KR20120057324A

KR20120057324A - 페로센을 포함하는 고리형 구조의 새로운 가돌리늄 킬레이트

Info

Publication number: KR20120057324A
Application number: KR1020100119002A
Authority: KR
Inventors: 김태정; 장용민; 김희경
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2012-06-05
Also published as: WO2012070712A1

Abstract

본 발명은 페로센을 포함하는 고리형 구조의 새로운 가돌리늄 킬레이트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 화학식 1의 구조를 갖는 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 리간드로 포함하는 새로운 MRI 조영제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 제조할 수 있으며, 상기 화합물을 이용하여 고리형의 가돌리늄 착물을 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 가돌리늄 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명혈관 조영제는 현재 사용화되어 있는 다른 조영제보다 열역학적, 속도론적 안정성면에서 우수할 뿐만 아니라, 혈액 내에서 자기이완율이 뛰어나므로 보다 안정적이며, 혈관조영이 가능한 MR 혈관 조영제로서의 응용이 가능하다.

Description

페로센을 포함하는 고리형 구조의 새로운 가돌리늄 킬레이트 {Gd-complexs of macrocyclic type comprising ferrocene}

본 발명은 페로센을 포함하는 고리형 구조의 새로운 가돌리늄 킬레이트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 화학식 1의 구조를 갖는 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 리간드로 포함하는 새로운 MRI 조영제에 관한 것이다.

자기공명영상(Magnetic Resonance Imagine; MRI)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용하여, 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보 영상을 얻는 방법으로, 인간 또는 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간으로 영상화할 수 있는 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.

생명과학, 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해, 외부에서 물질을 주입하여 영상대조도를 증가시키는데, 이때 사용되는 물질을 조영제(contrast agent)라고 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상이며, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고, MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직 간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다. 조영제들을 이용하여 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 주변과 영상신호를 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화 해준다. MRI 이미지를 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 상대적으로 높게 만드는 조영제를 'positive 조영제' 라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 'negative 조영제' 라고 한다. 자기공명영상의 대조 조영제로 인체 사용을 위해 승인된 조영제로는 자기이완율이 약 4.7 mM^-1s^-1(20 MHz, 298 K)을 나타내는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N'',N''-펜타아세테이트, (N-Me-글루카민)₂[Gd(DTPA)(H₂O)] (Magnevist, Schering)와 같은 이온화 Gd(Ⅲ) 착물과 자기이완율이 4.4 mM^-1s^- ¹(20 MHz, 298 K)를 나타내는 [Gd(DTPA-bismethylamide)(H₂O)] (Omniscan, Nycomed)와 같은 중성 Gd(Ⅲ) 착물이 있다.

이러한 자기공명영상의 대조 조영제로서의 필요한 성질은 열역학적 안정성, 수용성, 및 상자성 Gd(Ⅲ) 이온을 만드는 원인이 되는 다배위(multidentate) 구조, 즉 적어도 한 분자의 물과 결합해 높은 물과의 자기이완을 나타내어야 한다. 또한 자기공명영상 대비 조영제는 화학적 활성이 없어야하며, 생체 내에서 세포 독성이 낮아야하고, 진단이 끝난 후에는 생체 밖으로 완전히 배출되어야 한다. 그러나 상기 조영제들은 수용성과 자기이완율이 낮은 편이며, 생체 내에서 세포 독성이 비교적 높다는 문제점이 있다. 따라서 여전히 최적화된 자기공명영상 조영제의 개발이 절실한 실정이다.

한편, CE-MRA(Contrast-enhanced magnetic resonance angiography)는 혈관 질환(vascular disease)의 진단에 매우 효과적이다. CE-MRA는 방사능 및 요오드화(iodinated)되는 조영제를 요구하지 않으므로, 전산화 단층촬영(computed tomography, CT)의 안전한 대안방법이다. 현재 CE-MRA로 사용 중인 표준ECF(extracellular contrast fluid) 시약은 대조(sontrast)의 극대화를 위해 주사량 및 볼루스(Bolus; 정맥주사의 한 형태) 타이밍의 정확한 제어를 요구한다. 게다가 ECF 시약들은 혈액 내에서 상대적으로 짧은 체류 시간(retention time) 때문에 제한적이며, 조직 주변으로 자유롭게 흘러나온다. 최근에는 BPCAs(blood pool contrast agents)로 언급되는 혈관 내 분포에 관한 새로운 조영제가 사용할 수 있게 되었다. 상기 BPCAs는 강하고, 지속된 혈관 증강을 나타낸다. 이러한 BPCAs의 작용 메커니즘에 따라 세 가지로 분류하여 개발될 수 있다: (1) 간질 공간(interstitial space) 내에서 즉시의 유출을 예방하기 위해 HSA(human serum albumin)에 대한 저분자량 Gd-킬레이트(GdL)의 비공유 결합(non-covalent bond); (2) 조영제 크기의 증가에 따른 폴리머 또는 리포솜을 융합하는 시스템, 이는 내피세포 기공을 통한 유출 속도를 느리게함; 및 (3) 유출 경로의 변화를 수반하는 나노입자를 기반으로한 시스템. 상기 분류 (1)을 가장 성공적으로 나타내는 것은 MS-325 및 B-22956(콜릭산 잔기를 포함하는 Gd-DTPA 유도체)로 알려진 Vasovist이다. 상기 물질들은 HSA에 강하고, 가역적으로 결합하며, 임상의 전계 강도(field strength)에서 높은 이완률을 나타낼 뿐 아니라, ECF 시약들과 비교하면 혈액 내에서 체류 시간이 훨씬 길다. 킬레이트에서 방향족 잔기로 대표되는 친치질성(lipophilic) 구성성분은 Gd-킬레이트 및 HSA 사이의 비공유 상호작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에서, 페로센(ferrocene)은 벤젠(benzene)보다 본질적으로 더 방향족 이므로, 페닐 잔기(phenyl moiety)를 페로센 유도체로 대체 가능하다. 또한 페로센은 다양한 비-산화(non-oxidizing) 매개물(media)에서 화학적으로 안정하며, 원위치(in situ)에서 대사성 ferricinium ion을 형성하기 때문에 작은 위해(harm)를 일으키는 것으로 알려져 있다. 실제로, 몇몇 페로센 컨쥬게이트들은 항종양 활성을 가지는 것으로 보고되고 있다 [P. K, Eur. J. Clin. Pharmacol., 1994, 47, 1; S. Top, A. Vessi, G. Leclercq, Q. Jacques, J. Tang, J. Vaissermann, M. Huchand G. Jaouen, Chem. Eur. J., 2003, 9, 5223 ].

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 높은 방향성을 갖는 페로센을 포함하는 고리형 구조의 상자성 가돌리늄 킬레이트를 제조하는 경우, 혈관 내에서 자기이완율이 뛰어나기 때문에 보다 안정적으로 높은 혈관 조영효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 화학식 1의 구조를 갖는 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 착물 리간드(L)용 조성물 및 상기 화합물을 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 높은 이완율과 열역학 및 속도론적 안정성을 갖는 페로센을 포함하는 고리형의 가돌리늄 착물을 함유하는 혈관 조영제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 페로센을 포함하는 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식에서 R은 H, Et, Me, Ph, 또는 Cyclohexyl이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물의 제조방법을 제공한다:

a) 1,1'-비스(아미노에틸)페로센(1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene)에 DTPA-bis(anhydride)를 첨가하여 반응시키는 단계;

b) 상기 혼합물을 저압에서 용매를 모두 제거한 후, 메탄올을 넣어 녹인 후, 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계;

c) 상기 크로마토그래피로 얻은 용출액의 용매를 제거하고, 잔류물을 아세톤:디에틸에테르 혼합용액과 섞어 분말화 하는 단계; 및

d) 상기 분말화된 물질을 필터, 세척 및 건조하여 고체상태의 DTPA-bis(amide)-페로센을 얻는 단계.

상기 제조방법에 따라 생성되는 화합물의 모식도를 도 1에 나타내었다. 본 발명을 보다 자세히 설명하면 하기와 같다.

상기 a) 단계의 1,1'-비스(아미노에틸)페로센은 초기물질로 1,1'-Diacetylferrocene을 이용하여 합성하게 되는데, 보다 구체적인 방법은 실시예 1에 자세히 나타내었다. 상기 a) 단계를 완료하게 되면 1a 화합물(N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylethyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate)이 합성되며, 이후의 과정들을 완료하면 노란색의 파우더 형태의 DTPA-bis(amide)-페로센 화합물을 얻을 수 있다.

