CN106045987B - 一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒及其制备和应用 - Google Patents

一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒及其制备和应用。该磁性纳米微粉粒同时具备磁共振成像和光学成像两种功能，既能用于阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白Aβ斑块成像，同时对Aβ‑样淀粉蛋白聚合具有抑制作用，可以用于制备治疗阿茨海默症的药物。

Description

一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒及其制备和应用。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一种退行性脑神经系统疾病，属于最常见的老年痴呆症的一种。针对AD的病理机制主要有3种假说:淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles)以及胆碱能神经元退行性病变。其中“淀粉样级联假说”被人们广泛认可，该假说认为：在AD发生的早期，β-淀粉样蛋白(Aβ，主要是Aβ40和Aβ42)逐渐聚合沉积形成淀粉样斑块，引发tau蛋白磷酸化和神经纤维缠结，最终导致神经元丢失、退化和痴呆。由于AD发病隐蔽性强，病程缓慢，对AD的早期诊断极为关键，因此研究和开发针对Aβ斑块的诊断试剂，对于在分子水平研究AD的病理生理过程、以及为疾病的早期诊断和治疗提供依据显得尤为迫切。
分子成像技术对患者创伤小，在分子水平上具有高敏感性，很有希望为AD早期诊断和治疗提供有效依据。磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层显像(SPECT)和近红外荧光(NIRF)成像均能够提供AD脑部变化的信息，具有进行人和动物模型的AD诊断潜力。目前，应用于AD患者早期诊断的主要是PET和SPECT成像的Aβ探针，但PET/SPECT成像成本高、有放射性危险、采集数据耗时长、核发射正电子半衰期短且同位素可用性狭窄。近红外荧光(NIRF)成像方法具有许多优点，包括灵敏度高、检测安全、实时成像、成本适中等。近年来有一些关于检测Aβ斑块的近红外荧光探针的报道，如噁嗪类衍生物(AOI987)、噻吩类衍生物(NIAD)、姜黄素类衍生物(CRANAD)、硼二吡咯亚甲基类衍生物(BODIPY)、氨基萘-2-氰基丙烯酸酯类衍生物(ANCA)、共轭π电子链类(DANIRs)。但是，大多数近红外荧光(NIRF)成像探针都无法满足脑Aβ斑块成像的多种严格要求，如需要良好的血脑屏障通透性、对Aβ斑块高选择性和较强的亲和力、具有低神经毒性和良好的生物稳定性等。另外，核磁共振具有较高的空间分辨率、较好的软组织对比度，是研究神经系统病变的一个有力工具，它可以帮助更好的研究AD的发病机制、发生发展过程，同时为药物开发、治疗跟踪提供重要的信息。然而，目前诊断成像方法都有其各自固有的优点和缺点，如果能够提供一种汇集两个诊断方法优点的成像探针，这将能提高诊断的效率和精准度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒，同时具备磁共振成像和光学成像两种功能，既能用于阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白Aβ斑块成像，同时对Aβ-样淀粉蛋白聚合具有抑制作用，可以用于治疗阿茨海默症。
本发明的另一目的在于提供一种上述多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述多功能近红外荧光磁性纳米微粒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒，其通式为：
其中，m为整数1或2；n为整数1或2；R为氢或氯。
上述具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备方法，包括下述步骤：
(1)化合物2、化合物3的制备：在氢化钠碱性条件下，化合物0(式0)与碘甲烷在DMF中反应生成化合物1(式1)；在氩气保护下,化合物1与三氯氧磷在DMF中反应回流10～20小时，得到接有一个醛基的化合物2(式2)；以三(3,6-二氧杂庚基)胺为相转移催化剂，碳酸氢钠/碳酸钠饱和溶液体系为碱性介质，以二氯甲烷为反应溶剂，化合物2与(1,3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化瞵回流反应20～30小时，经柱层析或重结晶提纯后，得到化合物3(式3)；如反应式I所示；
(2)化合物5的制备：在碱性条件下，化合物4(式4)与2,2'–(硫代羰基(硫))二乙酸盐酸盐发生缩合反应，然后通过柱层析法提纯，得到化合物5(式5)；如反应式II所示；
(3)化合物7、化合物9的制备：以二氯甲烷为溶剂，化合物2与化合物5(n＝1)进行Knoevenagel缩合反应，在常温下反应2～5小时，通过柱层析法提纯，得到化合物6(式6)，然后在常温和三氟乙酸酸性条件下，化合物6进行脱脂反应，重结晶后得到化合物7(式7)；用同样的实验条件，化合物2与化合物5(n＝2)进行Knoevenagel缩合反应，可以得到化合物8(式8)，化合物8进行脱脂反应，重结晶后得到化合物9(式9)；如反应式III所示；
