CN111886226B - 化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂 - Google Patents

化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN111886226B
CN111886226B CN201980020930.4A CN201980020930A CN111886226B CN 111886226 B CN111886226 B CN 111886226B CN 201980020930 A CN201980020930 A CN 201980020930A CN 111886226 B CN111886226 B CN 111886226B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gdl
cyclooxygenase
compound
present
inflammatory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980020930.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111886226A (zh
Inventor
张用敏
金姬冏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority claimed from PCT/KR2019/003353 external-priority patent/WO2019182395A1/ko
Publication of CN111886226A publication Critical patent/CN111886226A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111886226B publication Critical patent/CN111886226B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
    • A61K49/106—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA
    • A61K49/108—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA the metal complex being Gd-DOTA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/085—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier conjugated systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/244—Lanthanides; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

在本发明的化合物、包括其的抗炎剂、环氧化酶‑2抑制剂、脑疾病治疗剂、以及MRI造影剂中，本发明的化合物具有由本发明的化学式1表示的结构。

Description

化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂
技术领域
本发明涉及一种具有新结构的化合物、更具体而言，涉及一种具有较高的自弛豫率并能靶向治疗炎症部位，同时，能够诊断及治疗炎症靶向的具有新结构的化合物、包括其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂。
背景技术
炎症介质是在疼痛和炎症的发生、传播及持续中起重要致病性作用的因子，作为主要的炎症介质有前列腺素(prostagalandin)。
非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是通过阻断参与前列腺素的生物合成的环氧化酶(COX)而用于患有疼痛和炎症的急性及慢性疾病的物质。通常，NSAID通过阻断环氧化酶中的环氧化酶-1(COX-1)、环氧化酶-2(COX-2)来阻断花生四烯酸的前列腺素的合成，来起减轻疼痛及缓解炎症的作用。
但是，平时COX-2很少表达，而一部分因有害刺激而发生的炎症反应被迅速诱导表达并参与炎症反应，但COX-1的大部分组织被表达并参与维持正常的细胞作用，从而，负责维持胃肠道粘膜的保护、血管的稳态、血小板的聚集、维持肾功能等的稳态，所以，抑制COX-1会引起在胃肠道及心血管发生的胃肠到出血、心血管类血清反应、心肌梗塞、脑中风等的副作用。
因此，为了避免这种异常反应，需要能够选择性地仅抑制由炎症反应表达而持续及恶化炎症反应的COX-2的抗炎物质，但是，现有的大部分NSAID都抑制COX-1及COX-2，因此，还需要研发对COX-2显示选择性抑制特性的新型抗炎物质。
发明内容
本发明的一目的在于，提供一种具有新结构的化合物。
本发明的其他目的在于，提供一种包括所述化合物的抗炎剂。
本发明的其他另一目的在于，提供一种包括所述化合物的环氧化酶-2(cox-2)。
作为一侧面，本发明提供一种化合物，其具有由下述化学式1表示的结构。
[化学式1]
在所述化学式1中，
Linker表示*-(CH2)x-A-(CH2)y-*，
x及y分别独立地表示0至5中的一个整数，
A表示*-COO-*、*-CO-*、*-CONH-*或*-O-*，
X表示
或
所述化学式1由化学式2、3或4表示。
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
所述化合物靶向炎症部位，并具有炎症部位的靶向诊断及抗炎活性。
尤其，化学式1、2、3的化合物在炎症部位通过选择性地抑制环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)来具有抗炎活性。
尤其，化学式3及4的化合物，所述化合物在脑炎部位靶向诊断并具有抗炎活性。
所述化合物在1.5T的磁共振成像(magnetic resonance image,MRI)中呈现出4mM-1s-1至5mM-1s-1的自弛豫度。
所述化合物与一个以上的水分子配位。
作为另一侧面，本发明提供一种抗炎剂，其中，包括具有由下述化学式1表示的结构的化合物，靶向炎症部位，在炎症部位具有抗炎活性。
所述化学式1由化学式2、3及4表示。所述化学式的化合物在炎部位选择性地抑制环氧化酶-2。在环氧化酶-1及环氧化酶-2中仅选择性地抑制环氧化酶-2。
尤其，在化学式3及4的脑炎部位具有靶向及抗炎活性。
作为其他另一侧面，本发明提供一种MRI造影剂，其中，其包括具有由化学式1表示的结构的化合物，在1.5T的磁共振成像中呈现出4mM-1s-1至5mM-1s-1的自弛豫度。
所述化合物由化学式2、3及4表示。
尤其，包括由化学式3及4表示的化合物的造影剂，其中，所述造影剂特异性地靶向脑梗塞部位增强信号。
作为其他另一侧面，本发明提供一种脑炎疾病治疗剂，其中，其包括具有由化学式1表示的结构的化合物，脑炎疾病为痴呆症。所述痴呆症可为脑血管性痴呆症或退化性痴呆症。环氧化酶-2(COX-2)作为炎症因子表达脑血管性痴呆或退化性痴呆，是一种恶化病状的因子。
[化学式1]
在所述化学式1中，
Linker表示*-(CH2)x-A-(CH2)y-*，
x及y分别独立地表示0至5中的一个整数，
A表示*-COO-*、*-CO-*、*-CONH-*或*-O-*，
X表示
所述化学式1由下述化学式3及4表示。
[化学式3]
[化学式4]
发明效果
