KR20000005385A

KR20000005385A - 키메라 이소프레노이드 신타제 및 그의 용도

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Publication number: KR20000005385A
Application number: KR1019980708111A
Authority: KR
Inventors: 채펠 조셉; 백경환
Original assignee: 조셉 엘. 프린크 써드; 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 켄터키
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2000-01-25
Also published as: IL126486A; US6072045A; ES2132046T3; WO1997038703A1; ID19769A; IL126486A0; EA001622B1; EP0904095B1; TW509724B; AR006638A1; AP9700971A0; BR9708650A; EP1229122A2; AP808A; OA10895A; EA199800917A1; GR990300025T1; PL329404A1; EP1229122A3; HK1017275A1

Abstract

본원은 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제(second, heterologous isoprenoid synthase)로부터의 제 2 도메인에 연결된 제 1 이소프레노이드 신타제로부터의 제 1 도메인을 포함하여, 제 2의 이종 이소프레노이드의 제 2 도메인이 없으면 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드를 개시한다. 또한 본 발명은 비대칭적으로 위치된 동종 도메인들(asymmetrically positioned homologous domain)을 포함하여, 키메라 이소프레노이드 신타제가 상기 도메인이 상기 키메라 이소프레노이드 신타제내의 그의 본래의 부위에 있을 때에는 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드도 개시한다.

Description

키메라 이소프레노이드 신타제 및 그의 용도

[연방정부의 후원 연구에 대한 설명]

본 발명은 연방정부의 일부 투자에 의해 성안되었으므로, 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.

이소프레노이드(isoprenoid)란 용어는 이소프렌 빌딩 블록으로부터 유래된 화합물 군을 뜻하는 것으로 사용된다. 특히, 식물 이소프레노이드는 일차 및 2차 대사산물의 클래스들로 분류될 수 있는 구조적으로 다양한 그룹의 화합물들을 포함한다(도 1). 1차 대사산물인 이소프레노이드들은 스테롤, 카로티노이드, 성장조절제(growth regulators) 및 돌리콜(dolichols), 퀴논, 및 단백질들의 폴리프레놀 치환체(polyprenol substituents)들을 포함한다. 이들 화합물들은 각각 막 완전성(membrane integrity), 광보호(photoprotection), 발생 프로그램들의 조화(orchestration of developmental programs), 및 특이한 막 시스템에 대한 필수 생화학 기능들의 부착에 필수적이다. 2차 대사산물로 분류되는 이소프레노이드는 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 및 디테르펜을 포함한다. 이들 화합물들은 식물과 그의 환경 사이의 중요한 상호작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 특수한 테르페노이드들은 식물-식물(Stevens, In : Isopentoids in Plants, Nes, W.D. Fuller, G., and Tsai, L.-S., eds., Marcel Dekker, New York, pp. 65-80, 1984), plant-insect(Gibson and Pickett, Nature 302:608,1983), 및 식물-병원체 상호작용(Stoessl et al., Phytochemistry 15:855, 1976)에 관련된다.

이러한 다양한 배열의 화합물들의 공통분모는 보편적인 5-탄소 빌딩 블록( five-carbon building blocks), 이소프렌이다. "생체 이소프렌 룰(biogenic isoprene rule)"은 이소프렌으로부터 유래되는 모든 테르펜들의 생합성 근원을 이론적으로 설명하기 위해 이용되었다(Ruzicka, Experientia 10:357, 1953). 두 가지의 디포스포릴레이티드 이소프렌 빌딩 블록들(예컨대, IPP, 및 디메틸알릴)은 모노테르펜인 고리형 또는 선형 최종-생성물로 전환되거나 다른 라운드의 중합에 이용될 수 있는 제라닐 디포스페이트(GPP), 선형 C10 중간생성물을 생성한다. GPP에 대한 세 번째 이소프렌 단위의 부가는 파네실 디포스페이트(FPP)를 생성하는데, 이것은 세스퀴테르펜 클래스인 고리형 또는 선형 생성물로 전환된다. 중합 및 화학적 분화 사이클(chemical differentiation cycle)을 계속하면 그들의 생합성 과정에 들어간 이소프렌 빌딩 블록의 수에 따라 명명되는 다른 클래스의 테르페노이드들이 생성되는데, 예를 들어, FPP에 대한 세 번째 IPP의 부가는 제라닐제라닐 디포스페이트(GGPP)를 생성한다.

이러한 중합 반응들은 IPP 분자상의 이중결합의 전자-풍부 탄소원자(electron-rich carbon atom)에 대한 카르보 양이온(carbocation; 하나의 기질의 디포스페이트 부분의 상실에 의해 전자가 부족하게 된 양전하를 띄고 있는 탄소원자)의 공격을 지시하는 프레닐트랜스페라제(prenyltransferase)에 의해 촉매된다(도 2). 이러한 반응들의 친전자성(electrophilic nature)은 보다 일반적인 핵친화성 축합반응(nucleophilic condensation reactions)에 비해 특이하지만, 이소프레노이드 생합성 효소들, 특히 여러 가지 이소프레노이드 중간생성물의 고리화를 촉매하는데 관여하는 효소들 사이에는 흔한 반응으로 보인다(Gershenzon and Croteau, In : Lipid Metabolism in Plants, Moore, T.S., ed., CRC Press, Boca Raton, FL, PP. 340-388). GPP, FPP, 및 GGPP의 고리화를 담당하는 효소들은 각각 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 및 디테르펜 신타제(synthase)로 불리우고, 각각 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 및 디테르펜 클래스에서 일반적인 이소프레노이드 경로로부터 탄소를 최종 생성물로 보내는 반응을 담당한다.

프레닐트랜스페라제와 신타제 사이의 두 가지 중요한 생화학적 차이점이 도 2에 도시되어 있다. 프레닐트랜스페라제는 두 개의 기질 분자들 사이의 탄소-탄소 결합 형성을 촉매하는데 반하여, 신타제는 분자내 탄소-탄소 결합(intramolecular carbon-carbon bond) 형성을 촉매한다. 프레닐트랜스페라제는 또한 그 다음의 중합체의 입체화학 또는 길이 사이에 변화가 매우 적은 반응을 촉매한다. 프레닐트랜스페라제는 반응의 개시에 허용될 수 있는 알릴형 기질의 길이가 다르다. 신타제도 기질 특이적이다. 그러나, 다양한 세스퀴테르펜 신타제들은, 예를 들어, 동일한 기질을 이용하여 상이한 반응생성물을 만들어 낼 수 있다.

고리형 테르펜과 같은 이소프레노이드의 생합성은 테르펜 신타제라고 하는 중요한 분지점 효소들(branch point enzyame)에 의해 결정된다고 한다. 테르펜 신타제에 의해 촉매되는 반응들은 몇몇 부분 반응(partial reactions)들을 포함하는 복잡한 세포내 고리화이다. 예를 들어, 두 개의 세스퀴테르펜 신타제에 의한 FPP의 고리화의 생물유기화학적 설명을 도 3에 도시하였다. 단계 1에서, FPP의 최초의 이온화 이후에 디포스페이트 부분을 포함하는 탄소와 원위 이중결합 사이의 분자내 친전자성 공격이 이어져 거대고리형 중간생성물인 게르마크렌 A(germacenc A)가 생성된다. 단계 2에서는 내부 고리가 닫히고 유데스메인 카르보니움 이온(eudesmane carbonium ion)이 생성된다. 담배 5-에피-아리스톨로첸 신타제(TEAS)의 경우에, 최종 단계는 도 3a에 도시된 바와 같이, 수소 음이온 옮김, 메틸기 이동, 및 C9에서의 탈양성자화에 의한 5-에피-아리스톨로첸의 생성이다. 히오스시아무스 무티쿠스 베티스피라디엔 신타제(HVS; Hyoscyamus muticus vetispiradiene synthase)는 단계 1 및 단계 2는 공통적으로 거치지만, 3 번째 부분 반응은 TEAS와 다른데, 전자쌍의 대체 이동(alternative migration)에 의해 고리 축소(ring contraction)가 일어난다. 각각의 경우에, 약 64kD의 단량체 단백질이 전체 세트의 부분 반응들을 촉매하고 Mg⁺²이외의 보조인자를 필요로 하지 않는다.

[발명의 요약]

일반적으로, 본 발명은 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제(second, heterologous isoprenoid synthase)로부터의 제 2 도메인에 연결된 제 1 이소프레노이드 신타제로부터의 제 1 도메인을 포함하여, 제 2의 이종 이소프레노이드의 제 2 도메인이 없으면 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 바람직한 구현예에 있어서, 키메라 이소프레노이드 신타제는 적어도 두 가지의 상이한 이소프레노이드 반응 생성물을 촉매할 수 있고; 이소프레노이드 반응생성물은 고리형이며; 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제의 제 2 도메인은 키메라 이소프레노이드 신타제의 생성물들의 이소프레노이드 반응생성물의 비율을 결정하고; 제 1 이소프레노이드 신타제로부터의 제 1 도메인은 식물 이소프레노이드 신타제이고 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제로부터의 제 2 도메인도 식물 이소프레노이드 신타제이다.

바람직하게, 키메라 이소프레노이드 신타제는 (a) 담배-히오스시아무스 CH4 키메라 이소프레노이드 신타제; (b) 담배-히오스시아무스 CH10 키메라 이소프레노이드 신타제; (c) 담배-히오스시아무스 CH11 키메라 이소프레노이드 신타제; (d) 담배-히오스시아무스 CH12 키메라 이소프레노이드 신타제; (e) 담배-히오스시아무스 CH13 키메라 이소프레노이드 신타제; (f) 담배-히오스시아무스 CH14 키메라 이소프레노이드 신타제로 구성되는 군으로부터 선택된다.

바람직한 구현예에 있어서, 키메라 이소프레노이드 신타제는 농업적, 약품적, 상업적, 또는 산업적 중요성을 갖는 이소프레노이드 반응 생성물(예컨대, 항진균제, 항균제 또는 항종양제)의 생산을 촉매한다.

다른 관련 양상에 있어서, 본 발명은 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드들을 코드화하거나 포함하는 DNA, 벡터, 및 세포들(예를 들어, 이, 콜라이(E. coli), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 동물 또는 식물 세포들)을 특징으로 한다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 비대칭적으로 위치된 동종 도메인들(asymmetrically positioned homologous domain)을 포함하여, 키메라 이소프레노이드 신타제가 상기 도메인이 키메라 이소프레노이드 신타제내의 그의 본래의 부위(naturally-occurring site)에 있을 때에는 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물(바람직하게, 고리형 생성물)의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드를 특징으로 한다.

