DE60022487T2 - In vivo färbemittel und verwendungsmethoden zur identifizierung von dysplastischem gewebe - Google Patents

In vivo färbemittel und verwendungsmethoden zur identifizierung von dysplastischem gewebe Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue biologische Färbemittelverbindungen, die zur humanen topischen In-vivo-Anwendung von Nutzen sind.
  • Gemäß einem anderen und weiteren Aspekt betrifft die Erfindung In-vivo-Verfahren zur Verwendung solcher neuartigen Verbindungen zur Identifizierung von verdächtigem dysplastischem, d.h. anormalem, Gewebe.
  • In noch einer anderen und weiteren Hinsicht betrifft die Erfindung neue Verbindungen und In-vivo-Diagnoseverfahren für ihre Verwendung, die speziell auf einen Nachweis von verdächtigem dysplastischem oralem Gewebe, insbesondere kanzeröses und präkanzeröses Gewebe, ausgelegt sind.
  • Die verschiedenen Ausgestaltungen der Erfindung und ihre Umsetzung werden der fachkundigen Person anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung und Zeichnungen offensichtlich. Dabei zeigt:
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 ein Verfahrensablaufdiagramm, das ein Verfahren zum Synthetisieren der neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen darstellt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die meisten Epithelläsionen rühren von Traumata her. Andere Läsionen sind jedoch dysplastische Tumore, von denen einige gutartig sein können, manche aber auch entweder kanzerös oder präkanzerös sein können. Darüber hinaus sind viele dysplastische Läsionen klein und werden von Klinikern bei routinemäßigen visuellen Untersuchungen leicht übersehen, vor allem solche in Körperhöhlen wie der Mundhöhle.
  • Es ist ein In-vivo-Diagnosetest bekannt, der verdächtiges dysplastisches Gewebe identifiziert und abgrenzt. Dieser Screening-Test unter Verwendung von Toluidin Blau O (Toloniumchlorid) als In-vivo-Färbemittel, das selektiv kanzeröses und präkanzeröses Gewebe färbt, wird im US-Patent 4,321,251 von Mashberg und im US-Patent 5,372,801 von Tucci et al. allgemein beschrieben. Wenn eine verdächtige dysplastische Läsion durch das Mashberg-Protokoll ermittelt wird, kann eine reguläre Biopsieprobe entnommen und histologisch untersucht werden, um zu bestimmen, ob die Läsion bösartig oder präkanzerös ist. Kits zur Durchführung dieses Tests, die vorgemischten Farbstoff und Spüllösungen in den richtigen Mengen und Konzentrationen enthalten, sind von Zila, Inc. lizensiert und in mehreren Ländern unter den Warenzeichen ORASCREEN® und ORATEST® im Handel erhältlich.
  • Die EP-A-0 966957, WO97 26018A und WO99 02960 offenbaren biologische Färbemittelzusammensetzungen.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Ich habe jetzt neue Verbindungen entdeckt, die als biologische In-vivo-Färbemittel zum selektiven Färben und Abgrenzen von dysplastischem Gewebe nützlich sind. Zu diesen Verbindungen gehören
  • Figure 00020001
  • Figure 00030001
  • Die folgenden Verbindungen werden in der Beschreibung erwähnt und sind Vergleichsverbindungen.
  • Figure 00030002
  • Figure 00040001
  • Kurze Beschreibung des Herstellungsverfahrens
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch ein Verfahren synthetisiert, das dem in dem am 30. November 1889 ausgestellten US-Patent 418,055 von Dandliker et al. für die Produktion von Toluidin Blau O („TBO") beschriebenen Verfahren ähnlich ist (mit den nachfolgend aufgeführten Ausnahmen). Die Dandliker-Synthese umfasst eine Reihe von drei Oxydationsschritten: (1) Oxydation von N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, z.B. mit Kaliumdichromat, um 2-Amino-5-dimethylaminophenylthiosulfonsäure zu bilden; (2) Kondensation der Thiosulfonsäure mit o-Toluidin, um die entsprechende Indamin-Thiosulfonsäure zu bilden; und (3) Ringschluss der Indamin-Thiosulfonsäure, z.B. in Anwesenheit eines Komplexbildners bei Kochtemperatur für etwa 30 Minuten, um Toluidin Blau O zu bilden. Das Reaktionsgemisch wird anschließend abgekühlt und das Reaktionsprodukt des Ringschlussreaktionskomplexes wird ausgesalzt. Die Reinigung des Komplexes kann durch wiederholtes erneutes Lösen und Ausfällen erreicht werden.
  • Die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von der Dandliker-Synthese darin, dass der Komplexbildner vor dem dritten Oxydationsschritt zugegeben wird, vorzugsweise während des ersten Oxydationsschrittes, und die neuartigen Produkte der vorliegenden Erfindung von dem präzipitierten Komplex durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) isoliert und separiert werden.
  • Kurze Beschreibung der Verwendung der Produkte für den Nachweis von Epithelkrebs
  • Die erfindungsgemäßen neuartigen Verbindungen werden gemäß dem Mashberg-Protokoll eingesetzt, um dysplastisches Epithelgewebe selektiv zu färben, mit der Ausnahme, dass jede dieser Verbindungen anstelle von Toluidin Blau O verwendet wird. Die vorliegende Erfindung sieht folglich auch ein Verfahren für den humanen In-vivo-Nachweis von dysplastischem Gewebe vor, umfassend den Schritt des Auftragens einer Zusammensetzung, die eines der oben beschriebenen neuen Produkte oder Gemische davon enthält, auf humanes Epithelgewebe.
  • Ausführliche Beschreibung des Herstellungsverfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte
  • 1 ist ein Verfahrensablaufdiagramm, das ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen darstellt.
  • Das Ausgangsmaterial 10 für die Synthese ist handelsübliches, hochreines N,N-Dimethyl-a-phenylendiamin.
  • Bildung des ersten Reaktionsgemischs
  • Eine wässrige Lösung des Ausgangsmaterials 10 wird oxydiert 11, vorzugsweise unter 10°C, insbesondere unter etwa 5°C, durch eine Reaktion mit einem geeigneten Oxydationsmittel 12, z.B. Kaliumdichromat 12, in Anwesenheit von Säure, Aluminiumsulfat und einem Reagens 13 (von dem angenommen wird, dass es das/die Intermediat(e) komplexiert, und das in einem späteren Stadium des Verfahrens verwendet wird, um die Reaktionsproduktkomponenten zu komplexieren, z.B. Zinkchlorid. Anschließend wird eine Quelle von Thiosulfationen 14, z.B. Natriumthiosulfat, zugegeben, um ein erstes Reaktionsgemisch 15 zu bilden, das das erste Intermediat, 2-Amino-5-dimethylaminophenylthiosulfonsäure, enthält.
  • Bildung des zweiten Reaktionsgemischs
  • Das erste Reaktionsgemisch 15 wird dann weiter reagiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht mehr als etwa 10°C, mit zusätzlichem Oxydationsmittel 16, z.B. Kaliumdichromat, und o-Toluidinhydrochlorid 17, in einem Kondensationsschritt 18, um das zweite Intermediat, ein Kondensationsprodukt, Indaminthiosulfonsäure, im zweiten Reaktionsgemisch 19 zu bilden.
  • Bildung des dritten Reaktionsgemischs
  • Das zweite Reaktionsgemisch 19 wird dann weiter oxydiert 21, vorzugsweise durch die Zugabe eines geeigneten Oxydationsmittels 22, z.B. Kaliumdichromat, bei einer Temperatur von nicht mehr als etwa 10°C. Es folgt die Zugabe von Kupfersulfat, Zinkchloridkomplexbildner, Säure und eine Erhitzung auf 100°C, um den Schluss des Indaminrings zu bewirken, wodurch ein Endreaktionsprodukt in einem dritten Reaktionsgemisch 24 gebildet wird. An diesem Punkt wird das Reaktionsprodukt von dem dritten Reaktionsgemisch getrennt und gereinigt.
  • Trennung/Reinigung des dritten Reaktionsprodukts
  • In der derzeit bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Reaktionsprodukt zum Beispiel vom dritten Reaktionsgemisch durch Komplexbildung 24 mit einem geeigneten Komplexbildner 25, z.B. Zinkchlorid, präzipitiert, um das Komplex-Zinkchlorid-Doppelsalz zu bilden. Das Präzipitat wird aus der flüssigen Phase 26 filtriert und mit Natriumchloridlösung 27 gewaschen. Der gewaschene Filterkuchen wird dann in einem kritischen Volumen von Wasser 29 erneut gelöst 28, um eine
  • Reaktionsproduktlösung 30 zu bilden, die dann filtriert 31 wird, um ungelöste Feststoffe 32a zu entfernen, die verworfen werden. Zinkchlorid und ein/eine kritische(s) Volumen/Konzentration von Natriumchlorid 33 werden anschließend zum Filtrat 32 gegeben, um das Zinkchlorid-Doppelsalz noch einmal zu präzipitieren.
  • Das Doppelsalzprodukt wird von dem Gemisch durch Filtration getrennt, um einen Filterkuchen 34 zu erhalten. Wie durch die gestrichelte Linie 35 angedeutet, kann der Filterkuchen 24 mehrere Male erneut gelöst, filtriert, erneut präzipitiert und erneut isoliert werden, um den gewünschten Reinheitsgrad und die gewünschte Ausbeute des Doppelsalzkomplexreaktionsprodukts zu erhalten. Das endgültige gereinigte Filterkuchenkomplexprodukt 34 wird dann in Wasser gelöst und die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden isoliert und separiert durch HPLC-Verfahren, wie nachfolgend beschrieben.
  • ARBEITSWEISE
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen die Praxis der Erfindung so erläutern, dass eine fachkundige Person die neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen herstellen und die neuartigen Diagnoseverfahren unter Verwendung solcher neuen Verbindungen umsetzen kann, die zusammen die verschiedenen Ausgestaltungen der Erfindung darstellen, und um der fachkundigen Person die besten derzeit bekannten Verfahren zur Umsetzung der verschiedenen Ausgestaltungen der Erfindung aufzuzeigen.
  • 1. BEISPIEL
  • Herstellungsverfahren
  • Dieses Beispiel erläutert die exakten Verfahren zur Herstellung einer Charge eines Farbstoffproduktkomplexes und Trennung der neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen von dem Komplexprodukt durch HPLC.
  • Herstellung von Rohmateriallösungen
  • Ausrüstung/Zubehör:
    • A. Ohaus IP15KS Waage
    • B. AnD HV150KAI Waage
    • C. Fairbanks H90-5150 Waage
    • D. OHAUS WB25/1–20W Waage
    • E. Cole Parmer (51201-30) und Thermolyne (525535) Rührer
    • F. Probenehmer wie Stahlschöpflöffel, Trommelprobenehmer, usw.
    • G. Erlenmeyer-Kolben, Becher, Ballons und andere geeignete Glaswaren
    • H. Produktionslösungsetiketten
  • Sicherheit:
  • Beim Umgang mit Chemikalien ist gemäß MSDS-Richtlinien Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrillen, Labormäntel und Atemschutzmasken zu tragen.
  • Herstellungsverfahren für Rohmateriallösungen:
    • Zu Chlorwasserstoffsäure, 1364,2 g (± 5,5 g), werden 1364,2 g (± 5,5 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Aluminiumsulfathexadecahydrat, 1779,1 g (± 7,0 g), werden 2548,9 g (± 10,0 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Zinkchlorid, 7384,6 g (± 30,0 g), werden 2786,7 g (± 11,0 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Kaliumdichromat, 2101,9 g (± 8,0 g), werden 25203,8 g (± 100 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Natriumthiosulfatpentahydrat, 1526,6 g (± 6,0 g), werden 2043,6 g (± 8,0 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Kupfersulfatpentahydrat, 509,7 g (± 2,0 g), werden 1613,1 g (± 6,0 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Schwefelsäure, 600,0 g (± 2,0 g), werden 600,0 g (± 2,0 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
    • Zu Natriumchlorid, 70,4 kg (± 250 g), werden 234,4 kg (± 850 g) gereinigtes USP-Wasser gegeben. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sie klar ist.
  • SYNTHESE
  • Syntheseausrüstung und Zubehör:
    • LFE Bedientafel (3000)
    • 20 Gallonen fassende, ummantelte, mit Glas ausgekleidete Reinigungstanks mit Deckel (E71224)
    • Zwei 100 Gallonen fassende, ummantelte, mit Glas ausgekleidete Reinigungstanks mit Deckel (P1, PT-001)(P2, L-13621)
    • FTS Umlaufkühler (RC96C032) und 500 Gallonen fassender Kühltank (500CST)
    • Drei Caframo-Mischer (BDC-1850) (R1, 18500961)(P1, 18501148) (P2, 18501173) mit Welle und Rührflügel
    • Blitzmischer (L1U08) (201550)
    • Drei Wärmetauscher (Gardner Machinery) (R1, 01960763) (P1, 01960764) (P2, 08950727)
    • Drei 12KW Mantelfluidrezirkulatoren (Watlow, BLC726C3S 20)
    • Drei Umwälzpumpen (Sta-Rite, JBHD-625, C48J2EC15)
    • Masterflex peristaltische Digitalpumpe (A94002806)
    • Masterflex Peristaltikpumpe (L95003320)
    • Cole Parmer Peristaltikpumpe (B96002074)
    • Neutsche Filtrationseinheit (70-2038, 43421-1)
    • Zwei Buchner Filtrationseinheiten (Z11,624-6, Z10,441-8) Siemens Vakuumpumpe (F2BV2)
    • 60 Gallonen fassender, mit Glas ausgekleideter Auffangtank mit Deckel (86854, E164-1186)
    • Luftkompressor (DF412-2) (9502312538)
    • Durchflussregler (3-5500) (69705069190)
    • Sechs Chargenregler (3-5600) (Nr. 1, 69705069191, Nr. 2, 69705069199, Nr. 3, 69705069194, Nr. 4, 69705058829, Nr. 5,69705058805, Nr. 6, 69705069195)
    • Sechs Durchflusssensoren (Nr. 1, 69704295165, Nr. 2, 69704024995, Nr. 3, 69704024994, Nr. 4, 69704025027, Nr. 5, 69612178606, Nr. 6, 69703120990)
    • Vier Membranpumpen (M1)
    • Vier Überspannungsschutzeinrichtungen (A301H) (Nr. 2, 15557, Nr. 3, 15561, Nr. 4, 15558, Nr. 5, 15559)
    • Vier Luftregler (CFR10)
    • Vier Magnetventile (werden mit Luftreglern verwendet)
    • Vier Niedrigflusssensoren (FS-500)
    • Drei Magnetventile (EASM5V16W20)
    • Luftfilter/Regler (T1R)PTFE/F06R113AC
    • Filtermedium, Polypropylen (7211-1)
    • Filtermedium, Whatman Grade 52
    • PharMed Rohrmaterial (–18, –82, –90)
    • pH-Messgerät; Hanna 9321 (1303675) & Orion 620 (001911)
    • Spektrofotometer 20 (3MU7202070)
    • Fisher Scientific Vakuumofen (9502-033)
    • VWR 1370 FM Umluftofen (1370FM)
    • Staub/Dunstrespirator
    • Thomas Wiley Labormühle (3375-E10)
    • Patterson-Kelley Mischer (Blendmaster, C416578)
    • OHAUS TS4KD Waage
    • OHAUS IP15KS Waage
    • Mettler AG 104 Waage
    • AnD HV150KA1 Waage
    • Fairbanks H90-5150 Waage
    • OHAUS AS123 Drucker
    • OHAUS AS142 Drucker
    • AD-8121 Multifunktionsdrucker
    • Citizen iDP 3540 Rasterdrucker
    • Hewlett Packard HPLC (1050)
    • Ultraschallreiniger (8892-DTH, QCC9601 005C)
    • Type K Thermoelement-Temperaturschreiber (KTx, 6292753, 6355146)
    • Erlenmeyer-Kolben (8 l, 6 l, 4 l, 1 l)
    • Becher (8 l, 6 l, 500 ml, 250 ml)
    • Ballons (4 l, 10 l, 50 l)
    • HDPE-Trommeln (55 Gallonen, 100 Gallonen)
    • Messkolben (100 ml)
    • Plastiktrichter
    • Pastuer Pipetten & Kolben und Vollpipetten (10 ml, 5 ml) & Kolben
    • Blasebalg (25 ml, 50 ml)
    • Wiegepapier
    • Spateln
    • Verpackungsmaterial (Behälter, Deckel, Etiketten)
    • Rohmateriallösungen
  • SYNTHESE: Schritt 1
  • Synthese von 2-Amino-5-dimethylaminophenylthiosulfonsäure:
    • – Die Integrität des USP-Wassersystems prüfen. Das abgewogene gereinigte USP-Wasser (28.000 g ± 100,0 g) zum Reaktor geben und mit 190 ± 10 RPM rühren.
    • – N,N-Dimethyl-1,4-phenylendiamin (5,128 Mol, 720,0 g ± 3,0 g) zugeben. Das Material muss als Pulver (keine Klumpen) zugegeben werden. 10 Minuten rühren (± 5 Minuten).
    • – Chlorwasserstoffsäure (6 N, 1136,9 g ± 5,0 g) zugeben. 15 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren.
    • – Eine Reaktionsgemischprobe von etwa 10 ml mit einem Kunststoffprobenehmer entnehmen. Den pH-Wert prüfen. Der pH-Wert muss zwischen 2,8 und 3,8 bei 25°C ± 5°C liegen.
    • – Aluminiumsulfathexadecahydratlösung (4328,0 g ± 21,0 g) zugeben. 10 Minuten (± 5 Minuten) lang bei 275 ± 10 RPM rühren.
    • – Zinkchloridlösung (3641,5 g ± 18,0 g) zugeben. Auf 4°C ± 1°C kühlen.
    • – Wenn die Temperatur (PV1) 4°C ± 1°C erreicht hat, Kaliumdichromatlösung (6532,4 g ± 32,0 g) über einen Zeitraum von 20 Minuten (± 5 Minuten) zugeben. Nach Beenden der Zugabe 20 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren.
    • – Während die Temperatur unter etwa 10°C gehalten wird, Natriumthiosulfatpentahydratlösung (3570,2 g ± 18,0 g) zugeben. Die Lösung 30 Minuten (± 5 Minuten) lang bei 10°C rühren.
    • – Den Sollwert auf 60°C ändern. Wenn die Temperatur (PV1) 60,0°C ± 3,0°C erreicht, das Reaktionsgemisch 5 Minuten (± 3 Minuten) lang rühren und den Sollwert auf dem LFE Controller auf 10,0 ändern.
    • – Nachdem die Temperatur 13,0°C ± 2,0°C erreicht hat, den pH-Wert prüfen. Der pH-Wert muss zwischen 3,1 und 4,1 bei 25°C ± 5°C liegen.
  • SYNTHESE: Schritt 2
  • Synthese von Indaminthiosulfonsäure
    • – o-Toluidin (604,4 g ± 2,5 g) abwiegen und in einem Eisbad auf 18°C ± 3°C kühlen. Chlorwasserstoffsäure (6 N, 1230,7 g ± 5,0 g) langsam zum o-Toluidin geben. o- Toluidinhydrochlorid aus dem Eisbad nehmen und die Lösung auf 38°C ± 3°C kühlen lassen. Die Lösung zum Reaktionsgemisch geben und 5 Minuten (± 3 Minuten) lang rühren.
    • – Kaliumdichromatlösung (6532,4 g ± 32,0 g) über einen Zeitraum von 20 Minuten (± 5 Minuten) zugeben. Nach Beenden der Zugabe 10 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren.
    • – Den Controller-Sollwert (SP1) auf 60,0 ändern. Wenn die Reaktionsgemischtemperatur 60,0°C ± 3°C erreicht hat, das Gemisch 25 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren. Es bildet sich ein Präzipitat aus, das aus einem grünen Indamin besteht.
  • SYNTHESE: Schritt 3
  • Synthese von Zinkchlorid-Doppelsalz:
    • – Den Sollwert des LFE-Controllers auf 7,0 einstellen. Wenn die Reaktionsgemischtemperatur 10,0°C ± 3°C erreicht hat, Kaliumdichromatlösung (6532,4 g ± 32,0 g) über einen Zeitraum von 20 Minuten (± 5 Minuten) zugeben. Nach Beenden der Zugabe 20 Minuten lang rühren.
    • – Kaliumdichromatlösung (5225,9 g ± 26,0 g) über einen Zeitraum von 20 Minuten (± 5 Minuten) zugeben. Nach dem Ende der Zugabe 20 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren.
    • – Zinkchloridlösung (3641,5 g ± 18,0 g) zugeben. 20 Minuten (± 5 Minuten) lang bei 350 ± 10 RPM rühren.
    • – Kupfersulfatpentahydrat (2122,8 g ± 10,0 g) zugeben. 15 Minuten (± 5 Minuten) lang rühren.
    • – Den Controller-Sollwert (SP1) auf 100,0 ändern. Wenn die Reaktionsgemischtemperatur 67,0°C ± 3°C erreicht hat, Schwefelsäurelösung bis auf einen pH-Wert von 2,9 ± 0,3 durch Zugeben von Aliquoten (500 ml, 250, 125 ml, usw.) zugeben. Nach jeder Zugabe 5 bis 10 Minuten lang rühren und den pH-Wert prüfen.
    • – Wenn die Reaktionsgemischtemperatur 100,0°C ± 3°C erreicht hat, das Gemisch 35 ± 5 Minuten lang rühren.
    • – Den Controller-Sollwert (SP1) auf 35,0 ändern. Wenn die Reaktionsgemischtemperatur 70,0°C ± 3°C erreicht hat, den Controller-Sollwert (SP1) auf 2,5 ändern. In 4 Stunden auf 2,5°C kühlen und 4 bis 18 Stunden lang auf 2,5°C ± 2,0°C halten.
  • Reinigung: Schritt 1
    • – Das Reaktionsgemisch durch ein geeignetes Filtermedium (Whatman Grade 52) filtern.
    • – Wenn der Reaktor leer ist, 24,0 kg ± 150,0 g 30%ige NaCl-Lösung abwiegen und 24,0 kg ± 150,0 g USP-Wasser zugeben. Das Reaktorbodenventil schließen und die 15%ige NaCl-Lösung zum Reaktor geben. Die Lösung kurz rühren. Nach dem Ende der Filtration die NaCl-Lösung zur Filtrationseinheit geben und den Filterkuchen abspülen.
    • – Den Zustand des 100 Gallonen fassenden, mit Glas ausgekleideten, ummantelten Reinigungstank Nr. 1 prüfen und sicherstellen, dass der Tank sauber ist; den Tank mit einem HDPE-Deckel, Caframo-Rührer, einer Rührwelle, einem Propeller und einer in einen Kunststoffthermoelementschacht eingefügten Thermoelementsonde ausstatten.
    • – 190,0 kg ± 1,0 kg USP-Wasser in einen HDPE-Behälter abwiegen und das Wasser zum Reinigungstank 1 übertragen. Das Gemisch mit 350 RPM rühren. Am Ende der NaCl-Wäsche des Filterkuchens den Filterkuchen unter Rühren in den Reinigungstank 1 geben.
    • – Das Gemisch 2 bis 4 Stunden lang rühren.
    • – Den LFE-Controller des Reinigungstanks 1 auf 75,0 (SP1) einstellen.
    • – Wenn die Gemischtemperatur (PV1) 75,0°C ± 3°C erreicht, den Sollwert am Controller auf 40,0 ändern.
    • – Das Gemisch bei 40°C mit 350 RPM 12 bis 36 Stunden lang rühren.
    • – Eine Probe (über das Bodenventil) von etwa 50 ml entnehmen. 1,0 ml der Probe mit einer 1,0 ml Pipette abmessen und in einem 100-ml-Messkolben auf 100 ml verdünnen. Anschließend 10,0 ml dieser Lösung mit einer 10,0 ml Pipette aufnehmen und in einem 100-ml-Messkolben auf 100 ml verdünnen. Die Absorbanz dieser Probe mit dem Spectronic 20+ messen. Die Absorbanz der Probe sollte bei ≥ 0,220 liegen.
  • Reinigung: Schritt 2
    • – Das Gemisch durch ein Filtermedium in der Filtrationseinheit filtern. Das Filtrat in einem tarierten HDPE-Behälter mit Deckel auffangen.
    • – Den 100 Gallonen fassenden, mit Glas ausgekleideten, ummantelten Reinigungstank 2 mit einem Deckel, Caframo-Rührer, einer Rührwelle, einem Propeller und einer in einen Kunststoffthermoelementschacht eingefügten Thermoelementsonde ausstatten.
    • – In einen sauberen HDPE-Behälter eine Menge von 30%iger NaCl-Lösung abwiegen, die gleich dem oben registrierten Lösungsvolumen ist, unter Verwendung der folgenden Formel: (ml von Lös.)(116,91 g NaCl Lös./100,0 ml NaCl Lös.) = g NaCl Lös.
    • – ≈ 10 ml des Filtrats als Probe entnehmen und den pH-Wert prüfen. Der pH-Wert muss zwischen 3,0 und 4,0 liegen. Das Filtrat zum Reinigungstank 2 übertragen. Die Lösung mit 350 RPM rühren.
    • – Zinkchloridlösung (1636,3 g ± 6,5 g) zugeben.
    • – Die NaCl-Lösung (nach Gewicht) in den Reinigungstank 2 übertragen.
    • – Den LFE-Controller des Reinigungstanks 2 auf 75,0 (SP1) einstellen.
    • – Wenn die Gemischtemperatur (PV1) 75,0°C ± 3°C erreicht, den Sollwert am Controller auf 5,0 ändern.
    • – In 6 Stunden auf 5°C kühlen und 4 bis 24 Stunden lang auf 5°C ± 4,0°C halten.
  • VERARBEITUNG:
  • i. Filtern
    • – Das Gemisch durch ein tariertes Filtermedium (Whatman Grade 52) in der Filtrationseinheit filtern.
    • – 12 kg ± 50 g 30%ige Natriumchloridlösung abwiegen und mit 12 kg ± 50 g USP-Wasser verdünnen. Den Filterkuchen mit der 15%igen Natriumchloridlösung durch direkte Zugabe der Lösung in die Buchner-Einheit waschen. Nach der Filtration das Filterpapier, das das Produkt enthält, vorsichtig entfernen.
  • ii. Trocknen
    • – Das gereinigte Komplexreaktionsprodukt in den Ofen geben und 5 Stunden (± 1 Stunde) lang bei 50,0°C ± 3,0°C trocknen. Das Komplexprodukt aus dem Umluftofen nehmen und in den Vakuumofen geben. Bei 45,0°C ± 3,0°C bei 948 hPa ± 68 hPa (711,2 mm Hg ± 50,8 mm Hg; 28'' Hg ± 2'' Hg) 10 ± 2 Stunden lang trocknen.
  • iii. Mahlen
    • – Das 0,5 mm Sieb an der Thomas Wiley Labormühle installieren. Einen sauberen Behälter an der Schüttrinne befestigen. Die Kammertür muss geschlossen und verriegelt werden.
    • – Die Schiebeklappe am Boden des Trichters schließen, den Trichterdeckel abnehmen und das getrocknete Komplexprodukt einfüllen. Den Trichterdeckel wieder aufsetzen. Die Mühle einschalten und die Schiebeklappe leicht öffnen. Produkt so langsam in die Mühlenkammer einspeisen, dass die Mühle nicht verlangsamt oder blockiert wird.
    • – Nach dem Ende des Mahlvorgangs den Behälter vorsichtig von der Schüttrinne entfernen.
  • v. Mischen
    • – Das Produkt in den Patterson-Kelly LabBlender-Behälter geben und den Deckel schließen. Die Zeituhr auf 15 Minuten ± 5 Minuten einstellen.
  • HPLC-Verfahren zur Isolierung und Trennung
  • Dieses Beispiel beschreibt ein geeignetes HPLC-Verfahren zur Isolierung und Trennung der neuartigen erfindungsgemäßen Verbindungen von dem getrockneten, gemahlenen und gemischten Komplexprodukt, das wie oben beschrieben hergestellt wurde.
  • A. Instrumente und Ausrüstung
    • 1. HPLC-Chromatographieverfahren
    • a. HP1100 HPLC Chromatographiesystem
    • b. HP1100 Diodengruppendetektor
    • c. HP1100 Quarternäre HPLC-Pumpe
    • 2. Fraktionssammlung und -reinigung
    • a. ISCO Foxy Jr., 10-Kanal-Fraktionssammler
    • b. Büchi, Modell R-124 Rotationsverdampfer
    • c. Sep-pak Patrone, C18, Varian
    • 3. Massenspektrumanalysen
    • a. Elektronenstoß-/Massenspektrometrie (EI-MS)
    • 1. MS Instrument: VG Analytical ZAB 2-SE
    • 2. Ausgangstemperatur: 200°C
    • 3. Elektronenspannung: 70eV
    • 4. Probensonde: feste Sonde
    • 5. Sondentemperatur: 280°C
    • b. Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC-MS)
    • 1. HP1100 Binärpumpe mit Vakuumentgaser
    • 2. Lösungsmittel A: Wasser:ACN (88:12) v/v mit 0,1 % TEA
    • 3. Lösungsmitel B: Wasser:ACN (1:1) v/v mit 0,1 TEA
    • 4. Gradient: 0 % Lösungsmittel B angehoben auf 30 Lösungsmittel B in 18 Minuten; angehoben auf 100 Lösungsmittel B nach 27 Minuten, 3 Minuten halten
    • 5. Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/Minute
    • 6. Säule: Water Symmetry C18 Säule, 4,6 mm × 250 mm, 5 μm)
    • 7. Säulentemperatur: 40°C
    • 8. Detektor: Variable Wellenlänge UV, 290 nm
    • 9. MS Instrument: VG Bio-Q Triple-Quadrupol-Massenspektrometer
    • 10. Betriebsmodus: Positive Elektrosprayionisierung (+ESI) Modus
    • 11. Ausgangstemperatur: 80°C
    • c. Fast Atom Bombardment (FAB-MS)
    • 1. MS Instrument: VG Analytical ZAB 2-SE
    • 2. Probeneingabe: Caesiumionenstrahler
    • 3. Datensystem: VH Analytical 11-250J mit PDP 11/73
    • d. Elektrospray-Massenspektrometer (ESI-MS)
    • 1. MS Instrument: VG Biotech Bio-Q mit Vierpolanalysator
    • 2. Betriebsmodus: negative Ionen direkte Infusion
    • 3. Injektionsvolumen: 50–75 μl
    • 4. Elutionslösungsmittel: 50 % wässriges ACN mit 0,1 % FA
    • 5. Fließgeschwindigkeit: 10 μl/Minute
    • e. Elektrospray MS/MS (ESI-MS/MS)
    • 1. MS Instrument: VG Quattro II Bio-Q Triple-Quadrupol-Analysator
    • 2. Kollisionsgas Argon
    • 3. Probenaliquote: 50–75 μl
    • 4. Elutionslösungsmittel: 50 % wässriges ACN mit 0,1 % TFA
    • 5. Fließgeschwindigkeit: 10 μl/Minute
    • f. Hochauflösendes Massenspektrometer (HR-MS)
    • 1. MS Instrument: VG Analytical ZAB 2-SE
    • 2. Probeneingabe: Caesiumionenstrahler
    • 3. Datensystem: VH Analytical 11-250J mit PDP 11/73
    • 4. Kernmagnetische Resonanzspektrometrie (NMR)
    • a. 400 MHz Varian Inova NMR
    • 5. Analysen durch Röntgenstrahlungbeugung im Einkristall
    • a. Nonius CAD4, Modell 586, automatisierter Einkristalldiffraktometer
    • b. Cu Röntgenröhre, Feinfokus, (λ=1,5418Å)
    • c. Zufällig ausgerichtete Fotoausrüstung, Polaroid, Modell 57-3
    • d. EXPRESS Datenerfassungssoftware
    • e. MOLEN Dateninterpretationssoftware
  • B. Chemikalien, Reagenzien und Standards
    • 1. Chemikalien und Reagenzien
    • a. Acetonitril (ACN), HPLC-Güte
    • b. Methanol (MeOH), HPLC-Güte
    • c. Chloroform (CHCl3), HPLC-Güte
    • d. Eisessig (GAA), ACS-Güte
    • e. Chlorwasserstoffsäure (HCl), ACS-Güte
    • f. Milli-Q-Wasser
    • g. Triethylamin (TEA), HPLC-Güte
    • h. Ammoniumacetat, AR-Güte
    • i. Natriumhydroxid-(NaOH)-Pellets, Reagensgüte
    • j. Stickstoffgas, Nullgüte
    • k. Methanol, deuteriert (d4-MeOH)
    • l. Dimethylsulfoxid, deuteriert (d6-DMSO)
    • m. Wasser, deuteriert (D2O)
    • n. Chlorwasserstoffsäure, deuteriert (DCl)
    • o. Natriumtetraphenylborat, Reagensgüte
  • Erstes präparatives HPLC-System 2 zur Faktionssammlung von Verbindungen
  • Erste Fraktionssammlung
  • Wässriges Verdünnungsmittel – Eine Lösung aus 0,1 M Essigsäure herstellen und den pH-Wert mit NaOH auf 6,1 ± 0,1 einstellen.
    Mobile Phase A – 88:12 wässriges Verdünnungsmittel: ACN
    Mobile Phase B – 50:50 wässriges Verdünnungsmittel: ACN
  • Probenherstellung: Eine 15 mg/ml Lösung des getrockneten, gemischten Komplexreaktionsprodukts in wässrigem Verdünnungsmittel herstellen. Die Lösung in 30 bis 40 ml Aliquoten auf separate 10 g C18 SPE-Patronen geben, mit etwa 20 ml wässrigem Verdünnungsmittel waschen und dann mit etwa 10 ml Wasser waschen. Mit etwa 10 ml 0,01 N HCl in MeOH eluieren. Die gereinigte Probe zur Trockne rotationsverdampfen und erneut in wässrigem Verdünnungsmittel lösen.
  • Chromatographisches System: Ein AP 1100 HPLC-System mit einem Säulenheizer wird mit einer 7 μm, 30,0 cm × 7,8 mm C18 Säule und einem geeigneten UV-Detektor für den Nachweis bei 290 nm und einer Diodengruppe ausgestattet; die Fließgeschwindigkeit wird auf 5,0 ml/Minute eingestellt und die Säulentemperatur auf 20°C. Es wird die folgende Gradientenelution verwendet:
  • Figure 00200001
  • Verfahren: 900 μl Aliquoten der Probe werden auf das Chromatographiesystem injiziert und die Peaks von Interesse werden mit einem Mehrkanal-Fraktionssammler gesammelt. Nach dem Sammeln aller Fraktionen wird jede Fraktion rotationsverdampft, um den größten Teil des ACN zu entfernen, anschließend auf einer C18 SPE-Patrone konzentriert, mit Wasser gewaschen und mit etwa 5 ml 0,01 N HCl in MeOH eluiert. Das Elutionsmittel wird zur Trockne rotationsverdampft und zur weiteren Reinigung beiseite gelegt.
  • Letzte Fraktionssammlung
    • Mobile Phase A – 88:12 0,1 % TER:ACN
    • Mobile Phase B – 50:50 0,1 % TEA:ACN
  • Probenherstellung: Lösungen der getrockneten Fraktionen von der ersten Fraktionssammlung herstellen und mit der mobilen Phase A verdünnen.
  • Chromatographiesystem: Ein HP1100 HPLC-System mit einem Säulenheizer wird mit einer 7 μm, 30,0 cm × 7,8 mm C18 Säule und einem geeigneten UV-Detektor für den Nachweis bei 290 nm und einer Diodengruppe ausgestattet; die Fließgeschwindigkeit wird auf 5,0 ml/Minute und die Säulentemperatur auf 30°C eingestellt. Es wird die folgende Gradientenelution verwendet:
  • Figure 00210001
  • Verfahren: 200 μl Aliquoten der Probe werden auf das Chromatographiesystem injiziert und die Peaks von Interesse werden mit einem Mehrkanal-Fraktionssammler gesammelt. Nach dem Sammeln aller Fraktionen wird jede Fraktion zunächst rotationsverdampft, um den größten Teil des ACN zu entfernen, anschließend auf einer C18 SPE-Patrone konzentriert, mit Wasser gewaschen und mit etwa 5 ml 0,01 N HCl in MeOH eluiert. Die Fraktionen werden dann unter einem trockenen Stickstoffstrom getrocknet und für Identifikationsanalysen beiseite gelegt.
  • Verbindung IV – Charakterisierung
  • Trennung und Isolierung
  • Die Verbindung IV wird mit einem semi-präparativen HPLC-Verfahren isoliert. Die Fraktion wird gesammelt, der größte Teil des ACN wird durch Rotationsverdampfung entfernt und die Fraktion wird mit einer C18 SPE Patrone weiter konzentriert, mit Wasser gewaschen und mit etwa 5 ml 0,01 N HCl in MeOH eluiert. Die Fraktion wird dann unter einem trockenen Stickstoffstrom getrocknet. Ein Teil des Materials wird in einer mobilen Phase erneut gelöst und auf das HPLC-System injiziert, um die Reinheit der Fraktion zu bestimmen. Diese Injektion der Verbindung IV ergibt eine Reinheit von etwa 95 %, und 8,2 mg werden durch NMR getestet.
  • Massenspektrumanalysen
  • Vorläufige LC-MS Massenspektrumdaten des gemahlenen, gemischten Komplexreaktionsprodukts zeigen, dass die Molekülmasse der Verbindung IV etwa 375,3 m/z beträgt. Weitere HR-MS-Studien mit Fraktionen aus der LC-MS ergeben eine Masse von 375,1655 m/z und eine Molekülformel von C22H23N4S1 für die Verbindung IV. Die Töchter des 375 m/z Mutterions der Verbindung IV werden mit positiver ESI-MS/MS untersucht. Das Fragmentationsmuster zeigt die vorherrschenden Verluste von 16 amu und 44 amu aus dem Molekülion der Verbindung IV zeigt die Struktur der Verbindung IV. Diese Verbindung und ihre Derivate, Verbindungen V und VI, werden in einer Sekundärreaktion der Stammverbindung (TBO) und von überschüssigem Ausgangsmaterial O-Toluidin gebildet.
  • Vergleichsverbindung I – Charakterisierung
  • Trennung und Isolierung
  • Die Vergleichsverbindung I wird mit dem semi-präparativen HPLC-Verfahren isoliert. Die Fraktion wird gesammelt, der größte Teil von ACN wird durch Rotationsverdampfung entfernt und die Fraktion wird weiter mit einer C18 SPE Patrone konzentriert, mit Wasser gewaschen und mit etwa 5 ml 0,01 N HCl in MeOH eluiert. Die Fraktion wird dann unter einem trockenen Stickstoffstrom getrocknet. Ein Teil des Materials wird in mobiler Phase erneut gelöst und auf das HPLC-System injiziert, um die Reinheit der Fraktion zu bestimmen. Diese Injektion der Vergleichsverbindung I ergibt eine Reinheit von etwa 95 %, und 18,9 mg werden durch NMR getestet.
  • Massenspektrumanalysen
  • Vorläufige LC-MS Massenspektrumdaten des getrockneten, gemischten Komplexreaktionsprodukts zeigen, dass die Molekülmasse der Vergleichsverbindung I etwa 284,1 m/z beträgt. Weitere HR-MS-Studien mit Fraktionen aus der LC-MS ergeben eine Masse von 284,1223 m/z und eine Molekülformel von C16H18N3S1 für die Vergleichsverbindung I . Die Töchter des 284 m/z Mutterions der Vergleichsverbindung I werden mit positiver ESI-MS/MS untersucht. Das vorgeschlagene Struktur- und Fragmentationsmuster, das die vorherrschenden Verluste von 16 amu, 30 amu und 59 amu aus dem Molekülion zeigt, ergibt die Struktur der Verbindung I. Verbindung I und ihre Derivate. Vergleichsverbindungen II und III werden durch Fangen eines freien Radikals von einer Methylgruppe von einem anderen demethylierten Molekül an dem entsprechenden Stamm-TBO-Isomer gebildet.
  • Die Vergleichsverbindungen II, III und die Beispiele V und VI werden durch die oben für die Isolierung und Charakterisierung der Verbindungen VI und I beschriebenen Verfahren isoliert und charakterisiert.
  • 2. BEISPIEL
  • Klinisches Testprotokoll
  • Herstellung klinischer Testlösungen
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der jeweiligen Produkte aus dem 1. Beispiel bei der Identifizierung von oraler Dysplasie.
  • Vergleichsverbindung I, Himbeeraromastoff (IFF Raspberry IC563457), Natriumacetattrihydrat-Puffermittel und H2O2 (30 % USP) Konservierungsmittel (siehe US-Patent 5,372,801) werden in gereinigtem Wasser (USP), Eisessig und SD 18 Ethylalkohol gelöst, um eine Testlösung mit der in Tabelle A angegebenen Zusammensetzung herzustellen.
  • TABELLE A
    Figure 00240001
  • Es werden Vorspül- und Nachspültestlösungen aus 1 Gew.-% Essigsäure in gereinigtem Wasser, Natriumbenzoat-Konservierungsmittel und Himbeeraroma hergestellt.
  • Klinisches Protokoll
  • Dem Patienten wird ein Tuch zum Schutz der Kleidung umgelegt. Es wird davon ausgegangen, dass der Patient expektoriert; ihm wird deshalb ein 10-oz.-Becher gegeben, der in einem Behälter für infektiösen Abfall entsorgt oder dessen Inhalt direkt in die Mitte eines Spülbeckenabflusses gegossen werden kann, um eine Verfärbung des Spülbeckens zu vermeiden. In der Umgebung befindliche Oberflächen oder Gegenstände, die verfärbt werden können, werden zugedeckt oder aus dem Testbereich entfernt.
  • Es wird eine visuelle Oralkrebsuntersuchung durchgeführt, bei der keine Instrumente verwendet werden, die Kerben oder Schnitte in Weichteilen verursachen können. Das Aussehen von Weichteilen und Zähnen vor dem Färben wird notiert.
  • Der Patient spült die Mundhöhle etwa 20 Sekunden lang mit etwa 15 ml der Vorspüllösung und expektoriert, um überschüssigen Speichel zu entfernen und eine einheitliche Mundumgebung zu schaffen. Dieser Schritt wird dann mit zusätzlicher Vorspüllösung wiederholt.
  • Der Patient spült und gurgelt dann 20 Sekunden lang mit Wasser und expektoriert.
  • Der Patient spült und gurgelt anschließend eine Minute lang mit 30 ml der Testlösung und expektoriert.
  • Der Patient spült anschließend 20 Sekunden lang mit 15 ml der Nachspüllösung und expektoriert. Dieser Schritt wird wiederholt.
  • Der Patient spült und gurgelt anschließend 20 Sekunden lang mit Wasser und expektoriert. Dieser Schritt wird dann wiederholt.
  • Die Mundhöhle wird dann mit geeigneten Weichteiluntersuchungstechniken wie Retraktion, ausgewogene Beleuchtung und Vergrößerung, falls erforderlich, untersucht. Ort, Größe, Morphologie, Farbe und Oberflächeneigenschaften verdächtiger Läsionen, die eine blaue Verfärbung behalten, werden aufgezeichnet.
  • Zur Reduzierung falscher positiver Ergebnisse wird bei dem Patienten 10 bis 14 Tage später das obige Protokoll wiederholt. Während dieses Zeitraums heilen ulzerative oder traumatische Läsionen oder Reizungsursachen aus, die zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung evtl. vorhanden waren. Eine positive Verfärbung im Anschluss an die zweite Untersuchung eines verdächtigen Bereichs, der in der ersten Untersuchung erfasst wurde, wird als ein Hinweis auf kanzeröses oder präkanzeröses Gewebe angesehen, und es erfolgt eine Biopsie zur Bestätigung dieses Ergebnisses.
  • Frühe erythroplastische Läsionen verfärben sich oft in einem getupften oder fleckigen Muster blau. Es ist jedoch normal, das das Färbemittel in den unregelmäßigen Papillenspalten auf dem Zungenrücken zurückgehalten wird, was kein positives Ergebnis ist. Zu anderen Bereichen, die blaues Färbemittel zurückhalten, jedoch nicht als positive Bereiche angesehen werden, gehören Zahnbelag, die Zahnfleischränder der jeweiligen Zähne, eine diffuse Verfärbung des Gaumensegels aufgrund einer Farbstoffübertragung von der Verfärbung des Zungenrückens sowie ulzerative Läsionen, die leicht unterschieden werden können. In allen Fällen, in denen eine Läsion äußerst verdächtig ist, jedoch mit diesem Test nicht positiv verfärbt wird, ist eine Biopsie unumgänglich.
  • Beispiele 3 – 7
  • Die oben beschriebenen Verfahren werden wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Vergleichsverbindungen II, III und die Beispiele IV, V und VI anstelle der Vergleichsverbindung I verwendet werden. Es werden ähnliche Ergebnisse erhalten.
  • Nachdem ich meine Erfindung nun so beschrieben habe, dass die fachkundige Person sie verstehen und umsetzen kann, und nachdem ich ihre derzeit bevorzugten besten Verfahren identifiziert habe, beanspruche ich Folgendes:

Claims (4)

  1. Verbindung mit der Strukturformel
    Figure 00270001
  2. Verbindung mit der Strukturformel
    Figure 00270002
  3. Verbindung mit der Strukturformel
    Figure 00270003
  4. Verwendung einer Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Erkennen von dysplastischem Gewebe durch selektives Färben von dysplastischem Gewebe.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7462346B2 (en) * 2001-08-28 2008-12-09 Zila Biotechnology, Inc. Light-stabilized(in vivo) stain composition and method of manufacture
US20050089472A1 (en) * 2003-10-22 2005-04-28 Shovers Aaron H. Monitoring the status of a condition of an animal through visually observable indicia

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4321251A (en) * 1979-12-19 1982-03-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Detection of malignant lesions of the oral cavity utilizing toluidine blue rinse
JPS63187154A (ja) * 1987-01-29 1988-08-02 Kishida Kagaku Kk 酸素検知剤
ES2133143T3 (es) * 1991-10-31 1999-09-01 Zila Inc Composicion de tincion biologica, procedimiento de preparacion y procedimiento de utilizacion para la deteccion del cancer epitelial.
US5942410A (en) * 1997-07-07 1999-08-24 Oncometrics Imaging Corp. Composition and method for staining cellular DNA, comprising thiazine derivative metabisulfite and methanol or ethanol
US6417003B1 (en) * 1993-01-14 2002-07-09 Zila, Inc. Method and kit for epithelial cancer screening
ATE253380T1 (de) * 1996-01-16 2003-11-15 Zila Inc Verfahren und mittel zur in-vivo erkennung von mundhöhlenkrebs und von präkanzerösen zuständen
CA2249227A1 (en) * 1997-01-20 1998-07-23 Kyowa Medex Co., Ltd. Methods and reagents for quantitatively determining ascorbic acid
DE19716586C1 (de) * 1997-04-21 1998-08-06 Continental Ag Verfahren zum Ermitteln der Profiltiefe eines Fahrzeugreifens am fahrenden Fahrzeug
US6194573B1 (en) * 1997-11-13 2001-02-27 Zila, Inc. Process for manufacture of in vivo stain composition
US6649144B1 (en) * 2000-02-28 2003-11-18 Zila, Inc. Method for detecting and killing epithelial cancer cells

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Publication number Publication date
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EA200101028A1 (ru) 2002-02-28
KR20010108431A (ko) 2001-12-07
CA2366759A1 (en) 2001-08-02
DK1165087T3 (da) 2005-11-21
EA003939B1 (ru) 2003-10-30
MXPA01009797A (es) 2002-11-04
JP2003520816A (ja) 2003-07-08
CN1219515C (zh) 2005-09-21
HUP0201634A3 (en) 2009-08-28
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