根据本发明的化合物、包括其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂，本发明可以提供化合物，所述化合物靶向炎症部位，在炎症部位具有抗炎活性，并且具有自弛豫特性，从而能够靶向诊断炎症部位。本发明的化合物显示出相比于现有的临床MRI造影剂更高的自弛豫率，并具有优秀的运动稳定性，特别是，相比于现有造影剂更长时间增强炎症部位的信号强度，从而，可用作具有能够对炎症部位靶向诊断的优秀的特性的造影剂。另外，本发明的化合物在炎症部位可以选择性地抑制环氧化酶-2的活性，从而，可以用作环氧化酶-2选择性抑制剂，而且，通过抑制环氧化酶-2可现实有效的抗炎活性，因此，可用作具有优秀的抗炎活性的抗炎剂。因此，本发明的化合物可以靶向诊断包括风湿性关节炎等在内的炎症疾病的炎症部位的同时，还可以治疗的抗炎剂及环氧化酶(COX-2)选择性抑制剂。
附图说明
图1为用于说明本发明化合物的运动稳定性的图。
图2a及2b为用于说明本发明的化合物的炎症靶向能力评价结果的图。
图2c为用于说明商用造影剂的炎症靶向能力评价结果的图。
图2d为用于说明本发明的化合物及商用造影剂的炎症靶向能力结果的对比度噪声比(CNR)图表。
图3为用于说明本发明化合物的抗炎特性的图。
图4为用于说明本发明化合物的环氧化酶-2的选择性抑制特性的图。
图5a为对脑炎疾病中的急性脑卒中或血管性痴呆症的动物实验结果，图5b为对因缺血性脑卒中而引起的脑梗塞(cerebral infarction)的实验结果，图5c为通过免疫印记法(western blot)确认缺血性脑卒中引起的脑梗塞部位组织中表达的作为炎症因子的环氧化酶-2的蛋白量的结果。
图6为示出在大脑皮层神经细胞中本发明的GdL(6)和GdL(14)及现有物质即二氟尼柳(diflunisal)及舒林酸(sulindac)中的细胞生存能力实验结果。
图7为示出在脑卒中动物模型中GdL(6)和GdL(14)在缺血部位的信号均增加的结果。
图8为示出本发明的3个物质GdL(6)、GdL(10)、GdL(14)与作为比较物质的二氟尼柳(diflunisal)、芬布芬(fenbufen)、舒林酸高(sulindac)的环氧化酶-2靶向亲和性结果。
具体实施方式
以下，参照附图，详细说明本发明的实施例。本发明可进行多种变更并可具有多种形态，在附图例示特定实施例并在说明书中对其进行详细说明。但是，需要理解的是，这并不将本发明限定于特定的公开方式，而是包含本发明的思想及技术范围中的所有变更、均等物或代替物。在说明各个附图的过程中，对于相似的结构要素使用相似的附图标记。
在本申请中所使用的术语仅用于说明特定实施例，并不限定本发明。除非在文脉上明确表示，则单数的表达包括复数的表达。在本申请中，“包括”或“具有”等的术语用于指定说明书上记载的特征、步骤、动作、结构要素、部件或组合的存在，而不是预先排除一个或一个以上的其他特征或步骤、动作、结构要素、部件或它们的组合的存在或附加可能性。
除非另行定义，包括技术术语或科学术语在内的在此使用的所有术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。通常使用的词典所定义的术语的含义与现有技术的文脉所具有的含义一致，除非在本申请中明确定义，则不应解释为过于理想或形式上的含义。
本发明的化合物具有由下述化学式1表示的结构。
化学式1
在所述化学式1中，Linker表示*-(CH2)x-A-(CH2)y-*，x及y分别独立地表示0至5中的一个整数，A表示*-COO-*、*-CO-*、*-CONH-*或*-O-*，
X表示在此情况下，*意味着结合部位。
在由所述化学式1表示的本发明的化合物中，钆(Gd)可与一个以上的水分子配位。在此情况下，在所述化合物中，钆还可与Linker A的氧原子形成配位键。
如一例，由所述化学式1表示的本发明的化合物可以为由下述化学式2表示的化合物。
化学式2
或者，由所述化学式1表示的本发明的化合物可以为由下述化学式3表示的化合物。
化学式3
本发明的化合物对炎症部位可具有靶向性，可在炎症部位呈现出抗炎效果。具体地，本发明的化合物可靶向炎症部位来抑制在炎症部位诱导的环氧化酶(cyclooxygenage，COX)的表达，由此，可阻断从环氧化酶诱导的花生四烯酸的前列腺素合成来呈现出阻断炎症反应的发生、传播及持续的抗炎活性。在此情况下，本发明的化合物在炎症部位具有针对环氧化酶-2(COX-2)的选择性抑制特性，因此，可防止均抑制环氧化酶-1(COX-1)及环氧化酶-2的现有的大多数非甾体抗炎止痛药(NSAIDs)所具有的胃肠道出血、穿孔或心血管疾病等的副作用。因此，本发明的化合物可用作环氧化酶-2选择性抑制剂或抗炎剂。
并且，本发明的化合物具有优秀的自弛豫特性。自弛豫特性意味着可在磁共振成像(magnetic resonance image，MRI)中呈现出造影增强的特性。磁共振成像为利用磁场中氢原子的自旋弛豫的现象来获取身体的解剖、生理、生化信息影像的方法，当进行磁共振成像测定时，通过注入外部物质来增加影像对比度，在此情况下，所使用的物质为造影剂(contrast agent)。组织中水分子核通过自旋回到平衡状态的弛豫作用因组织而异，因此，出现组织之间的对比度，造影剂对这种弛豫作用产生影响来扩大组织之间的弛豫差异，诱发磁共振成像信号变化，从而使组织之间的对比变得更明显。造影剂需具有高的热力学稳定性，具有水溶性，与至少一个水分子结合来具有与水的高的自弛豫特性。本发明的化合物可与至少一个水分子形成配位键，且具有自弛豫特性，因此，在人体内，与至少一个水分子结合来增加水分子中的氢原子弛豫率，从而可提高影像对比度。因此，本发明的化合物可用作磁共振成像用造影剂，在此情况下，本发明的化合物可以为在磁共振成像中使目标身体部位的影像信号相对增加的阳性造影剂。例如，本发明的化合物可在1.5T的磁共振成像中呈现出4mM-1s-1至5mM-1s-1的优秀的自弛豫度。
而且，如上所述，本发明的化合物可靶向炎症部位，本发明的化合物可用作靶向如类风湿关节炎的炎症疾病等的炎症部位来对其进行诊断的造影剂。并且，本发明的化合物可在炎症部位选择性抑制环氧化酶-2来呈现出抗炎活性，因此，可在诊断炎症部位的同时进行治疗。即，本发明的化合物可以为同时靶向炎症诊断/治疗的化合物，以靶向炎症部位来对其进行诊断，同时，具有炎症部位的抗炎活性而治疗炎症部位，由此，可通过包含本发明的化合物来提供可同时靶向炎症诊断及治疗的多功能性抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂。
以下，通过具体例来说明本发明的化合物及其制备方法以及包含本发明的化合物的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂。
合成本发明的化合物
(1)合成配体
为了制备本发明的化合物，首先，合成了具有环形结构的配体。具体地，将三叔丁基2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetate)(5g，9.72mmol)溶解于160mL的乙腈(acetonitrile，ACN)后，添加碳酸氢钾(KHCO3)(2.96g，29.69mmol)，并搅拌30分钟。之后，添加溴乙酸乙酯(ethyl bromoacetate)(1.18mL，10.69mmol)，加热至60℃并反应24小时。接着，过滤未溶解的反应物，并去除反应物的所有溶剂。之后，溶解于二氯甲烷(DCM)后，通过过滤未溶解的反应物来去除反应物的所有溶剂，对其进行真空干燥来获取了略呈黄色的固体三叔丁基2,2',2”-(10-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(10-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetate)(以下，称为化合物(1))(收率：5.8g(99％))。
