EA003939B1

EA003939B1 - Производные фенотиазина, окрашивающие диспластические ткани in vivo

Info

Publication number: EA003939B1
Application number: EA200101028A
Authority: EA
Inventors: Дуглас Д. Беркетт
Original assignee: Зила, Инк.
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2003-10-30
Also published as: ES2248061T3; ATE303810T1; DE60022487D1; BR0009427A; PL349999A1; JP2003520816A; NO20014720D0; IL145589A0; CA2366759A1; AU3695600A; CN1219515C; CN1345241A; SK13782001A3; HUP0201634A3; HUP0201634A2; TR200102815T1; US6830743B1; KR20010108431A; EA200101028A1; NO20014720L

Abstract

Соединения структурной формулы (А), где Х представляет собой водород, метил; Y представляет собой -NH-R и R представляет собой группу формулы (В), полезны в качестве красителей in vivo для обнаружения диспластической ткани.

Description

Данное изобретение относится к новым соединениям для биологического окрашивания, полезным для местного применения ίη νίνο человеком.

В другом аспекте изобретение относится к способам применения ίη νίνο таких соединений для идентификации ткани с подозрением на дисплазию, т.е. атипичной ткани.

Еще в одном аспекте изобретение относится к новым соединениям и их применению при диагностических методах ίη νίνο, специально приспособленным для обнаружения ткани ротовой полости с подозрением на дисплазию, в особенности, раковой и предраковой ткани.

Различные варианты воплощения изобретения и их практического применения будут очевидны для специалистов в этой области техники из последующего подробного описания изобретения и прилагаемого чертежа.

Чертеж представляет собой схему технологического процесса, изображающую способ синтеза новых соединений настоящего изобретения.

Предпосылки создания изобретения

Большинство эпителиальных повреждений является результатом травмы. Однако другие повреждения представляют собой диспластические опухоли, из которых некоторые могут быть доброкачественными, но некоторые могут быть или раковыми, или предраковыми. Кроме того, многие диспластические повреждения небольшие по размеру и могут быть просто не замечены врачами при обычном визуальном обследовании, в особенности, повреждения в полостях организма, таких как полость рта.

Известен диагностический тест ίη νίνο, идентифицирующий и очерчивающий ткань с подозрением на дисплазию. Такой скринингтест с использованием толуидинового синего О (толонийхлорида) в качестве красителя ίη νίνο, селективно окрашивающего раковую и предраковую ткань, в общих чертах описан в патенте США 4321251, МакйЬетд и в патенте США 5372801, Тиес1 е! а1. Как только повреждение с подозрением на дисплазию идентифицировано по схеме МакйЬетд, можно брать систематические биоптаты и подвергать их гистологической проверке, чтобы подтвердить, является ли повреждение злокачественным или предраковым. Наборы для осуществления такого теста, содержащие предварительно приготовленную смесь с красителем и растворы для полоскания в надлежащих количествах и концентрациях, запатентованы Ζί1α. 1пс., и доступны коммерчески в ряде стран под товарными знаками ОКАЗСКЕЕЫ® и ОКАТЕ8Т®.

Краткое описание изобретения

В настоящее время автором обнаружены новые соединения, полезные в качестве биологических красителей ίη νίνο для селективного окрашивания и очерчивания диспластической ткани. Такие соединения имеют структурную формулу

где Х представляет собой водород, метил;

Υ представляет собой -ΝΗ-К- или водород; и

К представляет собой метил или

νη₂

В качестве иллюстрации такие соединения включают

νη₂

Краткое описание способа получения

Соединения изобретения синтезируют способом, подобным (за исключением отмеченного ниже) способу, описанному в патенте США 418055, выданном 30 ноября 1889 г. на имя Эапб11кег е! а1. на получение толуидинового синего О (ТВО). Синтез ОаибЫхег представляет собой ряд процессов из трех стадий окисления: (1) окисление Ν,Ν-диметил-п-фенилендиамина, например бихроматом калия, с образованием 2-амино-5-диметиламинофенилтиосульфоновой кислоты; (2) конденсация тиосульфоновой кислоты с О-толуидином с образованием соответствующей индаминтиосульфоновой кислоты; и (3) замыкание в цикл индаминтиосульфоновой кислоты, например, в присутствии комплексообразователя при температуре кипения в течение примерно 30 мин, с образованием толуидинового синего О. Затем реакционную смесь охлаждают и высаливают продукт реакции комплекс с замкнутым циклом. Очистку комплекса можно осуществить путем повторения операций растворения и осаждения.

Способы получения соединений настоящего изобретения отличаются от синтеза ОаибИкег в том, что комплексообразователь добавляют до третьей стадии окисления, предпочтительно - во время первой стадии окисления, и новые продукты настоящего изобретения извлекают и выделяют из осажденного комплекса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Краткое описание применения продуктов для обнаружения эпителиального рака

Новые соединения изобретения используют, согласно протоколу МакйЬегд, для селективного окрашивания диспластической эпителиальной ткани, за исключением того, что вместо толуидинового синего О используют каждое из указанных соединений. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу обнаружения ίη νίνο диспластической ткани у человека, включающему стадию применения к эпителиальной ткани человека композиции, содержащей один из описанных выше новых продуктов или их смесь.

