TWI250157B - In vivo stain compounds - Google Patents
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Description
1250157
、發明說明$ 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 社 印 製 局關於-種新的生物染色化合物，其用於人類的 定％ ,t面本發明關於活體上使用此種新穎化合物來鑑 走馬發頁不良，如異常的組織。 同時S 一 、 _ 万面’本發明關於新的化合物和在活體上應用 此化合物作診斷的方法特別適合於檢測疑爲發育不良的口 腔、，且織，尤其是癌或癌前組織。 本發明的各種具體實施例及其應用，下面細節敘述如圖 表對嫻熟此藝者是明顯易懂的，其中 圖表的主要敘述 Q 1爲加工况私圖，係描述合成本發明之新穎化合物的加 工過程。 發明背景 大部份的上皮組織損害導因於創傷。然而，其他的損害 舄發㈢不良的腫瘤，其中邵份是良性的，但其中部份是癌 或癌前。此外，許多發育不良的損害很小且易在醫生常態 目視檢查時忽略，特別這些損害在人體的腔道中如口腔。 一種已知的活體診斷方式其可鑑別和描劃出疑爲發育不 良的組織。此種篩檢於Mashberg著之美國專利4,321 251和 Tucci等人著之美國專利5,372,801中描述使用甲苯胺藍 〇 (氯化甲苯铵）作爲活體染色劑，此種染劑可選擇性染出 癌和癌前組織。一旦以Mashberg步驟鑑定疑爲發育不良的 損害，必須取得例行的活體組織切片並作組織學上的檢 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 卜訂·
1250157 A7 B7 五、發明說明（2 ) 查，以確定此損害是否爲惡性或癌前性。作此試驗的試劑 組含有以正確量和濃度預混好的染劑和洗劑，由Zila公司 取得許可以ORASCREEN®和ORATEST®商標於數個國家販 賣。 發明主要斂沭 吾之新發現爲可用於選擇性的活體染色並鑑定出發育不 良組織的新穎化合物。這些化合物具有下列結構式：
X
X 其中X是氫，甲基或Y ; Y是-NH-R或氫；而尺是甲基或 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
圖解説明，這些化合物包括 -5- 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250157 A7 B7 五、發明說明（ 3 (I) 2 Μ 8 CHZ 〆、〆％〆、〆H?C II \ \l ^l〇 3 \N/ \S ^、NHLz i»3 (II)
H • ii j i 、〆、〆、夕、〆、yHLz (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 (HI)
E
2 N 8 CHi 1/ -II J 二 /L \s /、NH -|線_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250157 A7 B7 五、發明說明（ 4
N 、N〆、夕 (1h3 (V) ch3
ι/2、〆％〆、〆0"3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 和 （VI) h2n- 夕2
N：H3 l·訂· -線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製造過程的主要敘述 本發明之化合物係由近似於1889年1 1月3 0日出版 Dandliker等人所著之美國專利第418,055號甲苯胺藍Ο (’’ TBO ’’）之製法的加工方法來合成。Dandliker合成法由一 系列三個氧化步驟所構成··（i)n，n-二甲基-對·苯二胺的 氧化，如在重鉻酸鉀的存在下，形成2_胺基-5-二甲基胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2Ϊ0 X 297公釐） 1250157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（） 苯基硫代磺酸；（2 )硫代磺酸與鄰·甲苯胺縮合，以形成對 應的indamine ·硫代磺酸；和（3 ) indamine -硫代磺酸的環閉 鎖’如在沸騰溫度下，與合成劑作用3 〇分鐘，以形成甲苯 胺藍Ο。此反應混合物接著被冷卻且環閉鎖反應複合物的 反應產物以鹽析出。複合物的純化可藉反覆的溶解和沉澱 來達成。 裝備本發明化合物的方法不同於Dandliker合成法之處在 合成劑的添加早於第三氧化步驟，較好是在第一氧化步驟 且本發明的新穎產物是藉高度液態色層分析法（HPLC)自沉 澱複合物游離和分離出來。 使用本發明之產物偵測上皮細胞癌之用法主要敘述 本發明的新穎化合物與Mashberg步驟一致，使用於選擇 性染出發育不良的上皮組織，除了以這些化合物的每一個 來取代甲苯胺藍〇之外。因此本發明也考慮到一種於人體 活體上偵測發育不良組織的方法，其包括施用含有上述新 顆產物之一或其混合物之組合物至人類上皮組織的步驟。 製備本發明表物之製法主要敘述 圖1爲描劃製備本發明之新穎化合物製法的加工流程圖。 合成所需之起始物質10爲商業上可取得之高純度N，N-二 甲基-對-苯二胺。 第一反應混合物的形成 起始物質1 〇的水溶液藉著與適當氧化劑i 2和重鉻酸钟 1 2，在酸，硫酸鋁和試劑i 3 (被認爲用以組成中間產物並 應用於稍後的組成反應產物組合物的過程，如氯化鋅）的存 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 --線- -8 -
1250157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（6 ) 在下被氧化1 1，較好是在1 0 °C以下，特別是在5 °C以下。 接著，硫代硫酸鹽離子1 4的來源如硫代硫酸鈉被加入以形 成第一反應混合物15 ’其包含第一中間產物，2·胺基- 5-二甲基胺苯基硫代磺酸。 第二反應混合物的形成 第一反應混合物1 5接著與添加的氧化劑1 6如重鉻酸钾和 鹽酸鄰-甲苯胺1 7進一步反應，較佳在不大於約丨〇 X：之溫 度，進行縮合步驟1 8以形成第二中間產物此爲一種縮合產 物indamine硫代續酸，即爲第二反應混合物1 9。 第三反應混合物的形成 第二反應混合物1 9接著較好是藉適當氧化劑2 2，如重鉻 酸鉀的添加進行氧化21，溫度不超過i〇°C。接著藉添加硫 酸銅，氯化鋅合成劑，酸並加熱至1〇〇 °C以閉鎖in(jamine 環，形成最後的反應產物，即爲第三反應混合物2 4。此時 反應產物自第三反應混合物中分離並純化。 第三反應混合物的分離/純化 舉例來説，本發明加工過程中現行較好的實例是反應產 物從第二反應混合物藉複合物2 4與適當的合成劑2 5，如氣 化鋅來形成複合氯化鋅雙重鹽時沉澱出來。此沉澱以液相 過濾26並以氯化鈉溶液27清洗。清後的濾出塊狀物以臨界 量的水2 9再次溶解2 8以形成反應產物溶液3 〇，接著再以 過濾3 1去除不溶的固體32a，此部份予以抛棄。再接著以 氯化鋅，臨界2量/濃度的氯化鈉33加入濾液32中再次沉澱 出氯化鋅雙重鹽。 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 卜訂i)· ;線· 1250157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 此二重鹽產物以過濾法自混合物中分離出來，得到一塊 狀物34。虛線35表示濾出的塊狀物34可以再次溶解，過 濾，再沉澱和多次再分離以達到想要的純度和雙重鹽複合 反應產物的產率。最後純化的濾出塊狀複合產物34溶解= 水中並以HPLC游離和分離出本發明的新穎化合物，細描 述如下。 如果使用太多的水，會使反應產物無法分離，如果使 用太少的水（1)所有的反應產物無法溶解，減少產率（2)也 會降低產物的純度。 2如果使用太少的氯化鋅，全部的產物將不會被鹽析 出，因而減少產率。如果使用太多的氣化鋅，其會與二應 產物一起沉澱析出形成雜質，降低產物純度。 〜 工作實例 茲提出下列實例係爲説明本發明在這些名詞術語下的實 際2用能夠讓嫻熟此技藝者去製造本發明之新穎化合物並 練習使用此新穎化合物的新診斷方法，其同時來自於本發 明不同的實例巾，並且對嫻熟此技藝者指出實際應用本發 明不同實例時，最近已知的最佳模式。所提出的這些實例 僅在說明而非受限於本發明於後附申請專利範羞 提出之觀點。 義時 實例1 製備過程 此2例係説明製備一批次量染劑產物複合物和從複合產 物中藉HPLC分離出本發明之新穎化合物的正確步驟。 本紙張尺度賴巾目職標準（CNS)A4規格⑵〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-10- 1250157 Α7 Β7 五、發明說明f ) 生料溶液的製備 設備/提供者： A. Ohaus IP15KS 天平 B. AnD HV150KAI 天平 C. Fairbanks H90-5 150 天平 D. OHAUS WB25/1-20W 天平 E. Cole Parmer (51201-30)和 Thermolyne (S25535)攪拌器 F. 採樣裝置，如鋼勺，鼓狀樣品瓶等 G . Erlyenmeyer錐形瓶，燒杯，大玻璃瓶和其他適用的玻 璃器皿 Η.產物溶液標籤 安全性： 根據MSDS指示，當操作化學藥劑時保護設備如手套，安 全玻璃，實驗衣和防毒面具皆應穿戴整齊。 生料溶液製備步驟： 取氫氯酸1364.2克（± 5.5克）加1364.2克（± 5.5克）的 USP純水。攪拌至溶液呈透明。 取含1 6份結晶水的硫酸鋁1779.1克（± 7.0克）加2548.9 克（土 10.0克）的USP純水。攪拌至溶液呈透明。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •ΊΙΤΙ——.——·裝 i — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
取氯化鈉73 84.6克（士 30.0克）加2786.7克（± 11.0克）的 USP純水。攪拌至溶液呈透明。 取重鉻酸鉀2101.9克（土 8.0克）加25203.8克（± 100克） 的USP純水。攪拌至溶液呈透明。 取含5份結晶水的硫代硫酸鈉1526.6克（± 6.0克）加 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1250157 B7__ 五、發明說明f ) 2043.6克（±8.0克）的USP純水。攪拌至溶液呈透明。 取含5份結晶水的硫酸銅509.7克（± 2.0克）加16131克 (土 6.0克）的USP純水。攪拌至溶液呈透明。 取硫酸600.0克（土 2.0克）加600.0克（土 2.0克）的USP純 水。攪拌至溶液呈透明。 取氯化鈉70.4公斤（± 250克）加234.4公斤（± 85〇克）的 USP純水。攪拌至溶液呈透明。 合成 合成設備和提供者： LFE控制平台（3000) 2 0加崙外有包覆内襯玻璃的純化桶附蓋（E71224 ) 2個100加崙外有包覆内襯玻璃的純化桶附蓋（P 1，PT-001) (P2 ， L-13621) FTS循環冷卻器（RC96C〇32)和500加崙冷藏貯存桶（500 CST) 三台 Caframo 混合機（BDC-1850)(R 1，18500961 )(P 1， 18501148)(P2，18501173 )附軸與葉片。 閃電混合機（LIU08)(201550) 三台熱交換機（Gardner Machinery)(Rl，01960763 )(P1， 01960764)(P2 ， 08950727) 三台12千瓦拍打式流體循環器（Watlow，BLC726C3S20) 三台循環馬達（Sta-Rite，JBHD-62S，C48J2EC15) Masterflex數位蠕動馬達（A94002806)
Masterflex蠕動馬達（L95003320) -12_ 氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ •TIITI.---.---裝—— (請先閱讀背面之注音3事項再填寫本頁) 卜訂·
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250157 A7 ___B7_ 五、發明說明（Μ )
Cole Parmer蠕動馬達（B96002074)
Neutsche 過濾組（70-2038，43421-1) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 二台 Buchner 過濾組（Z 1 1，624-6，Z10，441-8)
Siemens 眞空馬達（F2BV2) 60加崙内襯的玻璃收集桶附蓋（86854，E164-1186) 空氣壓縮器（DF412-2 )(95023 12538) 流速控制器（3 _ 5500) (69705069190) 六台批次控制器（3_5600)(#1，69705069191，#2， 69705069199 ， #3 ， 69705069194 ， #4 ， 69705058829 ， #5 ， 69705058805 ， #6 ， 69705069195) 六台流速感應器（#1，69704295165，#2，69704024995， #3 ， 69704024994 ， #4 ， 69704025027 ，#5 ， 69612178606 ， #6 ， 69703120990) 4台隔板馬達（Ml) 4 台波浪抑制器（A301H)(#2，15557，#3，15561，#4， 15558 ， #5 ， 15559) 4台空氣調節器（CFR10) 4台螺旋活瓣（用於空氣調節器） 4台低流速感應器（FS-500) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 三台螺旋活瓣（EASM5V16W20) 空氣過濾器/調節器（TIR)PTFE-F06R113AC 過濾介質，聚丙烯（7211-1) 過濾、介質，Whatman Grade 52 PharMed 管（·18，-82，·90) -13- $張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1250157 A7 B7 11 五、發明說明（） pH測定儀；Hanna 9321 (1303675)和 Orion 620 (001911) 分光光度計20(3MU7202070) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Fisher Scientific 眞空烘箱（9502-033 ) VWR 1370 FM空氣加壓烘箱（ 1370FM)
Dust/Mist防毒面具
Thomas Wiley 實驗用研缽（3375-E10)
Patterson-Kelley 混合器（Blendmaster ; C416578) OHAUS TS4KD 天平 OHAUS IP15KS 天平 Mettler AG 104 天平 AnD HV150KA1 天平 Fairbanks H90-5150 天平 OHAUS AS 123 列印機 OHAUS AS 142 列印機 AD-8121多功能列印機 Citizen iDP 3540點陣式列印機 Hewlett Packard HPLC( 1050) 超音波清潔機（8892-DTH，QCC9601 005C) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Type K Thermocouple 溫度記錄器（KTx，6292753，6355146) Erlenmeyer 錐形瓶（8 L，6L，4L，1L) 燒杯（8L，6L，500 ml，250 ml) 大玻璃瓶（4L，10L，50L) HDPE鼓狀桶（55加崙，100加崙） 定量瓶（100毫升） -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明F ) 塑膠漏斗 Pasture吸管和吸球和定量吸管（1〇 mL，5 mL)和吸球 風箱（25 mL，50 mL) 秤量紙 藥鏟 打包器材（容器’蓋子，標籤） 生料溶液 合成··步驟1. 2 -胺基二5 -二甲基胺苯基硫代橫酸的合成： • 確定USP純水系統應無缺，於反應器中加入稱量的USP 級純水（28,000克± 1〇〇〇克）並以190± 1〇 RPM轉速攪 拌。 • 加入N，N-二甲基_1，4-苯二胺（5.128莫耳，720.0克土 3.0克）。此物質應以粉狀加入（不含結塊）。揽拌i 〇分 鐘（土 5分鐘）。 • 加入氫氣酸（6N，1136.9克土 5.0克），攪摔1 5分鐘（土 5分鐘）。 • 以塑膠採樣裝置取約1 0毫升的反應混合物樣品。確定 p Η 値，p Η 値必須在 2.8 - 3.8 @ 2 5 °C ± 5 °C。 • 加入含1 6份結晶水的硫酸鋁溶液（4328.0克土 21·〇 克）。以275 ± 10 RPM轉速攪拌10分鐘（±5分鐘）。 • 加入氯化鋅溶液（3641.5克土18.0克）。冷卻至4。(：土1 °C。 • 一旦溫度（P VI)到達4 土 1 °C時加入重鉻酸鉀溶液 -15- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 '—訂 _ ·
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明p ) (6532.4克±32.0克）經過20分鐘（土5分鐘），當添加是 必須完全攪拌20分鐘（±5分鐘）。 • 此時溫度保持在1 〇 °C以下，加入含5份結晶水的硫代 硫酸鈉溶液（3570.2克± 18·0克）。在10X：下攪捽溶液 30分鐘（± 5分鐘）。 • 改變設定溫度爲6 0 °C，當溫度（p VI)到達6 0 °C 土 3 · 0 °C 時允許攪拌溶液5分鐘（±3分鐘）並改變LFE控制器之 設定値爲10.0。 • 一旦溫度到達13.0 °C ±2.0 °C，確認pH値，pH値必須 在3.1-4.1@25。(3土5。(^。 合成：步驟2 Indamine硫代續酸的合成 • 稱量鄰-甲苯胺（604.4克土 2.5克）並於冰浴中冷卻至1 8 °〇土3。(：。緩慢地加入氫氯酸（61^，1230.7 土5.0克）至 鄰-甲苯胺中。自冰浴中取出鹽酸鉀-甲苯胺並允許溶 液升溫至3 8 C 土 3 C。將此溶液加入反應混合物中並 攪拌5分鐘（土 3分鐘）。 • 加入重鉻酸鉀水溶液（6532.4克土 32.0克）經過2 〇分鐘 (土 5分鐘）。當添加時必須完全揽摔1〇分鐘（土 5分鐘） • 改變控制器的設定値（SPI)爲60.0，一旦反應混合物的 溫度到達60.0 °C ± 3。(：允許混合物攪拌2 5分鐘（± 5分 鐘），將會形成含有綠色indamine的沉澱。 合成：步驟3 氩化瘦^重鹽的合成： -16- 本紙張尺度適用中ΐϊ家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " ----- 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ訂.
1250157 A7 B7 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • 將LFE控制器設定値設定爲7.0。一旦反應混合物溫度 到達10.0°C ±3°C時加入重鉻酸鉀溶液（6532.4克±32.0 克）經過20分鐘（土 5分鐘），當添加時必須完全攪掉20 分鐘。 • 加入重鉻酸鉀溶液（5225.9克土 26.0克）經過20分鐘（土 5分鐘），當添加時必須完全攪拌20分鐘（±5分鐘） • 加入氯化鋅溶液（3641.5克± 18.0克）。以350 ± 10 RPM 轉速攪掉2 0分鐘（±5分鐘）。 • 加入含5份結晶水的硫酸銅溶液（2122.8克士 10.0克）。 攪拌15分鐘（土 5分鐘）。 • 改變控制器的設定値爲100.0。一旦反應混合物溫度到 達67.0°C±3°C時，開始以整數量（500毫升，250，125 毫升等）加入硫酸溶液至pH爲2.9 土0.3。每次添加完畢 攪掉5至1 〇分鐘後確認p η値。 • 一旦反應混合物溫度到達100.0 °C 土 3 °C允許混合物攪 摔35分鐘土 5分鐘。 • 改變控制器設定値爲35.0當反應混合物溫度到達7 0 °C 土 3 °C時，改變控制器設定値爲2.5。在4小時内冷卻至 2.5°C並保持在2.5°C ± 2.0°C下4至1 8小時。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 純化：步驟1 • 經過適合的過濾介質（Whatman Grade 52 )過濾反應混 合物。 • 當反應器淨空後稱重24.0公斤± 150.0克的30%氯化鈉 溶液並加入24.0公斤土 150.0克的USP純水。關閉反應 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250157
、發明說明$ 器底邵活瓣加入15 %氯化鈉溶液至反應器中。短暫地 攪拌落液。當過濾完成後加入氣化鈉溶液至過濾組中 清洗濾出的塊狀物。 •確任100加崙内襯玻璃外有包覆的純化桶# 1之情況並 確足桶内的乾淨且桶子裝自HDPE蓋子，Cafram0攪掉 器’擅:拌軸，螺旋漿葉和thermocouple探針插入塑膠的 thermocouple孔中。確認底部活瓣是關閉的且洩氣孔已 覆蓋。 •稱重190 〇公斤± 1.0公斤的USP純水至HDPE容器中再 將水移至純化桶1。以350 RPM擾掉，一旦氯化鈉清洗 濾出塊狀物完成，即可將塊狀物加入純化桶1中並加揽 • 攪拌混合物2至4小時。 • 設定純化桶1LFE控制器至75.0(SP1)。 • 當混合物溫度（PV1)到達75.0°C 士 3 °C，改變控制器設 定値爲4 0.0。 • 允許混合物於40°C下以350 RPM攪拌12至36小時。 • 取約50¾升樣品（從底邵活瓣），以1〇毫升吸管量取 1.0¾升樣品置入100毫升定量瓶中稀釋至1〇〇毫升。然 後以1 0·0毫升吸管取10.0毫升此溶液至1〇〇毫升定量瓶 中再稀釋至100毫升，以分光光度計20 +測量此樣品之 吸收光譜。樣品之吸收光譜應爲20.220。 純化：步驟2 • 將混合物通過過濾組的過濾介質，以已扣重之附蓋 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250157 A7 B7 16 五、發明說明 HDPE容器搜集濾液。 •裝備1〇〇加崙内襯破璃外有包覆的純化桶2與蓋子， Caframo攪拌器，攪拌軸，螺旋漿葉和therm〇c〇upie探 針插入塑膠的thermocouple孔中。 •在乾淨的HDPE容器中稱量相當於上面記錄的溶液量以 下列公式計算所得之定量3 〇 %氯化鈉溶液： (落液*升量）（116.91克氯化鈉溶液/ 1〇〇 〇亳升氯化鈉 溶液）=克氣化鈉溶液 •採樣約1 〇毫升的濾液並確認p Η値，p Η値應爲3.〇 _ 4.0。將濾液移至純化桶2，以350 RPM攪掉溶液。 • 加入氯化鋅溶液（ 1636.3克±6.5克）。 • 將氯化鈉溶液（以重量計）移至純化桶2。 • 設定純化桶2的LFE控制器爲75.0(SP 1)。 • 當混合物溫度（P V 1)到達7 5 · 0 °C 土 3 °C，改變控制器設 定値爲5.0。 • 在6小時内冷卻至5 °C，並保持於5 Ό 土 4.0 °C下4至2 4 小時。 力口工過程 ： i.過滤 • 將混合物通過過滤組中已扣重的過滤介質（Whatman Grade 52)進行過濾。 • 稱重1 2公斤土 5 0克的3 0 %氯化鈉溶液並以1 2公斤土 5 0克的USP純水稀釋。以直接將溶液加^入buchner的方 式用1 5 %氯化鈉溶液清洗濾出之塊狀物，當濾液完全 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 171250157 A7 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 小心地移除後濾紙上含有產物。 ii.乾燥 •將純化的複合反應產物置入烘箱中K50(rc±3力^下 乾燥5 ± 1小時。 •從空氣加壓烘箱將複合產物移至眞空烘箱，於45 〇r 土 3.0 C @ 28" Hg ± 2” Hg 下乾燥 i 0 土 2 小時。 i i i.磨粉 •將0·5毫米篩網置入Thomas Wiley實驗用研缽中。連接 一乾淨容器於瀉槽口，房間門須關起並栓上。 •關閉底邵漏斗的滑動遮板，移除漏斗蓋再加入乾燥的 複合產物，蓋上漏斗蓋，打開研缽開關並輕輕打開滑 動遮板，產物緩慢流入研磨室中不要使研磨器慢下來 或變成塞滿。 • 一旦磨粉元成小心地自涛槽口移出容器。 v.混合 •將產物移至Patterson-Kelly Lab混合槽容器中並蓋上蓋 子，設定定時器爲15分鐘土 5分鐘 游離和分離的HPLC步驟 此實例乃描述從乾燥，研磨過並混合過之前述製得的複 合產物中游離並分離出本發明之新穎化合物的適當HpLC步 驟。 A.設備和儀器 1 · HPLC層析法步驟 a· HP1100 HPLC層析系統 τι·τι*ιι — ~" - 裝· - ί . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·
-20- I X 297公釐） 1250157 A7 B7 五、發明說明（18) b· HP1100眞空管序列（Diode-array)偵測器 e. HP1100 4個一組的HPLC馬達 2 ·微量收集和純化 a· ISCO Foxy jr.，10槽微量搜集器 b· Biichi，模組R-124迴轉蒸發器 c · Sep-pak 鉛筒，Cu，Varian 3 · 質譜分析 a· 電子撞擊/質譜儀（EI-MS)
1. MS裝置：VG Analytical ZAB2-SE
2. 來源溫度：200°C
3 .電子伏特：70 eV
4 ·樣品探針：固體探針 5·探針溫度：280°C b·液體層析法/質譜儀（LC-MS) 1. HP11〇〇二個一組的馬達與眞空脱氣
2. 溶劑 A :水：ACN(88 : 12)v/v 含 0.1% TEA
3 ·溶劑 B :水：ACN(1 : l)v/v含0.1% TEA 4 ·升降率：1 8分鐘由0 %溶劑B上升至3 〇 %溶劑 B ; 27分鐘後上升到1〇〇%溶劑b，維持3八 鐘 刀 5 .流速：1.5毫升/分鐘 6·管柱：Water Symmetry C18 管柱 4.6 毫米 χ 25〇 亳米，5微米）
7·管柱溫度：40°C -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
1250157 A7 B7 19 五、發明說明（） 8. 偵測器：可變波長UV，290奈米 9. MS裝置：VGBio_QS倍四倍質譜儀 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 10. 操作法：陽極電子噴霧離子化（ + ESI)法
11. 來源溫度：8 0 °C c. 快速原子撞擊（fab_ms)
1 . M S 裝置：VG Analytical ZAB 2-SE 2. 樣品輸入：絶離子槍 3. 數據系統：VH Analytical 11-250J 與 PDP 11/73 d. 電子噴霧質譜儀（ESI_MS) 1. MS裝置：VGBiotechBio-Q和四倍分析器 2. 操作法：陰極離子指向未熔合 3. 注射量：50_75微升
4. 清洗溶劑：50%ACN水溶液含0.1%FA 5. 流速：1〇微升/分鐘 e. 電子噴霧MS/MS(ESI-MS/MS) 1 . M S裝置：VG Quattro II Bio-Q三倍四倍分析 器 2. 撞擊氣體：氬 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3. 樣品數：50_75微升
4. 清洗溶劑：50% ACN水溶液含0.1% TFA 5. 流速：微升/分鐘 f. 高度變換質譜儀（HR-MS)
1. MS裝置：VG Analytical ZAB2-SE -22- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ' 1250157 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明f ) 2. 樣品輸入：铯離子管 3. 數據系統：VH Analytical 1 1-250J 和 PDP 11/73 4. 核磁共振光譜儀（NMR)
a. 400 MHz Varian Inova NMR 5. X-光繞射單一結晶分析 a . Nonius CAD4，模式586，自動單一結晶繞射儀 b. 銅 X-光管，細焦（λ -1.5418A) c . 任意方向照相裝置，Polaroid模式5 7 · 3 d . EXPRESS數據收集軟體 e . MOLEN數據解説軟體 B.化學藥品，試劑和標準品 1 .化學藥品和試劑 a. 乙腈（ACN)，HPLC 級 b. 甲醇（MeOH)，HPLC 級 c. 氯仿（CHCI3)，HPLC 級 d. 冰醋酸（GAA)，ACS級 e. 氫氯酸（HCI)，ACS級 f. Milli_Q 水 g. 三乙基胺（TEA)，HJPLC級 h. 醋酸銨，AR級 i. 氫氧化鈉（NaOH)丸，試藥級 j. 氮氣，〇級 k. 氘化甲醇，（d4-MeOH) -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裳—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^訂 _
1250157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明θ ) 1· 氘化二甲基亞颯（d6-DMSO) m ·氘化水（D 2 Ο) η·氮化氫氯酸（DCI) 〇·四苯基硼酸鈉，試藥級 化合物微量收集的HPLC系統2起始準備 起始微量收集 水性稀釋劑-製備〇· 1 Μ的醋酸溶液並以NaOH調整至p Η 6·1 土 0.1
移動相Α-8 8 : 12水性稀釋劑：ACN 移動相Β_5 0 : 50水性稀釋劑：ACN 樣品準備：製備15毫克/毫升的乾燥，混合過的複合反應 產物溶於水性稀釋的溶液。溶液以3 〇至4 〇亳升的整數量置 於分離的1 0克C!8 SPE鉛筒中，以約2 0毫升的水性稀釋劑 清洗然後再以約1 〇毫升的水清洗。以約1 〇毫升溶於Me〇H 的0.01 N HCI洗出。將乾淨的樣品置於旋轉式蒸發器上乾 燥再重新溶於水性稀釋液中。 層析系統：一套附管柱加熱器的AP 11〇〇 HPLC系統裝上 一 7微米，30.0公分X 7.8毫米的Cls管柱和偵測波長29〇奈 米的適當UV偵測器和眞空管序列，流速設定爲5 〇毫升/分 鐘和管柱溫度2 0 °C，使用下列升降率之洗出液： 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-24-
1250157 A7 B7 五、發明說明ρ 時間(分). 0 15 15.1 25 25.1 %移動相
A
B 80 60 0 0 80 20 40 100 100 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 琴::咸IT，升的樣品压入層析系統並以多槽微量控制 八參切 一王4的分率收集完全，將每個 分率置於旋轉蒸發器上以移除 夕你文4份的ACN，然後於C i 8 :錯筒中濃縮’以水清洗後再以約5毫升溶KMe〇H的 去丄NHCI洗出。洗出液置於旋轉蒸發器上乾燥後置於一 旁作進一步純化。 最終微量收集 移動相 A-88 : 12 0.1% tea : ACN 移動相 B - 5 0 : 5 0 0· 1% tea : ACN 樣品準備：製備由起始微量收集所得的乾燥部份以移動 相A稀釋之溶液。 層析系、统：一套附管柱加熱器的Ηρ 11〇〇帆〔系統裝上 一 7微米，30.〇公分χ7·8毫米的Ci8管柱和偵測波長29〇奈 米的U V偵測器和眞空管序列，流速設定爲5 〇毫升/分鐘， 而管柱溫度爲3 0 °C，使用下列升降率之洗出液· -25 Μ氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) · 裝 訂ί
-1- 1250157 A7 五、發明說明（23 時間(分Λ 0 8 8.1 9 16 16.1 %移動相 A 73 70.6 45 45 25.5 73 B 27 29.4 55 55 74.5 27 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 步驟：取200微升的樣品主 . 果7王入層析系統並以多槽微量控制 器收集感興趣的波峰，一 H人 ^ 一王部的分率收集完畢，將每個 分率先置於旋轉蒸發器上以移除大部份的ACN，然後於 C i 8 SPE 4。筒中濃縮，以水清洗後再以約$毫升溶於Me〇H 的0:01NHCI洗出。這些部份接著置於乾燥的氣氣氣流下 乾燥並置於一旁作鑑定分析。 化合物IV的性質 分離和游離 化合物IV係使用半恢復性HPLC法游離出來，所收集得 到的部份，其中大部份的則以旋轉蒸發器去除，進而以 C18 SPE鉛筒濃縮，以水清洗後再以約5毫升溶sMe〇H的 0:01 NHCI洗出，此部份接著置於乾燥的氮氣氣流下乾 燥。所得物質的一部份重新溶於移動相中並注入Ηριχ系統 中以測足分率純度。化合物1¥的注入顯示純度約95%且以 NMR測有8.2毫克。 26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卜訂· 1250157 A7 B7 五、發明說明f4 ) 質譜分析 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 磨碎，混合後之複合反應產物的初步L C - M S質譜數據指 出化合物IV的分子量約375.3 m/z。進一步以收集LC-MS 指示分子量爲375· 1655 m/z的部份作HR-MS研究得知化合 物IV分子式爲CmH^ISUSi。化合物IV的375 m/z親源離子之 產物以陽極ESI - M S / M S測試。崩解的式樣顯示從化合物 IV的分子離子中主要失去了 16 amu和44 amu，因此顯示出 化合物IV的結構。此化合物與其N -和N，N _二甲基化衍生 物，化合物V和VI是由親源化合物（TBO)和過量的起始物 質鄰-甲苯胺二級反應所形成。 化合物I的性質 分離和游離 化合物I係使用半恢復性HPLC法游離出來，所收得之部 份其大部份之ACN以旋轉蒸發器去除而進一步以Cl8 SPE 鉛筒濃縮，以水清洗後再以約5毫升溶於MeOH的0.01 N HCI洗出，此部份接著置於乾燥的氮氣氣流中乾燥。所得 物質的一部份重新溶解於移動相中並注入HPLC系統中測定 分率純度。化合物I的注入顯示純度約9 5 %且以NMR測有 18.9毫克。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 質譜分析 乾燥，混合後之複合反應產物的初步L C - M S質譜數據指 出化合物I的分子量約284.1 m/z。進一步以收集LC - Μ S指 示分子量爲284· 1223 m/z的部份作H R - M S研究得知化合物I 分子式爲Ci6H18N3S!。化合物I的284 m/z親源離子之產物以 -27- 玉紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（21G X 297公f ) " 1250157 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明f5 ) 陽極ESI-MS/MS測試。建議的結構和崩解的式樣顯示分子 離子主要失去了 16 amu，30 amu和5 9 amu因此得到化合物 I的結構。化合物I與其N -和N，N -二甲基化衍生物，化合物 II和11是從對應親源TBO異構物對其他去甲基分子的甲基 自由基清除時所形成。 化合物11，III，V和VI之分離和定性步驟描述如上之化 合物VI和I之分離和特性。 實例2 臨床測試步驟 臨床測試溶浚之蟄備 此實例係説明使用每一槽實例1之產物於鑑定口腔發育不 良的方法。 化合物I，覆盆莓風味劑（IFF Raspberry IC563457)，三水 醋酸鈉緩衝劑和H2O2(30% USP)防腐劑（見美國專利第 5,372,801號）溶於純水（USP)，冷醋酸和SD 18乙基乙醇中 製成測試溶液，組成如表A所示：
表A 成份 重量％ 化合物I 1.00 香精 .20 緩衝劑 2.45 防腐劑 .41 醋酸 4.61 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — —----------·裝------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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五、發明說明P 乙基乙醇 水 7.48 83.85 100.00 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備含1重量百分比的醋酸於純水中，苯曱酸鈉防腐劑和 覆盆子香精的測試前洗淨和後洗淨溶液。 臨床步骤 受試者披上圍巾以防止衣服沾染染劑，預料需要吐出廢 液’所以給每位受試者一個1 0 - 〇 z的杯子，此杯子可在丢 棄在感染性廢物收集器中或者將内容物直接倒到丨亏水槽排 水管中以避免將污水槽染色，環境表面或物品從受試區域 移開或披掛時可能會被染色。 進行此一可見的口腔癌症測試不須要使用任何可能引起 割痕的設備或切下軟組織的設備，記下染色前軟組織和牙 齒的樣子。 受試者以約1 5亳升的前洗淨液清洗口腔約2 〇秒後吐出， 去除過多的唾液並提供前後一致的口腔環境，然後以新的 前洗淨溶液重覆一次。 受試者接著以水洗淨並嗽口 2 0移後吐出。 再接著受試者以3 0毫升測試液清洗並嗽口 1分鐘後吐 出0 接著受試者以丨5毫升後洗淨液洗淨2 0移後吐出，重覆此 步驟。 再接著受試者以水洗淨並嗷口 2 0移後吐出重覆此步驟。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1250157 A7 B7 27 五、發明說明（ 觀察處理後的口腔，以適當的軟組織檢查技術，包括縮 合，如果需要的活加強照明和放大。疑爲損傷的區域，大 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 小、形態、顏色和表面特徵保有藍色可加以檢查和記錄。 爲了減少僞陽性的狀況，受試者應在丨〇 〖4天後回診重 覆上述步驟，這段時間允許所有潰瘍或外傷或於第一次試 驗時的過敏復原。第一次試驗偵測得到的懷疑區域在第二 次試驗後呈陽性即考慮指向癌或癌前組織並作活體切片以 確認此結果。 早期的紅斑瘤的傷口染上藍色，常常是以點狀或斑紋 狀。然而，正常的染色也會留下不規則的乳頭狀裂缝在舌 頭的背部，這不是陽性反應，其他區域可能會殘留藍色染 劑，但是不考慮爲陽性，&括齒斑，#顆牙嵩的齒銀邊， 軟顎的擴散染色因爲是從舌頭背面的染劑殘留轉移所致， 和容易區別出的潰療。在所有實例中，高度懷疑的損傷但 未本試驗染出陽性反應者，依然急需進行活體組織切片檢 查。 實例3 - 7 重覆上述步驟，除了以化合物π，ΠΙ，Ιν，#νι取代 化合物I之外，亦可獲得相似的結果。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明以這些名詞術語進行敘述爲了能讓嫻熟此 解並練習它同時亦提出現行最佳的作法。 ·、 -30-
Claims (1)
- I25(y〇§^〇3482號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年7月) 7.8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 1. 一種具有下列結構式的化合物，λη2 2. —種具有下列結構式的化合物，3. —種具有下列結構式的化合物， 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1250157 申請專利範圍 H2N^本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）
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