接着，将化合物(1)(3.2g，5.33mmol)溶解于7mL的甲醇(MeOH)后，添加6mL的乙二胺(ethylenediamine)，并在常温条件下反应了4天左右。之后，连接真空线来加热至约55℃并去除溶剂，从而获取了如油的固体。利用二乙醚(diethyl ether)对其进行数次清洗后进行真空干燥并溶解于甲醇。之后，过滤未溶解的反应物后，在二氯甲烷/甲醇条件下，通过开口柱色谱法获取了略呈黄色的固体三叔丁基2,2',2”-(10-(2-((2-氨乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(10-(2-((2-aminoethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetate，DO3At(Bu)3-NH2)(以下，称为化合物(2))(收率：1.87g(57％)。
上述化合物(1)及化合物(2)的合成反应如下述反应式1所示。
反应式1
在反应式1中，1表示化合物(1)，2表示化合物(2)。
(2)根据本发明实施例1的化合物：合成GdL(6)
首先，将二氟尼柳(Diflunisal)(3g，12mmol)溶解于40mL的四氢呋喃(THF)，并添加N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)后搅拌30分钟。接着，在4℃的温度条件下，将溶解于30mL的四氢呋喃的N，N'-二环己基碳二亚胺(N，N'-Dicyclohexylcarbodiimide，DCC)缓慢添加至反应物后，在常温条件下反应24小时。之后，过滤未溶解的反应物并去除所有溶剂后，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，99:1)分离纯化呈白色的固体2,5-二氧代吡咯烷-1-基2',4'-二氟-4-羟基-[1,1'-联苯基]-3-羧酸盐(2，5-dioxopyrrolidin-1-yl 2'，4'-difluoro-4-hydroxy-[1，1'-biphenyl]-3-carboxylate)(以下，称为化合物(3))(收率：2.36g(57％))。
接着，混合溶解于20mL的四氢呋喃的化合物(3)(2.36g，6.8mmol)与溶解于20mL的甲醇的化合物(2)(3.5g，5.7mmol)后，在常温条件下反应24小时。之后，去除所有溶剂后，在二氯甲烷/脱离子水条件下进行提取，利用硫酸钠(Na2SO4)对二氯甲烷层进行脱水后去除溶剂。接着，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，98:2)分离纯化白色固体三叔丁基2,2',2”-(10-(2-((2-(2',4'-二氟-4-羟基-[1,1'-联苯基]-3-甲酰胺乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(10-(2-((2-(2'，4'-difluoro-4-hydroxy-[1，1'-biphenyl]-3-carboxamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetate)(以下，称为化合物(4))(收率：2.7g(56％))。
之后，在0℃的温度条件下，将化合物(4)(2.5g，2.95mmol)溶解于二氯甲烷/三氟乙酸(TFA)(1:1，40mL)后，在常温条件下反应24小时。去除反应物的溶剂后，溶解于10mL的甲醇，并将其沉淀在200mL的二乙醚。过滤沉淀物后，通过使用制备高效液相色谱(prep.HPLC)来分离白色固体2,2',2”-(10-(2-((2-(2',4'-二氟-4-羟基-[1,1'-联苯基]-3-甲酰胺乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(2，2'，2”-(10-(2-((2-(2'，4'-difluoro-4-hydroxy-[1，1'-biphenyl]-3-carboxamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triaceticacid)(以下，称为化合物(5))。在此情况下，收率为1.91g(95％)。
接着，将化合物(5)(0.25g，0.368mmol)溶解于脱离子水(DI water)后，利用1M的NaOH来将溶液的pH值调节为3。之后，将氯化钆六水合物(GdCl3·6H2O)(0.15g，0.405mmol)溶解于1mL的水后缓慢添加。利用1M的NaOH来将反应物的pH值调节为7，在55℃的温度条件下，反应18小时。接着，去除溶剂后，通过利用制备高效液相色谱的分离纯化获取了白色固体的本发明实施例1的化合物(以下，称为GdL(6))(收率：0.21g(68％))。
本发明实施例1的化合物的合成反应如下述反应式2所示。
反应式2
在反应式2中，2表示化合物(2)，3表示化合物(3)，4表示化合物(4)，5表示化合物(5)，6表示GdL(6)。
(3)根据本发明实施例2的化合物：合成GdL(10)
并且，为了制备本发明实施例2的化合物，首先，将芬布芬(Fenbufen)(2.5g，9.83mmol)溶解于40mL的四氢呋喃后，添加N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，并搅拌30分钟。接着，在4℃的温度条件下，将溶解于30mL的四氢呋喃的二环己基碳二亚胺缓慢添加至反应物后，在常温条件下反应24小时。之后，过滤未溶解的反应物并去除所有溶剂后，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，99:1)分离纯化白色固体来获取2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-([1，1'-联苯基]-4-基4-氧代丁酸盐(2，5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-([1，1'-biphenyl]-4-yl)-4-oxobutanoate)(以下，称为化合物(7))(收率：1.65g(48％))。
之后，混合溶解于20mL的四氢呋喃的化合物(7)(1.95g，5.55mmol)与溶解于20mL的甲醇的化合物(2)(2.84g，4.63mmol)，并在常温条件下反应24小时。接着，去除所有溶剂后，在二氯甲烷/脱离子水条件下进行提取，利用Na2SO4对二氯甲烷层进行脱水后去除溶剂。之后，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，96:4)分离纯化白色固体来获取三叔丁基2，2'，2”-(10-(2-((2-(4-([1，1'-联苯基]-4-基)-4-恶丁胺)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(10-(2-((2-(4-([1，1'-biphenyl]-4-yl)-4-oxobutanamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetate)(以下，称为化合物(8))(收率：2.46g(51％))。
接着，在0℃的温度条件下，将化合物(8)(1.68g，1.98mmol)溶解于二氯甲烷/三氟乙酸(1:1，40mL)后，在常温条件下反应24小时。去除反应物的溶剂后，溶解于10mL的甲醇并沉淀在200mL的二乙醚。过滤沉淀物后，使用制备高效液相色谱来分离获取白色固体2，2'，2”-(10-(2-((2-(4-([1，1'-联苯基]-4-基)-4-恶丁胺)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸(2，2'，2”-(10-(2-((2-(4-([1，1'-biphenyl]-4-yl)-4-oxobutanamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetic acid)(以下，称为化合物(9))(收率：1.56g(94％))。
