KR100641972B1

KR100641972B1 - 생체내 염료 화합물 및 이형성 조직을 확인하는데사용하는 방법

Info

Publication number: KR100641972B1
Application number: KR1020017012461A
Authority: KR
Inventors: 더글라스 디. 버케트
Original assignee: 자일러 바이오테크놀로지, 인크.
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2006-11-02
Also published as: CN1219515C; TWI250157B; NO20014720D0; SK13782001A3; BR0009427A; AU3695600A; EA200101028A1; DE60022487T2; EP1165087A4; WO2001054696A1; ES2248061T3; MXPA01009797A; DE60022487D1; PL349999A1; EP1165087A1; ATE303810T1; HUP0201634A2; KR20010108431A; CZ20013504A3; EP1165087B1

Abstract

화학식 (A)를 가진 화합물(여기서, X는 수소, 메틸, 또는 Y이고; Y는 -NH-R 또는 수소이며; R은 메틸 또는 화학식 (B)이다)은 이형성 조직을 검출하기 위한 생체내 염료로서 유용하다.

Description

생체내 염료 화합물 및 이형성 조직을 확인하는데 사용하는 방법 {IN VIVO STAIN COMPOUNDS AND METHODS OF USE TO IDENTIFY DYSPLASTIC TISSUE}

본 발명은 사람 생체내에서 국소 적용에 유용한 신규의 생물학적 염료 화합물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 의심되는 이형성, 즉 비정상 조직을 확인하기 위하여 상기 신규의 화합물을 생체내에서 사용하는 방법에 관한 것이다.

다른 추가의 측면에서, 본 발명은 신규의 화합물, 및 의심되는 이형성 구강 조직, 특히 암성(cancerous) 및 전암성(precancerous) 조직을 검출하기에 특히 적합한, 상기 화합물을 사용한 생체내 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다양한 구현예 및 이들의 실시는 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 신규의 화합물을 합성하는 공정을 도시하는 공정 흐름도이다.

발명의 배경

대부분의 상피성 병변은 외상으로부터 기인한다. 그러나, 다른 병변들은 이형성 종양이며, 이들중 일부는 양성일 수 있으나, 일부는 암성 또는 전암성일 수 있다. 또한, 많은 이형성 병변은 크기가 작아 임상의에 의한 통상적인 시각 검사시 놓치기 쉽고, 구강과 같은 체강내에 있는 것들이 특히 그러하다.

의심되는 이형성 조직을 확인하고 식별하는 생체내 진단 검사는 공지되어 있다. 암성 및 전암성 조직을 선택적으로 염색하는 생체내 염료로서 톨루이딘 블루 O(톨로늄 클로라이드)를 사용하는 이러한 스크리닝 검사는 매쉬버그(Mashberg)의 미국 특허 제 4,321,251호 및 터치(Tucci) 등의 미국 특허 제 5,372,801호에 일반적으로 기재되어 있다. 매쉬버그의 프로토콜에 의해 의심되는 병변이 확인되면, 정규의 생검 샘플을 취해 조직 검사를 수행하여, 병변이 악성 또는 전암성인지 여부를 확인한다. 적당한 양 및 농도로 사전혼합된 염료 및 헹굼 용액을 함유하는, 이러한 검사를 수행하기 위한 키트는 자일러, 인코포레이티드(Zila, Inc.)에게 특허되어 오라스크린(ORASCREEN^®) 및 오라테스트(ORATEST^®)라는 상표명으로 여러 국가에서 시판되고 있다.

발명의 간단한 설명

본 발명자는 이제 이형성 조직을 선택적으로 염색하고 식별하는 생체내 생물학적 염료로서 유용한 신규의 화합물을 발견하였다. 이들 화합물은 하기 화학식을 가진다:

상기 식에서,

X는 수소, 메틸, 또는 Y이고;

Y는 -NH-R 또는 수소이며;

R은 메틸 또는

이다.

예를 들어, 이들 화합물은 하기 화학식의 화합물을 포함한다:

(I)

(II)

(III)

(IV)

(V)

(VI)

제조 방법의 간단한 설명

본 발명의 화합물은 1889년 11월 30일자로 댄드라이커(Dandliker) 등에게 허여된 미국 특허 제 418,055호에 기재된 톨루이딘 블루 O("TBO")의 제조 방법과 유사한 방법(예외 사항은 하기에 언급)에 의해 합성된다. 댄드라이커 합성법은 일련의 3개의 산화 단계로 되어 있다: (1) N,N-디메틸-p-페닐렌디아민을, 예를 들어 중크롬산 칼륨으로 산화시켜 2-아미노-5-디메틸아미노페닐티오설폰산을 형성하는 단계; (2) 상기 티오설폰산을 O-톨루이딘과 축합시켜, 상응하는 인다민-티오설폰산을 형성하는 단계; 및 (3) 상기 인다민-티오설폰산을, 예를 들어 착물화제의 존재하에 비등점에서 약 30분간 폐환시켜, 톨루이딘 블루 O를 형성하는 단계. 그 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 폐환 반응 착체의 반응 생성물을 염석(salting out)시킨다. 착체의 정제는 재용해 및 재침전을 반복함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 화합물을 제조하는 공정은, 착물화제를 세 번째 산화 단계 이전에, 바람직하게는 첫 번째 산화 단계 동안 첨가하고, 본 발명의 신규의 생성물을 침전된 착체로부터 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리 및 분리한다는 점에서, 댄드라이커 합성법과 상이하다.