(4)化合物11、化合物13的制备：以二氯甲烷为溶剂，化合物3与化合物5(n＝1)进行Knoevenagel缩合反应，在常温下反应2～5小时，通过柱层析法提纯，得到化合物10(式10)，然后在常温和三氟乙酸酸性条件下，化合物10进行脱脂反应，重结晶后得到化合物11(式11)；用同样的实验条件，化合物3与化合物5(n＝2)进行Knoevenagel缩合反应，可以得到化合物12(式12)，化合物12进行脱脂反应，重结晶后得到化合物13(式13)；如反应式IV所示；
(5)在三乙胺的碱性条件下，聚乙二醇(PEG)与溴乙酰氯反应，得到BBrAc-PEG(式14)；然后BBrAc-PEG与等当量多巴胺进行取代反应，得到DPA-PEG-BrAc(式15)；DPA-PEG-BrAc再与N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺进一步取代反应，得到DPA-PEG-NHBoc(式16)，随后DPA-PEG-NHBoc脱保护，得到DPA-PEG-NH2(式17)；如反应式V所示；
(6)四氧化三铁纳米颗粒的制备：先将三乙酰丙酮铁(III)溶解在苄基醚和油胺的混合溶液中，在氩气和120～130℃下脱水，1～2小时后，将温度迅速升至270～300℃，在氩气下搅拌2～4小时；然后将反应混合物冷却到室温，加入乙醇到反应混合物中，用离心机进行沉淀，得四氧化三铁纳米颗粒(式18)；
(7)四氧化三铁的DPA-PEG-NH2的制备：在碱性条件和溶剂中，将四氧化三铁纳米颗粒分散在二氯甲烷中，然后加入DPA-PEG-NH2，在氩气、25℃下搅拌16～24小时，然后超声处理15～30分钟，用己烷沉淀，用离心方法收集得到四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(式19)；
(8)多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备：在二环己基碳二亚胺(简称DCC)作为偶联剂和三乙胺作为碱存在条件下，化合物7、化合物9、化合物11(R为H)、化合物11(R为Cl)、化合物13在溶剂中分别与N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)进行偶联反应，得到活化的中间体(式20)，然后该中间体进一步与四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(式19)偶联反应，最终制备得到五种多功能近红外荧光磁性纳米微粒(分别简称PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-5)，如反应式VI所示。
步骤(7)中，碱性条件采用三乙胺，所述溶剂为二甲基亚砜。
步骤(8)中，所述溶剂为二甲基亚砜，反应条件为在室温并氩气下搅拌16～24小时。
上述具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒在制备用于治疗阿茨海默症的药物中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明的近红外荧光磁性纳米微粒，能够汇集两个诊断方法即近红外荧光和核磁共振成像的优点，能提高诊断的效率和精准度。
(2)本发明的近红外荧光磁性纳米微粒，不仅能作为诊断试剂，而且能作为药物应用于阿茨海默症。
(3)本发明的近红外荧光磁性纳米微粒能够应用于跟踪阿茨海默症的治疗，这样能更好的了解阿茨海默症的治疗过程以及它的发病机理。
(4)本发明的近红外荧光磁性纳米微粒集诊断和治疗于一起，具有克服诊断试剂和治疗药物分开使用而造成的生物分布和选择性差异的潜力。
(5)本发明的近红外荧光磁性纳米微粒，可以通过一个外部磁场帮助到达目标区域，并可以被保持到治疗完成。
附图说明
图1为红外光谱，其中A是四氧化三铁的DPA-PEG-NH2纳米微粒，B是多功能近红外荧光磁性纳米微粒(PH-1)。
图2为四氧化三铁的DPA-PEG-NH2纳米微粒和多功能近红外荧光磁性纳米微粒的透射电子显微镜图。
图3为Aβ聚集体染色。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：合成10-甲基-10H-吩噻嗪-3-甲醛(即化合物2，其中R为H)
称取NaH(60％纯度，1.0克，25.1毫摩尔)，在冰水浴中缓慢加入有DMF(10毫升)的50毫升圆底瓶中，随后加入碘甲烷(1.3g，11.04毫摩尔)和化合物吩噻嗪(2克，10.0毫摩尔)，转移至室温搅拌2h，TLC监测反应结束后，加水，用DCM萃取(50毫升x3)，硫酸镁干燥后再浓缩干，经硅胶柱分离得到化合物1(R为H)，即10-甲基-10H-吩噻嗪(2.1克)，白色固体，熔点:96℃,收率97％。
1H NMR(400MHz,(CD3)2CO)δ7.21(td,J＝8.0,1.5Hz,2H),7.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.14(d,J＝1.5Hz,1H),6.96-6.93(m,4H),3.39(s,3H).
