CN108059638A - 一类标记淀粉样蛋白的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一类标记淀粉样蛋白的荧光探针及其制备方法与应用。所述荧光探针为式I所示化合物，其中R1、R2独立地选自‑CF3和‑CN。式I所示化合物作为荧光探针在淀粉样蛋白标记中的应用也属于本发明的保护范围。式I所示化合物可用于制备诊断阿尔兹海默症产品。本发明首次合成了含有生物活性的1,8‑萘啶基为母体化合物的BODIPY类荧光探针分子，应用于标记β‑淀粉样蛋白，可用于早期诊断阿尔兹海默症。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一类标记淀粉样蛋白的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
阿尔兹海默(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病，影响着全世界数百万人，至今很难诊断且不可治愈。目前的临床药物只能改善AD患者的症状，减缓AD病的发病过程，不能从根本上治疗。大量研究表明，早在AD症状出现前10-20年，大脑中的病理改变已经发生。针对AD的病理机制目前有3种假说：淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结以及胆碱能神经元退行性病变。其中“淀粉样蛋白沉积”被人们广泛认可。在AD发生的早期，β-淀粉样蛋白(Aβ，主要是Aβ40和Aβ42，Aβ42的神经毒性强于Aβ40)逐渐聚合沉积形成淀粉样斑块，导致tau蛋白磷酸化和神经纤维缠结，最终导致神经元丢失、退化，AD患者认知功能障碍、痴呆。因此，研究和开发针对Aβ斑块的小分子探针，对于在分子水平研究AD疾病的病理生理过程，以及AD疾病的早期诊断和治疗提供依据显得尤为重要。
分子成像技术对患者创伤小，且敏感性高，为AD患者的早期诊断和治疗提供有力依据。主要有磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层现象(SPECT)和近红外荧光成像(NIRF)。MRI只有在患者发生脑组织萎缩时才能检测得到，而此时患者脑组织的病理学改变早已发生，且费用昂贵，不易推广；PET和SPECT属于放射性影像学，因其对患者有放射性危险，且半衰期适宜的放射性元素有限，操作时间受半衰期限制，其临床应用终将被近红外荧光成像技术替代。
荧光探针标记Aβ原理，Aβ(1-42)的氨基酸序列为：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，其中包括疏水性氨基酸(G,A,F,V,L,I,M)、带负电的氨基酸(D,E)、带正电的氨基酸(K)和极性氨基酸(Y,H,Q,N,S)。Aβ(1-42)的氨基酸序列中KLVFF为主要核心片段，分子探针主要与核心片段中的疏水性片段LVFF通过化学键相互作用结合，而探针中的亲水性基团则与亲水性的HHQK片段相互作用。探针与Aβ斑块结合后荧光特性发生显著改变(荧光强度、荧光寿命、发射波长和量子产率)，通过对荧光检测，获得被测靶蛋白定性、定量及定位信息。
迄今为止，已报道许多关于检测Aβ斑块的荧光探针，这些探针均有共同的结构特点，即由3个结构片段形成的高共轭分子，包括：接受电子基团，简称受体，如二氰亚甲基；供给电子基团，简称供体，如对二甲氨基苯基；连接基团，也称连接桥，一般为共轭π电子链。共有以下几类：苯乙烯基类衍生物、噁嗪类衍生物(AOI987)、噻吩类衍生物(NIAD)、姜黄素类衍生物(CRANAD)、硼二吡咯亚甲基类衍生物(BODIPY)、4,6(1H,5H)-嘧啶二酮类衍生物(THK-265)、氨基萘-2-氰基丙烯酸酯类衍生物(ANCA)、共轭π电子链类(DANIRs)。有的脑血屏障穿透性不好，有的标记Aβ斑块特异性不好，各有优缺点。
1,8-萘啶基团具有较好的生物活性受药物分子设计合成科技工作者的追捧，广泛应用于抗肿瘤，抗抑郁等药物，但尚未见有报道以1,8-萘啶为母体的荧光探针标记Aβ斑块。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种化合物，其结构式如式I所示：
上述式I中，R1、R2独立地选自-CF3和-CN；
R3为下述任一基团：-N(CnH2n+1)2，-OCnH2n+1，-COOCnH2n+1,其中，n＝1-6。
上述式I所示化合物具体可为：
上述式I所示化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1)在惰性气体保护下，在磷酸中，使得2,6-二氨基吡啶与式II所示化合物进行回流反应，得到式III所示化合物；
上述式II、式III中，R1、R2的定义同式I中R1、R2的定义；
2)在碱性条件下，使得式III所示化合物与式IV所示化合物进行回流反应，得到式V所示化合物；
上述式IV，式V中，R1、R2、R3的定义同式I中R1、R2、R3的定义；
3)在有机胺作用下，使得式V所示化合物与BF3.Et2O反应，得到式I所示化合物。
上述方法步骤1)中，2,6-二氨基吡啶与式II所示化合物的摩尔比可为1：1-2，具体可为1:1。
所述反应在搅拌下进行，所述反应的时间为8-24小时，具体可为24小时。
上述方法步骤2)中，所述反应在无水有机溶剂中进行，所述无水有机溶剂具体可为无水THF；
所述碱具体可为NaH。
所述式III所示化合物与式IV所示化合物的摩尔比为1：1-2，具体可为1:1。
所述反应在搅拌下进行，所述反应的时间为8-24小时，具体可为24小时。
上述方法步骤3)中，所述有机胺具体可为三乙胺。
式V所示化合物与所述有机胺的摩尔比为1：15-20，具体可为0.8：15；
式V所示化合物与BF3.Et2O的摩尔比为1：10-20，具体可为1：10。
所述反应在无水CHCl3中进行。
所述反应的温度为室温，时间为12-24小时，具体可为24小时。
本发明的另一目的是提供上述式I所示化合物的应用。
本发明所提供的式I所示化合物的应用是式I所示化合物在制备标记Aβ斑块的荧光探针中的应用。
本发明所提供的式I所示化合物的应用是式I所示化合物作为荧光探针在淀粉样蛋白标记中的应用。
所述淀粉样蛋白为Aβ42，Aβ40。
上述式I所示化合物在制备诊断阿尔兹海默症产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的又一目的是提供一种诊断阿尔兹海默症的产品，其包括上述式I所示化合物。
本发明首次合成了含有生物活性的1,8-萘啶基为母体化合物的BODIPY类荧光探针分子，应用于标记β-淀粉样蛋白。可用于早期诊断阿尔兹海默症。
本发明所涉及的一类荧光探针为含有1,8-萘啶基为母体结构的一类化合物，在已有相关荧光探针的报道中尚未发现，1,8-萘啶基由于其较好的生物活性广泛应用于抗肿瘤，抗抑郁等药物，因此，本发明所涉及的一类荧光探针较之已报道的相关化合物在生物活性上具有优势。
附图说明
图1为阿尔兹海默患者的病理机制。
图2为本发明中C3化合物的合成路线图。
图3为C3化合物的氢谱图。
图4为C3化合物的X轴椭球模型图。
图5为C3、C3+BSA、C3+Aβ42和C3+Aβ40的荧光发射光谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1C3化合物的制备
按照图2所示的合成路线图制备C3化合物。
步骤1：
2-氨基-5,7-三氟甲基-1,8-萘啶的合成(化合物1)：2,6-二氨基吡啶(市售，分析纯，10.9g,0.1mol)与六氟乙酰丙酮(市售，分析纯，10.0g,0.1mol)，100mL磷酸，氮气保护，搅拌回流24小时。冷却反应液，在冰浴条件下，用氨水调至中性。于5℃冷藏过夜后抽滤，用冷水洗涤滤饼，干燥得到粗产品。粗产品用无水乙醇重结晶得到浅黄色固体粉末。Yield:17.3g(61.3％)。
步骤2：
化合物3的合成：化合物1(2.81g,0.01mol)和化合物2(0.01mol)室温下溶于100mL无水THF溶液中，加入NaH(60w％,0.8g)。混合物回流搅拌24h。冷却至室温，旋干溶剂，残渣用饱和氯化铵溶液洗涤，过滤，固体干燥后硅胶柱层析纯化。(洗脱剂CH2Cl2/MeOH 100:1)Yield:1.4g(32％)。
步骤3：
化合物C3的合成：化合物3(0.35g,0.8mmol)溶于70mL无水CHCl3，加入三乙胺(2mL,15mmol)逐滴加入BF3.Et2O(2mL,8mmol)室温下搅拌24h。反应完成后，混合物用CH2Cl2稀释，有机相用水洗涤后无水Na2SO4干燥，过滤。旋干溶剂，粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚/CH2Cl2,100:1)Yield:0.24g(62％)。
氢谱图见图3所示。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)8.70(d,Napy-H,J＝9.3Hz,1H),8.54(d,Ar-H,J＝8.4Hz,2H),8.19(d,Ar-H,J＝8.4Hz,2H),8.16(s,Napy-H,1H),7.80(d,Napy-H,J＝9.3Hz,1H),3.99(s,CH3,3H).
图4为X轴椭球模型图。
由此可知，合成的化合物确实为C3化合物。
实施例2化合物C3用于淀粉样蛋白Aβ42，Aβ40的荧光标记
1、淀粉样蛋白Aβ42，Aβ40聚合物的制备：人淀粉样蛋白淀粉样蛋白Aβ42(AS-20276，HPLC纯化，AnaSpec Co.)，Aβ40(AS-24236，HPLC纯化，AnaSpec Co.)均1mg溶于4mLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)，蛋白浓度为0.25mg/mL，持续轻缓摇动，于37℃下孵育42h，加入PBS缓冲溶液稀释为0.2mg/mL；
2、化合物C3乙醇溶液(1μmol，光谱纯)300μL，加入Aβ42聚合物或者Aβ40聚合物或者BSA(牛血清蛋白，0.2mg/mL，PBS缓冲溶液)300μL，再加入PBS缓冲溶液2400μL，溶液总体积为3000μL，蛋白总量为60μg，配制比例为化合物C3:蛋白1:1，混合物于室温下孵育30min；
3、孵育后荧光检测，荧光仪F-4600FL Spectrophotometer，EX WL：350nm。
图5为C3、C3+BSA、C3+Aβ42和C3+Aβ40的荧光发射光谱图。
由图5可知：化合物C3最大发射波长为431nm，发射强度为361，与Aβ42结合后，发射波长431nm处发射强度增强为561，荧光探针与Aβ42标记后荧光强度增强155％；与Aβ40结合后，发射波长431nm处发射强度增强为560，荧光探针与Aβ40标记后荧光强度增强155％。BSA为牛血清蛋白，作为蛋白对照样，评价荧光探针化合物是否对Aβ有特异性。从实验结果中可知，化合物C3与BSA结合后发射波长431nm处发射强度仅发生略微改变，为408，相比C3，荧光强度增强113％。由此可见，化合物C3能特异性结合Aβ42和Aβ40，可作为标记Aβ的荧光探针化合物。
Claims (10)
1.式I所示化合物：
式I中，R1、R2独立地选自-CF3和-CN；
R3为下述任一基团：其中，n＝1-6。
2.制备权利要求1中式I所示化合物的方法，包括下述步骤：
1)在惰性气体保护下，在磷酸中，使得2，6-二氨基吡啶与式II所示化合物进行回流反应，得到式III所示化合物；
式II、式III中，R1、R2的定义同权利要求1式I中R1、R2的定义；
2)在碱性条件下，使得式III所示化合物与式IV所示化合物进行回流反应，得到式V所示化合物；
式IV，式V中，R1、R2、R3的定义同权利要求1式I中R1、R2、R3的定义；
3)在有机胺作用下，使得式V所示化合物与BF3.Et2O反应，得到权利要求1中式I所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，2,6-二氨基吡啶与式II所示化合物的摩尔比为1：1-2；
所述反应在搅拌下进行，所述反应的时间为8-24小时。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述反应在无水有机溶剂中进行，所述无水有机溶剂具体可为无水THF；
所述碱具体可为NaH；
所述式III所示化合物与式IV所示化合物的摩尔比为1：1-2；
所述反应在搅拌下进行，所述反应的时间为8-24小时。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述有机胺为三乙胺；
式V所示化合物与所述有机胺的摩尔比为1：15-20；
式V所示化合物与BF3.Et2O的摩尔比为1：10-20；
所述反应在无水CHCl3中进行；
所述反应的温度为室温，时间为12-24小时。
6.权利要求1中式I所示化合物在制备标记Aβ斑块的荧光探针中的应用。
7.权利要求1中式I所示化合物作为荧光探针在淀粉样蛋白标记中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述淀粉样蛋白为Aβ42，Aβ40。
9.权利要求1中式I所示化合物在制备诊断阿尔兹海默症产品中的应用。
10.一种诊断阿尔兹海默症的产品，其包括权利要求1中式I所示化合物。
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