EA001622B1 - Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы - Google Patents

Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы Download PDF

Info

Publication number
EA001622B1
EA001622B1 EA199800917A EA199800917A EA001622B1 EA 001622 B1 EA001622 B1 EA 001622B1 EA 199800917 A EA199800917 A EA 199800917A EA 199800917 A EA199800917 A EA 199800917A EA 001622 B1 EA001622 B1 EA 001622B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
isoprenoid synthase
chimeric
synthase
chimeric isoprenoid
domain
Prior art date
Application number
EA199800917A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199800917A1 (ru
Inventor
Джозеф Чэппелл
Киоунгвхан Бэк
Original Assignee
Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Кентукки
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Кентукки filed Critical Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Кентукки
Publication of EA199800917A1 publication Critical patent/EA199800917A1/ru
Publication of EA001622B1 publication Critical patent/EA001622B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Описан полипептид химерной изопреноидсинтазы, включающий первый домен от первой изопреноидсинтазы, соединенный со вторым доменом от второй гетерологичной изопреноидсинтазы, благодаря чему указанная химерная изопреноидсинтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции, которые не продуцируются в отсутствии второго домена от второй гетерологичной изопреноидсинтазы. Описан также полипептид химерной изопреноидсинтазы, включающий асимметрично расположенный гомологичный домен, благодаря чему указанная химерная изопреноидсинтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции, которые не продуцируются в том случае, если указанный домен расположен в его природном сайте в указанном полипептиде изопреноидсинтазы. Описаны также кодирующая указанную химерную изопреноидсинтазу последовательность ДНК, экспрессирующий вектор, содержащий указанную последовательность, линия клеток, трансформированная указанным вектором, и способ получения химерной изопреноидсинтазы.

Description

Указание на исследование, спонсированное Федеральным правительством
Разработка настоящего изобретения была частично финансирована Федеральным правительством, а поэтому Правительство имеет определенные права на это изобретение.
Предпосылки создания настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к химерной изопреноидсинтазе, к кодирующей ее последовательности ДНК, к экспрессирующему вектору, содержащему указанную последовательность, к линии клеток, трансформированной указанным вектором, и к способу получения химерной изопреноидсинтазы.
Используемый термин «изопреноид» относится к семейству соединений, происходящих от изопренового структурного элемента. В частности, растительные изопреноиды составляют структурно отличающуюся группу соединений, которая может быть подразделена на классы первичных и вторичных метаболитов (фиг. 1). Изопреноидами, составляющими группу первичных метаболитов, являются стеролы, каротеноиды, регуляторы роста и полипреноловые заместители долихолов, хинонов и белков. Эти соединения играют важную роль в сохранении целостности мембраны, защиты от светового излучения (фотозащиты), регуляции программы эволюционного развития организма и основных биохимических функций связывания со специфическими мембранными системами, соответственно. Изопреноидами, классифицированными как вторичные метаболиты, являются монотерпены, сесквитерпены и дитерпены. Известно, что эти соединения опосредуют важные взаимодействия между растениями и окружающей средой. Так, например, специфические терпеноиды коррелируют со взаимодействиями растениерастение (81еуепз, ΙδορίΌηοίάδ ίη Р1апК Να \ν.Ό. Ри11ег, С., & Т§а1, Ь.-8., еб§., Магсе1 Эеккег Νο\ν Уогк, рр.65-80, 1984), растение-насекомое (С1Ь§оп & РюкеИ №Циге. 302:608, 1983) и растение-патоген (81оеаа1 е1 а1., РйуФсйетШгу, 15:855, 1976).
Общим признаком этого множества соединений является их универсальный структурный элемент, изопрен, состоящий из пяти атомов углерода. Для обоснования биосинтетического происхождения всех терпеноидов, полученных из изопрена, используется «биогенное изопреновое правило» («правило Ружички») (Яи/юка, Ехрепепба, 10:357, 1953). Посредством полимеризации двух дифосфорилированных изопреновых структурных элементов (например, 1РР и диметилаллила) получают геранилдифосфат (СРР), линейное промежуточное соединение с 10 атомами углерода, которое может быть превращено в циклические или линейные конечные продукты, представляющие собой монотерпены, либо это соединение может быть использовано для другого цикла полимеризации. После присоединения третьего изопренового звена к СРР образуется фарнезилдифосфат (РРР), который может быть также превращен в циклические или линейные продукты, представляющие собой соединения класса сесквитерпенов. Последующее продолжение цикла полимеризации и химической дифференциации приводит к продуцированию других классов терпеноидов, называемых в соответствии с числом изопреновых структурных элементов, используемых для их биосинтеза, например, присоединение третьего 1РР к РРР приводит к образованию геранилгеранилдифосфата (ССРР).
Эти реакции полимеризации катализируются пренилтрансферазами, которые регулируют действие карбокатиона (атома углерода с недостающим электроном, образующегося в результате потери дифосфатной группы одного субстрата) на электрон-обогащенный атом углерода двойной связи в молекуле 1РР (фиг. 2). Известно, что электрофильная природа этих реакций не похожа на более универсальные нуклеофильные реакции конденсации, но эта реакция является, очевидно, характерной реакцией для изопреноидных биосинтетических ферментов, а особенно, тех ферментов, которые участвуют в катализе циклизации изопреноидных промежуточных соединений (СегхЕепхоп & Сго1еаи, ЫрИ Ме1аЬо118т ш Р1апК Мооге, Т.8., еб., СЯС Рге§8, Воса Яа1оп, РЬ, рр. 340-388). Ферменты, ответственные за циклизацию СРР, РРР и ССРР, относятся к монотерпен-, сесквитерпен- и дитерпен-синтазам или просто синтазам, и осуществляют реакции передачи атома углерода из общего пути метаболизма изопреноидов конечным продуктам класса монотерпенов, сесквитерпенов и дитерпенов, соответственно.
Два важных отличительных биохимических признака, существующих между реакциями пренилтрансферазы и синтазы, проиллюстрированы на фиг. 2. Пренилтрансферазы катализируют образование углерод-углеродной связи между двумя молекулами субстрата, тогда как синтаза катализирует образование внутримолекулярной углерод-углеродной связи. Пренилтрансферазы также катализируют реакции с очень небольшим изменением стереохимии или длины образующегося полимера. Пренилтрансферазы отличаются по длине аллиловых субстратов, которые могут участвовать в инициации этих реакций. Синтазы также являются субстрат-специфичными. Однако различные сесквитерпен-синтазы могут, например, использовать один и тот же субстрат для продуцирования различных продуктов реакции.
Известно, что биосинтез изопреноидов, таких как циклические терпены, определяется ферментами ключевых точек ветвления, называемыми терпен-синтазами. Реакции, катализируемые терпен-синтазами, являются сложными реакциями внутримолекулярной циклизации, которые могут включать несколько парциальных реакций. Так, например, биоорганический принцип для циклизации ЕРР двумя сесквитерпен-синтазами, показан на фиг. 3. В стадии 1 за начальной ионизацией ЕРР следует внутримолекулярное электрофильное взаимодействие между углеродом, несущим дифосфатную часть, и дистальной двойной связью с образованием гермацена А, макроциклического промежуточного соединения. Замыкание внутреннего кольца и образование иона карбония Эвдесмана (Еибектапе) происходит во 2 стадии. Для 5-эпиаристолохен-синтазы табака (ТЕА8), конечная стадия представляет собой гидридный сдвиг, миграцию метила и депротонирование у С9, что приводит к образованию 5-эпиаристопохена, как показано в стадии 3а. Ветиспирадиенсинтаза Нуоксуатик тибсик (НУ8) (белена) имеет общий механизм в стадиях 1 и 2, но отличается от ТЕА8 в третьей парциальной реакции, в которой из-за альтернативной миграции электронной пары может происходить сокращение кольца циклической структуры. В любом случае, мономерный белок размером приблизительно 64 кДа катализирует полную серию парциальных реакций и не требует других кофакторов кроме Мд+2.
Краткое описание изобретения
В общих чертах, настоящее изобретение относится к полипептиду химерной изопреноидсинтазы, включающему первый домен от первой изопреноид-синтазы, соединенный со вторым доменом от второй гетерологичной изопреноид-синтазы, в результате чего указанная химерная изопреноид-синтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции, которые не продуцируются в отсутствии второго, домена от второй гетерологичной изопреноид-синтазы. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, химерная изопреноид-синтаза способна катализировать, по крайней мере, два различных изопреноидных продуктов реакции; изопреноидные продукты реакции являются циклическими;
второй домен от второй гетерологичной изопреноид-синтазы также определяет соотношение изопреноидных продуктов реакции химерной изопреноид-синтазы; первый домен от первой изопреноид-синтазы происходит от растительной изопреноид-синтазы, и второй домен от второй гетерологичной изопреноид-синтазы также происходит от растительной изопреноидсинтазы.
Химерную изопреноид-синтазу выбирают, предпочтительно, из группы, включающей (а) химерную изопреноидсинтазу СН4 №собапаНуоксуатик; (б) химерную изопреноидсинтазу СН10 Мсобапа-Нуок-суатик; (в) химерную изопреноидсинтазу СН11 Мсобапа-Нуоксуатик; (г) химерную изопреноидсинтазу СН12 N Коба паНуоксуатик;
(д) химерную изопреноидсинтазу СН13 Мсобапа-Нуоксуатик; и (е) химерную изопреноидсинтазу СН14 Мсобапа-Нуоксуатик, при чем все указанные ферменты описаны в настоящей заявке.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения химерная изопреноидсинтаза катализирует продуцирование изопреноидного продукта реакции, имеющего сельскохозяйственное, фармацевтическое или промышленное значение (например, являющегося противогрибковым агентом, антибактериальным агентом или противоопухолевым агентом).
В других родственных аспектах настоящее изобретение относится к ДНК, векторам и клеткам (например, Е.сой, 8ассйаготусек сегеу181ае, клеткам животных или растений), кодирующим или содержащим полипептид химерной изопреноид-синтазы.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду химерной изопреноид-синтазы, включающему асимметрично расположенный гомологичный домен, благодаря чему химерная изопреноид-синтаза способна катализировать продуцирование изопреноидных продуктов реакции (предпочтительно, циклических продуктов), в том случае, когда в указанном полипептиде изопреноидсинтазы домен расположен в сайте своей природной локализации.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полипептида химерной изопреноид-синтазы, предусматривающему: (а) продуцирование клетки, трансформированной ДНК, кодирующей химерную изопреноид-синтазу, предназначенную для экспрессии в клетке; (Ь) культивирование трансформированной клетки в условиях, благоприятных для экспрессии указанной ДНК; и (с) выделение указанной химерной изопреноид-синтазы.
Термин «изопреноид-синтаза» означает полипептид, который способен катализировать реакцию, приводящую к образованию внутримолекулярной углерод-углеродной связи аллилдифосфатного субстрата (например, С10, С15 или С20-аллилдифосфатного субстрата) с изопреноидным продуктом (например, с монотерпеном, дитерпеновым, сесквитерпеновым или стероловым продуктом). Примерами таких изопреноидсинтаз являются, но не ограничиваются ими, монотерпен-синтазы (например, лимоненсинтаза), дитерпен-синтазы (например, касбенсинтаза) и сесквитерпен-синтазы (например, 5эпи-аристолохен-синтаза, ветиспирадиенсинтаза и кадинен-синтаза), которые ответственны за циклизацию геранилдифосфата (СРР), фарнезилдифосфата (ЕРР) и геранилгеранилдифосфата (ССРР) соответственно. Был выделен и охарактеризован ряд терпен-синтаз, происходящих от растительных и микробных источников (см., например, Моек!га & \Уек1 Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 238:325, 1985; 11о1ш & Уап М1бб1ектеог1й, Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 251:756, 1986; Нойп & Р1айпег, Агсй. Вюсйет. Вюрйук.