在0°摄氏度的冰水浴中，将三氯氧磷(1.98克，1.18毫升，12.9毫摩尔)缓慢滴加在有干燥DMF(904L，11.73毫摩尔)的25毫升圆底瓶中，搅拌0.5h后，加入溶在5毫升DCM的化合物1(R为H)(500毫克，2.34毫摩尔)，将反应体系升温至回流7h。TLC监测反应结束后，加水，用DCM萃取(50毫升x3)，硫酸镁干燥后再浓缩干，经硅胶柱分离得到产物10-甲基-10H-吩噻嗪-3-甲醛(320毫克，1.33毫摩尔)，黄色固体，熔点:106℃，收率56.8％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.78(s,1H),7.64(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),7.59(d,J＝2.0Hz,1H),7.17(td,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.11(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),6.97(t,J＝7.5Hz,1H),6.85(d,J＝7.5Hz,1H),6.82(d,J＝7.5Hz,1H),3.41(s,3H).
实施例2:合成8-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪-3-甲醛(即化合物2，R为Cl)
参照实施例1第一步操作过程，分离得产物化合物1(R为Cl)，即2-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪，白色固体，熔点：75℃，收率97％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(td,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.12(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),6.99(d,J＝8.5Hz,1H),6.94(t,J＝7.5Hz,1H),6.88(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),6.78(d,J＝8.5Hz,1H),6.73(d,J＝2.0Hz,1H),3.29(s,3H).
参照实施例1第二步操作过程，分离得产物8-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪-3-甲醛，黄色固体，熔点：160℃，收率38％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.16(td,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.11(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.01(d,J＝8.2Hz,1H),6.93(td,J＝7.6,1.4Hz,1H),6.88(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.8(d,J＝8.2Hz,1H),6.75(d,J＝2.0Hz,1H),3.35(s,3H).
实施例3:合成(E)-3-(10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)丙烯醛(即化合物3，R为H)
将饱和的碳酸钾溶液(15毫升)加入到溶有三(3,6-二氧杂庚基)胺(TDA-1)(738毫克，2.28毫摩尔，1.1当量)的DCM(10毫升)中，然后按顺序加入(1,3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化膦(1.43克，3.32毫摩尔，1.6当量)和化合物2(500毫克，2.07毫摩尔，1当量)。反应体系升温至回流状态搅拌约20h，TLC监测反应结束后，先用(DCM 2x25毫升)萃取，先再用食盐水清洗，有机相用硫酸镁干燥后浓缩干，在0摄氏度下加入20毫升的THF和10％的HCl(20毫升)，室温搅拌1h。将反应体系在0摄氏度冰水浴中用10％的NaOH调节pH至7，再用DCM(2x25毫升)和水萃取，最后用饱和食盐水和硫酸镁干燥后浓缩干，经硅胶柱分离得到产物即化合物3(R为H)(490毫克)，橘黄色固体，熔点：129℃，收率是88.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.61(d,J＝8.0Hz,1H),7.65-7.29(m,3H),7.17(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.12(dd,J＝7.5,1.0Hz,1H),6.95(td,J＝7.5,1Hz,1H),6.82(d,J＝8.5Hz,1H),6.72(d,J＝8.5Hz,1H),6.56(q,J＝7.8Hz,1H),3.38(s,3H).
实施例4:合成(E)-3-(8-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)丙烯醛(即化合物3，R为Cl)
化合物2(R为Cl)(500毫克，1.81毫摩尔)，参照实施例3操作过程，分离得产物即化合物3(R为Cl)(502毫克)，橘黄色固体，熔点：145℃，收率91％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.62(d,J＝7.5Hz,1H),7.36-7.29(m,3H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.93(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.8(d,J＝8.5Hz,1H),6.78(d,J＝2.0Hz,1H),6.57(q,J＝7.8Hz,1H),3.39(s,3H).
实施例5:合成2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)乙酸叔丁酯(即化合物5，n＝1)
将甘氨酸乙酯盐酸盐(500毫克，3毫摩尔，1当量)加入到溶有2,2'–(硫代羰基(硫))二乙酸(813毫克，3.6毫摩尔，1.2当量)的异丙醇(4毫升)中，然后再往体系中滴入Et3N(1毫升，7.2毫摩尔，2eq)。将反应体系加热至82°摄氏度，搅拌1h。TLC监测反应结束后，浓缩干后，经硅胶柱分离得到产物即化合物5(504毫克)，白色固体，熔点：57℃,收率68％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.59(s,2H),4.04(s,2H),1.44(s,9H).