또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 (a); 세포내에서 발현하도록 위치된 키메라 이소프레노이드 신타제를 코드화하는 DNA로 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 세포를 DNA 발현을 위한 조건하에서 배양하는 단계; 및 (c) 키메라 이소프레노이드 신타제를 회수하는 단계를 포함하는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드의 제조방법을 특징으로 한다.

본 발명에서 "이소프레노이드 신타제"란 이소프레노이드 생성물(예컨대, 모노테르펜, 디테르펜, 세스퀴테르펜, 또는 스테롤 생성물)이 생성되도록 알릴성 디포스페이트 기질(예컨대, C₁₀, C₁₅, C₂₀알릴성 디포스페이트 기질)의 분자내 탄소-탄소 결합 생성을 포함하는 반응을 촉매할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 이소프레노이드 신타제의 예들은 각각 제라닐 디포스페이트(GPP), 파네실 디포스페이트(FPP), 및 제라닐제라닐 디포스페이트(GGPP)의 고리화를 담당하는, 모노테르펜 신타제(예컨대, 리모넨 신타제), 디테르펜 신타제(예컨대, 카스벤 신타제), 및 세스퀴테르펜 신타제(예컨대, 5-에피아리스톨로첸 신타제, 베티스피라디엔 신타제, 및 카디넨 신타제)를 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다. 식물 및 미생물로부터 수많은 테르펜 신타제들이 분리되었고 규명되었다(예를 들어, Moestra and West, Arch. Biophys. 238:325, 1985; Hohn and Van Middlesworth, Arch. Biochem. Biophys. 251:756, 1986; Hohn and Plattner, Arch. Biochem. Biophys. 272:137, 1989; Cane and Pargellis, Arch. Biochem. Biophys. 254:421, 1987; Munck and Croteau, Arch, Biochem. Biophys. 282:58, 1990; Alonso et al., J. Biol. Chem. 267:7582, 1992; Savage et al., J. Biol. Chem. 269:4012 1994; Croteau et al., Arch. Biochem. Biophys. 309: 184, 1994; Vogeli et al., Plant Physiol, 93:182, 1990: Guo et al., Arch. Biochem. Biophys. 308:103, 1994; 및 Gambliel and Croteau, J. Biol, Chem. 259:740, 1984 참조). 일반적으로, 테르펜 신타제들은 분자량이 약 40 내지 100 kD 정도 되는 가용성 효소들이다. 다수의 모노테르펜, 디테르펜, 세스퀴테르펜 신타제들을 코드화하는 유전자들이 다수의 식물 및 미생물 유기체에 대해서 기술되어 있다(예컨대, Hohn and Beremand, Gene 79:131, 1989;Proctor and Hohn, J. Biol. Chem. 268:4543, 1993; Facchini and Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11088, 1992; Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375, 1995; Colby et al., J. Biol. Chem. 268: 23016, 1993; Man and West, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8497, 1994; Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324:255, 1994; 및 Cane et al., Biochemistry 33: 5846, 1994 참조).

"폴리펩타이드" 또는 "단배질"은 길이 또는 해독후 변형(예컨대, 포도당화 또는 인산화)에 관계 없이 임의의 아미노산 쇄를 의미한다.

"-에 연결된(joined to)"이라 함은 양자가 직접 또는 간접으로 공유결합된(즉, 도메인들이 중간에 낀 아미노산 서열들에 의해 분리되어 있음) 것을 의미한다. 이러한 도메인들은 펩타이드 본드 또는 화학결합을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 임의의 수단에 의해 결합될 수 있다.

"도메인"이란 폴리펩타이드 또는 단백질내의 인접한 아미노산 스트레치를 의미한다.

"이소프레노이드"란 이소프렌 빌딩 블록으로부터 유래된 화합물을 의미한다. 구체적으로, 이소프레노이드 화합물들은 모노테르펜, 디테르펜, 세스퀴테르펜 및 스테롤들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본원에 기술된 바와 같이, 이소프레노이드들은 매우 다양한 유기체, 예컨대, 동물, 진균, 또는 세균 근원에서 발견된다.

"비대칭적으로 위치된(asymmetrically positioned)"이란 의미는 천연 폴리펩타이드 내에서의 그의 위치와 다른 키메라 폴리펩타이드내의 위치에 위치하는 것을 의미한다.

"이종(heterologous)"이란 상이한 근원(이 경우에는, 상이한 폴리펩타이드)로부터 유래된 것을 의미한다.

"동종(homologous)"이란 동일한 근원(이 경우에는, 동일한 폴리펩타이드)로부터 유래된 것을 의미한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점들은 이하의 구현예의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.

본 발명은 변형된 이소프레노이드 신타제 효소(isoprenoid synthase enzymes), 그것을 코드화하는 유전자 및 그의 용도에 관계한다.

도 1은 최종 생성물의 유형에 대한 이소프레노이드의 생합성 경로 및 그들의 각각의 생리적 기능을 개략적으로 설명한 도면이다. 점선은 다수 단계(multiple steps) 또는 반응들을 의미한다.

도 2는 프레닐트랜스페라제 및 테르펜 신타제들에 의해 촉매되는 여러 가지 반응들의 개략도이다.

도 3은 에레모필레인(담배-5-에피-아리스톨로첸 신타제, TEAS) 및 베티스피라디엔(히오스시아무스 베티스피라디엔 신타제, HVS) 타입 세스퀴테르펜 신타제들의 합성 반응 메카니즘의 개략도이다. 부분 반응 1 및 2는 양자의 타입의 신타제에 있어서 공통되는 것으로 생각된다. 부분 반응 3a 및 3b에서의 메카니즘상의 차이는 도시된 상이한 반응 생성물을 만들기에 충분하다.

도 4a는 세스퀴테르펜 신타제내의 촉매 도메인들의 매핑(mapping)에 이용된 키메라 구조물들의 개략도이다. 굵은 선분으로 도시한 것은 세균 발현벡터 pGBT-T19내에 유전자조작된 야생형(즉, TEAS 및 HVS) 및 키메라(CH1-CH14) 세스퀴테르펜 신타제 유전자들의 복잡한 다이어그램을 도시한 것이다. 유전자 구조물들은 이용가능한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 PCR 및 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 PCR 프라이머의 이용에 의한 선택 부위의 증폭에 의해 만들어졌다. 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 아미노산 위치들 사이의 대응관계를 도시하였다.

도 4b는 TEAS, HVS 및 키메라 신타제 구조물들(CH1-CH14)을 발현하는 이. 콜라이(E. coli) TB1 세포들의 초음파파쇄된 용해물들내의 신타제 효소의 활성을 나타낸 것으로³H-FPP에 의해 측정된 TLC 실험의 결과 사진이다. 반응생성물들은 은염색-TLC(argentation-thin layer chromatography)에 의해 분리되어 오토래디오그래피에 의해 검출되었다. 각각의 은염색-TLC 플레이트의 0.5 mm 세그멘트의 방사능을 신틸레이션 카운터로 측정하였고 TEAS, 및 HVS 특이적 생성물(TEAS and HVS specific products)의 존(zone)에 결합된 방사능을 100%로 설정하였다.

도 5는 이소프레노이드 신타제 내의 엑손과 기능성 도메인(functional domain) 사이의 대응관계를 개략적으로 도시한 도면이다. 상단 다이어그램은 TEAS 유전자내의 엑손의 구성을 도시한 것인데, 이는 HVS 및 카스벤 신타제 유전자의 그것과 거의 동일하다. 하단 다이어그램은 TEAS 및 HVS 유전자의 엑손 구성에 대한 기능성 도메인들의 배열을 도시한 것이다. 엑손 번호를 상단 다이어그램내에 표시하였고, 다른 숫자들은 아미노산의 위치를 나타내는데, 이들 중 일부는 주목되는 제한엔도뉴클레아제 부위를 가리킨다.

도 6은 무활동 신타제(QH1; quiescent synthase)를 만드는데 이용된 도메인 교체 방법(domain switching strategy)을 개략적으로 도시한 것이다. 엑손 4에 해당하는 불활성 HVS 도메인을 CH3내에 대체시키면 변화된 효소 활성을 갖는 신타제가 수득된다.

도 7은 키메라 무활동-카스벤(casbene) 신타제를 만드는데 이용된 도메인 교체 방법 및 가능한 반응생성물을 개략적으로 도시한 것이다.

도 8은 키메라 무활동-카디넨(cadinene) 신타제를 만드는데 이용된 도메인 교체 방법 및 가능한 반응생성물을 개략적으로 도시한 것이다.

키메라 이소프레노이드 신타제들

담배-5-에피-아리스톨로첸 신타제로부터의 하나의 도메인을 코드화하는 유전자 부분을 히오스시아무스 베티스피라디엔 신타제(Hyoscyamus vetispiradiene synthase)로부터의 도메인을 코드화하는 유전자 부분으로 대체함으로써 키메라 신타제를 발현하도록 설계된 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라미스드들을 세균에서 발현시켜, 세균 용해물(lysate)을 준비하고 세스퀴테르펜 신타제 활성에 대해 분석하였다. 세스퀴테르펜 신타제 분석은 아리스톨로첸과 베티스피라디엔 반응생성물을 서로 구별할 수 있는 은염색-박막크로마토그래피(TLC) 분석을 포함하였다(Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375, 1995). 도 4a에 도시된 바와 같이, 14개의 키메라 신타제 구조물들을 만들어 다음과 같이 분석하였다.

5-에피-아리스톨로첸 신타제(TEAS) 및 히오스시아무스 베티스피라디엔 신타제(HVS)에 해당하는 전체 길이의 cDNA들을 pBluescript SK(Stratagene)의 EcoR1/XhoⅠ 부위내에 클로닝하여, 각각 pBSK-TEAS 및 pBSK-HVS 플라스미드를 만들었다(Back and Chappell, J. Biol. Chem. 270:7375, 1995). 이러한 발현 플라스미드내의 TEAS 및 HVS cDNA 삽입물들은 그들의 해독개시 코돈(translation start codon)이 EcoR1 제한부위에 인접하고 그들의 3' 폴리 A 테일이 pSK 플라스미드의 XhoⅠ 제한부위에 측접하는 방향으로 삽입된다.

키메라 신타제 CH1, CH2, CH5 및 CH7은 담배 및 히오시아무스 유전자사이에서 발견되는 보존 HindⅢ 및 NdeⅠ 제한부위를 이용하여 구성하였다. CH1은 TEAS 유전자의 5' 말단 부위(EcoR1 내지 HindⅢ 단편에 해당)와 HVS 유전자의 3'말단 부위(HindⅢ 내지 KpnⅠ 단편에 해당)를 사전에 EcoR1 및 KpnⅠ으로 절단한 세균 발현벡터 pGBT-T19(Gold Biothchnology)내에 연결함으로써 제작하였다.