상피암을 검출하기 위한 생성물의 사용 방법에 대한 간단한 설명

본 발명의 신규의 화합물은 톨루이딘 블루 O 대신에 사용된다는 점을 제외하고는, 매쉬버그 프로토콜에 따라 사용되어 이형성 상피 조직을 선택적으로 염색한다. 따라서, 본 발명은 사람의 생체내에서 이형성 조직을 검출하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 사람의 상피 조직에 상기 신규의 화합물들중 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 생성물을 제조하는 제조 방법의 상세한 설명

도 1은 본 발명의 신규의 화합물을 제조하는 공정을 도시하는 공정 흐름도이다.

합성의 출발 물질(10)은 시판되는 고순도의 N,N-디메틸-a-페닐렌디아민이다.

제 1 반응 혼합물의 형성

출발 물질(10)의 수용액을, 바람직하게는 10℃ 미만, 특히 약 5℃ 미만에서 산, 황산 알루미늄, 및 시약(13)(상기 시약은 중간체(들)를 착물화시키는 것으로 믿어지며 반응 생성물 성분을 착물화하기 위하여 공정의 보다 후속 단계에서 사용됨, 예를 들어 염화 아연)의 존재하에 적당한 산화제(12), 예를 들어 중크롬산 칼륨(12)과 반응시켜 산화시킨다(11). 그 후, 티오황산염 이온원(14), 예를 들어 티오황산 나트륨을 첨가하여 제 1 중간체인 2-아미노-5-디메틸아미노페닐 티오설폰산을 함유하는 제 1 반응 혼합물(15)를 형성시킨다.

제 2 반응 혼합물의 형성

그 후, 제 1 반응 혼합물(15)를, 축합 단계(18)에서, 바람직하게는 약 10℃ 이하의 온도에서, 추가의 산화제(16), 예를 들어 중크롬산 칼륨과, o-톨루이딘 히드로클로라이드(17)와 추가로 반응시켜 제 2 반응 혼합물(19)중에 제 2 중간체이며 축합 생성물인 인다민 티오설폰산을 형성시킨다.

제 3 반응 혼합물의 형성

그 후, 제 2 반응 혼합물(19)를, 약 10℃ 이하의 온도에서, 바람직하게는 적당한 산화제(22), 예를 들어 중크롬산 칼륨의 첨가에 의해 추가로 산화시킨다. 그 후에, 황산 구리, 염화 아연 착물화제, 산을 첨가하고 100℃로 가열하여 인다민 고리를 폐환시켜 제 3 반응 혼합물(24)중에 최종 반응 생성물을 형성시킨다. 이 때, 반응 생성물을 제 3 반응 혼합물로부터 분리하여 정제시킨다.

제 3 반응 생성물의 분리/정제

예를 들어, 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 반응 생성물을 적당한 착물화제(25), 예를 들어 염화 아연으로 착물화(24)시킴으로써 제 3 반응 혼합물로부터 침전시켜 착체인 염화 아연 복염(double salt)을 형성시킨다. 침전물을 액체상으로부터 여과시키고(26) 염화 나트륨 용액(27)으로 세척시킨다. 그 후, 세척된 여과 케이크를 임계¹ 부피의 물(29)에 재용해시켜(28) 반응 생성물 용액(30)을 형성시킨 후, 여과하여(31) 용해되지 않은 고형물(32a)을 제거하여 폐기한다. 그 후, 염화 아연, 이어서 임계² 부피/농도의 염화 나트륨(33)을 여액(32)에 첨가하여 염화 아연 복염을 재침전시킨다.

¹ 너무 다량의 물을 사용하면, 반응 생성물의 단리가 저해된다. 너무 소량의 물을 사용하면, (1) 반응 생성물이 전부 용해되지 않아 수율이 감소되고, (2) 생성물의 순도가 감소된다.

² 너무 소량의 염화 나트륨을 사용하면, 생성물이 전부 염석되지 않아 수율이 감소된다. 너무 다량의 염화 나트륨을 사용하면, 불순물이 반응 생성물과 함께 침전되어 생성물의 순도가 감소된다.

복염 생성물을 여과에 의해 혼합물로부터 분리하여 여과 케이크(34)를 수득한다. 점선(35)에 의해 표시한 바와 같이, 여과 케이크(34)를 수회 재용해, 여과, 재침전 및 재단리시켜 목적하는 순도 및 수율의 복염 착체 반응 생성물을 수득할 수 있다. 그 후, 최종 정제된 여과 케이크 착체 생성물(34)를 물에 용해시키고 본 발명의 신규 화합물을 하기에 기재된 HPLC 방법에 의해 단리 및 분리시킨다.

실시예

하기 실시예는 당업자가 본 발명의 다양한 구현예를 이루는 본 발명의 신규 화합물의 제조 및 이러한 신규 화합물을 사용한 신규의 진단 방법을 실시할 수 있도록 본 발명의 실시를 예시하고, 본 발명의 다양한 구현예를 실시하기 위한 현재 공지된 최선의 방식을 당업자에게 제시하기 위하여 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시적으로 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 정의된다.

실시예 1

제조 방법

본 실시예는 염료 생성물 착체의 배치(batch)를 제조하고 HPLC에 의해 착체 생성물로부터 본 발명의 신규 화합물을 분리하는 정확한 방법을 예시한다.

원료 용액의 제조

장치/준비물:

A. 오하우스 IP15KS 밸런스(Ohaus IP15KS Balance)

B. 앤드 HV150KAI 밸런스(AnD HV150KAI Balance)

C. 페어뱅크스 H90-5150 밸런스(Fairbanks H90-5150 Balance)

D. 오하우스 WB25/1-20W 밸런스(OHAUS WB25/1-20W Balance)

E. 콜 파머(Cole Parmer) (51201-30) 및 써모라인(Thermolyne) (S25535) 교반기

F. 샘플링 장치, 예를 들어 스틸 스쿠프(scoop), 드럼 샘플러 등

G. 엘렌마이어 플라스크, 비이커, 카보이(carboy), 및 기타 적당한 유리제품

H. 제조 용액 라벨

안전성:

MSDA 가이드라인에 따라 화학물질을 취급할 때에는 보호 장치, 예를 들어 장갑, 안전 안경, 실험복, 및 레스피레이터(respirator)를 착용하여야 한다.

원료 용액 제조 과정:

염산 1364.2g(±5.5g)에 USP 정제수 1364.2g(±5.5g)을 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반시킨다.

황산 알루미늄 헥사데카히드레이트 1779.1g(±7.0g)에 USP 정제수 2548.9g(±10.0g)을 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

염화 아연 7384.6(±30.0g)에 USP 정제수 2786.7g(±11.0g)을 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

중크롬산 칼륨 2101.9g(±8.0g)에 USP 정제수 25203.8g(±100g)을 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

티오황산 나트륨 오수화물 1526.6g(±6.0g)에 USP 정제수 2043.6g(±8.0g)을 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

황산 구리 오수화물 509.7g(±2.0g)에 USP 정제수 1613.1g(±6.0g)를 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

황산 600.0g(±2.0g)에 USP 정제수 600.0g(±2.0g)를 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

염화 나트륨 70.4kg(±250g)에 USP 정제수 234.4kg(±850g)를 첨가한다. 용액이 투명해질 때까지 교반한다.

합성

합성 장치 및 준비물:

LFE 조절 패널(LFE Control Panel) (3000)

뚜껑있는 20갤론의 재킷팅되고 유리 라이닝된 정제 탱크 (E71224)

뚜껑있는 2개의 100갤론의 재킷팅되고 유리 라이닝된 정제 탱크 (P1, PT-001) (P2, L-13621)

FTS 재순환 냉각기 (RC96C032) 및 500갤론 냉각 저장 탱크 (500CST)

샤프트(shaft) 및 임펠러(impeller)를 가진 3개의 카프라모(Caframo) 혼합기 (BDC-1850) (R1, 18500961) (P1, 18501148) (P2, 18501173)

라이트닝 혼합기(Lightning Mixer) (L1U08) (201550)

3개의 열교환기(가드너 머시너리(Gardner Machinery) (R1, 01960763) (P1, 01960764) (P2, 08950727)

3개의 12KW 재킷 유체 재순환기(왓로(Watlow), BLC726C3S20)

3개의 재순환 펌프(스타-라이트(Sta-Rite), JBHD-62S, C48J2EC15)

마스터플렉스 디지털 연동 펌프(Masterflex Digital Peristaltic Pump) (A94002806)

마스터플렉스 연동 펌프(Masterflex Peristaltic Pump) (L95003320)

콜 파머 연동 펌프(Cole Parmer Peristaltic Pump) (B96002074)

뉴트스체 여과 유닛(Neutsche Filtration unit) (70-2038, 43421-1)

2개의 부흐너 여과 유닛(Buchner Filtration Unit) (Z11, 624-6, Z10, 441-8)

지멘스(Siemens) 진공 펌프 (F2BV2)

뚜껑있는 60갤론 유리 라이닝된 수집 탱크 (86854, E164-1186)

공기 압축기 (DF412-2) (9502312538)

흐름 조절기 (3-5500) (69705069190)

6개의 배치 조절기 (3-5600) (#1, 69705069191, #2, 69705069199, #3, 69705069194, #4, 69705058829, #5, 69705058805, #6, 69705069195)

6개의 흐름 센서(Flow Sensor) (#1, 69704295165, #2, 69704024995, #3, 69704024994, #4, 69704025027, #5, 69612178606, #6, 69703120990)

4개의 다이아프램 펌프(Diaphragm Pump) (M1)

4개의 써지 억제기(Surge Supresser) (A301H) (#2, 15557, #3, 15561, #4, 15558, #5, 15559)

4개의 공기 조절기 (CFR10)

4개의 솔레노이드 밸브 (공기 조절기와 함께 사용)

4개의 저흐름 센서 (FS-500)

3개의 솔레노이드 밸브 (EASM5V16W20)

공기 필터/조절기 (T1R)PTFE/F06R113AC

필터 매질, 폴리프로필렌 (7211-1)

필터 매질, 왓트만 등급(Whatman Grade) 52

파메드 튜빙(Pharmed tubing) (-18, -82, -90)

pH 미터; 한나(Hanna) 9321 (1303675) & 오라이언(Orion) 620 (001911)

분광광도계 20 (3MU7202070)

피셔 사이언티픽 진공 오븐 (Fisher Scientific Vacuum Oven) (9502-033)

VWR 1370 FM 강제 공기 오븐 (1370FM)

분진/미스트 레스피레이터

토마스 와일리 래보라토리 밀(Thomas Wiley Laboratory Mill) (3375-E10)

패터슨-켈리 블렌더(Patterson-Kelley Blender)(블렌드마스터(Blendmaster), C416578)

오하우스 TS4KD 밸런스 (OHAUS TS4KD Balance)

오하우스 IP15KS 밸런스 (OHAUS IP15KS Balance)

메틀러 AG 104 밸런스 (Mettler AG 104 Balance)

앤드 HV150KA1 밸런스 (AnD HV150KA1 Balance)

페어뱅크스 H90-5150 밸런스 (Fairbanks H90-5150 Balance)

오하우스 AS123 프린터 (OHAUS AS123 Printer)

오하우스 AS142 프린터 (OHAUS AS142 Printer)

AD-8121 다기능 프린터

시티즌 iDP 3540 도트 매트릭스 프린터

휴렛 팩커드 HPLC (1050)

초음파 세정기 (8892-DTH, QCC9601 005C)

타입 K 열전쌍 온도 기록기 (KTx, 6292753, 6355146)

엘렌마이어 플라스크 (8L, 6L, 4L, 1L)

비이커(8L, 6L, 500mL, 250mL)

카보이(4L, 10L, 50L)

HDPE 드럼 (55갤론, 100갤론)

부피 플라스크(100mL)

플라스틱 펀넬

파스퇴르 피펫 & 벌브 및 부피 피펫(10mL. 5mL) & 벌브

벨로우(Bellow) (25mL, 50mL)

검량 페이퍼(Weigh paper)

주걱(Spatula)

포장재(용기, 뚜껑, 라벨)

원료 용액

합성: 단계 1

2-아미노-5-디메틸아미노페닐 티오설폰산의 합성:

USP 수계의 완전성을 점검한다. 반응기에 계량한 USP 등급 정제수(28,000g ±100.0g)을 첨가하고 190 ±10RPM으로 교반시킨다.

N,N-디메틸-1,4-페닐렌디아민(5.128몰, 720.0g ±3.0g)을 첨가한다. 재료는 분말(덩어리가 아닌)로서 첨가하여야 한다. 10분(±5분)간 교반시킨다.

염산(6N, 1136.9g ±5.0g)을 첨가한다. 15분(±5분)간 교반시킨다.

플라스틱 샘플링 장치를 사용하여 약 10mL의 반응 혼합물 샘플을 취한다. pH를 점검한다. pH는 25℃ ±5℃에서 2.8 내지 3.8이어야 한다.

황산 알루미늄 헥사데카히드레이트 용액(4328.0g ±21.0g)을 첨가한다. 275±10RPM에서 10분(±5분) 동안 교반한다.

염화 아연 용액(3641.5g ±18.0g)을 첨가한다. 4℃ ±1℃로 냉각한다.

온도(PV1)가 4℃ ±1℃로 되면, 중크롬산 칼륨 용액(6532.4g ±32.0g)을 20분(±5분)의 기간에 걸쳐 첨가한다. 첨가 완료시, 20분(±5분) 교반한다.

온도를 약 10℃ 미만으로 유지하면서, 티오황산 나트륨 오수화물 용액 (3570.2g ±18.0g)을 첨가한다. 용액을 10℃에서 30분(±5분) 동안 교반한다.

설정점을 60℃로 변경한다. 온도(PV1)가 60.0℃ ±3.0℃에 도달할 때, 반응 혼합물을 5분(±3분) 동안 교반시키고 LFE 조절기 상에서 설정점을 10.0로 변경시킨다.

온도가 13.0℃ ±2.0℃에 도달하면, pH를 점검한다. pH는 25℃ ±5℃에서 3.1 내지 4.1이어야 한다.

합성: 단계 2

인다민 티오설폰산의 합성

o-톨루이딘(604.4g ±2.5g)을 칭량하고 빙욕에서 18℃ ±3℃로 냉각한다. 염산(6N, 1230.7g ±5.0g)을 o-톨루이딘에 서서히 첨가한다. 빙욕으로부터 o-톨루이딘 히드로클로라이드를 제거하고 용액을 38℃ ±3℃로 냉각시킨다. 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 5분(±3분) 동안 교반한다.

중크롬산 칼륨 용액(6532.4g ±32.0g)을 20분(±5분)의 기간에 걸쳐서 첨가한다. 첨가 완료시, 10분(±5분) 동안 교반한다.

조절기 설정점(SP1)을 60.0으로 변경한다. 반응 혼합물 온도가 60.0℃ ±3℃에 도달하면, 혼합물을 25분(±5분) 동안 교반시킨다. 녹색의 인다민으로 구성된 침전물이 형성된다.

합성: 단계 3

염화 아연 복염의 합성:

LFE 조절기 설정점을 7.0으로 설정한다. 반응 혼합물 온도가 10.0℃ ±3℃에 도달하면, 중크롬산 칼륨 용액(6532.4g ±32.0g)을 20분(±5분)의 기간에 걸쳐서 첨가한다. 첨가 완료시, 20분(±5분) 동안 교반한다.

중크롬산 칼륨 용액(5225.9g ±26.0g)을 20분(±5분)의 기간에 걸쳐서 첨가한다. 첨가 완료시, 20분(±5분) 동안 교반한다.

염화 아연 용액(3641.5g ±18.0g)을 첨가한다. 350 ±10RPM에서 20분(±5분) 동안 교반한다.

황산 구리 오수화물(2122.8g ±10.0g)을 첨가한다. 15분(±5분) 동안 교반한다.

조절기 설정점(SP1)을 100.0으로 변경한다. 반응 혼합물 온도가 67.0℃ ±3℃에 도달하면 황산 용액을 분취량(500mL. 250, 125mL, 등)으로 첨가하기 시작하여, pH가 2.9 ±0.3이 되게 한다. 각 첨가 후에, 5 내지 10분간 교반하고 pH를 점검한다.

반응 혼합물 온도가 100.0℃ ±3℃에 도달하면, 혼합물을 35 ±5분 교반시킨다.

조절기 설정점(SP1)을 35.0으로 변경한다. 반응 혼합물 온도가 70.0℃ ±3℃에 도달하면, 조절기 설정점(SP1)을 2.5로 변경한다. 4시간 내에 2.5℃로 냉각시키고, 4 내지 18시간 동안 2.5 ℃±2.0℃로 유지시킨다.

정제: 단계 1

반응 혼합물을 적당한 필터 매질(왓트만 등급 52)을 통해 여과시킨다.

반응기가 비워지면, 30% NaCl 용액 24.0kg ±150.0g을 계량하고 USP 물 24.0kg ±150.0g을 첨가한다. 반응기 바닥 밸브를 폐쇄하고 반응기에 15% NaCl 용액을 첨가한다. 용액을 잠시 교반한다. 여과 완료시, 여과 유닛에 NaCl 용액을 첨가하여 여과 케이크를 헹군다.

100갤론의 유리 라이닝되고 재킷팅된 정제 탱크 #1 상태를 점검하고 탱크가 깨끗한지 확인하고 탱크에 HDPE 뚜껑, 카프라모 교반기, 교반 샤프트, 프로펠러 및 플라스틱 열전쌍 웰에 삽입된 열전쌍 프로브을 장착한다. 바닥 밸브가 잠겨 있는지 출구가 캡핑되어 있는 지를 점검한다.

USP 물 190.0kg ±1.0kg을 HDPE 용기내로 계량해 넣고, 물을 정제 탱크 1에 옮긴다. 혼합물을 350RPM으로 교반한다. 여과 케이크의 NaCl 세척이 완료되면, 여과 케이크를 교반하면서 정제 탱크 1에 첨가한다.

혼합물을 2 내지 4시간 교반한다.

정제 탱크 1 LFE 조절기를 75.0(SP1)으로 설정한다.

혼합물 온도(PV1)가 75.0℃ ±3℃에 도달하면, 조절기 설정점을 40.0으로 변경한다.

혼합물을 40℃ 및 350RPM에서 12 내지 36시간 동안 교반시킨다.

샘플을 약 50mL 취한다(바닥 밸브를 통해). 샘플 1.0mL를 1.0mL 피펫으로 계량하고 100mL 부피 플라스크에서 100mL로 희석시킨다. 그 후에, 10.0mL 피펫으로 이 용액 10.0mL를 취하여 100mL 부피 플라스크에서 100mL로 희석시킨다. 이 샘플의 흡광도를 스펙트로닉 20+를 사용하여 측정한다. 샘플의 흡광도는 ≥0.220이 어야 한다.

정제: 단계 2

혼합물을 여과 유닛에서 필터 매질을 통해 여과시킨다. 여액을 뚜껑있는 계량식 HDPE 용기(tared HDPE container)내로 수집한다.

100갤론의 유리 라이닝되고 재킷팅된 정제 탱크 2에 뚜껑, 카프라모 교반기, 교반 샤프트, 프로펠러, 및 플라스틱 열전쌍 웰에 삽입된 열전쌍 프로브를 장착한다.

깨끗한 HDPE 용기내로 하기 식을 사용하여 상기 기록된 용액 부피와 동일한 양의 30% NaCl 용액을 칭량한다:

(용액 mL)(NaCl 용액 116.91g/NaCl 용액 100.0mL) = NaCl 용액 g

여액 약 10mL를 샘플링하고, pH를 점검한다. pH는 3.0 내지 4.0이어야 한다. 여액을 정제 탱크 2에 옮긴다. 용액을 350RPM으로 교반한다.

염화 아연 용액(1636.3kg ±6.5g)을 첨가한다.

NaCl 용액(중량)을 정제 탱크 2에 옮긴다.

정제 탱크 2 LFE 조절기를 75.0(SP1)으로 설정한다.

혼합물 온도(PV1)가 75.0℃ ±3℃에 도달하면, 조절기상의 설정점을 5.0으로 변경한다.

6시간 내에 5℃로 냉각하고, 4 내지 24시간 동안 5℃±4.0℃로 유지시킨다.

공정:

i. 여과

여과 유닛에서 계량식 여과 매질(tared filtration media)(왓트만 등급 52)을 통해 혼합물을 여과한다.

30% 염화 나트륨 용액 12kg ±50g을 칭량하고 USP 물 12kg ±50g으로 희석시킨다. 15% 염화 나트륨 용액을 부흐너에 직접 첨가함으로써 여과 케이크를 세척한다. 여과 완료시 생성물을 함유하는 여과지를 조심스럽게 분리한다.

ii. 건조

정제된 착체 반응 생성물을 오븐에 넣고 5 ±1시간 동안 50.0℃ ±3.0℃에서 건조시킨다.

착체 생성물을 강제 공기 오븐에서 분리하여 진공 오븐에 넣는다. 10 ±2시간 동안 45.0℃ ±3.0℃ 및 28"Hg ±2"Hg에서 건조시킨다.

iii. 분쇄(grind)

토마스 와일리 래보라토리 밀에 0.5mm 스크린을 설치한다. 전달 슈트 (delivery chute)에 깨끗한 용기를 부착한다. 챔버 도어를 닫고 걸쇠를 걸어야 한다.

호퍼 바닥의 슬라이딩 셔터를 폐쇄하고, 호퍼 뚜껑을 벗기고 건조된 착체 생성물을 첨가한다. 호퍼 뚜껑을 교체한다. 밀을 작동시키고 슬라이딩 셔터를 약간 개방시킨다. 밀이 속도가 떨어지거나 막히지 않도록, 생성물을 밀 챔버에 서서히 공급한다.

분쇄가 완료되면, 전달 슈트로부터 용기를 조심스럽게 분리한다.

v. 블렌딩

생성물을 패터슨-켈리 랩 블렌더 용기로 옮기고 뚜껑을 닫는다. 타이머를 15분 ±5분으로 설정한다.

단리 및 분리를 위한 HPLC법

본 실시예는 본 발명의 신규 화합물을 상기와 같이 제조된 건조되고 분해되고 블렌딩된 착체 생성물로부터 단리 및 분리하기 위한 적당한 HPLC법을 기술한다.

A. 기계 및 장치

1. HPLC 크로마토그래피법

a. HP1100 크로마토그래피 시스템

b. HP1100 다이오드-어레이 검출기

c. HP1100 쿼터너리 HPLC 펌프(Quaternary HPLC pump)

2. 분획 수집 및 정제

a. ISCO 폭시 주니어(Foxy Jr.), 10채널 분획 수집기

b. 뵈치(Buechi), 모델 R-124 회전 증발기

c. 셉-팩 카트리지(Sep-pak catridge), C₁₈, 베리언(Varian)

3. 질량 스펙트럼 분석

a. 전자 충격/질량 분광법(EI-MS)

1. MS 기계: VG 분석 ZAB 2-SE

2. 소스(Source) 온도: 200℃

3. 전자 전압: 70eV

4. 샘플 프로브: 고체 프로브

5. 프로브 온도: 280℃

b. 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC-MS)

1. 진공 탈기장치를 가진 HP1100 바이너리 펌프(binary pump)

2. 용매 A: 0.1% TEA를 함유하는 물:ACN(88:12) v/v

3. 용매 B: 0.1% TEA를 함유하는 물:ACN(1:1) v/v

4. 구배: 0% 용매 B를 18분내에 30% 용매 B로 상승시키고; 27분 후에 100% 용매 B로 상승시키고, 3분간 유지함

5. 유량: 1.5mL/분

6. 칼럼: 수대칭(water symmetry) C₁₈ 칼럼 4.6mm X 250mm, 5㎛

7. 칼럼 온도: 40℃

8. 검출기: 가변 파장 UV, 290nm

9. MS 기계: VG 바이오-Q 트리플 사중극 질량 분광계

10. 작동 방식: 포지티브 전기분무 이온화(+ESI) 방식

11. 소스 온도: 80℃

c. 고속 원자 충돌(Fast Atom Bombardment)(FAB-MS)

1. MS 기계: VG 분석 ZAB 2-SE

2. 샘플 투입: 세슘 이온총

3. 데이타 시스템: PDP 11/73을 가진 VH 분석 11-250J

d. 전기분무 질량 분광계 (ESI-MS)

1. MS 기계: 사중극 분석기를 가진 VG 바이오텍 바이오-Q

2. 작동 방식: 네가티브 이온 직접 언퓨전 (unfusion)

3. 주입 부피: 50 내지 75㎕

4. 용리 용매: 0.1% FA를 함유하는 50% 수성 ACN

5. 유량: 10㎕/분

e. 전기분무 MS/MS (ESI-MS/MS)

1. MS 기계: VG 쿼트로(Quattro) II 바이오-Q 트리플 사중극 분석기

2. 충돌 기체: 아르곤

3. 샘플 분취량: 50 내지 75㎕

4. 용리 용매: 0.1% TFA를 함유하는 50% 수성 ACN

5. 유량: 10㎕/분

f. 고분해능 질량 분광계 (HR-MS)

1. MS 기계: VG 분석 ZAB 2-SE

2. 샘플 투입: 세슘 이온총

3. 데이타 시스템: PDP 11/73을 가진 VH 분석 11-250J

4. 핵자기공명 분광법(NMR)

a. 400MHz 베리언 이노바(Varian Inova) NMR

5. X-선 회절 단일 결정 분석

a. 노니어스(Nonius) CAD4, 모델 586, 자동 단일 결정 회절계

b. Cu X-선 튜브, 미세 촛점, (λ=1.5418Å)

c. 랜덤 배향 사진 부착물(random orientation photographic attachment) 폴라로이드, 모델 57-3

d. 익스프레스(EXPRESS) 데이타 수집 소프트웨어

e. 몰렌(MOLEN) 데이타 해석 소프트웨어

B. 화학약품, 시약, 및 표준품

1. 화학약품 및 시약

a. 아세토니트릴(ACN), HPLC 등급

b. 메탄올(MeOH), HPLC 등급

c. 클로로포름(CHCl₃), HPLC 등급

d. 빙초산(GAA), ACS 등급

e. 염산(HCl), ACS 등급

f. 밀리-큐 수 (Milli-Q water)

g. 트리에틸아민(TEA), HJPLC 등급

h. 아세트산 암모늄, AR 등급

i. 수산화 나트륨(NaOH) 펠릿, 시약 등급

j. 질소 기체, 0 등급(zero grade)

k. 메탄올, 중수소처리(d₄-MeOH)

l. 디메틸 설폭시드, 중수소처리(d₆-DMSO)

m. 물, 중수소처리(D₂O)

n. 염산, 중수소처리(DCl)

o. 나트륨 테트라페닐보레이트, 시약 등급

화합물의 분획 수집을 위한 초기 제조용 HPLC 시스템 2

초기 분획 수집

수성 희석액 - 0.1M 아세트산 용액을 제조하고 NaOH를 사용하여 pH를 6.1 ±0.1로 조정한다.

이동상 A - 88:12 수성 희석액:ACN

이동상 B - 50:50 수성 희석액:ACN

샘플 제조: 수성 희석액중의 건조되고 블렌딩된 착체 반응 생성물 용액 15mg/mL를 제조한다. 용액을 30 내지 40mL 분취량으로 개별적인 10g C₁₈ SPE 카트리지상에 로딩하고, 약 20mL의 수성 희석액으로 세척한 다음, 약 10mL의 물로 세척한다. MeOH중 0.01N HCl 약 10mL로 용리시킨다. 세척된 샘플을 회전 증발시켜 건조시키고 수성 희석액에 재용해시킨다.

크로마토그래피 시스템: 칼럼 가열기를 가진 AP 1100 HPLC 시스템에 7㎛, 30.0cm X 7.8mm C₁₈ 칼럼 및 290nm에서의 검출을 위한 적당한 UV 검출기 및 다이오드 어레이를 장착시키고, 유량을 5.0mL/분으로 설정하고 칼럼 온도는 20℃로 설정한다. 다음의 구배 용리를 사용한다:

	% 이동상
시간(분)	A	B
0	80	20
15	60	40
15.1	0	100
25	0	100
25.1	80	20

방법: 샘플 900㎕ 분취량을 크로마토그래피 시스템상에 주입하고 관심있는 피크를 다중채널 분획 수집기로 수집한다. 모든 분획이 수집되면, 각 분획을 회전 증발시켜 대부분의 ACN을 제거한 다음 C₁₈ SPE 카트리지상에서 농축시키고, 물로 세척하고 MeOH중의 0.01N HCl 약 5mL로 용리시킨다. 용리액을 회전 증발시켜 건조시키고 추가 정제를 위해 보관해 둔다.

최종 분획 수집

이동상 A - 88:12 0.1% TEA:ACN

이동상 B - 50:50 0.1% TEA:ACN

샘플 제조: 초기 분획수집물로부터 건조된 분획의 용액을 제조하고 이동상 A로 희석시킨다.

크로마토그래피 시스템: 칼럼 가열기를 가진 HP 1100 HPLC 시스템에 7㎛, 30.0cm X 7.8mm C₁₈ 칼럼 및 290nm에서의 검출을 위한 적당한 UV 검출기 및 다이오드 어레이를 장착시키고, 유량을 5.0mL/분으로 설정하고 칼럼 온도는 30℃로 설정한다. 다음의 구배 용리를 사용한다:

	% 이동상
시간(분)	A	B
0	73	27
8	70.6	29.4
8.1	45	55
9	45	55
16	25.5	74.5
16.1	73	27

방법: 샘플 200㎕ 분취량을 크로마토그래피 시스템상에 주입하고 관심있는 피크를 다중채널 분획 수집기로 수집하였다. 모든 분획이 수집되면, 각 분획을 우선 회전 증발시켜 대부분의 ACN을 제거한 다음 C₁₈ SPE 카트리지상에서 농축시키고, 물로 세척하고 MeOH중의 0.01N HCl 약 5mL로 용리시켰다. 그 후, 분획을 건조 질소 스트림하에서 건조시키고 확인을 위한 분석을 수행하기 위해 보관해 두었다.

화합물 IV 특성화

분리 및 단리

화합물 IV를 반제조용 (semi-preparative) HPLC법을 사용하여 단리시켰다. 분획을 수집하고, 대부분의 ACN을 회전 증발에 의해 제거하고, 분획을 C₁₈ SPE 카트리지를 사용하여 추가로 농축시키고, 물로 세척하고 MeOH중의 0.01N HCl 약 5mL로 용리시켰다. 그 후, 분획을 건조 질소 기류하에서 건조시켰다. 재료 일부를 이동상에 재용해시키고 HPLC 시스템상에 주입하여 분획의 순도를 측정하였다. 화합물 IV의 주입 결과 약 95%의 순도를 나타냈고, NMR에 의해 8.2mg을 검사하였다.

질량 스펙트럼 분석

분쇄되고 블렌딩된 착체 반응 생성물의 예비 LC-MS 질량 스펙트럼 데이타는 화합물 IV의 분자량이 약 375.3m/z임을 나타냈다. LC-MS로부터 수집한 분획을 사용한 추가 HR-MS 조사는 화합물 IV에 대해서 질량 375.1655m/z 및 분자식 C₂₂H₂₃N₄S₁을 나타냈다. 화합물 IV의 375m/z 모이온 (parent ion)의 딸이온 (daughter)을 포지티브 ESI-MS/MS를 사용하여 검사하였다. 화합물 IV의 분자 이온으로부터 16amu 및 44amu의 현저한 손실을 나타내는 단편화 패턴 (fragmentation pattern)은 화합물 IV의 구조를 나타내었다. 이 화합물 및 이것의 N-, 및 N,N-디메틸화 유도체인 화합물 V 및 VI는 모화합물 (TBO) 및 과량의 출발 물질 O-톨루이딘의 2차 반응으로부터 형성된다.

화합물 I 특성화

분리 및 단리

화합물 I을 반제조용 HPLC법을 사용하여 단리시켰다. 분획을 수집하고, 대부분의 ACN을 회전 증발에 의해 제거하고, 분획을 C₁₈ SPE 카트리지를 사용하여 추가로 농축시키고, 물로 세척하고 MeOH중의 0.01N HCl 약 5mL로 용리시켰다. 그 후, 분획을 건조 질소 기류하에서 건조시켰다. 재료 일부를 이동상에 재용해시키고 HPLC 시스템상에 주입하여 분획의 순도를 측정하였다. 화합물 I의 주입 결과 약 95%의 순도를 나타냈고, NMR에 의해 18.9mg을 검사하였다.

