EA007091B1 - Лечение гепатита с в азиатской популяции подкожным введением бета-интерферона - Google Patents

Abstract

Описано применение рекомбинантного IFN-бета для получения лекарственного средства для лечения инфекции HCV путем подкожного введения пациентам азиатской расы, не отвечающим на предшествующее лечение альфа-интерфероном. По предпочтительному осуществлению изобретения лечение может быть более благоприятным и далее фокусируется на тех пациентах, которые через 4 недели начального лечения IFN-бета характеризуются клиренсом РНК HCV.

Description

Данное изобретение относится к применению рекомбинантного ΙΡΝ-бета для получения лекарственного средства для лечения инфекции НСУ путем его подкожного введения пациентам азиатской расы, которые характеризовались недостаточным ответом на предшествующее лечение альфаинтерфероном.

Предпосылки изобретения

Вирус гепатита С (НСУ) вызывает состояние хронической инфекции почти у всех остро инфицированных субъектов. Примерно у 20% пациентов с хронической инфекцией НСУ (СНС) развивается цирроз с последующей печеночной недостаточностью, портальной гипертензией, асцитом, энцефалопатией и нарушениями с кровотечением (А11ег М., 1992). Долгосрочные наблюдения указывают на то, что данные оценки могут быть консервативны (Ωηνίκ СП 1990), однако, хроническая инфекция НСУ выраженно ассоциирована с гепатоцеллюлярной карциномой (ТаЬог Е. е! а1., 1992).

Интерфероны (ΙΡΝ) представляют собой гликопротеины, продуцируемые организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защищенных клетках. ΙΡΝ, которые состоят из белков с низкой молекулярной массой, замечательно неспецифичны в своем действии, т. е. ΙΡΝ, индуцированный одним вирусом, эффективен против большой группы других вирусов. Однако они видоспецифичны, т. е. ΙΡΝ, продуцируемый одним видом, будет стимулировать лишь противовирусную активность в клетках того же или близкородственных видов. ΙΡΝ представляли собой первую группу цитокинов, которые были использованы в плане их потенциальной противоопухолевой и противовирусной активности.

Три основных ΙΡΝ обозначены ΙΡΝ-альфа, ΙΡΝ-бета и ΙΡΝ-гамма. Такие основные типы ΙΡΝ вначале классифицировали по клеткам, из которых они происходят (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько типов могут продуцироваться одной клеткой. Поэтому лейкоцитарный ΙΡΝ сейчас называют ΙΡΝ-альфа, фибробластный ΙΡΝ представляет собой ΙΡΝ-бета и Т-клеточный ΙΡΝ представляет собой ΙΡΝ-гамма. Также имеется четвертый тип ΙΡΝ, лимфобластный ΙΡΝ, продуцируемый в клеточной линии «Ν;·ιιη;·ι1\ν;·ι» (происходящей из лимфомы Беркитта), которая, оказывается, продуцирует смесь лейкоцитарного и фибробластного ΙΡΝ.

В частности, человеческий фибробластный интерферон (ΙΡΝ-бета) характеризуется противовирусной активностью и может также стимулировать действие клеток-естественных киллеров против клеток неоплазии. Это полипептид массой примерно 20000 Да, индуцируемый вирусами и двухцепочечными РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированной по технологии рекомбинантной ДНК, Оегупк е! а1. (Оегупк В. е! а1., №11игс 285,542-547, 1980) предсказали полную аминокислотную последовательность данного белка. Ее длина составляет 166 аминокислот.

Зйерагб е! а1. (Зйерагб Н.М. е! а1., №!ше, 294,563-565, 1981) описали мутацию основания 842 (Сук Туг в положении 141), которая отменяет противовирусную активность и клон-вариант с делецией нуклеотидов 1119-1121.

Магк е! а1. (Магк Ό.Ρ. е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. Зег ИЗА, 81 (18) 5662-5666, 1984) встраивали искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), что вызывает переключение аминокислоты от Сук на Зег в положении 17. Полученный в результате ΙΡΝ-бета, как сообщается, был активен как «нативный» ΙΡΝ-бета и стабилен во время долгосрочного хранения (-70°С).

ВеЬ1£® (рекомбинантный человеческий интерферон-бета-1а) представляет собой последнюю разработку в интерфероновой терапии рассеянного склероза (МЗ) и является существенным улучшением лечения. ВеЬ1£® представляет собой интерферон (ШЫ)-бета-1а, продуцируемый клеточными линиями млекопитающих.

Механизмы, по которым ΙΡΝ оказывают свое действие, полностью не ясны. Однако в большинстве случаев они действуют путем влияния на индукцию транскрипции некоторых генов, воздействуя таким образом на иммунную систему. Исследования ίη νίίτο показали, что ΙΡΝ способны индуцировать или подавлять около 20 генных продуктов.

Для СНС не имеется полностью эффективного лечения. Лучшие результаты были получены с альфа-интерфероном, хотя это не является универсальным рекомендованным лечением. Многие клиницисты только наблюдают пациентов с СНС по причине неопределенной природы инфекции НСУ и токсичности, ассоциированной с альфа-интерфероном.

Большинство пациентов с СНС не дают полноценной реакции на лечение альфа-интерфероном. Контролируемые попытки введения альфа-интерферона в течение шести месяцев в результате привели к нормализации сывороточной АЬТ у 40-50% пациентов в конце лечения, но данный ответ поддерживался лишь у 15-25% (НооГпаДе ЕН. е! а1., 1997).

Увеличение доз и продление лечения приводили к малому повышению сохранения ответа, но ценой увеличения стоимости и токсичности (Роупагб Т. е! а1., 1996). Кроме того, преимущество увеличенных доз часто является преходящим, и после прерывания лечения обычны рецидивы (Ьтбкау К.Ь. е! а1., 1996).

По результатам исследования 35 пациентов, не отвечающих на альфа-интерферон, сообщалось об отсутствии преимущества от продления лечения от шести до 12 месяцев, повышения дозы альфа

- 1 007091 интерферона, переключения лечения от рекомбинантного на лимфобластоидный интерферон или применения стероидов (Ρίοοίηίηο Ρ. е! а1., 1993).

Природа инфекции НСУ после недостаточности ответа на альфа-интерферон не была соответствующим образом исследована, только в одном исследовании с мониторингом 28 пациентов в течение по меньшей мере 2 лет после лечения был обнаружен лишь один случай окончательной ремиссии в течение 16 месяцев (нормализация АЬТ и исчезновение РНК НСУ) (Такеба Т. е! а1., 1993).

Некоторые факторы, как было обнаружено, ассоциированы с большей вероятностью долгосрочного поддержания ответа на альфа-интерферон: генотип, не относящийся к типу 1, низкая концентрация РНК НСУ в сыворотке, меньшая длительность инфекции, меньшая масса тела, смягченная активность процесса на биопсии печени, отсутствие цирроза и низкие уровни ферритина и железа сыворотки, насыщения трансферрина и концентрации железа в печени (Зейуагсх К. е! а1., 1989, Васоп В.К. е! а1., 1995, Софееуагат Н.8. е! а1., 1995, Вопкоукку Н.Ь. е! а1., 1997).

Пациенты с СНС, которые не могут достичь поддержания ответа после лечения альфаинтерфероном, как полагают, характеризуются более агрессивным ходом заболевания, возможно вследствие отбора устойчивых генотипов, но выработка нейтрализующих антител против альфа-интерферона может также быть способствующим фактором. Оказывается, имеется выраженная корреляция между выработкой нейтрализующих антител против интерферона-альфа-2а и недостаточной клинической выгодой при инфекциях СНС и вирусом гепатита В (НВУ) (Эоид1а5 Ό.Ό. е! а1., 1993, Мбе11а М.М. е! а1., 1993, Ьок А8Р е! а1., 1990). Фактически, выработка антител к одному рекомбинантному типу альфаинтерферона может нейтрализовать другие субтипы альфа-интерферона (Вгапб С.М. е! а1., 1993).

Имеется относительно мало опыта применения бета-интерферона при инфекции НСУ. Сообщались весьма многообещающие результаты, касающиеся лечения бета-интерфероном острой инфекции НСУ, притом, что 7 из 11 пациентов достигали длительной нормализации АЬТ в течение одного года по сравнению только с одним из 14 контрольных пациентов (Ота!а М. е! а1., 1991). Одиннадцать пациентов лечили в среднем в течение 30 суток средней в./в. дозой из 52 МИ происходящего из фибробластов, «нативного» интерферона и бета-интерферона. Примечательно, что не сообщалось о значимой токсичности.

В настоящее время в Японии природный ΙΡΝ-бета повсеместно используется для лечения хронического гепатита С, и рекомендуемым режимом является внутривенное введение суточной дозы из 3-6 МГО в течение 6-8 недель (см. НаЬегаеЩет е! а1., Ыует, 2000, 20, 438, 4111 11пе).

Была очень низкая эффективность внутримышечного введения ΙΡΝ-бета (3 МИ т.р.н.) пациентам с НСУ неазиатской расы (Регех К. е! а1., 1. Упо1. Нера!. 1995,2(2), 103-6).

У пациентов с НСУ, которые все относились к неазиатской (белой) расе, подкожное введение (9 или 12 МИ) рекомбинантного ΙΡΝ-бета характеризовалось эффективностью, по меньшей мере, в группе пациентов (НаЬегае^ег е! а1., Ыует, 2000,20 437-441).

КщЫата е! а1. (Рикикока Ас!а Меб., 86(4), 113-20, 1995) описывают лечение натуральным ΙΡΝ-бета, вводимым внутривенно, в дозе 6 МГО пациентам с НСУ, не отвечающим на ΙΡΝ-альфа.

В предварительном сравнительном изучении альфа-интерферона и бета-интерферона при НВУ и НСУ, коэффициенты ответа были 81% для альфа-интерферона и 86% для бета-интерферона, с подобными коэффициентами ответа, поддерживаемыми в течение 6 месяцев (72% для альфа-интерферона и 79% для бета-интерферона) (Типбо Ь., 1993). Побочные действия приводят к прекращению лечения для 24% в группе, получавшей альфа-интерферон, по сравнению с 0% в группе, получавшей бета-интерферон.

Обнадеживающие начальные результаты некоторых предшествующих исследований, проведенных настоящим заявителем, вместе с хорошим профилем безопасности и переносимости ΙΡΝ-бетаЛа, привели к данному исследованию, в котором изучаются более высокие и более интенсивные режимы дозирования в течение более длительного периода лечения пациентов с хроническим гепатитом С, которые не отвечали на лечение ΙΡΝ-альфа.

Описание изобретения

Из-за спонтанного сообщения о результатах с высокой эффективностью, сделанного авторами настоящего изобретения в Тайваньском центре, проводили исследовательские анализы по центру и по демографическим характеристикам, что привело к установлению различий между пациентами азиатского и неазиатского происхождения. Поэтому план анализа данного исследования был изменен так, что оно должно было охватывать оценку обеих данных популяций.

Главной целью настоящего изобретения является применение рекомбинантного ΙΡΝ-бета для получения лекарственного средства для лечения инфекции НСУ путем его подкожного введения пациентам азиатской расы, которые не отвечали на предшествующее лечение альфа-интерфероном.

Поэтому другой целью настоящего изобретения является способ лечения инфекции НСУ, включающий в себя подкожное введение эффективного количества ΙΡΝ-бета вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем пациентам азиатской расы, которые не отвечали на предшествующее лечение ΙΡΝ-альфа.

«Эффективное количество» относится к количеству активных ингредиентов, которое достаточно для воздействия на ход и тяжесть заболевания, что ведет к редукции или ремиссии такой патологии. Эффективное количество зависит от пути введения и состояния пациента.

- 2 007091 «Фармацевтически приемлемый», как подразумевается, охватывает любой носитель, не препятствующий проявлению биологической активности активного ингредиента и не токсичный в отношении организма, в который он вводится. Например, для парентерального введения указанные выше активные ингредиенты могут быть составлены в порционные дозированные формы для инъекции в таких носителях, как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Кроме фармацевтически приемлемого носителя композиции по изобретению могут также содержать малые количества добавок, таких как стабилизаторы, наполнители, буферы и консерванты.

Термин «рекомбинантный бета-интерферон (ΙΡΝ-бета)» при использовании в настоящем изобретении, как подразумевается, охватывает человеческий фибробластный интерферон, полученный способами рекомбинантной ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и фрагменты.

Термин «функциональные производные» охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, оказывающихся боковыми цепями остатков или из Ν- или С-концевых групп, средствами, известными в данной области, и они относятся к изобретению, пока сохраняют фармацевтическую приемлемость, т.е. они не отменяют описанной выше биологической активности белков, т.е. способности связывать соответствующий рецептор и инициировать передачу сигнала с рецептора, и не придают содержащим их композициям токсических свойств. Производные могут иметь химические радикалы, такие как углеводные или фосфатные остатки, что обеспечивает сохранение такому производному биологической активности белка и фармацевтической приемлемости.

Например, производные могут включать алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп за счет взаимодействия с аммонием или первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные ацильными радикалами (например, алканольные или карбоциклические ароильные группы) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, остатков серила или треонила), образованные ацильными радикалами. Такие производные могут также включать, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут скрывать антигенные участки и продлевать присутствие молекулы в жидкостях организма.

Особой значимостью обладает белок, который дериватизирован или объединен с комплексообразователем для обеспечения большей продолжительности жизни. Например, конъюгированные с ПЭГ варианты или генетически сконструированные белки, которые характеризуются долгосрочной активностью в организме, могут использоваться по настоящему изобретению. Конъюгированный с ПЭГ вариант интерферона-бета-1 описан в \УО 99/55377 и рассматривается как включенный в состав определения бетаинтерферона по настоящей заявке.

Термин «производное», как предполагается, включает только те производные, которые не характеризуются заменами одних аминокислот на другие в пределах двадцати обычно встречающихся природных аминокислот.

Термин «соли» относится к солям карбоксильных групп и к кислым аддитивным солям аминогрупп белков, описанных выше, или их аналогов. Соли карбоксильных групп могут быть образованы средствами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например, натрия, кальция, аммония, соли железа или цинка, и тому подобное, и соли с органическими основаниями, такие как образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и тому подобное. Кислые аддитивные соли включают, например, соли неорганических кислот, такие как, например, соли хлористо-водородной или серной кислот, и соли органических кислот, такие как, например, соли уксусной кислоты или щавелевой кислоты. Конечно, любые такие соли должны сохранять свою биологическую активность белка, относящегося к настоящему изобретению, т.е. способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигнала от рецептора.

«Фрагмент» по настоящему изобретению относится к любому подмножеству молекул, т.е. к более короткому пептиду, который сохраняет требуемую биологическую активность. Фрагменты могут быть легко получены путем удаления аминокислот с каждого конца молекулы и тестирования полученной в результате молекулы на предмет ее свойств в качестве агониста рецептора. Известны протеазы для удаления одной аминокислоты за раз от Ν-конца или С-конца полипептида, и определение таким образом фрагментов, которые сохраняют требуемую биологическую активность, включает только рутинное экспериментирование.

«Вариант» по настоящему изобретению относится к молекуле, которая, по существу, сходна с целыми белками, определенными выше, или к ее фрагменту. Пептиды-варианты могут быть удобно получены прямым химическим синтезом пептида-варианта с использованием способов, хорошо известных в данной области. Конечно, такие варианты будут характеризоваться связыванием рецептора и активностью по инициации сигнала, сходными с таковыми для соответствующего встречающегося в природе белка.

Варианты аминокислотной последовательности, определенные выше, могут быть получены путем мутаций в ДНК, которые кодируют синтезируемые производные. Такие варианты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотной последовательности. Любое сочетание делеции,

- 3 007091 вставки и замены также может быть осуществлено для достижения конечной конструкции, при обеспечении того, что конечная конструкция будет обладать требуемой активностью. Очевидно, что мутации, которые могут быть выполнены в ДНК, кодирующей пептид-вариант, не должны менять рамку считывания и предпочтительно не создадут областей комплементарности, которые будут приводить к образованию вторичных структур мРНК.

На генетическом уровне данные варианты обычно получают путем сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей пептидную молекулу, с продукцией таким образом ДНК, кодирующей вариант, после чего ДНК экспрессируется в рекомбинантной культуре клеток. Варианты обычно проявляют ту же качественную биологическую активность, что свойственна пептиду, не являющемуся вариантом.

«Аналог» определенного выше белка по настоящему изобретению относится к неприродной молекуле, которая, по существу, подобна целым молекулам или их активному фрагменту. Такой аналог проявляет ту же активность, что у соответствующего встречающегося в природе белка.

Типы замен, которые могут быть сделаны в бета-интерфероне по настоящему изобретению, могут основываться на анализе частот аминокислотных замен в гомологичных белках различных видов. На основе данного анализа консервативные замены могут определяться как замены в пределах одной из следующих пяти групп:

I. Малые, алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: А1а, 8ег, Тйг, Рго, О1у.

II. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Аки, О1ц, О1и.

III. Полярные, положительно заряженные остатки: Ηίκ, Агд, Ьук.

IV. Большие, алифатические неполярные остатки: Ме1, Ьеи, Не, Уа1, Сук.

V. Большие ароматические остатки: Рйе, Туг, Тгр.

В пределах указанных выше групп следующие замены считаются «высококонсервативными»:

Акр/01ц

Ηίκ/Агд/Ьук

Рйе/Туг/Тгр

Ме1/Ьеи/Пе^а1

Полуконсервативные замены определяются как замены между двумя группами (Ί)-(Ίν), указанными выше, которые ограничены надгруппой (А), включающей (I), (II) и (III), указанные выше, или надгруппой (В), включающей (IV) и (V), указанные выше. Замены не ограничены генетически кодируемыми или даже встречающимися в природе аминокислотами. Когда эпитоп получен пептидным синтезом, требуемые аминокислоты могут быть использованы непосредственно. Альтернативно, генетически кодируемая аминокислота может быть модифицирована путем ее взаимодействия с органическим дериватизующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками.

Остатки цистеинила обычно взаимодействуют с альфа-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением производных карбоксиметила или карбоксиамидометила. Остатки цистеинила также дериватизуются путем взаимодействия с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Νалкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.

Остатки гистидила дериватизуются путем взаимодействия с диэтилкарбонатом при рН 5,5-7,0, поскольку данный агент является относительно специфичным в отношении боковой цепи гистидила. Парабромфенацилбромид также может применяться; взаимодействие предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при рН 6,0.

Остатки лизинила и аминоконцевые остатки взаимодействуют с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Дериватизация данными агентами обладает действием по замене заряда остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для дериватизации остатков, содержащих альфааминокислоты, включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборгидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; О-метилизомочевина; 2,4-пентандион; и катализируемое трансаминазой взаимодействие с глиоксилатом.

Остатки аргинила модифицируют путем взаимодействия с одним или несколькими общепринятыми реагентами, среди которых фенилглиоксаль; 2,3-бутандион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует, чтобы взаимодействие проводилось в щелочных условиях, по причине высокого значения рКа функциональной группы гуанидина. Более того, данные реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.

Специфичную модификацию остатков тирозила рег ке интенсивно исследовали с особым интересом к введению спектральных меток в остатки тирозила путем взаимодействия с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Наиболее часто Ν-ацетилимидазол и тетранитрометан используют для образования соединений О-ацетилтирозила и ε-нитропроизводных соответственно.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (Κ.'Ν-ί'.'-Ν-Κ.'). такими как 1-циклогексил-3-[2-морфолинил-(4

- 4 007091 этил)]карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Более того, остатки аспартила и глутамила преобразуются в остатки аспарагинила и глутаминила путем взаимодействия с ионами аммония.

Остатки глутаминила и аспарагинила часто деамидируются с образованием соответствующих остатков глутамила и аспартила. Альтернативно, данные остатки деамидируются в мягких кислых условиях. Любая форма данных остатков лежит в объеме данного изобретения.

Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для получения аналогов для применения по настоящему изобретению, включают любые известные стадии способа, такие как представленные в патентах США КЕ 33653; 4959314; 4588585 и 4737462, выданных Магк с1 а1.; 5116943, выданных Κοίΐΐδ с1 а1.; 4965195, выданных Матеи с1 а1.; и 5017691, выданных Ьее с1 а1., и замещенные лизином белки, представленные в патенте США 4904584 (8бате е1 а1.).

Предпочтительно определенный выше вариант или аналог содержит коровую последовательность, которая совпадает с «нативной» последовательностью, или ее биологически активный фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 70%-ной идентичностью в отношении нативной аминокислотной последовательности и сохраняет ее биологическую активность. Более предпочтительно такая последовательность характеризуется по меньшей мере 80%-ной идентичностью, по меньшей мере 90%-ной идентичностью или наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью в отношении природной последовательности.

Используемый здесь термин «идентичность последовательности» означает, что последовательности сравнивают следующим образом. Последовательности выравнивают с использованием версии 9 Оеиебс Сотрибид Отоир'к ОАР (программы глобального выравнивания), с использованием матрицы по умолчанию (В1.О81Л162) (значения от -4 до +11) с штрафом за открытие вставки -12 (за первое незначащее значение вставки) и со штрафом за продление вставки -4 (за каждое дополнительное последующее незначащее значение во вставке). После выравнивания идентичность в процентах рассчитывают, выражая число совпадений как процент от количества аминокислот в заявленной последовательности.

Аналоги или варианты по настоящему изобретению можно также определять по следующей процедуре. ДНК с нативной последовательностью известна из предыдущих исследований в данной области и может быть найдена в литературе. Полипептиды, кодируемые какой-либо нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с комплементарной последовательностью природной ДНК или РНК в высоко жестких или умеренно жестких условиях, при сохранении таким полипептидом биологической активности природной последовательности, также рассматриваются как относящиеся к объему настоящего изобретения.

Условия жесткости представляют собой функцию температуры, используемой в эксперименте по гибридизации, молярности одновалентных катионов и процентного содержания формамида в растворе гибридизации. Для определения степени жесткости, связанной с каким-либо данным набором условий, вначале используют уравнение Метко® е1 а1. (1984) для определения стабильности гибридов со 100%ной идентичностью, выраженной в виде температуры плавления гибрида ДНК-ДНК Тт: Тт = 81,5°С + 16,6 (_ЪодМ) + 0,41 (%ОС) - 0,61 (%форм.) - 500/6. где М представляет собой молярность одновалентных катионов, %ОС представляет собой процентную долю нуклеотидов О и С в данной ДНК, %форм. представляет собой процент формамида в растворе гибридизации, и Ь представляет собой длину пар оснований. Для каждого 1°С, на который снижается Тт от рассчитанного для гибрида со 100%-ной идентичностью, количество разрешенных несовпадений повышается примерно на 1%. Таким образом, если Тт, используемое для какого-то данного эксперимента по гибридизации при конкретных концентрациях соли и формамида, составляет 10°С ниже рассчитанного для 100%-ного гибрида Тт по уравнению Ме1ико1б, гибридизация будет происходить, даже если имеется вплоть до 10% несоответствий.

Используемые условия высокой жесткости таковы, что они устойчивы к расхождению последовательностей до 15%, в то время как умеренно жесткие условия устойчивы к расхождению последовательностей до 20%. В неограничивающих примерах высоко жестких условий (12-15°С ниже рассчитанной Тт гибрида) и умеренно жестких условий (15-20°С ниже рассчитанной Тт гибрида) используется раствор для промывки 2 х 88С (стандартный цитратно-солевой) и 0,5% 8Ό8 при подходящей температуре ниже рассчитанной Тт гибрида. Окончательная жесткость условий первично определятся условиями промывки, в частности, если используемые условия промывки таковы, что позволяют менее стабильным гибридам образовываться вместе со стабильными гибридами. Тогда условия промывки более высокой жесткости удаляют менее стабильные гибриды. Обычные условия гибридизации, которые могут быть использованы в условиях промывки от высоко жестких до умеренно жестких, описанных выше, представляют собой гибридизацию в растворе 6 х 88С (или 6 х 88РЕ) , 5 х реагента Пеийатб!, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося, при температуре, примерно на 2025°С ниже Тт. При использовании смешанных зондов предпочтительно использовать вместо 88С хлорид тетраметиламмония (ТМАС) (Аи8иЬе1, 1987-1998).

Хотя настоящее изобретение предоставляет рекомбинантные способы получения определенных выше производных, данные производные могут также быть получены общепринятыми способами белкового синтеза, которые хорошо известны специалистам в данной области.

- 5 007091

По настоящему изобретению «раса» представляет собой популяцию, которая может отличаться от другой подгруппы внутри вида (например, вида человек). Раса обладает уникальным и особым ансамблем генов и определяется по признакам (как интеллектуальным, так и физическим), продуцируемым данным генетическим ансамблем. Представители одной расы проявляют характерные генетические характеристики, поскольку они имеют общего генетического предка и, следовательно, сходный генетический ансамбль.

На основе исследований ядерной ДНК Ьшщ СауаШ ЗГогха и его коллег можно определить по меньшей мере 6 человеческих рас/популяций: кавказоидная (которая включает европейскую и индийскую популяции), африканская, азиатская, арктическая, американских индейцев и тихоокеанская (Ь. СауаШЗГогха, 8с1еп1Шс Атепсаи, 72-78, Νον. 1991).

По настоящему изобретению «азиат» означает любого субъекта, происходящего от любого из коренных народов Китая, Монголии, Тайваня, Сингапура, Кореи, Японии, Вьетнама, Камбоджи, Лаоса, Бирмы, Таиланда, Малайзии, Индонезии и Филиппин.

Как подразумевается здесь, «неазиат» означает ссылку на другие человеческие расы/популяции, которые не подпадают под указанное выше определение «азиат».

Пациентов обычно запрашивают на предмет их самоидентификации по «расе», или врач на основе их соматических признаков и/или страны происхождения указывает расу.

По настоящему изобретению «пациенты, которые недостаточно отвечали на предшествующее лечение ΙΡΝ-альфа», представляют собой тех пациентов с НСУ, которые подвергались предшествующему лечению любым типом (или типами) альфа-интерферона (по меньшей мере 12 недель лечения в дозе, по меньшей мере, равной 3 МГИ, 3 раза в неделю), с одним из следующих исходов: (а) неспособность нормализовать сывороточную АТТ, или (Ь) нормализация АТТ с последующим внезапным подъемом (подъем АТТ) до окончания лечения. Дозировки и режимы могут быть выбраны врачом в зависимости от тяжести заболевания, возраста и пола пациента. Согласно настоящему изобретению использовали следующие четыре режима и дозировки.

Режим А: 12 М1И (44 мкг) рекомбинантного ΙΡΝ-бетаДа три раза в неделю, режим В: 12 М1И (44 мкг) рекомбинантного ΙΡΝ-бетаДа ежесуточно, режим С: 24 М1И (88 мкг) рекомбинантного ΙΡΝ-бетаДа три раза в неделю или режим И: 24 МГО (88 мкг) рекомбинантного ΙΡΝ-бетаДа ежесуточно.

По предпочтительному осуществлению изобретения лечение ΙΡΝ-бета следует проводить только в подгруппе пациентов, которые характеризовались клиренсом РНК НСУ через 4 недели лечения. Фактически было замечено, что в данной подгруппе пациентов вероятность того, что лечение будет успешным через 48 недель лечения, является очень высокой, близкой к 100%. «Клиренс РНК НСУ» означает отсутствие детектируемой РНК НСУ в сыворотке подвергавшихся лечению пациентов.

Иными словами, лечение по настоящему изобретению может преимущественно предваряться «фазой тестирования», в которой пациенты получают такое же лечение ΙΡΝ-бета в течение 4 недель и в конце «фазы тестирования» предпочтительно пациентам, которые характеризуются клиренсом РНК НСУ, предлагают провести лечение в течение большего количества недель.

По дальнейшему предпочтительному осуществлению настоящего изобретения лечение ΙΡΝ-бета можно совмещать с сопутствующим лечением другим противовирусным лекарственным средством. Наиболее обычно используемым при лечении НСУ противовирусным лекарственным средством является рибавирин (аналог нуклеозида), но другие лекарственные средства характеризуются некоторым потенциалом при данном лечении, и они перечислены в последнем обзоре (Т ^йкшюи, Сшт. Ор. Ιηνδΐ. Итид, 2(11), 1516-22, 2002) и включают ингибиторы сериновых протеаз, ингибиторы РНК-зависимой РНК-полимеразы (КбКр) и ингибиторы хеликазы. Данные лекарственные средства могут быть введены одновременно, отдельно или последовательно при сочетании с рекомбинантным ΙΡΝ-бета.

Настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные осуществления, но содержание описания содержит все модификации и замены, которые могут быть проведены специалистом в данной области без уклонения за пределы значения и цели формулы изобретения.

Изобретение будет описано посредством следующих примеров, которые никоим образом не должны быть предназначены для ограничения настоящего изобретения. Примеры будут ссылаться на следующие фигуры.

Список сокращений

А - Азиат

АЕ - Побочный эффект

АЕТ - Аланинаминотрансфераза (8СРТ)

ΑΝΑ - Антитела против ядра

А8Т - Аспартатаминотрансфераза (8СОТ)

ΒυΝ - Азот мочевины крови

С - Цирротический

СНС - Хронический гепатит С

СТ - Доверительный интервал

- 6 007091

СК - Полный ответ

СКЕ - Форма истории болезни

СТ - Компьютерная томография

ЕЫ8А - Иммуноферментный твердофазный анализ

Н & Е - Гематоксилин и эозин

ΗΑΙ - Индекс гистологической активности

НВс - Коровый антиген гепатита В

НВе - Антиген е гепатита В

НВ 8 Ад - Поверхностный антиген гепатита В

НВУ - Вирус гепатита В

11СС - Человеческий хорионический гонадотропин

НСУ - Вирус гепатита С

Ηΐν - Вирус иммунодефицита человека

1ЕС - Независимый комитет по этике

ΙΕΝ - Интерферон

1дМ - Иммуноглобулин М

в./м. - Внутримышечный (но)

ΙΝΚ - Международное нормированное отношение

1КВ - Наблюдательный совет института ΐυ - Международная единица(ы)

в./в. - Внутривенный(но) л - литр(ы)

Ьи - Лабораторные единицы мкг - Микрограмм(ы) мкмоль - Микромоль(и) мэкв - Миллиэквивалент(ы)

Μΐυ - Миллион международных единиц (10⁶ ΐυ) мл - миллилитр(ы) мм рт. ст. - миллиметр(ы) ртутного столба ммоль - Миллимоль(и)

ΜΚΙ - Магнитно-резонансное изображение (сканирование)

Ми - Миллион единиц (10⁶ и)

ΝΑ - Неазиат

ΝΑ6 - Нейтрализующее антитело (антитела)

ΝΑΝΒΗ - Гепатит ни А, ни В

NС - Нецирротический

Νυ - Нейтрализующие единицы

ΘΌ - Оптическая плотность

ОК - Коэффициент различия

РСК - Полимеразная цепная реакция пмоль - Пикомоль(и)

РО Рег 08 - Через рот

РТ - Протромбиновое время

0Ω - Ежедневно

КТ-РСК - Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

п./к. - Подкожный(но)

816 - Стандартное отклонение

8ООТ - Сывороточная глутаматоксалоацетаттрансаминаза (А8Т)

80РТ - Сывороточная глутаматпируваттрансаминаза (АЬТ)

8МА - Антитела против гладкой мышцы

Т1ВС - Способность к связыванию общего железа

т.р.н. - Три раза в неделю νδν - Вирус везикулярного стоматита

АВС - Лейкоцит(ы)

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ΑΙ8Η - Амниотическая клеточная линия человека

Описание чертежей

На фиг. 1 представлено распределение пациентов в течение курса исследования общей популяции: 198 из 267 распределенных случайным образом пациентов завершали 48 недель лечения (74,2%), и 183 завершали периоды лечения и наблюдения (68,5%). Пятьдесят шесть (56) пациентов выбыли до окончания периода лечения.

- 7 007091

На фиг. 2 также приведен отчет о распределении пациентов в течение курса исследования, но он ограничен азиатской популяцией: двадцать один (21) из 24 пациентов-азиатов завершали 48 недель лечения (87,5%), и все эти пациенты продолжали проходить период наблюдения.

Фиг. 3 также имеет отношение к распределению пациентов по времени, но на ней представлено сравнение между азиатской и неазиатской популяциями. Из фигуры можно заметить, что отношение выполнения среди азиатских пациентов заметно выше, чем среди неазиатов: 87,5% завершали период лечения по сравнению с 72,8% (177 из 243) неазиатов, и 87,5% завершали как период лечения, так и период наблюдения по сравнению с 66,7% (162 из 243) для неазиатов.

На фиг. 4 приводится сравнение основных результатов по эффективности пациентов-азиатов и неазиатов для выходного параметра, ассоциированного с клиренсом РНК НСУ. Точки представляют собой процент пациентов в каждой популяции, которые достигали выходного параметра, и горизонтальные линии представляют собой доверительные интервалы данных процентных долей; также для данных коэффициентов различия представлены нескорректированные коэффициенты различия (ОН) и доверительные интервалы (С1). Хотя число азиатских пациентов было относительно малым, азиаты значимо с большей вероятностью, чем неазиаты, достигали полного клиренса РНК НСУ на 48 неделю лечения (нескорректированный ОН 5,0; С! для коэффициента различия [1,7-14,5]; р=0,006), на 24 неделю наблюдения (нескорректированный ОН 8,2; С! для коэффициента различия [2,4-27,5]; р=0,003), и в оба момента времени (длительный вирусологический ответ, первичные выходные параметры эффективности исследования: нескорректированный ОН 16,6; С! для коэффициента различия [4,1-67,3]; р<0,001).

На фиг.5 приводится сравнение основных результатов эффективности между пациентами азиатами и неазиатами для выходного параметра, ассоциированного с нормализацией АЬТ. Точки представляют собой процент пациентов в каждой популяции, которые достигали выходного параметра, а горизонтальные линии представляют собой доверительные интервалы для данных процентных долей; также для данных коэффициентов различия представлены нескорректированные коэффициенты различия (ОН) и доверительные интервалы (С!). Азиаты также с большей вероятностью, чем неазиаты, достигали нормального сывороточного уровня АЬТ: различие не было статистически значимым на 48 неделю лечения (нескорректированный ОН 1,8; С! для коэффициента различия [0,7-4,8]; р=0,251), но на 24 неделю наблюдения нескорректированный коэффициент различия азиатов от неазиатов составлял 11,9 (С! для коэффициента различия [4,7-29,9]; р<0,001), а нескорректированный коэффициент различия азиатов от неазиатов для длительной нормализации АЬТ составлял 4,9 (С! для коэффициента различия [1,4-17,1]; р=0,024).

Примеры

Выбор популяции для исследования

Планировалось задействовать примерно 250 пациентов, 200 без цирроза и 50 с компенсированным циррозом, как определено в следующем разделе. Чтобы подлежать включению в исследование, пациенты должны удовлетворять всем следующим критериям в пределах 28 суток перед 1 сутками исследования, которые были определены как первые сутки лечения ШЫ-бета-1а: любые исключения должны были быть одобрены настоящим исследователем во время привлечения пациентов.

Критерии включения

1. Инфекция гепатитом С, подтвержденная серопозитивностью в отношении РНК НСУ (путем НТРСН).

2. Предшествующее лечение любым типом (или типами) альфа-интерферона (по меньшей мере 12 недель лечения в дозе, равной, по меньшей мере, 3 М!и, 3 раза в неделю), с одним из следующих исходов:

ί) неспособность к нормализации сывороточной АЬТ, или ίί) нормализация АЬТ с последующим резким подъемом (повышением АЬТ) по окончании терапии.

3. Пациенты, которые достигали нормализации сывороточной АЬТ во время лечения ΓΡΝ-альфа, но испытывали рецидив после прерывания лечения, не подходили.

4. Гистологические характеристики хронического гепатита, без признаков другого заболевания печени, в биопсии печени, взятой в течение 3 месяцев перед 1 сутками исследования и по окончании лечения альфа-интерфероном. Биопсии печени должны были быть доступны для обзора в Центре.

5. Для четырех или более пациентов на центр (примерно до 50 в сумме): компенсированный цирроз, определенный следующими гистологическими и клиническими критериями:

ί). диагноз вероятного или установленного цирроза на биопсии печени с использованием модифицированного гистологического индекса активности Кпобе11 (Пйак К. е! а1., 1995) или алгоритма Ме1ау1т (Вебо8§а Р. е! а1., 1996) и ίί) максимальный коэффициент СЫ1б-Ридй (Мс!п!уге Ν. е! а1., 1996), равный 6, без признаков печеночной энцефалопатии или асцита.

6. Прерывание терапии альфа-интерфероном по меньшей мере через 3 месяца до 1 суток исследования.

7. Аномальные сывороточные концентрации АЬТ, измеренные в двух случаях, отстоящих друг от друга по меньшей мере на 4 недели во время любого трехмесячного интервала после прерывания тера

- 8 007091 пии альфа-интерфероном (может включать измерения, проведенные во время скрининга для данного исследования). Уровень АЬТ должен оставаться аномальным до начала лечения в рамках исследования.

8. Лабораторные показатели перед лечением в следующих интервалах:

a) АВС >3,0х10⁹/л

b) нейтрофилы >1,5х10⁹/л

c) тромбоциты >120х10⁹/л

б) гемоглобин >6,8 ммоль/л (>11 г/дл)

е) сывороточный альбумин >35 г/л

I) общий билирубин >27,4 мкмоль/л (1,6 мг/дл, кроме пациентов с выявленным синдромом Гилберта)

д) протромбиновое время >2 с выше контроля (или ΙΝΚ<1,4)

II) сывороточный креатинин > верхнего предела нормы.

9. Возраст от 18 до 65 лет для любого пола.

10. Пациенты-женщины не должны быть беременными или кормящими грудью и должны быть или в менопаузе, или хирургически стерилизованы, или должны применять гормональные контрацептивы, внутриматочные устройства, диафрагму со спермицидом, или презервативы со спермицидами в течение исследования.

11. Подтверждение того, что пациентки не беременны, должно было быть получено путем отрицательного теста на беременность с измерением сывороточного НОС, проведенного в течение 28 суток до 1 суток исследования. Этого не требовалось для пациенток в менопаузе или стерилизованных хирургически пациенток.

12. Письменное информированное согласие, данное до любой относящейся к исследованию процедуры, и способность выполнять протокол в течение исследования.

Критерии исключения

Пациентов исключали, если выполнялись любые из следующих критериев:

- предшествующее лечение СНС бета-интерфероном или любым системным антивирусным средством, отличным от альфа-интерферона;

- никакого предшествующего лечения СНС или повторное лечение любым типом альфаинтерферона после полного ответа;

- серологические признаки острой или хронической инфекции гепатитом В (положительность в отношении НВкАд или 1дМ против НВс). Пациенты с прошлой историей инфекции гепатитом В подходили, только если их серологические профили указывали на излечение от НВУ (позитивность анти-НВкАд и анти-НВе);

- серопозитивность в плане Ηΐν (предпочтительно активное тестирование, но оно не требуется, если противоречит 1ЕС или ЖВ);

- исторические, биохимические или морфологические признаки другого хронического заболевания печени, включая болезнь Вильсона, дефицит альфа-1-антитрипсина (позволен любой не-2-фенотип) или гемохроматоз;

- серологические или морфологические признаки аутоиммунного гепатита, первичного билиарного цирроза, первичного склерозирующего холангита или другого аутоиммунного заболевания;

- история острого или хронического заболевания печени, возникшего вторично вследствие приема гепатотоксических лекарственных средств;

- алкогольное заболевание печени (основано на оценке биопсии печени перед исследованием);

- подозрение на рак печени или его признаки.

История или имеющиеся признаки печеночной недостаточности, кровотечения из расширенных вен, асцита, печеночной энцефалопатии или печеночно-почечного синдрома.

История злокачественной опухоли, за исключением карциномы ίη κίΐιι шейки матки или адекватно леченной базально-клеточной карциномы кожи.

Другие серьезные сопутствующие системные нарушения, несовместимые с исследованием (оставлено на усмотрение настоящего исследователя).

Имеющее место в данный момент злоупотребление внутривенными наркотиками или алкоголем. Прием алкоголя в течение исследования не должен превышать 10 г в сутки.

Выведение пациентов из группы лечения или оценки

Пациентов информировали, что они имеют право отказаться от участия в исследовании в любое время без ущерба в их медицинском обслуживании и что они не обязаны излагать причины этого. Пациенты могли быть выведены в любой момент, если настоящий исследователь считал, что это в их интересах.

Требовалось выведение пациентов в случае угрожающей жизни токсичности 4 степени, связанной, как считается, с интерфероном-бета-1а, или в случае беременности. Пациентов также могли вывести из исследования в случае нарушений протокола, серьезных интеркуррентных заболеваний, или серьезных побочных эффектов, или по административным причинам.

- 9 007091

Если пациент преждевременно вышел или был выведен из исследования, основную причину выхода фиксировали в форме истории болезни пациента (СНЕ) и проводили последующую оценку. Пациентов, вышедших или выведенных из исследования по любой причине, не заменяли.

Лечение

Назначенное лечение.

Пациенты получали лечение в виде одного из следующих режимов лечения:

режим А: 12 Μΐυ (44 мкг) 1ЕЫ-бета-1 три раза в неделю, режим В: 12 Μΐυ (44 мкг) ΙΕΝ-бетаЛ ежесуточно, режим С: 24 Μΐυ (88 мкг) ΙΡΝ-бетаЛ три раза в неделю или режим Ό: 24 Μΐυ (88 мкг) ΐΕΝ-бетаЛ ежесуточно.

Лечение осуществляли подкожным введением в течение периода 48 недель. Пациенты должны были сами вводить себе лекарственное средство, фиксируя подробности введения в дневниках пациентов. Участки инъекции следовало часто менять. 1Ж-бета-1а. используемый для лечения, представлял собой ВеЫ1Т® (8егопо).

Характеристика продуктов, применяемых в исследовании.

1Ж-бета-1а поставляется в виде стерильного, лиофилизованного порошка в стеклянных пузырьках, каждый из которых содержит 12 Μΐυ (44 мкг) 1Е№Ые1а-1а плюс наполнители и стабилизаторы (человеческий сывороточный альбумин, маннит и ацетат натрия). К каждому пузырьку с исследуемым лекарственным средством прилагался 0,9% раствор хлорида натрия для применения в качестве разбавителя; инструкции для восстановления предоставлены в буклете информации для пациента и в протоколе исследования. Лиофилизованное исследуемое лекарственное средство следовало хранить в безопасном месте при температуре от 2 до 8°С, и оно не должно было замораживаться. Препарат не содержал противомикробных консервантов, и поэтому реконструированный медикамент следовало вводить немедленно. Этикетку и упаковку подготавливали согласно местным регуляторным требованиям.

В данном исследовании не применяли слепой метод.

Выбор доз для исследования.

Дозы, применяемые для исследования, выбирали на основе результатов предыдущих исследований с природными и рекомбинантными ΐΕΝ-бета.

Пациенты сами вводили себе исследуемое лекарственное средство и фиксировали подробности введения в дневниках пациентов, которые возвращали персоналу исследования с использованными и неиспользованными пузырьками с исследуемым лекарственным средством. Пациентов просили возвращать неиспользованный медикамент в Центр предпочтительно в его оригинальной упаковке.

Требовалось, чтобы пациентов предварительно лечили ΐΕΝ-альфа от их хронического гепатита С. Протокол исключал пациентов, которые получали предшествующее лечение бета-интерфероном или антивирусными средствами, отличными от альфа-интерферона, для лечения СНС, или которых повторно лечили альфа-интерфероном после полного ответа. Пациентов, которые злоупотребляли внутривенными наркотиками или алкоголем, также исключали.

Во время данного исследования пациенты могли принимать парацетамол (ацетаминофен), если требовалось ослабить органические симптомы, такие как лихорадку, миалгии или гриппоподобные симптомы: общая доза не должна была превышать 3000 мг в сутки. Парацетамол также можно было давать профилактически по усмотрению настоящего исследователя. Было решено информировать пациентов о том, что при длительном введении может развиться тахифилаксия побочных эффектов интерферона, и что введение данного медикамента перед сном может уменьшить восприятие данных побочных эффектов.

Пациентам не позволяли получать другой иммунотерапии, химиотерапии, радиационной терапии или кортикостероидов во время исследования, за исключением местного введения или ингаляции кортикостероидов, и введения гормональных контрацептивов.

Любая сопутствующая терапия, которую считали необходимой для благополучия пациента, и которая не препятствовала исследованию, могла проводиться на усмотрение исследователя. Введение всех сопутствующих видов терапии фиксировалось в СНЕ пациента.

Анализ РНК НСУ.

Анализы РНК НСУ проводили центрально, в лаборатории, имеющей опыты в детекции, количественном анализе и генотипировании НСУ, которая ранее участвовала в стадиях подтверждения используемых в настоящее время диагностических тестов.

Образцы собирали и получали по руководству, предоставленному в протоколе исследования. Качественное выявление РНК НСУ проводили с использованием теста на НСУ Воске СОВА8 Атрйсог (версия 2.0). Количественный анализ РНК НСУ проводили с использованием разветвленного анализа ДНК (Оиапйр1ех НСУ ΒΝΑ 2.0-СЫгои/Вауег). Количественный анализ проводили в подходящих группах серий пациентов для минимизации вариации от анализа к анализу.

Генотипирование проводили на образцах сыворотки, полученных до лечения, собранных во время периода скрининга. Генотип НСУ определяли с использованием анализа с зондами линии !ппо1|ра (1иио

- 10 007091 депейсз) после амплификации путем КТ-РСК 5'-некодирующей области геномной последовательности НСУ.

Гистология печени.

Среди трех классических выходных параметров, задействованных в исследованиях противовирусного лечения СНС, а именно, АКТ, РНК НСУ и гистология печени, гистологическая оценка образцов биопсии печени представляет собой замещающий выходной параметр, который считается ближайшим к «истинному» выходному параметру связанной с печенью заболеваемости и смертности. Кроме того, это также выходной параметр с наиболее серьезными ограничениями и источниками смещения. Критерии для оценки гистологического улучшения пока не стандартизованы, и применяемые в разных регионах практические варианты могут отличаться друг от друга. Данные ограничения были сформулированы для данного исследования следующим образом.

Наличие биопсии печени перед лечением, которая демонстрирует черты хронического гепатита, без признаков другого заболевания печени, требовалось для всех пациентов, приемлемых для исследования. Биопсию печени перед лечением должны были брать по окончании предшествующего лечения альфаинтерфероном и в пределах 12 месяцев до 1 суток исследования (первая поправка к протоколу сократила данное окно до 3 месяцев до 1 суток исследования). Биопсия после лечения должна была быть получена в пределах недели по окончании 48 недель лечения. Все биопсии печени должны были быть доступны для обзора в Центре.

Образцы следовало получать с использованием обычных процедур, принятых в институте, и они должны были содержать по меньшей мере пять подлежащих оценке портальных трактов. Три среза следовало получать из каждого образца биопсии: один неокрашенный, один окрашенный гематоксилином и эозином (Н & Е) и один окрашенный трихромом (если трихром недоступен, следовало подавать по меньшей мере один неокрашенный срез и один окрашенный Н & Е).

Образцы биопсии исследовались в центре одним патологом с обширным опытом в гистологии печени. Патолог не имел информации о личности пациента, лечебном назначении и центре исследования. Образцы биопсии исследовались в виде биологической пары, срезы, полученные перед лечением и после лечения от одного пациента, считывали одновременно, не зная порядка, в котором были получены данные образцы.

В гистологической оценке использовали полуколичественный гистологический индекс активности Кпос1е11 (НА1) в модифицированной версии по Ы1ак е1 а1. вместе с системой стадий для оценки изменений архитектоники, т.е. фиброза или цирроза.

Таблица 1

Модифицированный гистологический индекс активности (НА1)

Модифицированная классификация

ΗΑΙ (нвкровоспалительные коэффициента)

Перипортальный или перисептальный гепатит области раздела (фрагментарный некроз)

Сливной некроз;

гибель групп соседних гепатоцитов без ясной зональной локализации или соединения, зональный сливнои некроз, соединяющий панацинарныи некроз, связывающий сосудистые структуры, и или мультиацинарный некроз

Местный (пятнистый) литический некроз, апоптоз и местное воспаление; с выбросом клеток печени

Портальное воспаление

Каждый из четырех гистологических параметров - перипортальный или перисептальный гепатит области раздела (фрагментарный некроз), сливной некроз, местный (пятнистый) литический некроз, апоптоз и местное воспаление, и портальное воспаление - классифицируется отдельно по системе коэффициентов, использующей последовательные целые числа. Между коэффициентами, сгенерированными для каждого отдельного компонента, проводят сравнения.

Большинство пациентов с СНС характеризовались мягкой или умеренной степенью некровоспаления печени. При использовании полуколичественной системы численного коэффициента НА1 снижение по меньшей мере двух пунктов классификации (т.е. некровоспаления) любого компонента НА1, в общем, считается соответствующим относящемуся к лечению гистологическому улучшению. Аналогично увеличение по меньшей мере двух или нескольких пунктов классификации указывает на относящееся к ле чению гистологическое ухудшение.

- 11 007091

Часто сообщают об общем коэффициенте для классификации, вычисляемом путем суммирования компонентов классификации, хотя это методологически неверно (8сйеиет Р.1., 1996). Сумма индивидуальных коэффициентов представляет собой общий некровоспалительный коэффициент, который варьирует от 0 до 18: наивысшим является коэффициент, отражающий максимально развернутое заболевание печени. Общий коэффициент классификации ΗΑΙ вычисляется только для сравнения с другими опубликованными исследованиями.

При разделении на стадии оценивают изменения архитектоники, фиброз и цирроз, с помощью системы коэффициента, использующей следующие друг за другом целые числа от 0 = «нет фиброза» до 6 = «возможный или выраженный цирроз». В настоящей практике определения улучшения и/или ухудшения при разделении на стадии (фиброз, цирроз) существуют противоречия. В то время как некоторые считают, что достаточно изменения на один пункт, наиболее консервативным подходом является определение улучшения или ухудшения на основе изменения по меньшей мере двух пунктов.

Клиническая лабораторная оценка.

Стандартными способами измеряли следующие параметры.

Гематология: гемоглобин, число эритроцитов, гематокрит, число тромбоцитов, число лейкоцитов и лейкоцитарная формула (х 10⁹/л).

Биохимия: натрий, калий, общий кальций, мочевина (ΒυΝ), креатинин, альбумин, общий белок, билирубин (общий и прямой), АЬТ, щелочная фосфатаза, глюкоза и триглицериды. Путем измерения триглицеридов следовало определить, взяты образцы натощак или нет; в случае аномальных результатов измерения следовало повторить с использованием взятых натощак образцов.

Анализ мочи: глюкоза, кетоны, белок, кровь и рН.

Коагуляция: протромбиновое время.

Щитовидная железа: тиреоидстимулирующий гормон (если результаты не соответствовали норме, проводили тесты на антитела против микросом щитовидной железы и на антитела против тиреоглобулина).

Детекция антител против бета-интерферона.

Образцы для детекции потенциальных антител против исследуемого медикамента собирали в начале исследования в качестве фона, в конце 12, 24 и 48 недели лечения и в конце 4 недели наблюдения. Руководства для получения образцов и обращения с ними предоставлялись протоколом исследования. Образцы вначале тестировали на предмет связывания антител с использованием иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЫ8А). Тестируемые образцы или образцы контроля качества (разведение 1/10) инкубировали с антигеном (ГЕИ-бетаЧа), сорбированным на лунки для микротитрования. После промывки и инкубации с меченным пероксидазой поликлональным антителом к человеческому иммуноглобулину и инкубации с хромогенным раствором, измеряли оптическую плотность (ΘΌ) полученного в результате окрашивания:

ΘΌ пропорциональна концентрации антител против 1Ж-бета-1а. присутствующих в образце. В каждый анализ включали в качестве отрицательного контроля образец нормальной сыворотки человека. Среднее ΘΌ плюс два стандартных отклонения (816) от среднего использовали в качестве значения отсечения для оценки состояния антител в тестируемых образцах: все образцы со значениями ΘΌ ниже значения отсечения считали негативными. Все образцы со значениями выше уровня отсечения далее тестировали с использованием анализа поглощения. Данный полуколичественный анализ позволял различить связывание антител специфично с 1Ж-бета-1а от неспецифического связывания и предоставлял титр данных антител. Образцы, позитивные при ЕЬ18А-скрининге, предварительно инкубировали с антигеном в жидкой фазе (ГГИ-бетаЧа) и сравнивали непосредственно в том же анализе (проводимом, как описано выше, для ЕЫ8А) с непоглощенными образцами в интервале разведений, с подходящими контролями. Значение отсечения рассчитывали, как описано для ЕЬ18А, и значения ΘΌ непоглощенных образцов сравнивали с таковыми поглощенных образцов. Образцы, продемонстрировавшие различие в их поглощенных и непоглощенных значениях ΘΌ, считали позитивными, и титр рассчитывали из самого большого разведения, обеспечивающего значение ΘΌ выше уровня отсечения данного анализа. Образцы, которые не характеризовались различием в их поглощенных и непоглощенных значениях ΘΌ, считали негативными, и их связывание было охарактеризовано как неспецифическое.

Затем позитивные образцы подвергались дальнейшему тестированию на предмет нейтрализующей активности, с использованием анализа, основанного на ингибировании цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита (У8У), вызванного обработкой ίη νίίτο человеческим ΙΡΝ-бета. Человеческие амниотические клетки \νΐ8Η, культивируемые в виде монослоя в 96-луночных планшетах для микротитрования со смесью сывороток пациента и фиксированной концентрацией ΙΡΝ-бета, инфицировали У8У. Число клеток, переживших инфекцию через 24 ч, оценивали окрашиванием кристаллическим фиолетовым: число выживших клеток пропорционально оптической плотности, измеренной многоканальным спектрофотометром для считывания микропланшетов для ЕЫ8А при 592 нм. Чем больше количество (титр) нейтрализующих ΙΡΝ-бета антител в сыворотке при оценке, тем меньше защита клеток \νΐ8Η от индуцированных У8У цитопатических эффектов и, следовательно, ниже оптическая плотность окрашенного монослоя. Количества нейтрализующих антител стандартизовано (согласно ВОЗ) в нейтрализую

- 12 007091 щих единицах (Νϋ) на миллилитр. Одна Νυ/мл определена как количество нейтрализующего антитела, которое снижает противовирусную активность от 10 лабораторных единиц (Ьи) на миллилитр до 1 Ьи/мл (т.е. на количество ΙΕΝ-бета, ограничивающее повреждение клеток на 50% цитопатического эффекта, индуцированного вирусом в отсутствие ΙΕΝ-бета). В данном исследовании все образцы, характеризующиеся какой-либо нейтрализующей активностью, считали №Ь-положительными.

Первичные и вторичные выходные параметры эффективности.

Первичный выходной параметр исследования представлял собой коэффициент длительного вирусологического ответа, определенный как отсутствие детектируемой РНК НСУ в сыворотке в конце лечения (неделя 48) и в конце 24 недель наблюдения. Вторичными выходными параметрами являлись

- наличие или отсутствие РНК НСУ в сыворотке на 48 неделю лечения,

- нормализация сывороточных уровней АЬТ и АЬТ с течением времени,

- эффект лечения на вирусную загрузку,

- элиминация РНК НСУ и нормализация АЬТ как объединенный выходной параметр и

- улучшение гистологии печени в конце лечения.

Статистическое и аналитическое планирование

Популяции для исследования.

Данное исследование охватывало пациентов как с циррозом, так и без него. Популяцию пациентов без цирроза считали наиболее интересной, поскольку, как ожидалось, она должна была быть первичной целевой популяцией для лечения ШЛ-бета-1а.

Анализы безопасности и эффективности, описанные в последующих разделах, следовало проводить отдельно для популяции с циррозом и без него. Все сравнения, проводимые между данными двумя популяциями, должны быть описательными по природе.

Из-за спонтанного сообщения о результатах с высокой эффективностью, сделанного авторами настоящего изобретения в Тайваньском центре, проводили исследовательские анализы по центру и по демографическим характеристикам, что привело к установлению различий между пациентами азиатского и неазиатского происхождения. Поэтому план анализа данного исследования был изменен так, что оно должно было охватывать оценку обеих данных популяций.

Оценка сравнимости групп лечения.

Для визуального сравнения должны быть сведены в таблицу базовые характеристики с использованием суммарной статистики по группе лечения. Они должны охватывать демографические данные, медицинскую историю, сопутствующее лечение, уровни РНК НСУ и АТТ в сыворотке, гистологию печени и другие характеристики заболевания.

Оценка эффективности.

Должно было быть два промежуточных и один окончательный анализ данных. Первый промежуточный анализ следовало проводить по окончании 48 недель лечения. Второй промежуточный анализ следовало проводить после того, как пациенты, вовлеченные в первый промежуточный анализ, закончат 24 недели наблюдения.

Доверительные интервалы (95%) следовало использовать в каждой промежуточной точке. В дополнение к одномерным тестам, в окончательном анализе следовало применять подход, предложенный О'Впеп (О'Впеи РС, 1984): по существу, это непараметрический основанный критерий суммы рангов, который проверяет гипотезу об отсутствии различий, связанных с лечением, с мощью, направленной на альтернативы, в которых по меньшей мере один способ лечения равномерно лучше других. Перед анализом выходные параметры следует предварительно группировать. Результаты промежуточных анализов следовало использовать для целей внутреннего планирования. Их не меняли для изменения курса процедур по исследованию.

Окончательный анализ следовало проводить, когда все пациенты заканчивали 48 недель лечения и 24 недели наблюдения.

Популяции для анализа эффективности.

Анализы эффективности для популяции без цирроза следовало проводить с использованием двух популяций для анализа:

- все пациенты (популяция, предназначенная для лечения),

- пациенты, которые закончили период данного исследования без больших нарушений протокола (популяция по протоколу).

Анализы популяции, предназначенной для лечения, следует проводить двумя путями: а) считая все выпадения из исследования неудачами лечения (способ первичного анализа) и Ь) подробно оценивая причины выпадения. Следовало проводить анализы чувствительности для сравнения результатов, полученных данными двумя подходами, для оценки надежности результатов при различных допущениях.

Такие подробные анализы не следует проводить для популяции с циррозом, если конечный размер выборки не позволяет проводить такие анализы.

- 13 007091

Статистическое сравнение.

Для каждого выходного параметра группы лечения следовало предоставлять статистику на выходе. В дополнение к анализам, проведенным на группах лечения, выходные параметры следовало сравнивать следующими способами:

1) должен исследоваться уровень дозы путем сравнения ответов от пациентов, получавших 44 мкг, с таковыми от пациентов, получавших 88 мкг, вне зависимости от режима дозировки,

2) должен исследоваться режим дозировки путем сравнения ответов от пациентов, получавших лечение ежесуточно, с таковыми от пациентов, получавших его три раза в неделю (т.р.н.), независимо от уровня дозы,

3) должны исследоваться взаимоотношения доза-ответ с использованием запланированной недельной дозы. В случае значительной неподверженности лечению также следовало исследовать действительно полученную недельную дозу.

Первичный выходной параметр эффективности.

Первичным выходным параметром исследования являлся коэффициент длительного вирусологического ответа, определенный как отсутствие детектируемой РНК Ηί,'ν в сыворотке как в конце 48 недель лечения, так и в конце 24 недель наблюдения.

Позитивность в плане РНК ΗСV считали отсутствием ответа. Процент отвечающих пациентов (коэффициент ответа) следовало рассчитывать на группу лечения и сравнивать, как описано ниже.

Вторичные выходные параметры эффективности.

Вторичные выходные параметры эффективности были такими, как перечислено ниже. Вторичные выходные параметры эффективности следовало анализировать на 48 неделе лечения и 24 неделе наблюдения, кроме отмеченных иначе случаев.

- Наличие или отсутствие РНК Ηί,'ν в сыворотке на 48 неделю лечения.

- Нормализация АЬТ и значения АЬТ в течение времени.

- Эффекты лечения на вирусную загрузку, включая изменение РНК ΗСV в сыворотке и процентное изменение концентраций РНК Ηί,'ν в сыворотке.

- Элиминация РНК ΗСV и нормализация АЬТ как объединенный выходной параметр.

- Улучшение гистологии печени (степень и стадия) в конце лечения по сравнению с биопсией перед лечением. Гистологическая классификация должна основываться на полуколичественном гистологическом индексе активности Киобе11 (ΗΑI), модифицированном по ЕНак е1 а1. Модифицированная система коэффициентов ΗΑI включает четыре отдельных компонента для классификации некровоспалительной активности. Сравнения должны были осуществляться между коэффициентами, сгенерированными для каждого отдельного компонента. Часто сообщают об общем коэффициенте для классификации, вычисляемом путем суммирования компонентов классификации, хотя это методологически неверно (8сЬеиег РЬ 1996). Поэтому общий коэффициент для классификации ΗΑI должен рассчитываться для сравнения с другими опубликованными исследованиями. Гистологическое разделение на стадии, в котором оценивают изменения архитектоники, фиброз и цирроз, должно быть основано на отдельной шкале стадий, опубликованной ЕНак е1 а1.

Методология статистической обработки.

Выходные параметры данного исследования включали бинарные исходы, категорические исходы более чем с двумя уровнями и непрерывные исходы. Поэтому должны были применяться следующие методологии. Следовало проводить стратификацию по центрам, если из центров было привлечено достаточное число пациентов. По причине малого количества пациентов с циррозом на центр не планировалось принимать центр во внимание при анализах популяции с циррозом, но если ситуация иная, то для популяций с циррозом и без цирроза следует применять одну и ту же методологию.

Между группами лечения следовало сравнивать коэффициенты ответа, основанные на бинарных выходных параметрах (таких как элиминация РНК ΗСV) с использованием односторонних точных тестов Фишера с уровнем значимости 0,05, и их следовало стратифицировать по центрам, если это осуществимо.

Следовало проводить анализы по исследованию эффекта ковариации на бинарные исходы с использованием логистической регрессии, включая переменную для центра, если это осуществимо. Поэтому результаты данных анализов должны быть асимптотическими и неточными.

Коэффициенты ответа, основанные на категорических выходных параметрах (таких как классификация и разделение на стадии), следует сравнивать между группами лечения с использованием тестов Мантеля-Хентцеля (коэффициенты построчного среднего), стратифицируя по центрам, если это осуществимо.

Отдельные профили непрерывных величин (РНК ΗСV и АЬТ), оцениваемых повторно через интервалы времени, следовало наносить на график для определения того, какая величина представляет собой подходящий итог ответа для всех пациентов.

Непрерывные выходные параметры эффективности (такие как изменение РНК ΗСV) следовало анализировать с использованием дисперсионного анализа (ΑNОVΑ; модель главного эффекта, включая

- 14 007091 факторы лечения и центра). Взаимоотношения доза-ответ следовало анализировать путем проверки на тренд (Οιιζίοΐ; 1., 1985), как и разницу между полученными и планируемыми дозами.

Непрерывные выходные параметры безопасности (такие как лабораторные значения) следовало анализировать с использованием теста Вилкоксона с относительными рангами (для отделения значимых изменений от фона) и тестов Крускала-Уоллиса (для проверки гетерогенности ответа на лечение), которые не должны включать фактор центра.

Корреляцию между первичными и вторичными выходными параметрами следовало анализировать с описательными и исследовательскими целями. Следовало строить различные графики для каждого уровня и режима дозировки.

Результаты для выходных параметров, измеренных в разные моменты времени (такие как 48 неделя лечения и 24 неделя наблюдения), следовало отображать соответственно.

Определение размера выборки.

Размер выборки, равный 50 пациентам без цирроза на группу лечения, выбирали по клиническим соображениям. Точный тест Фишера использовали для сравнения процентных долей отвечающих пациентов (пациенты без детекции РНК НСУ) по причине малых размеров вовлеченных выборок и соответственно малых ожидаемых частот попадания в ячейку в таблице исходов против лечения. Размеры выборки и мощность, оцененная из формул для двух групп, скорректированный для непрерывности Х²-тест для равных пропорций, были подходящими для применения с точным тестом Фишера. Для привлечения были предоставлены примерно 50 пациентов с циррозом, которых случайно распределяли по четырем группам лечения и равномерно распределяли по центрам. Число пациентов с циррозом, подлежащее привлечению одним центром, было ограничено для того, чтобы гарантировать общее число, примерно равное 50. Привлечение в исследование следовало останавливать, основываясь на привлечении требуемого количества пациентов без цирроза.

Изменения в проведении исследования или запланированных анализов.

Из-за спонтанного сообщения о результатах с высокой эффективностью, сделанного авторами настоящего изобретения в Тайваньском центре, предварительные исследовательские анализы основных выходных параметров эффективности по центрам (Тайваньскому и другим) и по демографическим характеристикам (азиатская раса против неазиатской расы) проводили до закрытия базы данных. План анализа для данного исследования обновляли на основе результатов данных предварительных анализов и тех из первых промежуточных анализов, которые показали полный вирусологический ответ на 48 неделе лечения у очень малого количества пациентов и малые различия между пациентами с циррозом и без цирроза. Изменения первоначального плана включали в себя следующее.

Эффективность следовало оценивать с использованием только полного набора для анализа (предназначенная для лечения популяция, включающая всех рандомизированных пациентов, которые получали какое-либо количество лекарственного средства по исследованию).

На первичной переменной эффективности не следовало проводить каких-либо тестов по проверке статистических гипотез (коэффициент длительного вирусологического ответа).

Анализ эффективности должен быть главным образом описательным, с оценкой 95% доверительных интервалов, где это является подходящим.

Анализы подгрупп азиатской и неазиатской популяций следовало проводить для фоновых характеристик и для выходных параметров эффективности и безопасности.

Основной анализ первичного выходного параметра должен включать в себя оценку доверительных интервалов для процентных долей пациентов, характеризующихся продолжительным вирусологическим ответом: проверки гипотез не должны подлежать интерпретации из-за очень малого количества наблюдаемых ответов. Эффекты лечения, цирротического состояния, азиатского происхождения и фонового уровня РНК НСУ также следовало исследовать с использованием в основном описательных способов, и следует эффект других переменных, включая возраст, пол и воздействие лечения.

Для вторичных выходных параметров эффективности следовало рассчитывать 95%-ные доверительные интервалы. Для бинарных переменных следовало использовать точное биномиальное распределение. Для непрерывных переменных, которые не соответствуют требованию нормальности, следовало рассчитывать непараметрические доверительные интервалы для медианы (номинально доверительные интервалы должны составлять 95%).

Наличие или отсутствие РНК НСУ в сыворотке на 48 неделю лечения следовало суммировать посредством «коэффициента вирусологического клиренса» (число пациентов с отсутствием детектированной РНК НСУ, разделенное на число рандомизированных и подвергавшихся лечению пациентов).

Нормализацию АТТ следовало суммировать посредством «коэффициента нормализации» (число пациентов с нормальным уровнем АЬТ, разделенным на число случайно распределенных и обработанных пациентов), и уровни АЬТ, измеренные через некоторые промежутки времени, следовало суммировать с использованием описательной статистики.

Эффекты лечения на вирусную загрузку следует оценивать с использованием описательной статистики для измеренных значений и оценки абсолютных и процентных изменений концентрации РНК НСУ в сыворотке.

- 15 007091

Элиминация РНК НСУ и нормализация АЬТ, как объединенный выходной параметр, следовало оценивать путем анализа числа и процентной доли пациентов, характеризующихся и клиренсом РНК НСУ, и нормализацией ЛЬТ на 48 неделю лечения и на 24 неделю наблюдения. Улучшение гистологии печени следовало оценивать с использованием гистологического индекса активности Кио6е11 (ΗΑΙ), модифицированного по Ыак е1 а1. Следовало оценивать четыре компонентных коэффициента для классификации некровоспалительной активности и один коэффициент для классификации фиброза/цирроза. Изменение следовало оценивать путем вычитания фоновых коэффициентов из коэффициентов 48 недели, с отрицательным результатом, который указывает на улучшение. Коэффициенты и изменения для каждого компонента следует суммировать с использованием счетов частоты. Общий коэффициент классификации ΗΑΙ следовало получать путем суммирования четырех компонентных коэффициента для каждого пациента и следовало суммировать с использованием описательной статистики (с рассмотрением общего коэффициента в качестве непрерывной переменной). Улучшения в компонентах классификации следовало анализировать с использованием логистической регрессии (или теста Кокрана-МантеляХентцеля, если размеры выборок были слишком малыми) для исследования эффекта демографической и фоновой характеристики, и следовало рассчитывать доверительные интервалы для коэффициентов различия.

Выводимые путем заключения анализы (точный тест Фишера и логистическую регрессию) использовали в исследовательской манере для образования гипотез, особенно, в отношении различий между азиатскими и неазиатскими пациентами. Следует отметить, что имеется очень большой дисбаланс между числом азиатских и неазиатских пациентов. Поэтому требуется осторожность при интерпретации результатов выводимых путем заключения анализов.

Точный тест Фишера использовали для сравнения доли азиатских и неазиатских пациентов, достигавших клиренса РНК НСУ (на 48 неделю лечения и 24 неделю наблюдения), длительного клиренса РНК НСУ, нормализации АЬТ на 12 неделю, нормализации АЬТ на 24 неделю и длительной нормализации АЬТ на 24 неделю. Девяностопятипроцентные доверительные интервалы для данных долей вычисляли с использованием точного способа Атшйаде аиб Веггу (Атшйаде Р., 1990). Рассчитывали нескорректированные коэффициенты различия для азиатской популяции против неазиатской вместе с их 95% доверительными интервалами.

Логистическую регрессию (8А8 Ргос Ьод18бс) использовали для оценки влияния выбранных потенциальных объясняющих переменных на основные выходные параметры эффективности: длительный клиренс РНК НСУ, полный клиренс РНК НСУ (на 48 неделю) и длительную нормализацию АЬТ. Использованные объясняющие переменные представляли собой фоновые значения выходных переменных (например, фоновый уровень РНК НСУ), возраст, пол, цирротический статус, раса (азиатская против неазиатской), режим лечения (4 группы), частота дозирования (т.р.н. против Οϋ). интенсивность дозы (44 мкг против 88 мкг) и воздействие (общая доза и доза на килограмм). Прямую селекцию использовали для включения в модель переменных. Рассчитывали скорректированные и нескорректированные коэффициенты различия.

Распределение пациентов

Анализы, включенные в данный раздел, проводили для пяти популяций пациентов: общая популяция, подгруппы с циррозом и без цирроза и азиатская и неазиатская подгруппы. Всего привлекали 270 пациентов и случайно распределяли их по 19 центрам. Из данных пациентов 43 случайно распределяли как пациентов с циррозом, а 227 случайно распределяли как пациентов без цирроза. Двадцать четыре (24) из 270 пациентов (8,9%), привлеченные в 4 центрах, были азиатского происхождения. Двух из азиатских пациентов случайно распределяли как пациентов с циррозом, а остальных случайно распределяли как пациентов без цирроза.

Всего 65 пациентам по случайному принципу назначали 44 мкг т.р.н., 68 по случайному принципу назначали 88 мкг т.р.н., 72 по случайному принципу назначали 44 мкг РЭ и 65 по случайному принципу назначали 88 мкг РЭ. В азиатской подгруппе 6 пациентов по случайному принципу распределяли по каждой группе, получавшей лечение т.р.н., 5 по случайному принципу назначали 44 мг РЭ и 7 по случайному принципу назначали 88 мкг РЭ.

Три случайно выбранных пациента никогда не получали лечения, и их данные пропущены во всех следующих таблицах. Все эти три пациента были неазиатами.

Одного из пациентов исключали из анализа эффективности, поскольку проведенная в центре оценка РНК НСУ путем РСВ на уровне фона показала, что он НСУ-негативен: данный пациент был введен в исследование на основе положительного теста на РНК НСУ, проведенного местной лабораторией. Данный пациент должен был исключаться из исследования по причине отрицательного результата из лаборатории в центре; однако, поскольку данный результат не был доступен в то время, когда он уже стал получать лечение, было решено включить его в предварительное исследование и анализы безопасности.

Всего 198 из 267 случайно распределенных пациентов заканчивали 48 недель лечения (74,2%), и 183 заканчивали периоды лечения и наблюдения (68,5%),

- 16 007091

Пятьдесят шесть (56) выпадали из исследования до окончания периода лечения. Профиль ранних отказов четко выявляет связанные с режимом ограничения приверженности пациентов и переносимости ими лечения: 43 из 56 отказавшихся вводили лекарственное средство ежесуточно.

Тридцать два из 43 пациентов с циррозом заканчивали лечение (74,4%), 31 из них доходили до окончания периода наблюдения (72,1% популяции). Из 9 пациентов с циррозом, которые покидали фазу лечения, 5 получали ежесуточную дозировку.

Двадцать один (21) из 24 азиатских пациентов заканчивали 48 недель лечения (87,5%), и все данные пациенты доходили до окончания периода наблюдения. Выходы из исследования в данной популяции не показали четкой связи с дозой или частотой введения; однако, здесь было только три выхода.

Доля окончания среди азиатских пациентов была заметно выше, чем таковая у неазиатов: 87,5% заканчивали период лечения по сравнению с 72,8% (177 из 243) для неазиатов, и 87,5% заканчивали и лечение, и наблюдение по сравнению с 66,7% (162 из 243) для неазиатов.

На фиг.1-3 проиллюстрировано распределение пациентов согласно цели исследования по настоящему изобретению.

Оценка эффективности Анализированные наборы данных

Анализы эффективности следовало проводить с использованием полного набора для анализа (предназначенные для лечения субъекты), состоящего из всех случайно распределенных пациентов, которые получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства. Однако одного из пациентов (без цирроза и азиат) исключали из анализов эффективности, поскольку проведенная в центре оценка РНК НСУ путем РСК на уровне фона показала, что он НСУ-негативен (тест на РНК НСУ, проведенный местной лабораторией, был положительным в плане РНК НСУ). Данный пациент должен был исключаться из исследования по причине отрицательного результата из лаборатории в центре; однако, поскольку данный результат не был доступен в то время, когда он уже стал получать лечение, было решено включить его в предварительное исследование и анализы безопасности.

Все анализы, включенные в данный раздел, проводили для пяти популяций пациентов: общая популяция, подгруппы с циррозом и без цирроза и азиатская и неазиатская подгруппы. Также получали сравнительные табуляции, представляющие результаты как для азиатской, так и для неазиатской подгрупп. Результаты сфокусированы на общей популяции, азиатской подгруппе и сравнении азиатской и неазиатской подгрупп.

Демографические и другие фоновые характеристики.

Там, где измерения проводили несколько раз до инициации лечения в рамках исследования, те, которые проводили на 1 сутки исследования до введения исследуемого лекарственного средства, принимали за фоновые измерения. Если измерения 1 суток исследования не были доступны, использовали измерения перед исследованием, ближайшие к 1 суткам исследования.

Демография.

В табл. 2 представлены демографические характеристики для различных популяций. Популяция в целом относилась преимущественно к белым (81,3%) и мужчинам (74,9%). Эти пропорции существенно не изменялись среди групп лечения или среди популяций с циррозом и без цирроза. В азиатской подгруппе доля мужчин была несколько ниже (66,7%).

Возраст, рост, вес и индекс массы тела (ΒΜΙ) по группам лечения в общей популяции, в основном, были одинаковыми. В подгруппе с циррозом пациенты, получавшие 44 мкг т.р.н., были чуть старше, чем пациенты в других группах лечения, с чуть меньшим весом и ΒΜΙ. В азиатской подгруппе различия между группами лечения по возрасту, росту, весу и ΒΜΙ были более заметными.

Пациенты-азиаты были ниже и легче неазиатов, но возраст этих субпопуляций был сходным. Пациенты с циррозом были чуть старше и тяжелее, чем пациенты без цирроза.

- 17 007091

Таблица 2

Данные демографии (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Данные демографии	Азиаты (п=24)	Неазиаты (п=243)	Общие данные (п=267)
Возраст (годы)	Число Среднее (ст.откл.) Медиана (01;РЗ) Разброс	п=24 47 (12,2) 44,5 (38;59,5) 23;64	п=243 44,9 (8,1) 45 (40;50) 16;69	п=267 45,1 (8,6) 45 (39;50) 16;69
Вес (кг)	Число Среднее (ст.откл.) Медиана (<2>1;ОЗ) Разброс	п=24 68,5 (10,4) 68 (63;76,5) 46;86	п=243 85,8 (19,3) 84 (73,2;96) 47; 162	п=267 84,3 (19,3) 81 (71,4;95) 46; 192
Рост (см)	Число Среднее (ст.откл.) Медиана (Ц1 ;ЦЗ) Разброс	п=24 165,3 (7,5) 167 (160;172) 151;178	п=243 172,7 (9) 173 (166;180,3) 149;202	п=267 172,1 (9,9) 172,7 (165,1;180) 149;202
ΒΜΙ (кг/м2)	Число Среднее (ст.откл.) Медиана (01;03) Разброс	п=24 25(3,5) 25,1 (22,7;27,4) 18;33	п=243 28,7 (5,7) 28,4 (24,7;31,2) 17;58	п=267 28,4 (5,7) 27,9 (24,5;30,9) 17;58
Пол	Мужской Женский	16(66,7%) 8 (33,3%)	184 (75,7%) 59 (24,3%)	200 (74,9%) 67(25,1%)

Длительность и состояние инфекции.

Всего длительность инфекции изменялась от 7 до 374 месяцев со средним (ст.откл.), равным 63 (±57) месяцам, и медианой, равной 46,5 месяцев. Неудивительно, что средняя длительность заболевания и ее медиана были больше среди пациентов с циррозом по сравнению с пациентами без цирроза. Длительность инфекции была меньше среди азиатов, чем среди неазиатов: среднее (ст.откл.) и медиана для азиатов составляли 41,3 (±19,7) и 34 месяца по сравнению с 64,8 (±58,7) и 47,5 месяцев для неазиатов. Это различие не было статистически значимым (р=0,077).

Наиболее частым путем заражения, о котором сообщалось, было злоупотребление в./в. наркотиками (109 из 267 пациентов; 40,8%), затем следовали «неизвестный путь» и переливание крови.

Среди пациентов с циррозом злоупотребление в./в. наркотиками было наиболее обычным, за ним следовали переливание крови и «неизвестный путь». Среди азиатов единственными путями заражения, о которых сообщалось, были переливание крови (один пациент) и «неизвестный путь» (23 пациента).

Предшествующее лечение ΣΕΝ-альфа.

Примерно две трети пациентов получали И^;\-сиьфа-2Ь в качестве их последней терапии альфаинтерфероном до входа в исследование. П^;\-сиьфа-2а представлял собой вторую наиболее часто предписываемую терапию. Наиболее распространенным режимом было 3 ΜΣϋ, вводимых подкожно 3 раза в неделю. Терапии выбора были соответствующими в пределах групп в общей, цирротической, нецирротической и неазиатской популяции. Среди азиатов равные количества пациентов получали ТЕ\-альфа-2а и И^;\-сЕ1ьфа-2Ь; однако, наиболее распространенный режим в данной популяции также представлял собой 3 МШ подкожно 3 раза в неделю.

Средняя длительность лечения в плане предыдущей терапии ΣΕΝ-альфа составляла примерно 6 месяцев для всех популяций, кроме азиатов, для которых средняя длительность составляла примерно 5 месяцев. Длительности лечения менее 3 месяцев, наиболее вероятно, представляют собой «артефакты», вследствие правил сбора данных для данного исследования, согласно которым изменение дозы или частоты инъекций считались началом нового курса лечения. Всего 22,8% пациентов проходили более одного курса лечения альфа-интерфероном до входа в исследование; данная доля в основном соблюдалась по популяциям.

Как ожидалось, концентрация ЛЕТ в сыворотке в конце терапии ΣΕΝ-альфа, как сообщалось, не соответствовала норме для всех пациентов, кроме одного, и только два пациента характеризовались клиренсом РНК ΗСV (результаты по РНК ΗСV были доступны лишь для 140 пациентов).

Всего уровни РНК НСУ варьировали от 0,2 до 127,8х10⁶ мэкв/мл: среднее (ст.откл.) и медиана были следующими 12,4 (±15,4) и 7,4х10⁶ мэкв/мл соответственно. Уровни РНК ΗСV были несколько ниже среди пациентов с циррозом, чем среди пациентов без цирроза: среднее (ст.откл.) и медиана составляли

- 18 007091

10,2 (±15,8) и 4,7х10⁶ мэкв/мл для пациентов с циррозом по сравнению с 12,8 (±15,3) и 8,5х10⁶ мэкв/мл для пациентов без цирроза.

Азиаты характеризовались более низкими уровнями РНК ΗΟν, чем неазиаты, со средним значением (ст.откл.) и медианой, равными 5 (±6,2) и 2,6х10⁶ мэкв/мл для азиатов по сравнению с 13,1 (±15,8) и 8,7х10⁶ мэкв/мл для неазиатов. Это различие было статистически значимым (р<0,001). Максимальное значение среди азиатов составляло лишь 23,2х10⁶ мэкв/мл.

Генотипирование ΗΟν.

В настоящее время обнаружены шесть (6) основных генотипов вируса гепатита С, многие из которых содержат более близкородственные варианты, так называемые субтипы. Некоторые генотипы ΗΟν, такие как субтипы 1а, 2а и 2Ь, характеризуются широким распространением в мире, тогда как другие, такие как типы 5а и 6, обнаружены только в конкретных географических областях. В Западной Европе и США у пациентов с СНС часто наблюдаются генотипы 1а, 1Ь, 2а, 2Ь и 3а. Генотипы 3 и 6 широко распространены в Индии и Юго-Восточной Азии.

Вирус гепатита С генотипа 1 считается отрицательным прогностическим индикатором для ожидаемого ответа на способы лечения, основанные на интерфероне (МсНи1сЫкоп 1.С. е! а1., 1998; Роупагб Т. е! а1., 1998). Поскольку данное исследование включало в себя популяцию пациентов, не отвечающих на альфа-интерферон, было обоснованно ожидать более высокий процент пациентов, экспрессирующих генотип 1, чем в нормальной инфицированной ΗСV популяции. Однако этого не происходило. В неазиатской популяции преобладание различных генотипов вируса гепатита С (81,5% генотипа 1) соответствовало действительному преобладанию генотипов, сообщаемого для Соединенных Штатов (А11ег М.1. е! а1., 1999; 2еш Ν.Ν. е! а1., 1996) и Европы (МсОтСН Е. е! а1., 2000). Тип 1 также является преобладающим генотипом для Азии, в частности в Японии и Китае, тогда как генотип 6 наблюдается преимущественно в Гонконге. Генотип типа 3 наблюдается в некоторых областях Юго-Восточной Азии, в частности в Таиланде, но также в Австралии и Новой Зеландии (МсСаидНап С.А., 2000).

Как могло ожидаться, распределение генотипов между азиатской и неазиатской популяциями отличается. В азиатской популяции генотип 1 обнаружен у 12 из 24 пациентов (50%). Десять (10) пациентов (43,5%) были инфицированы ΗСV генотипа 2 и один пациент (4,3%) был инфицирован генотипом 6.

В неазиатской популяции 198 из 243 пациентов экспрессировали генотип 1, 1а, 1 а/Ь или 1Ь (81,5%). Наблюдаемые не относящиеся к 1 типу генотипы представляли собой 2, 3, 3а, 4, 4с/б и 5.

Распределение генотипов между группами лечения не отличается.

Результаты по эффективности

При интерпретации данных по эффективности, особенно касающихся взаимоотношений с дозировками, следует иметь в виду профиль ранних отказов по четырем группам лечения (обсуждаемый в разделе 0); низкие коэффициенты прекращения для режима т.р.н. по сравнению с высокими коэффициентами для групп 0Ό четко указывают на достижение пациентами пределов приверженности лечению и его переносимости. Из-за повышенного уровня отказов для группы с 0Ό дозировкой любые выводы, сделанные для данных групп, относятся к малым, избранным (и, возможно, смещенным) популяциям пациентов.

В общем, между популяциями с циррозом и без цирроза наблюдалось мало различий; однако, различия между азиатами и неазиатами часто были очень заметными. Следует принимать во внимание размер группы с циррозом и азиатской подгруппой (п=43 и п=24), поскольку это может ограничивать возможность обобщения результатов.

Первичный выходной параметр: коэффициент длительного вирусологического ответа.

Длительный вирусологический ответ определяли как отсутствие детекции РНК НСУ в сыворотке как в конце лечения (48 неделя) и в конце 24 недель наблюдения: между данными моментами времени не проводилось измерений РНК ΗСV.

В табл. 3 представлено число пациентов и коэффициенты длительного вирусологического ответа с доверительными интервалами для данных коэффициентов. Коэффициенты замедленного вирусологического ответа были низкими в целом: всего отмечено 9 длительных ответов, что представляет коэффициент ответа, равный 3,4% для всей популяции. В подгруппе цирроза отмечен только один длительный ответ (коэффициент ответа 2,3%), у пациента-азиата, получавшего 44 мкг т.р.н.

Однако в азиатской подгруппе коэффициенты длительного ответа были заметно выше, чем таковые в общей и неазиатской популяции: 5 из 9 длительных ответов происходили у пациентов-азиатов. Коэффициент ответа среди азиатов составлял 21,7% (5 из 23 пациентов) по сравнению лишь с 1,6% для неазиатов: доверительные интервалы не перекрываются, что предоставляет доказательство значимой разницы. Коэффициенты ответа среди групп лечения варьировали от 16,7 до 28,6% среди пациентов-азиатов и, как оказалось, были связанными с дозой и частотой дозирования, хотя число рассмотренных пациентов было очень малым.

Явные отношения доза-ответ, наблюдаемые в азиатской подгруппе, также присутствовали в общей популяции, где коэффициенты ответа по группе лечения варьировали от 1,5 до 6,3%. Однако довери

- 19 007091 тельные интервалы для длительного ответа перекрывались друг с другом, что указывало на то, что наблюдаемые взаимоотношения не были статистически значимыми.

Таблица 3

Длительный клиренс РНК НСУ и 95% С! для данного коэффициента (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Длительный ответ	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет	18-78,3% (56, 3,-92, 5)	239-98,4% (95,8,-99,5)	257-96,6% (93,7,-98,4)
Есть	5-21,7% (7,5,-43,7)	4-1,6% (0,5,-4,2)	9-3,4% (1,6,-6,3)

Для пациентов, достигавших длительного вирусологического ответа, время до длительного ответа оценивали с использованием определения времени между началом лечения и первым наблюдаемым клиренсом РНК НСУ (табл. 4). Длительный клиренс достигался через 48 недель лечения. Пациенты-азиаты характеризовались более ранним клиренсом, чем пациенты-неазиаты, через 1-4 недели лечения, по сравнению с 11-48 неделями для неазиатов.

Таблица 4

Время до длительного клиренса РНК НСУ (общая популяция)

Пациент*	Лечение	Время до длительного клиренса (недели)
91420091027(ΝΟ-Α)	88 мкг ζ)ϋ	4
91420231005(ЫС-А)	88 мкг ζ)ϋ	2
91420231008(ΝΟ-Α)	88 мкг т.р.н.	1
91420231017(ΝΟ-Α)	44 мкг £Ю	2
91420232013(С-А)	44 мкг т.р.н.	2
91420041009(ΝΟ-ΝΑ)	44 мкг ζ)Ώ	47
91420091029(ΝΟ-ΝΑ)	88 мкг т.р.н.	12
91420151007(ΝΟ-ΝΑ)	88 мкг ζ)ϋ	4.8
91420161002(ΝΟ-ΝΑ)	88 мкг ОБ	11

*В скобках: С=с циррозом, ΝΟ=6β3 цирроза, А=азиат, ЫА=неазиат

Данное наблюдение может использоваться для установки «тест-фазы», во время которой пациенты с НСУ подвергаются лечению ΓΡΝ-бета: пациенты, которые после периода 1-4 недели лечения будут характеризоваться клиренсом РНК НСУ, с очень высокой вероятностью (близкой к 100%) достигнут к концу лечения длительного ответа.

Вторичные выходные параметры.

Полный ответ РНК НСУ на 48 неделю.

Определенный протоколом выходной параметр «наличия или отсутствия РНК НСУ в сыворотке на 48 неделе» оценивал полный клиренс РНК НСУ из сыворотки (полный ответ РНК НСУ).

В табл. 5 представлены коэффициенты полного ответа РНК НСУ для различных популяций с доверительными интервалами. Всего 22 пациента характеризовались полным ответом РНК НСУ к 48 неделе (8,3% общей популяции). Коэффициенты полного ответа были сходными в цирротической, нецирротической и неазиатской популяциях (7,0, 8,5 и 6,6% соответственно). Ответы оказались связанными с дозой в общей, нецирротической и неазиатской популяциях: от 4,6 до 14,3% в общей популяции, от 1,8% до 17,0% в нецирротической и от 1,7 до 12,5% в неазиатской популяции.

Азиаты составляли 6 из 22 полных ответа на 48 неделе, что демонстрировало коэффициент полного ответа, равный 26,1%, по сравнению с 6,6% для неазиатов. Отношение к дозе не могло быть установлено в азиатской популяции, возможно, вследствие малого числа пациентов; самый высокий коэффициент ответа имел место в группе, получавшей самую низкую дозу (44 мкг т.р.н.; 2 из 6 или 33,3%).

- 20 007091

Таблица 5

Полный ответ РНК НСУ и 95% С1 для данного коэффициента (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Ответ	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет	17-73,9% (51,6;89,8)	227-93,4% (89,5,-96,2)	244-91,7% (87,7,-94,7)
Есть	6-26,1% (10,2,-48,4)	16-6,6% (3,8,-10,5)	22-8,3% (5,3,-12,3)

В общей популяции пик процентной доли пациентов, характеризующихся клиренсом, имел место на 12 неделе (13,9% пациентов с клиренсом РНК НСУ). После этого момента процентная доля падала.

Популяция с циррозом характеризовалась максимальной процентной долей пациентов с клиренсом РНК НСУ на 4 неделю, но профили отдельных групп лечения отличались (группа, получавшая 44 мкг т.р.н., характеризовалась увеличением на 4 неделю, группа, получавшая 44 мкг Ρϋ, - на 12 и 24 недели, а количества ответов в других группах были слишком малы для какого-либо профиля).

В азиатской популяции пик имел место на 4 неделю. Как и в популяции с циррозом, профили отдельных групп лечения отличались друг от друга с увеличением, отмеченным на 24 неделе для группы, получавшей 44 мкг т.р.н., на 2 неделе для группы, получавшей 88 мкг т.р.н., на 12 неделе для группы, получавшей 44 мкг Ρϋ, и на 4 неделе для группы, получавшей 88 мкг ΡΌ.

В общей популяции 56 пациентов характеризовались клиренсом РНК НСУ по меньшей мере один раз (21,1%). Среди пациентов с циррозом 18,6% характеризовались клиренсом по меньшей мере один раз по сравнению с 21,5% для пациентов без цирроза. Среди пациентов-азиатов 13 характеризовались клиренсом РНК НСУ по меньшей мере один раз (56,5% по сравнению с 17,7% для неазиатов; доверительные интервалы не перекрываются, что обеспечивает доказательство значимого различия). Процентные доли пациентов, характеризовавшихся клиренсом по меньшей мере один раз, возрастали с дозой и частотой введения во всех популяциях, кроме подгруппы цирроза, в которой не выявлялось какого-либо ясного профиля.

Нормализация сывороточной АЕГ в конце лечения.

Следует заметить, что пациенты-азиаты характеризовались более высокими уровнями АЕГ на 1 сутки, чем неазиаты: среднее (ст.откл.) и медиана для азиатов составляли 200,6 (±145,4) и 150 ΐυ/л, по сравнению с 137,3 (±88,4) и 106,5 ΐυ/л для неазиатов. Такое различие было статистически значимым (р=0,023).

В табл. 6 представлены количества и процентные доли пациентов, характеризовавшихся нормализацией сывороточной АЕГ в конце лечения, с доверительными интервалами. В общей популяции 46 пациентов характеризовались нормализацией АЕГ на 48 неделю (17,3%). Коэффициенты нормализации АЕГ на 48 неделю были слегка ниже для пациентов с циррозом по сравнению с нециррозными пациентами (11,6% по сравнению с 18,4%), и ситуация у азиатов была заметно лучше, чем у неазиатов (26,1% по сравнению с 16,5%). Не имелось четкой связи между ответом АЕГ и дозой или частотой введения.

Таблица 6 Нормализация АЕГ в конце лечения (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Нормализация	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет	17-73,9% (51,6; 89,8)	203-83,5% (78,3; 88,0)	220-82,7% (77,6; 87,1)
Есть	6-26,1% (10,2; 48,4)	40-16,5% (12,0; 21,7)	46-17,3% (12,9; 22,4)

В общей популяции 37 пациентов характеризовались нормальным уровнем сывороточной АЕГ в конце периода наблюдения (13,9%; снижение от 17,3% в конце лечения). Наиболее высокая процентная доля пациентов с нормальным уровнем сывороточной АЕГ наблюдалась в группе приема 88 мкг Ρϋ (20,6%); процентные доли в группах лечения варьировали от 10,8 до 13,4%.

Среди пациентов с циррозом лишь 4,7% характеризовались нормальной АЕГ в конце наблюдения (2 пациента, один получал 44 мкг т.р.н. и другой - 44 мкг Οϋ) по сравнению с 15,7% для пациентов без цирроза. Соответствующие процентные доли в конце лечения составляли 11,6% для пациентов с циррозом и 18,4% для пациентов без цирроза.

Среди неазиатов 9,9% характеризовались нормальной АЕГ на 24 неделе наблюдения по сравнению с 16,5% в конце лечения; однако, коэффициент нормализации среди азиатов в действительности возрастал от 26,1% в конце лечения до 56,5% в конце наблюдения.

Разница между азиатами и неазиатами на 24 неделе наблюдения была значимой, что было продемонстрировано перекрывающимися доверительными интервалами. Ответ оказался лучше с более высокими дозами в азиатской популяции, но доверительные интервалы перекрывались (см. табл. 7).

- 21 007091

Таблица 7 Нормализация АЬТ на 24 неделю наблюдения (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Нормализация	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет	10-43,5% (23,2, 65,5)	219-90,1% (85,7,-93,6)	229-86,1% (81,3,-90,0)
Есть	13-56,5% (34,5; 76,8)	24-9,9% (6,4,-14,3)	37-13,9% (10,0,-18,7)

Длительная нормализация определялась как значения АЬТ в пределах интервала нормы на 48 неделю и на 24 неделю наблюдения без отличных от нормы результатов между этими двумя измерениями. Длительная нормализация была отмечена только у 14 пациентов общей популяции (5,3%). Не имелось ясного эффекта дозы, но задействованные количества пациентов были малыми.

Только один пациент с циррозом (которому назначали 44 мкг ОЭ) достигал длительной нормализации АКТ (2,3% по сравнению с 5,8% для пациентов без цирроза).

Четверо (4) из 14 пациентов, характеризовавшихся длительной нормализацией АЬТ, были азиатами при коэффициенте нормализации, равном 17,4% у азиатов по сравнению с 4,1% для неазиатов. Двое (2) из 4 отвечающих азиатов получали 44 мкг ОЭ, а другие получали 88 мкг т.р.н.

Эффект лечения на вирусную загрузку.

Обсуждение вирусной загрузки касается значений РНК НСУ при визитах и отклонений от фонового значения для различных групп пациентов: «фоновое значение» определяется как значение, измеренное перед лечением на 1 сутки в случае, где оно доступно, и, в ином случае, значение перед исследованием, измеренное в ближайшее к 1 суткам время.

В общей популяции фоновая вирусная загрузка широко варьировала от 0,2 до 127,8 х 10⁶ мэкв/мл на 1 сутки. Значения медианы фона слегка варьировали между группами лечения (от 6,0 до 10,2 х 10⁶ мэкв/мл на 1 сутки). Снижения вирусной загрузки были очевидны в такой ранний момент, как 3 сутки (первое измерение при лечении), и минимальные значения достигались на 4 неделю. Не имелось ясного эффекта дозы, хотя снижения вирусной загрузки были соответственно выше у пациентов, получавших 88 мкг (т.р.н. или РЭ). После 4 недели уровень РНК НСУ постепенно возрастал, достигая уровней, близких к фоновым, во всех группах лечения на 24 неделю наблюдения.

Фоновая вирусная загрузка была несколько ниже для пациентов с циррозом, по сравнению с пациентами без цирроза: значения медианы составляли 4,7х10⁶ мэкв/мл на 1 сутки для пациентов с циррозом, по сравнению с 12,8х10⁶ мэкв/мл для пациентов без цирроза. Вариация между группами лечения от фонового значения была более выражена среди пациентов с циррозом, по сравнению с пациентами без цирроза: значения медианы на 1 сутки варьировали от 1,6 до 10,2 х 10⁶ мэкв/мл среди пациентов с циррозом, по сравнению с 10,9-15,2 х 10⁶ мэкв/мл среди пациентов без цирроза. Эти данные получены, наиболее вероятно, вследствие меньшего количества пациентов с циррозом. Изменения от фонового значения среди пациентов с циррозом следовали тому же общему профилю, что наблюдается в общей популяции: быстрые снижения, достигавшие максимума между 4 и 12 неделей и затем постепенное возвращение к фоновому значению. Не имелось четких отношений между ответом и дозой, хотя снижения опять были большими у пациентов, получавших 88 мкг.

Медиана вирусной загрузки в фоновом значении была заметно ниже для азиатов, чем для неазиатов (2,6х10⁶ мэкв/мл на 1 сутки по сравнению с 8,7х10⁶ мэкв/мл для неазиатов). Интервал фоновых значений был также меньшим для азиатов (0,2-23,2 х10⁶ мэкв/мл на 1 сутки по сравнению с 0,2-127,8х10⁶ мэкв/мл для неазиатов). Это различие было статистически значимым (р<0,001). Вариация фонового значения между группами лечения была несколько выше среди азиатской, по сравнению с неазиатской популяцией (медианы варьировали от 0,6 до 5,7х10⁶ мэкв/мл на 1 сутки для азиатов и от 6,1 до 10,5 х10⁶ мэкв/мл для неазиатов), возможно вследствие меньшего количества пациентов-азиатов. Как наблюдалось и для других популяций, вирусная загрузка быстро снижалась в азиатской популяции, достигая максимума между 4 и 12 неделями и возвращаясь к фоновому значению на 24 неделе наблюдения. Не имелось явных отношений между ответом и дозой.

Среди тех, кто характеризовался длительным ответом, интервал фоновых значений был меньше и ниже, чем для популяции в целом (в общей популяции: 0,2-17,7х10⁶ мэкв/мл на 1 сутки для пациентов с длительным ответом по сравнению с 0,2-127,8х10⁶ мэкв/мл для всех пациентов).

Для целой популяции наблюдались ранние снижения (3 сутки), в общем, достигающие наибольшей величины (в случае пациентов с длительным ответом, полного клиренса РНК НСУ) через 2-12 недель лечения.

В популяции с циррозом имел место только один пациент с длительным ответом. Фоновое значение у данного пациента составляло 0,2х10⁶ мэкв/мл, причем оно снижалось до нуля через две недели лечения и оставалось на таком уровне.

- 22 007091

Пять (5) из девяти 9 длительных ответов происходили в азиатской популяции. Медианы фоновых значений варьировали между группами лечения среди азиатских и неазиатских пациентов с длительным ответом: от 0,2 до 7,8х10⁶ мэкв/мл для азиатов (медианы были менее чем или равными 1 х 10⁶ мэкв/мл для всех групп лечения, кроме группы 88 мкг ОЭ) и от 1,9 до 17,7 х 10⁶ мэкв/мл для неазиатов на 1 сутки. Всего средние значения на 1 сутки составляли 1 х 10⁶ мэкв/мл для азиатских пациентов с длительным ответом и 3х10⁶ мэкв/мл для неазиатов.

Четверо (4) из 5 азиатских пациентов с длительным ответом характеризовались не подлежащей выявлению вирусной загрузкой на 2 неделю: оставшийся пациент достигал клиренса на 4 неделю. У неазиатских пациентов с длительным ответом снижения уровня РНК НСУ происходили рано (3 сутки), но полный клиренс не достигался до 11 недели (один пациент) или 48 недели (3 пациента).

Элиминация РНК НСУ и нормализация АЬТ (как объединенный выходной параметр).

В табл. 8 представлены количества и процентные доли пациентов с клиренсом РНК НСУ и нормализацией АЬТ в конце периода лечения с доверительными интервалами. В общей популяции только 10 пациентов характеризовались и клиренсом РНК НСУ, и нормализацией АЬТ на 48 неделю (3,8%): данные пациенты равномерно распределены по группам приема 88 мкг т.р.н., 44 мкг ЭО и 88 мкг ΡΌ. Ни один из пациентов с циррозом не достигал обоих выходных параметров. Двое (2) из пациентов с сочетанным ответом были азиатами при коэффициенте сочетанного ответа 8,7% для азиатов и 3,3% для неазиатов.

Таблица 8

Ответ в плаве нормализации РНК НСУ и АЬТ на 48 неделю лечения (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Пациенты сочетанным ответом	с	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет		21-91,3%	235-96,7% (93,6,-98,6)	256-96,2% (93,2,-98,2)
Есть		2-8,7% (1,1;28,0)	8-3,3% (1,4;6,4)	10-3,8% (1,8,-6,8)

В табл. 9 представлены количества и процентные доли пациентов, характеризующихся и длительным клиренсом РНК НСУ (клиренс на 48 неделю и 24 неделю наблюдения), и нормализацией АЬТ на 24 неделю наблюдения с доверительными интервалами. В общей популяции только 8 пациентов достигали обоих выходных параметров (3,0%). Двое (2) из данных пациентов получали 88 мкг т.р.н., 2 получали 44 мкг ЭО и 4 получали 88 мкг ΡΌ. Ни один из пациентов с сочетанным ответом не характеризовался циррозом. Примечательно, что 4 пациента с сочетанным ответом были азиатами, с коэффициентами сочетанного ответа 17,4% для азиатов и 1,6% для неазиатов.

Интересно, что процент азиатских пациентов, характеризовавшихся сочетанным ответом на 24 неделю наблюдения (что определяется нормальным уровнем АЬТ на 24 неделю наблюдения и длительным клиренсом РНК НСУ), был выше, чем процентная доля сочетанного ответа в конце лечения на 48 неделю, в то время как процентная доля неазиатов с сочетанным ответом была ниже на 24 неделю наблюдения, чем на 48 неделю.

Таблица 9

Ответ в плане длительного клиренса РНК НСУ и нормализации АЬТ на 24 неделю наблюдения (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Пациенты с сочетанным ответом	Азиаты (п=23)	Неазиаты (п=243)	Общее (п=266)
Нет	19-82,6% (61,2,-95,0)	239-98,4% (95,8;99,5)	258-97,0% (94,2;98,7)
Есть	4-17,4% (5,0,-38,8)	4-1,6% (0, 5;4,2)	8-3,0% (1,3,-5,8)

Результаты исследовательских анализов.

Выводимые путем заключения анализы (точный тест Фишера и логистическая регрессия) использовали в исследовательской манере для генерирования гипотез, особенно, в отношении различий между азиатскими и неазиатскими пациентами. Следует заметить, что имеется очень большой дисбаланс между количествами азиатских и неазиатских пациентов. Поэтому требуются предосторожности в интерпретации результатов выводимых путем заключения анализов.

Точный тест Фишера.

Точный тест Фишера использовали для сравнения пропорций азиатских и неазиатских пациентов, достигавших клиренса РНК НСУ (на 48 неделю лечения и 24 неделю наблюдения), замедленного кли

- 23 007091 ренса РНК НСУ, нормализации АЬТ на 12 неделю, нормализации АЬТ на 24 неделю и длительной нормализации АЬТ. Девяностопятипроцентные доверительные интервалы для пропорций вычисляли с использованием точного метода Агшйаде апб Веггу. Нескорректированные коэффициенты различия (ОВ) для азиатской популяции по сравнению с неазиатской рассчитывали вместе с 95%-ными доверительными интервалами. Сравнения основных результатов по эффективности для азиатских и неазиатских пациентов представлены на фиг. 4 для выходных параметров, ассоциированных с клиренсом РНК НСУ, и на фиг. 5 для тех, что ассоциированы с нормализацией АЬТ. На каждой фигуре точки представляют собой процентную долю пациентов в каждой популяции, достигавших выходного параметра, и горизонтальные линии представляют собой доверительные интервалы для данных процентных долей; также представлены нескорректированные коэффициенты различия (ОВ) и доверительные интервалы (О).

Хотя число пациентов-азиатов было относительно малым, азиаты со значимо большей вероятностью достигали полного клиренса РНК НСУ на 48 неделю лечения (нескорректированный ОВ 5,0; О для коэффициента различия [1,7-14,5]; р=0,006), на 24 неделю наблюдения (нескорректированный ОВ 8,2; О для коэффициента различия [2,4-27,5]; р=0,003) и в оба момента времени (длительный вирусологический ответ, первичный выходной параметр эффективности данного исследования: нескорректированный ОВ 16,6; С для коэффициента различия [4,1-67,3]; р<0,001).

Азиаты также с большей вероятностью, чем неазиаты, характеризовались нормальным уровнем сывороточной АЬТ: различие не было статистически значимым на 48 неделю лечения (нескорректированный ОВ 1,8; О для коэффициента различия [0,7-4,8]; р=0,251), но на 24 неделю наблюдения нескорректированный коэффициент различия для азиатов по сравнению с неазиатами составлял 11,9 (С! для коэффициента различия [4,7-29,9]; р<0,001), и нескорректированный коэффициент различия азиатов по сравнению с неазиатами для длительной нормализации АЬТ составлял 4,9 (О для коэффициента различия [1,4-17,1]; р=0,024).

На фиг. 4 проиллюстрирован итог по выходным параметрам, касающимся клиренса РНК НСУ (азиатская популяция по сравнению с неазиатской).

На фиг. 5 проиллюстрирован итог по выходным параметрам, касающимся нормализации АЬТ (азиатская популяция по сравнению с неазиатской).

Краткое изложение данных по эффективности

Три классических выходных параметра, используемых в исследованиях противовирусной терапии СНС, представляют собой нормализацию АЬТ, клиренс РНК НСУ и улучшение гистологии печени. Успехи в технологии анализа, обеспечившие детекцию РНК НСУ в сыворотке, в настоящее время утвердили клиренс НСУ как наиболее точный выходной параметр для оценки эффективности противовирусной эффективности инфекции НСУ. Нормализация АЬТ, с другой стороны, является далеко не столь специфичной. Однако, вследствие ее простого и недорогого определения, измерение АЬТ является частью любых рутинных биохимических оценок. По этой причине и по историческим причинам нормализация АЬТ сохраняет свою роль, по меньшей мере, в качестве вторичного выходного параметра эффективности. Гистология печени, третий классический выходной параметр, представляет замещающий выходной параметр, считающийся ближайшим к «истинным» выходным параметрам связанной с печенью заболеваемости и смертности. Все эти три параметра оценивали в данном исследовании.

Влияние лечения на уровни РНК НСУ (вирусологический ответ).

В общей популяции фоновая вирусная загрузка сильно варьировала. После лечения снижения вирусной загрузки были очевидны на 3 сутки (первое измерение при лечении), и минимальные значения достигались на 4 неделю. После 4 недели уровень РНК НСУ постепенно повышался, достигая уровней вблизи фона во всех группах лечения к 24 неделе наблюдения. Фоновая вирусная загрузка была несколько ниже у пациентов с циррозом по сравнению с пациентами без цирроза, и вариация между группами лечения по уровню фона была более выражена среди пациентов с циррозом, чем среди пациентов без цирроза; эти данные получены, наиболее вероятно, вследствие меньшего количества пациентов с циррозом. Изменения от фонового значения среди пациентов с циррозом следовали тому же общему профилю, что наблюдается в общей популяции: быстрые снижения, достигавшие максимума между 4 и 12 неделей и затем постепенное возвращение к фоновому значению. Вирусная загрузка на уровне фона была заметно ниже у азиатов, чем у неазиатов. Как видно и из других популяций, вирусная загрузка в азиатской популяции быстро снижалась, достигая максимума между 4 и 12 неделей и возвращаясь к фоновому значению к 24 неделе наблюдения. Не имелось четкой связи между ответом и дозой в какой-либо из популяций.

Пациентов с полным клиренсом РНК НСУ из сыворотки в конце лечения на 48 неделе определяли как пациентов с полным ответом РНК НСУ. Двадцать два пациента (22) характеризовались полным ответом РНК НСУ на 48 неделе (8,3% от полной популяции). Коэффициенты полного ответа были сходными в популяциях с циррозом и без цирроза. Однако в азиатской популяции коэффициенты полного ответа были заметно выше, чем таковые в общей популяции. Азиаты насчитывали 6 из 22 полных ответов на 48 неделю, что представляет коэффициент полного ответа, равный 26,1%, по сравнению с 6,6% для неазиатов: это различие было статистически значимым. Ответ оказался зависимым от дозы в общей популяции, но связь с дозой не была установлена в азиатской популяции, возможно, вследствие малого количества

- 24 007091 пациентов. Наивысший коэффициент ответа среди азиатов имел место в группе наименьшей дозы (44 мкг т.р.н.; 2 из 6 или 33,3%).

В общей популяции 56 пациентов (21,1%) характеризовались клиренсом РНК НСУ по меньшей мере один раз во время исследования. Доли пациентов, характеризующихся клиренсом РНК НСУ, по меньшей мере один раз были сходными между популяциями с циррозом и без цирроза. Однако 13 из 24 азиатских пациентов характеризовались клиренсом РНК НСУ по меньшей мере один раз (56,5% по сравнению с 17,7% для неазиатов). Доля пациентов, характеризующихся клиренсом, по меньшей мере один раз возрастала с дозой и частотой введения во всех популяциях, кроме подгруппы с циррозом, в которой явного профиля не выявлялось.

Первичным выходным параметром исследования являлся коэффициент длительного вирусологического ответа, определенного как отсутствие детектируемой РНК НСУ в сыворотке как в конце лечения (48 неделя), так и в конце 24 недель наблюдения. Коэффициенты длительного вирусологического ответа были низкими: было отмечено только 9 длительных ответов, что представляло собой коэффициент ответа 3,4% в общей популяции. В подгруппе цирроза отмечен только один длительный ответ. Азиатская подгруппа опять характеризовалась коэффициентами длительного ответа намного выше, чем в общей популяции. Пять (5) из 9 длительных ответов происходили у пациентов-азиатов, что приводило к коэффициенту ответа среди азиатов, составлявшему 21,7% по сравнению лишь с 1,6% для неазиатов (р<0,001). Среди пациентов-азиатов коэффициенты ответа по группам лечения варьировали от 16,7% до 28,6% и, как оказалось, были связанными с дозой и частотой дозирования, хотя число рассмотренных пациентов было очень малым. Явные отношения доза-ответ, наблюдаемые в азиатской подгруппе, также присутствовали в общей популяции, где коэффициенты ответа по группе лечения варьировали от 1,5 до 6,3%.

Среди пациентов, достигавших длительного вирусологического ответа, вирусная загрузка на уровне фона была ниже, чем в популяции в целом. Как наблюдалось и для целой популяции, снижения имели место рано (3 сутки), в общем, достигая наибольшей величины (в случае пациентов с длительным ответом, полного клиренса РНК НСУ) через 2-12 недель лечения. Четверо (4) из 5 азиатов с длительным ответом характеризовались не подлежащей выявлению вирусной загрузкой на 2 неделю (самый ранний клиренс был отмечен на 1 неделю); оставшийся пациент достигал клиренса на 4 неделю. У неазиатских пациентов с длительным ответом снижения уровня РНК НСУ происходили рано (3 сутки), но полный клиренс не достигался до 11 недели (один пациент) или 48 недели (3 пациента).

Влияние лечения на уровни АЬТ (биохимический ответ).

Фоновые уровни АЬТ были значимо выше у азиатов по сравнению с неазиатами: на 1 сутки среднее (ст.откл.) и медиана для азиатов составляли 200,6 (±145,4) и 150 ΐυ/л по сравнению с 137,3 (±88,4) и 106,5 ΐυ/л для неазиатов (р=0,023).

В общей популяции 46 пациентов характеризовались нормализацией АЬТ в конце лечения на 48 неделю (17,3%). Процентная доля пациентов с нормализацией АЬТ на 48 неделю была чуть ниже для пациентов с циррозом (11,6%) по сравнению с пациентами без цирроза (18,4%). Ситуация у азиатов опять была заметно лучше, чем у неазиатов (26,1% по сравнению с 16,5%). Не имелось четкой связи между ответом АЬТ и дозой или частотой введения.

В общей популяции 37 пациентов характеризовались нормализацией АЬТ в конце наблюдения (24 неделя): 13,9% в общей популяции; снижение от 17,3% в конце лечения. Наиболее высокая процентная доля пациентов с нормальным уровнем сывороточной АЬТ наблюдалась в группе приема 88 мкг РЬ (20,6%); процентные доли в группах лечения варьировали от 10,8% до 13,4%. Среди пациентов с циррозом лишь два пациента (4,7%) характеризовались нормальной АЬТ в конце наблюдения по сравнению с 15,7% для пациентов без цирроза. Среди неазиатов только 9,9% характеризовались нормальной АЬТ на 24 неделе наблюдения по сравнению с 16,5% в конце лечения; однако, коэффициент нормализации среди азиатов в действительности возрастал от 26,1% в конце лечения до 56,5% в конце наблюдения. Ответ в азиатской популяции, как оказалось, был лучше при более высокой дозе, но количества рассмотренных пациентов были очень малыми.

Длительная нормализация АЬТ определялась как значения АЬТ в пределах интервала нормы на 48 неделю и на 24 неделю наблюдения без отличных от нормы результатов между этими двумя измерениями. Длительная нормализация была отмечена только у 14 пациентов общей популяции (5,3%). Только один пациент с циррозом (которому назначали 44 мкг РЬ) достигал длительной нормализации АЬТ (2,3% по сравнению с 5,8% для пациентов без цирроза). Четыре (4) азиатских пациента характеризовались длительной нормализацией АЬТ (17,4% у азиатов по сравнению с 4,1% для неазиатов): 2 получали 44 мкг ΡΌ, а другие получали 88 мкг т.р.н. Не имелось ясного эффекта дозы, но задействованные количества пациентов были малыми.

В исследовании также оценивали элиминацию РНК НСУ и нормализацию АЬТ в качестве объединенного выходного параметра. Только 10 пациентов характеризовались и клиренсом РНК НСУ, и нормализацией АЬТ на 48 неделю (3,8% от общей популяции): данные пациенты равномерно распределены по группам приема 88 мкг т.р.н., 44 мкг ΡΌ и 88 мкг ΡΌ. Ни один из пациентов с циррозом не достигал обоих выходных параметров. Двое (2) из пациентов с сочетанным ответом были азиатами при коэффи

- 25 007091 циенте сочетанного ответа 8,7% для азиатов и 3,3% для неазиатов. Только 8 пациентов достигали длительного клиренса РНК НСУ в сочетании с нормализацией АЬТ на 24 неделю наблюдения (3,0% от общей популяции). Двое (2) из данных пациентов получали 88 мкг т.р.н., 2 получали 44 мкг РЭ и 4 получали 88 мкг РЭ. Ни один из пациентов с сочетанным ответом не характеризовался циррозом. Примечательно, что 4 пациента с сочетанным ответом были азиатами с коэффициентами сочетанного ответа 17,4% для азиатов и 1,6% для неазиатов.

Влияние лечения на гистологию печени (гистологический ответ).

Биопсии печени получали до и после 48 недель лечения. Поскольку способ оценки основан на сравнении биопсий перед лечением и после него, на предмет изменений могли оцениваться только пациенты, для которых были доступны и подлежали оценке оба образца (176 пациентов в общей популяции). Как и для большинства оцениваемых переменных, изменения гистологии печени были в общем сходными между пациентами с циррозом и без цирроза. В отличие от других выходных параметров, изменения гистологии печени между азиатской и неазиатской популяциями существенно не отличались: однако, количества пациентов с результатами, полученными и до, и после лечения, были малыми, особенно среди азиатов (10 азиатов и 166 неазиатов).

Общий коэффициент классификации НА1, полученный путем суммирования компонентов классификации, считается методологически некорректным (8йеиег Р1, 1996), но рассчитан для сравнения с другими опубликованными исследованиями. Фоновые коэффициенты НА1 изменялись от 5,9 до 6,4, что указывало на умеренное заболевание, и, в общем, были сравнимы между группами лечения. Для тех пациентов, у которых были доступны биопсии до и после лечения, коэффициенты НА1 снижались от фонового значения во всех группах лечения, с наибольшими снижениями, происходящими в группах, получавших 44 мкг РЭ и 88 мкг РЭ, и с общим снижением на -0,8. Общее снижение на -1,1 наблюдали у пациентов с циррозом; связь с дозой не была очевидной, возможно, вследствие малых количеств пациентов. У пациентов-азиатов коэффициенты НА1 снижались в двух группах с дозированием т.р.н., но повышались в группах дозирования РЭ при общем изменении на -0,2. Интерпретацию данных результатов предпринимали с осторожностью по причине очень низких количеств пациентов с доступными биопсиями.

Активность в перипортальной и перисептальной областях может являться предсказательной в плане последующего развития цирроза. В общей популяции фрагментарный некроз улучшался на один пункт у 27,3% пациентов и на >2 пункта у 16,5% всех пациентов; 33,5% пациентов не характеризовались изменениями. Процентные доли пациентов в популяции с циррозом и в азиатской популяции, характеризовавшихся улучшением и отсутствием изменений, были сходными с таковыми в общей популяции с отсутствием признаков взаимоотношений с дозой по данному параметру, но количества пациентов были малыми. Ни один из образцов биопсии не характеризовался признаками сливного некроза, который представляет собой редкую гистопатологическую находку при гепатите С, наблюдаемую главным образом в наиболее тяжелых случаях. Из оцениваемых компонентов НА1 местный литический некроз, апоптоз и местное воспаление характеризовались минимальным улучшением: 25,0% от общей популяции давали улучшение на один пункт, только 5,7% давали улучшение на >2 пункта, и 50,6% не характеризовались изменениями.

Процентные доли пациентов с циррозом и без цирроза, характеризующихся улучшением, были сходными, но процентная доля с улучшением на >2 пункта была меньше среди пациентов с циррозом. Только 2 азиатских пациента характеризовались улучшением.

Портальное воспаление улучшалось на один пункт у 33,0% от общей популяции, при этом 11,9% характеризовались улучшением на >2 пункта и 30,7% не характеризовались изменениями. Пациенты с циррозом с чуть меньшей вероятностью характеризовались улучшением на >2 пункта, и как пациенты с циррозом, так и азиатские пациенты, с большей вероятностью не характеризовались никакими изменениями; однако количества пациентов в данных популяциях были малыми. Всего 32,2% пациентов характеризовались улучшением по меньшей мере на один пункт по архитектонике печени (фиброз и цирроз), но только 7,9% характеризовались улучшением на >2 пункта. Чуть больше одной трети пациентов (34,5%) не характеризовались изменениями в конце лечения.

Исследовательские анализы.

Наиболее впечатляющим и неожиданным открытием данного исследования было различие в результатах по эффективности между азиатской и неазиатской популяциями пациентов. В литературе не было отчетов такого типа. Поэтому выводимые путем заключения анализы (точный тест Фишера и логистическая регрессия) использовали в исследовательской манере для генерирования гипотез, особенно, в отношении различий между азиатскими и неазиатскими пациентами. Следует заметить, что имеется очень большой дисбаланс между количествами азиатских и неазиатских пациентов. Поэтому требуются предосторожности в интерпретации результатов выводимых путем заключения анализов.

Точный тест Фишера показал, что азиаты со значимо большей вероятностью достигали полного клиренса РНК НСУ на 48 неделю лечения (нескорректированный ОК 5,0; С1 для коэффициента различия [1,7-14,5]; р=0,006), на 24 неделю наблюдения (нескорректированный ОК 8,2; С1 для коэффициента различия [2,4-27,5]; р=0,003) и в оба момента времени (длительный вирусологический ответ, первичный

- 26 007091 выходной параметр эффективности данного исследования: нескорректированный ОК 16,6; С1 для коэффициента различия [4,1-67,3]; р<0,001). Азиаты также с большей вероятностью, чем неазиаты, характеризовались нормальным уровнем сывороточной АЬТ: различие не было статистически значимым на 48 неделю лечения (нескорректированный ОК 1,8; С1 для коэффициента различия [0,7-4,8]; р=0,251), но на 24 неделю наблюдения нескорректированный коэффициент различия для азиатов по сравнению с неазиатами составлял 11,9 (С1 для коэффициента различия [4,7-29,9]; р<0,001), и нескорректированный коэффициент различия азиатов по сравнению с неазиатами для длительной нормализации АЬТ составлял 4,9 (С1 для коэффициента различия [1,4-17,1]; р=0,024).

Анализ логистической регрессии показал, что возраст, пол, состояние цирроза, частота дозирования и интенсивность дозы не являлись значимыми предсказательными параметрами длительного клиренса РНК НСУ. Было обнаружено, что значимыми являются фоновый уровень РНК НСУ и раса, и главная выбранная модель включала в себя фоновый уровень НСУ и расу. Пациенты с низким фоновым уровнем РНК НСУ с большей вероятностью достигали длительного вирусологического ответа, чем пациенты с высокими фоновыми значениями (доведенное ОК 1,07; С1 для ОК [0,95-1,20]), и азиаты с большей вероятностью испытывали длительный вирусологический ответ, чем неазиаты, после доведения до фонового уровня НСУ (скорректированный ОК 12,36; С1 для ОК [2,93-52,14]). Возраст, пол, состояние цирроза, фоновый уровень РНК НСУ, частота дозирования и интенсивность дозы не являлись значимыми предсказательными параметрами клиренса РНК НСУ в конце лечения на 48 неделе. Однако высоко значимой была раса (р=0,0065). Азиаты с большей вероятностью достигали клиренса РНК НСУ в конце лечения, чем неазиаты (нескорректированный ОК 5,0; С1 для ОК [1,7-14,5]). Раса представляла собой единственную значимую объясняющую переменную для длительной нормализации АЬТ (р=0,0247): азиаты с большей вероятностью испытывали длительную нормализацию АЬТ, чем неазиаты (нескорректированный ОК 4,9; С1 для ОК [1,4-17,1]).

Степень воздействия в плане дозы (общая доза и доза на килограмм) так же, как было обнаружено, являлась значимым предсказательным параметром эффективности. Однако следует отметить, что на степень воздействия влияла приверженность к лечению, его эффективность и переносимость, и что поэтому данные результаты подвергаются сдвигу и должны интерпретироваться с осторожностью.

Эффект дозы и частоты введения.

Влияние дозы и частоты введения было наиболее очевидным для клиренса РНК НСУ: клиренс РНК НСУ в конце лечения и в конце наблюдения оказался связанным с дозой, при увеличении коэффициента от 44 мкг т.р.н. до 88 мкг ЦЭ. Однако явные, связанные с дозой тенденции не были статистически значимыми (см. результаты анализов логистической регрессии). Не имелось ясной связи между нормализацией АЬТ и дозой или частотой введения. В частности, длительная нормализация АЬТ не характеризовалась эффектом дозы; однако, число вовлеченных пациентов было малым. Не отмечали эффекта дозы для объединенного выходного параметра элиминации РНК НСУ и нормализации АЬТ или для изменений гистологии печени.

Обсуждение и общие выводы

Целью данного исследования был выбор лучшей дозы и режима подкожного введения интерферона-бета-1а для применения при лечении пациентов с хроническим гепатитом С, устойчивых к альфа-интерферону. К моменту планирования исследования полагали, что необходимы дозы, более высокие, чем те, что достижимы с применением ΙΕΝ-альфа, если отсутствие ответа было вследствие появления устойчивых генотипов НСУ, или если более высокие дозы требовались по любой другой причине для достижения противовирусного или иммуномодулирующего эффекта. Поскольку ΙΕΝ-бета лучше переносится, чем ΙΕΝ-альфа, полагали, что более высокие п./к. дозы ШЫ-бета-1а могут быть введены с относительно меньшей токсичностью.

Дозы для изучения в данном исследовании выбраны на основании результатов предыдущих испытаний с природным и рекомбинантным ΙΕΝ-бета в СНС, в которых исследовали дозы от 3 Μΐυ (11 мкг) до 18 ΜΙυ (66 мкг), вводимые три раза в неделю в течение 3-6 месяцев. В данных исследованиях был продемонстрирован четкий ответ на дозу. Однако ответ не был длительным, указывая на то, что для длительного ответа потребуется более высокая доза и/или более длительное лечение. Поэтому выбирали 44 мкг т.р. н. в качестве минимальной эффективной дозы для исследования. Исследования вирусной кинетики демонстрировали краткий период полужизни кругооборота НСУ, указывая на то, что для оптимальной супрессии репликации вируса может быть необходимым ежесуточное дозирование вместо трех раз в неделю. Поэтому, в дополнение к принятому регламенту трех раз в неделю, оценивали ежесуточное введение. Исследование Ι фазы, проведенное настоящим заявителем на пациентах с развернутой злокачественной опухолью, показало, что ежесуточное введение доз вплоть до 18 ΜΙυ/м² ШЫ-бета-1а хорошо переносилось; однако ограничивающая дозу токсичность развивалась при 24 ΜΙυ/м². Поэтому было решено в данном исследовании изучить ежесуточное введение 24 ΜΙυ (88 мкг), поскольку ожидалось, что такая доза будет переноситься большинством пациентов. Эффективность и необходимость хронического п./к. дозирования поддерживается предшествующими исследованиями других интерферонов. В 1997 г. списком консенсусных протоколов Ναΐίοηαΐ ΙηδΙίΙιιΝδ о£ НеаИй было рекомендовано применение 12

- 27 007091 месячного режима введения ΙΕΝ-альфа вместо 6-месячного (Έάίίοπαΐ. 1997). Поэтому сочли резонным оценивать ответ на 12-месячное введение 1Ж-бета-1а.

В исследованиях противовирусного лечения СНС три классических используемых исхода представляют собой нормализация ЛЬТ, клиренс РНК НСУ и улучшение гистологии печени. Все три исхода оценивали в данном исследовании.

Однако наиболее впечатляющим и неожиданным открытием данного исследования было различие в результатах по эффективности между популяциями азиатских и неазиатских пациентов. Таких отчетов не имеется в литературе.

После лечения снижение вирусной загрузки было очевидным в такой ранний момент, как на 3 сутки (первое измерение при лечении), и минимальные значения достигались на 4 неделю. В общей популяции 21,1% пациентов характеризовались отсутствием детекции РНК НСУ по меньшей мере один раз во время исследования. Среди пациентов с циррозом 18,6% характеризовались клиренсом по меньшей мере один раз по сравнению с 21,5% для пациентов без цирроза. Азиатская подгруппа характеризовалась намного большей пропорцией пациентов, отвечающих на лечение: 56,5% характеризовались отсутствием детекции сывороточной РНК НСУ по меньшей мере один раз. В конце лечения на 48 неделю всего 22 пациента характеризовались полным клиренсом РНК НСУ (8,3% от общей популяции).

Коэффициенты полного ответа были сходными в цирротической и нецирротической популяциях (7,0 и 8,5 % соответственно). Однако в азиатской подгруппе коэффициенты полного ответа были заметно выше, чем в общей популяции. Азиаты составляли 6 из 22 полных ответа на 48 неделе, что демонстрировало коэффициент полного ответа, равный 26,1%, по сравнению с 6,6% для неазиатов. Первичным выходным параметром исследования являлся коэффициент длительного вирусологического ответа. Коэффициенты замедленного вирусологического ответа были низкими в общей исследуемой популяции: всего отмечено 9 длительных ответов, что представляет коэффициент ответа, равный 3,4% для всей популяции. В подгруппе цирроза отмечен только один длительный ответ (коэффициент ответа 2,3%), у пациента-азиата, получавшего 44 мкг т.р.н. Азиатская подгруппа опять характеризовалась коэффициентами длительного ответа намного выше, чем во всей популяции. Пять (5) из 9 длительных ответов происходили у пациентов-азиатов, что приводило к коэффициенту ответа среди азиатов, составлявшему 21,7% по сравнению лишь с 1,6% для неазиатов. Среди пациентов-азиатов коэффициенты ответа по группам лечения варьировали от 16,7% до 28,6% и, как оказалось, являлись связанными с дозой и частотой дозирования, хотя число рассмотренных пациентов было очень малым. Явные отношения доза-ответ, наблюдаемые в азиатской подгруппе, также присутствовали в общей популяции, где коэффициенты ответа по группе лечения варьировали от 1,5 до 6,3%; однако, данные тенденции не были статистически значимыми. Из неазиатских пациентов, которые достигали длительного вирусологического ответа, некоторые достигали длительного ответа через 11 недель лечения, в то время как для других требовалось свыше 48 полных недель лечения. Пациенты-азиаты характеризовались более ранним клиренсом РНК НСУ, чем пациенты-неазиаты, достигая клиренса НСУ через одну неделю после начала лечения (интервал 1-4 недели лечения).

В качестве вторичного выходного параметра анализировали уровни ЛЬТ. По окончании лечения на 48 неделе в общей популяции 46 пациентов характеризовались нормализацией ЛЬТ (17,3%). Коэффициенты нормализации ЛЬТ на 48 неделю были слегка ниже для пациентов с циррозом по сравнению с нециррозными пациентами (11,6% по сравнению с 18,4%), и ситуация у азиатов была опять заметно лучше, чем у неазиатов (26,1% по сравнению с 16,5%). Не имелось четкой связи между ответом ЛЬТ и дозой или частотой введения. В общей популяции 37 пациентов характеризовались нормальным уровнем сывороточной ЛЬТ в конце периода наблюдения (13,9%; снижение от 17,3% в конце лечения). Среди пациентов с циррозом лишь 4,7% характеризовались нормальной ЛЬТ в конце наблюдения. Среди неазиатов 9,9% характеризовались нормальной ЛЬТ на 24 неделе наблюдения по сравнению с 16,5% в конце лечения; однако, коэффициент нормализации среди азиатов в действительности возрастал от 26,1% в конце лечения до 56,5%. Длительная нормализация была отмечена только у 14 пациентов общей популяции (5,3%). Только один пациент с циррозом достигал длительной нормализации ЛЬТ (2,3% по сравнению с 5,8% для пациентов без цирроза). Четверо (4) из 14 пациентов, характеризовавшихся длительной нормализацией ЛЬТ, были азиатами при коэффициенте нормализации, равном 17,4% у азиатов по сравнению с 4,1% для неазиатов. В общей популяции только 10 пациентов характеризовались и клиренсом РНК НСУ, и нормализацией ЛЬТ на 48 неделю (3,8%). Ни один из пациентов с циррозом не достигал обоих выходных параметров. Двое (2) из пациентов с сочетанным ответом были азиатами при коэффициенте сочетанного ответа 8,7% для азиатов и 3,3% для неазиатов. Только 8 пациентов в общей популяции достигали длительного клиренса РНК НСУ в сочетании с нормализацией ЛЬТ на 24 неделю наблюдения (3,0%). Ни один из пациентов с сочетанным ответом не характеризовался циррозом. Примечательно, что 4 пациента с сочетанным ответом были азиатами, с коэффициентами сочетанного ответа 17,4% для азиатов и 1,6% для неазиатов.

Как и для большинства оцениваемых переменных, изменения гистологии печени были в общем сходными между пациентами с циррозом и без цирроза. Однако в отличие от других выходных параметров, изменения гистологии печени между азиатской и неазиатской популяциями существенно не отлича

- 28 007091 лись. Это может быть связано с малым количеством азиатских пациентов с результатами, полученными после лечения (10 азиатов по сравнению со 166 неазиатами).

Выводимые путем заключения анализы (точный тест Фишера и логистическая регрессия) использовали в исследовательской манере для генерирования гипотез, особенно, в отношении различий между азиатскими и неазиатскими пациентами. Было обнаружено, что азиаты со значимо большей вероятностью достигали полного клиренса РНК ΗСV на 48 неделю лечения, на 24 неделю наблюдения и в оба момента времени. Азиаты также с большей вероятностью, чем неазиаты, характеризовались нормальным уровнем сывороточной АЬТ.

Влияние дозы и частоты введения было наиболее очевидным для клиренса РНК ΗСV; однако, явные, связанные с дозой тенденции, не были статистически значимыми. Влияние дозы и частоты введения на уровни АЬТ было менее определенным.

Низкие коэффициенты прекращения для режима т. р. н. по сравнению с высокими коэффициентами для групп РЬ четко указывает на достижение пациентами пределов приверженности лечению и его переносимости. Из-за повышенного уровня отказов для группы с Ρϋ дозировкой следует подчеркнуть, что любые выводы, сделанные для данных групп, относятся к малым, избранным (и, возможно, смещенным) популяциям пациентов. Однако держа в уме данные предосторожности, следует также заметить, что несмотря на высокие дозы и интенсивные частоты введения, использованные в данном исследовании, большинство из обычно отмечаемых событий попадали в категории свойственных симптомов, известных как ассоциированные с интерферонами, и нарушений места применения, и большей частью по тяжести они были от мягких до умеренных.

Claims (7)

1. Применение рекомбинантного ΙΕΝ-бета для получения лекарственного средства для лечения инфекции НСУ путем подкожного введения пациентам азиатской расы, не отвечавшим на предшествующее лечение альфа-интерфероном.

2. Применение рекомбинантного ΙΕΝ-бета для получения лекарственного средства для лечения инфекции НСУ путем подкожного введения пациентам азиатской расы, которые не отвечали на предшествующее лечение альфа-интерфероном и которые через 4 недели начального лечения ΙΕΝ-бета характеризуются клиренсом РНК НСУ.

3. Применение по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный ΙΕΝ-бета представляет собой рекомбинантный Ш№-бета-1а.

4. Применение по любому из предыдущих пунктов, где пациенты, которые не отвечали на предшествующее лечение альфа-интерфероном, являются теми пациентами, которые подвергались лечению ΙΕΝ-альфа по меньшей мере 12 недель в дозе, по меньшей мере, равной 3 МШ, 3 раза в неделю, с одним из следующих исходов: (а) неспособность к нормализации сывороточной АЬТ или (Ь) нормализация АЬТ с последующим внезапным подъемом (подъем АЬТ) до окончания лечения.

5. Применение по любому из предыдущих пунктов, где дозировки и режимы лечения выбраны из группы, состоящей из 12 МШ (44 мкг) рекомбинантного ЕЕ№бета-1а три раза в неделю, 12 МШ (44 мкг) рекомбинантного Ш№-бета-1а ежесуточно, 24 МШ (88 мкг) рекомбинантного Ш№-бета-1а три раза в неделю и 24 МШ (88 мкг) рекомбинантного ЕЕ№бета-1а ежесуточно.

6. Способ лечения инфекции НСУ, включающий подкожное введение эффективного количества ΙΕΝ-бета вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем пациентам азиатской расы, не отвечавшим на предшествующее лечение альфа-интерфероном.

7. Способ лечения инфекции НСУ, включающий подкожное введение эффективного количества ΙΕΝ-бета вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем пациентам азиатской расы, не отвечавшим на предшествующее лечение альфа-интерфероном и которые через 4 недели начального лечения ΙΕΝ-бета характеризуются клиренсом РНК НСУ.

Распределение пациентов (общая популяция)

Всего 267 пациентов (всех случайно распределяли и подвергали лечению)

1 1 1 —I I 44 ΜΚΓΤ,ρ,Η. 65 пациентов 88 ΜΚΓΤ,ρ,Η. 67 пациентов 44 мкг СЮ 72 пациента 88 мкг СЮ 63 пациента

5 (7,7%) покидали исследование в период лечения 8 (11,9%) покидали исследование в период лечения 21 (29,2%) покидали исследование в пеоиод лечения 22 (34,9%) покидали исследование в пеоиод лечения - 0 останавливали леч., но входили в пеоиод наблюден 5 (7,5%) останавл. лечен., но входили в период набл. 6 (8,3%) останавл. лечен., но входили в период набл. 2 (3,2%) останавл. лечен., но входили в период набл. 0 не заканчивали наблюдение 1 не заканчивали наблюдение - 2 не заканчивали наблюдение О не заканчивали наблюдение 0 заканчивали 24 нед. наблюдения 4 заканчивали 24 нед. наблюдения 4 заканчивали. 24 нед. наблюдения 2 заканчивали 24 нед. наблюдения 60 (92,3%) заканчивали 48 недель лечения 54 (80,6%) заканчивали 48 недель лечения 45 (62,5%) заканчивали 48 недель лечения 39 (61,9%) заканчивали 48 недель лечения 0 не входили в период наблюдения 0 не входили в период наблюдения 0 не входили в период наблюдения 1 не входили в период наблюдения - 4 не заканчивали наблюдение - 1 не заканчивали наблюдение - 5 не заканчивали наблюдение 4 не заканчивали наблюдение 56 (86,2%) заканчив. 24 нед. наблюдения - 53(79,1%) заканчив. 24 нед. наблюдения 40 (55,6%) заканчив. 24 нед. наблюдения 34 (54%) заканчив. 24 нед. наблюдения

Фиг. 1

- 30 007091

Фиг. 2

Распределение пациентов (азиатская популяция по сравнению с неазиатской)

Всего 267 пациентов, случайно распределенных и подвергнутых лечению

Азиаты Неазиаты 24 пациента 243 пациента

2 (8,3%) покидали исследование в период лечения 54 (22,2%) покидали исследо~ вание в период лечения 1 (4,2%) останавлив. лечение, но входили в период наблюд. 12 (4,9%) останавлив. лечение, * но входили в период наблюд. 0 не заканчивали наблюдение 3 (1,2%) не заканчивали наблюдение 1 (4,2%) заканчивали 24 недели наблюдения 9 (3,7%) заканчивали 24 недели наблюдения 04 /Я*7 ΚΟΖΛ ммаииимапи с.1 ,ν /о/ оамлгтнпкхмт 48 недель лечения 1 177 ^72,8%^ аягпиммпяпи Н 48 недель лечения 0 не входили в период наблюдения _ 1 (0,4%) не входили в ' период наблюдения 0 не заканчивали наблюдение 14 (5,8%) не заканчи' вали наблюдение 21 (87,5%) заканчивали 24 недели наблюдения 162 (66,7%)заканчивали ' 24 недели наблюдения

Фиг. 3

- 31 007091 неазиаты неазиаты

Итог по выходным параметрам: клиренс РНК НСУ (азиатская популяция по сравнению с неазиатской) неазиаты азиаты —е— азиаты -·— азиаты -·—

Длительный мониторинг РНК НС)/ р<0,00Г — ОК.: 16,6 (4,1 -67,3)

РНК НС)/ на 24 неделю наблюдения р=0,003* — О.К: 8,2 (2,4-27,5)

РНК НС\/ на 48 неделю лечения р=0,006* — ОК: 5,0 (1,7-14,5) ₁ [ _г

Процентная доля ¹⁵ Точный тест Фишера

Фиг. 4

Итог по выходным параметрам: нормализация ΑΙ.Τ (азиатская популяция по сравнению с неазиатской) неазиаты_____________азиаты________________________ Длительная нормализация ΑίΤ р=0,024‘

-·=------------- — ОК. 4,9 (1,4-17,1) неазиаты азиаты Нормализация ΑίΤ на 24 неделю наблюдения р<0,001‘ --·--- ” ОК: 11,9 (4,7-29,9) неазиаты азиаты Нормализация АН на 48 неделю лечения р=0,25Г ---*---- · — ОК: 1,8 (0,7-4,8) 1111 0 10 20 30 I 40 50 1 1 1 60 70 80

Процентная доля

Точный тест Фишера