之后，将化合物(9)(0.25g，0.368mmol)溶于脱离子水后，利用1M的NaOH来将溶液的pH值调整为3。接着，将GdCl3 6H2O(0.15g，0.405mmol)溶解于1mL的水后缓慢添加，利用1M的NaOH将反应物的pH值调整为7，并在55℃的条件下反应18小时。接着，去除溶剂后，使用制备高效液相色谱分离纯化白色固体，从而获取本发明实施例2的化合物(以下，称为GdL(10)(收率：0.2g(65％))。
本发明实施例2的化合物的合成反应如下述反应式3。
反应式3
在反应式3中，2表示化合物(2)，7表示化合物(7)，8表示化合物(8)，9表示化合物(9)，10表示GdL(10)。
(4)比较化合物：合成GdL(14)
作为本发明的比较例，利用舒林酸(sulindac)制备比较化合物。具体地，将舒林酸(1.7g，4.77mmol)溶解于40mL的四氢呋喃并添加N-羟基丁二酰亚胺后，搅拌30分钟。将N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于30mL的四氢呋喃，在4℃的温度条件下向反应物缓慢添加后，在常温条件下反应24小时。接着，过滤未溶解的反应物并去除所有溶剂后，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，99:1)分离纯化黄色固体，从而获取2，5-二氧代吡咯烷-1-基(Z)-2-(5-氟代-2-甲基-1-(4-(甲基亚砜基)亚苄基)-1H-茚-3-基)乙酸盐(2，5-dioxopyrrolidin-1-yl(Z)-2-(5-fluoro-2-methyl-1-(4-(methylsulfinyl)benzylidene)-1H-inden-3-yl)acetate)(以下，称为化合物(11))(收率：1.17g(51％))。
之后，混合溶解于20mL的四氢呋喃的化合物(11)(2.5g，5.5mmol)与溶解于20mL的甲醇的化合物(2)(2.83g，4.6mmol)并在常温条件下反应24小时。接着，去除所有溶剂后，在二氯甲烷/脱离子水条件下进行提取，利用Na2SO4对二氯甲烷层进行脱水后去除溶剂，通过开口柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，96:4)分离纯化黄色固体，从而获取三叔丁基2，2'，2”-(10-(2-((2-(2-(5-氟代-2-甲基-1-(4-(甲基亚砜基)亚苄基)-1H-茚-3-基)乙酰胺基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)(Z)-三乙酸酯(tri-tert-butyl 2，2'，2”-(10-(2-((2-(2-(5-fluoro-2-methyl-1-(4-(methylsulfinyl)benzylidene)-1H-inden-3-yl)acetamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)(Z)-triacetate)(以下，称为化合物(12))(收率：2.46g(51％)。
接着，在0℃的温度条件下将化合物(12)(2.5g，2.95mmol)溶解于二氯甲烷/三氟乙酸(1:1，40mL)后，在常温条件下反应24小时。之后，去除反应物的溶剂后，溶解于10mL的甲醇并沉淀在200mL的二乙醚。接着，过滤沉淀物并使用制备高效液相色谱来分离获取黄色固体(Z)-2，2'，2”-(10-(2-((2-(2-(5-氟代-2-甲基-1-(4-(甲基亚砜基)亚苄基)-1H-茚-3-基)乙酰胺基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸((Z)-2，2'，2”-(10-(2-((2-(2-(5-fluoro-2-methyl-1-(4-(methylsulfinyl)benzylidene)-1H-inden-3-yl)acetamido)ethyl)amino)-2-oxoethyl)-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetic acid)(以下，称为化合物(13))(收率：0.45g(22％))。
之后，将化合物(13)(0.25g，0.368mmol)溶解于脱离子水后，利用1M的NaOH将溶液的pH值调整为3。将GdCl3·6H2O(0.15g，0.405mmol)溶解于1mL的水后缓慢添加，利用1M的NaOH将反应物的pH值调整为7，在55℃的温度条件下反应18小时，接着，去除溶剂后使用制备高效液相色谱分离纯化黄色固体，从而获取本发明比较例的化合物(以下，称为GdL(14))(收率：0.18g(58％))。
本发明的比较化合物GdL(14)的合成反应如下述反应式4所示。
反应式4
在反应式4中，2表示化合物(2)，11表示化合物(11)，12表示化合物(12)，13表示化合物(13)，14表示GdL(14)。
特性评价：自弛豫度
确认了根据本发明的实施例1及实施例2制备的本发明的多个化合物、GdL(6)及GdL(10)的自弛豫度(relaxivity)。
自弛豫度为将在磁共振成像(MRI)中造影剂所具有的造影增强程度数值化的值，将本发明的实施例1及实施例2的GdL(6)及GdL(10)和作为商用造影剂的溶解于磷酸缓冲溶液(PBS)(pH值为7.4)后，在常温(25℃)、1.5T条件下分别测定自弛豫率，对其进行比较来评价本发明的GdL(6)及GdL(10)的造影增强效果是否有效。在表1示出其结果。
表1
表1示出本发明实施例1及实施例2的GdL(6)及GdL(10)和商用造影剂的自弛豫率结果。
参照表1，可确认，本发明实施例1的GdL(6)的自弛豫率为r1＝4.54±0.20、r2＝4.63±0.30的值，本发明实施例2的GdL(10)的自弛豫率为r1＝4.95±0.19、r2＝4.69±0.17的值，作为比较组所测定的的自弛豫率为r1＝4.12±0.15、r2＝4.55±0.18的值。这意味着本发明的化合物、GdL(6)及GdL(10)呈现出比作为商用造影剂的/>更高的自弛豫率，从而，本发明的化合物具有足够高的自弛豫率，以能够有效地用作获取体内(invivo)磁共振成像的造影剂。即，可确认，本发明的化合物可用作优秀的造影剂。
特性评价：运动稳定性
并且，确认了本发明实施例1及实施例2的化合物、GdL(6)及GdL(10)的运动稳定性。可通过随着时间变化的自弛豫率确认GdL(6)及GdL(10)的运动稳定性，具体地，向分别溶解GdL(6)及GdL(10)的溶液添加氯化锌(ZnCl2)后，诱导钆与锌离子的金属转移(transmetallation)反应，并测定其自弛豫率来确认运动稳定性。在此情况下，在添加锌离子后，自弛豫率的变化越大，运动稳定性越不稳定。同时，与本发明的GdL(6)及GdL(10)一同评价4种商用造影剂( 及 )的运动稳定性，并与本发明的GdL(6)及GdL(10)进行比较。在图1示出其结果。
图1为用于说明本发明化合物的运动稳定性的图。
参照图1，可确认，本发明实施例1及实施例2的GdL(6)及GdL(10)表示4种商用造影剂中的与/>之间的自弛豫变化率。即，可确认，本发明的GdL(6)及GdL(10)呈现出相比于稳定性较低的线性结构的作为商用造影剂的/>及/>显著高的自弛豫变化率，并且还呈现出与稳定环结构的作为商用造影剂的/>及/>相似的高运动稳定性。
即，可确认，本发明的化合物呈现出优秀的运动稳定性。
特性评价：炎症靶向能力
针对本发明实施例1及实施例2的GdL(6)及GdL(10)的体内(in vivo)炎症靶向能力，通过大腿炎症动物模型中的体内磁共振成像实验确认并评价GdL(6)及GdL(10)的体内分布和炎症靶向功能，并与作为商用造影剂的的结果进行比较。在图2a至图2d示出本发明的GdL(6)及GdL(10)与商用造影剂/>的体内分布和炎症靶向能力评价结果。
图2a及2b为用于说明本发明的化合物的炎症靶向能力评价结果的图，图2c为用于说明商用造影剂的炎症靶向能力评价结果的图。
图2d为用于说明本发明的化合物及商用造影剂的炎症靶向能力结果的对比度噪声比(CNR)图表。
首先，参照图2a至2c，可确认，在的情况下，在注射后，炎症看似明亮，但是，信号增强效果逐渐降低，相反，在本发明的GdL(6)及GdL(10)的情况下，从注射后的2小时以上持续呈现出信号增强效果。
并且，参照图2d，可确认，当以对比度噪声比图表示出本发明的GdL(6)及GdL(10)与的炎症靶向性时，注射之后的对比度噪声比相似，但是，随着时间的推移，其差异逐渐变大，尤其，在经过2小时的情况下，对比度噪声比相差4倍以上。
即，如图2a至图2d所示，可确认，本发明的化合物GdL(6)及GdL(10)呈现出相比于商用造影剂更优秀的炎症靶向能力。
特性评价：抗炎特性
并且，确认了本发明的化合物GdL(6)及GdL(10)的抗炎特性。抗炎特性通过体外(in vitro)实验执行，具体地，利用作为炎症诱发物质的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)处理细胞来进行炎症反应后，利用3种非甾体抗炎止痛药(二氟尼柳(Diflunisal)、芬布芬(Fenbufen)以及舒林酸(Sulindac))和本发明的化合物GdL(6)及GdL(10)以及本发明的比较化合物GdL(14)分别处理细胞，拍摄其免疫荧光(immunofluorescence)图像来在细胞中确认了环氧化酶-2抑制能力。在图3示出其结果。
图3为用于说明本发明化合物的抗炎特性的图。
图3的(A)部分示出在脂多糖处理的细胞中分别处理二氟尼柳、芬布芬、舒林酸、GdL(6)、GdL(10)及GdL(14)后的细胞的荧光图像，图3的(B)部分示出将环氧化酶-2表达细胞定量化的图表。
在图3中，“对照组(Control)”表示未处理的细胞，“脂多糖”表示利用脂多糖处理的细胞，“脂多糖+二氟尼柳”、“脂多糖+芬布芬”、“脂多糖+舒林酸”、“脂多糖+GdL(6)”、“脂多糖+GdL(10)”及“脂多糖+GdL(14)”分别示出在脂多糖处理细胞处理二氟尼柳、芬布芬、舒林酸、GdL(6)、GdL(10)及GdL(10)后的细胞。
参照图3，首先，若比较对照组(附图，Control)和脂多糖处理细胞(脂多糖)，则可确认，仅在脂多糖处理细胞中呈现出绿色荧光。绿色荧光表示因利用脂多糖进行处理而在细胞中发生炎症并诱导的环氧化酶-2的存在，环氧化酶-2为在炎症表达过程中诱导的代表性细胞因子，环氧化酶-2的表达及增加为炎症表达的指标。即，在细胞中，绿色荧光可以意味着发生炎症且存在环氧化酶-2，可根据绿色荧光的程度确认炎症程度。
由此，可确认，若比较在脂多糖处理细胞中对二氟尼柳及本发明的GdL(6)进行处理时的细胞荧光，则在仅处理二氟尼柳的情况下(“脂多糖+二氟尼柳”)，荧光相比于仅处理脂多糖的细胞略有减少，但是，依然存在大量绿色荧光。但是，可确认，在处理本发明的GdL(6)的情况下(“脂多糖+GdL(6)”)，相比于仅处理二氟尼柳的情况，绿色荧光肉眼可见地显著减少，几乎没有出现。并且，尤其，如图3的(B)部分所示，在环氧化酶-2阳性细胞的定量数值中也可以客观地确认本发明的GdL(6)呈现出比二氟尼柳更优秀的数值。这意味着在处理本发明的GdL(6)的情况下，相比于单独使用二氟尼柳的情况，显著抑制环氧化酶-2的表达，即，本发明的GdL(6)不仅呈现出比二氟尼柳优秀的抗炎效果，还客观上呈现出非常优秀的抗炎效果。
同时，可确认，在脂多糖处理细胞中，当比较处理芬布芬及本发明的GdL(10)时的细胞荧光，在仅处理芬布芬的情况下(“脂多糖+芬布芬”)，相比于仅处理脂多糖的情况下，在处理本发明的GdL(10)的情况下(“脂多糖+GdL(10)”)，绿色荧光进一步肉眼可见地减少，在处理本发明的GdL(10)的细胞中，几乎没有出现绿色荧光。由此可确认，如图3的(B)部分所示，在环氧化酶-2阳性细胞的定量数值中也具有相同结果值，由此，可确认，在处理本发明的GdL(10)的情况下，相比于单独使用芬布芬，进一步抑制了环氧化酶-2的表达。即，本发明的GdL(10)具有优秀的环氧化酶-2抑制及抗炎效果。
因此，可确认，相比于在发生炎症反应的细胞中处理作为商用抗炎剂的二氟尼柳和芬布芬，当使用本发明的GdL(6)及GdL(10)时，可更优秀地抑制环氧化酶-2表达，由此，本发明的GdL(6)及GdL(10)具有优秀的抗炎特性。
另一方面，可确认，在利用舒林酸处理脂多糖处理细胞的情况下(“脂多糖+舒林酸”)，呈现出了优秀的环氧化酶-2抑制能力，相反，在使用GdL(14)的衍生物的情况下，环氧化酶-2抑制能力比舒林酸减少，且呈现出更亮的荧光。这意味着当从所有抗炎剂形成包含基于本发明的DO3A的钆合物配体的化合物时并不具备相同特性，在下述内容中进行与此有关的详细说明。
并且，为了更加具体地说明对于环氧化酶-2的选择性抑制，对包含通过脂多糖处理而表达的环氧化酶-2在内的参与炎症表达的几种细胞因子执行了3种非甾体抗炎止痛药(二氟尼柳、芬布芬以及舒林酸)和本发明的化合物GdL(6)及GdL(10)以及本发明的比较化合物GdL(14)的免疫印迹(western blotting)。在图4示出其结果。
图4为用于说明本发明化合物的环氧化酶-2的选择性抑制特性的图。
图4的(A)部分示出在细胞因子分别处理二氟尼柳、芬布芬、舒林酸、GdL(6)、GdL(10)及GdL(14)后的免疫印迹结果，图4的(B)部分示出将相对于β-肌动蛋白(β-actin)对环氧化酶-2定量化的图表。
参照图4，可确认，首先，若确认图4的(A)部分的环氧化酶-2带，则在处理二氟尼柳和芬布芬的情况下，未呈现出环氧化酶-2抑制效果，但是，大大抑制了本发明的GdL(6)和GdL(10)的环氧化酶-2表达。即，可确认，当比较本发明的化合物GdL(6)和GdL(10)仅处理脂多糖的情况及处理脂多糖之后，在一同处理各个抗炎治疗剂的情况时，具有非常优秀的环氧化酶-2选择性抑制特性并呈现出优秀的抗炎特性。
另一方面，可确认，在舒林酸的情况下，具有环氧化酶-2抑制能力，但是，如在所述图3所确认，比较化合物GdL(14)对于环氧化酶-2的抑制效果降低。这与参照所述图3说明的免疫荧光结果一致的结果，即，通过免疫荧光结果和免疫印迹实验结果可确认，与比较化合物GdL(14)不同，本发明的GdL(6)及GdL(10)对于环氧化酶-2呈现出优秀的选择性抑制特性。这表示，根据本发明，可将环氧化酶-1及环氧化酶-2非选择性二氟尼柳及芬布芬与基于DO3A的钆合物配体结合来用作造影剂，还可利用环氧化酶-2非选择性抗炎物质提供新的抗炎物质，所述新的抗炎物质呈现出与以环氧化酶-2选择性抑制剂而周知的舒林酸几乎相似的非常优秀的环氧化酶-2抑制特性及得到提高的抗炎特性。
即，若总结在所述内容中所确认的事项，则本发明的化合物呈现出优秀的自弛豫率，通过炎症疾病动物模型实验也呈现出对炎症部位的强造影增强及长时间维持的靶向性，还可通过运动稳定性试验确认优秀的体内稳定性，由此，本发明的化合物具有优秀的自弛豫率及运动稳定性，在可用作造影剂的同时可靶向炎症部位，在炎症部位中通过选择性地抑制环氧化酶-2而具有优秀的抗炎特性，进而，本发明的化合物不仅具有比现有的抗炎物质更优秀的抗炎特性，尤其，环氧化酶-2可选择性抑制通过炎症反应诱导的环氧化酶-2的表达，因此，可使现有的抗炎剂所具有的环氧化酶-1、环氧化酶-2非选择性抑制引起的如胃肠道疾病的问题/副作用最小化，同时，通过相对于环氧化酶-1的环氧化酶-2的选择性抑制有效地治疗炎症反应。