본 발명의 화합물 제조방법에 있어서, 상기 a) 단계의 1,1'-비스(아미노에틸)페로센(1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene) 대신 1,1'-비스(아미노벤질)페로센(1,1'-bis(aminobenzyl)ferrocene)을 첨가하는 것을 특징으로 한다.

상기 1,1'-비스(아미노벤질)페로센은 초기물질로 1,1'-Dibenzoylferrocene을 이용하여 합성한 것이며, 보다 구체적인 방법은 실시예 1에 자세히 나타내었다. 상기 1,1'-비스(아미노벤질)페로센을 이용하여 a) 단계를 완료하면 1b 화합물(N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylbenzyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate)이 합성되며, 이후의 과정들을 완료하면 노란색의 파우더 형태의 DTPA-bis(amide)-페로센 유도체 화합물을 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 포함하는 착물 리간드(L)용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 리간드(L)로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물을 제공한다.

본 발명의 착물에 있어서, 상기 금속원자는 가돌리늄(Gadolinium, Gd)인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 착물에 있어서, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물은 [Gd(L)(H₂O)] 화학식을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 착물의 화학식 중 'L'은 본 발명에 따른 리간드 즉, DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 의미한다.

본 발명의 금속원자를 포함하는 착물은 상기 서술한 바와 같이 합성된 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물(1a 및 1b 화합물)을 이용하여 제조한다. 1a 페로센 화합물과 Gd₂O₃를 반응시켜 가돌리늄 착물(2a 화합물; [N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylethyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate](aquo)gadolinium(III))을 제조하며, 1b 페로센 유도체 화합물과 Gd(OAc)₃을 반응시켜 가돌리늄 착물(2b 화합물; [N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylbenzyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate](aquo)gadolinium(III))을 제조한다. 이렇게 제조된 가돌리늄 착물은 고리형의 구조를 갖는다. 가돌리늄 착물의 보다 구체적인 합성방법은 하기 실시예 2에 나타내었다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명혈관 조영제(CE-MRA)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조영제는 혈액 내에서 단백질과 가역적 비공유 결합하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조영제는 높은 자기이완율, 향상된 열역학적 및 속도론적 안정성을 가지는 것을 특징으로 한다.

구체적으로 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 가돌리늄 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명 혈관 조영제의 상자기성 이완율의 변화(R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0))를 측정하는 경우, acyclic 구조의 조영제들 보다 macrocyclic 구조를 갖는 본 발명의 조영제가 높은 이완율을 나타내었으며, 이는 본 발명의 가돌리늄 착물이 macrocyclic effect를 나타냄을 의미하며, 속도론적 안정성을 띄고 있음을 의미한다 (도 2 참조). 또한 본 발명에 따른 가돌리늄 착물의 이완 시간(T ₁, T ₂)과 이완율(R ₁, R ₂)을 측정하는 경우 상용화되어 있는 조영제와 비교할 때, 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물)이 상당히 높은 R ₁ 값을 지니고 있음을 확인하였다 (표 4 참조). 높은 이완율을 갖는 조영제는 상대적으로 적은 양을 투여해도 높은 조영증강효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 혈관 조영제는 뛰어난 조영증강효과를 보일 것이다. 실제로, 실험용 쥐를 통해 조영효과를 확인한 경우 본 발명의 혈관 조영제를 투여한 후 혈액에서 높은 조영효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다 (도 6a 및 6b 참조).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 제조할 수 있으며, 상기 화합물을 이용하여 고리형의 가돌리늄 착물을 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 가돌리늄 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명혈관 조영제는 현재 사용화되어 있는 다른 조영제보다 열역학적, 속도론적 안정성면에서 우수할 뿐만 아니라, 혈액 내에서 자기이완율이 뛰어나므로 보다 안정적이며, 혈관조영이 가능한 MR 혈관 조영제로서의 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 가돌리늄 착물의 합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 가돌리늄 착물(2a 화합물)과 상용화 되어 있는 MRI 조영제의 상자기성 이완율의 변화(R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0))를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Gd 농도에 따른(0.25, 0.5 및 1.0 mM)가돌리늄 착물(2a 화합물) 및 Omniscan의 물과 혈액에서의 이완률 map 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 가돌리늄 착물(2a 화합물) 및 상용화 되어 있는 MRI 조영제와 혈액 단백질과의 친지질성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 본 발명의 따른 가돌리늄 착물의 농도에 따른 COS-7 세포에서 세포 독성을 관찰한 결과이며, (B)는 IMR-90 세포에서 세포 독성을 관찰한 결과이다.
도 6a 및 6b는 실험용 쥐에 가돌리늄 착물을 투여한 후, 투여 경과 시간에 따른 MR 이미지를 측정한 결과이다.
도 7은 측정된 MR 이미지를 이용하여 CNR을 계산한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. macrocyclic DTPA 컨쥬게이트 제조

macrocyclic DTPA 컨쥬게이트를 제조하기 위한 합성과정은 하기에 자세히 나타내었으며, 각각의 합성된 화합물은 NMR, 원소 분석 및 질량 분석을 이용하여 확인하였다. 합성에 사용된 모든 공업용 시약은 Aldrich로부터 구입하였으며, 모든 실험에서 탈이온수를 사용하였다. ¹H NMR은 경북대학교의 Bruker Advance 400 Spectrometer를 이용하여 수행하였다. NMR 결과에서 화학적 이동(chemical shift)은 TMS(tetramethylsilane)를 기준으로 δ 값으로 나타내었다. 결합 상수(coupling constant)는 Hz로 나타내었다. 원소 분석(elemental analysis)는 경북대학교의 기기 분석 센터와 대구 가톨릭대학교에서 수행하였다. FAB-mass 스펙스라는 JMS-700(Jeol, Japan) mass spectrophotometer(Korea Basic Science Institute)를 이용하였다.

1-1. DTPA-bis(amide)-페로센 합성

(1) 1,1'-Diacetylferrocene 합성

1,1'-Diacetylferrocene의 합성은 페로센(ferrocene, 5.0 g, 26.9 mmol), 아세틸 클로라이드(acetyl chloride, 4.6 ml, 64.5 mmol), 알루미늄(Ⅲ) 클로라이드(aluminum(Ⅲ) chloride, 8.6 g, 64.5 mmol)를 이용하여 문헌에 공개된 방법에 따라 수행하였다 [L. Schwink and P. Knochel, Chem. Eur. J., 1998, 4, 950]. 합성 후 빨간색의 고체 결정의 1,1'-Diacetylferrocene이 얻어졌으며, 크로마토그래피(HEX : EA = 87.5 : 12.5)를 통해 얻은 수득률은 88%(6.4 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 4.77(s, 4H, Fc-H), 4.51(s, 4H, Fc-H), 2.36(s, 6H, -COCH ₃). Anal. Calcd. for C₁₄H₁₄FeO₂: C, 62.25; H, 5.22. Found: C, 62.21; H, 5.22.

(2) 1,1'- bis ( hydroxyethyl )ferrocene 합성

상기에서 합성한 1,1'-Diacetylferrocene(5.0 g, 18.5 mmol)을 건조된 THF 50 mL에 넣어 준비하고, 상기 용액을 0 ℃에서 교반시키면서 건조된 THF 100 mL에 LiAlH₄(1.7 g, 44.4 mmol)를 첨가한 용액을 상기 페로센 용액에 천천히 떨어트려 첨가하였다. 이후 상온에서 3 시간 동안 교반시켜 반응시킨 후, 반응 용액에 탈이온수(deionized water) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 퀀치(quench)시키고, 필터하였다. 필터 후 용액이 두 상(phase)으로 분리되었으며, 이 중 액체상(aqueous phase)은 에틸아세테이트로 추출하였으며, 유기상(organic phase)은 포화된 NaCl로 혼합하고 세척하였다. 혼합된 유기상을 MgSO₄를 이용하여 건조시키고, 필터하고 진공조건에서 용매를 증발시켰다. 이후 정제되지 않은 혼합물을 재결정(recrystallization)(HEX/CH₂Cl₂)으로 정제하였다. 그 결과, 옐로우-오렌지(yellow-orange)색의 1,1'-bis(hydroxyethyl)ferrocene 결정이 얻어졌으며, 수득률은 79%(3.9 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 4.60-4.67(q, 2H, -CHCH₃), 4.15-4.19(m, 8H, Fc-H), 3.76(s, 2H, OH), 1.38-1.40 (d, 6H, -CHCH ₃). Anal. Calcd. for C₁₄H₁₈FeO₂: C, 61.34; H, 6.62. Found: C, 61.30; H, 6.63.

(3) 1,1'-bis(acetoxyethyl)ferrocene 합성

상기에서 합성한 1,1'-bis(hydroxyethyl)ferrocene(5.0 g, 18.2 mmol), acetic anhydride(3.7 mL, 45.6 mmol), Et₃N(5.5 mL, 45.6 mmol) 및 DMAP(0.18 mmol)을 오렌지 오일(orange oil)에 넣어 혼합한 혼합물을 이용하여 문헌에 공개된 방법에 따라 수행하였다 [A. J. Locke, C. Jones and C. J. Richards, Journal of Organometallic Chemistry, 2001, 637-639, 669]. 이후 정제되지 않은 혼합물을 재결정(recrystallization)(HEX)으로 정제하였다. 그 결과, 옐로우(yellow)색의 1,1'-bis(acetoxyethyl)ferrocene 결정이 얻어졌으며, 수득률은 91.9%(6.52 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 5.78-5.84(q, 2H, -CHCH₃), 4.23-4.25(m, 2H, Fc-H), 4.19(m, 2H, Fc-H), 4.13-4.15(m, 4H, Fc-H), 2.05(s, 6H, -COCH ₃), 1.53-1.56(two d merge, 6H, -CHCH ₃). Anal. Calcd. for C₁₈H₂₂FeO₄: C, 60.35; H, 6.19. Found: C, 60.61; H, 6.20.

(4) 1,1'- bis ( aminoethyl )ferrocene 합성

DMF 100 mL에 상기에서 합성한 1,1'-bis(acetoxyethyl)ferrocene(2.0 g, 5.7 mmol)을 넣어 제조한 용액에 NH₄OH 300 mL을 첨가하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액을 냉각 회전기(cooling circulator)로 9 시간 동안 초음파 처리하고, 이때 초음파 처리와 함께 4 시간 동안은 30 mL의 NH₄OH를 첨가하였다. 얻어진 오렌지색의 혼합물은 MTBE와 2 N의 HCl을 이용하여 분리하였다. 액체상(aqueous phase)은 MTBE로 추출하고, 2 N NaOH를 이용하여 pH를 9 이상으로 적정하였다. 혼합된 유기층(organic layer)는 포화된 NaCl로 세척하고, MgSO₄를 이용하여 건조하였다. 건조 후 얻어진 화합물은 세정과정이 불필요할 만큼 완전히 깨끗한 상태였다. 결과적으로 옐로우-오렌지(yellow-orange)색의 1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene 오일이 얻어졌으며, 화학물의 수득률은 78%(1.2 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 4.09-4.16(m, 8H, Fc-H), 3.79-3.84(m, 2H, -CHCH₃), 1.66-1.69(br m, 4H, -NH ₂), 1.32-1.34(d, 6H, -CHCH ₃).

(5) 1a 화합물 합성

상기에서 합성한 1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene(1.0 g, 3.6 mmol)을 건조된 DMF 20 mL에 넣어 준비하고, 상기 용액을 교반시키면서 건조된 DMF 30 mL에 DTPA-bis(anhydride)(1.3 g, 3.6 mmol)를 첨가한 용액을 상기 페로센 용액에 첨가하였다. 이후 혼합액을 65 ℃에서 20 시간 동안 교반시켜 반응시켰다. 이후 반응용액으로부터 감압(reduced pressure)하에서 용매를 제거하고, 메탄올(2 mL)로 잔류물(residue)을 용해시켰다. 이후 용액을 실리카 겔(silica gel)(60 mesh)의 짧은 컬럼을 통과시켰으며, 이때 용리액으로 메탄올을 사용하였다. 컬럼을 통과한 용출액(eluate)으로부터 용매를 제거하여 얻어진 잔류물은 아세톤 및 디에틸에테르 혼합용액(30:70 v/v, 150 mL)과 섞어 분말화하였다. 이후 필터하고, 아세톤(3×30 mL)으로 세척하고, 70 ℃에서 8 시간 동안 진공 하에서 건조하여 고체 생성물을 분리하였다. 그 결과, 얻어진 화합물은 노란색의 파우더 형태의 N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylethyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate였으며, 수득률은 43.3%(1.0 g) 이었다.

¹H NMR (DMSO): δ = 8.08-8.10(d, 2H, -NH), 4.74(s, 2H, -CHCH₃), 4.10-4.22(m, 8H, Fc-H), 3.26-3.39(m, 10H, -NHCOCH ₂-(4H), -NCH ₂COO-(6H)), 2.81-2.99(m, 8H, -NCH ₂CH ₂N-), 1.26-1.32(d, 6H, -CHCH ₃). Anal. Calcd. for C₂₈H₃₉FeN₅O₈ㆍ4H₂O: C, 47.94; H, 6.75; N, 9.98. Found: C, 47.56; H, 6.65; N, 9.32. HR-FABMS (m/z): calc. for C₂₈H₄₀FeN₅O₈, 630.2227([MH]⁺), C₂₈H₃₉FeN₅NaO₈, 652.2046([MNa]⁺). Found: 630.2229([MH]⁺), 652.2048([MNa]⁺).

1-2. DTPA - bis ( amide )- 페로센 유도체 합성

(1) 1,1'- Dibenzoylferrocene 합성

1,1'-Dibenzoylferrocene의 합성은 페로센(ferrocene, 5.0 g, 26.9 mmol), 벤조일 클로라이드(benzoyl chloride, 12.5 ml, 107.5 mmol), 알루미늄(Ⅲ) 클로라이드(aluminum(Ⅲ) chloride, 14.3 g, 107.5 mmol)를 이용하여 문헌에 공개된 방법에 따라 수행하였다 [L. Schwink and P. Knochel, Chem. Eur. J., 1998, 4, 950]. 합성 후 빨간색의 고체 결정의 1,1'-Dibenzoylferrocene이 얻어졌으며, 크로마토그래피(HEX : EA = 9 : 1)를 통해 얻은 수득률은 72.3%(7.5 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 7.77-7.79(d, 4H, Ph-H), 7.52-7.56(t, 2H, Ph-H), 7.40-7.44(t, 4H, Ph-H), 4.92(s, 4H, Fc-H), 4.58(s, 4H, Fc-H). Anal. Calcd. for C₂₄H₁₈FeO₂: C, 73.12; H, 4.60. Found: C, 73.02; H, 4.56.

(2) 1,1'-bis(hydroxybenzyl)ferrocene 합성

상기에서 합성한 1,1'-Dibenzoylferrocene(3.0 g, 7.8 mmol)을 건조된 THF 100 mL에 넣어 준비하고, 상기 용액을 0 ℃에서 교반시키면서 건조된 THF 150 mL에 LiAlH₄(11.8 g, 310.9 mmol)를 첨가한 용액을 상기 페로센 용액에 천천히 떨어트려 첨가하였다. 이후 상온에서 밤새도록(overnight) 교반시켜 반응시킨 후, 반응 용액에 탈이온수(deionized water) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 퀀치(quench)시키고, 필터하였다. 필터 후 용액이 두 상(phase)으로 분리되었으며, 이 중 액체상(aqueous phase)은 에틸아세테이트로 추출하였으며, 유기상(organic phase)은 포화된 NaCl로 혼합하고 세척하였다. 혼합된 유기상을 MgSO₄를 이용하여 건조시키고, 필터하고 진공조건에서 용매를 증발시켰다. 이후 정제되지 않은 혼합물을 재결정(recrystallization)(MTBE)으로 정제하였다. 그 결과, 노란색의 고체 결정의 1,1'-bis(hydroxybenzyl)ferrocene이 얻어졌으며, 수득률은 87.4%(2.7 g) 이었다.

¹H NMR (DMSO): δ = 7.09-7.28(m, 10H, Ph-H), 5.79(d, 1H, -OH), 5.70-5.71(d, 1H, -OH), 5.36-5.37(t, 2H, -CH-Ph), 4.20-4.21(m, 1H, Fc-H), 4.12-4.14(m, 1H, Fc-H), 4.04-4.05(m, 1H, Fc-H), 3.95-4.00(m, 5H, Fc-H). Anal. Calcd. for C₂₄H₂₂FeO₂: C, 72.38; H, 5.57. Found: C, 72.44; H, 5.59.

(3) 1,1'- bis ( acetoxybenzyl )ferrocene 합성

상기에서 합성한 1,1'-bis(hydroxybenzyl)ferrocene(2.0 g, 5.0 mmol), acetic anhydride(12.8 mL, 135.6 mmol), 피리딘(pyridine, 60.6 mL, 502.3 mmol)을 오렌지 오일(orange oil)에 넣어 혼합한 혼합물을 이용하여 문헌에 공개된 방법에 따라 수행하였다 [A. J. Locke, C. Jones and C. J. Richards, Journal of Organometallic Chemistry, 2001, 637-639, 669]. 이후 합성된 화합물은 세정과정이 불필요할 만큼 완전히 깨끗한 상태였다. 그 결과, 노란색의 1,1'-bis(acetoxybenzyl)ferrocene 결정이 얻어졌으며, 수득률은 83.4%(1.65 g) 이었다.

¹H NMR (CDCl₃):δ = 7.19-7.30(m, 10H, Ph-H), 6.54-6.56(d, 2H, -CH-Ph), 4.21-4.22(m, 1H, Fc-H), 4.14(m, 1H, Fc-H), 3.99-4.02(m, 2H, Fc-H), 3.94-3.97(m, 2H, Fc-H), 3.89-3.90(m, 1H, Fc-H), 3.81-3.82(m, 1H, Fc-H), 2.00-2.01(d, 6H, COCH ₃).

(4) 1,1'-bis(aminobenzyl)ferrocene 합성

DMF 80 mL에 상기에서 합성한 1,1'-bis(acetoxybenzyl)ferrocene(0.5 g, 2.1 mmol)을 넣어 제조한 용액에 NH₄OH 150 mL을 첨가하여 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액을 냉각 회전기(cooling circulator)로 9 시간 동안 초음파 처리하고, 이때 초음파 처리와 함께 4 시간 동안은 50 mL의 NH₄OH를 첨가하였다. 이후 얻어진 오렌지색의 혼합물을 MTBE와 2 N의 HCl을 이용하여 분리하였다. 액체상(aqueous phase) MTBE로 추출하고, 2 N NaOH를 이용하여 pH를 9 이상으로 적정하였다. 혼합된 유기층(organic layer)는 포화된 NaCl로 세척하고, MgSO₄를 이용하여 건조하였다 [C.F. G. C. Geraldes, A. M. Urbano, M. C. Alpoim, A. D. Sherry, K. T. Kuan, R. Rajagopalan, F. Maton, R. N. Muller, Magn. Reson. Imaging, 1995, 13, 401]. 건조 후 얻어진 화합물은 세정과정이 불필요할 만큼 완전히 깨끗한 상태였다. 결과적으로 노란색의 1,1'-bis(aminobenzyl)ferrocene 고체 결정이 얻어졌으며, 수득률은 78%(0.6 g) 이었다.

¹H NMR (DMSO): δ = 7.14-7.35(m, 10H, Ph-H), 4.76(s, 2H, -CH-Ph), 4.31-4.33(d, 2H, Fc-H), 4.08-4.10(m, 6H, Fc-H), 2.24(s, 4H, -NH ₂). Anal. Calcd. for C₂₄H₂₄FeO₂: C, 72.74; H, 6.10; N, 7.07. Found: C, 72.31; H, 6.03; N, 6.40.

(5) 1b 화합물 합성

상기에서 합성한 1,1'-bis(aminobenzyl)ferrocene(0.8 g, 2.0 mmol)을 건조된 DMF 20 mL에 넣어 준비하고, 상기 용액을 교반시키면서 건조된 DMF 30 mL에 DTPA-bis(anhydride)(0.8 g, 2.2 mmol)를 첨가한 용액을 상기 페로센 용액에 첨가하였다. 이후 혼합액을 65 ℃에서 20 시간 동안 교반시켜 반응시켰다. 이후 반응용액을 감압(reduced pressure)하에서 용매를 제거하고, 메탄올(2 mL)로 잔류물(residue)을 용해시켰다. 이후 용액을 실리카 겔(silica gel)(60 mesh)의 짧을 컬럼을 통과시켰으며, 이때 용리액으로 메탄올을 사용하였다. 컬럼을 통과한 용출액(eluate)으로부터 용매를 제거한 후 얻어진 잔류물은 아세톤 및 디에틸에티르 혼합용액(30:70 v/v, 150 mL)과 섞어 분말화하였다. 이후 필터하고, 아세톤(3×30 mL)으로 세척하고, 70 ℃에서 8 시간 동안 진공 하에서 건조하여 고체 생성물을 분리하였다. 그 결과, 얻어진 화합물은 노란색의 파우더 형태의 N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylbenzyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate였으며, 수득률은 86.7%(1.3 g) 이었다.

¹H NMR (DMSO): δ = 8.82-8.89(d, 2H, -NH), 7.19-7.33(m, 10H, Ph-H), 5.85-5.95(m, 2H, -CH-Ph), 4.02-4.27(m, 8H, Fc-H), 3.39-3.49(m, 10H, -NHCOCH ₂-(4H), -NCH ₂COO-(6H)), 2.73-3.16(m, 8H, -NCH ₂CH ₂N-). Anal. Calcd. for C₃₈H₄₃FeN₅O₈ㆍ3H₂O: C, 56.51; H, 6.12; N, 8.67. Found: C, 56.49; H, 6.17; N, 8.87. HR-FABMS (m/z): calc. for C₃₈H₄₄FeN₅O₈, 754.2540([MH]⁺), C₃₈H₄₃FeN₅NaO₈, 776.2359([MNa]⁺). Found: 754.2543([MH]⁺), 776.2363([MNa]⁺).

실시예 2. 페로센 포함하는 고리형 구조의 가돌리늄 착물 제조

상기 실시예 1에서 합성한 macrocyclic DTPA 컨쥬게이트를 이용하여 고리형 구조의 가돌리늄 착물을 제조하였다. 가돌리늄 착물을 제조하기 위한 합성과정은 하기에 자세히 나타내었으며, 각각의 합성된 화합물은 FAB-Mass를 이용하여 확인하였다. FAB-mass 스펙스라는 JMS-700(Jeol, Japan) mass spectrophotometer(Korea Basic Science Institute)를 사용하여 얻어내었다.

2-1. 가돌리늄 착물 1(2a 화합물)의 합성

pH 7.2의 탈이온수 20 mL에 Gd₂O₃(0.3 g, 0.8 mmol)을 첨가하여 제조한 용액을 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 환류(reflux) 하에서 상기 플라스크에 합성한 DTPA-bis(amide)-페로센(1a)(0.5 g, 0.8 mmol)을 첨가하였다. 이후 반응 혼합물을 90 ℃에서 6 시간 동안 더 교반시킨 후, 고체 불순물을 셀라이트(celite)를 통해 필터하여 제거하고, 잔류물은 아세톤 100 mL과 섞어 분말화하였다. 이후 필터하고, 아세톤(3×30 mL)으로 세척하고, 실리카 겔 컬럼을 통과시켜 소량의 메탄올로 용해시켜 고체 물질을 얻어내었다. 이후 용매를 제거하고, 옅은 노란색의 고체 물질을 메탄올 및 아세톤(2:1 v/v) 혼합용매로 녹인 후, -4 ℃에서 결정화하였다. 그 결과, 옅은 노란색의 가돌리늄 착물 1 (2a 화합물; [N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylethyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate](aquo)gadolinium(III))이 얻어졌으며, 수득률은 96%(0.6 g) 이었다.

Anal. Calcd. for C₂₈H₃₆FeGdN₅O₈ㆍ7H₂O: C, 36.96; H, 5.54; N, 7.70. Found: C, 36.92; H, 5.32; N, 7.38. HR-FABMS (m/z): calc. for C₂₈H₃₇FeN₅O₈Gd, 785.1243([MH]⁺). Found: 785.1230.

2-2. 가돌리늄 착물 2(2b 화합물)의 합성

피리딘 20 mL 및 탈이온수 10 mL에 Gd(OAc)₃(0.3 g, 0.8 mmol)을 첨가하여 제조한 용액을 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 상기 플라스크에 합성한 DTPA-bis(amide)-페로센 유도체(1b)(0.5 g, 0.7 mmol)를 첨가하였다. 이후 혼합물을 70 ℃에서 밤새도록(overnight) 교반시켰다. 교반완료 후, 반응 혼합물의 용매를 제거하고, 잔류물을 에탄올 70 mL로 녹인 후 2 시간 동안 환류(reflux) 시켰다. 이후 고체 불순물을 제거하기 위해 상기 반응 혼합물을 식히고, 셀라이트(celite) 컬럼을 통과시켰다. 불순물을 제거한 용액을 실리카 겔 컬럼을 통과시킨 후, 디에틸에테르 10 mL을 첨가하여 침전시켜, 노란색의 분말을 얻어내었다. 이를 소량의 메탄올로 용해시킨 후 -4 ℃에서 결정화하였다. 그 결과, 노란색 결정의 가돌리늄 착물 2 (2b 화합물; [N,N''-(1.1'-ferrocenediylcarbamoylbenzyl)diethylenetriamine-N,N'',N'''-triacetate](aquo)gadolinium(III))가 얻어졌으며, 수득률은 94%(0.6 g) 이었다.

Anal. Calcd. for C₃₈H₄₀FeGdN₅O₈ㆍ6H₂O: C, 44.92; H, 5.16; N, 6.89. Found: C, 44.34; H, 5.11; N, 6.79. HR-FABMS (m/z): calc. for C₃₈H₄₁FeGdN₅O₈, 909.1558([MH]⁺), C₃₈H₄₁FeGdN₅NaO₈, 931.1365. Found: 909.1549([MH]⁺), 931.1354([MNa]⁺).

2-3. 가돌리늄 착물의 점도 및 몰랄삼투압농도 측정

점도(viscosity) 측정은 경북대학교의 Brookfield DV-2+Pro/LVDV-2+Pro를 이용하였으며, 몰랄삼투압농도(Osmolality) 측정은 방사능 의학 연구원(Seoul)의 5004 MICRO-OSMETTE^TM 정밀 시스템으로 수행하였다. 측정 결과는 표 1에 나타내었다. 비교의 목적으로 현재 상용화되어 있는 MRI 조영제 Magnevist 및 Omniscan과 MR 혈관 조영제인 MS-325을 대조군으로 설정하였다.

Osmolarity가 높으면 인체 내의 조직 간의 삼투압에 영향을 주게 되므로 혈액의 osmolarity와 가장 유사하므로, osmolarity가 낮을 수록 좋다. 그리고 ionic한 type의 조영제들은 높은 삼투압으로 인해 인체에 좋지 않은 영향을 준다고 알려져 있으며, 또한 viscosity는 점성을 나타내는 수치로써 점성이 높으면 환자가 injection 시 통증을 느끼게 되며 혈액의 점성과도 차이가 나게 되므로 주사 시 인체에 상당한 부담을 주게된다. 따라서 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물)은 non-ionic, 즉 중성으로 삼투압도 높지 않으면서 점성 또한 다른 조영제들에 비해 낮기 때문에 매우 안정한 조영제이다.

[표 1. 다양한 착물들의 점도 및 몰랄삼투압농도 (at 310K)]

실시예 3. 전위차 측정( potentiometric measurement ) 및 계산 방법( computational method )

전위차 적정(potentiometric titration)은 DTPA-bis-amide(1a 화합물)의 평형 상수(protonation constant) 및 금속 복합체의 안정화 상수(stability constant)를 결정하기 위해 자동적정장치(automatic titrator)로 수행하였다. 상기 자동적정 시스템은 798 MPT Titroprocessor, 728 교반기 및 PT-100 combination pH electrode (Metrohm)으로 구성되어 있다. pH 전극은 표준 버퍼 용액으로 보정하였으며, 모든 보정(calibration)과 적정(titration)은 0.10 mol/dm³ KCl의 이온 강도에서 25±0.1 ℃로 자동조정된 봉인된 유리 용기(50 cm³) 내에서 CO₂-free 질소 하에서 수행하였다. 금속 이온의 농도와 아미드 용액(amide solution)은 약 0.5 mmol/dm³로 유지하였다. CO₂-free KOH 용액(0.100 mol/dm³)은 적정(titration)하는 동안 이온 강도의 변화를 최소화하기 위해 적정제(titrant)로써 사용되었다. 다이옥시젠(dioxygen) 및 이산화탄소(carbon dioxide)는 적정 셀(titration cell)에서 정제된 질소의 양압(positive pressure)을 유지시킴으로써 반응 혼합물로부터 차단하였다. 셀의 기전력(electromotive force)은 E = E'⁰ + Q log[H⁺] + E_j로 계산되며, 여기서 E'⁰와 Q는 적정(titration)의 산성 범위(acid range)를 이용하여, 동일한 이온 강도에서 알려진 수소 이온 농도로 용액을 적정함으로써 결정하였다. 액간접촉전위(liquid junction potential; E_j)는 이용된 실험조건 하에서는 무시해도 무방하다. 리간드들의 평형 상수와 수용액에서 형성된 다양한 금속 복합체들의 안정화 상수는 컴퓨터 프로그램 HYPERQUAD를 이용하여 적정 데이터(titration data)로부터 결정하였다. 상기 방법의 정확도(accuracy)는 [DTPA-BMA]^3-의 Ca(Ⅱ), Zn(Ⅱ), Cu(Ⅱ) 및 Gd(Ⅲ) 복합체에 대한 평형 및 안정화 상수를 측정함으로써 증명하였다. 측정된 결과 값들은 참고문헌에 기재된 것과 비교하였다 [Magn. Reson. Imaging., 1990, 8(4), 467-481]. DTPA-bis(amide)-페로센(1a 화합물)의 평형 상수는 pH 2 ~ 11 범위에서 전위차 적정(potentiometric titration)으로 측정하였으며, 평형 상수(K _i ^H) 값은 하기 등식 1에 따라 계산하였다. 여기서 I는 상수 1, 2,... 이다.

<등식 1>

대조군으로 DTPA-BMA, DTPA 및 DOTA에 대해서 측정된 평형 상수는 하기 표 1에 나타내었다. 이미 알려진 바와 같이, DTPA-bis(amide) 리간드들은 첫 번째 양성자 첨가를 중앙의 질소 원자에 위치시키는 반면, 두 번째, 세 번째 양성자 첨가시에는 말단 아민 질소 원자에 위치시킨다 [C.F. G. C. Geraldes, A. M. Urbano, M. C. Alpoim, A. D. Sherry, K. T. Kuan, R. Rajagopalan, F. Maton, R. N. Muller, Magn. Reson. Imaging., 1995, 13, 401].

열역학적 안정화 상수(thermodynamic stability constant, K_ML ₍ _therm ₎)는 하기 등식 2에 따라 계산하며, 여기서 M은 비가수분해된 아쿠아 금속 이온(unhydrolyzed aqua metal ion; Gd, Ca, Zn, Cu)이고, L은 총 탈양성자화된(deprotonated) 자유 리간드이며, ML은 비양성자화(non-protonated) 및 비가수분해(non-hydrolyzed)된 복합체를 나타낸다.

<등식 2>

직접적인 전위차 적정(potentiometric titration) 방법은 낮은 pH 때문에 bis(amides)의 Gd(Ⅲ) 복합체들의 안정화 상수 측정에 상용되지 않는다. 대신에, Gd(Ⅲ) 이온에 대한 EDTA 및 bis(amide) 리간드(L) 간의 리간드-리간드 경쟁적 전위차 적정 방법을 이용하여 결정하였다 [W. R. Harris, A. E. Martell, Inorg. Chem., 1976, 15, 713; Y. Li, A. E. Martell, R. D. Hancock, J. H. Reibenspies, C. J. Anderson, M. J. Welch, Inorg. Chem., 1996, 404; C. H. Taliaferro, R. J. Motekaitis, A. E. Martell, Inorg. Chem., 1984, 23, 1188]. 하지만 Cu(Ⅱ), Zn(Ⅱ) 및 Ca(Ⅱ) 복합체의 안정화 상수는 리간드의 직접 적정(direct titration) 방법을 이용하여 측정하였다.

조건부 안정화 상수(conditional stability constant)는 주어진 pH에서 복합체의 양(extent)을 나타낸다. 생리적 pH에서 복합체들의 안정성을 이해하기 위해, pH 7.4에서 복합체들의 안정화 상수를 하기 등식 3을 이용하여 평가하였다. 여기서 K _n ^H(n=1, 2, 3, ...)는 리간드의 단계적 평형 상수(stepwise protonation constant)이다.

<등식 3>

변형된 선택 상수(selectivity constant, K' _sel)는 하기 등식 4 내지 8을 이용하여 계산할 수 있다. 여기서 α는 사이드 반응 계수(side reaction coefficient)이다.

<등식 4 내지 8>

pH 7.4에서 1a의 Gd(Ⅲ) 복합체에 대한 K' _sel 값은 [Cu(Ⅱ)] = 1.0×10^-3 mM, [Ca(Ⅱ)] = 2.5 mM 및 [Zn(Ⅱ)] = 5.0×10^-2 mM의 생체내 농도를 이용하여 계산하였다 . 모든 안정화 상수 측정 값은 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에 나타낸 평형상수들은 금속과 리간드 사이의 안정성을 확인하기 위해 측정한 것이다. 일반적으로 basicity(∑pK _a )가 높을수록 금속과 리간드의 안정도 상수가 높은 것으로 알려져 있으며, 실험을 통해 본 발명의 리간드(1a 화합물)가 DTPA-BMA와 유사한 basicity를 나타냄을 확인하였다 (표 2, ∑pK _a ). 그리고 상기 측정된 평형상수로부터 금속과 리간드의 안정도를 얻었다 (표 2, [GdL]/[Gd][L] 및 {logK _GdL(pH7.4)}). 측정 결과, 가돌리늄과 리간드의 안정도 상수는 리간드를 1a 화합물로 하였을 경우 가장 높은 값을 나타내었다. 이는 리간드가 macrocyclic 구조를 이루고 있기 때문인 것으로 사료된다.

또한 여러 금속과 리간드의 안정화 정도를 측정하기 위해, 금속 선택성 안정도를 측정하였다 (표 2, logK′_sel). 측정 결과, 착물 제조시 리간드를 1a 화합물로 할 경우 다른 조영제보다 더 높은 금속 선택성 안정도를 나타냄을 알 수 있다. 그리고 각 조영제들의 pM 값을 측정하여 용액속에서 존재할 금속이온의 양을 확인하였다. 일반적으로 pM 값이 높을수록 용액 속에 존재하는 금속이온의 양은 적다. 본 발명에 따른 가돌리늄 착물에서 가돌리늄 금속에 대한 리간드(1a 화합물)의 pM 값은 다른 조영제와 비교할 때 가장 높게 측정되는 것으로 보아, 가돌리늄 착물과 리간드의 금속 결합정도가 가장 우수하고, 안정성도 높은 것으로 사료된다.

[표 2. pH 7.4에서 Gd³ ⁺, Ca² ⁺, Zn² ⁺ 및 Cu² ⁺ 복합체들의 평형 상수(K _i ^H), ML(I=0.10 mol/dm³)의 안정화 및 선택 상수 및 pM ^a 값]

실시예 4. 금속교환( transmetallatin ) 운동

Gd-착물은 비록 열역학적으로 안정하더라고, 속도론적으로는 생체 내 이온에 의해 금속교환이 일어날 수 있으며, 이 과정에 의해 상자기성 가돌리늄(Gd(Ⅲ)) 이온이 complex에서 빠져나오게 된다. 이런 생체 내 이온으로는 구리, 칼슘, 망간 등이 있다. 구리이온은 생체 내의 혈액에 아주 작은 양(1 ~ 10 mol/L)이 존재하고, 칼슘 이온은 DTPA나 DOTA에 비해 상대적으로 낮은 결합 정도를 띄고 있다(Gd에 비해 대략 log10 정도 낮음). 망간만이 유일하게 혈액 내에서 가돌리늄 이온과 교환이 일어날 정도로 충분한 양(55 ~ 125 mol/L)을 가지고 있을 뿐만 아니라 열역학적으로 가돌리늄에 비해 4배 정도 낮다. 따라서 망간이온이 존재하는 상태에서의 Gd-complex의 안정성은 아주 중요하다. 신체 내에서 생체 내 이온에 의해 금속교환(transmetallation)이 발생한다면, 자유 가돌리늄 이온을 생성할 것이고 생체 내의 다른 이온이 리간드와 결합하여 신장을 통해 체외로 배출될 것이다.

만약 망간이온에 의해 상자기성 가돌리늄 착물에 금속교환(transmetallation)이 일어나게 되면, phosphate 완충 용액에 의해 자유 가돌리늄이온이 GdPO₄ 형태가 되는데, 수용성이 매우 낮고(K _sp = 10^-22.2 mol²/L²), 이로 인해 물의 양성자 이완율에 영향을 주지 못하게 된다. 따라서 시간에 따른 상대적인 값, R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0)는 금속교환을 측정하는 좋은 방법이다. 시간에 따른 R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0)의 변화는 속도론적인 측면에서 어느 정도의 정보를 제공하고, 이론적으로 시간이 무한대(t=∞)가 되면 열역학적인 측면을 반영한다.

본 발명에 따른 가돌리늄 착물의 금속교환 운동을 확인하기 위해 2.5 mmol/L의 Gd 복합체와 ZnCl₂가 Phosphate 완충용액(pH 7.4) 상에서 시간에 따라 변화하는 물의 양성자 이완율(proton relaxation rate, R ₁ ^P)을 측정하였으며, 이는 문헌에 공개된 방법에 따라 수행하였다 [S. Laurent, L. V. Elst, F. Copoix and R. N. Muller, Invest. Radiol . 2001, 36, 115].

이완율의 변화를 확인하기 위하여, 1 ml의 Gd 복합체 완충용액에 10 μL(250 mmol/L)의 ZnCl₂ 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 강하게 교반시켜 잘 혼합되도록 한 후, 300 μL를 취하여 이완지도법 연구(relaxometry study)에 사용하였다. 또한 대조효과를 확인하기 위해, Dotarem, Multihance및 Omniscan를 아연 아세테이트(Zinc acetate)에서 상기와 동일한 실험을 수행하였다. R ₁ ^P 이완율은 R ₁ = (1/T ₁) 이완율로부터 물의 양성자 이완의 반자성(diamagnetic) 기여를 감산(subtraction)한 후 얻어내었다. 측정은 상온에서 3 T whole body system(Magnetom Tim Trio, siemens, Germany)으로 수행하였다. 측정 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2는 상자기성 이완율의 변화(R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0))를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페로센을 포함하는 가돌리늄 착물(2a)의 플롯(plot)이 Gd-macrocyclic인 Dotarem과 Gd-acyclic DTPA인 Multihance및 Omniscan의 중간정도에 위치함을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 가돌리늄 착물이 macrocyclic effect를 나타냄을 의미하며, 속도론적 안정성을 띄고 있음을 알 수 있다. 본 발명의 가돌리늄 착물에서 링(ring) 내의 long-distance Fe...Gd 간의 약한 상호작용으로 인해 Gd 킬레이트가 약한 기저상태(ground-state) 안정성을 갖는 것으로 사료되며, 기저상태로 인해 열역학적 안정성을 갖는 것으로 해석될 수 있다.

Omniscan, Multihance에서는 급격한 감소 효과가 나타나는데, 이는 acyclic open-chain DTPA-bis(amide) motif에 의해서 발생한 것으로 판단된다.

실시예 5. 운동 상수( kinetic constant ) 측정

본 발명의 가돌리늄 착물의 운동 상수(kinetic constant)들은 하기 등식 9 내지 12에 따라 측정하였다 [S. Laurent, L. V. Elst, F. Copoix and R. N. Muller, Invest . Radiol. 2001, 36, 115]. 그리고 비교 목적으로 현재 상용화 되어 있는 조영제인 Dotarem, Multihance 및 Omniscan의 운동 상수를 함께 나타내었다.

<등식 9>

여기서 k _f 및 k _r 은 각각 정방향(forward) 금속교환 반응(transmetallation reaction) 및 역방향(reverse) 금속교환 반응에 대한 속도 상수를 나타낸 것이다. 금속교환 속도는 하기 등식 10으로부터 작성될 수 있다. 이때 가돌리늄 착물의 초기 농도([GdL]₀)에서는 [ZnL] = [GdL]₀ - [GdL] 이다.

<등식 10>

시간 t에서 [GdL]의 농도는 하기 등식 11에 의해 작성될 수 있다.

<등식 11>

k ₁ = k'_f + k'_r 이고, [GdL]_∞은 [GdL]의 평형농도(equilibrium concentration) 이다. 따라서 k'_f는 하기 등식 12에 의해 측정될 수 있다.

<등식 12>

k'_f 값은 실험 데이터를 각 식에 대입함으로써 얻어진다. 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

표 3에서 K ₁은 상수이며, [Lig Gd]_∞는 Ligand Gd가 평형이되는 농도로써 k'_f 값을 피팅(fitting)할 때 계산되는 상수이다. k'_f 측정 수치가 크다는 것은 상기 식에서 볼 수 있듯이 리간드에서 Gd가 떨어지고, ZnL(Ligand+Zn)이 형성되는 방향으로 많이 이동한다는 것이기 때문에, kinetic inertness가 낮다는 것, 즉 불안정 하다고 할 수 있다. 따라서 측정된 결과로 볼 때, 본 발명의 2a 화합물은 대조군인 Dotarem 보다는 안정성이 떨어지나 다른 상용화 되어 사용되고 있는 조영제들에 비해서는 비교적 안정성이 있는 수치를 보여주는 것이라고 볼 수 있다.

[표 3. Kinetic constants]

실시예 6. 이완 시간( relaxation time ) 및 이완율( relaxivity )

상기에서 제조한 가돌리늄 착물의 이완 시간(T ₁, T ₂)과 이완율(R ₁, R ₂)을 물(water)과 혈액(blood)에서 측정하였다. 높은 이완율을 갖는 조영제는 상대적으로 적은 양을 투여해도 높은 조영증강효과를 나타낸다.

T ₁ 측정은 1.5 T 에서 다양한 T ₁(inversion time)에 따른 inversion 회복(inversion recovery)을 사용하여 확인하였다. MR 이미지는 35 가지의 다른 T ₁ 값(50 ~ 1750 msec)에서 얻어졌다. T ₁ 이완시간(relaxatin time)은 각각의 T ₁ 값에서 측정된 signal intensity의 비선형 최소 제곱 방법(non-linear least squares fit)에 의해 측정되었으며, T ₂ 측정은 다양한 spin-echo 측정을 위한 CPMG(Carr Purcell Meiboon Gill) pulse sequence를 적용하여 이루어 졌다. 34 가지의 다른 영상은 10 ~ 1900 msec 범위에 이르는 34 가지의 TE(echo time) 값으로부터 얻어졌다. T ₂ 이완 시간은 각각의 TE(echo time)에서 다양한 spin-echo 측정에 대한 픽셀의 평균값을 비선형 최소 제곱 방법(non-linear least squares fit)에 적용하여 얻어내었다. 이완률(relaxivity)은 이완시간당 mM의 역수(R=1/sㆍmM)로 계산되었다. 결정된 이완시간(T ₁ 및 T ₂)과 이완율(R ₁ 및 R ₂)은 최종적으로 각각 이완시간 맵(map)과 이완률 맵(map)으로 변환시켰다. 상기 맵(map) 이미지는 동일 농도에서 비교를 목적으로 Omniscan과 가돌리늄 착물(2a 및 2a/HSA(human serum albumin))을 동시에 얻어내었으며, 이완율 데이터는 Magnevist 및 MRI bllod-pool agent로 잘 알려진 MS-325의 데이터를 비교하여 나타내었다. 측정 결과는 표 4 및 도 3에 나타내었다.

먼저 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 가돌리늄 착물(2a 화합물)은 물에서 다른 착물들에 비해 가장 높은 이완율을 나타냄을 확인할 수 있으며, 뿐만 아니라 혈액에서도 높은 이완율을 나타내었다. 특히 혈관 조영제로 알려진 MS-325(0.51)보다 높은 R ₁/R ₂ 값(0.63)을 나타내었다. 이러한 2a 화합물의 물에서의 높은 이완율은 무거운 페로센 유닛(heavy ferrocene unit)에 의해 입체적으로 팽창된 링(ring)이 형성되어 tumbling motion(longer rotational correlation time, τ_R)이 느리게 나타나는 현상으로 설명될 수 있다. 또한 혈액에서의 이완율 증가는 방향족 페로센과 HSA의 친지질성 상호작용(lipophilic interaction)에 인한 것으로 설명된다.

그리고 도 3은 상용화되어 사용되고 있는 Omniscan 조영제와의 R₁ 비교 map 뿐만아니라 HSA이 있을 때와 없을 때의 2a 화합물의 R₁ map을 함께 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 2a 화합물은 HSA이 있을 때 다른 두가지 조영제(just 2a 화합물 및 Omniscan)보다 더 밝으며 이를 Gd 농도에 따라 보여주고 있다.

상기 결과들을 종합해보면, 화합물 2a는 혈관 조영제로 알려진 MS-325와 마찬가지로 HSA 조건일 때 더 높은 이완률(relaxivity) 값을 나타내었다. 이는 2a 화합물이 HSA과 상호작용(interaction)하여 이완률이 높아졌기 때문이며, 그 이유는 2a 화합물과 HSA의 non-covalent bonding으로 인해 complex의 tumbling motion이 느려졌기 때문이다. 다시말하면, 이완률(relaxivity)에 영향을 주는 인자인 rotational correlation time이 커졌기 때문이라고 할 수 있다. 뿐만 아니라 HSA이 없는 물(water) 상태에서의 이완률과 HSA가 있을 때의 이완율의 증가율 차이는 MS-325보다 작지만 T ₁ 조영제로써의 능력을 가늠할 수 있는 R ₁/R ₂ ratio는 오히려 조금 더 높기 때문에 조영효과가 좋은 것으로 사료된다.

[표 4. 가돌리늄 착물의 이완시간 및 이완율 (64MHz; 310 K, 2a at 293 K)]

실시예 7. 혈청 안정성 분석( Serum stability assay )

혈청 안정성 테스트를 위해 HPLC를 이용하여 자유 Gd³ ⁺ 이온의 상대적인 양을 측정해온 기존의 방법 대신에 [T. Frenzel, P. Lengsfeld, H. Schirmer, J. Hand H. J. Weinmann, Invest. Radiol. 2008, 43, 817], 본 발명자들은 혈청 용액의 가돌리늄 착물(GdL, 2a 화합물)에 대한 배양 시간의 함수로써 이완율의 변화(R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0))를 측정함으로써 [Gd³ ⁺] 농도를 결정하는 정성 방법(qualitative method)을 개발하였다. 상기 방법의 일반적인 절차는 하기와 같다. 먼저 4 ℃에서 인간 혈청 수용액(180 μL)에 본 발명의 가돌리늄 착물 수용액(2a 화합물, 20 μL, 5mM)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 서로 다른 시간 간격(0 분, 30 분, 1, 2, 4, 48 및 96 시간)으로 37 ℃에서 배양하였다. 이후 무혈청(free serum)을 침전시키기 위해 각각의 시간에 TCA 용액(20%, 100 μL)을 첨가한 후, 4 ℃에서 10 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 침전된 하얀색의 인간 혈청을 제거하고 남은 상층액을 상온에서 3 T whole body system을 이용하여 이완율을 측정하였다. 상기 인간 혈청 수용액과 가돌리늄 착물 수용액 혼합물의 배양 전 및 후의 R ₁ 이완률의 변화(이완률의 증가)는 착물(GdL)로부터 자유 Gd 이온이 방출되었음을 나타내므로, 상기와 같은 혈청 안정성 분석은 정성적으로 수행될 수 있다. Omniscan, Magnevist 및 가돌리늄 착물(2a 화합물)의 혈청 안정성, 즉 R ₁ ^P(t)/R ₁ ^P(0) 플롯(plot)은 배양 시간에 대한 함수로 나타내었으며, 도 4에 보이는 바와 같다.

측정 결과, 혼합물의 배양 시간이 4 시간까지는 이완률의 변화가 모든 시료에서 나타나지 않으나, 이후부터 이완률의 변화가 나타남을 볼 수 있다. 특히 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물)의 이완률 변화는 Omniscan, Magnevist에 비해 변화율이 작게 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 가돌리늄 착물의 혈청 안정성이 현재 시판 중에 있는 Omniscan, Magnevist와 비교하여 실질적인 생리적 조건하에서 높은 혈청 안정성을 보인다. 이는 본 발명의 가돌리늄 착물이 혈액 내에서 단백질과 가역적 비공유 결합을 통해 자기이완율이 증가된 것으로 사료된다.

실시예 8. 생체내 세포 독성( In vivo cell toxicity )

본 발명에 따른 가돌리늄 착물의 세포 독성을 원숭이 신장 세포(monkey kidney cell)인 COS-7 및 인간 배아 폐 섬유아세포(human embryonic lung fibroblast)인 IMR-90을 이용하여 측정하였다.

먼저 상기 세포들을 heat-inactivated FCS(10%), 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 mg/mL) 및 젠타마이신(200 mg/mL) (모든 시약은 Gibco로부터 구입함)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium; Gibco) 배지에서 보존시켰다. 이후 상기 세포들을 1×10⁴ cells/well/200 μL 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였으며, 배지는 매 2일 마다 교체해 주었다. 여러 농도의 Gd(Ⅲ)가 포함된 조영제(COS-7: 0.01 ~ 0.5 mM, IMR-90: 0.01 ~ 2.0 mM)를 혈청이 제거된 배양 배지에 넣고, 24 시간 동안 배양하였다. 이후 세포 생존율을 측정하기 위해 CCK-8(10 μL)을 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 제거하였다. 세포의 생존/독성 측정을 위한 O. D.(optical density)는 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Molecular Device, USA Bio-rad 550 Reader)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 비교를 위해 Omniscan을 이용하여 세포 배양한 경우를 대조군으로 설정하였다. 측정 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, COS-7 세포의 경우 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물)의 농도에 관계없이 모든 실험군들의 세포 생존율이 100%에 근접하는 것으로 보아 COS-7 세포에 있어 본 발명의 가돌리늄 착물 조영제가 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다. 그러나 대조군으로 사용한 Omniscan의 경우 0.5 mM 농도에서 세포 생존율이 80% 정도까지 하락하였다. 또한 IMR-90 세포의 경우에서는 본 발명의 가돌리늄 착물 조영제 및 Omniscan 모두 모든 실험군의 세포 생존율이 100%에 근접하였다.

실시예 9. In vivo MRI test

모든 동물 실험은 경북대학교(Kyungpook National University) 동물연구위원회의 규칙에 따라 수행하였다.

본 발명에 따른 MRI 조영제의 조영효과 실험을 위해 6주령의 수컷 ICR 마우스(weight = 29 ~ 31 g)를 준비하였으며, CE-MRA를 위해 10주령의 수컷 SD 랫트(rat)(weight = 350 ~ 400 g)를 이용하였다. 상기 마우스(n=4) 및 랫트(n=4)를 산소 존재 하에서 1.5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취시킨 후, 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물) 조영제의 꼬리 정맥(tail vein) 주사를 수행한 후, 조영제의 주사 전ㆍ후를 측정하였다. MR 및 CE-MRA를 위한 각 주사시 조영제의 양은 0.1 mmol [Gd]/kg으로 주사하였다. 주사 후, 마취로부터 깨어난 마우스들은 우리(cage) 안에 넣고 물과 음식을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험 측정 동안 동물들은 따뜻한 물수건을 이용하여 약 37 ℃를 유지시켰다.

MR 이미지는 직접 제작한 동물용 RF 코일(RF coil)이 장착된 1.5 Tesla(T) MR unit(GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)으로 측정하였다. 상기 코일은 안쪽 직경이 50 mm 정도의 receiver 타입이다. 3D fast SPGR(spoiled GRASS image)의 영상지표(imaging parameter)를 사용하여 이미지를 획득하였다: TR(repetition time) = 9.2 ms; TE(echo time) = 2.1 ms; 12 mm FOV(field of view); 256×192 matrix size; 0.8 mm slice thickness; NEX(number of acquisition) = 8. MR 이미지는 조영제를 주사한지 120 분 후에 관찰하여 얻어내었다. 또한 CE-MRA는 8HR wrist coil이 장착된 3.0 Tesla(T) MR unit(Magnetom Tim Trio, Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany)을 이용하여 수행하였다. CR-MRA에 대한 영상지표는 다음과 같다: TR(repetition time) = 3.3 ms; TE(echo time) = 1.3 ms; 17 mm FOV(field of view); 192×65 matrix size; 0.9 mm slice thickness; NEX(number of acquisition) = 1. 각각의 이미지는 11 초 간격으로 이미지를 얻어내었다.

상기에서 획득한 MR 이미지의 분석은 Advantage Window software(GE Medical, USA)를 이용하여 특정 ROI(region of interest)에서의 신호 강도를 측정함으로써 수행되었다. 그리고 CNR(Contrast to Noise Ratio)은 하기 등식 13을 이용하여 계산하였으며, 등식에서 SNR은 noise ratio에 대한 신호를 의미한다.

<등식 13>

이미지 분석 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었으며, CNR 측정 결과는 도 7에 나타내었다. 먼저 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 1.5T에서 MRI 영상을 촬영해본 결과 심장과 복부대동맥, 경동맥 등의 혈관들에서 강한 조영효과를 보여줌을 알 수 있으며, 또한 신장과 방광이 조영되며 이로인해 조영제가 renal excretion 됨을 알 수 있다 (도 6a). 혈관만 조영한 MRI 영상의 경우에도 본 발명의 가돌리늄 착물(2a 화합물) 조영제를 투여한지 10 분 후 매우 강한 조영효과를 나타냄을 볼 수 있다 (도 6b). 그리고 도 7은 조영되는 부위에 ROI를 찍어 조영전에 비해 어느 정도 세기를 가지는 지에 대해 그래프로 나타낸 것이며, 나타낸 바와 같이 심장에서의 조영 효과가 월등하며 심지어 반감기가 약 2 시간 가까이 지속되는 것을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 페로센을 포함하는 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물:
[화학식 1]

상기 화학식에서 R은 H, Et, Me, Ph, 또는 Cyclohexy이다.
하기 단계들을 포함하는 제 1항에 따른 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물의 제조방법:
a) 1,1'-비스(아미노에틸)페로센(1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene)에 DTPA-bis(anhydride)를 첨가하여 반응시키는 단계;
b) 상기 혼합물을 저압에서 용매를 모두 제거한 후, 메탄올을 넣어 녹인 후, 실리카 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계;
c) 상기 크로마토그래피로 얻은 용출액의 용매를 제거하고, 잔류물을 아세톤:디에틸에테르 혼합용액과 섞어 분말화 하는 단계; 및
d) 상기 분말화된 물질을 필터, 세척 및 건조하여 고체상태의 DTPA-bis(amide)-페로센을 얻는 단계.
제 2항에 있어서, 상기 a) 단계의 1,1'-비스(아미노에틸)페로센(1,1'-bis(aminoethyl)ferrocene) 대신 1,1'-비스(아미노벤질)페로센(1,1'-bis(aminobenzyl)ferrocene)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 따른 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 포함하는 착물 리간드(L)용 조성물.
제 1항에 따른 DTPA-bis(amide)-페로센 또는 그 유도체 화합물을 리간드(L)로 포함하고, 상기 리간드에 배위결합하는 금속원자를 포함하는 착물.
제 5항에 있어서, 상기 금속원자는 가돌리늄(Gd)인 것을 특징으로 하는 착물.
제 6항에 있어서, 상기 착물은 [Gd(L)(H₂O)]의 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 착물.
제 5항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 착물을 유효성분으로 함유하는 자기공명혈관 조영제(CE-MRA).
제 8항에 있어서, 상기 조영제는 혈액 내에서 단백질과 가역적 비공유 결합하는 것을 특징으로 하는 자기공명혈관 조영제(CE-MRA).
제 8항에 있어서, 상기 조영제는 높은 자기이완율, 향상된 열역학적 및 속도론적 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 자기공명혈관 조영제(CE-MRA).