实施例6:合成2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)丙酸叔丁酯(即化合物5，n＝2)
3-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(500毫克，2.76毫摩尔，1当量)和2,2'–(硫代羰基(硫))二乙酸(749毫克，3.15毫摩尔，1.2当量)，参照实施例5操作过程，分离得产物即化合物5(467毫克)，白色固体，熔点：52℃,收率62％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.22(t,J＝7.5Hz,2H),3.95(s,2H),2.58(t,J＝7.5Hz,2H),1.22(s,9H).
实施例7:合成(E)-2-(5-((10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸叔丁酯(即化合物6)
称取化合物2(R为H)(229毫克，0.95毫摩尔，1当量)和化合物5(n＝1)(258.7毫克，1.05毫摩尔，1.1当量)分别溶于DCM(1.5毫升)中混合均匀。在反应体系中滴加哌啶(231微升，3当量)，室温下搅拌3h，TLC监测反应结束后，用10％的HCl调节pH至7。有机相用饱和食盐水清洗，硫酸镁干燥后再浓缩干，经硅胶柱分离得到产物即化合物6(350毫克)，红色固体，熔点：132℃，收率78.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(s,1H),7.3(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.17(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.12(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),6.96(t,J＝7.5Hz,1H),6.83(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),4.73(s,2H),3.40(s,3H),1.44(s,9H)；471.2[M+H]+。
实施例8:合成(E)-2-(5-((10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸(即化合物7)
称取化合物6(200毫克，0.43毫摩尔)溶于3毫升DCM中，滴加600微升三氟乙酸，在室温下搅拌2h，反应体系中有红色固体析出。TLC监测反应结束后，浓缩干燥后采用重结晶的方法得到纯净的化合物7(161毫克)，红色固体，熔点：253℃，收率是92％。
1H NMR(400MHz,(CD3)2CO)δ7.71(s,1H),7.52(dd,J＝8.5,2Hz,1H),7.4(d,J＝2Hz,1H),7.25(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.17(dd,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.13(d,J＝8.5Hz,1H),7.05-7.00(m,2H),4.87(s,2H),3.48(s,3H)；ESI-MS m/z:415.1[M+H]+。
实施例9:合成(E)-2-(5-((10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)丙酸叔丁酯(即化合物8)
化合物2(R为H)(100毫克，0.42毫摩尔，1当量)和2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)丙酸叔丁酯(119毫克，0.46毫摩尔，1.1当量)，参照实施例7操作过程，分离得产物即化合物8(160毫克)，红色固体，熔点：182℃，收率80％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(s,1H),7.29(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.2(d,J＝2.0Hz,1H),7.17(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.12(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.97(t,J＝7.5Hz,1H),6.84-6.80(m,2H),4.36(t,J＝7Hz,2H),3.39(s,3H),2.65(t,J＝7.5Hz,2H),1.42(s,9H)；ESI-MS m/z:485.1[M+H]+。
实施例10:合成(E)-2-(5-((10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚甲基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)丙酸(即化合物9)
化合物8(200毫克，0.43毫摩尔)，参照实施例8操作过程，分离得产物即化合物9(161毫克)，红色固体，熔点：250℃，收率是92％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.51(bs,1H),7.72(s,1H),7.48(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.42(d,J＝2.0Hz,1H),7.25(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.19(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.11(d,J＝8.5Hz,1H),7.05-6.99(m,2H),4.22(t,J＝7.0Hz,2H),3.38(s,3H),2.62(t,J＝7.5Hz,2H)；ESI-MS m/z:429.1[M+H]+。
实施例11:合成2-(5-(10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸叔丁酯(即化合物10，R为H)
化合物3(R为H)(300毫克，1.12毫摩尔，1当量)和2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)乙酸叔丁酯(304毫克，1.23毫摩尔，1.1当量)，参照实施例7操作过程，分离得产物即化合物10(R为H)(357毫克)，红色固体，熔点：202℃，收率68％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝12.0Hz,1H),7.32-7.26(m,2H),7.17(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.12(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.99-6.91(m,2H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),6.76(d,J＝8.0Hz,1H),6.58(dd,J＝11.0,11.0Hz,1H),4.70(s,2H),4.38(s,3H),1.44(s,9H)；ESI-MS m/z:497.2[M+H]+。
实施例12:合成2-(5-(8-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸叔丁酯(即化合物10，R为Cl)
化合物3(R为Cl)(270毫克，0.9毫摩尔，1当量)和2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)乙酸叔丁酯(250毫克，0.99毫摩尔，1.1当量)，参照实施例7操作过程，分离得产物即化合物10(R为Cl)(250毫克)，红色固体，熔点：202℃，收率52.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝12.0Hz,1H),7.29(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.26(d,J＝1.5Hz,1H),7.01(d,J＝12.0Hz,1H),6.92(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.77(d,J＝2.0Hz,1H),6.61(m,2H),6.57(dd,J＝11.0,11.0Hz,1H),4.74(s,2H),3.36(s,3H),1.44(s,9H)；ESI-MS m/z:531.1[M+H]+。
实施例13:合成2-(5-(10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸(即化合物11,R为H)
化合物10(R为H)(198毫克，0.4毫摩尔)，参照实施例8操作过程，分离得产物即化合物11(R为H)(168毫克)，红色固体，熔点：246℃，收率是95％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.62(d,J＝3.5Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(dd,J＝8.0,3.5Hz,1H),7.32(d,J＝15.0Hz,1H),7.23(t,J＝7.0Hz,1H),7.18(dd,J＝8.0,3.5Hz,1H),7.07(dd,J＝15.0,15.0Hz,1H),7.05-6.95(m,3H),4.69(s,2H),3.35(s,3H)；ESI-MS m/z:441.1[M+H]+。
实施例14:合成2-(5-(8-氯-10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)乙酸(即化合物11，R为Cl)
化合物10(R为Cl)(150毫克，0.28毫摩尔)，参照实施例8操作过程，分离得产物即化合物11(R为Cl)(121毫克)，红色固体，熔点：246℃，收率是90％。
1H NMR(400MHz,(CD3)2CO)δ7.58-7.51(m,3H),7.30(d,J＝15.0,1H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.08-6.98(m,4H),4.84(s,2H),3.86(s,3H)；ESI-MS m/z:475.1[M+H]+。
实施例15:合成2-(5-(10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基)丙酸叔丁酯(即化合物12)
化合物3(R为H)(100毫克，0.37毫摩尔,1当量)和2-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)丙酸叔丁酯(108毫克，0.41毫摩尔，1.1当量)参照实施例7操作过程，分离得产物即化合物12(118毫克)，红色固体，熔点：202℃，收率是62％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝12.0Hz,1H),7.32-7.28(m,2H),7.19(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.14(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.00-6.92(m,2H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.59(dd,J＝13.0,13.0Hz,1H),4.35(t,J＝7.5Hz,1H),3.40(s,2H),2.66(t,J＝7.5Hz,1H),1.44(s,9H)；ESI-MS m/z:511.2[M+H]+。
实施例16:合成2-(5-(10-甲基-10H-吩噻嗪-3-基)亚烯丙基)-4-氧代-2-硫代四氢噻吩-3-基))丙酸(即化合物13)
化合物12(100毫克，0.2毫摩尔)参照实施例8操作过程，分离得产物即化合物13(77.5毫克)，红色固体，熔点：267℃，收率是87％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.4(s,1H),7.62(d,J＝3.5Hz,1H),7.52-7.46(m,2H),7.29(d,J＝15.0Hz,1H),7.23(t,J＝8.0Hz,1H),7.18(dd,J＝8.0,3.5Hz,1H),7.06-6.95(m,4H),4.19(t,J＝8.0Hz,2H),3.23(s,3H)2.60(t,J＝8.0Hz,2H).ESI-MS m/z:455.1[M+H]+。
实施例17:合成DPA-PEG-NH2(即化合物17)
聚乙二醇(10.0克，5.0毫摩尔)，2-溴乙酰氯(1.75毫升，20.0毫摩尔)和三甲胺(2.8毫升，20毫摩尔)溶解在20毫升二氯甲烷中。将该溶液在室温,在氩气下搅拌过夜。得到的BBrAc-PEG(即化合物14)在乙醚中沉淀，过滤该固体并溶解在NaCl溶液(35％)中，然后用二氯甲烷萃取并用二乙醚沉淀，得到6.2克所需产物，收率为62％。
1H-NMR(400MHz；CDCl3):δ3.61-3.68(234H,-O-CH2-CH2-O-),4.11(4H,s,–CH2-Br),4.34(4H,t,–CH2-COO-).
BBrAc-PEG(6克，2.68毫摩尔)溶于250毫升二氯甲烷，然后多巴胺氢溴酸盐(0.69克，2.94毫摩尔)，KI(0.22克，1.34毫摩尔)和K 2CO 3(1.29克，9.37毫摩尔)加入到该溶液并在室温下氩气流下搅拌过夜。过滤除去不溶性化合物，将滤液用二乙醚沉淀。过滤该固体并溶解在NaCl溶液(35％)中，用二氯甲烷萃取以重新沉淀，得到5.62克所需产物DPA-PEG-BrAc(即化合物15)，收率为75％。
1H-NMR(400MHz；CDCl3):δ2.69(2H,t,-CH2-CH2N-),2.90(2H,t,–Ph-CH2-CH2-),3.5-3.7(234H,-O-CH2-CH2-O-),4.09(2H,s,–CH2-Br),4.25(4H,t,–CH2-COO-),6.54(1H,d,Ph),6.74(2H,m,Ph).
DPA-PEG-BrAc(5.00克，2.09毫摩尔)和N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(0.39克，2.5毫摩尔)溶解于二氯甲烷(250毫升)。然后，KI(0.42克，2.5毫摩尔)和K2CO3(1.46克，10.45毫摩尔)加入该溶液并在氩气室温下搅拌过夜。在真空下蒸干溶剂,然后加入乙醚进行沉淀，过滤该固体并溶解在NaCl溶液(35％)中，用二氯甲烷萃取，并用水洗涤。将有机相收集，干燥，蒸干溶剂，加入二乙醚，过滤得到3.79克所需产物DPA-PEG-NHBoc(即化合物16)，收率为76％。
1H-NMR(400MHz；CDCl3):δ1.44(9H,s,t-Bu),2.72(2H,t,–CH2-CH2N-),2.84(2H,t,–Ph-CH2-CH2),2.92(2H,t,–CH2-CH2-NHBoc),3.21(2H,t,-CH2-NHBoc),3.53-3.76(234H,-O-CH2-CH2-O-),4.24(4H,s,Ph-CH2-CH2-NHCH2-,–CH2-NH-CH2-CH2-NHBoc),4.46(4H,t,-CH2-COO-),6.55(1H,d,Ph),6.80(2H,m,Ph).
DPA-PEG-NHBoc(1.0克，0.04毫摩尔)溶解在20毫升二氯甲烷中，然后加入1.5毫升三氟乙酸并在室温下搅拌1小时。蒸干溶剂，产物(DPA-PEG-NH2)用二氯甲烷洗涤并在乙醚沉淀，过滤得到993毫克所需产物DPA-PEG-NH2(即化合物17)，收率为96％。
1H-NMR(400MHz；CDCl3):δ2.71(2H,t,–CH2-CH2N-),2.85(2H,t,–Ph-CH2-CH2),2.86(2H,t,–CH2-CH2-NH2),2.91(2H,t,-CH2-NH2),3.51-3.60(234H,-O-CH2-CH2-O-),4.26(2H,s,Ph-CH2-CH2-NHCH2-,2H of–CH2-NH-CH2-CH2-NH2),4.46(4H,t,-CH2-COO-),6.55(1H,d,Ph),6.80(2H,m,Ph),7.80(2H,bs,NH2)
实施例18:合成多功能近红外荧光磁性纳米微粒(即化合物PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-5)
三乙酰丙酮铁(III)(2.12克，6.0毫摩尔)溶解在苄基醚和油胺(30/30毫升)的混合溶液中，用磁搅拌器搅拌。该溶液在氩气和120℃下,使用Dean-Stark装置脱水。1小时之后，将温度迅速升至270℃，在氩气下搅拌2小时。将反应混合物冷却到室温，然后加入乙醇(80毫升)到该暗褐色混合物中，用离心机(5000rpm)进行沉淀。所得产物再分散在正己烷(30毫升)，并储存在4℃，得1.15克四氧化三铁纳米颗粒(即化合物18)，收率为54.3％。
将四氧化三铁纳米颗粒(0.2克，0.86毫摩尔)分散在二氯甲烷中，加入DPA-PEG-NH2(1克)并在室温氩气下搅拌过夜。然后，用超声处理分钟并加入二氯甲烷/己烷(1：5)混合溶剂，产物四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(即化合物19)用离心机(4000rpm)沉淀收集得到630毫克，其结构用红外光谱鉴定。最后，将深褐色固体再分散在20毫升乙醇中。如图1所示，A是四氧化三铁的DPA-PEG-NH2的红外光谱。
二环己基碳二亚胺(55毫克，0.26毫摩尔)，荧光探针(即化合物7、化合物9、化合物11(R＝H)、化合物11(R＝Cl)或化合物13)(0.24毫摩尔)和N-羟基琥珀酰亚胺(31毫克，0.26毫摩尔)溶解在1毫升二甲基亚砜中。然后，加入三甲胺(35微升,0.24毫摩尔)到该溶液中并在氩气室温下搅拌过夜。加入己烷使其沉淀，再用乙醚洗涤,得到0.16毫摩尔中间体(即化合物20)，收率为67％。
将四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(20毫克)分散在DMSO中，然后加入三乙胺(2.5微升,0.018毫摩尔)。另外，将中间体(0.006毫摩尔)溶解在0.2毫升DMSO中。这两种溶液混合并在氩气室温下搅拌过夜。加入乙醚，用离心方法收集固体微粒，并用去离子水洗涤得到26毫克多功能近红外荧光磁性纳米微粒(即化合物PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-5)，其结构用红外光谱鉴定，如图1所示，B是多功能近红外荧光磁性纳米微粒PH-1的红外光谱。
如图2所示，透射电子显微镜显示，PH-1和PH-4纳米微粒平均大小分别是9.47±2.09nm、10.03±3.2nm。
测试例1：多功能近红外荧光磁性纳米微粒的吸收和发射性能
吸收光谱和发射波长是用多模式分光光度计(多功能酶标仪spectramaxParadigm，旧金山，加利福尼亚，美国)测试。
如表1所示，所有化合物最大吸收和荧光发射光谱值分别在470～480nm和640～650nm之间，因此这些磁性纳米微粒作为近红外荧光探针，可以用于Aβ斑块成像。
表1：多功能近红外荧光磁性纳米微粒的吸收和荧光发射波长
测试例2:Aβ聚集体染色
在37℃下，Aβ1-42在PBS溶液中搅拌3天，聚和成Aβ的聚集体。在96孔板加入20微摩尔Aβ聚集体和1微摩尔的ThT，PH-1或PH-4进行染色，10分钟之后，使用荧光显微镜(OlympusIX71 invertedfluorescence显微镜)检查，如图3所示,结果显示PH-1或PH-4能对Aβ聚集体进行非常好的染色。
测试例3：Kd值测试和β-淀粉样蛋白的自聚集抑制活性测试
采用Aβ(1–42)聚集体固定浓度为1微摩尔和不同浓度的多功能近红外荧光磁性纳米微粒(PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-5)结合。荧光信号检测是根据各自化合物的激发/发射光谱。Kd值采用Grafpad Prism软件计算确定，结果如表2所示。
β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)冻干粉溶解于六氟异丙醇，室温静置16个小时进行解聚，再在室温下用氮气流吹除六氟异丙醇，得解聚的Aβ1-42用DMSO溶解配制成浓度为200微摩尔溶液，用荧光法测定化合物的Aβ自聚集抑制活性。反应总容量为10微升，内含样品的DMSO溶液5微升(浓度为200微摩尔)，解聚的Aβ1-42DMSO溶液5微升(浓度为200微摩尔)，在37℃保温72h后加入硫黄素T的磷酸二氢钾缓冲液(PH＝7.4)溶液40微升(浓度为200微摩尔)，在paradigm微孔板检测仪上读取荧光值，激发波长为485nm，发射波长下为435nm。所有样品均平行测三次，以未加化合物的测定组吸光度作为100％，测定的化合物组荧光值与未加化合物组相比较，降低的百分率即为在20微摩尔浓度下Aβ自聚集抑制率。得到的测试结果如表2所示。
表2：近红外荧光纳米微粒与Aβ自聚集体的结合常数和抑制率
a20微摩尔
从表2所示的化合物于Aβ(1-42)自聚体的结合能力测试结果来看，这类近红外荧光磁性纳米微粒具有与Aβ自聚体很强的结合能力，最强的其Kd值为17.9ng/mL。另外，在体外化合物与β-淀粉样蛋白的自聚集抑制活性测试中显示，所有化合物对Aβ1-42的自聚集具有较好的抑制作用，它们的抑制作用都比对照物姜黄素要强，特别是PH-5，其IC50仅为9.9ng/mL，而同等条件下，姜黄素在20微摩尔浓度下的抑制强度仅为41％。因此，这类近红外荧光磁性纳米微粒同样可以用于治疗抗阿茨海默症。

Claims (5)

1.一种具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒，其通式为：
其中，m为整数1或2；n为整数1或2；o为整数1或2；R为氢或氯。
2.一种权利要求1所述的具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)化合物2、化合物3的制备：在氢化钠碱性条件下，化合物0(式0)与碘甲烷在DMF中室温下反应生成化合物1(式1)；在氩气保护下,化合物1与三氯氧磷在DMF中反应回流10～20小时，得到接有一个醛基的化合物2(式2)；以三(3,6-二氧杂庚基)胺为相转移催化剂，碳酸钾为碱性介质，以二氯甲烷为反应溶剂，化合物2与(1,3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化瞵回流反应20～30小时，经柱层析或重结晶提纯后，得到化合物3(式3)；如反应式I所示；其中，R为氢或氯；
(2)化合物5的制备：以异丙醇为溶剂，以三乙基胺为碱性条件下，化合物4(式4)与2,2'–(硫代羰基(硫))二乙酸发生缩合反应，然后通过柱层析法提纯，得到化合物5(式5)；如反应式II所示；其中，m为整数1或2；
(3)化合物7、化合物9的制备：该步骤的反应均以二氯甲烷为溶剂，化合物2与化合物5进行Knoevenagel缩合反应，其中化合物5结构式中m＝1，采用piperidine为碱性介质，在常温下反应2～5小时，通过柱层析法提纯，得到化合物6(式6)，然后在常温和三氟乙酸酸性条件下，化合物6进行脱脂反应，重结晶后得到化合物7(式7)；用同样的实验条件，化合物2与化合物5进行Knoevenagel缩合反应，其中化合物5结构式中m＝2，可以得到化合物8(式8)，化合物8进行脱脂反应，重结晶后得到化合物9(式9)；如反应式III所示；
(4)化合物11、化合物13的制备：该步骤的反应均以二氯甲烷为溶剂，化合物3与化合物5进行Knoevenagel缩合反应，其中化合物5结构式中m＝1，采用piperidine为碱性介质，在常温下反应2～5小时，通过柱层析法提纯，得到化合物10(式10)，然后在常温和三氟乙酸酸性条件下，化合物10进行脱脂反应，重结晶后得到化合物11(式11)；用同样的实验条件，化合物3与化合物5进行Knoevenagel缩合反应，其中化合物5结构式中m＝2，可以得到化合物12(式12)，化合物12进行脱脂反应，重结晶后得到化合物13(式13)；如反应式IV所示；
(5)在三乙胺的碱性条件下，聚乙二醇(PEG)与溴乙酰氯反应，得到BBrAc-PEG(式14)；然后BBrAc-PEG在KI/K2CO3条件下，与等当量多巴胺进行取代反应，得到DPA-PEG-BrAc(式15)；同样在KI/K2CO3条件下，DPA-PEG-BrAc再与N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺进一步取代反应，得到DPA-PEG-NHBoc(式16)，随后采用TFA使DPA-PEG-NHBoc脱保护，得到DPA-PEG-NH2(式17)；如反应式V所示；
(6)四氧化三铁纳米颗粒的制备：先将三乙酰丙酮铁(III)溶解在苄基醚和油胺的混合溶液中，在氩气和120～130℃下脱水，1～2小时后，将温度迅速升至270～300℃，在氩气下搅拌2～4小时；然后将反应混合物冷却到室温，加入乙醇到反应混合物中，用离心机进行沉淀，得四氧化三铁纳米颗粒(式18)；
(7)四氧化三铁的DPA-PEG-NH2的制备：将四氧化三铁纳米颗粒分散在二氯甲烷中，然后加入DPA-PEG-NH2，在氩气、25℃下搅拌16～24小时，然后超声处理15～30分钟，用己烷沉淀，用离心方法收集得到四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(式19)；
(8)多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备：在二环己基碳二亚胺作为偶联剂和三乙胺作为碱存在条件下，化合物7、化合物9、结构式中R1为H的化合物11、结构式中R1为Cl的化合物11、化合物13在溶剂中分别与N-羟基琥珀酰亚胺进行偶联反应，得到活化的中间体(式20)，然后该中间体进一步与四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(式19)偶联反应，最终制备得到五种多功能近红外荧光磁性纳米微粒(分别简称PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-5)，如反应式VI所示：
3.根据权利要求2所述的具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，溶剂为二甲基亚砜。
4.根据权利要求2所述的具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，在中间体(式20)与四氧化三铁的DPA-PEG-NH2(式19)偶联反应中，溶剂为二甲基亚砜，反应条件为在室温并氩气下搅拌16～24小时。
5.一种权利要求1所述的具有多功能近红外荧光磁性纳米微粒的应用，是其特征在于：在制备用于治疗阿茨海默症的药物中的应用。
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