KR101836463B1 - 망간 착물을 함유하는 mri 조영제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 형태의 EDTA-BTA 리간드 및 이의 망간 착물을 함유하는 MRI 조영제에 관한 것으로, 보다 구체적으로 EDTA-BTA 구조의 신규 화합물 및 이의 망간 착물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 새로운 형태의 EDTA-BTA 리간드 및 이의 망간 착물(complex)은 높은 이완율, 우수한 간-특이적 조영효과, 낮은 금속교환반응을 나타내어 유리(free) 망간 이온에 의한 부작용이 매우 적은 비-가돌리늄 기반의 자기공명영상(MRI) 조영제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 새로운 형태의 EDTA-BTA 리간드 및 이의 망간 착물(complex)은 높은 이완율, 우수한 간-특이적 조영효과, 낮은 금속교환반응을 나타내어 유리(free) 망간 이온에 의한 부작용이 매우 적은 비-가돌리늄 기반의 자기공명영상(MRI) 조영제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 망간 착물을 함유하는 MRI 조영제에 관한 것으로, 보다 구체적으로 EDTA와 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline)이 결합된 구조의 신규 화합물 및 이의 망간 착물에 관한 것이다.
자기공명영상(Magnetic Resonance Imagine; MRI)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용하여, 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보 영상을 얻는 방법으로, 인간 또는 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간으로 영상화할 수 있는 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.
생명과학, 의학분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해, 외부에서 물질을 주입하여 영상대조도를 증가시키는데, 이때 사용되는 물질을 조영제(contrast agent)라고 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상이며, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고, MRI시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다. 조영제들을 이용하여 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 주변과 영상신호를 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해준다. MRI 이미지를 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 상대적으로 높게 만드는 조영제를 'positive 조영제' 라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 'negative 조영제' 라고 한다.
현재 임상적으로 가장 일반적으로 사용되고 있는 조영제는 가돌리늄(Gd) 킬레이트에 기반을 둔 조영제로 Gd-DTPA (Magnevist®), Gd-DOTA (Dotaram®), Gd(DTPA-BMA), (Omniscan®), Gd(DO3A-HP) (ProHance®) and Gd(BOPTA) (MultiHance®) 등이 사용되고 있다. 그러나, 가돌리늄 기반의 조영제의 경우, 우수한 조영효과에도 불구하고 신성전신섬유화증(nephrogenic systemic fibrosis)과 같은 독성반응을 유발한다고 보고되고 있다. 비록, 가돌리늄 기반의 조영제가 신성전신섬유화증과 같은 부작용을 유발하는 원인은 정확하게 밝혀지지는 않았지만 독성이 낮은 비-가돌리늄 금속 기반의 조영제 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
비-가돌리늄 기반의 조영제 중, 망간을 이용한 조영제의 개발이 주목을 받고 있다. 망간은 신체에 내재하는 금속으로, 독특한 생체분포 패턴과 심근, 간 및 뇌에서 높은 조영효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 현재, 상업적으로 이용 가능한 망간 기반의 조영제는 두 가지로 경구제제로 개발된 MnCl2(Lumanhance) 및 정맥 투여제로 개발된 MnDPDP(Mangofordipir triosodium)이 그것이다.
하지만, 상기한 망간 기반의 조영제들은 상대적으로 낮은 이완율을 나타내기 때문에, 충분한 조영효과를 얻기 위해서는 투여 농도를 증가시키는 것이 필요하였다. 그러나, 조영제를 높은 용량으로 투여할 경우 원치 않는 독성 반응을 유발할 수 있다. 그 일례로, 망간을 정맥내 투여하는 경우, 이는 심장 근육세포 중 칼슘을 치환함으로써 심장의 정상 기능을 방해할 수 있으며, 유리 망간이온의 혈중 농도 증가로 인해 심혈관 및 뇌 시스템에 유독한 문제가 나타날 수 있다. 실제로 MnDPDP(Teslascan®)은 MRI 용량(5~10 mmol/kg)으로 정맥투여 된 이후에 80%에 달하는 유리 망간 이온이 DPDP로부터 이탈하는 것으로 알려져 있다(Drug Discovery Today. 2015, 20, 411-421).
따라서, 종래의 망간 기반의 조영제가 나타내는 독성 문제들이 경감되고 우수한 조영효과를 나타내는 비-가돌리늄 기반의 조영제 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 독성 문제가 적고 우수한 간 조영효과를 나타내는 비-가돌리늄 기반의 조영제를 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, EDTA(2-(2-[Bis(carboxymethyl)amino]ethyl(carboxymethyl)amino)acetic acid, Ethylenediaminetetraacetic acid)와 BTA(benzithiazole aniline)가 결합된 새로운 형태의 리간드에 망간을 배위결합시킨 착물이 열역학적으로 매우 안정하고 우수한 이완율 및 간 조영효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 EDTA-BTA(benzothiazole aniline) 화합물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다:
(a) 2,3-디아미노프로피오닉산 모노하이드로프로마이드(2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide)에 디-터셔리-부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 첨가하여 교반하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline)을 첨가하여 교반하는 단계;
(c) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반하는 단계;
(d) 상기 혼합물에 터셔리-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)를 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반한 후 용매를 제거하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물을 리간드로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 착물을 유효성분으로 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제를 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 EDTA-BTA(benzothiazole aniline) 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 2,3-디아미노프로피오닉산 모노하이드로브로마이드(2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide)에 디-터셔리-부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 첨가하여 교반하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline)을 첨가하여 교반하는 단계;
(c) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반하는 단계;
(d) 상기 혼합물에 터셔리-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)를 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반한 후 용매를 제거하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 리간드로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 착물을 유효성분으로 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제를 제공한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 EDTA-BTA(benzothiazole aniline) 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 EDTA에 BTA를 결합시킨 상기 화학식 1의 화합물을 개발하였으며, 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 바이다.
상기 화학식 1의 화학구조 중 EDTA 모이어티에는 금속이 배위결합 할 수 있다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물은 BTA 모이어티를 갖고 있고, 이는 친유성(lipophilic)을 나타내기 때문에 생체분포에 있어서 종래 보고된 EDTA 기반의 화합물들과 다른 특성을 나타낼 수 있다. 또한, BTA는 상기한 친유성 이외에도 항-염증, 항박테리아 및 항암 효과를 나타내는 것으로 알려져 있어 여러 가지 유리한 생리학적 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자는 상기 화학식 1의 화합물에 망간을 배위결합시켜 착물을 제조하였고, 상기 착물은 열역학적으로 매우 안정하여 유리 망간 이온의 방출이 적고, 우수한 이완율을 나타내며, 간-특이적 조영효과를 나타내는 특징이 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 화학식 1의 화학구조를 갖는 화합물은 간 특이적 조영제를 개발하기 위한 리간드로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 EDTA-BTA 화합물을 리간드로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물을 제공한다.
상기 금속원자는 자성을 나타내어 자기신호를 전달할 수 있는 금속원자는 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 코발트(Co), 철(Fe), 망간(Mn), 니켈(Ni), 가돌리늄(Gd), 몰리브덴(Mo), 구리(Cu), 마그네슘(Mg), 아연(Zn) 또는 크롬(Cr)일 수 있고, 가장 바람직하게는 망간(Mn)일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "착물(complex)"은, 1개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단 등이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자 또는 원자단을 리간드(ligand; 配位子)라고 부른다. 착물임을 명시하기 위해서 화학식에서는 일반적으로 대괄호([ ])로 묶어서 나타내며, 중심원자와 배위자 사이의 결합 정도는 이온결합 또는 공유결합이며, 리간드의 수는 생긴 원자단이 대전(帶電)해 있지 않아도 포함된다.
상기 화학식 1의 EDTA-BTA 화합물에 망간(Mn)이 배위결합하여 형성된 착물은 하기 화학식 2의 구조로 나타낼 수 있다:
[화학식 2]
상기 화학식 2의 구조에서 볼 수 있는 바와 같이, 망간은 화학식 1의 리간드 중 EDTA 모이어티와 배위결합을 형성하고 있다. 망간의 배위수는 최대 7인데, EDTA 모이어티는 6개의 배위결합을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 화학식 2의 착물에서 망간은 배위결합이 가능한 1개의 잔여 오비탈을 갖게 되고 여기에 물이 결합하여 빠른 물 교환력을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 화학식 2의 착물에서 BTA 모이어티는 상술한 바와 같이 높은 친유성을 나타내어 간-특이적 조영효과를 나타내는데 기여하고 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 망간 착물은 매우 우수한 운동학적 안정성을 나타내어 내인성 금속 이온들과의 금속교환(transmetalation)율이 매우 낮은 것으로 확인되었다. 금속 착물과 내인성 금속이온과의 금속교환(transmetalation) 반응이 더 빈번할수록, 리간드와 금속 사이의 배위결합은 더욱 불안해지고, 체내에 투여된 이후에 유리(free) 망간이온이 금속 착물로부터 방출되어 이로 인한 다양한 부작용들이 유발될 수 있다. 다양한 내인성 이온 중에서 특히 Zn2 +는 인체에서 두 번째로 풍부한 미량 금속이므로, Cu2 + 및 Ca2 +와 같은 다른 내인성 이온보다 Zn2 +는 많은 Mn2 + 이온을 대체 할 수 있다. 이에, 본 발명자는 상기 화학식 2의 망간착물과 Zn2 +과의 금속교환반응 정도를 상용 망간 조영제인 Mn-DPDP와 직접 비교해 본 결과, 본 발명의 망간착물이 훨씬 낮은 금속교환반응을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 곧, 임상적으로 적용이 되었을 때 망간의 방출로 인한 부작용의 가능성이 낮다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 망간착물은 매우 우수한 이완율(relaxivity)을 나타내는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 상기 망간착물은 상용 망간 조영제인 Mn-DPDP보다 높은 r1 이완율을 나타냈으며 낮은 r2/r1 비율을 나타내어 이상적인 조영제로서의 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 망간착물은 세포독성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 곧 임상적으로 충분한 신호강도를 얻는데 필요한 농도범위 내에서 별다른 독성반응을 나타내지 않을 수 있다는 점에서 매우 중요한 특징이라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 EDTA-BTA 리간드에 금속원자가 배위결합하고 있는 착물을 유효성분으로 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제를 제공한다. 바람직하게는, 상기 금속원자는 망간(Mn)일 수 있다.
상기 MRI 조영제는 종래 조영제가 사용될 수 있었던 암을 포함한 질병의 진단을 위한 MRI 영상을 얻는데 사용될 수 있으며, 상기한 바와 같이 낮은 독성, 우수한 이완율, 낮은 금속교환반응 등의 특성으로 인해 종래의 가돌리늄 조영제 또는 망간 조영제보다 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조영제가 신호증강 효과를 나타낼 수 있는 장기는 특별히 제한되지는 않으며, 바람직하게는 간, 신장, 담낭 또는 장(intestine)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 간일 수 있다.
더욱 주목할 것은, 상기 본 발명이 제공하는 조영제는 간의 병변, 특히 간암의 진단을 위한 MRI 조영제로 사용될 수 있다는 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화학식 2의 망간착물은 간을 통해 일차적으로 전달되는데, 간의 정상적인 조직에는 잘 전달되는 데 반해 자신의 기능이 상실된 병변(예: 암) 부위에는 전달되지 않아 간의 병변과 정상조직 간의 부위를 구분할 수 있는 MRI 영상을 얻을 수 있어, 간에서의 병변을 확인할 수 있는 MRI 조영제로서 이용될 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 조영제는 조성물의 형태로 제제화될 수 있으며, 당해 기술분야에 공지되어 있는 조영제 제조를 위한 통상의 제제화 방법에 따라 제제화될 수 있다. 바람직하게는 정맥주사제로서 제제화될 수 있다. 본 발명의 조영제는 또한 생리학적으로 적용 가능한 버퍼(예컨대, 0.08% NaCl 식염 용액, 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 및 생리학적으로 적용 가능한 첨가제(예: 파라벤과 같은 안정화제)를 포함하여 조영제 조성물로 이용이 될 수 있다.
본 발명의 조영제는 상기 화학식 1의 저분자 화합물을 이용하고도, 상용 조영제 이상의 조영효과 및 우수한 안정성을 나타낸다는 점에서 종래 보고된 상기 망간-기반의 조영제보다 더 우수하다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 2,3-디아미노프로피오닉산 모노하이드로브로마이드(2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide)에 디-터셔리-부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 첨가하여 교반하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline)을 첨가하여 교반하는 단계;
(c) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반하는 단계;
(d) 상기 혼합물에 터셔리-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)를 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반한 후 용매를 제거하는 단계.
상기 (a) 단계를 완료하면 2,3-Bis-tert-butoxycarbonylamino-propionic acid 화합물이 생성되며, 상기 (b) 단계를 완료하면 [2-(4-Benzothiazol-2-ylphenylcarbamoyl)-2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl] -carbamic acid tert butyl ester 화합물이 생성되며, 상기 (c) 단계를 완료하면, 2,3-Diamoniumtrifluoroacetate-N-(4-benzothiazol-2-yl-phenyl)-propionamide 화합물이 생성되며, 상기 (d) 단계를 완료하면 [1-(4-Benzothiazol-2-yl-phenylcarbamoyl)-2-(bis-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-tert-butoxycarbonylmethyl-amino-acetic acid tert-butyl ester 화합물이 생성되며, 상기 (e) 단계를 완료하면 본 발명의 상기 화학식 1의 화학구조를 갖는 [1-(4-Benzothiazol-2-yl-phenylcarbamoyl)-2-(bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino-acetic acid 화합물이 생성된다.
본 발명의 상기 (a) 단계와 (d) 단계는 염기성 조건에서 진행되는 것이 바람직하다.
상기 (c) 단계와 (e) 단계에서 사용하는 산의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 용액의 pH를 7 이하로 낮추기 위하여 사용되는 것이라면 통상의 기술자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적인 제조과정은 실시예를 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 새로운 형태의 EDTA-BTA 화합물 및 이의 망간 착물(complex)은 높은 이완율, 우수한 간-특이적 조영효과, 낮은 금속교환반응 등의 특성을 나타내어 유리(free) 망간 이온에 의한 부작용이 매우 적은 비-가돌리늄 기반의 자기공명영상(MRI) 조영제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 Mn-EDTA-BTA 리간드 및 이의 망간 착물을 합성하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 3T, 293K 조건에서 1 mM의 Mn-DPDP(비어있는 삼각형 표지자), Gd-DTPA(사각형 표지자) 및 Mn-EDTA-BTA(빨간 동그라미 표지자)의 금속교환(transmetalation) 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 64MHz 및 293K 조건에서, HSA(0.67mM) 수용액에서 [Mn]의 함수로서의 Mn-EDTA-BTA의 양성자 세로 방향 상자성 이완율을 나타낸 결과이다.
도 4는 Mn-EDTA-BTA를 그래프에 표시된 농도로 DU 145 세포 또는 NCTC 1469 세포에 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 Mn-EDTA-BTA를 정상 ICR 마우스의 꼬리 정맥에 투여한 후(0.05 mmol/kg), in vivo T1 가중 스핀 에코(spin echo) MR 영상을 시간 순서에 따라 나타낸 도면이다(투여 전, 투여 후 2분, 30분, 90분 및 3시간).
도 6은 Mn-EDTA-BTA의 생체분포도를 나타낸 도면으로, Mn-EDTA-BTA(0.05 mmol Mn/kg body weight)을 정상 ICR 마우스에 투여한 후 각 장기에서 Mn 함유 비율을(%) 그래프로 나타낸 것이다. 30분, 1시간, 6시간, 12시간 및 24시간 각각 마우스 마리수는 4마리이다.
도 7은 Mn-EDTA-BTA (100μ을 NCTC-1469 세포분획에 12시간동안 처리한 후 T1-가중된 MR 영상을 나타낸 도면이다.
도 8은 HepG2 이종 이식 마우스의 Axial T1 가중 영상을 나타낸 것이다: (a) Mn-EDTA-BTA (0.05 mmol / kg) 주입 전(pre) 또는 주입 후 30분(post 30 min), (b) Mn-DPDP (0.01 mmol/kg) 주입 전(pre) 또는 주입 후 30 분(post 30 min). 흰색 화살표는 간 종양 병변을 나타낸다. (c) 정상 및 종양 간 조직 간의 CNR의 차이를 나타낸 도면(Mn-EDTA-BTA (채워진 파란색 사각형), Mn-DPDP (채워진 빨간색 원형)를 시간 함수로 나타낸 결과임).
도 2는 3T, 293K 조건에서 1 mM의 Mn-DPDP(비어있는 삼각형 표지자), Gd-DTPA(사각형 표지자) 및 Mn-EDTA-BTA(빨간 동그라미 표지자)의 금속교환(transmetalation) 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 64MHz 및 293K 조건에서, HSA(0.67mM) 수용액에서 [Mn]의 함수로서의 Mn-EDTA-BTA의 양성자 세로 방향 상자성 이완율을 나타낸 결과이다.
도 4는 Mn-EDTA-BTA를 그래프에 표시된 농도로 DU 145 세포 또는 NCTC 1469 세포에 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 Mn-EDTA-BTA를 정상 ICR 마우스의 꼬리 정맥에 투여한 후(0.05 mmol/kg), in vivo T1 가중 스핀 에코(spin echo) MR 영상을 시간 순서에 따라 나타낸 도면이다(투여 전, 투여 후 2분, 30분, 90분 및 3시간).
도 6은 Mn-EDTA-BTA의 생체분포도를 나타낸 도면으로, Mn-EDTA-BTA(0.05 mmol Mn/kg body weight)을 정상 ICR 마우스에 투여한 후 각 장기에서 Mn 함유 비율을(%) 그래프로 나타낸 것이다. 30분, 1시간, 6시간, 12시간 및 24시간 각각 마우스 마리수는 4마리이다.
도 7은 Mn-EDTA-BTA (100μ을 NCTC-1469 세포분획에 12시간동안 처리한 후 T1-가중된 MR 영상을 나타낸 도면이다.
도 8은 HepG2 이종 이식 마우스의 Axial T1 가중 영상을 나타낸 것이다: (a) Mn-EDTA-BTA (0.05 mmol / kg) 주입 전(pre) 또는 주입 후 30분(post 30 min), (b) Mn-DPDP (0.01 mmol/kg) 주입 전(pre) 또는 주입 후 30 분(post 30 min). 흰색 화살표는 간 종양 병변을 나타낸다. (c) 정상 및 종양 간 조직 간의 CNR의 차이를 나타낸 도면(Mn-EDTA-BTA (채워진 파란색 사각형), Mn-DPDP (채워진 빨간색 원형)를 시간 함수로 나타낸 결과임).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. EDTA-BTA 리간드의 제조
<1-1> 2,3-Bis-tert-butoxycarbonylamino-propionic acid (1).
2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide (5g, 27mmol)에 NaHCO3 (9.07 g, 108 mmol)을 증류수 (108 mL)에 녹인 후, ice-bath를 설치하여 0 ℃로 식혀준다. 이 용액에 1,4-Dioxane (67.5 mL)에 녹인 di-tert-butyl dicarbonate (14.73 g, 67.5 mmol)을 천천히 가한다. 같은 온도에서 혼합 용액을 30분 동안 교반시켜 준 후, 상온에서 다시 하룻밤 동안 교반시킨다. 이후 혼합물을 다시 0℃로 만든 후, 염산 수용액(3 M)을 이용하여 pH가 2-3으로 유지시킨다. 반응 후, 유기층을 추출 하여, MgSO4로 수분을 제거한다. 반응 생성물은 감압 여과 후 용매를 제거하여 무색 오일로 얻는다. 생성물은 얇은 층 크로마토그래피 방법으로 부탄올/물/아세트산(8:1:1)의 전개액에서 확인 하였고, Ninhydrin(2%)을 포함하는 알콜 용액을 검출에 이용하였다. 이를 감압 건조하여 흰 색 고체를 얻는다. Yield: 7.8g (95%). 1H NMR (CDCl3): δ = 1.45 (s, 18H, CH3), 3.55 (m, 2H, CH2), 4.12 (s, 1H, CH), 4.275.17 (m, 1H, NH), 5.85 (s, 1H, OH), 2.05 (s, 1H, NH). Anal. Calcd for C13H24O6N2·2EtOAc: C, 51.71; H, 8.04; N, 8.10. Found: C, 51.87; H, 8.15; N,7.75.
<1-2 >[2-(4-Benzothiazol-2-ylphenylcarbamoyl)-2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl] -carbamic acid tert butyl ester (2)
Pyridine(40 mL)에 녹인 2, 3-bis-tert-butoxycarbonylamino-propionic acid (1) (7.00 g, 23.01 mmol)과 피리딘(20 mL)에 녹인 benzothiazole aniline (5.20 g, 23.01 mmol)을 천천히 가한다. 혼합 용액을 10분간 교반한 후에, triphenyl phosphite (7.13 ml, 23.01 mmol)를 첨가한다. 반응 용액을 3시간 동안 80℃에서 교반한 후, 상온에서 밤새 교반시킨다. 이 기간 중에 생성된 침전을 분리하여, 증류수와 아세톤으로 씻은 후, acetonitrile을 사용하여 재결정하여 백색 고형물을 얻는다. Yield : 9.6 g (81.4%), Anal. Calcd for C26H32N4O5S: C, 60.92; H, 6.29; N, 10.93; S, 6.26. Found: C, 60.05; H, 6.36; N, 10.60; S, 5.98. 1H NMR (CDCl3): δ = 9.28 (s, 1H, NH) 8.068.01 (m, 3H, BTA), 7.897.85 (d, 1H, BTA), 7.687.64 (d, 2H,BTA), 7.497.44 (t, 1H, BTA), 7.387.33 (t, 1H, BTA), 5.97-5.93 (s, 2H, NH), 4.023.98 (d, 1H, CH) 3.57-3.41 (m, 2H, CH2), 1.50-1.40(d,18H,CH3).
<1-3>2,3-Diamoniumtrifluoroacetate-N-(4-benzothiazol-2-yl-phenyl)-propionamide (3)
[2-(4-benzothiazol-2- ylphenylcarbamoyl)-2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl]-carbamic acid-tert-butyl ester(1.5 g, 2.92 mmol)를 0℃로 유지한 CH2Cl2 (20 mL)에 녹인다. 이 용액에 trifluoroacetic acid (10 ml)를 천천히 가한다. 용액의 색깔이 노란색으로 변했다. 이 용액에 ether를 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물을 ether로 세 번 더 세척하고, 여과하여 연한 노란색의 고형물을 얻는다. Yield: 0.82g (90%), 1H NMR (MeOH-d4): δ = 8.75 (s, 1H, NHO), 8.017.99 (d, 2H, BTA), 7.97.89 (d, 2H, BTA), 7.827.78 (d, 2H, BTA), 7.45 (t, 1H, BTA), 7.35 (t, 1H, BTA), 4.43 (t, 1H, CH), 3.623.55 (dd, 1H, CH2), 3.51-3.44 (dd, 2H, CH2), 1.94 (s, 2H, NH). Anal. Calcd for C16H16N4OS: C, 44.45; H, 3.36; N, 10.37; S, 5.93. Found: C, 43.43; H, 3.54; N, 10.28; S, 5.56.
<1-4> [
1-(4-
Benzothiazol
-2-
yl
-
phenylcarbamoyl
)-2-(bis-
tert
-
butoxycarbonylmethyl
-amino)-ethyl]-tert-butoxycarbonylmethyl-amino-acetic acid
tert
-butyl ester (4)
2,3-diamoniumtrifluoroacetate-N-(4-benzothiazole-2-yl-phenyl)-propionamide (2 g, 3.70 mmol), diisoppropylethylamine (7.66 mL, 59.2 mmol), 그리고 potassium iodide(1.84 g, 11.1 mmol)를 dimethyl formaimde (20 mL)에 녹여, 45℃에서 교반한다. 이 용액에 tert-butyl bromoacetate (5.77 mL, 29.6 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 가한다. 용액을 110℃에서 4시간 더 교반한 후, 상온으로 식힌다. 용매를 제거한 후, NaHCO3 용액(10%)과 ethyl acetate로 추출한다. 물 층을 ethyl acetate로 세 번 정도 더 추출하는 것을 반복하여 유기층을 Na2SO4을 첨가하여 수분을 제거한 후 용매를 제거하고, 이를 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하면 (SiO2, hexane/EtOAc = 9:1) 진한 갈색의 오일을 얻는다 (33.7 g, 82%). 1H NMR (CDCl3): δ = 10.85 (s, 1H, NH), 8.088.01 (m, 3H, BTA), 7.917.82 (dd, 3H, BTA), 7.47 (t, 1H, BTA), 7.36 (t, 1H, BTA), 3.75 (t, 1H, CH), 3.623.40 (m, 8H, CH2-tBu), 3.04-2.96 (dd, 2H, CH2), 1.46 (s, 36H, t -Bu). Anal. Calcd for C40H56N4O9S2O: C, 58.37; H, 7.59; N, 6.81; S, 3.90; Found: C, 58.61; H, 7.31; N, 6.46; S, 3.58.
<1-5>[1-(4-
Benzothiazol
-2-
yl
-
phenylcarbamoyl
)-2-(bis-
carboxymethyl
-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino-acetic acid (5)
화합물 4 (1.5 g, 1.95 mmol)를 acetonitrile (30 mL)에 녹여 HCl (36%, 15mL)을 5분간 0℃를 유지하면서 첨가하고, 상온에서 20시간 동안 교반하여준다. HCl (36%, 15mL)을 더 첨가하고 한 시간 더 교반하여준다. 진공 회전 농축기를 이용하여 전체 용액의 부피를 75% 줄이고, 물 30 mL를 첨가한 후, NaOH (1M)을 조금씩 첨가하여 pH를 1.6으로 맞춘다. 생성되는 하얀 침전물을 필터로 걸러내고 물(pH= 1.6), Et2O(30 mL), EtOAc(30 mL)로 씻어내어 하얀 파우더를 얻는다. Yield: 0.89 g (83%). 1H NMR (CDCl3): δ = 8.068.01 (m, 2H, BTA), 7.997.96 (d, 2H, BTA), 7. 857.83 (d, 2H, BTA), 7.52-7.49 (t, 1H, BTA), 7.427.39 (t, 1H, BTA), 5.50-5.48 (s, 2H, OH), 4.023.98 (d, 1H, CH), 3.963.76 (m, 8H, CH2), 3.57-3.41 (m, 2H, CH2), Anal. Calcd. for C24H24N4O9S·2O): C, 51.24; H, 4.66; N, 9.96; S, 5.70. Found: C, 51.02; H, 4.65; N, 9.54; S, 5.54. HR-FABMS (m/z): calcd for C24H25N4O9S, 545.13 ([M+H]+); found, 545.13 ([M+H]+).
2. 망간
착물(complex)의
제조
가지 달린 플라스크(100 mL)에 메탄올(15 mL)과 증류수(15 mL)를 취한 후, L1(1g, 1.8 mmol)을 가한다. 용액을 교반하면서 1 M NaOH 용액을 소량씩 첨가하면서 pH를 6으로 맞춰준다. MnCl2(0.356 g, 1.8 mmol)를 첨가하면서 pH를 6이 유지되도록 필요 시 NaOH 용액을 가한다. 첨가가 끝난 후 용액을 밤새 상온에서 교반한다. 이후 회전농축기로 용매를 제거하고, 황색 고형물을 얻는다. 이 물질을 소량의 물에 녹여 역상 플래시 칼럼(reverse flash column)을 통하여 분리하고, 용매를 제거한 후 원하는 생성물을 흰색 가루로 얻는다. Yield: g (32%). FABMS: Calcd. m/z 595.0331; Found: 595.0327.
3. 금속교환 운동(
transmetallation
kinetics)
ZnCl2를 녹인 10 mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액 20 μL를 망간 착물을 1 mM로 녹인 완충 용액 1 mL에 첨가하여 섞어 준 후에 시간에 따른 T2를 측정하였다. 비교실험으로 Teslascan® 과 Magnevist® 역시 동시에 측정하였고, 이 실험은 3T MRI 장비 (Discovery MR750w 3.0T, GE healthcare)에서 실행되었다.
4. 이완율(
relaxivity
)의 평가
T1값은 1.5 T (64 MHz, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)에서 가변의 반전시간(variable inversion time, TI)으로 반전회복법(inversion recovery method)을 이용하여 수행하였다. T2 측정을 위해 CPMG (Carr-Purcell-Meiboon-Gill) 펄스 서열을 다중 스핀-에코(multiple spin-echo) 측정에 적용시켰다. 34개의 이미지는 10 내지 1900 msec 범위를 갖는 34개의 서로 다른 에코 시간(TE) 값과 함께 요구되었다. T2 이완시간은 각 에코 시간의 다중 스핀-에코 측정에 대한 평균 픽셀 값(mean pixel values)의 비-선형 최소제곱법으로부터 구하였다. 그런 다음, 이완성(R1 및 R2)은 mM 당 이완시간의 역으로 계산하였다. 계산된 이완시간(T1 및 T2) 및 이완성(R1 및 R2)으로 최종적으로 이미지-작업하여 각각 이완시간 지도 및 이완율 지도를 만들었다.
5.
옥탄올
-물 분배계수
1 mg의 망간 착물을 2 mL의 옥탄올과 물 1:1 혼합용액에 녹인 후, 30초 동안 흔들어 준 후에, 해당 바이알을 혼합기를 사용하여 48시간동안 흔들어준다. 혼합 후에 24 시간 동안 안정 상태로 두었다가 옥탄올 층과 물층을 따로 분리하여 각 층에 있는 망간 양을 ICP-MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry)를 통해 측정하였다. 분배계수는 log P = log (Co/Cw) 로 계산되고, 이 때, Co는 옥탄올 층에 있는 망간의 양, Cw는 물 층에 있는 망간의 양이다.
6. 간암 모델
간암 모델은 DGMIF에서 제공받아 사용하였다. 5주령의 누드 마우스에 HepG2-luc2 세포 (1 x 106 cell/50μL)를 왼쪽 간 lobe에 주사하여 4주 후에 간암이 생긴 것을 확인하여 in vivo 실험을 진행하였다.
7.
In vitro
세포 독성 실험
인간 유래 전립선 암 세포 (DU 145)와 쥐 유래 간 세포주 (NCTC 1469) 세포가 있는 1 x 104 의 96-well plate에서 DMEM과 RPMI 와 같은 성장 배지는 제거하고 망간 착물을 넣어 24 시간동안 배양시켰다. 배양 후, 살아 있는 세포를 CCK-8 (Dojindo, Journal of Medicinal Chemistry Article Sunnyvale, CA)을 이용하여 개발자의 프로토콜에 따라 카운트하였다.
8. MRI 세포 실험
NCTC 1469 세포를 2 ×105 in 35mm dishes 에 둔다. 성장배지를 제거하고 망간착물 100μM을 첨가하여 12 시간동안 배양한다. 배양 후에 PBS 완충 용액으로 여러 차례 씻어내어 원심분리기를 이용하여 핵, 세포질, 세포막 층을 분리한다. 분리한 부분을 에펜튜브에 담아 1.5T MRI 로 영상을 확인하였다.
9.
In vitro
MR 영상은 다음과 같은 파라미터로 측정되었다.
In vitro MR imaging. In vitro MR images were taken with a 1.5 T (T) MR unit (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) equipped with a homemade small RF coil. The imaging parameters for SE (Spin Echo) are as follows: repetition time (TR) = 500 ms; echo time (TE) = 13.6 ms; 10 mm field of view (FOV); 192 ×128 matrix size; 1.0 mm slice thickness; number of acquisition (NEX) = 15.
10.
In
vivo
MR 영상.
25-30g의 6주령의 수컷 쥐를 사용하였고, 1.5% isoflurane in oxygen을 사용하여 마취하였으며, 꼬리 정맥을 통해 물에 녹인 망간 착물을 주사하였다. MR 영상 촬영을 위한 파라미터는 다음과 같다.
Whole body MR images were taken with a 1.5 T MR unit (GE healthcare) equipped with a homemade small animal RF coil. The coil was of the receiver type with its inner diameter being 50 mm. The imaging parameters for SE (spin echo) are as follows: repetition time (TR) = 300 ms; echo time (TE) = 12 ms; 11 mm field of view (FOV); 192 x 128 matrix size; 1.2 mm slice thickness; number of acquisition (NEX) = 8.
11. 생체 내 분포 확인
시간대별로 네 마리의 수컷 쥐에 망간 착물을 꼬리 정맥 주사한 후, 30분, 1,6,12, 24시간 후에 해부하여 장기(뇌, 심장, 폐, 간, 담낭, 방광, 신장, 비장, 장, 혈액)를 얻었다. 장기 적출 후에 ICP 분석을 통해 각 장기에 얼마나 망간이 존재하는지를 측정하였다.
<실험결과>
실시예
1. 합성결과
망간 화합물은 도 1에 그려진 것과 같은 순서로 합성되었다. 리간드, L의 합성은 판매하는 D,L-2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide를 시작 물질로 하여 합성하였다. 화합물 1은 논문에 기재된 것과 같은 방법으로 합성되었고, 벤조사이아졸 아닐린과 트리페닐 포스파이트 존재 하에서 반응하면 하얀 고체 형태로 화합물 2를 얻었다. TFA 와 다이클로로메테인의 혼합물을 이용하여 tert-Butyl 기를 디프로텍션시켜 침전 후에 노란색의 화합물 3을 얻었다. tert-Butyl-bromoacetate를 이전에 발표된 컨디션에 따라 알킬레이션하면 칼럼 크로마토그래피 후에 좋은 수득률로 프로텍트된 화합물 4를 얻을 수 있었다. 염화수소를 이용하여 디프로텍션 후에 pH 2에서 높은 순도의 리간드 L을 얻었다.
pH 6에서 같은 당량의 MnCl2.4H2O를 상기 리간드(L)와 반응시키면 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제 후에 Mn-EDTA-BTA (망간 착물)을 얻을 수 있었다. 리간드와 망간 착물을 포함하여 합성한 화합물들은 다양한 분광학적 방법 (1H NMR, HR-FAB-MS, Elemental Analysis 등)으로 확인되었다.
실시예
2. 운동학적 비활성(Kinetic inertness)
다양한 내인성 이온 중에서 Zn2 +는 인체에서 두 번째로 풍부한 미량 금속이므로, Cu2 + 및 Ca2 +와 같은 다른 내인성 이온보다 Zn2 +는 많은 Mn2 + 이온을 대체 할 수 있다. 금속교환(transmetalation) 반응이 더 빈번할수록, 리간드와 금속 사이의 킬 레이션은 더 불안정해진다. 그러므로 조영제의 안정성은 Zn2 +를 이용한 transmetalation test로 측정 할 수 있다. 금속교환(transmetalation)은 종종 시간의 함수로서 표준화 된 종-방향 (r1) 또는 횡-방향 (r2) 이완의 발전으로 표현된다. 본 발명에서, Mn-EDTA-BTA의 운동학적 안정성은 횡-방향 이완율 변화 (Δr2(t) = r2 (0) - r2(t))를 시간의 함수로 나타낸다. 여기서, 임의의 시간 t에서의 r2(t) 값은 아연에 의한 망간의 금속교환 정도를 나타내는 좋은 예측치가 되어준다. Mn-DPDP 및 Gd-DTPA도 비교하기 위해서 평가하였다(도 2).
종래 보고된 방법을 조금 변형시킨 방법에 따르면, 본 발명자는 두 조건 하에서 복합체를 준비했다. 즉, pH 6.0의 MES 완충액에서 Zn2 + (10 당량 및 25 당량)과 함께 인큐베이션한 Mn-EDTA-BTA의 Δr2(t)를 측정하여 금속교환 정도를 평가 하였다. 본 발명자는 각 복합체에 대해 두 세트의 금속교환 시험을 수행 하였지만, 그 결과는 매우 유사하므로 한 세트의 결과(10 mM Zn2 +)만 표시했다. 동일한 방법을 사용하여 MnDPDP와 Gd-DTPA의 금속교환을 평가 하였다.
Mn-DPDP의 Δr2(t)는 빠르게 증가하고 포화되었다. 반대로, Mn-EDTA-BTA의 경우, Mn-DPDP에 비해 Δr2(t)값이 처음에는 급격히 증가했지만, Mn-DPDP와 비교해 훨씬 낮은 Δr2(t)값으로 천천히 도달하는 것으로 확인되었다. 따라서, Mn-DPDP와 비교하여 Mn-EDTA-BTA는 Mn2 +의 금속교환에 있어서 충분히 불활성이라는 것을 알 수 있었다. 또한, Mn-EDTA-BTA의 Δr2(t) 패턴은 임상적으로 널리 사용되고 있는 조영제인 Gd-DTPA와 거의 동일한 것으로서, 이는 곧 Mn-EDTA-BTA가 Gd-DTPA 만큼 안정하다는 것을 보여준다고 할 수 있다.
실시예
3. 이완율 및
친유성
Mn-EDTA-BTA의 이완율은 비교 목적을 위해 Mn-DPDP 및 Gd-DTPA와 함께 하기 표 1에 요약하였다.
상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, Mn-EDTA-BTA가 가장 높은 이완율을 나타냈다.
Mn2+ (S = 5 / 2)는 Gd3+ (S = 7 / 2)보다 비공유 전자수가 적지만 친유성 잔기인 BTA는 텀블링(tumblimg) 움직임을 좀 더 천천히 일으켜, Gd-DTPA와 비교하여 높은 이완율을 나타내는 데에 중요한 역할을 했을 것으로 판단된다. 또한, Mn2+와 물 사이의 거리가 더 짧기 때문에 Mn-EDTA-BTA의 이완율이 증가된 것으로 볼 수 있다.
한편, HSA는 사람의 혈액 중에 많은 양 존재하는 단백질(human serum albumin)로 MS-325와 같은 상용화된 혈관 조영제들이 혈액 중 HSA과 상호작용하여 보다 높은 자기 이완율을 낸다고 알려져 있다. 본 발명에서 합성한 망간 착물 역시 HSA가 있는 환경에서 자기 이완율을 측정하고 Ka 값을 구하면 혈액 내 단백질과 얼마나 상호작용하는지를 알 수 있고, Ka 값이 높은 경우 혈관 조영제의 특성을 가지는 것이므로 그 여부를 확인하기 위해 인간 혈청 알부민 (HSA)의 수용액에서 이완율을 측정하는 실험을 진행하였다.
그 결과, Ka 값은 Gd-DTPA보다 높았으며, 이는 HSA와 Mn-EDTA-BTA 사이의 상호 작용을 나타낸다. HSA와의 상호작용을 나타내는 결합 상수(Ka)는 종래 보고된 방법에 따라 교정될 수 있다. Mn-EDTA-BTA의 Ka값(95 M-1)은 Gd-DOTA의 Ka값(21 M-1)보다 높았다. 도 3은 고정된 농도의 HSA에서 Mn-EDTA-BTA의 농도에 따른 양성자 종-이완율을 측정하여 얻은 데이터인 피팅 데이터의 결과를 나타낸 것이다.
또한, 본 발명의 망간 착물의 친유성을 평가하기 위해 본 발명자는 옥탄올-물 분배계수(logP)를 조사했다. Mn-EDTA-BTA(logP = -1.84)에 대한 LogP 값은 MnDPDP(logP = -3.07) 및 Gd-DTPA (logP = -3.16)의 logP 값보다 높았으며, 이는 곧, Mn-EDTA-BTA의 높은 친유성을 시사한다(표 1). 이는 곧, 본 발명의 망간 착물이 Mn-DPDP 및 Gd-DTPA보다 더 친유성을 나타내며, 따라서 간 표적성에 더 적합하다는 것을 의미한다.
실시예 4.
In vitro
세포독성 평가
Mn-EDTA-BTA의 세포독성 시험은 인간 전립선암 세포주인 DU-145 및 마우스 간 세포주인 NCTC-1469에서 수행하였다.
도 4는 DU 145 세포의 세포생존률이 88% 이상이었고, NCTC 1469 세포의 경우에는 Mn-EDTA-BTA의 농도가 50μM가 될 때까지 세포 생존율이 86% 이상이었다. 이러한 결과는 곧 Mn-EDTA-BTA가 MR영상에서 충분한 신호강도 증가를 얻는 데 필요한 농도 범위에서 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 의미한다.
실시예 5. MR 영상 및
in vivo
생체분포
Mn-EDTA-BTA의 생체 내(in vivo) MR 영상은 6주령 수컷 ICR 마우스 꼬리정맥을 통해 Mn-EDTA-BTA를 주사 한 후, T1-강조된 MR 이미지로 시각화하였다(도 5).
Mn-EDTA-BTA의 가장 큰 MR 영상 특징은 주입한 이후에 간, 신장에서 강력한 조영 증강효과를 보인다는 것과, 간 및 신장 외에도 담낭 및 장에서 강한 조영효과를 나타낸다는 것이다.
따라서, 생체 내 MR 영상은 Mn-EDTA-BTA가 배설을 위한 이중 경로를 가지고 있음을 나타낸다. 즉, Mn-EDTA-BTA는 간-담도(hepatobiliary)와 신장 경로에 의해 배설된다. 간-담도 경로의 경우, Mn-EDTA-BTA는 간-담도 흡수 이후에 담관을 통해 배출이 된다. 흥미롭게도 Mn-EDTA-BTA의 이러한 이중배설 특성은 임상적으로 승인된 가돌리늄 간-특이적 제제인 Primovist(Gd-DTPA-EOB)와 매우 유사하다.
In-vivo에서의 Mn-EDTA-BTA의 생체 분포는 inductively coupled plasma(ICP) spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 측정하였다(도 6). 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 간과 장에서 가장 많은 Mn(II) 축적을 보여주며, 이는 곧 간-담도 경로를 통한 Mn-EDTA-BTA의 배설을 나타낸다고 할 수 있다. 간 뿐만 아니라, 신장에서 상대적으로 높은 Mn(II) 축적이 나타났는데, 이는 신장 경로를 통한 사구체 배설을 나타낸다고 할 수 있다.
생체 분포도 결과와 MR 영상 결과에 따르면, Mn-EDTA-BTA가 이중 경로(신장 및 간-담도 경로)에 의해 배설되는 것을 명확하게 확인할 수 있다.
실시예 6. 간세포 표적성
세포수준에서 간세포 표적성을 평가해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 NCTC 1469 세포의 세포막 또는 세포질보다는 핵에 더 강한 신호증강이 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 곧, Mn-EDTA-BTA가 세포 내부를 표적하는 속성이 있다는 것을 의미한다.
따라서, 상기 ex vivo 표적성 실험결과를 통해 Mn-EDTA-BTA가 간세포를 표적한 결과에 의해 간 MR 신호 증강이 나타난 것이라고 판단할 수 있었다. 즉, 본 발명의 상기 망간 착물이 직접 간 세포 핵에 들어간다는 것으로 정상 간 세포 (hepatocyte cell)에 표적성을 가지는 것을 확인한 결과라고 할 수 있다.
실시예 7. 종양 영상화(정상 간과 종양 조직의 구분)
Mn-EDTA-BTA는 간 특이적으로 작용하기 때문에 생체 내 검사에서 정상 간 조직과 종양 간 조직을 구별할 수 있는지 여부를 테스트 하였다.
도 8a 및 8b는 각각 Mn-EDTA-BTA 및 MnDPDP를 주사 한 후 HepG2 이종 이식 마우스 모델의 T1 강조 MR 이미지를 나타낸 것이다. Mn-EDTA-BTA의 경우 정상 간 조직에서 신호증강을 나타냈지만 종양 조직에서는 신호 증강이 적은 것을 확인할 수 있었다. 그러나, MnDPDP의 경우 양성 신호 증강이 정상 간세포와 종양 간 조직 모두에서 나타나 MnDPDP가 정상 간세포와 종양세포 모두에 의해 흡수된다는 것을 알 수 있었다.
따라서, Mn-EDTA-BTA는 MnDPDP와 비교할 때 종양과 정상 간 조직 사이에 훨씬 높은 ΔCNR을 보였으며(그림 8c), 종양의 검출에 현저한 이점이 있음을 알 수 있었다. 즉, Mn-EDTA-BTA는 간암의 진단용 조영제로서 매우 유용하다는 것을 의미한다.
MnDPDP의 투여량은 MnDPDP의 권고 임상용량으로 인해 Mn-EDTA-BTA의 투여량보다 낮지만, MnDPDP가 종양과 정상적인 간 조직 사이에 낮은 △CNR 값을 나타내는 것은 낮은 투여용량 때문이 아니라, 정상 간 세포와 종양조직 모두에서 흡수가 일어났기 때문이다. 또한, MnDPDP의 주입량은 생체 내 독성문제, 특히 DPDP로부터의 Mn2+ 방출로부터 기인하는 신경독성으로 인해 증가 될 수 없었다.
본 발명에 따른 새로운 형태의 EDTA-BTA 리간드 및 이의 망간 착물(complex)은 높은 이완율, 우수한 간-특이적 조영효과, 낮은 금속교환반응 등의 특성을 나타내어 유리(free) 망간 이온에 의한 부작용이 매우 적은 비-가돌리늄 기반의 자기공명영상(MRI) 조영제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1의 구조를 갖는 EDTA-BTA(benzothiazole aniline) 화합물:
[화학식 1]
- 하기 단계들을 포함하는 제1항에 따른 EDTA-BTA 화합물의 제조방법:
(a) 2,3-디아미노프로피오닉산 모노하이드로브로마이드(2,3-diaminopropionic acid monohydrobromide)에 디-터셔리-부틸 디카르보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 첨가하여 교반하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline)을 첨가하여 교반하는 단계;
(c) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반하는 단계;
(d) 상기 혼합물에 터셔리-부틸 브로모아세테이트(tert-butyl bromoacetate)를 첨가하여 교반하는 단계; 및
(e) 상기 혼합물에 산을 첨가하여 교반한 후 용매를 제거하는 단계.
- 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계 및 (d) 단계는 염기성 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 따른 EDTA-BTA 화합물을 리간드로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물.
- 제4항에 있어서, 상기 금속원자는 망간(Mn)인 것을 특징으로 하는 착물.
- 제4항 또는 제5항의 착물을 유효성분으로 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제.
- 제6항에 있어서, 상기 조영제는 간 특이성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조영제.
- 삭제
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| KR1020170011859A KR101836463B1 (ko) | 2017-01-25 | 2017-01-25 | 망간 착물을 함유하는 mri 조영제 |
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