272:137, 1989; Сапе & РагдеШз, АгсБ. ВюсБет. В1орБуз. 254:421, 1987; Мипск & Сго1еаи, АгсБ. ВюсБет. ВюрБуз. 282:58, 1990; А1опзо е! а1., 1. В1о1. СБет., 267:7582, 1992; 8ауаде е! а1., 1. Вю1. СБет., 269:4012, 1994; Сго1еаи е! а1., АгсБ. В1осБет. ВюрБуз. 309:184, 1994; Убдей е! а1., Р1ап! РЬу8ю1. 93:182, 1990; Сио е! а1., АгсБ. ВюсБет. ВюрБуз. 308:103, 1994; и СатЬ11е1 & Сго!еаи, 1. В1о1. СБет., 259:740, 1984). В основном, терпенсинтазы являются растворимыми ферментами, имеющими молекулярные массы от около 40 до 100 кДа. Гены, кодирующие ряд монотерпен-, дитерпен- и сесквитерпен-синтаз, описаны для ряда растений и микробов (см., например, НоБп & Вегетапб, Сепе 79:131, 1989; Ргос!ог & НоБп, 1. Вю1. СБет., 268:4543, 1993; ЕассЫш & СБарре11, Ргос. №111. Асаб. 8сГ, 89:11088, 1992; Васк & СБарре11, 1. Вю1. СБет., 270:7375, 1995; Со1Ьу е! а1., 1. Вю1. СБет., 268:23016, 1993; Маи & Аез!, Ргос. №111. Асаб. 8сг, 91:8497, 1994; СБеп е! а1., АгсБ. ВюсБет. ВюрБуз. 324:255, 1994; и Сапе е! а1., ВюсБет1з!гу, 33:5846, 1994).
Термин «полипептид» или «белок» означает любую цепь аминокислот независимо от ее длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования).
Термин «соединенный с...» означает «ковалентно связанный» прямо или опосредованно (то есть, когда домены разделены промежуточной аминокислотной последовательностью). Такие домены могут быть связаны любым способом, включая такой способ, но не ограничиваясь им, как пептидная связь или химическая связь.
Термин «домен» означает определенный участок аминокислотной последовательности в полипептиде или белке.
Термин «изопреноид» означает соединение, происходящее от изопренового структурного элемента. В частности, изопреноидными соединениями являются, но не ограничиваются ими, монотерпены, дитерпены, сесквитерпены и стеролы. Как описано в настоящей заявке, изопреноиды присутствуют в различных организмах, например, в организмах животных, в грибках или в бактериях.
Термин «асимметрично расположенный» означает локализацию в химерном полипептиде в положении, которое отличается от его положения в природном полипептиде.
Термин «гетерологичный» означает «происходящий от другого источника» (в данном случае, другие полипептиды).
Термин «гомологичный» означает «происходящий от того же самого источника» (в данном случае, те же самые полипептиды).
Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего описания его предпочтительных вариантов осуществления и из формулы изобретения.
Подробное описание изобретения
Ниже приводится описание чертежей.
Фиг. 1 схематически иллюстрирует каскад реакций биосинтеза изопреноидов в зависимости от типа конечного продукта и их соответствующих физиологических функций. Пунктирные стрелки указывают на множество стадий или реакций.
Фиг. 2 схематически иллюстрирует различные реакции, которые катализируются пренил-трансферазами и терпен-синтазами.
Фиг. 3 схематически иллюстрирует механизм реакции для синтеза сесквитерпен-синтаз типа эремофилан-синтазы (5-эпи-аристолохенсинтазы, ТЕА8) и ветиспирадиен-синтазы (ветиспирадиен-синтазы Нуозсуатиз, НУ8). Рассматриваются парциальные реакции 1 и 2, общие для обоих типов синтаз. Показано, что различия в механизмах парциальных реакций 3 а и 3Ь достаточны для того, чтобы приводить к продуцированию различных продуктов реакции.
Фиг. 4А схематически иллюстрирует химерные конструкции, используемые для картирования каталитических доменов в сесквитерпен-синтазах. Линейные схемы обозначают сложные диаграммы для генов сесквитерпенсинтаз дикого типа (то есть, ТЕА8 и НУ8) и химерных сесквитерпен-синтаз (СН1-СН14), которые были сконструированы в бактериальном экспрессирующем векторе рСВТ-Т19. Генные конструкции были получены с использованием комбинации имеющихся сайтов рестриктирующих эндонуклеаз и путем амплификации выбранных областей с использованием РСВ и РСВ-праймеров, несущих соответствующие сайты рестриктирующих эндонуклеаз. Показано соответствие между уникальными сайтами рестриктирующих эндонуклеаз и положениями аминокислот.
Фиг. 4В представляет фотографию, полученную в ТСХ-эксперименте и иллюстрирующую активность синтазных ферментов в обработанных ультразвуком лизатах клеток ТВ1 Е.со11, экспрессирующих ТЕА8, НУ8 и химерные конструкции синтазы (СН1-СН14), где указанная активность была измерена с использованием [3Н]-ЕРР. Продукты реакции выделяли посредством тонкослойной хроматографии (ТСХ) с серебрением и оценивали с помощью авторадиографии. Радиоактивность в 0,5 ммсегментах каждой дорожки ТСХ-пластины определяли в сцинтилляционном счетчике, а радиоактивность, ассоциированную с зонами ТЕА8- и НУ8-специфических продуктов принимали за 100%.
Фиг. 5 схематически иллюстрирует соответствие между экзонами и функциональными доменами в изопреноид-синтазах. Верхняя диаграмма представляет организацию экзонов в гене ТЕА8, которая почти идентична организации энзонов в генах НУ8 и касбен-синтазы. Нижняя диаграмма представляет сравнение пер001622 вичных структур функциональных доменов с организацией экзонов в генах ТЕА8 и НУ8. Номера экзонов показаны в верхней диаграмме, а все другие числа обозначают положения аминокислот, некоторые из которых соответствуют указанным сайтам рестриктирующих эндонуклеаз.
Фиг. 6 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию «переключения» доменов, используемую для продуцирования «заторможенной» синтазы (ОН1). Введение неактивного домена НУ8, соответствующего экзону 4, в СН3, приводит к продуцированию синтазы, имеющей измененную ферментативную активность.
Фиг. 7 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию «переключения» доменов, используемую для продуцирования химерной «заторможенной» касбенсинтазы, и возможных продуктов реакции.
Фиг. 8 представляет диаграмму, схематически иллюстрирующую стратегию переключения доменов, используемую для продуцирования химерной «заторможенной» кадиненсинтазы, и возможных продуктов реакции.
Химерные изопреноид-синтезы
Плазмиды, предназначенные для экспрессии химерных синтаз, были генерированы путем замены части гена, кодирующего домен от 5эпи-аристолохен-синтазы табака, на часть гена, кодирующего домен от ветиспирадиен-синтазы Нуовсуатив. Эти плазмиды были экспресированы в бактериях, и полученные бактериальные лизаты были проанализированы на сесквитерпен-синтазную активность. Анализ на сесквитерпен-синтазную активность включал анализ, проводимый методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с серебрением, и позволяющий различать аристохоленновые и ветиспирадиеновые продукты реакции (Васк & СНарре11, 1. Вю1. Сйет., 270:7375, 1995). Как показано на Фиг. 4А, было продуцировано 14 химерных конструкций синтазы, которые были проанализированы следующим образом.
Полноразмерную кДНК для 5-эпиаристолохен-синтазы (ТЕА8) и ветиспирадиенсинтазы Нуовсуатив (НУ8) клонировали в ЕсоШ/ХМ-сайты вектора В1ие8спр1 8К (81та1адепе), в результате чего были сконструированы плазмиды рВ8К-ТЕА8 и рВ8К-НУ8, соответственно (Васк & Сйарре11, 1. ΒίοΙ. Сйет., 270:7375, 1995). Ориентация ТЕА8- и НУ8-кДНК-вставок этих экспрессирующих плазмид обеспечивалась их кодонами инициации трансляции, расположенными возле рестрикционного ЕсоШ-сайта, и их 3'-ро1уА-хвостом, фланкированным рестрикционным Хйо1-сайтом плазмиды р8К.
Химерные синтазы СН1, СН2, СН5 и СН7 конструировали с использованием консервативных рестрикционных НтйШ- и Ыйе1-сайтов, локализованых между генами Мсойапа (табака) и Нуовсуатив. СН1 получали путем лигирова ния 5'-концевой части гена ТЕА8 (соответствующего ЕсоК1-НтйШ-фрагменту) с 3'концевой частью гена НУ8 (соответствующей ΗίηάΙΙΙ-ΚρηΙ-фрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор рОВТ-Т19 (Оо1й Вю1есйпо1оду), который был предварительно гидролизовал ферментами ЕсоШ и Крп1.
СН2 получали путем лигирования 5'концевой части гена ТЕА8 (соответствующей ЕсоШ-ИйеЕфрагменту) с З'-концевой частью гена НУ8 (соответствующей Ыйе1-Крп1фрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор рОВТ-Т19.
СН5 получали путем лигирования 5'концевой части гена НУ8 (соответствующей ЕсоШ-НтйШ-фрагменту) с З'-концевой частью гена ТЕА8 (соответствующей НшйШ-КрпН фрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор рОВТ-Т19.
СН7 получали путем лигирования 5'концевой части гена НУ8 (соответствующей ЕсоВ1-Ыйе1-фрагменту) с З'-концевой частью гена ТЕА8 (соответствующей Ыйе1-Крп1фрагменту) в бактериальный экспрессирующий вектор рОВТ-Т19.
СН3, СН4, СН12 и СН13 были сконструированы стандартными методами полимеразной цепной реакции (РСК) с использованием праймеров, предназначенных для амплификации конкретных сегментов гена НУ8. Для облегчения направленного клонирования и сохранения рамки считывания были также сконструированы праймеры, содержащие нужные рестрикционные сайты.
СН3 конструировали следующим образом. Рестрикционный ЕсоК1/С1а1-фрагмент гена
ТЕА8 выделяли и лигировали в С1а1/Крп1фрагмент гена НУ8. Этот С1а1/Крп1-фрагмент гена НУ8 получали РСЯ-методом с использованием олигонуклеотида: 5'-й(6СОАТС6АТ6АСАТА6ССАС6ТАТ6АООТТ; 8ЕО ГО Ыо:1)-3' (рестрикционный С1а1-сайт подчеркнут) в качестве прямого праймера, и олигонуклеотида:
5'-й(ААТАСОАСТСАСТАТАО; 8 ЕС) ГО Ыо:2)-3' в качестве обратного праймера (соответствующего последовательности Т7, обнаруживаемой в сайте множественного клонирования рВ8К), с использованием рВ8К-НУ8 в качестве ДНК-матрицы. Полученный рестрикционный фрагмент лигировали в ЕсоК1/Крп1сайты вектора рОВТ-Т19.
СН4 и СН13 конструировали аналогичным образом, но с использованием прямых праймеров для амплифиации 5'-б(ССАСТСААСАТ6ОТТТАТТОАОСОАТА; 8 ЕС) ГО Ыо:3)-3' (рестрикционный НтсП-сайт подчеркнут); и 5'б(ТАТТСТАСАТСТСТАТСАССАТТАТСАА; 8ЕО ГО Ыо:4)-3' (рестрикционный ХЬа1-сайт подчеркнут), соответственно.
СН12 получали путем лигирования РСКфрагмента, соответствующего первым 1326 нуклеотидам СН4, с С1а1/Крп1-фрагментом гена ТЕА8 в ЕсоК1/Крп1-сайты вектора рОВТ-Т19. СН4-фрагмент получали с использованием прямого праймера для амплификации 5'-б (666А6СТС6ААТТССАТ66ССТСА6СА0САОТТОСАААСТАТ; 8 НО ΙΌ Νο:5)-3' (рестрикционный ЕсоКЕсайт подчеркнут, а кодон инициации трансляции выделен жирным шрифтом), и обратного праймера 5'-б(ССОАТСОАТААСТСТССАТААТОТАССАТТ; 8ЕО ΙΌ Νο:6)-3' (рестрикционный С1а1-сайт подчеркнут).
