CN105899494B - 含do3a-氨甲环酸共轭物的钆配合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含钆配合物的MRI造影剂，尤其涉及一种具有化学式1所示结构的DO3A‑氨甲环酸或其酯类化合物及其钆配合物。根据本发明，能够制备DO3A‑氨甲环酸或其酯类化合物，能够利用所述化合物制备钆配合物。根据本发明制备的钆配合物具有热力学及动力学稳定性，具有能够与当前常用的临床造影剂相匹敌的弛豫率。因此，本发明的钆配合物能够广泛用作磁共振成像(MRI)造影剂。

Description

含DO3A-氨甲环酸共轭物的钆配合物
技术领域
本发明涉及含钆配合物的MRI造影剂，尤其涉及一种具有化学式1所示结构的新型DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物及其钆配合物。
背景技术
本发明在韩国未来创造科学部支援下通过课题编号2013029618得到，所述课题的研究管理专门机关为韩国研究财团，研究事业名称为“核心研究支援事业”，研究课题名称为“具有多重能量带宽的高敏感度CT分子影像纳米复合体的研究”，主管机关为庆北大学产学协力团，研究时间为2013.05.01-2014.04.30。
并且，本发明是在韩国未来创造科学部支援下通过课题编号2013069507得到，所述课题的研究管理专门机关为韩国研究财团，研究事业名称为“基础研究事业”，研究课题名称为“中子捕获治疗用钆纳米结构体基础研究室"，主管机关为庆北大学产学协力团，研究时间为013.12.01-2014.10.31。
磁共振成像(MRI)是根据优良的空间解析度(resolution)及对比度(contrast)用于人体解剖学、生理学及病态生理学的无创性诊断的最有力技术之一。现在的多数MRI技术为了增加人体内弛豫率(relaxation rate)以提高影像对比度，利用Gd(III)配合物实施。利用Gd(III)离子的代表性优点来自较高的磁矩及很长的电子自旋驰豫时间等独特特性。尽管其广泛、成功地临床应用，但目前的基于Gd(III)的造影剂(GBCAs)大部分都是快速肾脏(renal)排出的细胞外液(extracellular fluid ECF)造影剂。因此，需要同时具有高性能及特殊功能性的新型MRI造影剂。为开发能够用作器官(organ)标的MRI造影剂的新型MRI造影剂而付出了不懈努力。
肝(Liver)-特异性MRI造影剂可分为两种:(i)肝胆汁(hepatobiliary)-特异性(或肝胆汁性)造影剂；(ii)网状内皮细胞(reticuloendothelial cell)-特异性(或纳米粒子性)造影剂。前者(th e former)类型的造影剂被功能性肝细胞吸收并向胆汁(bile)排出，其顺磁性(paramagnetic)性质导致肝及胆的纵轴(longitudinal)弛豫时间T1缩短。该类型的当前可使用造影剂基于Gd-EOB-DTPA及Gd-BOPTA之类的Gd-螯合物。注射时，其在初期分布(distribute)于ECF CAs区域，后续被肝细胞(hepatocytes)吸收。另外，后者(the lat ter)类型定向网状内皮系系统的库普弗(Kupifer)细胞，该处发生造影剂吞噬作用(phagocyto sis)，铁(iron)离子效果使得肝信号强度减小，显示的不是通过肝细胞-特异性造影剂能够观察的典型的“白色(white)”肝，而是显示“黑色(black)”肝。
[图表1]
本发明人曾发表合成的几个DO3A-氨甲环酸(2a-b，图表1)的钆配合物具有肝胆汁-特异性质(Gu，S.；Kim，H.K.；Lee，G.H.；Kang，B.S.；Chang，Y.；Kim，T.J.J.Med.Chem.2011，54，143.)。通过这些观察及近来有关多功能性(multi functional)造影剂开发研究活动的启发，本发明人为了用作新型的肝-特异性造影剂而对几个另外的DO3A-氨甲环酸lc-e及对应的Gd-配合物2c-e。并且本发明人对肝-特异性进行了结构活性相关(SAR)分析。
发明内容
技术问题
因此，本发明的主要目的在于提供具有化学式1所示结构的DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物。
本发明的另一目的在于提供含所述化合物的配合物配体(L)用组合物及含作为配体的所述化合物的钆配合物。
本发明的又一目的在于提供含弛豫率、热力学及动力学稳定性及pH稳定性高的钆配合物的MRI造影剂。
技术方案
根据本发明的一个方面，本发明提供一种具有以下化学式1所示结构的DO3A-氨甲环酸(tranexamic acid)或其酯类化合物：
[化学式1]
所述化学式1中，R为H，NH2或CONH(CH2)2NH2。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种制备所述DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物(化学式1中R＝CONH(CH2)2NH2；化合物lc)的制备方法，包括以下步骤：
a)向反式-4-(氨甲基)环己烷羧酸乙酯盐酸盐(trans-4(aminomethyl)cyc1ohexaneethy lcarboxylatehydrochloride)添加溴乙酰溴(bromoacetyl bromide)并搅拌的步骤；
b)向如上得到的混合物添加DO3A-(tBuO)3并搅拌制备DO3A(tBuO)3-氨甲环酸乙酯共轭物的步骤；
c)向所述DO3A(tBuO)3-氨甲环酸乙酯共轭物添加1,2-二氨基乙烷的步骤；
d)在低压去除所述混合物中的所有溶剂后添加甲醇进行溶解，然后进行硅胶层析的步骤；
e)向通过所述硅胶层析得到的物质添加三氟乙酸脱除对叔丁基的保护的步骤；以及
f)在真空状态干燥所述物质得到DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物的步骤。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种制备所述DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物(化学式1中R＝NH2；化合物ld)的制备方法，包括以下步骤：
a)向反式-1,4-环己二胺(trans-l,4-diaminocyclohexane)添加二碳酸二叔丁酯(Di-tert-bu tyl dicarbonate)并搅拌的步骤；
b)向如上得到的混合物添加溴乙酰溴(bromoacetyl bromide)并搅拌的步骤；
c)向所述混合物添加DO3A-(tBuO)3并搅拌制备DO3A(tBuO)3-氨甲环酸胺的共轭物的步骤；
d)在真空去除所述混合物中的所有溶剂后添加甲醇进行溶解，然后进行硅胶层析的步骤；以及
e)向通过所述硅胶层析得到的物质添加三氟乙酸脱除对叔丁基的保护的步骤；
f)在所述真空的状态下进行干燥得到DO3A-氨甲环酸胺化合物的步骤。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种制备所述DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物(化学式1中R＝H；化合物le)的制备方法，包括以下步骤：
a)向氨甲基环己烷((aminomethyl)cyclohexane)添加溴乙酰溴(bromoacetylbromide)并搅拌的步骤；
b)向如上得到的混合物添加DO3A-(tBuO)3并搅拌制备DO3A-(tBuO)3-氨甲环酸共轭物的步骤；
c)在低压去除所述混合物中的所有溶剂后添加甲醇进行溶解，然后进行硅胶层析的步骤；以及
d)向通过所述硅胶层析得到的物质添加三氟乙酸脱除对叔丁基的保护的步骤；
e)在真空状态下进行干燥得到DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物的步骤。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种包含所述DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物的配合物配体(L)用组合物。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种包含作为配体(L)的所述DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物，并且包含与所述配体配位结合的金属原子的配合物。
本发明中，所述金属原子为钆(Gd)。
并且，特征在于，包含与所述配体配位结合的金属原子的配合物的化学式为[Gd(L)(H2O)]。
本发明的包含金属原子的配合物利用如上合成的DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物(1c～1e)制备。通过各1c至1e化合物与GdCl3·6H2O(gadolinium chloridehexahydrate)的反应制备钆配合物。
根据本发明的一个方面，提供一种将所述配合物作为有效成分的磁共振成像(MRI)造影剂。
本发明的特征在于，所述造影剂具有细胞外液(Extracelluar fluid；ECF)造影剂功能。本发明的实施例对五个配合物(2a-e)进行了结构活性相关性分析的结果为仅2a具有肝-特异性。虽然2b及2c在肝方面具有很大的增强，但未观察到能够称作肝-特异性造影剂的胆汁-排出。其余与之类的一般ECF造影剂非常相似。并且，本申请的新系列不具有阻碍在生物体内使用的任何毒性。
本发明的特征在于，所述造影剂具有很高的弛豫率，更高的热力学及动力学稳定性、pH稳定性。通过本发明的实施例证明本申请的系列在pH 3至11这个宽范围具有很高的动力学稳定性。
具体来讲，本发明实施例制备了系列的DO3A-氨甲环酸(tranexamates)共轭物(1c-e)及用作肝-特异性MRI造影剂的其Gd配合物(2c-e)。所有这些配合物全部具有能够与之类的结构上关联的临床造影剂相匹敌的热力学(thermodynamic)及动力学(kinetic)稳定性。并且，其R1弛豫率(relaxivities)为3.68-4.84mM-1s-1范围，与商业造影剂相匹敌。根据将2a-e用在小鼠生物体内(in vivo)得到的MR图像，仅2a具有肝(liver)特异性。虽然2b及2c在肝(liver)方面具有很大的增强(enhancement)，但未观察到能够称作肝-特异性造影剂的胆汁(bile)-排出。其余与之类的一般ECF造影剂非常相似。这些新系列不具有阻碍在生物体内使用的任何毒性。
如上所述，关于新系列的肝-特异性MRI造影剂的调查基于本发明的之前发现，即2a不仅作为HAS标的，还起到具有某种程度的肝-特异性的Gd配合物的动力学非活性(inert)生物适应性螯合物(biocompatibility chelate)的作用。新系列的DO3A-氨甲环酸包含2c-e，其合成是在典型的2a的合成的基础上通过略微变形制成的。即，所述合成是从初期形成DO3A(tBuO)3氨甲环酸共轭物开始，然后通过三氟乙酸(TFA)脱除对叔丁基的保护形成系列1，然后配合成Gd氯化物后获得系列2(参见图1至3)。其合成通过微观分析及多种分光(spectroscopic)技术得到确认。
技术效果
如上所述，本发明的新系列的DO3A氨甲环酸共轭物(lc-e)及其Gd配合物(2c-e)用作肝-特异性MRI造影剂。所有这些配合物全部具有热力学及动力学稳定性，R1弛豫率能够与之类的结构上关联的临床造影剂相匹敌。通过对五个配合物2a-e进行结构活性关联性分析得知，仅2a具有肝-特异性。虽然2b及2c在肝上有很大增强，但未观察到可称作肝-特异性造影剂的胆汁-排出。其余与之类的一般ECF造影剂非常相似。新系列不具有阻碍在生物体内使用的任何毒性。
附图说明
图1显示本发明的DO3A-氨甲环酸lc及其钆配合物2c的合成模拟图；
图2显示本发明的DO3A-氨甲环酸1d及其钆配合物2d的合成模拟图；
图3显示本发明的DO3A-氨甲环酸le及其钆配合物2e的合成模拟图；
图4为多种MRI造影剂的关于时间的函数，显示R1P(t)/R1Ρ(0)的进化(Evolution)；
图5中(A)显示注射造影剂五分钟后ICR小鼠的冠状位(coronal)及轴向(axial)T1-加权(weighted)图像，其中，K，肾脏；A，腹部大动脉；图5中(B)显示注射造影剂1h后冠状位及轴向T1-加权图像，其中，H，心脏；L，肝；B，膀胱；G，胆囊；
图6显示通过Gd-DOTA及2b-e得到的正常结膜成纤维细胞的相对细胞毒性(％)，标准偏差(士SD)通过三重分析(n＝3)得到；
图7a至图7e显示对配体的的结合热力学ITC结晶，结合等温为Gd3+/la-e的摩尔比函数，相当于积分热(heats)的绘图，实线是以数学方式确定的一套部位模型内的数据的最佳-拟合曲线，表示对各配体的一个分子(Gd3+)结合。解离常数(Kd)、缔合常数(Ka)、与各配体结合的Gd3+个数(N)及联合焓变化(ΔΗ)通过数据分析得到。解离常数及缔合常数是确定相比于配体(la-e)的相对稳定性方面的重要接近方法；
图8显示通过肝及肾脏处的多种造影剂得到的CNR曲线；
图9显示在不同pH条件下潜伏时间的函数，是在PBS对2([Gd]＝1.0mM)的R1的进化(Evolution)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行更具体说明。这些实施例仅用于举例示出本发明，不得解释为本发明受限于这些实施例。
本实施例中，所有反应均利用标准希莱克(Schlenk)技术在二氮(dinitrogen)的环境下实施。溶剂利用标准步骤提纯干燥。1，4，7，10-四氮杂环十二烷(DOTA)购买于Strem(U.S.)，反式-4-(氨甲基)-环己烷甲酸(氨甲环酸)及反式-1,4-环己二胺购买于Aldrich，氨甲基环己烷购买于TCI。所有其他商业试剂购买于Aldrich，在没有特殊说明的情况下均直接使用。去离子水(DI water)用于所有实验。1H实验是在KBSI的Bruker Advance400或500光谱仪(spectrometer)上实施的。化学位移(Chemical shifts)为内部标准，是作为对四甲基硅烷(TMS)的比较值的给定值δ。偶合常数用Hz表示，FAB质谱利用JMS-700型号(Jeol，Japan)质谱分光光度仪(mass spectrophotometer)得到。MALDI-TOF质谱利用Voyager DE-STR(Applied biosystems，U.S.)得到。成分(elemental)分析在KNU的科学仪器中心(Center for Scientific Instruments)实施。
[图表1]
实施例1.配体(Ligand)合成：
1)la及lb的合成
la及lb根据现有文献(Gu，S.；Kim，H..；Lee，G.H.；Rang，B.S.；Chang，Y.；Kim，T.J.J.Med.Chem.2011，54，143)制成。
2)lc的合成
将根据现有文献方法(Gu，S.；Kim，H.K.；Lee，G.H.；Kang，B.S.；Chang，Y.；Kim，T.J.J.Med.Chem.2011，54，143)制成的DO3A(tBuO)3-氨甲环酸乙酯的共轭物(6.8mmol)(cf，R＝CO2Et，图表1)添加到纯1，2-二氨基乙烷(2.3mL，33.8mmol)。在室温(RT)对所述混合物搅拌72h后添加氯仿(chloroform)并用水提取(30mL×3times)。在MgSO4上对有机(organic)提取物进行干燥、过滤、蒸发得到粗制物(crude)，并通过硅相的层析(梯度洗脱：从CH2C12至10％MeOH-CH2Cl2，Rf＝0.6(MeOH/CH2Cl2＝2:8))进一步提纯得到黄色固体。然后将其溶解在二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)，通过添加三氟乙酸脱除对叔丁基的保护。在室温对所述混合物搅拌一晚上并在真空下去除溶剂，仅留下油状残留物(oily residue)并使之被水吸收。添加丙酮使生成物沉淀出白色固体并用丙酮对此清洗若干次，让后在真空进行干燥。收率：0.36g(92％).1H NMR R(D2O)：δ＝3.82(s，4H，-NCH2CO2-)，3.62(2Η，-NCH2CO2-)，3.67(s，2H，-CH2CON)，3.44(m，10H，在环(8H)以及-CONHCH2-(2H)重叠的-NCH2CH2N-)，3.08(d，2H，-CONHCH-2C-)，2.24/1.52(m，2H，-CONH)，1.85/1.41(m，8H，-CH2-，环已基)，1.03(m，2H，-CH2-，环已基).对C26H47N7O8·2H2O的分析计算：C，50.23；H，8.27；N，15.77.发现的：C，50.66；H，8.24；N，16.01.MALDI-TOF MS(m/z)：对C26H47N7O8的分析计算：585.35，发现的：586.74([MH]+)，608.70([MNa]+)。
3)1d的合成
向根据现有文献方法(Lee，D.W.；Ha，H.J.Synthetic Cowmun 2007，37，737Roth，G.J.；Heckel，A.；Colbatzky，F.；Hands chuh，S.；Kley，J.；Lehmann-Lint z，T.；Lotz，R.；Tontsch-Grunt，U.；Walter，R.；Hilberg，F.J.Med.Chem.2009，52，4466)从反式-1,4-环己烷制成的氯仿(100mL)中的反式-[4-(2-氯乙烷酰氨基)环己基]氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.4mmol)溶液添加DO3Α-(ιΒιιΟ)3(1.6g，3.1mmol)。在室温对所述混合物搅拌24h小时并通过过滤去除所有固体，然后在真空蒸发过滤液留下黄色油状残留物。然后通过硅相的层析(梯度洗脱：从CH2C12至10％MeOH-CH2Cl2，Rf＝0.4(MeOH/CH2Cl2＝1:9))得到黄白色(off-white)固体。将其再溶于二氯甲烷并添加过量TFA。继续搅拌一晚后添加甲醇沉淀白色固体，用常用方法进一步提纯。收率：0.62g(87％).1H NMR(D2O)：δ＝3.72(m，10H，重叠的-NCH2CO2-(8H)、-CONHCH-以及H2NCH-(2H))，3.40/3.21(m，16H，-NCH2CH2N-)，2.06/1/55/1.38(m，8H，-CH2，环已基)。对C22H40N6O7·2CF3COOH·2H2O的分析计算：C，39.00；H，6.29；N，10.50.发现的C，39.13；H，6.05；N，9.35.MALDI-TOF MS(m/z)：对C22H40N6O7的分析计算：500.30，发现的：501.33[MH]+，523.33[MNa]+.
4)le的合成
向根据现有文献方法(Cho，S.D.；Song，S.Y.；Kim，.H.；Zhao，B.X.；Ahn，C；J oo，W.H.；Yoon，Y.J.；Falck，J.R.；Shin，D.S.B Kor.Chem.St.2004，25，415)制成的乙腈(30mL)中的2-氯-N-(环己基甲基)乙酰胺(1.2g，6.4mmol)溶液添加DO3A-(fBuO)3(3.0g，5.8mmol)。在室温对所述溶液搅拌24h。通过过滤去除固体杂质并在真空下蒸发过滤液得到油状残渣。然后，通过硅相的层析(梯度洗脱：从CH2C12至10％MeOH-CH2Cl2，Rf＝0.4(Me0H/CH2Cl2＝1:9))后在减压下蒸发得到黄白色固体。与所述1d的制备技术一样，通过TFA实施脱除保护得到生成物即黄白色固体。收率：2.4g(82％).1H NMR(D2O)：δ＝3.74/3.57(m，8H，-NCH2CO2-)，3.30(m，10H，重叠的-NCH2CH2N-(8H)以及-CONHCH2-(2H))，3.10(m，8H，-NCH2CH2N-)，1.98/1.44/1.27(m，4H，-CH2-，环已基)，1.88(m，1H，-NHCH2CH-).对C22H39N5O7·3CF3COOH·3H2O的分析计算：C，38.14；H，5.49；N，7.94.发现的：C，37.83；H，5.76；N，8.44.MALDI-TOF MS(m/z)：对C22H39N5O7的分析计算：485.28，发现的：486.42([MH]+)，508.44([MNa]+).
实施例2.Gd配合物(complex)的合成：
1)2a及2b的合成
2a及2b根据现有文献(Gu，S.；Kim，H.K.；Lee，G.H.；Kang，B.S.；
Chang，Y.；Kim，T.J.J.Med.Chem.2011，54，143)制成。
2)2c的合成
向水中(50mL)lc(1.0g，1.7mmol)溶液添加氯化钆(0.64g，1.7mmol)，并在50℃对混合物搅拌48h。周期性地确认pH，用1N NaOH调整到7.0-7.5。在真空下对所述反应混合物进行干燥留下油状残留物，并使之被水吸收。向所述溶液添加丙酮沉淀白色固体并通过过滤予以分离，让后用丙酮清洗并在真空下进行干燥。其生成物为吸湿性(hygroscopic)的象牙色固体。收率：0.75g(86％).对C26H44GdN7O8·2CF3COOH·8H2O的分析计算：C，32.40；H，5.62；N，8.82.发现的：C，31.99；H，5.22；N，9.00.HR-FABMS(m/z)：对C26H45GdN7O8的分析计算，741.26([MH-H2O]+).发现的：741.2567；对C26H44GdN7O8Na的分析计算，763.24([MNa-H2O]+).发现的：763.2397.
3)2d的合成
所述化合物除用1d替代lc之外，按照与上述制造方法相同的方法制成。其生成物为吸湿性的黄白色固体。收率：1.15g(.88％).对C22H37GdN6O7·2CF3COOH·5H2O的分析计算：C，32.10；H，5.08；N，8.64.发现的：C，31.55；H，5.09；N，9.06.HR-FABMS(m/z)：对C22H38GdN6O7的分析计算，656.21([MH-H2O]+).发现的：656.2045；对C26H44GdN7O8Na的分析计算，678.19([MNa-H2O]+).发现的：678.1867.
4)2e的合成
所述化合物除用le替代lc之外，按照与上述制造方法相同的方法制成。其生成物为吸湿性的黄白色固体。收率：0.75g(86％).对C23H38GdN5O7·4H2O的分析计算：C，38.06；H，6.39；N，9.65.发现的：C，38.59；H，6.09；N，9.69.HR-FAB MS(m/z)：对C23H39GdN5O7的分析计算，655.21([MH-H2O]+).发现的：655.2093.
实施例3.弛豫率(Relaxivity)的测定
关于T1的测定，在1.5T(64MHz)根据变动逆转时间(TI)用逆转回收法(inversionre covery method)实施。关于MR图像，从50至1750ms范围的35个不同TI值得到。T1弛豫时间根据在各TI值测定的信号强度的非线性最小二乘法拟合(nonlinearleast-squaresfit)得到。为测定T2CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脉冲序列而适用多重自旋回波的测定。34个图像从10至1900ms范围的34个不同的回波时间(TE)值得到。T2弛豫时间根据用于从回波时间测定多重自旋回波的平均(mean)像素值的非线性最小二乘法拟合得到。然后求出每个mM的弛豫时间的倒数作为弛豫率(R1及R2)。最终对确定的弛豫时间(T1及T2)和弛豫率(R1及R2)进行图像处理分别得到弛豫时间地图和弛豫率。
结果显示2a-e在PBS的R1弛豫率相当于或高于Gd-DOTA及Gd_BT-DO3A之类的可临床使用的MRI造影剂(表1)。通过在系列内进行比较，未发现R’s的可观察到的差异。关于测定，为确认其具有哪些血-池(blood-pool)效果，在两个不同的介质PBS(pH＝7.4)及HSA的PBS溶液下实施。与PBS处的R’s相比，在HAS处观察到一些明显上升，这表示我们的新型系列与HAS之间有些相互作用。
[表1]PBS及0.67mM HAS下的2a-e，Gd-DOTA及Gd-BT-DO3A的弛豫率数据(64MHz，293K)
实施例4.金属置换动力学(Transmetalation Kinetics)
该实验根据现有文献方法(Laurent，S.Elst，L.V.；Copoix，F.；Muller，R.N.Investigative radiology 2001，36，115)准备。其基于含2.5mmol/L钆配合物及2.5mmol/L ZnCl2的缓冲溶液(phosphate buffer，pH 7.4)的水质子纵轴弛豫率(R1P)的进化(evolution)的测定。然后，将10μL的ZnCl2250mmol/L溶液添加到1nk的顺磁性(paramagnetic)配合物缓冲溶液。强力搅拌该混合物并取300μL用于弛豫测定(relaxometric)研究。通过对Gd-DOTA、Gd-B0PTA、Gd-DTPA-BMA及Gd-E0B-DTPA实施的对照组研究结果显示与存在ZnCl2时得到的结果相同。控制观察的弛豫率R1＝(1/T1)中水质子弛豫反磁性(diamagnetic)贡献后得到R1Ρ弛豫率。关于测定，在室温3Τ全身系统(3Τwholebody system，Magnetom Tim Trio，Simens，Korea Institute of Radiological&MedicalScience)上实施。
图4为多种MRI造影剂的关于时间的函数，显示R1P(t)/R1Ρ(0)的进化(Evolution)。
关于正常顺磁性纵轴弛豫率R1P(t)/R1Ρ(0)的评价，在本系列2a-e及比较目的的 观察(图4)。用于试验的配合物可根据进化图案分为两个分组：(ⅰ)采用大环的(macrocyclic)螯合物的配合物；(ⅱ)具有无环的(acyclic)螯合物的配合物。因本系列采用大环的，具有非常高的动力学非活性(inertness)的概率高，因此72h的初期测定期间保持90％以上的顺磁性弛豫率。而作为对照，观察到属于后面分组的配合物的弛豫率明显减小。例如，及的斜率(slope)明显急剧，在相同测定期间，仅保持50％的初期弛豫率。
实施例5.等温滴定量热仪(Isothermal titration calorimeter：ITC)
为定量配体溶液的顺磁性金属离子Gd3+的结合等温(binding isotherms)，在VP-ITC等温滴定量热议(VP-ITC isothermal titration microcalorimeter)(Microcal，USA)实施ITC实验。数据收集、分析及绘图(plotting)借助Microcal提供的software packageOrigin，version 8.0实施。试料池(cell)的体积为1.43mL。向其中填满la-e配体(0.2mM)的水性缓冲溶液。将Gd3+(1.0mM)的水性缓冲溶液添加到300μL连续搅拌(300rpm)的注射器内分10yL等分(aliquots)注射到池内，以3分钟为间隔用20s传送。每2s收集数据点。在25℃进行测定。所有滴定(titrations)分三次实施确保数据的一惯性及溶液的稳定性。对这些滴定等温(titration isotherms)积分求出各注射时焓(enthalpy)变化。为较好地拟合数学上互异的两套部位模型而进行等温分析。通过热量测定分析计算包括结合常数(Ka)、焓变化(ΔΗ)及结合的化学计量学(N)在内的参数。然后，通过下述配合(complexation)等式确定自由能(AG)及熵(ΔS)的变化：△G＝-RT·lnKa＝△H-T△S，所述式中R为通用(universal)气体常数，T是开尔文(Kelvin)温度。
本系列在通过等温滴定量热议测定的情况下具有四阶(order)的高形成常数(Ka)，因此有必要留意本系列的高热力学稳定性(参照表2及图7a至图7e)。在系列内比较的情况下，lb在未知原因下显示出对Gd3+离子的最高偏好度(preference)。图7a显示对配体的Gd3+的结合热力学ITC结晶。结合等温为Gd3/la-e的摩尔比函数，相当于积分热(heats)的绘图。实线是以数学方式确定的一套部位模型内的数据的最-拟合曲线，表示对各配体的一个分子(Gd3+)结合。解离常数(Kd)、缔合常数(Ka)、与各配体结合的Gd3+个数(N)及联合焓变化(ΔΗ)通过数据分析得到。解离常数及缔合常数是确定相比于配体(la-e)的相对稳定性方面的重要接近方法。
[表2]在25℃及pH＝4.5向水及水性la-e(1.0mM)内滴定(Titration)Gd3+(0.2mM)
实施例6.生物体内(in vivo)MR实验
生物体内(invivo)研究按照庆北大学动物研究委员会的规则实施。用体重为29-31g且6周龄的雄性ICR小鼠进行生物体内研究。用氧气中含量为1.5％的异氟烷麻醉小鼠(n＝3)。在通过尾部静脉注射2a-e前后进行测定。每次注射的造影剂量如下：为MR图像而按照0.1mmol的Gd/kg注入。各测定后使小鼠从麻醉中醒来并放入能够自由靠近饲料及食物的笼内。对其进行测定期间，用水床使动物保持约37℃。用安装有手制小型动物RF线圈的1.5TMR unit(GE Healthcare，Milwaukee，WI)拍摄MR图像。所述线圈为具有50mm内径的接收器类型。自旋回波(SE)的图像参数如下：重复时间(TR)＝300msec；回旋时间(TE)＝13msec；8mm范围的视场(F0V)；192×128基质大小1.2mm薄片厚度采集个数(NEX)＝8。MR图像是注射后历经24h获得的。具有增大的对比度(contrast)的解剖学位置在造影后(post contrast)MR图像上中的肝(liver)、胆管(bile duct)及肾脏(kidney)。为定量测定，利用AdvantageWindow software(GE medical，U.S.)测定特定关心区域(R0I)的信号强度。CNR用下述等式(1)计算得到。下式中，SNR是信噪比。
CNR＝SNRpost-SNRpre (1)
图5中(A)为注射造影剂五分钟后ICR小鼠的冠状位(coronal)及轴向(axial)T1-加权(weighted)图像。K，肾脏；A，腹部大动脉。图5中(B)是注射造影剂1h后冠状位及轴向T1-加权图像。H，心脏；L，肝；B，膀胱；G，胆囊。
图8显示通过肝及肾脏处的多种造影剂得到的CNR曲线。
观察到2a-e在心脏及腹部大动脉(abdominal aorta)五分钟内具有明显的信号上升(enhancement)(图5中(A))。五个中，前三个(2a-c)在前一个小时内出现出现上升，这一点与典型的肝一特异性造影剂及相匹敌。而与及 相比，只有2a通过胆汁(bile)排出，从这种角度来讲，可以分类为真正的肝-特异性造影剂(图5中(B))。虽然2e也出现胆汁-排出，但其信号强度上升太多，不足以命名为肝-特异性造影剂。2e的信号强度的弱的程度相当于典型的ECF造影剂相当(图5中(A))。虽然2d在肾脏及腹部大动脉初期出现明显上升，但像一样在1小时内基本排出完毕，从这种角度来讲，可以分类为ECF造影剂。2b及2c在肝处出现明显上升(图5中(A)及图8)，但观察不到胆汁-排出。为说明从2b及2c观察到的异常形态，可以有以下两种假设：通过有机负离子转运多肽(0ATP)进入肝细胞后，细胞的管状膜的转运分子即耐多药蛋白质2(MRP2)没有转运(transport)2b及2c的能力或2b及2c通过MRP3或双向0ATP返回(return)血窦(sinusoids)。
需要注意的是典型的肝-特异性造影剂及通过正常肝细胞的基底侧膜上的0ATP1发生被动扩散。之后通过MRP2的作用向胆汁排出。相信及中的亲脂性乙氧苄基在所有这些过程中起到重要作用。从这种角度来讲，2a中亲脂性环己基部分的存在能够起到累似的作用。这种问题需要进一步研究。
实施例7.细胞存活率(Cell viability)的测定
使用正常结膜成纤维细胞。将细胞保持在添加热灭活的FCS(10％)、青霉素(100IU/mL)、链霉素(100mg/mL)及正大霉素(200mg/mL)(均从购入)的DMEM培养基两日更换一次，将细胞分株在96-孔板(1X 104个细胞/孔/200μL)。多种Gd(III)浓度(50-500μΜ)的造影剂添加到培养无血清培养基并潜伏24h。然后，CCK-8(10μL)添加到各个孔并评价细胞存活率。溶液在37℃经过4h后去除。用分子器件(MolecularDevice，USA Bio-rad 550Reader)读取450nm下的光密度(O.D.：Optical Density)值以确定细胞存活率/毒性。
图6显示通过Gd-DOTA及2b-e得到的正常结膜成纤维细胞的相对细胞毒性(％)。标准偏差(士SD)通过三重分析(n＝3)得到。
2b—e的细胞存活率与相当(图6)。即，潜伏24h的情况下对细胞增殖及生存率没有任何影响。MR图像中提高强度所需浓度范围内没有任何细胞毒性，从这种角度来讲，发现本系列内几乎没有差异。
实施例8.多种pH区域的动力学(Kinetic)稳定性
稳定性是室温下关于培养时间的函数，多种pH条件(pH：1，3，5，7，9及11)PBS对2([Gd]＝1.0mM)的数质子弛豫率的进化(evolution)。在1.5T全身系统(1.5T whole bodysystem)(GE Healthcare，Milwaukee，WI，USA)上进行测定。
图9显示在不同pH条件下潜伏时间的函数，是在PBS对2([Gd]＝1.0mM)的R1的进化(Evolution)。
本系列在pH 3至11这个宽范围具有很高的动力学稳定性(图9)。可知2a即使在pH1也足够稳定。
实施例9.H2O中水解稳定性
将100mg造影剂溶解在10mL蒸馏水后在50℃放置72h。然后用色谱法(HPLC)在197nm读取光密度(Optical Density；O.D.)值以确定物质的稳定性。并且，为了正确确定分解产物而利用质谱分析(LC：Mass Spectroscopy)确认各保留时间(retention time)的物质。
以下表3显示2a化合物经过72小时后的水解稳定性。2a是在H2O放置72小时的情况下，水解成2b(Gd-acid)，稳定性下降。确认出2a化合物具有反式(trans)及顺式(cis)两种异构体。
[表3]
以下表4显示2b化合物经过72小时后的水解稳定性。2b在H2O中放置72小时的情况下未知杂质(unknown impurity)上升。确认出2b化合物具有反式(trans)及顺式(cis)两种异构体。
[表4]
以下表5显示2c化合物经过72小时后的水解稳定性。2c在H2O放置72小时的情况下未知杂质(unknown impurity)微增，确认出2c化合物具有反式(trans)及顺式(cis)两种异构体。
[表5]
下述表6显示2d化合物经过72小时后的水解稳定性。2d在H2O放置72小时的情况下未知杂质(unknown impurity)微增，但比较稳定。
[表6]
下述表7显示2e化合物经过72小时后的水解稳定性。2e在H2O放置72小时的情况下未知杂质(unknown impurity)微增，但比较稳定。

Claims (8)

1.一种具有以下化学式1所示结构的DO3A-氨基烷基环己烷衍生物：
[化学式1]
所述化学式1中，R为H。
2.一种制备权利要求1所述DO3A-氨基烷基环己烷衍生物的制备方法，所述衍生物是化学式1中R＝H时的衍生物，包括以下步骤：
a)向氨甲基环己烷添加溴乙酰溴并搅拌的步骤；
b)向如上得到的混合物添加DO3A-(tBuO)3并搅拌制备DO3A-(tBuO)3-氨甲环酸共轭物的步骤；
c)在低压去除所述混合物中的所有溶剂后添加甲醇进行溶解，然后进行硅胶层析的步骤；以及
d)向通过所述硅胶层析得到的物质添加三氟乙酸脱除对叔丁基的保护的步骤；
e)在真空状态下进行干燥得到DO3A-氨甲环酸或其酯类化合物的步骤。
3.一种包含权利要求1所述DO3A-氨基烷基环己烷衍生物的配合物配体用组合物。
4.一种包含作为配体的权利要求1所述的DO3A-氨基烷基环己烷衍生物，并且包含与所述配体配位结合的金属原子的配合物。
5.根据权利要求4所述的配合物，其特征在于，所述金属原子为钆。
6.一种将权利要求4或5所述的配合物作为有效成分的磁共振成像造影剂。
7.根据权利要求6所述的磁共振成像造影剂，其特征在于，所述造影剂具有细胞外液造影剂功能。
8.根据权利要求6所述的磁共振成像造影剂，其特征在于，所述造影剂具有热力学及动力学稳定性、pH稳定性。
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