CH2는 TEAS 유전자의 5' 말단 부위(EcoR1 내지 NdeⅠ 단편에 해당)와 HVS 유전자의 3'말단 부위(NdeⅠ 내지 KpnⅠ 단편에 해당)를 pGBT-T19내에 연결함으로써 제작하였다.

CH5는 HVS 유전자의 5' 말단 부위(EcoR1 내지 HindⅢ 단편에 해당)와 TEAS 유전자의 3'말단 부위(HindⅢ 내지 KpnⅠ 단편에 해당)를 pGBT-T19내에 연결함으로써 제작하였다.

CH7은 HVS 유전자의 5' 말단 부위(EcoR1 내지 NdeⅠ 단편에 해당)와 TEAS 유전자의 3'말단 부위(NdeⅠ 내지 KpnⅠ 단편에 해당)를 pGBT-T19내에 연결함으로써 제작하였다.

CH3, CH4, CH12 및 CH13은 HVS 유전자의 특정 세그멘트를 증폭시키도록 설계된 프라이머를 이용하여 종래의 폴리메라제 연쇄반응법(PCR)에 의해 구성하였다. 방향성 코딩(directional coding) 및 해독틀의 유지를 위해 프라이머들을 편리한 제한부위를 포함하도록 설계하였다.

CH3은 다음과 같이 제작하였다. TEAS 유전자의 EcoRⅠ/ClaⅠ 제한단편을 분리하여 HVS 유전자의 ClaⅠ/KpnⅠ 제한단편에 연결하였다. HVS ClaⅠ/KpnⅠ 단편을 DNA 주형으로 pBSK-HVS를 이용하고, 순방향 프라이머로 5'-d(GGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT; 서열 1)-3'(ClaI 제한부위 밑줄)를 이용하고, 역방향 프라이머(pBSK의 다수의 클로닝 부위내에서 발견되는 T7 서열에 해당)로 5'-d(AATACGACTCACTATAG; 서열 2)-3'를 이용하여 PCR 방법에 의해 제작하였다.

CH4 및 CH13은 순방향 프라이머로 5'-d(CGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA; 서열 3)-3' (HincII 제한부위 밑줄)를 이용하고, 역방향 프라이머로 5'-d(TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA; 서열 4)-3'(XbaI 제한부위 밑줄)을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제작하였다.

CH12는 CH4의 처음 1326 뉴클레오티드들에 해당하는 PCR 단편을 TEAS 유전자의 ClaⅠ/KpnⅠ 단편과 함께 pGBT-T19 벡터내의 EcoR1/KpnⅠ 부위내에 연결함으로써 제작하였다. CH4 단편은 순방향 증폭 프라이머로 5'-d(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT;서열 5)-3'(EcoRI 제한부위 밑줄 및 해독개시코돈은 진하게 표시)를 이용하고, 역방향 프라이머로 5'-d(GGGATCGATAACTCTGCATAATGTAGCATT; 서열 6)-3'(ClaI 제한부위 밑줄)를 이용하여 제작하였다.

키메라 신타제 CH6, CH8, CH9, CH10, CH11, 및 CH14는 다음과 같은 방법으로 제작하였다. CH3의 HindⅢ/KpnⅠ 단편에 HVS 유전자의 EcoR1/HindⅢ 단편을 연결하여 CH6을 만들었다. CH8은 HVS의 EcoR1/NdeI 단편을 CH3의 NdeⅠ/KpnⅠ 단편에 연결함으로써 제작하였다. CH9는 CH5의 EcoR1/NdeⅠ 단편을 HVS의 NdeⅠ/KpnⅠ 단편에 연결함으로써 제작하였다. CH10은 HVS의 EcoR1/HindⅢ 단편을 CH4의 HindⅢ/KpnⅠ 단편에 연결함으로써 제작하였다. CH11은 HVS의 EcoR1/NdeⅠ 단편을 CH4의 NdeⅠ/KpnⅠ 단편에 연결함으로써 제작하였다. 그리고 CH14는 CH13의 EcoR1/NdeⅠ 단편을 pBSK-HVS의 대응하는 DNA 단편으로 대체함으로써 제작하였다. 키메라 구조물의 뉴클레오티드 접합점(junction)은 디데옥시 뉴클레오티드 쇄 종결 키트(dideoxy nucleotide chain termination kit)를 이용하여 제조자(U.S. Biochemical Corp.)의 지시에 따라 이중가닥 DNA 서열결정함으로써 확인하였다.

키메라 신타제는 이. 콜라이(E. coli) TB1 세포내에서 발현시켰다. 세균 세포의 배양, 유전자 발현의 유도, 세스퀴테르펜 신타제 효소 활성의 측정방법, 및 세균 용해물내의 총 단백질량 측정은 백과 채플의 방법에 따라 행하였다 (Arch. Biochem, Biophys. 315:527, 1994; J. Biol. Chem. 270:7375, 1995). 반응생성물을 벤젠:헥산:디에틸에테르(50:50:1)내의 15% 질산은에 침적된 G60 실리카 TLC 플레이트를 전개시켜 분리하였다. 정성분석을 위해, TLC 플레이트에 En3hance 표면 플루오로그래피 스프레이(듀퐁)을 분무하여 코닥 XAR-5 필름에 -70℃에서 2-5일간 노출시켰다. 정량분석을 위해, TLC 플레이트의 전체 레인의 5 mm 존들을 신틸레이션 바이알내에 스크랩하고 방사능을 Packard 1500 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 세균 용해물 내에서의 TEAS, HVS, CH4, 및 CH14 구조물들의 발현에 의해 결과된 신타제 활성에 의해 생성된 지배적인 반응생성물을 채플 등(Phytochemistry 26:2259, 1987)에 의해 기술된 조건에 따라 기체 크로마토그래피(GC) 및 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)에 의해 확인하였다. 또한, 질량 스펙트럼 거동을 5-에피-아리스톨로첸 신타제에 대해 발표된 것(Anke and Sterner, Planta Med. 57:344, 1991) 및 베티스피라디엔에 대해 예상된 단편화 패턴(fragmentation pattern)[Enzell et al., Mass Spectrometry Rev. 3:395, 1984]과 비교하였다.

도 4a-b에 도시된 바와 같이, 담배 TEAS 유전자의 발현에 의해 생기는 지배적인 반응생성물은 5-에피-아리스톨로첸이었고 베티스피라디엔은 HVS 유전자의 발현에 의해 생기는 지배적인 반응생성물임이 발견되었다. CH1 및 CH2의 발현에 의해 생성되는 주된 반응생성물도 HVS-특이적(즉, 베티스피라디엔)이었고 pBSK-HVS 플라스미드로부터 발현된 HVS에 대해 밝혀진 것과 유사한 효소특이적 활성을 구비하였다. 이러한 결과들은 TEAS 및 HVS의 아미노-말단쪽 반쪽이 HVS 카르복시-말단에 대해 기능상으로 동등하고 반응생성물의 특이성에 기여하지 않는다는 것을 가리킨다. HVS 아미노 말단과 TEAS 카르복시 말단을 포함하는 CH7은 CH2의 역의 구조물(converse construct)이고 그 결과로서 생기는 신타제 활성은 TEAS-특이적인 생성물(즉, 5-에피-아리스톨로첸)의 발현을 결과시킬 것으로 예상되었다. 면역검출 분석결과 CH7의 발현에 의해 생성된 신타제 단백질은 사이즈가 정확하고 예상한 존재비(abundance)로 존재하는 것으로 밝혀졌으나, 효소활성은 검출되지 않았다. 효소 활성이 없다는 것은 단백질의 아미노 말단과 카르복시 말단 사이의 상호작용이 효소 활성에 기여한다는 것을 의미한다. 이러한 해석은 CH5와 CH6 구조물에 의해 생성된 효소들의 특이적인 활성의 비교에 의해 추가로 뒤받침된다. CH5는 발현된 단백질의 절대적인 농도는 다른 구조물과 비교해 유사하였지만, 다른 키메라 신타제들에 비해 10배 정도 낮은 신타제 효소의 특수한 활성을 갖는 생성물을 발현시킨다(면역검출에 의해 측정시, 데이터는 도시하지 않음). HVS 카르복시-말단 지역의 대체는 CH6에 의해 생성된 신타제 효소의 특수한 활성을 복원시키는 것으로 밝혀졌다.

CH2와 CH3 키메라 신타제들의 비교 결과는 최종-생성물의 특이성이 TEAS 및 HVS 유전자내의 NdeⅠ 및 ClaⅠ 제한부위에 해당하는, 약 181 아미노산들의 도메인내에 존재한다는 것을 입증한다. CH4의 발현은 의외로 TEAS 및 HVS 효소들 모두 반영하는 반응생성물을 만들 수 있는 키메라 신타제 단백질을 생성시킨다. 우리는 이러한 결과가 담배 5-에피-아리스톨로첸 신타제내의 아미노산 261 내지 379가 TEAS-특이적 생성물(즉, cDNA의 NdeⅠ 내지 HincⅡ 단편에 해당하는 부위)을 담당하는 반면에, 히오스시아무스 단백질내의 아미노산 379 내지 442는 HVS-특이적 생성물(즉, cDNA의 HincⅡ 내지 ClaⅠ 단편에 해당하는 부위)을 담당한다는 것을 의미하는 것으로 해석하였다.

우리의 해석은 CH11 및 CH12의 발현생성물을 비교해 봄으로써 확인되었다. CH11은 히오스시아무스 유전자의 NdeⅠ 내지 HincⅡ 단편이 대응하는 담배 유전자 단편으로 대체된 것으로, HVS- 및 TEAS-특이성을 갖는 효소의 생산을 초래하였다. CH12는 담배 유전자의 HincⅡ 내지 ClaⅠ 단편이 대응하는 히오스시아무스 유전자 단편으로 대체된 것으로, HVS- 및 TEAS-특이성을 갖는 효소의 생산을 초래하였다. CH11과 CH13의 비교를 통해 TEAS-특이적 생성물을 담당하는 담배 효소의 도메인을 보다 정확하게 규명하게 되었다. CH13이 다기능성 효소(multifunctional enzyme)로 판명되었다는 사실은 담배 cDNA의 NdeⅠ 내지 XbaⅠ 제한부위 사이에 존재하는 DNA 단편에 의해 코드화되는 81 아미노산들이 지배적인 TEAS 특이적 생성물의 생성에 충분하다는 것을 가리킨다. 이러한 해석은 CH14내의 NdeⅠ/XbaⅠ HVS cDNA 제한 단편내에 포함된 도메인을 TEAS 유전자의 그것으로 대체함으로써 확인되었다(도 4a).

도 4b에 도시된 바와 같이, 세균 내에서 발현된 야생형 담배 TEAS 유전자 및 히오스시아무스 HVS 유전자들의 지배적인 반응생성물(들)은 질산은-TLC 플레이트 상에서 R_f값이 0.41 및 0.31이 되도록 이동하였는데, 이들 값들은 각각 5-에피-아리스톨로첸 및 베티스피라디엔으로서 이들 생성물들에 대해 앞서 규명한 것과 일치한다(Back and Chappell, J Biol. Chem. 270:7375, 1995; Back et al., Arch. Biochem. Biophys. 315:527, 1994). GC 및 GC-MS 분석은 지배적인 TEAS 반응생성물이 5-에피-아리스톨로첸(GC 분석에서 총 피크 면적의 백분율을 기준으로할 때, 총생성물의 70%) 및 2환식 세스퀴테르펜(20%)(204의 m/z에서 [M]⁺이온)이었고, 지배적인 HVS 반응생성물은 베티스피라디엔(〉90%)(204의 m/z에서 [M]⁺이온 및 m/z 41에서 베이스 피크 그리고 m/z 175, 108, 94 및 68에서 예측가능한 이온들)이었고, CH4의 지배적인 TEAS 반응생성물이 5-에피-아리스톨로첸(18%), 2환식 세스퀴테르펜(43%), 및 베티스피라디엔(32%)이었다.

또한, 히스티딘-택 재조합 신타제 단백질들의 친화성 정제에 기초한 연구 결과 각각 전체 생성물의 약 1%에 해당하는 다른 5 가지의 부수적인 반응생성물들이 밝혀졌다. 이들 5 가지는 모든 반응분석에서 동일한 상대적 존재비(relative abundance)를 나타내었다.

비율-결정 도메인(Ratio-Determinant Domain)

신타제 단백질들의 다른 도메인들이 다기능성 키메라 신타제 효소들에 의해 생성된 지배적인 반응생성물의 상대적인 비율을 비교해 봄으로써 확인되었다(도 4 a). 예를 들어, 구조물 CH4, CH10, CH11 및 CH12의 발현으로부터 결과되는 반응생성물들은 60-70% TEAS-특이적 내지 30-40%의 HVS-특이적인 비율로 생성되었다. 이와 반대로, 반응생성물들의 역의 비(inverse ratio)는 구조물 CH13 및 CH14의 발현으로부터 수득되었다. 이러한 결과는 XbaⅠ 내지 HincⅡ 도메인에 의해 포괄되는 부위가 다기능성 키메라 신타제 효소들에 의해 생성되는 반응생성물들의 상대적인 비에 영향을 미친다는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 신타제 펩타이드내의 두 개의 서로 분리되어 있는 상이한 도메인들이 생성된 반응생성물의 타입에 직접적으로 영향을 미치고, 본원에서 비율-결정 도메인이라고 칭하는 다른 도메인에 의해 인터럽트된다는 것을 가리킨다(도 5).

부위-특이적 돌연변이유발(Site-Directed Mutagenesis)

부위-특이적 돌연변이유발 방법을 이용하여 생성물 특이성(product specificity) 및 비율 결정 도메인들을 추가로 분석하였다. 이러한 분석의 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 예를 들어, 아리스톨로첸 특이적 도메인내에서 발견된 DDXXD 모티브는 TEAS 및 HVS를 포함하는 다수의 테르펜 생합성 효소들에서 발견되는 보존 서열(conserved sequences)이다. 이러한 산성 아미노산 집단은 다른 친유성 포켓(lipophilic pocket)내의 FPP의 디포스페이트 부분을 중화하는데 필요한 금속 보조인자와 조화한다고 한다. DDXXD 모티브의 첫 번째 아스파르트산을 글루탐산(전체 전하 보존) 또는 발린(산성 전하의 순수 손실) 잔기로 치환하면(즉, D301→E 및 D301→V) 효소가 불활성화된다. 두 번째 아스파르트산(D302)의 글루탐산 잔기로의 보존적 치환(즉, D302→E)도 키메라 신타제 효소 활성을 95% 정도 불활성화하여, 다기능성 효소의 생성물 분포를 약간 변화시킨다.

돌연변이 목표 유전자	돌연변이된 아미노산	생성물 비율아리스톨로첸 베티스피라디엔	고유활성도(nmol/mg h^-1
CH4		66%	34%	34
기질 결합 도메인(NdeⅠ/XbaⅠ부위)
담배	D301V	활성 없음		0
CH4	R287A	활성 없음		0
CH4	D301V	활성 없음		0
CH4	D301E	활성 없음		0
CH4	D302E	51%	49%	1.8
비율 결정 도메인(XbaⅠ/HincII 부위)
CH4	K347I	64%	36%	32
CH4	H360S	63%	32%	29
CH4	H364S	65%	35%	38
히오스시아무스 특이성 도메인(HincII/ClaI 부위)
CH4	T408A	67%	33%	48
CH4	K420M	68%	32%	29
CH4	H422A	67%	33%	30
CH4	N436S	70%	30%	32
CH4	AT437,438VI	61%	39%	33

비율-결정 도메인내의 부위특이적 치환을 위한 부위(즉, K347→I, H360→S, H364→S)는 신타제 효소학(synthase enzymology)에서의 하전된 아미노산 잔기(예컨대, 히스티딘, 또는 리신)의 중요성을 가정한 보고서의 분석에 의해 추론하였고, 이들 부위들은 TEAS 및 HVS 일차 서열(primary sequence) 사이의 비교에서 가장 큰 전하 차이를 보이는 아미노산들이었다. 분석된 세 가지 돌연변이 모두 전체 효소 활성 및 생성된 생성물의 비율에 영향을 미치지 않았다.

HVS 특이적 도메인내의 아미노산 치환은 HVS와 TEAS 단백질들의 2차 구조 예상에 기초하여 선택하였다. 돌연변이된 아미노산들은 주로 전하 때문에 이들 두 가지 단백질들의 2차 구조 모델에서의 구조 왜곡(structural distortions)에 불균형적으로 기여하는 것처럼 보였다. 그러나, 상기 표 1에 나타낸 바과 같이, 하전된 아미노산의 비하전 아미노산으로의 치환(즉, T308→M, H422→A) 또는 낮게 하전된 아미노산으로의 변화(즉, N436→S, A437→T, V438→I)를 포함하는 치환들은 전체적인 효소 활성에 영향을 미치지 않았고 하나의 생성물 또는 다른 생성물의 합성률(synthesis rate)에 영향을 미치지도 않았다.

무활동 신타제(Quiescent Synthases)

무활동 신타제를 만들기 위해, 도 6에 도시된 바와 같이, HVS의 엑손 4에 해당하는 무활동 도메인을 CH3의 대응하는 활성 도메인으로 치환하였다. CH3은 TEAS의 엑손 6에 해당하는 불활성 도메인을 포함하고, 목적으로 하는 치환을 하기에 편리한 NdeI 및 XbaI제한부위를 구비하며, 세균내에서 고농도로 과발현될 수 있다. 도메인 교체(domain switching)는 본원에 기술된 바와 같은 표준적인 분자 기술에 의해 이루어질 수 있다. 하나의 구체적인 예에서, 엑손 4에 해당하고, 아미노산 261 내지 342를 포함하며 프라이머 내에 적당한 NdeI 및 XbaI 제한부위를 갖는 HVS cDNA의 PCR 증폭 생성물이 CH3의 대응하는 부위 대신에 대체된다. 이러한 구조물의 생성시에는 적당한 아미노산 잔기 및 정확한 해독틀을 유지하도록 주의해야 하고 구조물의 발현 시험(expression test)을 위해 효소분석 및 면역블로팅 기술에 의해 세균 용해물의 가용성 및 불용성 분획들내의 단백질 농도를 측정해야 한다.

또한, 대규모 효소 반응을 수행하고, 반응생성물(들)을 헥산내에서 추출하여 생성물을 HPLC에 의해 정제한다. 무활동 효소 반응 생성물에 대한 추가의 평가는 TLC를 이용하여, TEAS 및 HVS 효소들에 의해 생성된 것과 실험 시료의 R_f값을 비교하여 행한다. 반응생성물(예컨대, 게르마크렌(germacrene) 또는 게르마크렌-유사 반응생성물)의 체류시간도 표준방법에 따라 GC, GC-MS, NMR을 이용하여 모니터한다.

무활동 신타제는 EAS 및 VS 반응들의 화학적 이론적 근거를 확인하기 위해 충분한 양의 게르마크렌 반응 중간생성물(들) (또는 이들의 유도체들)을 제공하는데 유용하고, 전체 신타제 반응 스킴에 새로운 최종 단계의 도입에 이용될 수 있는 주형 키메라 신타제를 제공한다.

키메라 카스벤 및 카디넨 신타제(Chimeric Casbene and Cadinene Synthase)

키메라 이소프레노이드 신타제들은 신규한 마크로사이클릭 이소프레노이드 또는 변형된 입체화학 특성을 갖는 이소프레노이드들을 만드는데도 유용하다. 예를 들어, 시클로프로필 사이드 그룹을 갖는 마크로사이클릭 디테르펜의 합성을 촉매하는 디테르펜 신타제인 카스벤 신타제, 및 바이사이클릭 세스퀴테르펜의 합성을 촉매하는 세스퀴테르펜 신타제인 카디넨 신타제는 마크로사이클릭 이소프레노이드 또는 변형된 입체화학 특성을 갖는 이소프레노이드 반응 생성물들을 생산할 수 있는 효소들의 조작(engineering)에 유용한 도메인을 제공한다. 이러한 키메라 신타제의 생산을 위한 일반적인 스킴을 도 7 및 도 8에 도시하였다.

이러한 키메라 카스벤 및 카디넨 신타제를 구성하기 위해, 무활동 아미노 말단 도메인들(및 필요에 따라 다른 신타제 도메인들)을 편리한 제한부위 및 상술한 바와 같이 해서 선택된 부위의 PCR 증폭을 이용하여 카스벤 및 카디넨 신타제로부터의 도메인들과 치환하였다. 카스벤 신타제의 N-말단, 플라스티드 표적 서열에 해당하는 서열들을 이들 구조물로부터 결실시켰다. 키메라 구조물들을 세균에서 발현시켜 세균 용해물들을 키메라 신타제 활성에 대해 조사하고 반응생성물들을 상술한 방법, 예컨대, 은염색-TLC에 의해 특성을 규명하였다. 세균에서 높은 수준의 신타제 활성을 지원하는 구조물들 및/또는 아리스톨로첸 및 베티스피라디엔 표준과 상이한 R_f로 이동하는 활성 생산 반응생성물(activity generating reaction products)이 본 발명에서 유용한 것으로 생각된다. 반응생성물들에 대해서도 GC, 필요한 경우 GC-MS, 및 NMR에 의해 체류시간을 조사하였다. 특유의 반응생성물의 합성에 기여하는 카스벤 신타제 및 카디넨 신타제의 도메인들도 도 4a에 도시한 것과 유사한 방법에 의해 지도작성하였다.

다른 키메라 이소프레노이드 신타제들의 생산

본원에 기술된 표준 분자 기술을 이용함으로써, 공지의 또는 새롭게 분리된 신타제 효소들의 도메인들을 포함하는 다른 키메라 신타제들을 손쉽게 만들 수 있다. 이러한 키메라 신타제들을 당업계에 공지되어 있는 적당한 효소분석법(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은) 또는 표준 면역검출기술을 이용함으로써 활성에 대해 시험할 수 있다.

당업계에 잘 알려져 있는 표준 클로닝 방법 및 기술을 이용함으로써 추가의 신타제 코드화 서열들을 분리할 수 있다. 예를 들어, 공지의 신타제 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용함으로써, 사람들은 손쉽게 신타제 변성 올리고뉴클레오티드 프로브(즉, 주어진 아미노산 서열에 대한 모든 가능한 코드화 서열의 혼합물)를 포함하는 신타제-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브들을 제작할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드들은 DNA 가닥의 서열에 기초하거나 신타제 뉴클레오티드 서열의 임의의 적합한 부분의 서열에 기초할 수 있다. 이러한 프로브들의 설계 및 제조방법은 Ausubel et al., 1996, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, and Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987에 기술되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 신타제 상보성 서열들과 혼성화할 수 있는 프로브로서의 효용 또는 다양한 증폭기술, 예컨대, 폴리메라제연쇄반응(PCR) 클로닝 방법에서의 프라이머로서의 효용이 있기 때문에 신타제 유전자의 분리에 유용하다.

혼성화 기술 및 스크리닝 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있는데, 예를 들어 상술한 오스벨 등의 문헌; Berger and Kimmel (supra); Chen at al. Arch. Biochem. Biophys. 324:255, 1995; and Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재되어 있다. 필요한 경우에, 재조합 DNA 도서관의 스크리닝을 위해 상이한 뉴클레오티드 프로브들을 조합해서 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드들은 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 검출가능하도록 표지되어 재조합 DNA 도서관으로부터의 필터 레플리카(filter replica)를 프로빙(probing)하는데 이용될 수 있다. 재조합 DNA 도서관들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제작될 수 있는데, 예를 들어, 상술한 오스벨 등의 문헌에 기술된 방법으로 제작하거나 시판되는 것을 구매할 수 있다.

전술한 바와 같이, 신타제 올리고뉴클레오티드들은 증폭 클로닝 방법( amplification cloning strategies), 예컨대, PCR에 프라이머로도 이용될 수 있다. PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, Technology, Erlich, ed., Stockton Press, London, 1989; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc., New York, 1990; 및 상술한 오스벨 등의 문헌에 설명되어 있다. 프라이머들은 선택적으로 증폭된 생성물이 적당한 벡터내에 클로닝되도록 설계되어야 하는데, 예를 들어 증폭된 단편의 5' 말단 및 3' 말단에 적당한 제한부위를 포함하도록 설계될 수 있다(본원에 기술된 바와 같이). 바람직한 경우, 신타제 유전자는 PCR "RACE" 기술을 또는 cDNA 말단의 고속증폭(예컨대, Innis 등의 상술한 문헌 참조)을 이용하여 분리할 수 있다. 이 방법에서, 신타제 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 3' 및 5' 방향으로 배향되고 중첩 PCR 단편들(overlapping PCR fragments)의 생성에 이용된다. 이들 중첩 3'- 및 5'-말단 RACE 생성물들은 결합되어 완전한 전체 길이 cDNA를 만든다. 이러한 방법은 Innis 등의 상술한 문헌; 및 Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998,(1998)에 기술되어 있다.

유용한 신타제 서열들은 적당한 유기체로부터 분리될 수있다. 서열들의 신타제 폴리펩타이드 군에 대한 관련성의 확인은 여러 가지 종래의 방법에 의해 행할 수 있는데, 예를 들어, 서열 비교에 의해 행할 수 있다. 또한, 신타제 단백질의 활성은 본원에 기술된 기술들 중 임의의 기술에 따라 평가할 수 있다.

키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드 발현

키메라 신타제 폴리펩타이드들은 적당한 발현벡터에 실려 있거나 생체내에서 키메라 신타제 폴리펩타이드의 발현을 증가시키도록 유전자조작된 플라스미드 구조물에 의해, 전부 또는 일부의 키메라 신타제 DNA(예컨대, 상술한 키메라 신타제 cDNA)로 적당한 숙주세포를 형질전환시킴으로써 만들 수 있다.

분자생물학 분야의 당업자들은 재조합 단백질을 제공하기 위해 매우 다양한 발현 시스템들이 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이용된 정확한 숙주 세포는 본 발명에서 중요하지 않다. 키메라 신타제 단백질은 원핵생물숙주, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) TB1, 또는 진핵숙주, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 포유동물세포(예컨대, COS1, 또는 NIH3T3 세포) 또는 진균류, 관목종, 장식종(ornamental species), 온대 과일종, 열대과일종, 채소종, 콩과식물종, 단자엽식물, 쌍자엽식물, 또는 상업적으로 또는 농업적으로 중요한 임의의 식물들을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 임의의 수의 식물 세포내에서 생산될 수 있다. 적당한 식물 숙주의 구체적인 예들은 구과식물, 피튜니아(가지과), 토마토, 감자, 담배, 아라비도프시스(Arabidopsis), 상추, 해바라기, 오일시드 레이프(Oilseed rape), 아마, 목화, 사탕무, 셀러리, 두유, 자주개자리, 메디카고(Medicago), 로터스의 열매, 비그나(Vigna), 오이, 당근, 가지열매, 꽃양배추, 양고추냉이, 나팔꽃, 사시나무, 호두, 사과, 아스파라거스, 쌀, 기장, 양파, 보리, 새발풀, 귀리, 호밀, 밀이 포함되지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아니다.

이러한 세포들은 American Type Culture Collection(Rockland, MD)를 포함하는 다수의 광범위한 공급원으로부터 입수할 수 있고 또 다수의 종자회사, 예컨대, W. Atlee Burpee Seed Co. (Warminster, PA), Park Seed CO.(Greenwood, SC), Johnny Seed Co.(Albion, ME), 또는 Northrup King Seeds(Harstville, SC)로부터 입수할 수 있다. 유용한 숙주 세포들의 설명 및 공급원은 Vasil I.K., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol Ⅰ, Ⅱ,Ⅲ Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984; Dixon, R.A. Plant Cell Culture-A Practical Approach, IRL Press, Oxford University, 1985; Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press, New York, 1987; and Gasser and Fraley, Science 244:1293, (1989)에서도 발견할 수 있다.

원핵생물 발현의 경우에, 키메라 신타제 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA는 원핵생물숙주에서의 발현을 달성할 수 있는 조절신호에 작동가능하도록 연결된 벡터에 실장된다. 바람직한 경우, 코드화서열은 발현된 단백질이 숙주세포의 원형질주변 공간(periplasmic space)에 분비되게 할 수 있는 임의의 공지의 신호서열들을 코드화하는 서열인, 그의 5' 말단을 포함하여 단백질의 회수와 그 이후의 정제를 용이하게 할 수 있다.

가장 자주 이용되는 원핵생물은 이. 콜라이의 다양한 균주들이다; 그러나, 다른 미생물 균주들도 이용될 수 있다. 플라스미드 벡터들은 복제기점, 선태가능한 마커, 및 미생물 숙주와 공존할 수 있는 종들로부터 유래된 조절서열들을 포함하는 것들이 이용된다. 이러한 벡터들의 예들은 상술한 포우웰 또는 오스벨의 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 흔히 이용되는 원핵생물 조절서열[control sequences]("조절 요소(regulatory elements)"라고도 함)는 본원에서 리보좀 결합부위와 함께 전사개시를 위한 프로모터를 포함하고, 선태적으로 오퍼레이터를 포함하는 것이다. 단백질을 발현시키기 위해 흔히 이용되는 프로모터는 람다-유래 P_L프로모터 및 N-유전자 리보좀 결합 부위(Simatake et al., Nature 292:128 (1982))는 물론 베타-락타마제(페니실리나제), 락토스(lac)[Chang et al., Nature 198:1056 (1977)], 트립토판(Trp)[Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057 (1980)], 및 tac 프로모터 시스템이다.

키메라 신타제 폴리펩타이드 생산을 위한 하나의 특수한 세균 발현 시스템은 이. 콜라이 pET 발현 시스템(Novagen)이다. 이러한 발현 시스템에 따라, 키메라 신타제 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA는 발현을 허용하는 방향으로 pET 벡터내에 도입된다. 키메라 신타제 유전자가 T7 조절신호의 조절하에 있기 때문에, 키메라 신타제의 발현은 숙주세포내에서 T7 RNA 폴리메라제의 발현을 유도함으로써 유도된다. 이것은 IPTG 유도에 반응하여 T7 RNA 폴리메라제를 발현하는 숙주 균주를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 일단 생산되면, 재조합 키메라 신타제 폴리펩타이드는 당업계에 공지된, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 분리된다.

키메라 신타제 폴리펩타이드 생산을 위한 다른 세균 발현 시스템은 pGEX 발현 시스템이다(파마시아). 이 시스템은 유전자 또는 유전자의 단편이 융합단백질 형태로 고농도로 발현되고 기능적인 유전자산물의 신속한 정제 및 회수를 가능하게 하도록 설계된 GST 유전자 융합 시스템을 이용한다. 목적으로 하는 키메라 신타제 단백질은 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum)으로부터 유래된 글루타치온 S-트랜스페라제 단백질의 카르복시 말단에 융합되고 글루타치온 세파로스 4B를 이용함으로써 친화성 크로마토그래피에 의해 손쉽게 정제된다. 융합단백질들은 글루타치온으로 용출함으로써 가혹하지 않은 조건하에서 회수될 수 있다. 글루타치온 S-트랜스페라제 도메인의 융합단백질로부터의 절단은 이 도메인의 상류에 있는 부위-특이적 단백질분해효소에 대한 인식부위가 존재할 경우 쉽게 이루어진다. 예를 들어, pGEX-2T 플라스미드에서 발현된 단백질들은 트롬빈에 의해 절단되고; pGEX-3X에서 발현된 단백질들은 요소 Xa에 의해 절단될 수 있다.

진핵생물 발현의 경우에, 형질전환 또는 트랜스펙션 방법과 키메라 신타제 폴리펩타이드의 발현을 위한 비히클의 선택은 선택되는 숙주 시스템에 의존할 것이다. 다수의 유기체들,예를 들어, 베이커의 효소 사카로마이세스 세레비시아에의 형질전환 또는 트랜스펙션 방법은 상술한 오스벨 등의 문헌; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990; Kindle, K., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 1228(1990); Potrykus, I., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biology 42:205(1991); and BioRad (Hercules, CA( Technical Bulletin #1687 (Biolistic Particle Delivery Systems)에 기술되어 있다. 발현 비히클들은 예컨대, Cloning Vectors: A Laboratory Manual(P.H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987); Gasser and Fraley(supra); Clontech Molecular Biology Catalog(Catalog 192/93 Tools for the Molecular Biologist, Palo Alto, CA; 및 위에서 언급한 참고문헌들에 제공되어 있는 것들 중에서 선택될 수 있다.

하나의 바람직한 진핵생물 발현시스템은 pMAMneo 발현벡터(클론텍)에 의해 트랙스펙션된 마우스 3T3 섬유아세포 숙주세포이다. pMAMneo는 : 덱사메타손-유도성 MMTV-LTR 프로모터에 연결된 RSV-LTR 인헨서, 포유동물 시스템에서 복제할 수 있게 해주는 SV40 복제기점, 선택가능한 네오마이신 유전자, 및 SV40 스플라이싱 및 폴리아데닐화 부위를 제공한다. 키메라 신타제 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA는 pMAMneo 벡터내에 발현을 허용하도록 설계된 방향으로 삽입한다. 재조합 키메라 신타제 폴리펩타이드는 이어서 상술한 바와 같은 방법에 의해 분리된다. pMAMneo 발현 비히클과 함께 사용될 수 있는 다른 바람직한 숙주세포는 COS 세포 및 CHO 세포들(각각, ATCC 기탁번호 CRL 1650 및 CCL 61)이다.

대안으로, 바람직한 경우에, 키메라 신타제 폴리펩타이드는 안정적으로 트랜스펙션된 포유동물 세포주에 의해 생산될 수 있다. 포유동물 세포의 안정한 트랜스펙션에 적합한 다수의 벡터들은 공지되어 있는데, 예를 들어 포우웰 등의 상술한 문헌 참조할 수 있고; 이러한 세포주를 만드는 방법도 공지되어 있는데, 일례로 상술한 오스벨 등의 문헌을 참조할 수 있다. 하나의 예로, 키메라 신타제 폴리펩타이드를 코드화하는 cDNA를 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 포함하는 발현벡터내에 클로닝한다. 플라스미드 및 결과적으로 키메라-신타제 코드화 유전자의 숙주 세포 염색체내로의 통합은 0.01-300μM 메토트렉세이트를 세포배양 배지에 포함시킴으로써(오스벨 등의 상술한 문헌에 기재된 대로) 선택해 낼 수 있다. 이러한 우성 선택(dominant selection)은 모드 세포 유형에서 가능하다. 재조합 단백질 발현은 트랜스펙션된 유전자의 DHFR-매개 증폭에 의해 증가시킬 수 있다. 유전자가 증폭된 세포주를 선택해내는 방법은 상술한 오스벨 등의 문헌에 기재되어 있고; 이러한 방법은 일반적으로 점차 증가하는 농도의 메토트렉세이트를 포함하는 배지에서 장기간 배양하는 과정을 포함한다. 일반적으로 이러한 목적을 위해 사용되는 DHFR-포함 발현벡터들은 pCVSEⅡ-DHrF, 및 pAdD26SV(A)(오스벨의 상술한 문헌에 기재)를 포함한다. 상술한 것들중 임의의 숙주세포들, 또는 바람직하게 DHFR-결핍 CH0 세포주(예컨대, CHO DHFR^-세포, ATCC 기탁번호 CRL 9096)들이 안정하게 트랜스펙션된 세포주의 DHFR 선택 또는 DHFR-매개 유전자 증폭에 바람직한 숙주세포들중 하나이다.

키메라 신타제 폴리펩타이드는 바람직하게 안정하게 트랜스펙션된 세포주 또는 형질전환 식물에 의해 생산된다. 식물 세포의 안정한 트랜스펙션 또는 형질전환 식물의 구성에 적합한 다수의 벡터들이 공지되어 있는데, 이러한 벡터들은 포우웰 등의 상술한 문헌, 바이스바흐 및 바이스바흐의 상술한 문헌, 및 겔빈 등의 상술한 문헌에 기술되어 있다. 이러한 세포주를 만드는 방법은 예컨대, 바이스바흐 및 바이스바흐의 상술한 문헌, 및 겔빈 등의 상술한 문헌에 기술되어 있다. 전형적으로, 식물 발현벡터들은 (1) 5' 및 3' 조절서열들의 전사조절하에 놓이는 클로닝된 키메라 신타제 유전자 및 (2) 우성 선택 마커를 포함한다. 이러한 식물 발현벡터들은 필요한 경우 프로모터 조절 부위(예컨대, 유도성 또는 항구성 또는 환경적으로- 또는 발생적으로-조절되거나 또는 상처-유도성 또는 세포- 또는 조직-특이성 발현을 부여하는 것), 전사개시부위, 리보좀 결합부위, RNA 프로세싱 신호, 전사종결부위 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수도 있다.

본 발명의 키메라 신타제 폴리펩타이드 DNA 서열은 바람직한 경우, 여러 가지 방법에 의해 다른 DNA 서열들과 결합될 수 있다. 본 발명의 키메라 신타제 DNA 서열은 보통 신타제 단백질과 결합되어 있는 유전자 서열의 전부 또는 일부와 함께 이용될 수 있다. 그의 구성요소에 있어, 키메라 신타제 단백질을 코드화하는 DNA 서열은 숙주세포에서의 전사와 해독을 프로모팅할 수 있는 전사개시 조절 부위를 갖는 DNA 구조물에 결합된다.

일반적으로, 상기 구조물들은 상술한 바와 같이 키메라 신타제 단백질의 생산을 제공하는 식물에서 기능할 수 있는 조절서열을 포함할 것이다. 키메라 신타제 단백질 또는 그의 기능성 단편을 코드화하는 개방해독틀은 천연 서열이 신타제구조 유전자의 5' 상류 부위에서 발견되는 것과 같이, 전사개시조절부위의 5' 말단에 연결될 것이다. 항구성 또는 유도성 조절을 제공하는 많은 수의 다른 전사개시 지역들을 이용할 수 있다.

발생적, 세포, 조직, 호르몬, 환경, 또는 병원체-유도성 발현이 바람직한 경우에, 적당한 5' 상류 비해독 부위들을 다른 유전자들로부터 수득할 수 있는데; 예를 들어 종자 발생중, 배발생중, 잎 발생, 또는 병원체에 반응하여 조절된 유전자들로부터 수득할 수 있다.

조절성 전사 종결 부위들도 본 발명의 DNA 구조물내에 삽입될 수 있다. 전사 종결 부위는 신타제 단백질을 코드화하는 DNA 서열에 의해 제공되거나 상이한 유전자 공급원으로부터 유래된 임의의 편리한 전사종결부위가 제공될 수 있다. 전사종결부위는 바람직하게 그로부터 종결부위가 유래된 구조유전자의 3' 적어도 1-3kb의 서열을 포함할 것이다. 이러한 유전자조작된 식물들은 상술한 여러 가지 산업적 및 농업적 응용에 유용하다. 중요하게, 본 발명은 나자식물 및 피자식물에 적용될 수 있고, 어떠한 새로운 또는 개량된 형질전환 또는 재생방법에 대해서도 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 유용한 식물 프로모터의 일례는 카울리모바이러스 프로모터, 예컨대, 꽂양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터이다. 이러한 프로모터들은 대부분의 식물조직에서 높은 수준의 발현을 제공하고, 이들 프로모터들의 활성은 바이러스가 코드화하는 단백질에는 의존하지 않는다. CaMV는 35S 및 19S 프로모터들의 공급원이다. 형질전환식물의 대부분의 조직에서, CaMV 35S 프로모터는 강한 프로모터이다(예컨대, Odell et al., Nature 313:810(1985) 참조). CaMV 프로모터는 단자엽 식물에서도 활성이 크다(예컨대, Dekeyser et al., Plant Cell 2: 591(1990); Terada and Shimamoto, Mol, Gen. Genet. 220:389,(1990) 참조). 더욱이, 이러한 프로모터의 활성은 CaMV 35S 프로모터의 복제에 의해 더 증가된다(즉, 2-10 배 사이)(예컨대, Kay et al., Science 236:1299(1987); Ow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4870(1987); and Fang et al., Plant Cell 1: 141(1989) 참조).

다른 유용한 프로모터들은 제한 없이 노팔린 신타제 프로모터(An et al., Plant Physiol. 88:547 (1988)), 및 옥토파인 신타제 프로모터(Fromm et al., Plant Cell 1:977 (1989))를 포함한다.

몇몇 특수한 경우에는, 적당한 조직에서, 적당한 농도로, 또는 적당한 발생시기에 키메라 신타제 유전자 생성물을 만드는 것이 바람직할 것이다. 이러한 목적을 위해, 조절서열내에 구현되어 있는 각기 자신의 독특한 특성을 갖는 유전자 프로모터의 유별(assortment)이 존재하는데, 이들은 환경, 호르몬 및/또는 발생 단계에 반응하여 조절되는 것으로 확인되었다. 이들은 열-조절 유전자(heat-regulated gene) 발현을 담당하는 유전자 프로모터(예컨대, Callis et al., Plant Physiol. 88:965 (1988); Takahashi and Komeda, Mol. Gen. Genet. 219:365 (1989) 참조); 및 Takahashi et al., Plant J. 2:75d1(1992)); 광-조절 유전자(light-regulated gene) 발현(예컨대, Kuhlemeier 등에 의해 기술된 완두콩 rbcS-3A (Plant Cell 1:471 (1989)참조); Schaffner 및 Sheen(Plant Cell 3:997 (1991))에 의해 기술된 옥수수 rbcS 프로모터; Simpson 등(EMBO J. 4:2723 (1985))에 의해 기술된 완두콩에서 발견된 클로로필 a/b-결합 단백질 유전자; 호르몬-조절 유전자 발현(예컨대, Marcotte 등(Plant Cell 1: 969(1989))에 의해 기술된 밀의 Em 유전자로부터의 앱시식 애시드(abscisic acid; ABA) 반응성 서열들; 보리 및 아라비돕시스(Arabidopsis)에 대해 Straub 등 (Plant Cell 6:617(1994), Shen 등 (Plant Cell 7:295(1994))에 의해 기술된 ABA-유도성 HVA-1 및 HVA22 및 rd29A 프로모터들, 및 상처유도 유전자 발현(예컨대, Siebertz 등에 의해 기술된 wunI)(Plant Cell 1: 961 (1989)), 또는 기관-특이성 유전자 발현(예컨대, Roshal 등(EMBO J. 6:1155(1987))에 의해 기술된 괴경특이성(tuber-specific) 저장 단백질 ; Schernthaner 등(EMBO J. 7:1249(1988))에 의해 기술된 옥수수의 23-kDa 제인 옥수수 유전자; 또는 Bustos 등(Plant Cell 1:839(1989))에 의해 기술된 프랑스 콩 β-페이스올린유전자(phaseolin gene); 및 Chappell 등에 의해 본원에 첨부된 미국특허원 제 08/471,983호, 제 08/443,639호, 및 제 08/577,483호에 기술된 병원체 유동성 유전자발현을 포함한다.

식물 발현벡터들은 선택적으로 RNA 프로세싱 신호(processing signals), 예를 들어, 효과적인 RNA 합성 및 축적에 중요한 것으로 입증된 인트론을 포함할 수 있다(Callis et al., Genes and Dev. 1:1183 (1987)). RNA 스플라이스 서열들의 위치는 식물에서 형질전환 유전자의 발현레벨에 극적으로 영향을 미친다. 이러한 관점에서, 인트론은 유전자 발현 수준을 조절하기 위해 형질전환유전자내에서 키메라 신타제 폴리펩타이드-코드화 서열의 상류 또는 하류에 위치될 수 있다.

전술한 5' 조절성 조절서열(regulatory control sequence)들 이외에, 발현벡터들은 일반적으로 식물 유전자의 3' 부위에 존재하는 조절성 조절 부위들을 포함할 수도 있다(Thornburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:744(1987); An et al., Plant Cell 1:11(1989)). 예를 들어, 3' 종결 부위(terminator region)가 mRNA의 안정성을 향상시키기 위해 발현벡터내에 포함될 수 있다. 이와 같은 종결 부위는 감자의 PI-Ⅱ 종결부위로부터 유래될 수 있다. 또한, 다른 흔히 이용되는 터미네이들은 옥토파인 또는 노팔린 신타제 신호로부터 유래된다.

식물 발현벡터는 전형적으로 형질전환된 세포를 가려내는데 이용되는 우성 선택가능한 마커 유전자도 포함한다. 식물 시스템에 유용한 선택가능한 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 블레오마이신, G418, 스트렙토마이신, 또는 스펙티노마이신에 대한 내성을 코드화하는 유전자들이다. 광합성에 요구되는 유전자들도 광합성-결핍 균주에서 선택가능한 마커로 이용될 수 있다. 대안으로, 해파리, 에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)의 녹색-형광 단백질도 선택가능한 마커로 이용될 수 있다(Sheen et al., Plant J. 8:777, 1995; Chiu et al., Current Biology 6:325(1996)). 끝으로 제초제 내성을 코드화하는 유전자들은 선택가능한 마커로 이용될 수 있는데, 유용한 제초제 내성 유전자는 효소 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제를 코드화하고 넓은 종류의 식물 제초제 Basta^R(Hoechst AG, Fankfurt, Germany)들에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자를 포함한다.

선택가능한 마커의 효과적인 이용은 식물세포의 특정한 선택가능한 약제에 대한 감수성의 측정 및 전부가 아니라면 대부분의 형질전환된 세포들을 효과적으로 살상하는 이 약제의 농도를 측정함으로써 촉진될 것이다. 담배 형질전환을 위한 항생제의 유용한 농도는 예를 들어, 75-100㎍/ml(카나마이신), 20-50 ㎍/ml(하이그로마이신), 또는 5-10 ㎍/ml(블레오마이신)이다. 제초제 내성에 대한 형질전환체의 효과적인 선택 방법은 예컨대, 바실 등의 상술한 문헌에 기술되어 있다.

분자생물학 분야, 특히 식물분자생물학 분야의 당업자들에게 유전자 발현이 프로모터, RNA 프로세싱 신호, 및 종결요소의 조합 뿐만 아니라 선택가능한 마커 유전자 발현의 레벨을 증가시키기 위해 이들이 이용된 방법에도 의존한다는 것은 자명한 사실이다.

식물 형질전환

식물 발현 벡터의 제작시에, 식물숙주내에 벡터를 도입하여 형질전환식물을 만드는 방법은 여러 가지가 있다. 이들 방법들은 (1) 아그로박테리움-매개 형질전환(A. tumefaciens 또는 A. rhizogenes)(예컨대, Lichtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol 6, PWJ Rigby, ed, London, Academic Press, 1987; and Lichtenstein, C.P., and Draper, J., In: DNA Cloning, Vol Ⅱ, D.M. Glover, ed, Oxford, IRI Press, 1985) 참조), (2) 입자 전달 시스템(particle delivery system)(예컨대, Gordon Kamm et al., Plant Cell 2:603 (1990); 또는 BioRad Technical Bulletin 1687, 참조); (3) 마이크로인젝션 프로토콜(microinjection protocols)(예컨대, Green et al., supra), (4) 폴리에틸렌글리콜(PEG)방법(예컨대, Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982); 또는 Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835(1988) 참조), (5) 리포좀-매개 DNA 흡수(liposome-mediated DNA uptake )(예컨대, Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:1353(1984) 참조), (6) 일렉트로포레이션 프로토콜(electroporation protocols) (예컨대, Gelvin et al., supra; Dekeyser et al., supra; Fromm et al., Nature 319:791(1986); Sheen, Plant Cell 2:1027(1990); or Jang and Sheen Plant Cell 6:1665(1994) 참조), 및 (7) 볼텍싱 방법(vortexing method) (예컨대 Kindle supra 참조)을 포함한다. 형질전환 방법은 본 발명에서 중요한 것은 아니다. 효과적인 형질전환을 달성할 수 있는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 새로운 방법이 형질전환 농작물 또는 기타의 숙주세포들에 이용될 수 있기 때문에, 이들을 직접 적용할 수도 있다.

이하에서 하나의 구체적인 기술, 즉 아그로박테리움-매개 식물 형질전환 방법을 개설한다. 이 기술에 의해, 식물세포의 게놈내에 유전자가 형질전환되도록 조작하는 일반적인 방법은 두 단계로 수행될 수 있다. 첫 째로, 클로닝 및 DNA 변형 단계는 이. 콜라이내에서 수행되고 목적으로 하는 유전자 구조물을 포함하는 플라스미드는 접합 또는 일렉트로포레이션에 의해 아그로박테리움내로 옮겨진다. 둘 째로, 그 결과로서 수득된 아그로박테리움 균주는 식물세포를 형질전환시키는데 이용된다. 따라서, 일반적인 식물발현벡터의 경우에, 플라스미드는 그것이 아그로박테리움 내에서의 복제할 수 있게 하는 복제기점과 이. 콜라이내에서 기능하는 고사본수 복제기점(high copy number origin of replication)을 포함한다. 이렇게 함으로써 아그로박테리움으로 옮긴후 식물세포내에 도입하기 이전에 이. 콜라이내에서 간이하게 형질전환 유전자를 생산하고 시험할 수 있다. 내성유전자들도 세균 내에서의 선택을 위해 벡터내에 포함시킬 수 있는데, 스트렙토마이신 및 카나마이신 내성 또는 제초제 내성을 코드화하는 유전자와 같은 식물에서 기능하는 다른 내성유전자들을 예로 들 수 있다. 하나 이상의 형질전환 유전자 및 아그로박테리움의 전달기능(transfer function)에 의해 인식될 때 식물로 전달되어야 하는 DNA 부위를 한정해 주는 방향성 T-DNA 경계 서열(directional T-DNA border sequences)들을 삽입하기 위해 벡터에는 제한 엔도뉴클레아제 부위들도 존재해야 한다.

다른 실시예에서, 식물세포들은 클로닝된 DNA가 실장된 텅스텐 마이크로프로젝타일(tungsten microprojectiles)을 식물에 발사함으로써 형질전환될 수도 있다. 발사에 이용되는 Biolistic Apparatus(Bio-Rad)에서, 포격위력 챠지(22 caliber Power Piston Tool Charge) 또는 공기-구동 폭발은 플라스틱 마이클프로젝타일을 총신을 통과하도록 구동한다. DNA가 침전되어 있는 텅스텐 입자들의 현탁액의 소분취량을 플라스틱 마이크로프로젝타일 앞에 위치시킨다. 플라스틱 마이크로프로젝타일은 마이크로프로젝타일이 통과하기에는 너무 작은 구멍을 갖는 아크릴 스토핑 플레이트에서 점화된다. 그 결과로 플라스틱 마이크로프로젝타일은 스토핑 플레이트에 세게 충돌하고 텅스텐 마이크로프로젝타일은 플레이트내의 구멍을 통해서 그들의 표적을 향해 날아간다. 본 발명에서 표적은 식물, 조직, 종자, 또는 배아일 수 있다. 마이크로프로젝타일에 의해 세포내에 도입된 DNA들은 그들이 핵 또는 엽록체내에 통합된다.

일반적으로, 형질전환유전자를 식물로 옮겨 발현시키는 것은 이제 당업자들에게 매우 루틴한 실무가 되었고 식물에서 유전자발현 연구를 수행하고 농업적 또는 상업적 목적으로 보다 개량된 품종들을 생산하는데 있어서의 주된 수단이 되었다.

형질전환 식물 재생(Transgenic Plant Regeneration)

식물 발현벡터들에 의해 형질전환된 식물 세포들은 재생될 수 있는데, 예를 들어, 표준 식물 배양 기술에 의해 단일 세포, 칼루스 조직, 또는 잎 디스크로부터 재생될 수 있다. 전체 식물의 임의의 부분으로부터의 다양한 세포들, 조직들, 또는 기관들이 성공적으로 배양되어 전체 식물로 재생될 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다; 이런 기술은 예컨대, 바실 등의 상술한 문헌, 그린 등의 상술한 문헌, 바이스바흐 및 바이스바흐의 상술한 문헌, 및 겔빈 등의 상술한 문헌에 기술되어 있다.

하나의 실시예에 있어서, EAS4 프로모터 및 노팔라인 신타제 터미네이터의 조절하에 있고 선택가능한 마커(예컨대, 카나마이신 내성)를 포함하는 클로닝된 키메라 신타제 폴리펩타이드는 아그로박테리움내에 형질전환된다. 벡터-포함 아그로박테리움에 의한 잎 디스크(예를 들어, 담배 잎 디스크)의 형질전환은 Horsch 등 (Science 227:1229 (1985)) 등에 의해 기술된 대로 수행할 수 있다. 형질전환체로 추정되는 것을 카나마이신(예컨대, 100 ㎍/㎖)을 포함하는 식물조직 배양배지상에서 수주후(예컨대, 3 내지 5주)후에 선택한다. 카나마이신-내성인 신생 부분( shoot)을 호르몬을 포함하지 않는 식물조직 배양배지에 놓고 뿌리가 내리게 한다. 카나마이신-내성 식물들을 온실에서 생장시키기 위해 선택한다. 바람직한 경우, 이어서 자가-수정된 형질전환 식물들의 종자들을 무토양 배지(soil-less medium)에 파종하고 온실에서 생육시킨다. 카나마이신-내성 자손들은 호르몬을 포함하지 않고 카나마이신을 포함하는 배지상에 표면 멸균처리된 종자들을 파종함으로써 선택된다. 형질전환 유전자의 통합(integration)의 분석은 표준 기술에 따라 행할 수 있다.(예컨대, 오스벨 등의 상술한 방법 및 겔빈 등의 방법 참조).