Подробное описание технологических приемов для получения продуктов настоящего изобретения

Чертеж представляет собой схему технологического процесса, отображающую способ получения новых соединений настоящего изобретения.

Исходное вещество 10 для синтеза представляет собой коммерчески доступный Ν,Νдиметил-а-фенилендиамин высокой степени чистоты.

Получение первой реакционной смеси

Водный раствор исходного вещества 10 окисляют (11) предпочтительно при температуре ниже 10°С, в частности при температуре ниже примерно 5°С, путем взаимодействия с подходящим окислителем 12, например бихроматом калия 12, в присутствии кислоты, сульфата алюминия и реагента 13 (который, как предполагается, образует комплекс с промежуточным(и) соединением(ями) и используется на более поздней стадии способа для образования комплекса с компонентами продукта реакции), например хлорида цинка. Затем добавляют источник тиосульфат-ионов 14, например тиосульфат натрия, и получают первую реакционную смесь 15, содержащую первое промежуточное соединение 2-амино-5-диметиламинофенилтиосульфоновую кислоту.

Получение второй реакционной смеси

Затем первую реакционную смесь 15 вводят в дальнейшее взаимодействие предпочтительно при температуре не выше примерно 10°С, с добавочным окислителем 16, например бихроматом калия, и гидрохлоридом отолуидина 17 на стадии конденсации 18 с образованием во второй реакционной смеси 19 продукта конденсации - второго промежуточного соединения индаминтиосульфоновой кислоты.

Получение третьей реакционной смеси

Затем вторую реакционную смесь 19 вводят в дальнейшее взаимодействие, предпочтительно добавляя подходящий окислитель 22, например бихромат калия, при температуре не выше примерно 10°С. Затем добавляют сульфат меди, комплексообразователь хлорид цинка, кислоту и смесь греют при 100°С для осуществления замыкания индаминового цикла, причем в третьей реакционной смеси 24 образуется конечный продукт реакции. В указанный момент продукт реакции выделяют из третьей реакционной смеси и очищают.

Выделение/очистка продукта третьей реакции

Например, в приведенном здесь предпочтительном варианте воплощения способа настоящего изобретения продукт реакции осаждают из третьей реакционной смеси путем образования комплекса 24 с подходящим комплексообразователем 25, например хлоридом цинка, с образованием комплексной двойной соли с хлоридом цинка. Осадок отделяют от жидкой фазы фильтрацией 26 и промывают раствором хлорида натрия 27. Затем промытый остаток на фильтре снова растворяют 28 в критическом (если взять воды слишком много, это препятствует выделению продукта реакции. Если используется слишком мало воды, (1) весь продукт реакции не растворяется, причем снижается выход, и (2) снижается степень чистоты продукта) объеме воды 29 с образованием раствора продукта реакции 30, который затем фильтруют 31 для удаления нерастворившихся твердых веществ 32а, которые отбрасывают. Затем к фильтрату 32 добавляют хлорид цинка и затем критический (если хлорида натрия используется слишком мало, продукт не будет высаливаться полностью, причем снижается выход. Если хлорида натрия используется слишком много, это будет вызывать осаждение примесей вместе с продуктом реакции, причем снижается степень чистоты продукта) объем/концентрацию хлорида натрия 33, чтобы снова осадить двойную соль хлорида цинка.

Двойную соль отделяют от смеси фильтрацией и получают остаток на фильтре 34. Как показано пунктирной линией 34а, остаток на фильтре 34 можно снова растворять, фильтровать и снова осаждать и выделять многократно до достижения нужной степени чистоты и выхода продукта реакции двойной соли. Затем очищенный остаток на фильтре конечного комплексного продукта 34 растворяют в воде и новые соединения настоящего изобретения выделяют и разделяют методами ВЭЖХ, описанными ниже.

Рабочие примеры

Приведенные далее примеры представлены для иллюстрации практического осуществления изобретения с той целью, чтобы дать возможность специалистам в этой области техники получить новые соединения изобретения и применить на практике новые диагностические методы с использованием таких новых соединений, что все вместе образует различные варианты воплощения изобретения, и с целью показать специалистам в этой области техники известные в настоящее время наилучшие способы практического использования различных вариантов воплощения изобретения. Данные примеры приводятся только с целью иллюстрации, а не как указывающие пределы объема настоящего изобретения, который определяется только прилагаемой формулой изобретения.

Пример 1. Способ получения.

Данный пример иллюстрирует необходимые процедуры для получения партии комплекса красителя и выделения новых соединений изобретения из комплексного продукта методом ВЭЖХ.

Получение растворов исходных материалов.

Оборудование/принадлежности

A. Весы 1Р15К8, Ойаик

B. Весы ΗΥ150ΚΑΙ, ΑπΌ

C. Весы Н90-5150, ЕалБаикк

Ό. Весы \\'В25/1-20\\'_ ОНАИ8

Е. Мешалки Со1е Рагтег (51201-30) и Тйегто1уие (825535)

Е. Пробоотборники, такие как стальные совки, цилиндрические пробоотборники и т. п.

С. Колбы Эрленмейера, химические стаканы, бутыли и другая соответствующая стеклянная посуда

Н. Этикетки для полученных растворов

Меры безопасности.

При работе с химикатами следует надевать защитные приспособления, такие как перчатки, защитные стекла, спецодежду и респираторы, согласно нормам Μ8Ό8.

Процедура получения растворов исходных материалов.

К соляной кислоте (1346,2±5,5 г) добавляют 1364,2 г (±5,5 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К гексагидрату сульфата алюминия (1779,1±7,0 г) добавляют 2548,9 г (±10,0 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К хлориду цинка (7384,6 ± 30,0 г) добавляют 2786,7 г (±11,0 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К бихромату калия (2101,9 ± 8,0 г) добавляют 25203,8 г (±100 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К пентагидрату тиосульфата натрия (1526,6 ± 6,0 г) добавляют 2043,6 г (±8,0 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К пентагидрату сульфата меди (509,7 ± 2,0 г) добавляют 1613,1 г (±6,0 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К серной кислоте (600,0 ± 2,0 г) добавляют 600,0 г (±2,0 г) очищенной по И8Р воды. Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

К хлориду натрия (70,4 кг ± 250 г) добавляют 234,4 кг (± 850 г) очищенной по И8Р воды.

Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

Синтез

Оборудование для синтеза и принадлежности.

Регулятор ЬЕЕ (3000)

Футерованные стеклом резервуары для очистки с кожухами и крышками емкостью ~75,7 дм³ (20 галлонов) (Е71224)

Два футерованных стеклом резервуара для очистки с кожухами и крышками емкостью ~378,5 дм³ (100 галлонов) (Р1, РТ-001) (Р2, Ь13621)

Охладитель с рециркуляцией ЕТ8 (КС96С032) и охлаждаемый резервуар для хранения емкостью ~1892,7 дм³ (500 галлонов) (500С8Т)

Три смесителя СаРгато (ВЭС-1850) (К1, 18500961) (Р1, 18501148) (Р2, 18501173) со шпинделем и лопастью

Сверхскоростной смеситель (ЬШ08) (201550)

Три теплообменника (Сагбиег МаеЫиегу) (К1, 01960763) (Р1, 01960764) (Р2, 08950727)

Три 12-кВт устройства для рециркуляции жидкости в кожухе (\а11о^. ВЬС726С38 20)

Три рециркуляционных насоса (81а-Кйе, ΙΒΗΌ-628, С4812ЕС15)

Пальчиковый шланговый насос МайегПех (А94002806)

Шланговый насос МаЦегПех (Б95003320)

Шланговый насос Со1е Рагтег (В96002074)

Установка нутч-фильтрации (70-2038,

43421-1)

Две установки фильтрации по Бюхнеру (Ζ11,624-6, Ζ10,441-8)

Вакуумный насос 81етеи5 (Е2ВУ2)

Футерованный стеклом сборный резервуар с крышкой емкостью ~227,1 дм³ (60 галлонов) (86854, Е164-1186)

Воздушный компрессор (ΌΕ412-2) (9502312538)

Регулятор подачи (3-5500) (69705069190)

Шесть устройств управления загрузкой (35600)(№ 1 69705069191, № 2 69705069199, № 3

69705069194, № 4 69705058829, №

69705058805, № 6 69705069195)

Шесть

69704295165,

69704024994, датчиков расхода (№ № 2 69704024995, № № 4 69704025027, №

69612178606, № 6 69703120990)

Четыре диафрагменных насоса (М1) Четыре ограничителя перенапряжения (А301Н) (№ 2 15557, № 3 15561, № 4 15558, № 5

15559)

Четыре воздушных регулятора (СЕК10)

Четыре электромагнитных клапана (используемых в качестве воздушных регуляторов)

Четыре датчика низкого расхода (Е8-500)

Три электромагнитных клапана (ЕА8М5У16\20)

Воздушный фильтр/регулятор (Т1Р)

РТЕЕ/Е06Р113АС

Фильтрующие среды, Ро1ургору1епе (7211-1) Фильтрующие среды, ХУНаПшш сорт 52 Трубопровод РйагМеб (-18, -82, -90) рН-Метр; Наппа 9321 (13003675) и Опоп 620 (001911)

Спектрофотометр 20 (3МИ722070)

Вакуумная сушильная печь Избег 8с1епБПс (9502-033)

Воздушный термостат с принудительной вентиляцией УУР 1370 ЕМ (1370ЕМ)

Респиратор против пыли/тумана

Мельница Тбошаз Уйеу БаЬогаЮгу (3375Е10)

Смеситель Райегзоп-Ке11еу (Б1епбтаз1ег, С416578)

Весы Т84КО, ОНАИ8

Весы 1Р15К8, ОНАИ8

Весы АС 104, Мей1ег

Весы НУ150КА1, АпО

Весы Н90-5150, ЕаиЬапкз

Принтер А8123, ОНАИ8

Принтер А8142, ОНАИ8

Многофункциональный принтер АО-8121

Матричное печатающее устройство ЮР

3540, С’Шхеп

Установка ВЭЖХ НеЮей Раскагб (1050)

Ультразвуковой очиститель (8892-ОТН, ФСС9601 005С)

Термограф с термоэлементом типа К (КТх, 6292752,6355146)

Колбы Эрленмейера (8, 6, 4, 1 л)

Химические стаканы (8, 6 л, 500, 250 мл) Бутыли (4, 10, 50 л)

Бочки (~208,2 дм³ (55 галлонов), ~378,5 дм³ (100 галлонов))

Мерные колбы (100 мл)

Пластиковая воронка

Пастерки с шариками и градуированные пипетки (10, 5 мл) с шариком

Мембранные коробки (25, 50 мл)

Бумага \Уещ11

Шпатели

Упаковочный материал (контейнеры, крышки, этикетки)

Растворы исходных материалов

Синтез, стадия 1

Синтез 2-амино-5-диметиламинофенилтиосульфоновой кислоты.

Проверяют целостность системы подачи воды И8Р. В реактор загружают взвешенное количество очищенной воды степени чистоты по И8Р (28000 ± 100,0 г) и перемешивают при 190 ± 10 об./мин.

Добавляют Х,Х-диметил-1,4-фенилендиамин (5,128 моль, 720,0 ± 3,0 г). Материал необходимо добавлять в виде порошка (без комков). Перемешивают 10 ± 5 мин.

Добавляют соляную кислоту (6Ν, 1136,9 ± 5,0 г). Перемешивают 15 ± 5 мин.

Отбирают образец реакционной смеси приблизительно в 10 мл с использованием пластикового устройства для отбора образцов. Проверяют рН. рН должен составлять 2,8-3,8 при 25 ± 5°С.

Добавляют раствор гексагидрата сульфата алюминия (4328,0 ± 21,0 г). Перемешивают 10 ± 5 мин при 275 ± 10 об./мин.

Добавляют раствор хлорида цинка (3641,5 ± 18,0 г). Охлаждают до 4 ± 1°С.

Как только температура (РУ1) достигнет 4 ± 1°С, добавляют раствор бихромата калия (6532,4 ± 32,0 г) в течение 20 ± 5 мин. После завершения добавления смесь перемешивают 20 ± 5 мин.

Поддерживая температуру на уровне ниже примерно 10°С, добавляют раствор пентагидрата тиосульфата натрия (3570,2 ± 18,0 г). Раствор перемешивают при 10°С в течение 30 ± 5 мин.

Изменяют установку температуры на 60°С. Когда температура (РУ1) достигнет 60 ± 3,0°С, реакционную смесь перемешивают в течение 5 ± 3 мин и изменяют установку на регуляторе БЕЕ на 10,0.

Как только температура достигнет 13,0 ± 2,0°С, проверяют рН. рН должен составлять 3,1-

4,1 при 25 ± 5°С.

Синтез, стадия 2

Синтез индаминтиосульфоновой кислоты.

Взвешивают о-толуидин (604,4 ± 2,5 г) и охлаждают до 18 ± 3°С на ледяной бане. К отолуидину постепенно добавляют соляную кислоту (6Ν, 1230,7 ± 5,0 г). Удаляют гидрохлорид о-толуидина с ледяной бани и оставляют раствор охлаждаться до 38 ± 3°С. Добавляют раствор к реакционной смеси и перемешивают смесь 5 ± 3 мин.

Добавляют раствор бихромата калия (6532,4 ± 32,0 г) в течение 20 ± 5 мин. После завершения добавления смесь перемешивают 10 ± 5 мин.

Изменяют установку регулятора (8Р1) на 60,0. Как только температура реакционной смеси достигнет 60,0 ± 3,0°С, реакционную смесь перемешивают 25 ± 5 мин. Будет образовываться осадок, состоящий из зеленого индамина.

Синтез, стадия 3

Синтез двойной соли хлорида цинка.

Устанавливают регулятор БЕЕ на 7,0. Как только температура реакционной смеси достигнет 10,0 ± 3,0°С, добавляют раствор бихромата калия (6532,4 ± 32,0 г) в течение 20 ± 5 мин. После завершения добавления смесь перемешивают 20 мин.

Добавляют раствор бихромата калия (5225,9 ± 26,0 г) в течение 20 ± 5 мин. После завершения добавления смесь перемешивают 20 ± 5 мин.

Добавляют раствор хлорида цинка (3641,5 ± 18,0 г). Перемешивают в течение 20 ± 5 мин при 350 ± 10 об./мин.

Добавляют раствор пентагидрата сульфата меди (2122,8 ± 10,0 г). Перемешивают 15 ± 5 мин.

Изменяют установку регулятора (8Р1) на 100,0. Как только температура реакционной смеси достигнет 67,0 ± 3,0°С, начинают добавлять раствор серной кислоты до рН 2,9 ± 0,3, добавляя аликвоты (500, 250, 125 мл и т.д.). Реакционную смесь перемешивают 5-10 мин после каждого добавления и проверяют рН.

Как только температура реакционной смеси достигнет 100,0 ± 3,0°С, смесь перемешивают 35 ± 5 мин.

Изменяют установку регулятора (8Р1) на 35,0. Как только температура реакционной смеси достигнет 70,0 ± 3,0°С, изменяют установку регулятора (8Р1) на 2,5. Осуществляют охлаждение до 2,5°С за 4 ч и выдерживают при 2,5 ± 2,0°С в течение 4-18 ч.

Очистка, стадия 1

Фильтруют реакционную смесь через подходящую фильтрующую среду (ЛУНаЦпап Огабе 52).

Когда реактор выгружен, взвешивают 24,0 кг ± 150,0 г 30% раствора ЫаС1 и добавляют 24,0 кг ± 150,0 г воды по И8Р. Закрывают донный клапан реактора и добавляют в реактор 15% раствор №1С1. Кратковременно перемешивают раствор. Когда фильтрация завершена, в установку фильтрации добавляют раствор ЫаС1 для промывания остатка на фильтре.

Проверяют состояние футерованного стеклом, снабженного кожухом 378,5-дм³ резервуара для очистки № 1, очищают резервуар и снабжают резервуар крышкой НОРЕ, мешалкой СаГгашо. шпинделем, лопастью и термопарой, встроенной в пластиковое углубление для термоэлемента. Проверяют, закрыт ли донный клапан, и заглушают выходное отверстие.

Взвешивают 190,0 ± 1,0 кг воды по И8Р в контейнере НОРЕ и перемещают воду в резервуар для очистки 1. Перемешивают смесь при 350 об./мин. Как только промывка остатка на фильтре №1С1 завершается, остаток на фильтре при перемешивании загружают в резервуар для очистки 1.

Перемешивают смесь 2-4 ч.

Устанавливают регулятор ЬРЕ резервуара для очистки 1 на 75,0 (8Р1).

Когда температура смеси (РУ1) достигнет 75,0 ± 3,0°С, переставляют регулятор на 40,0.

Перемешивают смесь при 40°С и 350 об./мин в течение 12-36 ч.

Отбирают образец (через донный клапан) приблизительно в 50 мл. Отмеряют 1,0 мл образца 1,0-мл пипеткой и разбавляют до 100 мл в мерной 100-мл колбе. Затем отбирают 10,0 мл полученного раствора 10,0-мл пипеткой и разбавляют до 100 мл в мерной 100-мл колбе. Измеряют поглощение полученного образца с использованием 8рее1гоше 20+. Поглощение образца должно составлять > 0,220.

Очистка, стадия 2

Фильтруют смесь через фильтрующую среду в установке фильтрации. Собирают фильтрат в тарированный контейнер НОРЕ с крышкой.

Снабжают футерованный стеклом, снабженный кожухом 378,5-дм³ резервуар для очистки 2 крышкой НОРЕ, мешалкой СаГгато, шпинделем, лопастью и термопарой, встроенной в пластиковое углубление для термоэлемента.

В чистый контейнер НОРЕ отвешивают 30% раствор №1С1 в количестве, равном объему раствора, зарегистрированному выше, с использованием формулы (мл р-ра) (116,91 г р-ра МаС1/100 мл р-ра \аС1 = г р-ра \аС1

Отбирают образец фильтрата в »10 мл и проверяют рН. рН должен составлять 3,0-4,0. Перемещают фильтрат в резервуар для очистки

2. Перемешивают раствор при 350 об./мин.

Добавляют раствор хлорида цинка (1636,3 ± 6,5 г).

Перемещают раствор ЫаС1 (по массе) в резервуар для очистки 2.

Устанавливают регулятор ЬРЕ резервуара для очистки 2 на 75,0 (8Р1).

Когда температура смеси (РУ1) достигнет 75,0 ± 3,0°С, переставляют регулятор на 5,0.

Охлаждают смесь до 5°С 6 ч и выдерживают при 5,0 ± 4,0°С в течение 4-24 ч.

Обработка

1. Фильтрация.

Фильтруют смесь через затаренную фильтрующую среду (^Ьа1тап, сорт 52) в установке фильтрации.

Взвешивают 12 кг ± 50 г 30% раствора хлорида натрия и разбавляют 12 кг ± 50 г воды по И8Р. Промывают остаток на фильтре 15% раствором хлорида натрия, добавляя раствор непосредственно в воронку Бюхнера. Когда фильтрация завершается, осторожно извлекают фильтровальную бумагу, содержащую продукт.

ΐΐ. Сушка.

Помещают очищенный комплексный продукт реакции в печь и сушат при 50,0 ± 3,0°С в течение 5 ± 1 ч.

Извлекают комплексный продукт из печи с принудительной циркуляцией воздуха и помещают в вакуумную печь. Сушат при 45,0 ± 3,0°С при 28 ± 2 мм рт.ст. в течение 10 ± 2 ч.

ίίί. Измельчение.

Устанавливают 0,5-мм сито в мельницу Тйотак \УПеу ЬаЬота1огу. Присоединяют чистую емкость к жёлобу для выпуска. Заслонка камеры должна быть закрыта и зафиксирована.

Закрывают шибер на дне бункера, снимают крышку и загружают высушенный комплекс. Возвращают крышку на место. Включают мельницу и немного открывают шибер. Подают продукт в мельницу достаточно медленно, чтобы мельница не тормозилась или не забивалась.

Как только измельчение завершается, осторожно отделяют емкость от жёлоба для выпуска.

ν. Смешивание.

Перемещают продукт в емкость смесителя Рабег8ои-Ке11у ЬаЬ и закрывают крышку. Устанавливают таймер на 15 ± 5 мин.

Процедура ВЭЖХ для выделения и разделения

В данном примере описывается процедура ВЭЖХ, подходящая для разделения и выделения новых соединений настоящего изобретения из высушенного, измельченного и перемешанного комплекса, полученного так, как описано выше.

А. Приборы и оборудование.

1. Процедуры ВЭЖХ

a. Хроматографическая система для ВЭЖХ НР1100

b. Детектор с диодной матрицей НР1100

c. Четверной насос для ВЭЖХ НР1100

2. Сбор фракций и очистка

a. 10-Канальный сборник фракций 18СО Роху 1т.

b. Роторный испаритель ВисЫ, модель К124

c. Патрон 8ер-рак, С₁₈, Уапаи

3. Масс-спектральный анализ

a. Масс-спектрометрия с ионизацией электронным ударом (ΕΙ-Μ8)

1. Масс-спектрометр УС аналитический ΖΑΒ 2-8Ε

2. Температура источника 200°С

3. Напряжение 70 эВ

4. Зонд для образца: зонд для твердых веществ

5. Температура зонда 280°С

b. Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия (ЬС-Μδ)

1. Двойной насос НР1100 с вакуумным дегазатором

2. Растворитель А - вода: АСЫ (ацетонитрил) (88:12), об/об, содержит 0,1% ΤΕΑ

3. Растворитель В - вода АСЫ (1:1), об/об, содержит 0,1% ΤΕΑ

4. Градиент от 0% растворителя В до 30% растворителя В за 18 мин; повышение содержания растворителя В до 100% через 27 мин, выдержка 3 мин

5. Скорость потока 1,5 мл/мин

6. Колонка \Уа1ег 8ушше1ту С₁₈, колонка 4,6 х 250 мм, 5 мкм

7. Температура колонки 40°С

8. Детектор УФ с переменной длиной волны, 290 нм

9. МС-прибор тройной квадрупольный масс-спектрометр УС Вю-0

10. Принцип действия - по типу положительной ионизации распылением электронов (+Ε8Ι)

11. Температура источника 80°С

с. Бомбардировка быстрыми атомами (ΡΑΒ-Μδ)

1. Масс-спектрометр УС аналитический ΖΑΒ 2-δΕ

2. Ввод образца: цезиевая ионная пушка

3. Система данных: аналитическая УН 112501 с РЭР 11/73

б. Масс-спектрометр с электронным распылением (ΕδΙ-Μδ)

1. Масс-спектрометр УС квадрупольный анализатор Вю!есЬ Βίο-0

2. Принцип действия: прямое внедрение отрицательно заряженных ионов

3. Объем вводимой пробы 50-75 мкл

4. Элюент 50% водный ΑΟΝ, содержащий 0,1% ТФК

5. Скорость потока 10 мкл/мин

е. МС с электронным распылением/МС (Ε8Ι-Μ8/Μ8)

1. Масс-спектрометр тройной квадрупольный анализатор УС ОиаИго II Βίο-0

2. Газ для столкновений аргон

3. Аликвота образца 50-75 мкл

4. Элюент 50% водный ΑΟΝ, содержащий 0,1% ТФК

5. Скорость потока 10 мкл/мин

ί. Масс-спектрометрия высокого разрешения (НК-Μδ)

2. Ввод образца: цезиевая ионная пушка

3. Система данных: аналитическая УН 112501 с ΡΌΡ 11/73

4. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

а. ЯМР Уапаи Iηονа, 400 МГц

5. Рентгеноструктурный анализ монокристаллов

a. Нониус С'Э-4. модель 586, автоматизированный дифрактометр для монокристалла

b. Рентгеновская трубка Си, тонкая фокусировка (λ=1,5418Α)

c. Приспособление для фотографии с разупорядоченной ориентацией, Ро1аго1б, модель 573

6. Программное обеспечение по сбору данных ΕXΡКΕδδ

е. Программное обеспечение по обработке данных ΜΟ6ΕΝ

В. Химикаты, реагенты и эталоны.

1. Химикаты и реагенты

a. Ацетонитрил (ΑΟΝ), чистый для ВЭЖХ

b. Метанол (МеОН), чистый для ВЭЖХ

c. Хлороформ (СНС13), чистый для ВЭЖХ

б. Ледяная уксусная кислота (СЛЛ), чистая по требованиям ΑСδ

е. Соляная кислота (НС1), чистая по требованиям ΑСδ

ί. Вода Μ1111-Ο

д. Триэтиламин (ΤΕΑ), чистый для ВЭЖХ

Ь. Ацетат аммония, чистый для анализа

ί. Гидроксид натрия (ΝαΟΗ) в гранулах, степени чистоты реактивный

_). Газ азот, степени чистоты ноль

k. Метанол дейтерированный (б₄-МеОН)

l. Диметилсульфоксид дейтерированный (бб-ДМСО)

т. Вода, насыщенная дейтерием (Ό₂Ο) η. Соляная кислота дейтерированная (ЭС1) о. Тетрафенилборат натрия, степени чистоты реактивный

Система 2 начальной препаративной ВЭЖХ для сбора фракций соединений

Начальный сбор фракций.

Водный разбавитель - получают 0,1 М раствор уксусной кислоты и доводят рН до 6,1 ± 0,1 с помощью ΝαΟΗ.

Подвижная фаза А - водный разбавитель : АСИ = 88:12.

Подвижная фаза В - водный разбавитель : АСИ = 50:50.

Получение образцов. Получают 15 мг/мл раствор высушенного смешанного комплексного продукта реакции в водном разбавителе. Загружают раствор аликвотами по 30-40 мл для разделения в патроны 8РЕ с 10 г С₁₈, промывают приблизительно 20 мл водного разбавителя и затем промывают приблизительно 10 мл воды. Элюируют приблизительно 10 мл 0,01Ν раствора НС1 в МеОН. Выпаривают очищенный образец в роторном испарителе досуха и снова растворяют в водном разбавителе.

Хроматографическая система. Систему для ВЭЖХ АР 1100 с подогревателем колонок снабжают колонкой с С₁₈, 7 мкм, 30,0 см х 7,8 мм и подходящим УФ-детектором для детекции при 290 нм и диодной матрицей, устанавливают скорость потока в 5,0 мл/мин и температуру колонки 20°С. Используют элюирование с градиентом, указанным ниже.

	Подвижная фаза, %
Время, мин	А	В
0	80	20
15	60	40
15,1	0	100
25	0	100
25,1	80	20

Процедура. Аликвоты образца в 900 мкл вводят в хроматографическую систему и собирают пики, представляющие интерес, с использованием многоканального сборника фракций. Как только соберут все фракции, каждую фракцию упаривают на роторном испарителе для удаления большей части АСИ, затем концентрируют на патроне 8РЕ с С₁₈, промывают водой и элюируют приблизительно 5 мл 0,01Ν раствора НС1 в МеОН. Испаряют элюат на роторном испарителе досуха и оставляют для дальнейшей очистки.

Заключительный сбор фракций.

Подвижная фаза А - 0,1% ТЕА : АСИ = 88:12.

Подвижная фаза В - 0,1% ТЕА : АСИ = 50:50.

Получение образцов. Получают растворы высушенных фракций из начального сбора фракций и разбавляют подвижной фазой А.

Хроматографическая система. Систему для ВЭЖХ НР1100 с подогревателем колонок снабжают колонкой с С₁₈, 7 мкм, 30,0 см х 7,8 мм и подходящим УФ-детектором для детекции при 290 нм и диодной матрицей, устанавливают скорость потока в 5,0 мл/мин и температуру колонки 30°С. Используют элюирование с градиентом, указанным ниже.

	Подвижная фаза, %
Время, мин	А	В
0	73	27
8	70,6	29,6
8,1	45	55
9	45	55
16	25,5	74,5
16,1	73	27

Процедура. Аликвоты образца в 200 мкл вводят в хроматографическую систему и собирают пики, представляющие интерес, с использованием многоканального сборника фракций. Как только соберут все фракции, каждую фракцию сначала упаривают на роторном испарителе для удаления большей части АСИ, затем концентрируют на патроне 8РЕ с С₁₈, промывают водой и элюируют приблизительно 5 мл 0,01Ν раствора НС1 в МеОН. Затем фракции высушивают досуха в потоке сухого азота и оставляют для осуществления анализов для идентификации.

Характеристика соединения IV

Отделение и выделение.

Соединение IV выделяют с использованием метода полупрепаративной ВЭЖХ. Фракцию собирают, удаляют большую часть АСИ на роторном испарителе, и затем концентрируют с использованием патрона 8РЕ с С₁₈, промывают водой и элюируют приблизительно 5 мл 0,01Ν раствора НС1 в МеОН. Затем фракцию высушивают досуха в потоке сухого азота. Часть вещества повторно растворяют в подвижной фазе и вносят в систему ВЭЖХ для определения чистоты фракции. Инжекция соединения IV показывает чистоту примерно 95%, и методом ЯМР проверяют 8,2 мг.

Масс-спектральный анализ.

Предварительные данные масс-спектрального анализа методом ЬС-М8 измельченного смешанного комплексного продукта реакции показывают, что молекулярная масса соединения IV составляет приблизительно 375,3 т/ζ. Дальнейшие исследования методом НР-М8 с использованием фракций, собранных при Ь8 очищенной воде (И8Р), ледяной уксусной кислоте и этиловом спирте 8Ό 18 и получают испытываемый раствор состава, указанного в табл.

А.

Таблица А

М8, показывают для соединения IV массу 375,1655 т/ζ и молекулярную формулу С₂₂Н₂₃Л₄81. Осколки исходного иона в 375 т/ζ соединения IV проверяют с использованием положительной Е81-М8/М8. Картина фрагментации показывает преимущественные потери 16 и 4 ат. ед.массы из молекулярного иона соединения IV, отражая строение соединения IV. Данное соединение и его Ν- и Ν,Ν-диметилированные производные соединения V и VI образуются при вторичном взаимодействии исходного соединения (ТВО) и избытка исходного вещества О-толуидина.

Характеристика соединения I

Отделение и выделение.

Соединение I выделяют с использованием метода полупрепаративной ВЭЖХ. Фракцию собирают, удаляют большую часть ΑСN на роторном испарителе и затем фракцию концентрируют с использованием патрона 8РЕ с С₁₈, промывают водой и элюируют приблизительно 5 мл 0,01Ν раствора НС1 в МеОН. Затем фракцию высушивают досуха в потоке сухого азота. Часть вещества повторно растворяют в подвижной фазе и вносят в систему ВЭЖХ для определения чистоты фракции. Инжекция соединения I показывает чистоту примерно 95%, и методом ЯМР проверяют 18,9 мг.

Масс-спектральный анализ.

Предварительные данные масс-спектрального анализа методом ЬС-М8 высушенного смешанного комплексного продукта реакции показывают, что молекулярная масса соединения I составляет приблизительно 284,1223 т/ζ и молекулярную формулу для соединения I ^βΗ^Ν^μ Осколки исходного иона в 284 т/ζ соединения I проверяют с использованием положительной Е8БМ8/М8. Предполагаемая структура и картина фрагментации, показывающая преимущественные потери 16, 30 и 59 ат.ед.массы из молекулярного иона, дают строение соединения I. Соединение I и его Ν- и Ν,Νдиметилированные производные соединения II и III образуются при свободно-радикальном захвате метильной группы из другой диметилированной молекулы соответствующим исходным изомером ТВО.

Соединения II, III, V и VI выделяют и характеризуют с помощью процедур, описанных выше для выделения и характеристики соединений VI и I.

Пример 2. Протокол клинических испытаний.

Получение растворов для клинических испытаний.

Данный пример иллюстрирует применение каждого из продуктов примера 1 при идентификации дисплазии полости рта.

Соединение I, малиновую отдушку (ГРР ВакрЬепу Ш563457), буферное вещество тригидрат ацетата натрия и консервант Н₂О₂ (30%, И8Р) (см. патент США 5372801) растворяют в

Компонент	Масса, %
Соединение I	1,00
Отдушка	0,20
Буферное вещество	2,45
Консервант	0,41
Уксусная кислота	4,61
Этиловый спирт	7,48
Вода	83,85
	100,00

Приготавливают растворы для предварительного полоскания перед испытанием и последующего полоскания, содержащие 1 мас.% уксусной кислоты в очищенной воде, консервант бензоат натрия и малиновую отдушку.

Клинический протокол.

Пациенту надевают нагрудник, чтобы защитить одежду. Ожидается отплевывание, поэтому пациенту дают ~300-мл (10 унций) чашку, которую затем можно положить в емкость для инфицированных отходов или содержимое которой можно вылить непосредственно в сливное отверстие раковины, чтобы избежать окрашивания раковины. Поверхности вокруг участка испытаний или предметы, которые могут окраситься, закрывают или удаляют.

Проводят визуальное обследование полости рта на рак без применения каких-либо инструментов, которые могут поцарапать или порезать мягкие ткани. Перед окрашиванием отмечают внешний вид мягких тканей и зубов.

Пациент полощет полость рта приблизительно 15 мл раствора для предварительного полоскания в течение приблизительно 20 с и сплевывает, чтобы удалить избыток слюны и обеспечить сообразную среду полости рта. Затем эту стадию повторяют с новой порцией раствора для предварительного полоскания.

Затем пациент промывает и полощет горло водой в течение 20 с и сплевывает.

Затем пациент промывает и полощет горло 30 мл испытываемого раствора в течение 1 мин и сплевывает.

Затем пациент полощет рот 15 мл раствора для постполоскания в течение 20 с и сплевывает. Затем эта стадия повторяется.

Затем проводят обследование полости рта, используя соответствующие методы обследования мягких тканей, включая ретракцию, равномерное освещение и, при необходимости, увеличение. Оценивают и регистрируют расположение, размер, морфологию, цвет и характеристики поверхности подозрительных повреждений, сохранивших синюю окраску.

Для того чтобы уменьшить число ложных положительных оценок, пациента через 10-14 дней приглашают на повторное обследование по вышеописанному протоколу. Такой срок дает время для заживления любого язвенного или травматического повреждения или раздражения в период первого обследования. Положительное окрашивание после второго обследования подозрительного участка, выявленного при первом обследовании, рассматривают как указание на раковую или предраковую ткань, и проводят биопсию для подтверждения такого заключения.

Ранние эритропластические повреждения окрашиваются в синий цвет, часто в виде штрихов или пятен. Однако естественно для красителя сохраняться в неправильных папиллярных бороздках на тыльной поверхности языка, что не является положительным показанием. К другим участкам, где остается синий краситель, но которые не рассматриваются как положительные, относятся зубной налет, дёсенные края каждого зуба, мягкое нёбо, окрашенное за счет диффузии вследствие переноса красителя с оставшейся окрашенной тыльной стороны языка, и язвенные повреждения, которые легко различаются. Во всех случаях, когда повреждение является весьма подозрительным, но не окрашивается при данном испытании, тем не менее, проведение биопсии является обязательным.

Примеры 3-7.

Повторяют процедуры, описанные выше, за исключением того, что вместо соединения I используют соединения II, III, IV, V и VI. Получают схожие результаты.

На основании описания изобретения с целью предоставления возможности специалистам в данной области техники понять его и применить на практике, и при наличии идентифицированных и предпочтительных вариантов его воплощения, автор предоставляет формулу изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение структурной формулы
2. Соединение структурной формулы
3. Соединение структурной формулы
4. Способ обнаружения диспластической ткани, включающий стадию применения к эпителиальной ткани композиции для биологического окрашивания, селективно окрашивающей диспластическую ткань, отличающийся тем, что в указанном способе используют соединение структурной формулы по пп.1-3.