질량 스펙트럼 분석

건조되고 블렌딩된 착체 반응 생성물의 예비 LC-MS 질량 스펙트럼 데이타는 화합물 I의 분자량이 약 284.1m/z임을 나타냈다. LC-MS로부터 수집한 분획을 사용한 추가 HR-MS 조사는 화합물 I에 대해서 질량 284.1223m/z 및 분자식 C₁₆H₁₈N₃S₁을 나타냈다. 화합물 I의 284.1m/z 모이온 (parent ion)의 딸이온 (daughter)을 포지티브 ESI-MS/MS를 사용하여 검사하였다. 제안된 구조 및 분자 이온으로부터 16 amu, 30amu, 및 59amu의 현저한 손실을 나타내는 단편화 패턴으로 화합물 I의 구조를 얻었다. 화합물 I 및 이것의 N-, 및 N,N-디메틸화 유도체인 화합물 II 및 III은 상응하는 모 TBO 이성체상의 또 다른 디메틸화 분자로부터 메틸기의 자유 라디칼 스캐빈징으로부터 형성된다.

화합물 II, III, V, 및 VI를 화합물 IV 및 I의 단리 및 특성화에 대해 상술된 방법에 의해 단리 및 특성화하였다.

실시예 2

임상 시험 프로토콜

임상 시험 용액의 제조

본 실시예는 실시예 1의 각 생성물을 구강 이형성의 확인에 사용하는 것을 예시한다.

화합물 I, 산딸기 (raspberry) 착향제 (IFF Raspberry IC563457), 아세트산 나트륨 3수화물 완충제, 및 H₂O₂(30% USP) 보존제 [참조: 미국 특허 제 5,372,801호]를 정제수 (USP), 빙초산 및 SD 18 에틸 알코올에 용해시켜 표 A에 기재된 조성을 갖는 시험 용액을 제조하였다:

표 A
성분	중량%
화합물 I	1.00
착향제	.20
완충제	2.45
보존제	.41
아세트산	4.61
에틸 알코올	7.48
물	83.85
	100.00

정제수중의 1 중량% 아세트산, 벤조산 나트륨 보존제, 및 산딸기 착향제로 된 전헹굼 및 후헹굼 시험 용액을 제조하였다.

임상 프로토콜

환자에게 옷을 보호하기 위해 턱받이를 걸쳐주었다. 객담이 예상되어, 환자에게 감염 폐기물 용기내에서 처분하거나 그 내용물을 하수구의 중앙에 직접 부어 하수구의 염색을 방지할 수 있도록 10온스의 컵을 주었다. 염색될 수 있는 주변 표면 또는 물체를 포장을 치거나 시험 영역으로부터 치웠다.

연조직의 상처 또는 베임을 일으킬 수 있는 기구를 사용하지 않고 시각적인 구강암 검사를 수행하였다. 연조직 및 치아의 염색전 외관을 기록하였다.

환자가 전헹굼 용액 약 15ml로 약 20초간 구강을 헹구고 객담을 배출하도록 하여 과량의 타액을 제거하고 일관된 구강 환경을 제공하였다. 그 후, 이 단계를 추가의 전헹굼 용액으로 반복하였다.

그 후, 환자가 물로 20초간 헹구고 양치하고 객담을 배출하도록 하였다.

그 후, 환자가 시험 용액 30ml로 1분간 헹구고 양치하고 객담을 배출하도록 하였다.

그 후, 환자를 후헹굼 용액 15ml로 20초간 헹구고 객담을 배출하도록 하였다. 그 후, 이 단계를 반복하였다.

그 후, 환자가 물로 20초간 헹구고 양치하고 객담을 배출하도록 하였다. 그 후, 이 단계를 반복하였다.

그 후, 필요에 따라 수축 (retraction), 잘 균형을 이룬 조명 및 확대를 포함하는 적당한 연조직 검사 기술을 사용하여 구강 관찰을 행하였다. 청색 착색을 보유한 의심되는 병변의 위치, 크기, 형태, 색, 및 표면 특성을 관찰 및 기록하였다.

가양성을 감소시키기 위하여, 상기 프로토콜의 반복을 위한 10 내지 14일 후에 환자를 재차 방문하게 하였다. 이 기간은 1차 검사시 임의의 궤양성 또는 외상성 병변 또는 자극성 병인을 치유하기 위한 기간을 허용한다. 1차 검사에서 검출된 의심되는 영역의 2차 검사후 양성 염색은 암성 또는 전암성 조직의 징후인 것으로 간주되며 이러한 결론을 확인하기 위해 생검을 실시하였다.

초기 에리스로플라스틱(erythroplastic) 병변은 종종 점상 또는 반점형 패턴으로 청색으로 염색되었다. 그러나, 염색이 설배상의 불규칙한 파필라 크레비스 (papiliar crevice)에 의해 보유된 것은 정상이며, 이는 양성의 징후가 아니다. 청색 염색을 보유하지만, 양성으로 간주되지 않는 기타 영역은 치태, 각 치아의 치은연, 설배상에 보유된 염색으로부터 옮겨진 염료로 인한 연구개의 확산 염색, 및 용이하게 구분되는 궤양성 병변을 포함한다. 병변이 매우 의심되지만 상기 검사에서 양성으로 염색되지 않는 모든 경우에, 생검을 실시하는 것이 필수적이다.

실시예 3 내지 7

화합물 I 대신에 화합물 II, III, IV, V 및 VI를 사용한 것을 제외하고는, 상기 기재된 방법을 반복하였다. 유사한 결과를 얻었다.

본 발명을 당업자가 이해하고 실시할 수 있을 정도로 기재하였고, 바람직한 최선의 양태가 확인하면서, 본 발명자는 첨부된 청구의 범위를 청구한다.

Claims

하기 화학식을 가진 화합물:

상기 식에서,

X는 수소, 메틸, 또는 Y이고;

Y는 -NH-R이며;

R은
이다.
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하기 화학식을 가진 화합물:
하기 화학식을 가진 화합물:
하기 화학식을 가진 화합물:
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