이어서 선택가능한 마커들을 발현하는 형질전환된 식물들을 표준 면역블로팅 및 DNA 검출 기술에 의해 형질전환된 DNA의 전달(transmission)에 대해 스크리닝한다. 각각의 양성 형질전환 식물들 및 그의 형질전환된 자손들을 동일한 형질전환유전자에 의해 만들어진 다른 형질전환 식물들과 비교해보면 모두 독특하다. 형질전환 유전자 DNA의 식물 게놈 DNA내로의 통합은 대부분의 경우에 무작위로 일어나고, 통합 부위는 형질전환 유전자의 발현의 정도, 조직 및 발생적 패턴에 상당한 영향을 미친다. 따라서, 가장 적합한 발현 거동을 갖는 식물을 동정해서 선별해내기 위해 다수의 형질전환 세포주들(Transgenic lines)을 각각의 형질전환 유전자에 대해 스크리닝한다.

형질전환 라인들은 일반적으로 형질전환유전자 발현 수준에 대해 시험된다. RNA 레벨에서의 발현을 먼저 측정하여 발현-양성 식물들을 동정하고 정량한다. RNA 분석을 위한 표준 기술을 이용하는데, 이러한 기술은 형질전환 유전자 RNA 주형들만 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하는 PCR 증폭 분석법 및 형질전환유전자-특이적 프로브들(예컨대, 오스벨 등의 상술한 문헌 참조)용액 혼성화 분석법을 포함한다. 이어서 RNA-양성 식물들을 키메라 신타제에 대해 특이적인 항체를 이용하는 웨스턴 면역블로팅 분석법에 의해 단백질 발현에 대해 조사한다(예컨대, 오스벨 등의 상술한 문헌 참조). 또한, 각각 형질전환유전자-특이적 뉴클레오티드 프로브 및 항체들을 이용하여 제 위치 혼성화(in situ hybridization) 및 면역세포화학법을 행함으로써 형질전환 조직 내에서의 발현 부위의 위치를 결정할 수 있다.

일단 재조합 키메라 신타제 단백질이 세포 또는 형질전환 식물(예를 들어, 상술한 바와 같은)에서 발현되면 예컨대 친화성 크로마토그래피와 같은 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 하나의 예로, 항-키메라 신타제 항체(예컨대, 오스벨 등의 상술한 문헌에 기술된 바와 같은 방법대로 생산되거나 표준기술에 의해 생산된)를 칼럼에 부착시겨 폴리펩타이드를 분리하는데 이용할 수 있다. 친화성 크로마토그래피하기 이전에 표준방법에 따라 키메라 신타제-생산 세포들을 용해 및 분획화할 수 있다(예컨대, 오스벨 등의 상술한 문헌 참조). 일단 분리되면, 필요한 경우 재조합 단백질을 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 추가로 정제할 수 있다(예컨대, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980 참조).

이러한 일반적인 폴리펩타이드 발현 및 정제 기술들은 유용한 키메라 신타제 단편들 또는 유사체들의 생산 및 분리에도 이용할 수 있다.

용도(Use)

본 발명은 여러 가지 농업적, 약품적, 산업적 및 상업적 목적에 유용하다. 예를 들어, 방법, DNA 구조물들, 단백질들 및 본원에 기술된 세균, 효모 및 식물을 포함하는 형질전환 유기체들은 이소프레노이드 합성, 제조 및 생산의 개량에 유용하다.

위에서 제시한 본 발명자들의 결과는 키메라 신타제의 제공에 의해 이소프레노이드 신타제 활성을 조절하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 이러한 방법으로, 다양한 신타제 반응 생성물들을 변형하고, 제어하고, 또는 조작하여 여러 가지 신타제 반응생성물의 생산, 예컨대, 신규한 모노테르펜, 디테르펜, 및 세스퀴테르펜의 생산을 향상시킬 수 있다. 이러한 화합물들은 파이토알렉신, 살충제, 방향제, 및 항균제 및 항진균제와 같은 약품으로 유용하다.

항진균, 항균, 항말라리아, 및 항종양 특성을 갖는 화합물들의 생산에 유용한 많은 키메라 이소프레노이드 신타제들이 유전자조작될 수 있다. 예를 들어, 항진균 이소프레노이드의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 신타제의 생산을 위해, 카스벤 신타제의 C-말단 도메인(Mau and West, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8497, 1994)이 TEAS, HVS 또는 CH9의 N-말단 도메인에 연결된다. 항균 화합물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 신타제의 생산을 위해, 시클로파네스논 신타제(Habtermariam et al., J. Nat. Prod. 56:140, 1993)의 5' 말단이 TEAS, HVS 또는 CH9의 N-말단 도메인에 연결된다. 항말라리아 화합물은 아르테미시안 신타제(El-Feraly et al., J. Nat. Prod. 52:196, 1989)의 C-말단과 TEAS, HVS 또는 CH9의 N-말단 도메인을 갖는 키메라 신타제들을 이용함으로써 생산할 수 있다. 항종량 화합물을 생산할 수 있는 신타제들은 탁사디엔 신타제(Koepp et al., J. Biol. Chem. 270:8686, 1995) 또는 헬레날린 신타제(Lee et al., Science 196:533, 1977)를 TEAS, HVS 또는 CH9의 N-말단 도메인과 연결함으로써 생산할 수 있다.

본 발명은 살충제를 생산할 수 있는 키메라 신타제의 생산에도 유용하다. 이러한 키메라 신타제들은 카디넨 신타제(Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324:255, 1995)의 C-말단 도메인을 TEAS, HVS 또는 CH9의 N-말단 도메인에 연결함으로써 유전자조작된다.

끝으로, 키메라 신타제들은 신규한 조미료 또는 향료의 생산에도 유용하다. 하나의 구체적인 예로, 신규한 조미료 및 향기의 생산을 위해, 키메라 신타제는 리모넨 신타제(Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016, 1993)의 C-말단 도메인을 TEAS, HVS 또는 CH9의 C-말단 도메인에 연결함으로써 유전자조작된다.

본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허들은 각각이 참고로 본원에 첨부된다고 구체적이고 개별적으로 언급된 바와 같이 참고자료로 본원에 첨부된다.

기타의 실시양태

전술한 설명으로부터, 당업자들은 본 발명의 필수적인 특징들을 쉽게 확인할 수 있고 그것이 다양한 용도 및 조건에 부합하도록 다양하게 변형 및 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태들도 본 청구범위에 포함된다.

서열 목록

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 켄터키

(ii) 발명의 명칭:

(iii) 서열수: 6

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 클라크 앤드 엘빙 엘엘피

(B) 거리: 패더럴 스트리트 176

(C) 도시: 보스톤

(D) 주: 매사추세츠

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 02110-2214

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: DOS

(D) 소프트웨어: 패스트SEQ 버전 #2.0

(vi) 현재 출원 자료:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일 :

(C) 분류:

(vii) 우선권 자료:

(A) 출원 번호: 08/631,341

(B) 출원일: 1996년 4월 12일

(C) 분류:

(viii) 대리인 정보:

(A) 이름: 폴 티. 클라크

(B) 등록번호: 30,162

(C) 참고 번호/문서번호:07678/011001

(ix) 연락 정보:

(A) 전화번호: (617) 428-0200

(B) 팩스번호: (617) 428-7045

(C) 텔렉스:

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

GGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT 30

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 17 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

AATACGACTCACTATAG 17

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

CGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA 27

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA 28

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 42 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT 42

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (올리고뉴클레오티드)

(xi) 서열 설명:

GGGATCGATAACTCTGCATAATGTAGCATT 30

먼저 도면에 관하여 설명한다.

Claims

제 2의 이종 이소프레노이드 신타제(second, heterologous isoprenoid synthase)로부터 유래된 제 2 도메인에 연결된 제 1 이소프레노이드 신타제로부터의 제 1 도메인을 포함하여, 제 2의 이종 이소프레노이드의 제 2 도메인이 없으면 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 이소프레노이드 신타제가 적어도 두 가지의 상이한 이소프레노이드 반응 생성물을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항에 있어서, 상기 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제의 제 2 도메인이 상기 키메라 이소프레노이드 신타제의 이소프레노이드 반응생성물의 비율을 결정하는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항에 있어서, 상기 제 1 이소프레노이드 신타제로부터의 제 1 도메인은 식물 이소프레노이드 신타제이고 제 2의 이종 이소프레노이드 신타제로부터의 제 2 도메인은 식물 이소프레노이드 신타제인 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 4항에 있어서, 상기 키메라 이소프레노이드 신타제가 (a) 담배-히오스시아무스 CH4 키메라 이소프레노이드 신타제; (b) 담배-히오스시아무스 CH10 키메라 이소프레노이드 신타제; (c) 담배-히오스시아무스 CH11 키메라 이소프레노이드 신타제; (d) 담배-히오스시아무스 CH12 키메라 이소프레노이드 신타제; (e) 담배-히오스시아무스 CH13 키메라 이소프레노이드 신타제; (f) 담배-히오스시아무스 CH14 키메라 이소프레노이드 신타제로 구성되는 군으로부터 선택되는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 이소프레노이드 신타제가 항진균제의 생산을 촉매하는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 이소프레노이드 신타제가 항살균제의 생산을 촉매하는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 이소프레노이드 신타제가 항종양제의 생산을 촉매하는 키메라 이소프레노이드 신타제.
제 1항의 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
제 9항의 DNA를 포함하는 벡터.
제 9항의 DNA를 포함하는 세포.
제 11항에 있어서, 상기 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 세포.
비대칭적으로 위치된 동종 도메인들(asymmetrically positioned homologous domain)을 포함하여, 키메라 이소프레노이드 신타제가 상기 도메인이 상기 키메라 이소프레노이드 신타제내의 그의 본래의 부위에 있을 때에는 생산되지 않는 이소프레노이드 반응생성물의 생산을 촉매할 수 있는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드.
(a); 세포내에서 발현하도록 위치된 제 9항의 DNA로 세포를 형질전환시키는 단계;

(b) 형질전환된 세포를 상기 DNA 발현을 위한 조건하에서 배양하는 단계; 및

(c) 상기 키메라 이소프레노이드 신타제를 회수하는 단계를 포함하는 키메라 이소프레노이드 신타제 폴리펩타이드의 제조방법.