因此，本发明的化合物对炎症具有靶向性，靶向炎症部位来诊断的同时具有优秀的环氧化酶-2选择性抑制能力，由此，可用作能够治疗炎症的环氧化酶-2选择性抑制剂或同时实现诊断及治疗炎症的抗炎剂，包含本发明的化合物的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂呈现出优秀的活性。
大脑中动脉闭塞再灌注(Middle cerebral artery occlusion-reperfusion(MCAO-R))脑卒中动物模型中的治疗功效分析
为了确认在所述实施例中合成的GdL(14)和GdL(6)对于脑炎动物模型的治疗功效，使用了大脑中动脉闭塞再灌注脑卒中模型。为了诱发大脑中动脉闭塞再灌注脑卒中模型，首先，利用2.5％浓度的异氟烷麻醉7周龄的斯泼累格·多雷大鼠(Sprague Dawley(SD)rat)，之后，在阻塞颈总动脉(CCA，common carotid artery)的状态下通过颈外动脉(ECA，external carotid artery)插入尼龙细丝来将大脑中动脉(MCA)阻塞(occlusion)45分钟后再灌注(reperfusion)血液来诱发脑卒中。首先，利用免疫印记分析法测定再灌注后按照时间，即，0、1、3、6、12、24、48小时的炎症因子环氧化酶-2(cyclooxygenase-2)的表达量，将再灌注24小时后分离的整体大脑切成2mm的切片(section)并通过2％的氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride)染色分析脑卒中诱发的脑梗塞。在免疫印记分析过程中，利用蛋白提取缓冲液(50mM的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)(pH 8.0)、5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、150mM的氯化钠(NaCl)、1％的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)以及一种蛋白酶抑制剂混合物片剂(oneprotease inhibitor cocktail tablet)(Roche，德国(Germany))提取大脑组织中的蛋白质后进行离心分离(10000×g，15分钟，4℃)来提取蛋白提取物。使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce，IL)来对对蛋白浓度进行定量。将10μg的蛋白样品与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用样品缓冲液(100mM的三(羟甲基)氨基甲烷，2％的十二烷基硫酸钠，1％的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，2％的甘油(glycerol)，0.01％的溴酚蓝(bromophenol blue)，pH值为7.6)混合后加热(100℃，5分钟)来改性，并利用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳使用微型蛋白3细胞(Mini protean 3Cell)(Bio-Rad，加拿大(CA))。向硝酸纤维素膜(Whatman，德国)传递从凝胶分离的蛋白，通过丽春红(Ponceau S)染色确认蛋白传递和点滴的蛋白的量。之后，利用封闭缓冲液(10mM的三(羟甲基)氨基甲烷，pH值为7.5，150mM的氯化钠l，0.1％的吐温20(Tween 20)，3％的脱脂奶粉(nonfat drymilk))封闭硝酸纤维素膜并与第一抗体(稀释倍数，1:1000；Cell Signaling Technology，Inc.，MA)培养2小时。在此情况下，所述第一抗体使用与在脑炎中表达量增加的炎症因子环氧化酶-2及用于使蛋白量标准化的管家蛋白(house keeping protein)β-肌动蛋白特异性结合的抗体(Cell Signaling Technology，Inc.，MA)。利用封闭缓冲液将与第一抗体进行反应的膜清洗3次且时间为10分钟，之后，与第二抗体(1:2000)培养1小时。之后，利用封闭缓冲液清洗3次且时间为10分钟，之后，利用超灵敏发光底物(SuperSignal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate)(Pierce，IL)显影。利用LAS-3000发光图像分析仪(FujiPhoto Film Co.，Japan)检测荧光信号，使用Multi Gauge software version 3.0(FujiPhoto Film Co.)来测定带密度。
图5a为对脑炎疾病中的急性脑卒中或血管性痴呆症的动物实验结果，图5a示出由缺血性脑卒中(ischemic stroke)之后通过再灌注诱发的脑炎因子环氧化酶-2的增加。脑卒中之后的再灌注3小时之后开始增加，在24小时示出最高值。
图5b为对缺血性脑卒中引起的脑梗塞(cerebral infarction)的实验结果，可确认，舒林酸及GdL(14)以相似的水平抑制脑梗塞部位，二氟尼柳及GdL(6)也显著抑制脑梗塞。其中，GdL(6)呈现出最有效的脑梗塞治疗效果。
图5c为通过免疫印记法确认因缺血性脑卒中引起的脑梗塞部位组织中表达的作为炎症因子的环氧化酶-2的蛋白量的结果，与对于脑梗塞的治疗功效相同，舒林酸及GdL(14)呈现出相似水平的抑制功效，二氟尼柳及GdL(6)也呈现出环氧化酶-2活性抑制。与脑梗塞结果相同地，GdL(6)呈现出最有效的炎症因子抑制效果。
特性评价：大脑皮层成神经细胞(Brain cerebral cortex micorglia SIM-A9)中的细胞存活率(Cell viability)实验
为了评价在所述实施例中合成的GdL(14)和GdL(6)的细胞存活率，利用细胞计数试剂盒(CCK-8-kit，cell counting kit-8)进行了实验。细胞计数试剂盒利用高水溶性四唑盐-SST-8来分析，[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑，单钠盐]在电子媒介物的存在下还原时生成水溶性甲瓒橘色颜料。在细胞中通过脱氢酶生成的甲瓒颜料的量与活细胞数成比。在本实验中，使用了源于小鼠(Mouse)的大脑皮质(brain cerebral cortex)的小胶质细胞(microglia)SIM-A9向DMEM/F-12培养基添加5％的热灭活马血清(Heat-inactivated horse serum)、10％的热灭活胎牛血清(Heat-inactivated FBS)的完全生长培养基中的维持细胞以1.5×04细胞(cells)的密度(density)悬浮在200μl的体积中，并种植在96孔板(96well plate)的各个孔(well)。在37℃的温度条件下附着在5％的CO2培养箱(incubator)中并等待稳定，时间为14小时以上。第二天，去除孔的培养基，向各个孔添加具有多种浓度(0μM(对照组)，5μM，10μM，30μM，50μM，100μM，200μM)的DIF、Gd-DIF、FEN、Gd-FEN、SUL、Gd-SUL的100μl的DMEM/F-12无血清(serum free)培养基并进行培养。培养22小时后，向各个孔添加10μl的细胞计数溶液并再次培养2小时。利用微板读取器(microplate reader)在450nm的条件下测定完成培养的板的吸光度。细胞存活率的计算方法为如下。
细胞存活率(Cell viability)计算：
A：在对照组板中测定的吸光度值
B：在添加有药物的孔中测定的吸光度值
利用GraphPad Prism应用程序绘制所计算的值的图表。通过单因素方差分析(One-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test)确认了所算出的数值的统计学上的意义。表示*p<0.05**p<0.01，***p<0.001vs.对照组具有意义。
图6示出大脑皮层神经细胞中的细胞存活率实验结果，在脑皮层神经细胞中开放的GdL(6)和GdL(14)两种物质相比于作为现有物质的二氟尼柳和舒林酸均在高浓度中呈现出突出的存活率，由此，相比于现有的药物，毒性得到缓和。
特性评价：对于脑炎疾病中的急性脑卒中或血管性痴呆症的磁共振成像诊断能力评价
为了评价在所述实施例中合成的GdL(14)和GdL(6)的脑卒中模型中的磁共振成像诊断能力评价，利用在治疗功效中使用的同一动物模型来进行诊断能力评价。在同一动物模型再灌注后的第6小时通过尾静脉注射药物，在给药后的3小时内，每小时获取影像。在Bruker 4.7T的动物用磁共振成像中实施实验，使用4通道阵列(array)线圈。在imageJ程序中按相同窗口级别比较影像。获取对于脑卒中患者在临床中以实际诊断目的使用的T2加权影像(T2 weighted image)、弥散张量影像(Diffusion tensor image，DTI)以及T1加权影像。在脑卒中初始阶段中，在T2加权影像中难以进行详细地诊断，通过弥散张量影像预测缺血部位(ischemia)。但是，由于如弥散张量影像为通过图像处理而计算出的图像，因此具有预测准确的缺血部位及脑梗塞尺寸时准确性及可靠性降低的问题。因此，研发准确地靶向在脑梗塞部位发生的炎症部位并诊断准确的脑梗塞部位的磁共振成像造影剂具有重大意义。
从图7可知，脑卒中动物模型中的GdL(6)和GdL(14)在缺血部位的信号均增加。尤其，在GdL(6)的情况下，在注射药物的1小时后开始信号显著加强，在3小时后，仅靶向脑梗塞部位，且信号显著加强。在GdL(14)的情况下，同样在2小时后，在缺血部位呈现出信号显著加强的效果，并维持到3小时为止。
特性评价：通过与环氧化酶-2蛋白的结合亲和性(binding affinity)实验的靶向性评价
为了评价在所述实施例中合成的GdL(10)、GdL(14)和GdL(6)与环氧化酶-2蛋白的直接结合亲和性，执行了紫外线分光光度(UV-spectrophotometer)实验。在测定研发的物质所具有的固有的紫外线频谱强度(intensity)后，定期添加环氧化酶-2蛋白来测定频谱强度减少至饱和状态为止的浓度，通过利用此时获取的浓度及频谱强度值计算的结果获取了结合亲和性常数。并且，使用芬布芬、二氟尼柳、舒林酸作为比较物质。二氟尼柳、GdL(6)、GdL(10)、GdL(14)的开始浓度为10μM，芬布芬和舒林酸的开始浓度为5μM。针对所添加的环氧化酶-2的浓度，在芬布芬、二氟尼柳、GdL(6)、GdL(10)的情况下，向9μl的3μM环氧化酶-2溶液分别添加20μl的添加100μl的pH值为7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffer)的溶液，每次添加时测定频谱，在GdL(14)和舒林酸的情况下，向6μl的3μM环氧化酶-2溶液分别添加20μl的添加有100μl的pH值为7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的溶液，每次添加时测定频谱。利用所测定的值计算结合亲和性常数Ka的数学式如下。
1/(At-Aobs)＝1/(At-Atc)+1/Ka(At-Afc)[L]
Af：化合物本身的吸光度
*Aobs：每添加环氧化酶-2时的吸光度
Afc：添加蛋白后饱和状态的吸光度
[L]：化合物的浓度
通过图8可知，所研发的3个物质GdL(6)、GdL(10)、GdL(14)均具有比作为比较物质的二氟尼柳、芬布芬、舒林酸高出1.3倍以上的环氧化酶-2靶向亲和性，因此，由环氧化酶-2靶向增加引起的抑制能力与所述结果一致。
以上，参照本发明的优选实施例，对本发明进行了说明，本发明所属技术领域的普通技术人员应理解在不超出发明要求保护范围中所记载的本发明内的思想及领域的范围内可以对本发明进行多种修改及变更。

Claims (1)

1.由化学式3或化学式4表示的化合物在制备治疗脑中风疾病的药物中的用途，其中，所述化合物具有以下化学式：
[化学式3]
；
或
[化学式4]
。
CN201980020930.4A 2018-03-22 2019-03-22 化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂 Active CN111886226B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180033426 2018-03-22
KR10-2018-0033426 2018-03-22
KR10-2019-0027841 2019-03-12
KR1020190027841A KR102232979B1 (ko) 2018-03-22 2019-03-12 Do3a 가돌리늄 착물의 신규한 구조를 갖는 화합물, 이를 포함하는 항염증제 및 조영제
PCT/KR2019/003353 WO2019182395A1 (ko) 2018-03-22 2019-03-22 신규한 구조를 갖는 화합물, 이를 포함하는 항염증제 및 시클로옥시게나아제-2 억제제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111886226A CN111886226A (zh) 2020-11-03
CN111886226B true CN111886226B (zh) 2023-08-15

Family

ID=68422991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980020930.4A Active CN111886226B (zh) 2018-03-22 2019-03-22 化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3770149A4 (zh)
KR (1) KR102232979B1 (zh)
CN (1) CN111886226B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230154685A (ko) * 2022-05-02 2023-11-09 (주)에트노바테라퓨틱스 가돌리늄 착물을 함유하는 do3a 기반의 혈전억제제 또는 혈액용해제

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1676508A (zh) * 2004-04-02 2005-10-05 贝达医药开发(上海)有限公司 抗炎及抗血栓化合物及其药物组合物
CN103153969A (zh) * 2010-09-30 2013-06-12 庆北国立大学校产学协力团 含有钆配合物的mri造影剂
KR20140125896A (ko) * 2013-04-18 2014-10-30 경북대학교 산학협력단 Do3a-디아미노바이페닐 화합물 및 이를 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물
CN104693133A (zh) * 2015-02-16 2015-06-10 广州市盈宇医药科技有限公司 一种环氧化酶-2选择性抑制剂及其制备方法和应用
CN105899494A (zh) * 2014-01-10 2016-08-24 韩国庆北国立大学产业学术合作基金会 含do3a-氨甲环酸共轭物的钆配合物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1638612A4 (en) * 2003-06-25 2010-09-29 Univ Vanderbilt COX-2-MADE DISPLAY AGENTS
KR102068727B1 (ko) * 2018-03-22 2020-01-21 경북대학교 산학협력단 신규한 구조를 갖는 화합물, 이를 포함하는 항염증제 및 기질 금속 단백질분해효소-9 억제제

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1676508A (zh) * 2004-04-02 2005-10-05 贝达医药开发(上海)有限公司 抗炎及抗血栓化合物及其药物组合物
CN103153969A (zh) * 2010-09-30 2013-06-12 庆北国立大学校产学协力团 含有钆配合物的mri造影剂
KR20140125896A (ko) * 2013-04-18 2014-10-30 경북대학교 산학협력단 Do3a-디아미노바이페닐 화합물 및 이를 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물
CN105899494A (zh) * 2014-01-10 2016-08-24 韩国庆北国立大学产业学术合作基金会 含do3a-氨甲环酸共轭物的钆配合物
CN104693133A (zh) * 2015-02-16 2015-06-10 广州市盈宇医药科技有限公司 一种环氧化酶-2选择性抑制剂及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210052748A1 (en) 2021-02-25
CN111886226A (zh) 2020-11-03
EP3770149A4 (en) 2021-12-29
EP3770149A1 (en) 2021-01-27
KR20190111768A (ko) 2019-10-02
KR102232979B1 (ko) 2021-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2755181C2 (ru) Новые хелатные соединения гадолиния с высокой релаксивностью для применения в магнитно-резонансной визуализации
CN111886226B (zh) 化合物、包含其的抗炎剂及环氧化酶-2抑制剂
EP4095142A1 (en) Novel gadolinium-based compound, preparation method therefor, and mri contrast agent containing same
Ndiaye et al. Comparison of MRI properties between multimeric DOTAGA and DO3A Gadolinium-Dendron conjugates
KR102068727B1 (ko) 신규한 구조를 갖는 화합물, 이를 포함하는 항염증제 및 기질 금속 단백질분해효소-9 억제제
CN105899494B (zh) 含do3a-氨甲环酸共轭物的钆配合物
KR101836463B1 (ko) 망간 착물을 함유하는 mri 조영제
US20230094602A1 (en) Novel gadolinium-based compound, preparation method therefor, and mri contrast agent containing same
US20230233714A1 (en) Novel gadolinium-based compound, method for producing same, and mri contrast agent containing same
EP4043435A1 (en) Compound for detecting senescent cells and use thereof
KR20210068973A (ko) 신규한 가돌리늄계 화합물, 이를 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물, 및 mri 조영 조성물
US11998619B2 (en) Compound, antiinflammatory drug comprising the compound and cyclooxygenase-2 inhibitor comprising the compound
BR112021012694A2 (pt) Nanopartícula, agente de contraste para imagem de ressonância magnética compreendendo a mesma e composto de ligante zwitteriônico
KR20210052206A (ko) 신규한 가돌리늄계 화합물, 이의 제조 방법, 및 이를 함유하는 mri 조영제
EP4095143A1 (en) Novel gadolinium-based compound, method for producing same, and mri contrast agent containing same
KR102659248B1 (ko) 가돌리늄계 화합물, 이를 포함하는 mri 조영제
EP4374883A1 (en) Gadolinium-based compound, and mri contrast agent including same
KR102659229B1 (ko) 가돌리늄계 화합물, 이를 포함하는 mri 조영제
EP4374881A1 (en) Gadolinium-based compound and mri contrast agent comprising same
US11884638B2 (en) Compound or salt thereof, composition for cysteine detection, fluorescent probe and composition for diagnosing cancer containing the same, method for detecting cysteine, method for providing information for diagnosing cancer, and method for producing compound
CN112546242B (zh) 一种九肽基磁共振及荧光双模式成像诊断剂及其制备方法
RU2799760C2 (ru) Наночастица, содержащее ее контрастное вещество для магнитно-резонансной томографии и цвиттер-ионное лигандное соединение
CN114632079B (zh) 一种基于青蒿素的铁池靶向分子影像探针制备及其应用
CN110396122B (zh) 一种核磁共振造影剂、制备方法及其用于肿瘤诊断中的用途
CN117677403A (zh) 钆基化合物、包含其的mri造影剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant