 를 사용한 면역 복합체 침전물의 염색에서의 감소와 상관있었다 (도 22B).
SLE 병인에서 MMP-3 및 MMP-9 의 명백한 관련성 때문에, 인간 hCDR1 펩티드가 질환 증상의 개선과 연관하여 후자의 수준을 하향조절할 수 있는지 여부를 시험하였다. 그후, 10 주 동안 1 주 1 회 100 ㎍ 또는 300 ㎍/마우스의 hCDR1 을 s.c. 주사하여 처리한 (NZB x NZW)F1 마우스 군에서 모은 혈청을 치료 동안 여러 시점에 서 MMP 수준에 대해 시험하였다. 도 23 는 모든 임상 증상이 나타나는 7 월령에서 마우스를 처리하기 시작한 실험 결과를 나타낸다. hCDR1 를 5 회 주사한 후, 처리 도중에 수집한 혈청의 결과이다.
도 23 의 결과는 마우스를 300 ㎍ 의 hCDR1 로 처리하면 MMP-3 수준 및 MMP-9 의 활성을 하향조절한다는 것을 나타낸다. 상기 결과들은 hCDR1 로 처리한 후, 질환 증상의 유의미한 개선과 일치한다.
토의
상기 결과들은 SLE 의 쥐과 모델의 혈청 및 신장에서 MMP-3 및 MMP-9 가 모두 상승한다는 것을 나타낸다. 쥐과 mCDR1 펩티드는 SLE 처리 마우스의 혈청 및 신장 모두에서 MMP-9 및 MMP-3 의 수준을 하향조절할 수 있다. SLE 의 자발적 모델에서, 처음 3.5 개월째에 혈청 중 MMP-9 및 MMP-3 모두의 상향조절이 발생하는 것이 나타났다. 유도된 모델에서, 혈청 중 MMP-3 수준 상승은 매우 이른 반면 (16/6Id 를 사용한 추가접종 10 일 후), MMP-9 활성의 상승은 약 3 - 4 개월 후 발생한다. 질환의 제 1 단계에서 진행될 수 있도록 한 16/6Id 유도 모델의 결과에 따르면, MMP-3 가 질환 유도에 관련되며, 질환의 진행에는 MMP-9 가 관련되는 것으로 보인다.
SLE 의 마우스 모델에서 MMP-3 의 상승을 보이는 본 발명의 결과들은, MMP-3 이 SLE 환자의 혈청에서 유의미하게 증가하며 (Kotajima 등, 1998), MMP-3 전사가 (NZB x NZW)F1 마우스에서의 신염의 진행에 따라 유의미하게 증가한다는 (Nakamura 등, 1993) 것을 나타내는 결과와 일치한다. 이들과 함께, 상기 결과들은 MMP-3 가 루푸스 신염의 사구체 상해의 발생에 기여할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 결과들은 SLE 의 유도 및 자발적 모델 모두에서 질환 진행에 따라 MMP-2 의 수준이 유의미하게 상승되지 않음을 나타낸다. 상기 결과들은, MMP-2 수준이 SLE 에서 증가하지 않는다는 선행 보고의 것들과 상통한다 (Zucker, 1999). 따라서, 상기 효소는 CDR1 기재 펩티드 처리로 변화되지 않는다 (데이타는 나타내지 않음). MMP-2 의 수준은 구성적으로 분비되며, 기타 다른 병리 (예컨대 시신경염 및 다발성 경화증) 조건 하에서도 변화하지 않은 반면, MMP-9 의 수준은 건강한 대조군에 비해 상대적으로 상승하였다 (Gijbels 등, 1992; Paemen 등, 1994).
흥미롭게도, SLE 연관 T 세포 응답성에 특이적으로 직접 영향을 미치는 mCDR1 펩티드는 이들의 상승을 막을 뿐 아니라 (예방 프로토콜), 이미 상향조절된 MMP-3 및 MMP-9 의 수준을 하향조절할 수 있다 (치료 프로토콜).
혈청 중 MMP-9 활성은 SLE 환자에서도 SLE 동물 모델에서도 보고되지 않았다. 본 발명은 최초로 SLE 및 MMP-9 사이의 상관성을 나타내고, MMP-9 가 SLE 처리 마우스의 혈청 및 신장에서 상승됨을 증명하였다. 혈청 중 상승은 비교적 늦게 나타났지만 (추가접종 약 4 개월 후), 신장에서의 MMP-9 의 상승은 질병 유도 후 초기 단계 (2 개월째) 에 관찰되었다 (데이타는 나타내지 않음). 또한, 본원에서 마우스에서의 SLE 증상을 개선하는 펩티드 (상기 나타낸 바와 같이 mCDR1 및 hCDR1) 가 또한 혈청 및 신장에서 모두 MMP-9 를 하향조절한다는 것을 최초로 보였다. 후자 데이타는 또한 16/6Id 를 사용한 면역화가 MMP-9 활성을 상승시키는 반면에, CDR1 기재 펩티드를 사용한 치료는 이를 비면역화된 마우스의 활성 수준으로 하향조절한다는 것을 보여주는 MMP-9 활성 검정 시스템을 사용한 예비 결과에 의해서도 지지되었다.
또한, SLE 에 대해 특이적으로 보여준 자가면역 질환의 실험 모델에서 MMP-3 및 NMP-9 은 이들의 유도의 키네틱이 상이하다는 것을 본원에서 최초로 증명하였다. 이는, 상기 MMP 들이 질환의 병인에서 상이한 역할을 한다는 것을 의미할 수 있다. 상기 결과들은 SLE 연관 T 세포 응답성을 면역변화시키고 질환 증상을 하향조절하는 펩티드가 (T 세포 자체에 의한 것일 필요는 없지만) 혈청 및 신장에서 상기 MMP 들의 분비를 제어할 수 있음을 증명한다. 상기 결과들은 MMP-3 및 MMP-9 가 SLE 병인에서 역할을 하며, 한편으로는 질환 진행에서 및, 다른 한편으로는 소정의 치료에 의한 질환 개선에서 대용 마커로 제공될 수 있음을 나타낸다.
실시예 13
MMP-9 의 활성 (MMP-2의 활성은 아님) 이 SLE 환자의 혈청에서 상승한다.
본 실시예에서, SLE 환자 40 명의 혈청에서 MMP-9 및 MMP-2 의 수준을 측정했으며, MMP-2 활성이 아닌 MMP-9 활성이 건강한 대조군에 비해 SLE 환자의 혈청에서 유의미하게 상승된다는 것을 증명하였다. 높은 MMP-9 활성은 원반성 피부병변 (discoid rash), 레이노드 현상 (Raynaud phenomenon), 폐렴, 구강궤양의 존재 및 항 인지질 항체 (APLA) 의 존재성과 상관있었다. 또한, 상승된 수준의 MMP-9 는 남성 환자군에서의 SLE 활성과도 상관있었다.
재료 및 방법
환자. 32 명의 여성 및 8 명의 남성의 40 명의 SLE 환자가 본 연구에 참여하였다. 모든 환자들은 SLE 의 진단에 대해 American College of Rheumatism (ACR) 의 개정된 진단 기준 (Winchester, 1996) 의 4 가지 이상을 나타냈다. 25 명의, 성별 및 연령이 맞는 건강한 자원자가 본 연구의 대조군으로 제공되었다. 진단시 환자의 평균 연령은 29 ±9.7 (범위 15 - 48) 세였고, 평균 투병 기간 (follow-up period) 은 11 ±10 (범위 1 - 32) 년이었다. 질환 활성은 SLEDAI 루프스 활성 지수 (Bombardier 등, 1992) 및 BILAG 지수 (Hay 등, 1993) 에 따라 결정하였다. 본 연구는 Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel 의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
활성 검정 키트에 의한 MMP-2 및 MMP-9 의 측정 . MMP-2 및 MMP-9 의 활성을 제조사의 지시에 따라 특정 Biotrak MMP-2 또는 MMP-9 활성 검정 키트 (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, UK) 로 측정하였다. MMP-2 및 MMP9 활성 측정을 위해 혈청은 각각 1:100 및 1:32 로 희석하였다. 적절한 기준은 각각의 검정에서 추가하였다. MMP 의 총 함량을 측정하기 위해, MMP 의 전 형태의 활성화를 아세트산 p-아미노페닐수은 (APMA) 을 사용하여 수행하였다.
겔 자이모그래피에 의한 MMP-2 및 MMP-9 활성의 측정 . MMP-2 및 MMP-9 활성을 젤라틴 자이모그래피로 시험하였다. 5 ㎕ 의 혈청 샘플을 1 mg/ml 젤라틴으로 중합된 8% SDS-PAGE 겔로 분리하였다. 겔을 30 분 동안 2.5% Triton X-100 에서 1 회 세척하여 SDS 를 제거하고, 30 분 동안 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2 및 0.02% (w/v) Brij 35 (pH 7.5) 를 함유하는 반응 버퍼에서 1 회 세척하였다. 반응 버퍼를 새것으로 바꾸고, 겔을 37℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 젤라틴분해 활성은 0.5% 쿠마씨 브릴란트 블루로 겔을 염색하여 가시화하고, 밀도측정계로 정량하였다.
통계 분석 . 데이타는 카이 스퀘어 (chi-square) 또는 피셔의 정확 검정 (Fisher exact test), 언페어드 t 테스트 (unpaired t-test) 및 양측 유의 확률 (two tailed P-value) 을 사용하여 평가하였다. 피어슨 (Pearson), 스페어맨 (Spearman) 및 다변량 분석 (multivariate analysis) 을 또한 사용하였다.
실시예 13 (i)
MMP-2 의 활성이 아닌 MMP-9 의 활성이 SLE 에서 상승한다.
상기 기재된 바와 같이, MMP-9 은 각종 자가면역 질환 뿐 아니라 SLE 의 동물 모델에서도 관련이 있음이 나타났다. 따라서, MMP-9 가 SLE 환자의 혈청에서도 상승하는지 여부의 연구에 관심을 가졌다. 상기 목적을 위해, MMP-9 및 MMP-2 활성을 모두 가시화할 수 있는 겔 자이모그래피로 40 명의 SLE 환자 및 25 명의 건강한 대조군의 혈청을 검사하였다. 대표적인 겔을 도 24 에 나타냈다. 상기 도면에서 알 수 있듯이, MMP-9 의 수준은 건강한 대조군에 비해 SLE 의 혈청에서 상승된다. 40 명의 SLE 환자 및 25 명의 건강한 대조군의 혈청 자이모그램의 밀도측정 분석은 SLE 환자에 대한 평균 MMP-9 활성이 109 ±5.6 밀도측정계 단위이며, 건강한 대조군에 대해서는, 76.5 ±4.2 밀도측정계 단위임을 나타낸다 (P=0.0001). 밀도측정계 단위의 활성값이 85 (건강한 대조군의 평균 + 2 s.e.) 이상인 것이 큰 값으로 간주되었다. 결과들은 68% 의 SLE 환자에서 높은 활성 수준의 MMP-9 을 나타낸다. 건강한 대조군 중 3% 만이 높은 MMP-9 활성을 나타냈다 (P=0.001). 동일한 혈청 샘플에서의 MMP-2 수준의 밀도측정 분석은 SLE 환자 및 건강한 대조군의 혈청 사이의 MMP-2 활성의 상이점이 현저하지 않음을 밝혔다. 따라서, 109 ±7 및 123 ±5 (평균 활성 밀도측정계 단위 ±s.e.) 의 값이 각각 건강한 대조군 및 SLE 환자에 대해 결정되었다 (P=0.0531). 추가로 혈청 중의 MMP-9 및 MMP-2 의 활성 수준을 정량하기 위해, 활성 검정 키트를 사용하였다.
도 25 는 SLE 환자의 혈청 중의 MMP-9 의 활성이 건강한 대조군의 혈청에 비해 3 배 더 상승한다는 것을 나타내며, 상기 상승은 통계적으로 유의하다 (P=0.0302). 대조적으로, 두 군 사이의 MMP-2 수준의 상이점은 유의하지 않다 (P=O.1254).
다른 이들과 마찬가지로 (Ebihara 등, 1998 및 1999), 아마도 효소의 방출에 기인하는 비SLE성 만성 신부전 (예를 들어, 당뇨병, 고혈압) 을 가진 환자의 혈청에서 높은 MMP-9 를 검출했기 때문에, 시험된 SLE 환자군에서의 MMP-9 의 수준과 신장 기능 사이의 상관성을 분석하였다. 크레아티닌 수준과 MMP-9 수준 사이에는 상관성이 없는 것으로 관찰되었으며 (r2=0.01), 이는 SLE 환자에서의 상승된 MMP-9 의 수준은 신장 질환에 기인하는 효소의 방출 결과가 아님을 나타낸다.
실시예 13 (ii)
MMP-9 활성과 임상 및 실험실 파라미터의 상관성
SLE 환자의 혈청에서의 MMP-9 의 활성 수준의 상승은 임상 및 실험실 파라미터와 혈청 MMP-9 수준의 가능한 상관성을 고찰하게 하였다. 각각의 임상 증상에 대한 정상 및 높은 MMP-9 수준을 가진 환자의 수를 조사하고, 특정 임상 병후를 갖거나 또는 갖지 않은 환자에 대한 MMP-9 의 실제 평균 활성 수준을 취해 통계 분석 (카이 스퀘어 또는 피셔 정확 검정) 을 수행하였다 (표 15). 상기 두 분석의 결과는 유사하였다. 모든 임상 병후에 대해서는, 증가된 MMP-9 수준을 가진 환자의 백분율이 건강한 대조군의 것보다 훨씬 크다는 것이 두드러진다. MMP-9 의 수준은 성별, 투병 기간 또는 그의 발병 연령과 상관성이 없었다 (피어슨, 스피어맨).
표 15 는 MMP-9 활성 수준에 따른 SLE 환자의 임상 및 실험실 특성을 나타낸다 (건강한 대조군과 같거나 더 낮음 = 정상). MMP-9 의 높은 수준은 레노이드 현상 (P=0.0138) 및 APLA (P=0.041) 의 존재와 유의미하게 상관성이 있었다. 강한 상관성은 폐렴, 원반성 피부병변, 신경 질환 (neurological disorder) 및 구강궤양과 함께 관찰될 수 있다. 그러나, 후자의 증상이 있는 환자의 수는 통계 분석을 수행하기에는 너무 적었다. 다변량 분석은 레노이드 현상 및 저급 보체 (C3, C4) 수준이, 높은 MMP-9 수준와 양의 상관성이 있음을 밝혔다 (각각 P=0.0001 및 0.0137). 대조적으로, 감광성, 관절염 및 혈액학적 이상은 MMP-9 활성 수준과 음의 상관관계가 있다 (각각 P=0.0381, 0.0014 및 0.0065).
MMP-9 수준에 따른, 정상 및 높은 MMP-9 활성을 가진 SLE 환자의 임상 특성
MMP-9 수준 (%)
높음 정상
환자의 수 (%) 40 (100) 29 (68) 13 (32)
광민감성 13 8 (62) 5 (38)
구강궤양 9 8 (89) 1 (11)
협부 발진 9 7 (78) 2 (22)
원반성 피부병변 5 5 (100) 0 (0)
레노이드 현상 8 8 (100) 0 (0)
혈관염 18 14 (78) 4 (22)
관절염 31 21 (68) 10 (32)
장막염 9 7 (78) 2 (22)
폐렴 4 4 (100) 0 (0)
신경 질환 4 4 (100) 0 (0)
신장기능이상 16 11 (69) 5 (31)
혈액학적 이상 29 18 (62) 11 (38)
ANA 40 27 (68) 13 (32)
αds-DNA 36 24 (67) 12 (33)
APLA 25 20 (80) 5 (20)
저급 보체 (Low complement) (C3,C4) 30 21 (70) 9 (30)
임상 관련성은 ACR 개정 기준 (Winchester, 1996) 에 따라 정의하였다. 항핵 항체 (ANA) 및 항 dsDNA 항체는 각각 Hep2 세포 및 크리티디아 루실리애 (Crithidia luciliae) 를 사용하여 측정하였다. 항인지질 항체 (APLA) 는 하나 이상의 하기 검정으로 반응성으로서 정의하였다: 가양(false positive) VDR, 루푸스 항응고체 (LAC) 또는 항카디오리핀 (anticardiolipin) 항체용 ELISA.
남성 (도 26A) 및 여성 (도 26B) 에서의 SLEDAI 및 MMP-9 활성 사이의 가능한 상관관계성에 대해서도 고찰하였다. 흥미롭게도, 남성에 대해서는 유의미한 양의 상관계수 (r2 = 0.6333) 였지만, 여성에 대해서는 유의하지 않은 음의 상관계수 (r2 = 0.0571) 였다. 유사한 결과가 BILAG 스코어링 시스템을 사용하여 수득되었다. 따라서, MMP-9 활성 및 BILAG 스코어 사이의 양의 상관 계수가 남성에 대해 관찰되었으며 (r2 = 0.6442), 여성에 대해서는 유의하지 않았다.
또한, 환자에 의한 각종 치료 양상의 사용과 MMP-9 활성 사이에 상관성이 존재하는지 여부의 결정에 관심을 가졌다. 표 16(A) 에서 알 수 있는 바와 같이, 환자의 현재 치료와 MMP-9 활성 사이에는 유의미한 상관관계가 없었다. 그러나, 이들의 질환 코스 동안 임의의 시기에서의 환자의 치료를 고찰하면 (표 16(B)), 높은 MMP-9 수준은 세포살상제의 사용과 연관성이 있다 (82%).
MMP-9 수준에 따른 SLE 환자의 치료 양식
전체 환자수 MMP-9 수준 (%)
높음 정상
A. 현재 치료
세포살상제 8 6 (75) 2 (25)
스테로이드 23 17 (74) 6 (26)
항말라리아 21 14 (67) 7 (33)
NSAID 7 5 (71) 2 (29)
B. 병력기간에 따른 치료
세포살상제 17 14 (82) 3 (18)
스테로이드 29 19 (66) 10 (34)
항말라리아 26 16 (62) 10 (38)
NSAID 18 12 (67) 6 (33)
항말라리아제 히드록시클로로퀸은 200-400 mg/1 일의 투여량으로 사용하였다. 스테로이드 치료는 1 일 투여량 ≥5 mg 의 프레드니손으로 정하였다. 사용된 세포살상제는 시클로포스파미드 (매월 0.5-1 g/m2) 또는 아자티오프린 (100-150 mg/1 일) 이었다.
실시예 13 (iii)
상이한 시점에 개별적인 SLE 환자로부터 취한 혈청 샘플의 MMP-9 활성의 다변성
질병 활성이 시간에 따라 가변적이므로, 46 년의 투병 기간 동안 샘플링된 개별적인 환자의 혈청에서 MMP-9 및 MMP-2 의 활성 수준을 측정하였다. 상이한 시점에 취한 9 명의 환자의 혈청을 분석하였다. MMP-2 의 수준은 환자와 건강한 대조군 사이에서 유의미하게 변화하지 않았다. 시험한 9 명의 환자 중 5 명에서, 개별 환자의 혈청 샘플 중의 MMP-9 활성의 다변성이 시간에 따라 관찰될 수 있었다. 2 명의 대표적인 SLE 환자에 대한 결과를 도 27 에 나타냈다. 알 수 있는 바와 같이, MMP-2 활성과 달리, MMP-9 활성은 동일한 환자에서 시간에 따라 변화한다. 상기 변화는 SLEDAI 또는 BILAG 시스템 중 하나에 의해 측정된 바와 같이 질병 활성 지수와 연관성이 없었다. MMP-9 활성의 변화는 상이한 시점에 샘플링된 5 명의 건강한 대조군의 혈청에서 검출되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 4 명의 다른 SLE 환자에서는, 시간에 따른 MMP-9 또는 MMP-2 활성에서의 실질적인 변화가 관찰되지 않았으며, MMP-9 활성 수준은 개별적인 환자에 따라 높거나 낮게 유지되었다.
토의
본 연구는 최초로 인간 SLE 에서의 MMP-9 의 관련성을 증명하였다. 68% 의 SLE 환자에서 MMP-2 가 아닌 MMP-9 의 활성은 건강한 대조군에 비해 유의미하게 상승됨을 나타냈다. 높은 MMP-9 수준은 레노이드 현상, 폐렴, 신경 질환 (neurological disorder), 원반성 피부병변 및 APLA 의 존재성과 연관되었다. MMP-9 활성의 변화는 질환의 상이한 시기에서 동일한 환자로부터의 혈청에서 관찰되었다. MMP-9 활성 수준은 여성 환자에서는 질환 활성 지수와 관련되지 않았으나 (SLEDAI, BILAG), 남성 환자군에서는 SLE 활성과 관련있었다.
본 연구는 SLE 환자의 혈청에서 MMP-2 의 활성 수준이 유의미하게 상승하지 않음을 나타냈다. 상기 결과들은 MMP-2 수준이 SLE 에서 증가되지 않음을 보인 종전에 보고된 것 (Zucker, 1999) 과 상통한다. MMP-2 의 수준은 또한 구성적인 것이며, 건강한 대조군에 비해 상대적으로 MMP-9 수준이 상승하는 다른 병소 상태 (예컨대, 시신경염 및 다발성 경화증) 하에서 불변이었다 (Gijbels 등, 1992; Paemen 등, 1994).
추가적인 MMP 의 관련성, 즉 MMP-3 는 SLE 환자의 혈청에서 유의미하게 증가하므로 SLE 의 병인으로 제안되었다 (Kotajima 등, 1998). 본 발명의 실시예에서 나타나는 상승된 MMP-9 활성을 가진 SLE 환자의 빈도 (68%) 는 SLE (76%) 및 RA (82%) 환자에서의 높은 MMP-3 수준에 대해 보고된 빈도 (Kotajima 등, 1998) 와 유사하다. 더욱이, MMP-3 전사는 (NZB x NZW)F1 마우스의 신염 진행과 함께 유의미하게 증가하는 것으로 나타났다 (Nakamura 등, 1993).
SLE 환자의 혈청 중 상승된 MMP 의 원인은 공지되지 않았다. MMP-9 는 T 세포, 호중구, 및 대식세포와 같은 말초혈액 세포에 의해 분비되는 것으로 나타났다 (리뷰에 대해서는 Goetzl 등, 1996 을 참조). 환자에서의 MMP-9 활성 수준과 말초혈액 세포수 사이에서 상관성이 발견되지 않는다는 사실은 MMP-9 가 말초혈액 면역 세포에 의해 분비되지 않으나, 대신 신장 또는 폐/늑막과 같은 SLE 상관 장기에 의해 분비된다는 것이 시사될 수 있다. 폐렴이 있는 모든 SLE 환자가 높은 MMP-9 활성 수준을 나타낸다는 관찰은 높은 MMP-9 수준의 원으로서 병든 폐가 시사될 수 있다. 더욱이, SLE 연관 장기 이상의 심각성을 나타내는 세포살상 처치와 혈청 중 MMP-9 의 높은 수준 사이의 상관성은 또한 SLE 환자에서 병든 장기가 MMP-9 활성의 원이라는 것을 지지할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 더 적은 말초혈액 림프세포가 더 높은 활성 수준의 MMP-9 을 분비할 가능성은 여전히 있다.
TNF-α 및 IL-1 은 인간 질병 (Dean 등, 2000) 및 쥐과 모델 (Segal 등, 1997; Theofilopoulos 등, 1999; Eilat 등, 2001) 에서 모두 SLE 병인에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 각종 시스템에서, 상기 시토카인이 MMP-9 생성을 유도함을 보였으며 (Guedez 등, 1996), 따라서 후자의 MMP 유도는 SLE 에서 상기 시토카인의 병인 효과의 일부일 가능성이 있다. 건강한 개인의 말초혈액 단핵구에 의해 자발적으로 분비되는 MMP-9 의 수준은 TNF-α 및 IL-1β 에 노출되면 상향조절된다는 것이 보고되었다 (Saren 등, 1996). 또한, T 세포 및 대식세포의 MMP 는 모두 막결합 형태의 절단으로 TNF-α 의 분비를 촉진한다 (Gearing 등, 1994). 따라서, 상기 예들은 염증전 (proinflammatory) 시토카인에 대한 MMP 및 역의 상호 조절 효과를 증명한다. 그럼에도 불구하고, 일부 환자의 혈청에서 MMP-9 의 활성 수준은 투병 기간 동안 정상 범위 내에 남는 반면, 대부분 환자의 혈청에서 높은 수준의 MMP-9 의 활성이 측정된다는 사실은 후자의 조절에 유전적 인자의 연관성을 제안할 수 있다.
본 명세서의 결과들은 MMP-9 가 SLE 의 병인에 한 역할을 할 수 있으며, 상기 메탈로프로틴아제의 혈장/혈청 활성 수준을 측정하는 것이, MMP-9 활성을 방해하는 약물을 투여한 환자를 모니터링할 때 중요한 정보를 제공할 수 있음을 나타낸다.
참고문헌
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Figure 112003031673120-pct00009
Figure 112003031673120-pct00010
Figure 112003031673120-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> YEDA Research and Development Co. Ltd MOZES, Edna <120> PEPTIDES FROM THE 16/6id ANTIBODY FOR TREATING SLE <130> TEVA-003 KR <150> IL 141647 <151> 2001-02-26 <150> PCT/IL02/00148 <151> 2002-02-26 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Murine <400> 1 Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu 1 5 10 15 Glu Trp Ile Gly 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ala Lys Ala Thr 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Murine <400> 3 Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ser 20 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Murine <400> 4 Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Murine <400> 5 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Leu <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Human <400> 6 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Human <400> 7 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Human <400> 8 Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Human <400> 9 Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Human <400> 10 Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on the CDR1 of the heavy chain of human 1 6/6id mAb. Note:Thr (position 1) may be missing. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Xaa in position 9 is Arg or Lys; Xaa in position 11 is Pro or Ser ; Xaa in position 13 is Gly or Glu; Xaa in position 14 is Lys or Asp; Xaa in position 16 is Glu, Leu or Ser. <400> 11 Thr Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 Glu Trp Ile Gly 20 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Arg, Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Gly, Xaa (14) is Lys, and Xaa(16) is Leu. <400> 12 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO: 11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Arg, Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Gly, Xa a(14) is Lys, and Xaa(16) is Ser. <400> 13 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Ser Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO: 11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Arg, Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Gly, Xa a(14) is Asp, and Xaa(16) is Glu. <400> 14 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asp Gly Glu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO: 11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Lys, Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Gly, X aa(14) is Lys, and Xaa(16) is Glu. <400> 15 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Lys Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO: 11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Arg, Xaa(11) is Ser, Xaa(13) is Gly, Xa a(14) is Lys, and Xaa(16) is Glu. <400> 16 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Glu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:11 wherein Thr (position 1) is missing, Xaa(9) is Arg, Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Glu, Xaa (14) is Lys, and Xaa(16) is Glu. <400> 17 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Glu Glu 1 5 10 15 Trp Ile Gly <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO: 11 wherein Xaa(9) is Arg , Xaa(11) is Pro, Xaa(13) is Gly, Xaa(14) is Lys, and Xaa(16) is Glu. <400> 18 Thr Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu 1 5 10 15 Glu Trp Ile Gly 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide based on CDR3 of the heavy chain of human 16/6i d mAb. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> Xaa in position 6 is Gly or Phe; Xaa in position 9 is Arg or Ala; Xaa in position 10 is Gly or Ala; Xaa in position 11 is Gly or A la; Xaa in position 12 is Trp or Ala; Xaa in position 13 is Asn o r Ala; Xaa in position 18 is Tyr or Trp; Xaa in position 20 is Me t or Gln. <400> 19 Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Xaa Gly Xaa Asp Val 20 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Trp, X aa(13) is Ala, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 20 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Ala Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Ala, X aa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 21 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Ala Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Ala, Xaa(12) is Trp, Xaa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 22 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Ala Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Ala, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Trp, Xaa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 23 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Ala, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Trp, X aa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 24 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Ala Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sunthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Phe, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Trp, X aa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Met. <400> 25 Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) is Trp, X aa(13) is Asn, Xaa(18) is Tyr, and Xaa(20) is Gln. <400> 26 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Gln Asp Val 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic. Note: a peptide of SEQ ID NO:19 wherein Xaa(6) is Gly, Xaa(9) is Arg, Xaa(10) is Gly, Xaa(11) is Gly, Xaa(12) isTrp, Xa a(13) is Asn, Xaa(18) is Trp, and Xaa(20) is Met. <400> 27 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp 1 5 10 15 Tyr Trp Gly Met Asp Val 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide prepared in the reversed order of SEQ ID NO: 1. <400> 28 Gly Ile Trp Glu Leu Ser Lys Glu Pro Ser Gln Lys Val Trp Gln Met 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly Thr 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide prepared in reversed order of SEQ ID NO: 3. <400> 29 Ser Gly Gln Gly Trp Tyr Asp Met Ala Tyr Pro Glu Trp Leu Phe Arg 1 5 10 15 Ala Cys Tyr Tyr 20 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide prepared in the reversed order of SEQ ID NO: 6. <400> 30 Gly Ile Trp Glu Glu Gly Lys Gly Pro Pro Gln Arg Ile Trp Ser Trp 1 5 10 15 Tyr Tyr Gly

Claims (41)

  1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 펩티드:
    (a) 서열 번호 11 및 서열 번호 19 의 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 19 내지 22 개의 아미노산 잔기의 펩티드 또는 이의 아미드, 또는 염 펩티드;
    (b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 상기 (a) 의 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
    (c) 상기 (a) 의 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
    (d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 합성 펩티드:
    (a) 서열 번호 11 로 이루어진 펩티드;
    (b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 상기 (a) 의 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
    (c) 상기 (a) 의 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
    (d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 서열 번호 11 의 펩티드로 이루어진 합성 펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서, 서열 번호 12 내지 18 의 서열들로 이루어진 펩티드로부터 선택되는 합성 펩티드.
  5. 서열 번호 6 의 서열로 이루어진 펩티드 또는 이의 염.
  6. 제 5 항에 있어서, C-말단이 아미드화된 서열 번호 6 의 펩티드로 이루어진 펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 합성 펩티드:
    (a) 서열 번호 19 로 이루어진 펩티드;
    (b) 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 상호간 공유결합적으로 연결된 상기 (a) 의 펩티드의 2 개의 상이한 펩티드를 포함하는 이중 합성 펩티드;
    (c) 상기 (a) 의 펩티드의 다수의 서열을 포함하는 펩티드 중합체; 및
    (d) 거대분자 담체에 부착된 (a) 의 펩티드 또는 (c) 의 펩티드 중합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 서열 번호 19 의 펩티드로 이루어진 합성 펩티드.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열 번호 20 내지 27 의 서열로 이루어진 펩티드로부터 선택되는 합성 펩티드.
  10. 서열 번호 7 의 서열로 이루어진 펩티드 또는 이의 염.
  11. 제 10 항에 있어서, C-말단이 아미드화된 서열 번호 7 의 펩티드로 이루어진 펩티드.
  12. 제 1 항에 있어서, 서열번호 11의 펩티드가 서열번호 19의 펩티드에 직접적으로 또는 짧은 연결 사슬을 통해 공유결합적으로 연결된 이중 합성 펩티드인 합성 펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서, 서열 번호 11 의 펩티드가 서열 번호 19 의 펩티드에 직접 공유결합적으로 연결된 합성 펩티드.
  14. 서열 번호 6 의 펩티드가 서열 번호 7 의 펩티드에 공유결합적으로 연결된 이중 합성 펩티드.
  15. 제 1 항에 있어서, 서열 번호 6, 7 및 11 ~ 27 의 서열로부터 선택된 다수의 동일한 서열을 포함하는 펩티드 중합체인 합성 펩티드.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 합성 펩티드 또는 펩티드 중합체 또는 이들의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  17. 서열 번호 6 의 서열의 펩티드 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  18. C-말단이 아미드화된 서열 번호 6 의 서열의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  19. 서열 번호 7 의 서열의 펩티드 또는 이의 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  20. C-말단이 아미드화된 서열 번호 7 의 서열의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 경구, 정맥내, 피하, 관절내, 근육내, 흡입, 비강내, 지주막하, 복강내, 피내, 경피 또는 직장 투여를 위해 적합하게 된, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 비강내 투여를 위해 적합하게 된 약학적 조성물.
  23. SLE 환자의 치료에서 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 펩티드 중합체를 포함하는 약물의 효과의 평가 방법으로서, 상기 약물로 치료된 상기 환자에서 수득한 혈액 시료내 MMP-3 및/또는 MMP-9 의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여 MMP-3 및/또는 MMP-9 의 감소 수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 방법.
  24. SLE 환자의 치료에서 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 펩티드 중합체를 포함하는 약물의 효과의 평가 방법으로서, 상기 약물로 치료된 상기 환자에서 수득한 혈액 시료내 IL-2 및/또는 IFN-γ의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여 IL-2 및/또는 IFN-γ의 감소 수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 방법.
  25. SLE 환자의 치료에서 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 펩티드 중합체를 포함하는 약물의 효과의 평가 방법으로서, 상기 약물로 치료된 상기 환자에서 수득한 혈액 시료내 TGF-β의 수준을 상이한 시간 간격으로 측정하여 TGF-β의 증가 수준과 약물의 효과를 상관시키는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 16 항에 있어서, 경구, 정맥내, 피하, 관절내, 근육내, 흡입, 비강내, 지주막하, 복강내, 피내, 경피 또는 직장 투여를 위해 적합하게 된, 전신성 홍반성 루푸스의 치료를 위한 약학적 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 비강내 투여를 위해 적합하게 된 약학적 조성물.
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