Химерные синтазы СН6, СН8, СН9, СН10, СН11 и СН14 были сконструированы следующим образом. В результате лигирования ЕсоК1/НшбШ-фрагмента гена НУ8 с ΗίηάΙΙΙ/ΚρηΙ-фрагментом СН3 получали конструкцию СН6. СН8 создавали путем лигирования ЕсоЯ1/ЫбеЕфрагмента НУ8 с Ν6βΙ/ΚρηΙфрагментом СН3. СН9 получали путем лигирования ЕсоК1/Ыбе1-фрагмента СН5 с Ν6βΙ/ΚρηΙфрагментом НУ8. СН10 конструировали путем лигирования ЕсоКб/НшбШ-фрагмента гена НУ8 с НшбШ/КрпЕфрагментом СН4. СН11 конструировали путем лигирования ΕοοΚ.Ι/Ν6οΙфрагмента НУ8 с Ыбе1/Крп1-фрагментом СН4. А СН14 конструировали путем замены ЕсоКб/ЫбеЕфрагмента СН13 соответствующим ДНК-фрагментом рВ8К-НУ8. Области соединения химерных конструкций подтверждали путем секвенирования двухцепочечной ДНК с использованием набора для дидезокситерминации цепи в соответствии с инструкциями производителей (И.8. ВюсБетюа1 Согр.).
Химерные синтазы экспрессировали в клетках ТВ1 Е.со11. Процедуры культивирования бактериальных клеток, индуцирования экспрессии генов, измерения сесквитерпенсинтазной ферментативной активности, и определения полного белка в бактериальных лизатах осуществляли методами, описанными Васк & СБарре11 (АтсБ. ВюсБет. ВюрБук.. 315:527, 1994; 1. Вю1. СБет.. 270:7375. 1995). Продукты реакции выделяли путем проявления ТСХ-пластин, покрытых двуокисью кремния 060. и погруженных в 15% нитрат серебра в смеси бензола:генсана:диэтилового эфира (50:50:1). Для качественной оценки, на ТСХпластины, путем распыления, наносили раствор для высокоэффективной поверхностной флюорографии (^иροηΐ). и экспонировали с пленкой Κο6α1< ХАЯ-5 в течение от 2 до 5 дней при -70°С. Для количественной оценки 0.5 мм-зоны всей дорожки ТСХ-пластин соскабливали в сцинтилляционные сосуды и измеряли радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика Раскатб 1500 Εκ.|ΐιί6 8άηΐί11ηΙίοη Сοиηΐе^. Преобладающие продукты реакции, продуцированные благодаря синтазной активности, обусловленной экспрессией конструкций ТЕА8, НУ8. СН4 и СН14 в бактериальных клетках, были также подтверждены с помощью газовой хроматогра фии (ГХ). и комплексной газовой хроматографией-масс спектроскопией (ГХ-МС) в соответствии с условиями, описанными СБарре11 е! а1.. РБуФсБетщйу 26:2259. 1987). Кроме того, профили масс-спектров сравнивали с опубликованными профилями для 5-эпи-аристолохена (Апке &. 8!етпет. Р1ап!а Меб. 57:344. 1991) и предсказанной картиной фрагментации для ветис-пирадиена (Епхе11 е! а1.. Ма§8 8рес1готеПу Яеу. 3:395. 1984).
Как показано на фиг. 4А-В, преобладающим продуктом реакции, продуцируемым в результате экспрессии гена ТЕА8 табака, был 5эпиаристолохен, а ветиспирадиен был обнаружен как преобладающий продукт, полученный в результате экспрессии гена НУ8. Преобладающие продукты реакции, продуцированные в результате экспрессии СН1 и СН2, были также НУ8-специфическими (то есть, ветиспирадиен). при этом, фермент-специфическая активность была аналогична активности фермента НУ8. который был экспрессирован в плазмиде рВ8КНУ8. Эти результаты показали, что аминоконцевая половины ТЕА8 и НУ8 функционально эквивалентны по отношению к карбоксиконцу НУ8. и не вносит какой-либо вклад в специфичность продукта реакции. Конструкция СН7, имеющая амино-конец НУ8 и карбоксиконец ТЕА8. является обращенной конструкцией СН2, и ожидалось, что полученная в результате синтазная активность приведет к экспрессии ТЕА8-специфичного продукта (то есть, 5эпи-аристолохена). Иммунологичесий анализ выявил, что белок синтазы, продуцированной в результате экспрессии СН7, имел нужный размер и ожидаемую распространенность, однако, ферментативной активности не наблюдалось. Отсутствие ферментативной активности указывает на то, что эта ферментативная активность обеспечивается взаимодействием между карбокси- и аминоконцевыми частями белка. Такая интерпретация, кроме того, подтверждается сравнением специфической активности ферментов, продуцированных в результате экспрессии конструкций СН5 и СН6. Конструкция СН5 приводила к экспрессии продукта, имеющего в 10 раз меньшую специфическую синтазную ферментативную активность, чем другие химерные синтазы, даже несмотря на то, что абсолютный уровень экспрессированного белка был аналогичен уровню других конструкций (как было определено с помощью иммунологического анализа, данные не показаны). Было обнаружено, что замена карбоксиконцевой области НУ8 способствует восстановлению специфической активности синтазного фермента, который был генерирован конструкцией СН6.
Сравнение химерных синтаз СН2 и СН3 показало, что за специфичность образования специфичного конечного продукта ответственен домен приблизительно 181 аминокислот, соответствующий рестрикционному №еЕС1аЕ фрагменту в генах ТЕА8 и НУ8. Экспрессия СН4 неожиданно приводила к продуцированию химерного белка синтазы, способного генерировать продукты реакции, относящиеся как к ферментам ТЕЛ8, так и к ферментам НУ8. Мы считаем, что этот результат указывает на то, что аминокислоты 261-379 в 5-эпиаристолохенсинтазе табака являются ответственными за ТЕЛ8-специфические продукты (то есть, область, соответствующая ИбеЕНтсП-фрагменту кДНК), тогда как аминокислоты 379-442 в белке Нуоксуатик ответственны за НУ8специфические продукты (то есть, область, соответствующая Н1пс11-С1а1-фрагменту кДНК).
Наша интерпретация была подтверждена путем оценки продуктов экспрессии СН11 и СН12. Конструкция СН11 была получена путем замены ИбеЕНтсП-фрагмента гена Нуоксуатик соответствующим генным фрагментом гена табака, и продуцировала фермент, имеющий НУ8ΤΕΆδ-специфичность. Конструкция СН12 была получена путем замены Ншс11-С1а1-фрагмента гена табака соответствующим генным фрагментом Нуоксуашик и продуцировала фермент, имеющий НУ8-ТЕА8-специфичность. Сравнение СН11 с СН13 вносило еще большее уточнение в характеризацию домена фермента табака, ответственного за ТЕА8-специфические продукты. Было обнаружено, что СН13 является многофункциональным ферментом, и этот факт указывает на то, что 81 аминокислоты, кодированные ДНК-фрагментом, находящимся между рестрикционными И6е1-ХЬа1-сайтами кДНК табака, являются достаточными для образования доминирующих ТЕ А8-специфических продуктов. Эта интерпретация подтверждается заменой домена, содержащегося в рестрикционном И6е1/ХЬа1-фрагменте НУ8-кДНК конструкции СН14, доменом, кодируемым геном ТЕА8 (см. фиг. 4А).
Как показано на фиг. 4В, преобладающие продукт(ы) реакции ТЕА8 табака и НУ8 Нуоксуатик дикого типа, экспрессированные в бактериях, мигрированных на ТСХ-пластины, покрытые нитратом серебра, имеют величины В£ = 0,41 и 0,31, которые соответствуют величинам, полученным при проведенной ранее характеризации этих продуктов как 5-эпиаристолохен и ветиспирадиен, соответственно (Васк & СЬарре11, 1. Вю1. СЬет., 270:7375, 1995; Васк е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬуз., 315:527, 1994). ГХ- и ГХ-МС-анализы указывают на то, что преобладающими продуктами ТЕА8-реакции были 5эпиаристолохен (70% от всех продуктов, исходя из процента всех площадей пиков, полученных в ГХ-анализе) и бициклический сесквитерпен (20%) ([М]+ ион при т/ζ = 204). Преобладающим продуктом НУ8-реакции был ветиспирадиен (>90%) (ион [М]+ при т/ζ = 204 с основным пиком при т/ζ 41, и серия предсказанных ионов при т/ζ 175, 108, 94 и 68), а преобладающими продуктами реакции СН4 были 5-эпи аристолохен (18%), бициклический сесквитерпен (43%) и ветиспирадиен (32%).
Кроме того, в исследованиях, проводимых путем аффинной очистки меченых гистидином рекомбинантных синтазных белков, было обнаружено 5 других вспомогательных продуктов реакции, каждый из которых составлял примерно 1% от всех продуктов; при этом, все 5 продуктов были обнаружены при той же самой относительной распространенности во всех реакционных анализах.
Соотношение-определяющий домен
Другой домен синтазных белков был идентифицирован путем сравнения относительных уровней преобладающих продуктов реакции, продуцированных многофункциональными химерными синтазами (фиг. 4 А). Так, например, продукты реакции, полученные в результате экспрессии конструкций СН4, СН10, СН11 и СН12, были продуцированы в отношении: 6070% ТЕА8-специфических ферментов на 3040% НУ8-специфических ферментов. В отличие от этого, экспрессия конструкций СН13 и СН14 приводила к обратному соотношению продуктов реакции. Этот результат указывает на то, что область, охватываемая ХЬа1-Ншс11доменом, влияет на относительный уровень продуктов реакции, продуцируемых многофункциональными химерными синтазами. Эти результаты свидетельствуют о том, что два отдельных и различных домена в пептиде синтазы непосредственно влияют на типы продуцируемых продуктов реакции и прерываются другим доменом, который мы назвали «соотношениеопределяющим доменом». (фиг. 5).
Сайт-направленный мутагенез
Дополнительный анализ специфичности продуктов и соотношение-определяющих доменов был проведен с использованием стандартной методики сайт-направленного мутагенеза. Результаты этого анализа представлены в Таблице I (см. ниже). Так, например, мотив ΌΌΧΧΌ, обнаруженный в аристолохенспецифическом домене, представляет собой консервативную последовательность, которая присутствует в ряде терпен-биосинтетических ферментов, включая ТЕА8 и НУ8. Известно, что этот кластер аминокислот с кислотными свойствами координирует металлический кофактор, который необходим для нейтрализации дифосфатной группы БРР в том или ином липофильном кармане. Замена первого остатка аспарагиновой кислоты (Ό301) мотива ΌΌΧΧΌ либо остатком глутаминовой кислоты (при сохранении полного заряда), либо валиновым остатком (с полной потерей кислотного заряда) (т.е., Ό301 Е и Ό301 ^У) приводит к образованию инактивированного фермента. Консервативная замена второго остатка аспарагиновой кислоты (Ό302) остатком глутаминовой кислоты (т.е., Э302-Е) также снижает ферментативную активность химерной синтазы на 90% и приводит к небольшому изменению распределения продуктов многофункционального фермента.
Таблица I
Мутация целевого гена Мутированная аминокислота Соотношение продуктов Аристолохен Ветиспирадиен Специфическая активность (нмоль/мг-ч1)
СН4 66% 34% 34
Домен связывания с субстратом (ШеТ/ХЬаТ-область)
Табак П301У Не акгивен 0
СН4 В287А Не активен 0
СН4 П301У Не акгивен 0
СН4 Ώ301Ε Не атаивен 0
СН4 Ώ302Ε 51% 49% 1,8
Соотношение-определяющий домен (ХЬа1-Н1пс11-область)
СН4 Κ347Ι 64% 36% 32
СН4 Н3608 63% 32% 29
СН4 Н3648 65% 35% 38
Нуозсуашиз-специфический домен (Нтс11/С1а1-область)
СН4 Т408А 67% 33% 48
СН4 К420М 68% 32% 29
СН4 Н422А 67% 33% 30
СН4 N4368 70% 30% 32
СН4 АТ437,438У1 61% 39% 33
Сайты для направленных замен в соотношение-определяющем домене (то есть, Κ347-Ι, Н360-8, Н364-8) были определены путем анализа работ, в которых были высказаны предположения о важности заряженных аминокислотных остатков (например, гистидина или лизина) в энзимологии синтаз, и эти сайты представляли те аминокислоты, которые обнаруживали наибольшее различие в заряде по сравнению с первичными последовательностями ТЕА8 и НУ8. Ни одна из трех проанализированных мутаций не оказывала какого-либо влияния на всю каталитическую активность фермента или на соотношение продуцируемых продуктов.
Аминокислотные замены в НУ8специфическом домене были выбраны на основании сравнения предполагаемых вторичных структур белка НУ8 и белка ТЕА8. Было показано, что эти мутированные аминокислоты вносят, непропорционально, структурные нарушения в моделях вторичной структуры этих двух белков, что, главным образом, обусловлено зарядом. Однако, как показано в таблице I (см. выше), замены заряженных аминокислотных остатков на незаряженные остатки (то есть, Т408 А, К420 М, Н422 А) или остатки с меньшим зарядом (N436 8, А437 Т, У438 I) не влияют ни на полную ферментативную активность, ни на уровень синтеза одного или другого продукта.
«Заторможенные» синтазы
Для продуцирования «заторможенной» (с.|шс5ссп1) синтазы неактивный домен, соответствующий экзону 4 НУ8 заменяют соответствующим активным доменом СН3, как показано на фиг. 6. СН3 содержит неактивный домен, соответствующий экзону 6 ТЕА8, имет стандартные рестрикционные ΝάοΙ- и ХЬа1-сайты для нужных замен и может быть сверхэкспрессирован в бактериях с высокими уровнями про дуцирования. «Переключение» доменов осуществляли с использованием стандартной молекулярной техники, описанной в настоящей заявке. В одном конкретном примере соответствующую область СН3 заменяли продуктом РСВамплификации кДНК НУ8, соответствующим экзону 4, кодирующему аминокислоты 261-342 и содержащему соответствующие ΝάοΙ- и ХЬа1сайты в праймерах. При создании таких конструкций необходимо, чтобы были сохранены соответствующие аминокислотные остатки и правильная рамка считывания, а также необходимо провести тест на экспрессию конструкций, в котором предусматривается измерение уровня белка в растворимых и нерастворимых фракциях бактериальных лизатов с использованием техники иммуноблоттинга и ферментных анализов.
Кроме того осуществляли крупномасштабные ферментативные реакции, продукт (продукты) реакции экстрагировали гексаном, и полученные продукты очищали методами ВЭЖХ. Дополнительную оценку продуктов реакции устойчивого фермента осуществляли с использованием ТСХ, и путем сравнения величин Рг экспериментального образца с величинами Вг продуктов, продуцированных ТЕА8- и НУ8ферментами. Время удерживания продуктов реакции (например, гермакрена или гермакренподобного продукта реакции) также прослеживали с помощью ГХ, ГХ-МС и ЯМР в соответствии со стандартными методами.
«Заторможенная» синтаза может быть использована для получения достаточных количеств гермакреновых промежуточных продуктов реакции (или их производных) в целях подтверждения химического обоснования для реакций ЕА8 и У8 и получения матричной химерной синтазы, которая может быть использована для введения в новые конечные стадии всей схемы синтазной реакции.
Химерные касбен- и кадинен-синтазы
Химерные изопреноид-синтазы могут быть также использованы для создания новых макроциклических изопреноидов или изопреноидов, обладающих модифицированными стереохимическими свойствами. Так, например, изопреноид-синтазы, такие как касбен-синтаза, дитерпенсинтаза, катализирующая синтез макроциклических дитерпенов, имеющих циклопропильную боковую группу; и кадинен-синтаза, сесквитерпен-синтаза, катализирующая синтез бициклического сесквитерпена, имеют домены, которые могут быть использованы для конструирования ферментов, способных продуцировать макроциклические изопреноиды или продукты реакции изопреноидов, имеющие измененные стереохимические свойства. Основная схема продуцирования таких химерных синтаз представлена на фиг. 7 и 8.
Для конструирования таких химерных касбен- и кадинен-синтаз, неактивные амино концевые домены (и, если необходимо, другие домены синтазы) заменяют доменами от касбени кадинен-синтазы с использованием соответствующих рестрикционных сайтов и с помощью РСК-амплификации выбранных областей, как описано выше. В этих конструкциях последовательности, соответствующие Ν-концевой, нацеленной на пластиду, последовательности касбен-синтазы, были делетированы. Химерные конструкции экспрессировали в бактериях, после чего бактериальные лизаты оценивали на активность химерной синтазы, и продукты реакции характеризовали, как описано выше, например, посредством ТСХ с серебрением. При этом считалось, что в настоящем изобретении могут быть использованы конструкции, обнаруживающие высокие уровни синтазной активности в бактериях и/или активности, способствующей продуцированию продуктов реакции, которые мигрируют с различными от аристолохеновых и ветиспирадиеновых стандартов. Продукты реакции также анализировали на время их удерживания при ГХ и, если необходимо, подвергали ГХ-МС и ЯМР. Те домены касбен-синтазы и кадинен-синтазы, которые обеспечивают синтез уникальных продуктов реакции, могут быть также подвергнуты более детальному картированию с использованием стратегии, проиллюстрированной на фиг. 4А. Продуцирование других химерных изопреноидсинтаз
С использованием стандартной молекулярной техники, описанной в настоящей заявке, могут быть легко генерированы другие химерные синтазы, которые включают домены от известных или вновь сконструированных выделенных ферментов синтазы. Такие химерные синтазы могут быть протестированы на активность с использованием, например, любых подходящих ферментных анализов, известных специалистам (например, описанных в настоящей заявке), либо с использованием стандартных иммунологических анализов.
Выделение последовательностей, кодирующих другие синтазы, может быть также осуществлено с использованием стандартных методов и схем клонирования, которые хорошо известны специалистам. Так, например, с использованием всей или части аминокислотной последовательности известного полипептида синтазы, могут быть легко сконструированы синтаза-специфичные олигонуклеотидные зонды, включая вырожденные олигонуклеотидные зонды для синтазы (то есть, смесь всех возможных кодирующих последовательностей для данной аминокислотной последовательности). Эти олигонуклеотиды могут быть получены исходя из последовательности любой нити ДНК и любой соответствующей части нуклеотидной последовательности синтазы. Общие методы конструирования и получения таких зондов описаны, например, АикиЬе1 е! а1., 1996, Сиггеп! Рго!о ео1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, \УП1еу 1п!егкс1епсе, №\ν Уогк, и Вегдег & К1тте1, Сшбе !о Мо1еси1аг С1оп1пд Тесйшдцек, 1987, Асабетк Ргекк, №\ν Уогк. Эти олигонуклеотиды могут быть использованы для выделения гена синтазы либо посредством использования их в качестве зондов, способных гибридизироваться с комплементарной последовательностью синтазы, либо посредством использования их в качестве праймеров для различных методов амплификации, например, для проведения клонирования с помощью полимеразной цепной реакции (РСК).
Техника гибридизации и процедуры скрининга хорошо известны специалистам и описаны, например, АикиЬе1 е! а1. (см. выше) и Вегдег & К1тте1 (см. выше); Сйеп е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйук., 324:255, 1995; и 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, №\ν Уогк. Если необходимо, то может быть использована комбинация различных олигонуклеотидных зондов для скрининга рекомбинантной ДНК-библиотеки. Олигонуклеотиды могут быть помечены обнаружимой меткой с помощью методов, известных специалистам, и использованы для зондирования реплик на фильтрах, полученных от рекомбинантной ДНК-библиотеки. Рекомбинантные ДНК-библиотеки получали методами, хорошо известными специалистам, например, методами, описанными АикиЬе1 е! а1. (см. выше), либо они могут быть получены в готовом виде из коммерческих источников.
Как обсуждалось выше, олигонуклеотиды синтазы могут быть также использованы в качестве праймеров в стратегии клонирования путем амплификации, например, с использованием РСК. РСК-методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в РСК Тесйпо1оду, Егйсй еб., 8!оск!оп Ргекк, Ьопбоп, 1989; РСК Рго!осо1к: А Сшбе !о Ме!йобк апб Аррйсайопк, 1ппк е! а1., ебк., Асабетк Ргекк, 1пс., №\ν Уогк, 1990; и АикиЬе1 е! а1. (см. выше). Праймеры конструируют, но необязательно, для клонирования амплифицированного продукта в подходящий вектор, например, путем встраивания соответствующих рестрикционных сайтов в 5'- и З'-концы амплифицированного фрагмента (как описано в настоящей заявке). Если необходимо, то ген синтазы может быть выделен с использованием РСК.-техники «КАСЕ» или «Быстрой амплификации кДНК-концов» (Кар1б Атрййсабоп о£ с^NА Епбк) (см., например, выше, 1пшк е! а1.). С помощью этих методов олигонуклеотидные праймеры, полученные исходя из последовательности синтазы, ориентировали в 3'- и 5'направлениях, и использовали для генерирования перекрывающихся РСЯ-фрагментов. Эти перекрывающиеся 3'- и 5'-концевые КАСЕпродукты комбинировали для продуцирования интактной полноразмерной кДНК. Этот метод описан 1пшк е! а1. (см. выше); и Бгойтап е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 85:8998, (1988).
Используемые последовательности синтазы могут быть выделены из любого подходящего организма. Подтверждение родства последовательностей с полипептидом синтазы может быть получено с использованием ряда стандартных методов, например, путем сравнения последовательностей. Кроме того, активность любого белка синтазы может быть оценена любыми методами, описанными в настоящей заявке.
Экспрессия полипептида химерной изопреноидсинтазы
Полипептиды химерной синтазы могут быть получены путем трансформации подходящей клетки-хозяина всей или частью ДНК химерной синтазы (например, кДНК химерной синтазы, описанной выше) в подходящем экспрессирующем векторе, или плазмидой, сконструированной для увеличения уровня экспрессии полипептида химерной синтазы ίη νίνο.
Специалистам в области молекулярной биологии известно, что для получения рекомбинантного белка могут быть использованы любые экспрессирующие системы широкого ряда. Конкретный вид клетки-хозяина не имеет решающего значения для настоящего изобретения. Химерный синтазный белок может быть продуцирован в прокариотическом хозяине, например, в клетках ТВ1 Ε.οοίί, или в эукариотическом хозяине, например, в 8ассйаготусск ссгсуыас, в клетках млекопитающих (например, в клетках СО8 1 или ΝΙΗ ЗТЗ), либо в любых растительных клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетки водорослей, различных видов деревьев, декоративных видов растений, видов плодовых деревьев умеренного пояса, видов плодовых деревьев тропического пояса, овощных растений, бобовых растений, однодольных растений, двудольных растений, либо в клетках любых растений, имеющих промышленное или сельскохозяйственное значение. Конкретными примерами подходящих растений-хозяев являются, но не ограничиваются ими, хвойные деревья, петуния, томаты, картофель, табак, АгаЫборкк (Резушка Таля), салатлатук, подсолнечник, масличный рапс, лен, хлопчатник, сахарная свекла, зерновые культуры, соя, люцерна, Мсбкадо (вид люцерны), лотос, Уфпа (вигна), огурец, морковь, баклажан, цветная капуста, хрен, ипомея, тополь, ореховые растения, яблоня, спаржа, рис, кукуруза, просо, лук, ячмень, ежа сборная, овес, рожь и пшеница.
Такие клетки могут быть получены из множества источников, включая Американскую коллекцию типовых культур (КосИапб, МО); или от любых компаний, занимающихся заготовкой зерна, например, Айсе Вигрсс 8ссб Со. (ХУагттйсг. РА), Рагк 8ссб Со. (Сгсспетооб, 8С) , 1ойппу 8ссб Со. (А1Ьош, МЕ), или №г111гир К1пд 8ссбк (НагкМ11с, 8С). Описание и источники подходящих клеток-хозяев также можно также найти в УакП Ι.Κ., Сс11 Си1!игс апб 8отайс Сс11 СспсОс оГ Р1ап!к, νο1 I, II, III. ЯаЬога!огу Ргоссбигск апб Тйск АррНсаОопк Асабстк Ргскк, №\ν Уогк, 1984; О1хоп, Р.А., Р1ап! Сс11 Си1!игс-А Ргас(1са1 Арргоасй, [РЯ Ргскк, ОхЯогб ипщсгкйу, 1985; Сгссп с! а1., Р1ап1 Тккис апб Сс11 Си1!игс, Асабстк Ргскк, №\ν Уогк, 1987; и Сакксг & Бга1су, 8скпсс 244:1293, (1989).
Для экспрессии в прокариотических клетках, ДНК, кодирующую химерный полипептид синтазы, вводили в вектор, правильно присоединенный к регуляторной сигнальной последовательности, способной к эффективной экспрессии в прокариотическом хозяине. Если необходимо, то эта кодирующая последовательность может в своем 5'-конце содержать последовательность, кодирующую любую из известных сигнальных последовательностей, обеспечивающих эффективную секрецию экспрессированного белка в периплазматическое пространство клетки-хозяина, что значительно облегчает выделение белка и его последующую очистку. Наиболее часто используемыми прокариотами являются различные штаммы Е.сой, однако, могут быть также использованы и другие микробные штаммы. Были использованы плазмидные векторы, которые содержат сайты инициации репликации, селектируемые маркеры и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с микробным хозяином. Примеры таких векторов описаны в работах Рои\ус1к с! а1. (см. выше) или АикиЬс1 с! а1. (см. выше). В настоящем описании под обычно используемыми прокариотическими регуляторными последовательностями (также называемыми «регуляторными элементами») подразумеваются промоторы для инициации транскрипции (необязательно с оператором) вместе с последовательностями сайта связывания с рибосомой. Промоторами, обычно используемыми для направленной экспрессии белка, являются промоторы бета-лактамазы (пенициллиназы), промотор лактозы (1ас) (СЯапд с! а1., №-Щ1гс 198:1056 (1977)), промотор триптофана (Тгр) (Сосббс1 с! а1., №с1. Аабк. Иск. 8:4057 (1980)) и промоторные системы !ас, а также происходящий от фага лямбда промотор Ръ и сайт связывания с рибосомой Ν-гена (81та!акс с! а1., №!игс 292:128 (1981)).
Одной из конкретных бактериальных систем экспрессии полипептида химерной синтазы является экспрессирующая система рЕТ Е.сой (Шгадсп). В соответствии с этой экспрессирующей системой, ДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы, встраивают в вектор рЕТ в ориентации, способствующей экспрессии полипептида. Поскольку ген химерной синтазы находится под контролем регуляторных сигнальных последовательностей Т7, экспрессия химерной синтазы стимулируется путем индуцирования экспрессии РНК-полимеразы Т7 в клетке-хозяине. Это обычно достигается с ис пользованием штаммов-хозяев, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т7 в ответ на ГРТС-индукцию. После продуцирования рекомбинантный полипептид химерной синтазы выделяют стандартными методами, известными специалистам, например, методами, описанными в настоящей заявке.
Другой бактериальной экспрессирующей системой, подходящей для продуцирования полипептида химерной синтазы, является экспрессирующая система рСЕХ (Рйагтааа). В этой системе используется гибридная система гена С8Т, которая была сконструирована для осуществления высокого уровня экспрессии гена или его фрагмента с образованием гибридного белка с последующей быстрой очисткой и выделением функционального генного продукта. Нужный белок химерной синтазы объединяли с карбоксиконцом белка глутатион-3-трансферазы от 8с11й1о8ота _)арошсит, и легко выделяли из бактериальных лизатов с помощью аффинной хроматографии с использованием глутатионсефарозы 4В. Гибридные белки могут быть выделены в мягких условиях путем элюции глутатионом. Отщепление глутатион-3-трансферазы от гибридного белка облегчается присутствием сайтов распознавания для сайт-специфических протеаз, расположенных выше этого домена. Так, например, белки, экспрессированные в плазмидах рСЕХ-2Т, могут быть отщеплены тромбином, а белки, экспрессированные в плазмидах рСЕХ-ЗХ, могут быть отщеплены фактором Ха.
Для экспрессии в эукариотах способ трансформации или трансфекции, а также выбор вектора для экспрессии полипептида химерной синтазы будет зависеть от выбранной системы хозяина. Методы трансформации и трансфекции многочисленных организмов, например, пекарских дрожжей 8ассНаготусек сегссыас. описаны, например, в Аи8иЬе1 е! а1. (см. выше); АейкЬасН & АейкЬасй МеШобк Гог Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, Асабепис Ргекк, 1989; Сект е! а1., Р1аи1 Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1, К1тсег Асабепис РиЬНсйегк, 1990; Кшб1е, К., Ргос. Иаб. Асаб. 8с1 И8А 87:1228 (1990); Ро!гуки8, I., Аппи. Неу. Р1ап! РЬукюк Р1ап! Мо1. Вю1оду 42:205 (1991); и ВюЯаб (Негси1е8, СА) Тес1ниса1 Ви11е!ш # 1687 (ВюШбс Рагйс1е Ое1кегу 8у8!етк). Экспрессирующие векторы могут быть выбраны из векторов, описанных, например, в С1ошпд Уес!огк: А ЬаЬогаШгу Мапиа1 (Р.Н. Ротсей е! а1., 1985, 8ирр. 1987); Саккег апб Ега1еу (см. выше); С1оп1ес11 Мо1еси1аг Вю1оду Са!а1од (Са!а1од 1992/93 Тоо1к Гог 1Пе Мо1еси1аг В1о1од1к(, Ра1о А1!о, СА); и в работах, упомянутых выше.
Одной из предпочтительных эукариотических систем экспрессии является клетка-хозяин мышиного фибробласта ЗТЗ, трансфецированная экспрессирующим вектором рМАМпео (С1оп1ес11). Вектор рМАМпео содержит: энхансер Я8У-ЬТЯ, соединенный с дексаметазон индуцибельным промотором ММТУ-ЬТЯ; сайт инициации репликации 8У40, который обеспечивает репликацию в системах млекопитающих; селектируемый ген неомицина; и сайты сплайсинга 8У40 и полиаденилирования. ДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы, встраивают в вектор рМАМпео в ориентации, способствующей экспрессии. Затем рекомбинантный полипептид химерной синтазы выделяют, как описано ниже. Другими предпочтительными клетками-хозяевами, которые могут быть использованы в сочетании с экспрессирующим вектором рМАМпео, являются клетки Со8 и СНО (АтСС входящие №№ СЯЬ 1650 и ССЬ 61, соответственно).
Альтернативно, если необходимо, полипептид химерной синтазы продуцируют с помощью стабильно трансфецированной клеточной линии. Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, описан и известен специалистам, см., например, Ротсей е! а1. (см. выше); известны также методы конструирования таких клеточных линий, см., например, в Аи8иЬе1 е! а1. (см. выше). В одном примере, кДНК, кодирующую полипептид химерной синтазы, клонируют в экспрессирующий вектор, который включает ген дигидрофолат-редуктазы (ЭНЕЯ). Интеграцию плазмиды, и, тем самым, гена, кодирующего химерную синтазу, в хромосому клетки-хозяина, идентифицируют по включению 0,01-300 мкМ метотрексата в среде для культивирования клеток (как описано Аи8иЬе1 е! а1., см. выше). Такой доминантный отбор может быть осуществлен для большинства типов клеток. Уровень экспрессии рекомбинантного белка может быть увеличен путем ИНЕЯ-опосредованной амплификации трансфецированного гена. Методы отбора клеточных линий, несущих амплифицированный ген, описан Аи8иЬе1 е! а1. (см. выше); где указанные методы предусматривают, главным образом, выращивание культуры в среде, содержащей возрастающие уровни метотрексата. ИНЕЯ-содержащими экспрессирующими векторами, обычно используемыми в этих целях, являются рСУ8ЕП-ЭНгЕ и рАбИ268У(А), (описанные Аи8иЬе1 е! а1. (см. выше). Из клеток-хозяев, предпочтительных для ИНЕЯ-селекции стабильно трансфецированной или для ИНЕЯ-опосредованной амплификации гена, являются любые клетки-хозяева, описанные выше, или, предпочтительно, ИНЕЯдефицитная клеточная линия СНО (например, клетки ИНЕЯ--клетки СНО, АТСС вх.№ СЯЬ 9096).
Полипептид химерной синтазы продуцируют, предпочтительно, с использованием стабильно трансфецированной растительной клеточной линии или трансгенного растения. Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, описан и известен специалистам, см., например, Ротсей е! а1.
(см. выше), \Ус155Ьас11 & \Уе155Ьас11 (см. выше) и СеМп с1 а1. (см. выше) . Методы для конструирования таких клеточных линий описаны, например, \Уе155Ьас11 & \Уе155Ьас11 (см. выше) и Се1у|п е1 а1. (см. выше). Обычно растительные экспрессирующие линии включают (1) клонированный ген химерной синтазы, находящийся под транскрипционным контролем 5'- и 3'регуляторных последовательностей; и (2) доминантный селектируемый маркер. Такие растительные селектируемые экспрессирующие векторы могут также, если это необходимо, содержать промоторную регуляторную область (например, область, обеспечивающую индуцибельную или конститутивную экспрессию, либо экспрессию, регулируемую в зависимости от среды или стадии развития, либо экспрессию, индуцируемую патогеном или повреждением, либо клетко- или ткане-специфическую экспрессию), сайт инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомой, сигнал РНК-процессинга, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.
ДНК-последовательность химерной синтазы настоящего изобретения может быть объединена, если необходимо, с другими ДНКпоследовательностями различными путями. ДНК-последовательность химерной синтазы настоящего изобретения может быть использована со всеми генными последовательностями или их частичными последовательностями, обычно ассоциированными с белком синтазы. В этих составляющих частях, ДНКпоследовательность, кодирующую белок химерной синтазы, объединяют в ДНКконструкции, имеющей регуляторную область инициации транскрипции, способную стимулировать транскрипцию и трансляцию в клеткехозяине.
В основном эти конструкции включают регуляторные области, которые являются функциональными в растениях и которые обеспечивают продуцирование белка химерной синтазы, описанной в настоящей заявке. Открытая рамка считывания, кодирующая химерный белок синтазы или его функциональный фрагмент, может быть присоединена у своего 5'-конца к регуляторной области инициации транскрипции, такой как последовательность, обычно присутствующая выше (ближе к 5'-концу) области структурного гена синтазы. Существует ряд других областей инициации транскрипции, которые обеспечивают конститутивную или индуцибельную регуляцию.
Если необходимо обеспечить экспрессию, регулируемую в зависимости от стадии развития, клетко-специфическую экспрессию, тканеспецифическую экспрессию, гормоноспецифическую экспрессию, экспрессию, регулируемую в зависимости от среды, или экспрессию, индуцируемую патогеном, то соответствующую некодирующую область, расположен ную выше (в направлении 5'), получают от других генов, например, от генов, регулируемых в стадии развития семян, в стадии развития эмбрионов, в стадии развития листьев, или в ответ на патоген.
В ДНК-конструкциях настоящего изобретения могут также присутствовать регуляторные области терминации транскрипции. Области терминации транскрипции могут обеспечиваться ДНК-последовательностью, кодирующей белок синтазы, или любой стандартной областью терминации транскрипции, происходящей от различных генных источников. Область терминации транскрипции может, предпочтительно, содержать, по крайней мере, 1-3 т.п.о. последовательности, расположенной от 3'-конца структурного гена, от которого происходит область терминации транскрипции. Такие генетически сконструированные растения могут быть использованы в промышленных или сельскохозяйственных целях, как описано ниже. Важно отметить, что настоящее изобретение может быть применено к голосемянным и покрытосемянным растениям, и может быть легко применено в любых новых или усовершенствованных методах трансформации или регенерации растений.
Примером растительного промотора, который может быть использован в настоящем изобретении, является промотор колимовируса, например, промотор вируса мозаики цветной капусты (СаМУ). Эти промоторы обеспечивают высокие уровни экспрессии в большинстве растительных тканей, и активность этих промоторов не зависит от кодируемых вирусом белков. СаМУ является источником как для промотора 358, так и для промотора 198. В большинстве тканей трансгенных мышей, промотор 358 СаМУ является сильным промотором (см., например, Обе 11 е1 а1., №11иге 313:810 (1985)). Промотор СаМУ является также в высокой степени активным в однодольных растениях (см., например, Эекеу^ег е1 а1., Р1ап! Се11 2:591 (1990); Тегаба & 81итато1о. Мо1. Сеп. СепеЕ 220:389 (1990)). Кроме того, активность этого промотора может быть усилена (то есть, в 2-10 раз) путем дублирования промотора 358 СаМУ (см., например, Кау еЕ а1., 8с1епсе 236:1299 (1987); О\у еЕ а1., Ргос. ЫаЕ1. Асаб. 8ск И8Л 84:4870 (1987); и Еаид еЕ а1., Р1апЕ Се11 1:141 (1989)).
Другими эффективными растительными промоторами являются, но не ограничиваются ими, промотор нопалин-синтазы (Ап е1 а1., Р1апЕ РЬу8ю1. 88:547 (1988)) и промотор октапин синтазы (Еготт е1 а1., Р1апЕ Се11 1:977 (1989)).
Для некоторых применений может оказаться желательным продуцировать продукт гена химерной синтазы в соответствующей ткани, на соответствующем уровне или на соответствующей стадии развития. Для этой цели имеется ассортимент генных промоторов, каждый из которых имеет собственные отличительные свойства включения в свои регуляторные последовательности, и регуляция которых, как было показано, зависит от окружающей среды, присутствующих гормонов и/или стадии развития. Такими промоторами являются генные промоторы, которые ответственны за терморегулируемую экспрессию генов (см., например, СаШз е! а1., Р1ап! Рйумок 88:965 (1988); Такайазй1 & Котеба, Мо1. Сеп. Сепе!. 219:365 (1989); и Такайайн е! а1., Р1ап! 1. 2:751 (1992)), фоторегулируемую экспрессию гена (например, промотор гЬс8-3А гороха, описанный Кий1ете1ег е! а1., (Р1ап! Се11 1:471 (1989); промотор гЬс8 кукурузы, описанный 8сйаГГпег & 8йееп. Р1ап! Се11 3:997 (1991); промотор гена белка, связывающегося с хлорофиллом а/Ь, присутствующего в горохе и описанного 81трзоп е! а1. (ЕМВО 1. 4:2723 (1985)), гормонорегулируемую экспрессию гена (например, последовательности, восприимчивые к абсцизовой кислоте (АВА), от гена Ет пшеницы, и описанные Магсо!!е е! а1. (Р1ап! Се11 1:969 (1989)); АВАиндуцибельные промоторы НУА1 и НУА22, и промоторы гб29А для ячменя и АгаЫборзй, описанные 8!гаиЬ е! а1. (Р1ап! Се11 6:617 (1994), 8йеп е! а1. (Р1ап! Се11 7:295 (1994)), и индуцируемую повреждениями экспрессию гена (например, промотор гена \\11пк описанный 81еЬеПх е! а1. (Р1ап!. Се11 1:961 (1989)), или органспецифическую экспрессию гена (например, клубне-специфический промотор гена запасного белка, описанный Ро5йа1 е! а1. (ЕМВО 1., 6:1155 (1987)); промотор гена 23 кДа-зеина кукурузы, описанный 8сйегп!йапег е! а1. (ЕМВО 1., 7:1249 (1988)); и промотор гена β-фазеолина фасоли обыкновенной, описанный ВщЮк е! а1. (Р1ап!. Се11 1:839 (1989)); и индуцируемую патогеном экспрессию гена, описанную Сйарре11 е! а1., в И8 8ег. Хоз. 08/471983, 08/443639 и 08/577483, где указанные работы вводятся в настоящее изобретение посредством ссылки.
Растительные экспрессирующие векторы могут также, но необязательно, содержать сигналы РНК-процессинга, например, интроны, которые, как было обнаружено, играют важную роль для эффективного синтеза и аккумуляции РНК (СаШз е! а1., Сенек апб 1)е\. 1:1183 (1987)). Локализация последовательностей РНКсплайсинга может оказывать существенное влияние на уровень экспрессии трансгена в растениях. Учитывая этот факт, для модуляции уровней экспрессии гена, интрон может быть введен выше или ниже последовательности, кодирующей полипептид химерной синтазы в трансгене.
Помимо вышеуказанных 5'-регуляторных последовательностей, экспрессирующие векторы могут также включать регуляторные области, которые, обычно, присутствуют в 3'областях генов растений (ТйогпЬигд е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А 84:744 (1987); Ап е! а1., Р1ап! Се11 1:115 (1989)). Так, например, 3' область терминатора может быть включена в экспрессирующий вектор для повышения стабильности мРНК. Одна из таких областей терминатора может происходить от области терминатора Р1-11 картофеля. Кроме того, другие обычно используемые терминаторы происходят от сигнальных последовательностей октопинили нопалин-синтазы.
Обычно растительные экспрессирующие векторы также содержат доминирующий селективный маркерный ген, используемый для идентификации тех клеток, которые были трансформированы. Селектируемыми генами, обычно используемыми для растительных систем, являются гены, несущие устойчивость к антибиотикам, например, гены, кодирующие устойчивость к гигромицину, канамицину, блеомицину, С418, стрептомицину или спектиномицину. Гены, необходимые для фотосинтеза, могут быть также использованы в качестве селектируемых маркеров в дефектных по фотосинтезу штаммах. Альтернативно, в качестве селектируемого маркера может быть использован белок, продуцирующий флуоресценцию в зеленом диапазоне света, и происходящий от медузы Аесщогеа ую!опа (8йееп е! а1., Р1ап! 1. 8:777 (1995); Сй1и е! а1., Сиггеп! Вю1оду 6:325 (1996)). И наконец, в качестве селектируемых маркеров могут быть использованы гены, кодирующие устойчивость к гербицидам, где такими генами устойчивости к гербицидам являются ген Ьаг, кодирующий фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу и несущий устойчивость к гербицидам широкого спектра Ваз!а® (Ноесйз! АС, ЕгапкГип, Сегтапу).
Эффективное использование селектируемых маркеров облегчается путем определения восприимчивости клетки растения к конкретному селектируемому агенту и путем определения концентрации того агента, который способен эффективно уничтожать, если не все, то большинство трансформированных клеток. Некоторыми эффективными концентрациями антибиотиков для трансформации табака являются, например, 75-100 мкг/мл (канамицина), 25-50 мкг/мл (гигромицина) или 5-10 мкг/мл (блеомицина). Эффективная стратегия для отбора трансформантов на устойчивость к гербицидам описана, например, Уакб е! а1. (см. выше).
Каждому специалисту в области молекулярной биологии, особенно в области молекулярной биологии растений, известно, что уровень экспрессии гена зависит не только от комбинации промоторов, сигналов РНК-процессинга и элементов терминатора, но и также от того, каким образом эти элементы используются для повышения уровней экспрессии селектируемого маркерного гена.
Трансформация растений
После конструирования растительного экспрессирующего вектора могут быть использованы некоторые стандартные методы введе ния этого вектора в растение-хозяина, в результате чего будет продуцироваться трансгенное растение. Такими методами являются (1) трансформация, опосредованная агробактерией (А. ШтеГааепк А. или гЫходепек) (см., например, ЬюЙеп51ет & Еи11ег, СепеИс Епдшеегтд, νοί 6, Ρ\νΐ КгдЬу, еб, Ьопбоп. Асабетю Ргекк, 1987; и ЫсЙеп5!ет, С.Р. & Эгарег, 1, ΌΝΑ С1оптд, Уо1 II, Ό.Μ. С1о\'ег еб, ОхГогб, ΙΚ.Ι Ргекк, 1985), (2) система доставки частиц (см., например, Согбоп-Кашт е1 а1., Р1ап! Се11 2:603 (1990); или ВюИаб Тес1нпса1 Ви11еИп 1687, см. выше), (3) схема микроинъекций (например, Сгееп е1 а1., см. выше), (4) процедуры с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) (см., например, Эгарег е1 а1., Р1ап! Се11 РЬ18ю1. 23:451 (1982); или, например, ΖΠΗίβ & νυ, Тйеог. Арр1. Сепе1. 76:835 (1988)), (5) внедрение ДНК с помощью липосом (см., например. Егеетап е1 а1., Р1ап1 Се11 Р1пкю1. 25:1353 (1984), (6) методы электропорации (см., например, СеМп е1 а1., см. выше; Эекеукег е1 а1., см. выше; Еготт е1 а1., №Циге 319:791 (1986); 8йееп, Р1ап1 Се11 2:1027 (1990); или 1апд & 8йееп, Р1ап! Се11 6:1665 (1994)), и (7) метод интенсивного перемешивания (например, Кш61е, см. выше). Метод трансформации не играет решающего значения для настоящего изобретения. Может быть использован любой метод, который приводит к эффективной трансформации. При появлении более новых методов трансформации культур или других клеток-хозяев, эти методы также могут быть непосредственно использованы.
Ниже приводится пример одного конкретного метода, а именно, метода трансформации растений с помощью агробактерий. В этом методе основной процесс модификации генов для их переноса в геном растительных клеток осуществляется в две стадии. Сначала осуществляют стадии клонирования и модификации ДНК в Е.сой, и плазмиду, содержащую нужную генную конструкцию, переносят путем конъюгации или электропорации в агробактерию (АдгоЬас1егшт). Затем, полученный штамм АдгоЬас1егшт используют для трансформации растительных клеток. Таким образом, для продуцирования обобщенного растительного экспрессирующего вектора, получают плазмиду, содержащую сайт инициации репликации, который позволяет ей реплицироваться в АдгоЬас1егшт с высоким числом копий сайта инициации репликации, и который является функциональным в Е.соИ. Это позволяет облегчить продуцирование и тестирование трансгенов в Е.сой до переноса в АдгоЬас1епит для последующего введения в растения. В этом векторе могут присутствовать гены устойчивости, а именно, один ген, который необходим для отбора в бактерии, например, ген устойчивости к стрептомицину, а другой ген, который функционирует в растениях, например, ген, кодирующий устойчивость к канамицину или гербициду. Кроме того, в этом векторе при сутствуют сайты рестриктирующих эндонуклеаз для встраивания одного или нескольких трансгенов и пограничных направляющих последовательностей Т-ДНК, которые, при распознавании функциями переноса АдгоЬас1егшт, определяют границы ДНК-области, которая будет перенесена в растение.
В другом примере растительные клетки могут быть трансформированы путем «выстреливания» в эти клетки вольфрамовых микрочастиц, на которых присутствует осажденная клонированная ДНК. Биобаллистический аппарат (Вю-Яаб), используемый для такого выстреливания «порохового» заряда (заряд для пистолета калибра 22, Ро\\ег РЫоп Тоо1 Сйагде), или воздуходувка, выстреливает пластиковый макроснаряд через дуло пистолета. Аликвоту суспензии вольфрамовых частичек, на которые осаждают ДНК, помещают перед пластиковым макроснарядом. Этот макроснаряд выстреливается в акриловое заграждение в виде пластины, имеющей сквозное отверстие, которое слишком мало для того, чтобы через него мог пройти макроснаряд. В результате этого, пластиковый макроснаряд ударяется о заграждение, и вольфрамовые микрочастицы направляются к своей мишени через отверстие в пластине. Для настоящего изобретения такой мишенью может быть любая растительная клетка, ткань, семя или эмбрион. ДНК, введенная в клетку на макрочастицах, интегрируется либо в ядро, либо в хлоропласт.
В настоящее время перенос и экспрессия трансгенов в растительные клетки являются, в основном, стандартными методами, используемыми специалистами в этой области, и, кроме того, существует множество методов для осуществления исследований экспрессии генов в растениях, и для получения улучшенных сортов растений, представляющих агрономический или коммерческий интерес.
Регенерация трансгенных растений
Растительные клетки, трансформированные эксрессирующими векторами, могут быть регенерированы, например, из одной клетки, ткани каллуса или дисков листьев в соответствии со стандартной техникой культивирования растительной ткани. Каждому специалисту хорошо известно, что различные клетки, ткани и органы почти от любого растения могут быть с успехом культивированы и регенерированы в целое растение, и методы такой регенерации описаны, например, УакИ, см. выше; Сгееп е1 а1., см. выше, ’№е155Ьасй & ТСе^кЬасН, см. выше; и СеМп е1 а1., см. выше.
В одном из конкретных примеров клонированный полипептид химерной синтазы под контролем промотора ЕА84 и терминатора нопалин-синтазы, с селектируемым маркером (например, геном устойчивости к канамицину) трансформируют в АдгоЬас1егшт. Трансформацию дисков листьев (например, дисков листьев табака) вектор-содержащей агробактерией осуществляют как описано Ногксй е! а1. (8с1епсе 227:1229 (1985)). Через несколько недель (например, через 3-5 недель) предполагаемые трансформанты отбирают на среде для культивирования тканей, содержащей канамицин (например, 100 мкг/мл). Затем канамицинрезистентные всходы помещают на среду для культивирования растительной ткани, не содержащую гормонов для инициации роста корней. Затем канамицин-резистентные растения отбирают для выращивания в теплице. Если необходимо, то семена от самоопыляющихся трансгенных растений могут быть засеяны в беспочвенную среду и выращены в теплице. Канамицин-резистентное потомство может быть отобрано путем посева поверхностно стерилизованных семян на среду, содержащую канамицин и не содержащую гормонов. Анализ на интеграцию трансгена осуществляют стандартными методами (например, методами, описанными АикиЬе1 е! а1., см выше; СеМп е! а1., см. выше).
Затем трансгенные растения, экспрессирующие селектируемый маркер, скринируют на передачу трансгенной ДНК с помощью стандартного иммуноблоттинга и стандартными методами детекции ДНК. Каждое положительное трансгенное растение и его трансгенное потомство является уникальным при его сравнении с другими трансгенными растениями, полученными с тем же самым трансгеном. Интеграция трансгенной ДНК в геномную ДНК растения является, в большинстве случаев, произвольной, и сайт интеграции может в значительной степени влиять на уровни экспрессии и характер тканеспецифичности и стадиеспецифичности трансгена. Затем ряд трансгенных линий обычно скринируют для каждого трансгена в целях идентификации и отбора растений с наиболее приемлемыми профилями экспрессии.
Трансгенные линии обычно оценивают на уровни экспрессии трансгена. Сначала определяют экспрессию на РНК-уровне для идентификации и количественной оценки положительных по экспрессии растений. Стандартной техникой для РНК-анализа, которая может быть применена для этих целей, являются анализы методом РСВ-амплификации с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для амплификации только трансгенных РНКматриц, и анализы методами гибридизации в растворе с использованием трансген-специфических зондов (например, АикиЬе1 е! а1., см выше). Затем РНК-положительные растения анализируют на экспрессию белка с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием специфических антител против химерной синтазы (например, АикиЬе1 е! а1., см выше). Кроме того, для определения локализации областей экспрессии в трансгенных тканях, в соответствии со стандартной техникой, могут быть осуществлены ίη кйи-гибридизация и иммуноцитохимиче ский анализ с использованием трансгенспецифических нуклеотидных зондов и антител, соответственно.
После экспрессии рекомбинантного белка химерной синтазы в любой клетке или в трансгенном растении (например, описанном выше), этот белок может быть выделен, например, с использованием аффинной хроматографии. В одном из примеров антитело против химерной синтезы (продуцированное, как, например, описано АикиЬе1 е! а1., см. выше, или любым стандартным способом) может быть связано с колонкой и использовано для выделения полипептида. Перед проведением аффинной хроматографии может быть осуществлен лизис и фракционирование клеток, продуцирующих химерную синтазу, с использованием стандартной техники (например, АикиЬе1 е! а1., см. выше). После выделения рекомбинантный белок может быть, если необходимо, дополнительно очищен с помощью высокоразрешающей жидкостной хроматографии (см., Иксйет, ЬаЬога!огу Тесйпищек Ιη ВюсйешШту Апб Мо1еси1аг Вю1оду, ебк., \Уогк апб Витбоп, Е1кеу1ет, 1980).
Эти общие методы экспрессии и очистки полипептида могут быть также использованы для продуцирования и выделения нужных фрагментов или аналогов химерной синтазы.
Использование
Описанное в настоящей заявке изобретение может быть использовано в различных сельскохозяйственных, фармацевтических, промышленных и коммерческих целях. Так, например, методы, ДНК-конструкции, белки и трансгенные микроорганизмы, включая бактерии, дрожжи и растения, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для усовершенствования способов синтеза, промышленного изготовления и продуцирования изопреноидов.
Результаты, представленные в настоящей заявке, показали, что можно модулировать активность изопреноид-синтазы путем получения химерных синтаз. В этом способе различные продукты синтазных реакций могут быть модифицированы, проконтролированы и соответствующим образом обработаны, что приводит к увеличению продуцирования различных продуктов синтазных реакций, например, продуцирования монотерпенов, дитерпенов и сесквитерпенов. Эти соединения могут быть использованы в качестве фитоалексинов, инсектицидов, ароматизирующих средств и фармацевтических препаратов, таких как противобактериальные и противогрибковые средства.
Может быть сконструирован ряд химерных изопреноид-синтаз, которые могут быть использованы, например, для продуцирования соединений, обладающих противогрибковыми, антибактериальными и противоопухолевыми свойствами. Так, например, для продуцирования химерных синтаз, способных катализиро вать продуцирование противогрибковых изопреноидов, С-концевой домен касбен-синтазы (Маи & Аез!, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8сЕ 91:8497, 1994) присоединяют к Ν-концу домена ТЕА8, НУ8 или СН9. Для продуцирования химерной синтазы, способно катализировать продуцирование антибактериальных соединений, Сконцевой домен циклофарнезенон-синтазы (НаЬ!егтапат е! а1., I. Ыа!. Ргоб. 56:140, 1993) присоединяют к Ν-концу домена ТЕА8, НУ8 или СН9. Противомалярийные соединения могут быть продуцированы с использованием химерных синтаз, имеющих С-концевой домен от артемизиан-синтазы (Е1-Еега1у е! а1., I. Ыа!. Ргоб. 52:196, 1989) и Ν-концевой домен от ТЕА8, НУ8 или СН9. Синтазы, способные продуцировать противоопухолевые соединения, получают путем присоединения С-концевого домена таксадиен-синтазы (Коерр е! а1., I. Вю1. СБет., 270:8686, 1995) или геленалин-синтазы (Ъее е! а1., 8с1епсе 196:533, 1977) к Ν-концевому домену ТЕА8, НУ8 или СН9.
Настоящее изобретение может быть также использовано для получения химерных синтаз, которые способны продуцировать инсектициды. Такие химерные синтазы могут быть сконструированы путем присоединения С-концевого домена кадинен-синтазы (СБеп е! а1., АгсБ. ВюсБет. ВюрБуз. 324:255, 1995) и Ν-концевому домену ТЕА8, НУ8 или СН9.
И наконец, химерные синтазы могут быть также использованы для получения новых отдушек и ароматизирующих средств. В одном из конкретных примеров, для получения новых отдушек и ароматизирующих средств, химерную синтазу конструируют путем присоединения С-концевого домена лимонен-синтазы (Со1Ьу е! а1., I. Вю1. СБет., 268:23016, 1993) к Сконцевому домену ТЕА8, НУ8 или СН9.
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, вводятся в него во всей своей полноте посредством ссылки так, как если бы каждая конкретная публикация или каждый конкретный патент был указан отдельно.
Другие варианты осуществления изобретения
Исходя из вышеприведенного описания, каждый специалист легко поймет главные отличительные признаки настоящего изобретения и может внести различные изменения и модификации, адаптированные к различным целям и условиям применения. Таким образом, другие варианты осуществления настоящего изобретения также входят в объем притязаний, сформулированных в нижеследующей формуле изобретения.
Список последовательностей (2) Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:1:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 30 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (χί) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:1:
СССАТССАТС АСАТАСССАС СТАТСАССТТ (2) Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:2:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 17 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (χί) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:2:
ААТАССАСТС АСТАТАС (2) Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:3:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 27 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (х1) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:3:
ССАСТСААСА ТССТТТАТТС АСССАТА Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:4: (ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 28 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (χί) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:4:
ТАТТСТАСАТ СТСТАТСАСС АТТАТСАА (2) Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:5:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 42 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (χί) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:5:
СССАССТССА АТТССАТССС СТСАССАССА СТТССАААСТ АТ (2) Данные последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:6:
(ί) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 30 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: ДНК (олигонуклеотид) (χί) Описание последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо:6:

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Химерная изопреноидсинтаза, содержащая домен первой изопреноидсинтазы, связанный с доменом второй гетерологичной изопреноидсинтазы, причем указанная химерная изопреноидсинтаза способна катализировать образование изопреноидного продукта реакции, который не образуется в отсутствие домена второй гетерологичной изопреноидсинтазы.
  2. 2. Химерная изопреноидсинтаза по п. 1, отличающаяся тем, что способна катализировать образование, по крайней мере, двух различных изопреноидных продуктов реакции.
  3. 3. Химерная изопреноидсинтаза по п. 1, отличающаяся тем, что домен второй гетерологичной изопреноидсинтазы содержит соотношение-определяющий домен указанной химерной изопреноидсинтазы.
  4. 4. Химерная изопреноидсинтаза по п. 1, отличающаяся тем, что она выбрана из группы, включающей (а) химерную изопреноидсинтазу СН4 Мсойапа-Нуоксуатик; (б) химерную изопреноидсинтазу СН10 Мсойапа-Нуоксуатик; (в) химерную изопреноидсинтазу СН11 ДюоБапаНуоксуатик; (г) химерную изопреноидсинтазу СН12 Мсойапа-Нуоксуатик; (д) химерную изопреноидсинтазу СН13 Мсойапа-Нуоксуатик; и (е) химерную изопреноидсинтазу СН14 ДюоОапа-Нуоксуатик.
  5. 5. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что катализирует образование противогрибкового агента.
  6. 6. Химерная изопреноидсинтаза по п.1, отличающаяся тем, что катализирует образование антибактериального агента.
  7. 7. Химерная изопреноидсинтаза по п. 1, отличающаяся тем, что катализирует образование противоопухолевого агента.
  8. 8. Химерная изопреноидсинтаза по п. 1, отличающаяся тем, что указанный домен первой изопреноидсинтазы происходит из растительной изопреноидсинтазы, и указанный домен второй гетерологичной изопреноидсинтазы происходит из растительной изопреноидсинтазы.
  9. 9. Химерная изопреноидсинтаза по п.3, отличающаяся тем, что указанный соотношениеопределяющий домен указанной химерной изопреноидсинтазы определяет соотношение изопреноидных продуктов реакции указанной химерной изопреноидсинтазы.
  10. 10. Последовательность ДНК, кодирующая химерную изопреноидсинтазу по п. 1.
  11. 11. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность ДНК по п. 10.
  12. 12. Линия клеток, содержащих последовательность ДНК по п.10, используемая для получения химерной изопреноидсинтазы по п. 1.
  13. 13. Линия клеток по п. 10, отличающаяся тем, что представляет собой линию клеток ЕксйспсЫа сой.
  14. 14. Способ получения химерной изопреноидсинтазы, предусматривающий осуществление следующих стадий:
    (а) получение линии клеток, содержащих последовательность ДНК по п.10, введенную в указанные клетки для обеспечения экспрессии химерной изопреноидсинтазы;
    (б) культивирование указанных клеток в условиях, подходящих для экспрессии указанной химерной изопреноидсинтазы; и (в) выделение химерной изопреноидсинтазы из указанных клеток или культуральной среды.
    мевалонат НМС-СоА · ацетил-СоА ψ Классы ΙΡΡ фенильная | группа Примеры цитокинин Функции регулятор роста ОРР -> монотерпены 1 ментол продуцирование запаха и аромата, взаимодействие растение-насекомое * -сесквитерпены РРР I ^*стеролы капсидиол взаимодействие растениепатоген камлостерол мембранная структура и функция ν лдитерпены гибберелловая 60РР кислота, касбен регулятор роста взаимодействие полипренолы долихолы, убихинон, каротиноиды растение-патоген гликозилирование электронный транспорт фотозащита
    Пренилтрансфераза
EA199800917A 1996-04-12 1997-04-11 Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы EA001622B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/631,341 US5824774A (en) 1996-04-12 1996-04-12 Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof
PCT/US1997/005986 WO1997038703A1 (en) 1996-04-12 1997-04-11 Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199800917A1 EA199800917A1 (ru) 1999-04-29
EA001622B1 true EA001622B1 (ru) 2001-06-25

Family

ID=24530791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199800917A EA001622B1 (ru) 1996-04-12 1997-04-11 Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5824774A (ru)
EP (2) EP1229122A3 (ru)
JP (4) JP2000508899A (ru)
KR (1) KR20000005385A (ru)
AP (1) AP808A (ru)
AR (1) AR006638A1 (ru)
AT (1) ATE223225T1 (ru)
AU (1) AU2726497A (ru)
BR (1) BR9708650A (ru)
CA (1) CA2250712C (ru)
CZ (1) CZ294613B6 (ru)
DE (2) DE904095T1 (ru)
EA (1) EA001622B1 (ru)
ES (1) ES2132046T3 (ru)
GR (1) GR990300025T1 (ru)
HK (1) HK1017275A1 (ru)
ID (1) ID19769A (ru)
IL (2) IL126486A0 (ru)
IN (1) IN186316B (ru)
OA (1) OA10895A (ru)
PL (1) PL329404A1 (ru)
PT (1) PT904095E (ru)
TR (1) TR199802043T2 (ru)
TW (1) TW509724B (ru)
WO (1) WO1997038703A1 (ru)
ZA (1) ZA973108B (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7186891B1 (en) * 1996-04-12 2007-03-06 University Of Kentucky, Research Foundation Plant cells and plants expressing chimeric isoprenoid synthases
US8106260B2 (en) * 1996-04-12 2012-01-31 The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof
US5824774A (en) * 1996-04-12 1998-10-20 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof
US5945726A (en) * 1996-12-16 1999-08-31 Micron Technology, Inc. Lateral bipolar transistor
AR022383A1 (es) 1998-09-18 2002-09-04 Univ Kentucky Res Found Sintasas
US20040005673A1 (en) * 2001-06-29 2004-01-08 Kevin Jarrell System for manipulating nucleic acids
US6358712B1 (en) 1999-01-05 2002-03-19 Trustee Of Boston University Ordered gene assembly
JP2002537762A (ja) * 1999-01-05 2002-11-12 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 改良型核酸クローニング
US20030033626A1 (en) 2000-07-31 2003-02-13 Hahn Frederick M. Manipulation of genes of the mevalonate and isoprenoid pathways to create novel traits in transgenic organisms
US7405057B2 (en) 2001-03-09 2008-07-29 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Cytochrome P450s and uses thereof
AU2013204829B2 (en) * 2001-03-09 2013-07-04 University Of Kentucky Research Foundation Cytochrome P450s and uses thereof
AU2012202780B2 (en) * 2001-03-09 2014-07-03 University Of Kentucky Research Foundation Cytochrome P450s and Uses Thereof
US7192751B2 (en) * 2001-12-06 2007-03-20 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of amorpha-4,11-diene
US7172886B2 (en) 2001-12-06 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
US7442785B2 (en) * 2003-07-24 2008-10-28 The University Of Kentucky Research Foundation Sesquiterpene synthase gene and protein
US8124811B2 (en) 2007-03-20 2012-02-28 Allylix, Inc. Fragrance and methods for production of 5-epi-β-vetivone, 2-isopropyl-6,10-dimethyl-spiro[4.5]deca-2,6-dien-8-one, and 2-isopropyl-6,10-dimethyl-spiro[4.5]deca-1,6-dien-8-one
AU2008260555B2 (en) 2007-06-01 2012-07-26 Sapphire Energy, Inc. High throughput screening of genetically modified photosynthetic organisms
NZ583701A (en) * 2007-09-11 2012-03-30 Sapphire Energy Inc Molecule production by photosynthetic organisms
WO2009036087A1 (en) 2007-09-11 2009-03-19 Sapphire Energy, Inc. Methods of producing organic products with photosynthetic organisms and products and compositions thereof
SG191671A1 (en) * 2007-12-13 2013-07-31 Danisco Us Inc Cultured cells that produce isoprene and methods for producing isoprene
US8034992B2 (en) * 2008-06-16 2011-10-11 Academia Sinica Gibberellin 2-oxidase genes and uses thereof
US8481286B2 (en) * 2008-08-12 2013-07-09 Allylix, Inc. Method for production of isoprenoid compounds
JP2013544084A (ja) 2010-10-29 2013-12-12 アリリクス・インコーポレイテッド 改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、コーディング核酸分子およびその使用
WO2013110191A1 (en) 2012-01-23 2013-08-01 The University Of British Columbia Abc trepenoid transporters and methods of using the same
JP5950253B2 (ja) * 2012-02-13 2016-07-13 住友ゴム工業株式会社 イソプレノイドの製造方法、及びイソプレノイド
US9353385B2 (en) 2012-07-30 2016-05-31 Evolva, Inc. Sclareol and labdenediol diphosphate synthase polypeptides, encoding nucleic acid molecules and uses thereof
ES2911701T3 (es) 2012-11-01 2022-05-20 Univ British Columbia Polipéptidos de citocromo P450 y citocromo P450 reductasa, moléculas de ácido nucleico codificantes y usos de los mismos
ES2647828T3 (es) 2013-03-14 2017-12-26 Evolva, Inc. Polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico que los codifican y usos de los mismos
CN111621508B (zh) * 2020-06-11 2022-07-01 云南中烟工业有限责任公司 烟草萜类合成酶NtTPS7基因及其载体与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6449794A (en) * 1993-04-02 1994-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Southern corn rootworm control with limonene
CA2118071C (en) * 1993-10-28 2004-09-14 Rodney B. Croteau Dna encoding limonene synthase from mentha spicata
US5824774A (en) * 1996-04-12 1998-10-20 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL126486A (en) 2006-04-10
US6072045A (en) 2000-06-06
ES2132046T3 (es) 2003-03-16
WO1997038703A1 (en) 1997-10-23
ID19769A (id) 1998-07-30
IL126486A0 (en) 1999-08-17
EP0904095B1 (en) 2002-09-04
TW509724B (en) 2002-11-11
AR006638A1 (es) 1999-09-08
AP9700971A0 (en) 1997-07-31
BR9708650A (pt) 1999-08-03
EP1229122A2 (en) 2002-08-07
AP808A (en) 2000-02-29
OA10895A (en) 2001-10-11
KR20000005385A (ko) 2000-01-25
EA199800917A1 (ru) 1999-04-29
GR990300025T1 (en) 1999-07-30
PL329404A1 (en) 1999-03-29
EP1229122A3 (en) 2002-10-09
HK1017275A1 (en) 1999-11-19
ZA973108B (en) 1997-11-04
ATE223225T1 (de) 2002-09-15
EP0904095A1 (en) 1999-03-31
JP2000508899A (ja) 2000-07-18
DE904095T1 (de) 1999-10-07
TR199802043T2 (xx) 1999-01-18
DE69715192D1 (de) 2002-10-10
IN186316B (ru) 2001-08-04
ES2132046T1 (es) 1999-08-16
AU2726497A (en) 1997-11-07
JP2012005499A (ja) 2012-01-12
CZ317998A3 (cs) 1999-02-17
DE69715192T2 (de) 2003-04-30
PT904095E (pt) 2002-12-31
CZ294613B6 (cs) 2005-02-16
EP0904095A4 (en) 1999-07-07
CA2250712A1 (en) 1997-10-23
US5824774A (en) 1998-10-20
JP2015057074A (ja) 2015-03-26
JP2015171387A (ja) 2015-10-01
CA2250712C (en) 2008-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA001622B1 (ru) Химерная изопреноидсинтаза, последовательность днк, экспрессирующий вектор, линия клеток и способ получения химерной изопреноидсинтазы
US20220267787A1 (en) Genetic locus imparting a low anatabine trait in tobacco and methods of using
Stirnberg et al. MAX2 participates in an SCF complex which acts locally at the node to suppress shoot branching
US8741651B2 (en) Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof
Sun et al. The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novo cytokinin biosynthesis
Huang et al. Variation of herbivore-induced volatile terpenes among Arabidopsis ecotypes depends on allelic differences and subcellular targeting of two terpene synthases, TPS02 and TPS03
Fleischmann et al. Nonessential plastid-encoded ribosomal proteins in tobacco: a developmental role for plastid translation and implications for reductive genome evolution
US7186891B1 (en) Plant cells and plants expressing chimeric isoprenoid synthases
Frank et al. Hormone autotrophic growth and differentiation identifies mutant lines of Arabidopsis with altered cytokinin and auxin content or signaling
WO1997038703A9 (en) Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof
US20220142228A1 (en) Tobacco plants having increased nitrogen efficiency and methods of using such plants
Keddie et al. Transposon tagging of the Defective embryo and meristems gene of tomato
SA113340251B1 (ar) حوافز لتفاعل تنشيط التعبير الجينى للنبات واستخدامها
CN111411123B (zh) 一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体
Ueda et al. Agrobacterium tumefaciens tumor morphology root plastid localization and preferential usage of hydroxylated prenyl donor is important for efficient gall formation
Haws TESTING THE INFLUENCE OF CYP83A1, CYP79F1, AND CYP79F2 IN AUXIN ACCUMULATION AND LATERAL ROOT INITIATION IN ARABIDOPSIS THALIANA
Chappell et al. Chimeric Isoprenoid Synthases and Uses Thereof
CN117858952A (zh) 编辑香蕉基因的方法
JP2004350692A (ja) イネのアントラニル酸シンターゼの第１アイソザイムαサブユニットをコードするＤＮＡの改変体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU