CZ294613B6 - Polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy a způsob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidní syntázy spojenou s druhou doménou ze druhé heterologní isoprenoidní syntázy, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidních reakčních produktů, které jsou odlišné od reakčních produktů první isoprenoidní syntázy. Také je zde popsán polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidních reakčních produktů, které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující pozici v polypeptidu isoprenoidní syntázy. Je zde také popsán způsob přípravy polypeptidu chimérní isoprenoidní syntázy.ŕ

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká syntázových enzymů modifikovaných isoprenoidů, je kódujících genů a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Termín isoprenoid je použit pro označení rodiny sloučenin odvozených od isoprenové stavební jednotky. Zvláště rostlinné isoprenoidy zahrnují strukturálně různé skupiny, které mohou být rozděleny do tříd primárních a sekundárních metabolitů (obr. 1). Isoprenoidy patřící mezi primární metabolity zahrnují steroly, karotenoidy, růstové regulátory a polyprenolové substituenty dolicholů, chinonů a proteinů. Tyto sloučeniny jsou esenciální pro celistvost membrány, fotoochranu, uspořádání vývojových programů a pro kotvení důležitých biochemických funkcí do specifických membránových systémů. Isoprenoidy, které jsou klasifikovány jako sekundární metabolity, zahrnují monoterpeny, seskviterpeny a diterpeny. Má se za to, že tyto sloučeniny zprostředkovávají důležité interakce mezi rostlinami a jejich prostředím. Například, specifické terpenoidy jsou spojovány s interakcemi rostlina-rostlina (Stevens, v: Isopentoids in Plants, Nes W. D., Fuller, G a Tsai L. S. ed., Marcel Dekker, New York, str. 65-80, 1984), rostlina-hmyz (Gibson a Pickett, Nátuře 302: 608, 1983) a rostlina-patogen (Stoessl et al., Phytochemistry 15: 855, 1976).

Společným jmenovatelem této rozmanité skupiny sloučenin je jejich pětiuhlíkatá stavební jednotka, isopren. Pro vysvětlení biosyntetických výchozích bodů všech isoprenoidů odvozených od isoprenu byl využit „biogenní řád isoprenoidů“ (Ruzicka, Experientia 10:357, 1953).

Polymerizací dvou difosforylovaných isoprenových jednotek (např. IPP a dimethylallylu) vzniká geranyldifosfát (GPP), lineární C10 intermediát, který může být přeměněn na cyklické nebo lineární konečné produkty představující monoterpeny, nebo použit v dalším kole polymerizace. Přidáním třetí isoprenové jednotky k GTP vzniká farnesyldifosfát (FPP), který může být také přeměněn na cyklické nebo lineární konečné produkty představující seskviterpenovou třídu. Pokračující polymerizace a chemický diferenciační cyklus vedou ke vzniku dalších tříd terpenoidů, které se nazývají podle počtu isoprenových jednotek, např. přidáním třetího IPP k FPP vznikne geranylgeranyldifosfát (GGPP).

Tyto polymerizační reakce jsou katalyzovány přenyltransferásou, která řídí působení karbokationu (elektron-deficientní atom vzniklý ztrátou difosfátové části jednoho substrátu) na uhlíkový atom, bohatý na elektrony, dvojné vazby v IPP molekule (obr. 2). Elektrofilní povaha těchto reakcí je neobyčejně příbuzná obecnějším nukleofilním kondenzačním reakcím, ale takové reakce se jeví být běžné mezi reakcemi biosyntézy isoprenoidů, zejména reakcemi zahrnujícími enzymy katalyzující cyklizaci různých isoprenoidových intermediátů (Gerskenzon and Croteau, v: Lipid Metabolism in Plants, Moore, T. S., ed, CRC Press, Boča Raton, FL, str. 340-388). Enzymy, které jsou zodpovědné za cyklizaci GPP, FPP a GGPP se nazývají monoterpen-, seskviterpen- a diterpensyntázy a představují reakce přeměňující uhlík z obecné biosyntetické dráhy isoprenoidů na konečné produkty nezávisle ze tříd monoterpenů, seskviterpenů a diterpenů.

Dva důležité rozdíly mezi přenyltransferázovými a syntázovými reakcemi jsou vyznačeny na obr. 2. Prenyltransferázy katalyzují vznik vazby uhlík-uhlík mezi dvěma molekulami substrátu, zatímco syntázy katalyzují vznik intramolekulární vazby uhlík-uhlík. Prenyltransferázy také katalyzují reakce s velmi malými změnami v prostorovém uspořádání nebo délce výsledného polymeru. Prenyltransferázy se různí v délce allylových substrátů, které mohou být použity

-1 CZ 294613 B6 v iniciaci těchto reakcí. Syntázy jsou také substrátově specifické. Avšak například různé seskviterpensyntázy mohou využívat stejné substráty pro tvorbu různých produktů.

Biosyntézy isoprenoidů, jako např. cyklických terpenů jsou určeny klíčovými enzymy nazývanými terpensyntázy. Reakce katalyzované terpensyntázami jsou sdružené intramolekulární cyklizace, které mohou zahrnovat několik dílčích reakcí. Např. bioorganické principy cyklizace FPP pomocí dvou seskviterpensyntáz jsou vyznačeny na obr. 3. V kroku 1 je počáteční ionizace FPP následována intramolekulárním elektrofilním působením mezi uhlíkem nesoucím difosfátovou část a distální dvojnou vazbou za vzniku germakrenu A, makrocyklického intermediátu. Uzavření vnitřního kruhu a vznik eudesman karboniového iontu zahrnuje krok 2. Tabáková 5-epiaristolochensyntáza (TEAS) řídí v posledním kroku hydridový přesun, pohyb methylu a deprotonaci na C9, tím vzniká 5-epi-aristolochen, jak je uvedeno na obrázku lila. Hyoscyamus muticus vetispiradiensyntáza (VHS) sdílí mechanismus v kroku 1 a 2, ale liší se od TEAS ve třetí dílčí reakci, kde se objeví zmenšení kruhu způsobené pohybem páru elektronů. V každém případě katalyzuje monomerní protein, průměrně 64kD celý soubor dílčích reakcí a nevyžaduje jiné kofaktory než Mg⁺².

Podstata vynálezu

Obecně se vynález týká polypeptidu chimérní isoprenoidní syntázy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidní syntázy spojené s druhou doménou ze druhé heterologní isoprenoidní syntázy, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které jsou odlišné od reakčních produktů první isoprenoidní syntázy.

V preferovaných provedeních je chimérní isoprenoidní syntáza schopna katalyzovat produkci alespoň dvou různých isoprenoidních reakčních produktů; isoprenoidní reakční produkty jsou cyklické; druhá doména z druhé heterologní isoprenoidní syntázy také určuje poměr isoprenoidních reakčních produktů chimérní isoprenoidní syntázy; první doména z první isoprenoidní syntázy je rostlinná isoprenoidní syntáza a druhá doména z druhé heterologní isoprenoidní syntázy je také z rostlinné isoprenoidní syntázy. Přednostně je chimérní isoprenoidní syntáza vybrána ze skupiny složené z (a) tabák-Hyoscyamus CH4 chimérní isoprenoidní syntázy; (b) tabák-Hyoscyamus CH10 chimérní isoprenoidní syntázy; (c) tabák-Hyoscyamus CH11 chimérní isoprenoidní syntázy; (d) tabák-Hyoscyamus CH12 chimérní isoprenoidní syntázy; (e) tabák-Hyoscyamus CH13 chimérní isoprenoidní syntázy nebo (f) tabákHyoscyamus CH14 chimérní isoprenoidní syntázy, jak jsou zde popsány.

V preferovaných provedeních katalyzuje chimérní isoprenoidní syntáza produkci isoprenoidních reakčních produktů, které mají zemědělský, farmaceutický, komerční nebo průmyslový význam (např. fungicidní činidlo, antibakteriální činidlo nebo protinádorové činidlo).

Z jiného pohledu zahrnuje vynález DNA, vektory a buňky (např. E. coli, Saccharomyces cerevisiae, živočišné nebo rostlinné buňky) kódující nebo obsahující polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy.

Z jiného pohledu se vynález týká polypeptidu chimérní isoprenoidní syntázy, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidních reakčních produktů (přednostně cyklických), které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující pozici ve zmíněném polypeptidu isoprenoidní syntázy.

Z ještě jiného pohledu se vynález týká způsobu výroby polypeptidu chimérní isoprenoidní syntázy. Tento způsob zahrnuje: (a) použití buňky transformované DNA, která kóduje chimérní isoprenoidní syntázu, umístěnou pro expresi v této buňce; (b) pěstování transformované buňky za podmínek vhodných pro expresi a (c) získání chimérní isoprenoidní syntázy.

-2 CZ 294613 B6 „Isoprenoidní syntáza“ znamená polypeptid, který je schopen katalyzovat reakci zahrnující vznik intramolekulární vazby uhlík-uhlík u allyldifosfátového substrátu (např. Cjo, Ci₅ nebo C₂₀ allyldifosfátového substrátu) za vzniku isoprenoidního produktu (např. monoterpenového, diterpenového, seskviterpenového nebo sterolového). Příklady takovýchto isoprenoidních syntáz zahrnují monoterpensyntázy (například limonensyntázu), diterpensyntázy (například kasbensyntázu) a seskviterpensyntázy (například 5-epi-aristolochensyntázu, vetispiradiensyntázu a kadinensyntázu), které jsou zodpovědné za cyklizaci nezávisle geranyldifosfátu (GPP), farnesyldifosfátu (FPP) a geranylgeranyldifosfátu (GGPP). Tento výčet není omezující.

Rada terpensyntáz z rostlinných a mikrobiálních zdrojů byla izolována a charakterizována (viz např. Moestra a West, Arch. Biochem. Biophys. 238: 325, 1985; Hohn a Van Middlesworth, Arch. Biochem. Biophys. 251: 756, 1986; Hohn a Platter, Arch. Biochem. Biophys. 272: 137, 1989; Cane a Pargelli, Arch. Biochem. Biophys. 254: 421, 1987; Munck a Croteau, Arch. Biochem. Biophys. 282: 58, 1990; Alonso et al., J. Biol. Chem. 267: 7582, 1992; Sevage et al., J. Biol. Chem. 269: 4012, 1994; Croteau et al., Arch. Biochem. Biophys. 309: 184, 1994; Vogeli et al., Plant Physiol. 93: 182, 1990; Guo et al., Arch. Biochem. Biophys. 308: 103, 1994 aGambliel a Croteau J. Biol. Chem. 259:740, 1984). Obecně, terpensyntázy jsou rozpustné enzymy, které mají molekulovou hmotnost od asi 40 do 100 000. Geny kódující řadu monoterpen-, diterpen- a seskviterpensyntázy byly popsány u řady rostlina mikroorganismů (viz např. Hohn aBersmand, Gene 79:131, 1989; Proctor a Hohn, J. Biol. Chem. 268:4543, 1993; Facchiny aChappell, Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 11088, 1992; Back a Chappell, J. Biol. Chem. 270: 7375, 1995; Colby et al., J. Biol. Chem. 268: 23016, 1993; Mau a West, Proč. Nati. Acad. Sci. 91:8497, 1884; Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324:255, 1994 a Cane etal., Biochemistry 33: 5846, 1994).

„Polypeptid“ nebo „protein“ znamená jakýkoliv řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo posttranslační modifikace (např. glykosylaci nebo fosforylaci).

„Spojený s“ znamená kovalentně vázaný buď přímo, nebo nepřímo (např. domény jsou oddělené vmezeřenou aminokyselinovou sekvencí). Takovéto domény mohou být vázány jakýmkoliv způsobem, zahrnující bez omezování peptidovou vazbu nebo chemickou vazbu.

„Doména“ znamená souvislý úsek aminokyselin v rámci polypeptidu nebo proteinu.

„Isoprenoid“ znamená sloučenina, která je odvozena od isoprenové stavební jednotky. Obzvláště isoprenoidové sloučeniny zahrnují, bez omezování, monoterpeny, diterpeny, seskviterpeny a steroly. Jak je zde popsáno, isoprenoidy se nacházejí v řadě organismů, např. živočišných, houbových nebo bakteriálních.

„Asymetricky umístěný“ znamená umístěný v rámci chimérního polypeptidu v místě, které se liší od pozice v přirozeně se vyskytujícím polypeptidu.

„Heterologní“ znamená odvozený z různých zdrojů (v tomto případě různých polypeptidů). „Homologní“ znamená odvozený ze stejného zdroje (v tomto případě stejného polypeptidu).

Ostatní rysy a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu preferovaných provedení a z nároků.

Detailní popis

Chimérní isoprenoidní syntázy

Substitucí části genu, který kóduje doménu tabákové 5-epiaristolochensyntázy, částí genu, který kóduje doménu Hyoscyamus vetispiradiensyntázy, byly připraveny plazmidy určené pro expresi chimérní syntázy. Tyto plazmidy byly exprimovány v bakteriích, byly připraveny bakteriální lyzáty a ty byly testovány na seskviterpensyntázovou aktivitu. Zkoušky seskviterpensyntázové zahrnovaly argentation-thin layer chromatography (TLC), kterou byly rozeznány aristolochenové a vetispiradienové reakční produkty (Back a Chappell, J. Biol. Chem. 270: 7375, 1995). Jak ukazuje obr. 4A, bylo vytvořeno čtrnáct konstruktů chimémích syntáz, které byly testovány následovně.

Celé cDNA pro tabákovou 5-epi-aristolochensyntázu (TEAS) a Hyoscyamus vetispiradiensyntázu (HVS) byly jednotlivě vloženy do EcoRI/Xhol míst pBluescriptu SK (Stratagene) za vzniku pBSK-TEAS a pBSK-HVS plazmidů (Back a Chappell, J. Biol. Chem. 270: 7375, 1995). TEAS a HVS cDNA inserty těchto expresních plazmidů byly orientovány tak, že jejich translační startovní kódony sousedily s EcoRI restrikčním místem a jejich poly-A konce byly ohraničeny Xhol restrikčním místem pSK plazmidů.

Chimérní syntázy CH1, CH2, CH5 s CH7 byly připraveny za použití konzervovaných HindlII sNdel restrikčních míst, které byly nalezeny mezi geny tabáku a Hyoscyamus. CH1 byla připravena ligací 5’ terminální části TEAS genu (odpovídá fragmentu EcoRI á HINDIII) s 3’ terminální částí HVS genu (odpovídá fragmentu HindlII a KpnI) do bakteriálního expresního vektoru pGBT-T19 (Gold Biotechnology), který byl předštěpen EcoRI a KpnI.

CH2 byla připravena ligací 5’ terminální části TEAS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a Ndel) s 3’ terminální části HVS genu (odpovídá fragmentu Ndel a KpnI) do pGBT-T19.

CH5 byla připravena ligací 5’ terminální části HVS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a HindlII) s 3’ terminální částí TEAS genu (odpovídá fragmentu HindlII a KpnI) do pGBT-T19.

CH7 byla připravena ligací 5’ terminální části HVS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a Ndel) s 3’ terminální částí TEAS genu (odpovídá fragmentu Ndel a KpnI) do pGBT-T19.

CH3, CH4, CH12 a CH13 byly připraveny za použití běžných metod polymerázové řetězcové reakce (PCR) s primery navrženými pro amplifíkaci vybraných segmentů HVS genu. Pro usnadnění řízeného klonování a udržení čtecího rámce byly primery navrženy tak, že obsahují vhodná restrikční místa.

CH3 byla připravena následovně. EcoRI/Glal restrikční fragment TEAS genu byl izolován a ligován s Clal/KpnI fragmentem HVS genu. HVS Clal/KpnI fragment byl připraven metodou PCR za použití 5-díGGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT: SEK. i.č.: 1) _3’(ClaI restrikční místa podtrhnuta) jako přední primer a 5’-d(AATACGACTCACTATAG; SEK i.č.: 2) -3’ jako zpětný primer (odpovídá T7 sekvenci nacházející se ve vícenásobném klonovacím místě pBSK) a za použití pBSK-HVC jako DNA templát. Výsledný restrikční fragment byl ligován do EcoRI/Kpnl míst vektoru pGBT-T19.

CH4 a CH13 byly připraveny podobným způsobem, ale za použití předních amplifikačních primerů jednotlivě 5’-díCGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA; SEK i.č.: 3) -3' (HindlI restrikční místo podtrženo) a 5’-d(TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA; SEK i.č. 4) -3’(XbaI restrikční místo podtrženo).

C12 byla připravena ligací PCR fragmentu, který odpovídá prvním 1326 nukleotidům CH4, s Clal/KpnI fragmentem TEAS genu do EcoRI/Kpnl míst vektoru pGBT-19. CH4 fragment byl

-4CZ 294613 B6 připraven za použití předního amplifíkačního primeru 5’d(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT; SEK i.č.: 5) (EcoRI restrikční místo podtrženo a translační start kodon tučně) a zpětného primeru 5’-d(GGGATCGATAACTCTGC ATAATGTAGCATT; SEK i.č.: 6) (Clal restrikční místo podtrženo).

Chimérní syntázy CH6, CH8, CH9, CH10, CH11 a CH14 byly připraveny následovně. Ligací EcoRI/HindlII fragmentu HVS genu s HindlII/KpnI fragmentem CH3 vznikla CH6. CH8 vznikla ligací EcoRI/Ndel fragmentu HVS genu s Ndel/ KpnI fragmentem CH3. CH9 vznikla ligací EcoRI/Ndel fragmentu CH5 s Ndal/KpnI fragmentem HVS. CH10 byla připravena ligací EcoRI/HindlII fragmentu HVS genu s Hindlll/KpnI fragmentem CH4. CH11 byla připravena ligací EcoRI/Ndel fragmentu HVS genu s Ndel/ KpnI fragmentem CH4. A CH14 byla připravena substitucí EcoRI/Ndel fragmentu CH13 odpovídajícím DNA fragmentem pBSKHVS. Nukleotidová spojení chimérních konstruktů byla prověřena sekvenováním dvoušroubovicové DNA za použití kitu pro dideoxynukleotidovou terminaci řetězce, podle pokynů výrobce (U.S. Biochemical Corp).

Chimérní syntázy byly exprimovány v buňkách E. coli TB1. Postupy pro růst bakteriálních buněk, indukci exprese genu, měření aktivity seskviterpensyntázy a určení celkového proteinu v bakteriálním lyzátu byly provedeny podle metod popsaných v Back a Chappell (Arch. Biochem. Biophys. 315: 527, 1994; J. Biol. Chem. 270:7375, 1995). Reakční produkty byly odděleny vyvinutím G60 silikagelových TLC vrstev, impregnovaných 15% dusičnanem stříbrným v benzen:hexan:diethyletheru (50:50:1). Pro kvalitativní měření byly TLC vrstvy postříkány sprejem Enhance Surface Fluorography Spray (Dupont) a byly exponovány na film Kodak XAR5 po dobu 2-5 dní při -70 °C. Pro kvantitativní měření byly 0,5 mm části celých drah TLC vrstev seškrábány do scintilačních lahviček a byla změřena radioaktivita za použití scintilačního počítače Packard Liquid Scintillation Counter. Hlavní reakční produkty, vzniklé syntázovými aktivitami, které jsou výsledkem exprese konstruktů TEAS, HVS, CH4 a CH14, v bakteriálních lyzátech byly také ověřeny pomocí plynové chromatografie (GC) plynové chromatografiehmotnostní spektroskopie (GC-MS) způsobem popsaným v Chappell et al., Phytochemistry 26: 2259, 1987. Navíc byly profily získané hmotnostní spektroskopií porovnány s těmi publikovanými pro 5-epi-aristolochen (Anke a Sterner, Planta Med. 57: 344, 1991) a s předpovídaným fragmentačním vzorem pro vetispiradien (Enzell et al., Mass Spectrometry Rev. 3:395, 1984).

Jak ukazují obr. 4A-B, hlavním reakčním produktem, který je výsledkem působení enzymu vzniklého expresí TEAS genu, byl 5-opi-aristolochen a hlavním reakčním produktem, který je výsledkem působení enzymu vzniklého expresí HVS genu, byl vetispiradien. Převládající reakční produkty, které byly výsledkem působení enzymů vzniklých expresí CH1 a CH2, které měly enzymové aktivity podobné těm nalezeným pro HVS, jež byla exprimována z plazmidu pBSK-HVS, byly také HVS specifické (např. vetispiradien). Tyto výsledky naznačily, že aminoterminální poloviny TEAS a HVS genů jsou funkčně rovnocenné, s ohledem na karboxyterminální část, a nepřispívají ke specificitě reakčních produktů. CH7, která má HVS-aminoterminální část a TEAS-karboxyterminální část, je opakem CH2. Očekávalo se, že její výsledná syntázová aktivita dá vznik TEAS specifickému produktu (např. 5-epi-aristolochenu). Imunodetekční zkoušky ukázaly, že syntázový protein vzniklý při expresi CH7 byl správné velikosti a v očekávaném množství, avšak nebyla zjištěna žádná enzymová aktivita. Nepřítomnost enzymové aktivity naznačila, že interakce mezi karboxy a aminoterminální částí proteinu přispívají k enzymové aktivitě. Toto vysvětlení je dále podpořeno srovnáváním specifické aktivity enzymů, které vznikly expresí CH5 a CH6. Expresí CH5 vznikl produkt mající desetinásobně nižší specifickou syntázovou aktivitu než ostatní syntázy, i když celkové množství exprimovaného proteinu bylo podobné jako u ostatních konstruktů (určeno imunodetekcí, data nejsou uvedena). Zjistilo se, že záměnou karboxyterminální části za HVS- karboxyterminální část byla obnovena specifická aktivita syntázového enzymu, který vznikl expresí CH6.

Srovnání CH2 a CH3 chimérních syntáz poskytlo důkaz pro specificitu tvorby koncových produktů, za kterou je zodpovědná doména tvořená přibližně 181 aminokyselinami, což odpovídá

-5CZ 294613 B6

Ndel a Clal restrikčním místům v TEAS a HVS genech. Výsledkem exprese CH4 byla neočekávaně produkce chimémího syntázového proteinu, který je schopen tvorby reakčních produktů specifických pro oba, TEAS i HVS enzymy. Tento výsledek jsem byl vysvětlen tak, že naznačuje, že aminokyseliny 261-379 v rámci tabákové 5-epi-aristolochensyntázy jsou zodpovědné za TEAS-specifické produkty (např. úsek odpovídající Ndel/HincII fragmentu cDNA), zatímco aminokyseliny 379-442 v rámci proteinu z Hyoscyamus jsou zodpovědné za HVS-specifické produkty (např. úsek odpovídající HincII/Clal fragmentu cDNA).

Naše vysvětlení bylo potvrzeno testováním expresních produktů CH11 a CH12. Cil představuje záměnu Ndel/HimcII fragmentu z genu z Hyoscyamus za odpovídající fragment genu tabáku a výsledkem jeho exprese byl enzym mající HVS- a TEAS-specificitu. CH12 představuje záměnu HimcII/Clal fragmentu z genu tabáku za odpovídající fragment genu z Hyoscyamus a výsledkem jeho exprese byl enzym mající HVS- a TEAS-specificitu. Srovnání Cil s C13 poskytlo další znalost o doméně enzymu tabáku, která je zodpovědná za vznik TEAS-specifíckých produktů. Fakt, že bylo zjištěno, že C13 je multifunkční enzym, naznačil, že 81 aminokyselin kódovaných na DNA fragmentu mezi Ndel a Xbal restrikčními místy tabákové cDNA stačí pro tvorbu převládajících TEAS-specifických produktů. Toto vysvětlení bylo potvrzeno nahrazením domény obsažené mezi Ndel a Xbal restrikčními místy HVS cDNA odpovídajícím úsekem z TEAS genu u CH14 (obr. 4A).

Jak ukazuje obr. 4B, převažující produkt(y) vzniklý působením enzymů, které vznikly expresí genů divokého typu pro tabákovou TEAS a Hyoscyamus HVS, se pohybovaly po TLC vrstvě z dusičnanu stříbrného s hodnotami R_f0,41 a 0,31. Tyto hodnoty odpovídají dřívějšímu popisu těchto produktů jednotlivě jako 5-epi-aristolochen a vetispiradien (Back aChappell, J. Biol. Chem. 270:7375, 1995; Beck et al., Arch. Biochem. Biophys., 315: 527, 1994). GC a GC-MS analýzy ukázaly, že převažujícími reakčními produkty TEAS byly 5-epi-aristolochen (70 % všech produktů, založeno na procentním podílu z celkových vrcholů z GC analýzy) a bicyklický seskviterpen (20 %) ([M]⁺ iont při m/z 204). Převažujícím reakčním produktem HVS byl vetispirodien (> 90 %) ([M]⁺ iont při m/z 204 se základním vrcholem při m/z 41a řada předpověditelných iontů při m/z 175, 108, 94 a 68) a převažujícími reakčními produkty CH4 byl 5-epi-aristolochen (18 %), bicyklický seskviterpen (43 %) a vetispiradien (32 %).

Navíc studie využívající afinitní purifikaci rekombinantních syntázových proteinů s histidinovou kotvou odhalily dalších 5 minoritních reakčních produktů, z nichž každý představuje přibližně 1 % všech produktů a všech 5 bylo nalezeno ve stejném množství ve všech reakčních zkouškách.

Poměr určující doména

Srovnáním poměrů reakčních produktů produkovaných multifunkčními chimémími syntázovými enzymy (obr. 4A) byla identifikována další doména syntézy proteinu. Např. reakční produkty plynoucí z exprese konstruktů CH4, CH10, CH11 a CH12 vznikly v poměru 60 až 70% TEAS-specifických k 30 až 40 % HVS-specifickým. Naopak obrácený poměr reakčních produktů je výsledkem exprese konstruktů CH13 a CH14. Tento výsledek naznačil, že úsek obsažený v Xbal/HincII doméně ovlivňuje relativní poměr reakčních produktů produkovaných multifunkčními chimérními syntázovými enzymy. Tyto výsledky naznačily, že dvě oddělené a odlišné domény syntázového peptidu působí přímo na druh vzniklých reakčních produktů. Ty jsou rušeny jinou doménou, kterou nazýváme poměr určující doména (obr. 5).

Místně cílená mutageneze

Pro další analýzu domény určující specificitu produktů a domény určující poměr produktů byly použity obvyklé metody místně cílená mutageneze. Výsledky této analýzy jsou v tabulce I. Např. motiv DDXXD, nalezený v rámci aristolochen specifické domény, je konzervovanou sekvencí, která byla nalezena u řady enzymů pro biosyntézu terpenů, zahrnujíce TEAS a HVS. Má se za to, že tento shluk aminokyselin váže kovový kofaktor, který je nutný pro neutralizaci difosfátové

-6CZ 294613 B6 části FPP v jinak lipofílním obalu. Záměna prvního zbytku kyseliny asparagové (D301) motivu DDXXD za zbytek kyseliny glutamové (zachování celkového náboje) nebo valinu (zbytkové snížení kyselosti) (např. D301-E a D301-V) měla za následek vznik inaktivovaného enzymu. Záměna druhého zbytku kyseliny asparagové (D302) za zbytek kyseliny glutamové (např. D302-E) také zrušila aktivitu chimérního syntázového enzymu z 95 % a měla za následek mírnou změnu v rozložení produktů multifunkčního enzymu.

Tabulka I

Místa pro místně cílenou mutagenezi v rámci poměr určující domény (např. K347-I, H360-S, H364-S) byla odvozena rozborem prací, ve kterých je předpokládána důležitá role nabitých aminokyselinových zbytků (např. histidinu nebo lysinu) v syntázové enzymologii, a tato místa představují ty aminokyseliny, které vykazují nevětší rozdíl náboje při srovnání TEAS a HVS primárních sekvencí. Ani jedna ze tří analyzovaných mutací neměla žádný účinek na celkovou katalytickou aktivitu nebo poměr vzniklých produktů.

Záměny aminokyselin v rámci HVS specifické domény byly vybrány na základě porovnání předpověděné sekundární struktury proteinů HVS a TEAS. Ukázalo se, že aminokyseliny, které byly později mutovány, přispívají neúměrné ke strukturálním změnám modelů sekundární struktury těchto dvou proteinů hlavně kvůli velikosti náboje. Avšak, jak ukazuje tabulka I, záměny nabitých aminokyselin za nenabité (např. T408-A, K420-M, H422-A) nebo za méně nabité (N436-S, A437-T, V-438-I) neměly efekt na celkovou katalytickou aktivitu ani na úroveň syntézy jednoho či druhého produktu.

Klidová syntáza

Klidová syntáza je vytvořena, jak ukazuje obr. 6, záměnou inaktivní domény odpovídající exonu 4 z HVS za odpovídající aktivní doménu z CH3. CH3 obsahuje inaktivní doménu odpovídající exonu 6 z TEAS, má Ndel a Xbal restrikční místo pro požadovanou záměnu a může být exprimován v bakteriích na vysoké úrovni. Přesun domény je proveden za použití standardních molekulárních technik, jak je zde popsáno. Jedním příkladem je záměna PCR produktu HVS cDNA, který odpovídá exonu 4, obsahuje aminokyseliny 261 až 342 a také Ndel a Xbal restrikční místa z primerů, za odpovídající úsek CH3. Při tvorbě takovýchto konstruktů se dbá zejména na to, aby obsahovaly vhodné aminokyselinové zbytky a aby byl zachován správný čtecí rámec. Testování exprese konstruktů zahrnuje měření množství proteinu v rozpustné a nerozpustné frakci bakteriálních lyzátů pomocí imunoblotových technik a také testy enzymů.

Navíc byly provedeny enzymatické reakce ve velkém měřítku, reakční produkt(y) byly extrahovány v hexanu a byly vyčištěny pomocí metod HPLC. Byla provedena další měření reakčních produktů klidové syntázy za použití TLC a porovnání hodnot Rf standardů s hodnotami enzymů TEAS a HVS. Časy retence reakčních produktů (např. germakrenu nebo jemu podobných reakčních produktů) byly také monitorovány pomocí GC, GC-MS a NMR podle standardních metod.

Klidová syntáza je užitečná pro tvorbu dostatečného množství germakrenových reakčních intermediátů (nebo jejich derivátů) pro posílení chemické racionalizace reakcí EAS a VS, a tvoří templátovou chimérní syntázu, která může být použita pro zavedení nových terminálních kroků do celkového reakčního schématu.

Chimérní kasben- a kadinensyntáza

Chimérní isoprenoidní syntázy jsou také užitečné pro tvorbu nových makrocyklických isoprenoidů nebo isoprenoidů, které mají změněné prostorové uspořádání. Např. isoprenoidní syntáza jako např. kasbensyntáza, diterpensyntáza, která katalyzuje syntézu makrocyklického

-7CZ 294613 B6 diterpenu nesoucích cyklopropylovou boční skupinu, a kadinensyntáza, seskviterpensyntáza, která katalyzuje syntézu bicyklického seskviterpenu, poskytují domény užitečné pro přípravu enzymů schopných produkce makrocyklických isoprenoidů nebo isoprenoidů, které mají změněné prostorové uspořádání. Obecná schémata pro tvorbu takovýchto chimérních syntázje na obr. 7 a 8.

U konstruktů, jako např. chimérní kasben- a kadinensyntáza, jsou za aminoterminální domény klidové syntázy (nebo jiné syntázy, je-li to třeba) zaměněny domény z kasben- a kadinensyntázy za použití obvyklých restrikčních míst a PCR amplifíkace vybraných úseků jak je popsáno výše. Sekvence odpovídající N-terminální části, plastidová cílová sekvence kasbensyntázy je v těchto konstruktech oddělena. Chimérní konstrukty jsou exprimovány v bakteriích, bakteriální lyzáty jsou testovány na aktivitu chimérní syntázy a reakční produkty jsou charakterizovány, jak je popsáno výše, např. pomocí argentation-TLC. Konstrukty nesoucí vysokou hladinu syntázové aktivity v bakteriích a/nebo aktivitu pro tvorbu reakčních produktů, které se pohybuji s Rfs, který se liší od aristolochenových a vetispiradienových standardů, jsou v rámci vynálezu považovány za užitečné. Je-li to nutno jsou reakční produkty analyzovány pomocí GC, GC-MS a NMR. Ty domény kasbensyntázy a kadinensyntázy, které přispívají k syntéze jedinečných reakčních produktů mohou být také detailně mapovány za použití postupu, který je analogický k tomu zobrazenému na obr. 4A.

Tvorba jiných chimérních isoprenoidních syntáz

Za použití zde popsaných standardních molekulárních technik, mohou být snadno připraveny jiné chimérní syntázy, které obsahují domény ze známých nebo nově izolovaných syntázových enzymů. U takovýchto chimérních syntáz může být testována aktivita za použití např. jakýchkoliv vhodných zkoušek enzymů, které jsou známé odborníkům, (např. ty zde popsané), nebo standardních imunodetekčních technik.

Izolace sekvencí kódujících syntázy je také možná za použití standardních klonovacích technik, které jsou v oboru dobře známé. Např. za použití celé nebo jen části aminokyselinové sekvence polypeptidu známé syntázy se dají snadno navrhnout pro syntázu specifické oligonukleotidové sondy, zahrnující syntázové degenerované oligonukleotidové sondy (např. směs všech možných kódujících sekvencí pro danou aminokyselinovou sekvenci). Tyto oligonukleotidy mohou být založeny na sekvenci jednoho z řetězců DNA a jakékoliv vhodné části syntázové oligonukleotidové sekvence. Obecné metody pro navrhování a přípravu takovýchto sond jsou popsány např. v Ausubel et al., 1996, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, a Berger a Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academie Press, New York. Tyto oligonukleotidy jsou užitečné pro izolaci syntázového genu, kde mohou být použity jako sondy schopné hybridizace s komplementární sekvencí syntázy nebo jako primery pro různé amplifikační techniky, např. polymerázovou řetězovou reakci (PCR).

Hybridizační techniky a prohledávací postupy jsou odborníkům dobře známy a jsou popsány např. v Ausubel et al., (supra); Berger a Kimmel (supra); Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324: 255, 1995 a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Je-li to požadováno, může být pro prohledávání knihovny rekombinantní DNA použita kombinace různých oligonukleotidových sond. Tyto oligonukleotidy mohou být značeny za použití metod známých v oboru a mohou být užity pro sondování filtrové kopie knihovny rekombinantní DNA. Knihovny rekombinantní DNA jsou připraveny podle metod známých v oboru, popsaných např. v Ausubel et al., (supra) nebo se dají získat z komerčních zdrojů.

Jak je uvedeno výše, syntázové oligonukleotidy mohou být také použity jako primery v amplifikačních technikách, např. za použití PCR. Metody PCR jsou v oboru dobře známé a jsou popsány např. v PCR technology, Erlich, ed., Stockton Press, London, 1989; PCR Protocols: A Guide to Metods and Applications, Innis et al., Ed., Academie Press, lne., New York, 1990 a Ausubel et

-8CZ 294613 B6 al., (supra). Primery jsou volitelně navrženy tak, aby bylo možno vložit amplifíkovaný produkt do vhodného vektoru např. zahrnuje vhodná restrikční místa na 5’ a 3’ koncích amplifíkovaného fragmentu (jak je zde popsáno). Je-li to požadováno, může být syntázový gen izolován za použití PCR „RACE“ technik neboli Rapid Amplification of cDNA Ends (viz. Innis et al., (supra)). Při této metodě jsou oligonukleotidové primery, založené na syntázové sekvenci, orientovány ve směrech 3’ a 5’ a jsou použity pro vznik překrývajících se fragmentů. Tyto překrývající se 3’ a 5’ RACE produkty jsou kombinovány za vzniku intaktní cDNA plné délky. Tato metoda je popsána v Innis et al., (supra) a Frohman et al., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998, (1988).

Užitečné syntázové sekvence mohou být izolovány z jakéhokoliv vhodného organismu. Potvrzení příslušnosti sekvencí k syntázové rodině polypeptidů může být provedeno řadou obvyklých metod, např. porovnáním sekvencí. Navíc může být aktivita kteréhokoliv ze syntázových proteinů měřena jakýmikoliv zde popsanými technikami.

Exprese polypeptidů chimérní isoprenoid syntázy

Polypeptidy chimérní isoprenoidní syntázy mohou být produkovány pomocí transformace vhodné hostitelské buňky celou nebo částí DNA chimérní syntázy (např. cDNA chimérní syntázy popsané výše) ve vhodném expresním vektoru nebo plazmidovým konstruktem navrženým pro zvýšení exprese polypeptidů chimérní syntázy in vivo.

Odborníci v oboru molekulární biologie ocení, že se pro získání rekombinantního proteinu dá použít řada expresních systémů. Použití správné hostitelské buňky není v tomto vynálezu kritickým bodem. Protein chimérní syntázy může být produkován v prokaryotických buňkách, např. E. coli TB1, nebo v eukaryotických buňkách, např. Saccharomyces cerevisiae, savčích buňkách (např. COS 1 nebo NIH 3T3 buňkách), nebo v jakýchkoliv buňkách řady rostlin zahrnujících bez omezení řasy, druhy stromů, okrasné druhy, druhy ovoce mírného pásu, druhy tropického ovoce, druhy zeleniny, luštěnin, jednoděložné nebo dvouděložné rostliny nebo jakékoliv jiné rostliny komerčního nebo zemědělského významu. Tento výčet rostlin není omezující. Příklady obzvláště vhodných hostitelských buněk zahrnují buňky jehličnanů, petúnií, rajčat, brambor, tabáku, rodu Arabidopsis, salátu, slunečnice, řepky olejně, lnu, bavlny, cukrovky, celeru, sójových bobů, vojtěšky, rodu Medicago, kaki, rodu Vigna, okurky, mrkve, lilku, květáku, křenu, povijnice, topolu, ořešáku, jabloně, chřestu, rýže, kukuřice, prosa, cibule, ječmene, srhy laločnaté, ovsa, žita a pšenice. Tento výčet rostlin není omezující. Takovéto buňky jsou dosažitelné z řady zdrojů zahrnujících: Američan Type Culture Collection (Rockland, MD, USA); nebo od řady společností např. W. Atlee Burpee Seed Co. (Warminster, PA, USA), Park Seed Co. (Greenwood, SC, USA), Johnny Seed Co. (Albion, ME, USA) nebo Northrup King Seeds (Harstville, SC, USA). Popis a zdroje vhodných hostitelských buněk se dají najít ve Vasil I. K., Call Culture and Somatic Genetics of Plants, svazek I, II, III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academie Press, New York, 1984; Dixon R. A., Plant Cell Culture - aPractical Approach, IRL Press, Oxford University, 1985; Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, Academie Press, New York, 1987; a Gasser and Fraley, Science 244: 1293, 1989.

Při prokaryotické expresi je DNA kódující polypeptid chimérní syntázy nesena vektorem, který může být spojen s řídícími signály majícími vliv na expresi v prokaryotické buňce. Je-li to vyžadováno, může kódující sekvence na svém 5’ konci obsahovat sekvenci kódující jakoukoliv ze známých signálních sekvencí, schopnou působení na sekreci exprimovaného proteinu do periplazmatického prostoru hostitelské buňky, což usnadní získání tohoto proteinu a následné čištění. Nejčastěji používané prokaryoty jsou různé druhy E. coli, avšak mohou být použity i jiné mikrobiální kmeny. Používají se plazmidové vektory, které obsahují replikační počátek, selektovatelný markér a řídicí sekvence odvozené od druhů kompatibilních s mikrobiálním hostitelem. Příklady takovýchto vektorů jsou v Pouwels et al., (supra) nebo Ausbel et al., (supra). Běžně používané prokaryotické řídicí sekvence (také nazývané „regulační oblasti“) jsou zde definovány tak, že obsahují promotor iniciace transkripce, volitelně s operátorem, společně se sekvencemi ribozomálního vazebného místa. Běžně používané promotory pro řízeni exprese zahrnují beta

-9CZ 294613 B6 laktamázové (penicilinázové), laktózové (lac) (Chang et al., Nátuře 198: 1056 (1977), tryptofanové (Trp) Goeddel et al., Nucl. Acids: Res. 8: 4057 (1980) a tac promotorové systémy stejně jako od lambdy odvozený P_L promotor a ribozomální vazebné místo N-genu (Simatake et al., Nátuře 292: 128(1981)).

Jedním bakteriálním expresním systémem pro produkci polypeptidu chimérní syntázy je E. coli pET expresní systém (Novagen). V tomto expresním systému je DNA kódující polypeptid chimérní syntázy vložen do vektoru pET v orientaci umožňující expresi. Protože je gen chimérní syntázy pod kontrolou T7 regulačních signálů, je exprese chimérní syntázy indukována indukcí exprese T7 RNA polymerázy v hostitelské buňce. Toho je obvykle dosaženo použitím hostitelských kmenů, které exprimují T7 RNA polymerázu po indukci IPTG. Po expresi je rekombinantní polypeptid chimérní syntázy izolován standardními způsoby známými odborníkům, např. těmi zde popsanými.

Jiným bakteriálním expresním systémem pro produkci polypeptidu chimérní syntázy je pGEX expresní systém (Pharmacia). Tento systém využívá GST genový fúzní systém, který je navržen pro vysokou hladinu exprese genu nebo fragmentu genu jako fúzního proteinu s možností rychlé purifíkace a získání funkčního genového produktu. Požadovaný protein chimérní syntázy je spojen s karboxyterminální částí glutathion-S-transferázy ze Schistosoma japonicum a dá se snadno vyčistit z bakteriálního lyzátu pomocí afínitní chromatografíe za použití Glutathion Sepharose 4B. Fúzní protein se dá oddělit za mírných podmínek promytím glutathionem. Štěpení S-transferasové domény z fúzního proteinu je usnadněno přítomností míst rozpoznávaných proteázami, které jsou pro tato místa specifické, před touto doménou. Například proteiny exprimované v plazmidech pGEX-2T mohou být štěpeny trombinem; proteiny exprimované v pGEX-3X mohou být štěpeny faktorem Xa.

Při eukaryotické expresi závisí způsob transformace nebo transfekce a volba vektoru pro expresi polypeptidu chimérní syntázy na vybraném hostitelském systému. Transformační a transfekční metody u řady organismů, např. kvasinek Saccharomyces cerevisiae, jsou popsány např. v Ausubel et al., (supra); Weissbach a Weissbach, Metods of Plant Molecular Biology, Academie Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academie Publishers, 1990; Kindle K., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1228 (1990); Potrykus I., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biology 42: 205 (1991) a Biorad (Hercules, CA) Technical Bulletin 1687 (Biolistic Particle Delivery Systems). Expresní vektory mohou být vybrány z popsaných např. v Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P.H. Powels et al., 1985, dodatek 1987); Gasser a Fraley (supra); Clontech Molecular Biology Catalog (Catalog 1992/93 Tools for Molecular Biologist, Palo Alto, CA) a odkazech citovaných výše.

Jedním preferovaným eukaryotickým systémem je myší 3T3 fibroblastová hostitelská buňka transfekovaná expresním vektorem pMAM neo (Clontech). pMAM neo poskytuje: RSV-LTR enhancer vázaný na MMTV-LTR promotor indukovatelný dexamethasonem, SV40 replikační počátek, který umožňuje replikaci v savčích systémech, volitelný neomycinový gen, SV40 sestřihová a polyadenylační místa. DNA kódující polypeptid chimérní syntázy je vložen vektoru pMAM neo v orientaci umožňující expresi. Polypeptid chimérní syntázy je izolován jak je popsáno níže. Jiné preferované hostitelské buňky použité ve spojení s expresním vektorem pMAM neo zahrnují COS buňky a CHO buňky (nezávisle ATCC Accession Nos. CRL 1650 aCCL61).

Jinou možností je produkce polypeptidu chimérní syntázy stabilně transfekovanou savčí buněčnou linií. Řada vektorů vhodných pro transfekci savčích buněk je pro veřejnost dosažitelné, např. viz Pouwels et al., (supra), způsoby přípravy takovýchto buněčný linií jsou také veřejně dosažitelné, např. v Ausubel et al., (supra). V jednom příkladu je cDNA kódující polypeptid chimérní syntázy vložena do expresního vektoru, který zahrnuje gen pro dihydrofolatreduktasu (DHFR). Buňky, ve kterých je plazmid, a tím i gen kódující chimérní syntázu, integrován do chromozomu, jsou vyselektovány přidáním 0,01-300 mikroM methotrexátu do média (jak je

-10CZ 294613 B6 popsáno v Ausubel et al., supra). Tato selekce může být provedena u většiny typů buněk. Exprese rekombinantího proteinu může být zvýšena pomocí DHFR-řízené amplifikace transfekovaného genu. Způsoby selekce buněčných linií nesoucích amplifikované geny jsou popsány v Ausubel et al., (supra), takové metody obvykle využívají kultury v médiu, které obsahuje postupně rostoucí množství methotrexátu. Expresní vektory obsahující DHFR, které jsou běžně používány pro tento účel, zahrnují pCVSEIIDHrF a pAdD26SV(A) (popsané v Ausubel et al., (supra)). Mezi hostitelskými buňkami, preferovanými pro DHFR selekci stabilně transfekovaných buněčných linií nebo DHFR-řízenou genovou amplifikaci jsou kterékoliv hostitelské buňky popsané výše, nebo přednostně DHFR-deficientní CHO buněčné linie (např.: CHO DHFR-buňky, ATCC Accesion No. CRL 9096).

Polypeptid chimérní syntázy je přednostně tvořen stabilně transfekovanými rostlinnými buněčnými liniemi nebo transgenními rostlinami. Rada vektorů, vhodných pro stabilní transfekci rostlinných buněk nebo pro tvorbu transgenních rostlin je veřejně dosažitelná; takové vektory jsou popsány např. v Pouwels et al., (supra), Weissbach a Weissbach (supra) a Gelvin et al., (supra). Metody přípravy takovýchto buněčných linií jsou popsány např. v Weissbach a Weissbach (supra) a Gelvin et al., (supra). Obvykle obsahují rostlinné expresní vektory (1) klonovaný gen pro chimérní syntázu pod transkripční kontrolou 5’ a 3’ regulačních sekvencí a (2) hlavní selektovatelný markér. Takovéto rostlinné expresní vektory mohou také obsahovat, je-li to vyžadováno, promotorovou regulační oblast (např. zodpovědnou za indukovatelnou nebo konstitutivní expresi, okolím nebo vývojově regulovanou, nebo indukovatelnou patogenem nebo zraněním, nebo buněčně nebo tkáňově specifickou expresi), místo iniciace transkripce, ribozomální vazebné místo, místo terminace transkripce a/nebo polyadenylační signál. DNA sekvence chimérní syntázy tohoto vynálezu může být, je-li to požadováno, kombinována s jinými DNA sekvencemi řadou způsobů. DNA sekvence chimérní syntázy tohoto vynálezu může být použita s celým nebo částí sekvence genu normálně spojeného se syntázovým proteinem. Ze svých součástí je DNA sekvence, kódující chimérní syntázu, spojená v DNA konstrukt, který má regulační oblast iniciaci transkripce schopnou řídit transkripci a translaci v hostitelské buňce. Obecně budou takové konstrukty obsahovat regulační oblasti funkční v rostlinách, které, jak je zde uvedeno, obstarávají produkci chimérního syntázového proteinu. Otevřený čtecí rámec, kódující chimérní syntázový protein nebo jeho funkční část, bude spojen s 5’ koncem regulační oblasti iniciací transkripce, jako např. sekvencí, přirozeně se objevující v oblasti 5’ upstream syntázového strukturního genu. Je možno použít řadu jiných regulačních oblastí iniciaci transkripce, které obstarají konstitutivní nebo indukovatelnou regulaci.

Pro použití, kde je požadována vývojově, buněčně, tkáňově, okolím nebo patogenem indukovatelná exprese, se vhodné 5’ upstream nekódující oblasti dají získat z jiných genů, např. genů regulovaných během vývoje semen, vývoje embrya, listu nebo v odezvě na přítomnost patogena.

DNA konstrukty tohoto vynálezu mohou také obsahovat regulační oblasti terminace transkripce. Oblasti terminace transkripce mohou být poskytnuty sekvenci DNA kódující syntázový protein, nebo to mohou být vhodné oblasti terminace transkripce odvozené z jiných genových zdrojů. Oblast terminace transkripce bude obsahovat přednostně alespoň 1-3 kb sekvence 3’ strukturního genu, ze kterého je terminační oblast odvozena.

Takto geneticky upravené rostliny mají řadu použití v průmyslu a zemědělství, jak je uvedeno níže. Důležité je, že se tento vynález je aplikovatelný na krytosemenné a nahosemenné rostliny a snadno se zde dají využít jakékoliv nové nebo vylepšené transformační a regenerační metody.

Příkladem užitečného rostlinného promotoru podle vynálezu je promotor kaulimoviru, např. promotor viru mozaiky květáku (CaMV). Tyto promotory způsobují vysokou úroveň exprese ve většině rostlinných pletiv a jejich aktivita nezávisí na virem kódovaných proteinech. CaMV je zdrojem jak 35S, tak i 19S promotoru. Ve většině pletiv transgenních rostlin je CaMV 35S promotor silným promotorem (viz např. Oděli et al., Nátuře 313: 810 (1985). CaMV promotor je také vysoce aktivní v jednoděložných rostlinách (viz např. Dekeyser et al., Plant Cell 2: 591

- 11 CZ 294613 B6 (1990); Terada a Shimamota, Mol. Gen. Genet. 220: 389, (1990)). Navíc může být aktivita tohoto promotoru dále zvýšena (např. 2 až 10 krát) jeho duplikací (viz např. Kay et al., Science 236: 1290 (1987); Ow et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 4870 (1987) a Fang et al., Plant Cell: 141 (1989)).

Jiné užitečné rostlinné promotory zahrnují nopalinsyntázový promotor (An et al., Plant Physiol. 88: 457 (1988) a oktopinsyntázový promotor (Fromm et al., Plant Call 1: 977 (1989)). Tento výčet není omezující.

Pro jistá použití může být požadována tvorba produktu genu chimérní syntázy v příslušných pletivech, v příslušném množství nebo příslušném období vývoje. Pro tento účel existuje řada genových promotorů, z nichž každý má své vlastní charakteristiky regulačních sekvencí, které jsou regulovány v závislosti na vlivu okolí, hormonů a/nebo vývoje. Jsou zde zahrnuty genové promotory, zodpovědné za teplem regulovanou genovou expresi (viz např. Callis et al., Plant Physiol. 88: 965 (1988); Takahashi and Komeda, Mol. Gen. Genet. 219: 365 (1989); a Takahashi et al., Plant J. 2: 751 (1992)), světlem regulovanou genovou expresi (např. rbcS-3A z hrachu popsaný v Kuhlemeier et al., Plant Cell 1:471 (1389); rbcS promotor z kukuřice popsaný v Schaffner a Sheen, Plant Cell 3:997, (1991) nebo gen pro chlorofyl a/b vázající protein, nalezený u hrachu, popsaný v Simpson et al., EMBO J. 4: 2723 (1985)), hormonem regulovanou genovou expresi (např. ke kyselině abscisové (ABA) citlivá sekvence Em genu pšenice, popsané v Marcotte et al., Plant Cell 1:969 (1989); ABA indukovatelné HVA1, HVA22 a rd29A promotory popsané u ječmene a Arabidopsis v Straub et al., Plant Cell 6: 617 (1994), Shen et al., Plant Cell 7: 295 (1994)) a zraněním indukovanou genovou expresi (např. wunl popsaný v Siebertz et al., Plant Cell 1: 961 (1989) nebo orgánově specifickou genovou expresi (např. gen pro protein hlízově specifického uskladňování popsaný v Roshal et al., EMBO J. 6: 1155 (1987); gen pro 23-kDa zein z kukuřice popsaný v Schernthaner et al., EMBO J. 7: 1249 (1988); nebo gen pro beta-faseolin z fazolu obecného popsaný v Buston et al., Plant Cell 1: 839 (1989)) a patogenem indukovatelnou expresi popsanou v patentových přihláškách Chappell et al., US 8 471 983, 8 443 639 a 8 577 483, zde zahrnuty jako odkazy.

Vektory pro expresi v rostlinách mohou také volitelně obsahovat signály pro úpravu RNA, např. introny, které se ukázaly být důležitými pro účinnou syntézu a ukládáníRNA (Callis et al., Genes and Dev. 1: 1183 (1987)). Umístění sestřihových sekvencí může dramaticky ovlivnit hladinu exprese transgenu v rostlinách. Vzhledem k tomu může být intron umístěn v transgenu před nebo za sekvencí kódující polypeptid chimérní syntázy za účelem upravování hladiny genové exprese

Navíc mohou vedle již zmíněných 5’ regulačních sekvencí expresní vektory obsahovat také regulační úseky, které jsou obvykle ve 3’ oblasti rostlinných genů (Thomburg et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 744 (1987); An et al., Plant Cell 1: 115 (1989)). Například pro zvýšení stability mRNA může expresní vektor obsahovat 3’ terminátorovou oblast. Jedna taková terminátorová oblast může být odvozena od PI-II terminátorové oblasti z bramboru. Navíc, jiné běžně používané terminátory jsou odvozené od oktopin- nebo nopalinsyntázových signálů.

Vektory pro expresi v rostlinách také obvykle obsahují geny pro hlavní selektovatelný markér, které se používají pro identifikaci těch buněk, které byly transformovány. Užitečné selektovatelné geny v rostlinných systémech zahrnují geny kódující rezistenci k antibiotikům, např. ty kódující rezistenci k hygromycinu, kanamycinu, bleomycinu, G418, streptomycinu nebo spectinomycinu. Geny pro fotosyntézu nohou být také použity jako selektovatelné markéry u druhů, které nejsou schopny fotosyntézy. Jinou možností je použití zeleně fluoreskujícího proteinu z medúzy Aequorea victoria jako selektovatelného markéru (Sheen et al., Plant J. 8: 777, 1995; Chiu et al., Current Biology 6: 325 (1996)). Nakonec, jako selektovatelné markéry se dají použít také geny kódující rezistenci k herbicidům; užitečné geny kódující rezistenci proti herbicidům zahrnují bar gen kódující enzym fosfínotricinacetyltransferasu a poskytuje rezistenci proti širokospektrému herbicidu Basta® (Hoechst AG, Frankfurt, Německo).

- 12CZ 294613 B6

Účinné použití seíektovatelných markérů je usnadněno určením citlivosti rostlinné buňky k selektovatelné látce a určení koncentrace této látky, která účinně usmrtí většinu, ne-li všechny, transformovaných buněk. Některé užitečné koncentrace antibiotik pro transformaci tabáku zahrnují např. 75 až 100 pg/ml (kanamycin), 20 až 50 pg/ml (hygromycin) nebo 5 až 10 pg/ml (bleomycin). Užitečná strategie pro selekci transformantů na rezistenci k herbicidům je popsána např. Vasilem et al., supra.

Pro odborníka v oboru molekulární biologie, zejména molekulární biologie rostlin, je zřejmé, že hladina genové exprese nezávisí pouze na kombinaci promotorů, signálů pro úpravu RNA a terminátorových oblastí, ale také na tom, jak jsou tyto úseky použity pro zvýšení exprese genu pro selektovatelný markér.

Transformace rostliny

Při přípravě vektoru pro expresi v rostlinách existuje několik standardních metod zavedení vektoru do hostitelské buňky, čímž vznikne transgenní rostlina. Tyto metody zahrnují (1) Agrobacteriem zprostředkovanou transformaci (A. tumefaciens, A. rhizogenes) (viz např. Lichtenstein and Fuller v Genetic Engineering, svazek 6, PWJ Rigby, ed., London, Academie Press, 1987) a Lichtenstein C.P. and Draper J., v DNA Cloning, svazek II, D.M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985)), (2) částicový vektorový systém (viz např. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603 (1990); nebo BioRad Technical Bulletin 1687, supra), (3) mikroinjekční postupy (viz např. Green et al., supra), (4) polyethylenglykolové (PBG) postupy (viz např. Draper et al., Plant Cell Physiol. 23: 451 (1982); nebo např. Zhang a Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988)), (5) lipozómem zprostředkované přijetí DNA (víz např. Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353 (1984)), (6) elektroporační postupy (viz např. Gelvin et al., supra; Dekeyser et al., supra; Fromm et al., Nátuře 319: 791 (1986); Sheen, Plant Cell 2: 1027 (1990) nebo Jang a Sheen, Plant Cell 6: 1665 (1994)) a (7) třepací metodu (viz např. Kindle supra). Způsob transformace není kritickým bodem předkládaného vynálezu. Může být použit jakýkoliv způsob, kterým je dosaženo účinné transformace. Když budou dosažitelné novější metody transformace obilí nebo jiných hostitelských buněk, mohou být přímo použity.

Následující příklad nastiňuje jednu takovou techniku, transformaci rostliny zprostředkovanou Agrobacteriem. Při použití této techniky, je manipulace s geny, které mají být přeneseny do genomu rostliny, provedena ve dvou fázích. Za prvé je provedeno klonování a modifikace DNA v E. coli a plazmid obsahující náš gen je přenesen konjugací nebo elektroporací do Agrobacteria. Za druhé je výsledný kmen Agrobacteria použit pro transformaci hostitelské rostlinné buňky. Plazmid, obecně vektor pro expresi v rostlinách, obsahuje počátek replikace, umožňující replikaci v Abrobacteriu a zdroj velkého počtu kopií replikace, funkční v E. coli. To umožňuje jednoduchou produkci a testování v E. coli před přenesením do Agrobacteria, pro následné zavedení do rostliny. Vektorem mohou být neseny geny pro rezistenci, jeden pro selekci v bakteriích, např. streptomycin, a druhý, který funguje v rostlinách, např. gen kódující rezistenci ke kanamycinu nebo herbicidům. Vektor nese také místa pro restrikční endonukleasy, pro vložení jednoho nebo více transgenů, a přímé koncové repetice T-DNA, které, když jsou rozeznány transferovými funkcemi Agrobacteria, vymezí oblast DNA, která bude přenesena do rostliny.

Jiným příkladem může být transformace rostlinné buňky vstřelením wolframového mikroprojektilu, na kterém je vysrážena klonovaná DNA, do buňky. V Biolistic Appartus (Bio-Rad), použitém pro vstřelení, byla pro průlet plastikového makroprojektilu hlavní použita náplň prachu (22 Caliber Power Piston Tool Charge) nebo vháněný vzduch. Na přední stranu plastikového makroprojektilu bylo umístěn alikvótní množství suspense wolframových částic, na kterých se vysrážela DNA. Takto upravený makroprojektil je vstřelen do akrylové brzdicí desky, v níž je otvor, který je příliš malý pro to, aby jím mohl makroprojektil proletět. Výsledkem je, že se plastikový makroprojektil rozbije o brzdicí vrstvu a wolframové mikroprojektily pokračují skrze otvor ve vrstvě ke svému cíli. Pro předkládaný vynález může tímto cílem být rostlinná buňka,

- 13 CZ 294613 B6 semeno nebo embryo. DNA, zavedená na mikroprojektilech do buňky se integruje do jádra nebo do chloroplastu.

Obecně, přenos a exprese transgenu v rostlinné buňce jsou dnes pro odborníky v oboru rutinní záležitostí a staly se hlavním nástrojem studií genové exprese a tvorby vylepšených rostlinných odrůd zemědělského nebo komerčního zájmu.

Regenerace transgenní rostliny

Rostlinné buňky transformované vektorem pro expresi v rostlinách se mohou regenerovat např. ze samotných buněk, kalusových tkání nebo listových terčů podle standardních technik rostlinných tkáňových kultur. Odborníkům je známo, že mohou být úspěšně pěstovány různé buněčné tkáně a orgány z téměř všech rostlin za účelem regenerace celé rostliny; takovéto techniky jsou popsány např. v Vasil, supra; Green et al., supra; Weissbach, supra a Gelvin et al., supra.

V jednom příkladu je klonovaný polypeptid chimérní syntázy, který je pod kontrolou EAS4 promotoru a terminátoru nopalinsyntázy a který nese selektovatelný markér (např. rezistenci ke kanamycinu) transformován do Agrobacteria. Je provedena transformace listových terčů (např. listových terčů tabáku) Agrobacteriem obsahujícím tento vektor, způsobem popsaným Horschom et al., (Science 227: 1229 (1985)). Transformanty jsou selektovány po několika týdnech (např. 3 až 5 týdnech) na médiu rostlinné tkáňové kultury obsahujícím kanamycin (např. 100 pg/ml). Kanamycin-rezistentní transformanty se poté umístí na médium rostlinné tkáňové kultury bez hormonů pro růst kořene. Kanamycin-rezistentní rostliny jsou dále selektovány na skleníkový růst. Je-li to požadováno, semena samooplozené transgenní rostliny mohou být poté vysazena na bezpůdní médium a nechají se růst ve skleníku. Kanamycin-rezistentní potomstvo je selektováno vysetím povrchově sterilizovaných semen na kanamycin obsahující médium bez hormonů. Analýza integrace transgenu je provedena standardními technikami (viz např. Ausubel et al., supra; Gelvin et al., supra).

Transgenní rostliny exprimující selektovatelný markér jsou déle vybírány podle toho zda došlo k přenosu transgenní DNA standardními immunoblotovými a DNA detekčními technikami. Každá pozitivní transgenní rostlina a její transgenní potomstvo je unikátní ve srovnání s jinými transgenními rostlinami obsahujícími stejný transgen. Integrace transgenní DNA do genomové DNA rostliny je ve většině případů náhodná a místo integrace může silně ovlivnit stupeň atkáňový a vývojový profil exprese transgenu. V důsledku toho je z řady transgenních linií vybírána pro každý transgen rostlina s nejvhodnějším profilem exprese.

Obecně je u transgenních linií měřena hladina exprese. Nejdříve je pro identifikaci a určení množství rostlin schopných exprese použito měření exprese na úrovni RNA. Používají se standardní techniky pro analýzu RNA. Ty zahrnují PCR amplifikaci, používající oligonukleotidové primery navržené tak, aby byla amplifikována pouze transgenní RNA, a hybridizaci v roztoku, používající transgen-specifické sondy (viz např. Ausubel et al., supra). RNA-pozitivní rostliny jsou poté analyzovány na expresi proteinu Western immunoblotovou analýzou; používající specifické protilátky proti chimérní syntáze (viz. např. Ausubel et al., supra). Navíc, pro zjištění místa exprese v transgenní tkáni můžou být provedeny hybridizace in šitu a imunocytotochemické metody podle standardních protokolů za použití transgen-specifických nukleotidových sond a protilátek.

Chimérní syntáza exprimovaná v jakékoliv buňce nebo transgenní rostlině (např. jak je popsáno výše) může být izolována např. za použití afinitní chromatografíe. Jedním příkladem je použití protilátky proti chimérní syntáze vázané na koloně (např. připravené způsobem popsaným v Ausubel et al., supra) pro izolaci tohoto polypeptidu. Lýze a fragmentace buňky produkující chimérní syntázu před afinitní chromatografií může být provedena standardními metodami (viz Ausubel et al., supra). Izolovaný protein může být, je-li to požadováno, dále purifikován

- 14CZ 294613 B6 např. pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografíe (viz. např. Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed., Work a Burdon, Elsevier, 1980).

Tyto obecné techniky exprese a purifikace polypeptidů mohou být také použity pro produkci a izolaci užitečných analogů nebo fragmentů chimérních syntáz.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je schématická ilustrace ukazující biosyntetickou dráhu isoprenoidů s ohledem na druh koncových produktů a jejich fyziologickou funkci. Přerušované šipky označují vícenásobné kroky nebo reakce.

Obr. 2 je schématická ilustrace ukazující různé reakce, které jsou katalyzovány prenyltransforasami a terpensyntázami.

Obr. 3 je schématická ilustrace ukazující reakční mechanismus syntézy eremofílanu (tabáková 5-epi-aristolochensyntáza, TEAS) a vetispiradienu (Hyoscyamus vetispiradiensyntáza, HVS) za účasti seskviterpensyntáz. Dílčí reakce 1 a 2 jsou považovány za běžné u obou typů syntáz. Rozdíly v mechanismu dílčích reakcí 3a a 3b jsou dostatečné, jak je ukázáno, pro tvorbu různých reakčních produktů.

Obr. 4A je schématická ilustrace ukazující chimérní konstrukty, použité pro mapování katalytických domén v rámci seskviterpensyntáz. Jsou zde znázorněna schémata složení seskviterpensyntázových genů divokého typu (např. TEAS a HVS) a chimérních seskviterpensyntázových genů (CH1-CH14), které byly připraveny v bakteriálním expresním vektoru pGBT-T19. Genové konstrukty byly připraveny za použití kombinace zde přítomných míst pro restrikční endonukleasy a amplifikace vybraných úseků pomocí PCR a PCR primerů poskytujících běžná místa pro restrikční endonukleasy. Pozice aminokyselin odpovídající jedinečným místům pro restrikční endonukleasy a jsou vyznačeny.

Obr. 4B je fotografie TLC ukazující syntázové aktivity v sonikovaných lyzátech buněk E. coli TB1 exprimujících TEAS, HVS a chimérní syntázové konstrukty (CH1-CH14), měřené pomocí 3H-FPP. Reakční produkty byly odděleny pomocí argentation-TLC a byly detegovány autoradiograficky. Radioaktivita v 0,5 mm segmentech každé dráhy argentation-TLC vrstvy byla určena ve scintilačním počítači a radioaktivita v drahách TEAS a HVS specifických produktů byla označena jako 100 %.

Obr. 5 je schématická ilustrace ukazující odpovídající si exony a funkční domény v rámci isoprenoidní syntázy. Vrchní diagram představuje organizaci exonů v rámci TEAS genu, která je téměř identická s organizaci HVS a kasbensyntázových genů. Spodní diagram ukazuje uspořádání funkčních domén v TEAS a HVS genech. Čísla exonů jsou uvedena u horního diagramu a všechna ostatní čísla se týkají pozicí aminokyselin, z nichž některé odpovídají zmíněným místům pro restrikční endonukleázy.

Obr. 6 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu klidové syntázy (QH1). Přenesením inaktivní HVS domény odpovídající exonu 4 do CH3 má za následek vznik syntázy, která má změněnou enzymovou aktivitu.

Obr. 7 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu chimérní klidové kasbensyntázy, a možné reakční produkty.

Obr. 8 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu chimérní klidové- kadinensyntázy, a možné reakční produkty.

- 15CZ 294613 B6

Příklady provedení vynálezu

Zde popsaný vynález je užitečný pro řadu zemědělských, farmaceutických, průmyslových a komerčních účelů. Například tyto způsoby, DNA konstrukty, proteiny a transgenní organismy, zahrnujíce bakterie, kvasinky a rostliny zde popsané jsou užitečné pro zlepšení syntézy, zpracování a výroby isoprenoidů.

Naše výsledky prezentované výše ukázaly, že vytvořením chimémí isoprenoidní syntázy je možné upravovat isoprenoidní syntázovou aktivitu. Tímto způsobem mohou být různé syntázové reakční produkty modifikovány, řízeny nebo manipulovány a výsledkem je zvýšení produkce řady syntázových reakčních produktů, např. produkce nových monoterpenů, diterpenů a seskviterpenů. Takovéto sloučeniny jsou užitečné jako fytoalexiny, insekticidy, parfémy a farmaceutika, jako např. antibakteriální a fungicidní látky.

Může být vytvořena řada chimémích isoprenoidních syntáz, které jsou užitečné např. pro výrobu sloučenin, které mají fungicidní, antibakteriální, antimalariové a protinádorové schopnosti. Např. pro výrobu chimérní syntázy, schopné katalyzovat vznik fungicidních isoprenoidů, je spojena C-terminální doména kasbensyntázy (Mau a West, Proč. Nati. Acad. Sci. 91:8497, 1994) s N-terminální doménou TEAS, HVS nebo CH9. Pro výrobu chimémí syntázy, schopné katalyzovat vznik antibakteriálních sloučenin, je spojena C-terminální doména cyklofamesenonsyntázy (Habtermarian et al., J. Nati. Prod. 56: 140, 1993) s N-terminální doménou TEAS, HVS nebo CH9. Produkce antimalariových sloučenin je dosaženo použitím chimérní syntázy, která má C-terminální doménu z artemisiansyntázy (El-Farley et al., J. Nati. Prod. 52: 196, 1989) a N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9. Syntázy schopné produkce protinádorové sloučeniny jsou vytvořeny spojením C-terminální domény z taxadiensyntázy (Koapp et al., J. Biol. Chem. 270: 8686, 1995) nebo z helenalinsyntázy (Lee et al., Science 196: 533, 1977) s N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9.

Tento vynález je také užitečný pro výrobu chimémích syntáz, které jsou schopné katalyzovat vznik insekticidů. Takové chimérní syntázy jsou vytvořeny spojením C-terminální domény z kadinensyntázy (Chen et al., Arch Biochem. Biophys. 324: 255, 1995) s N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9.

Konečně, chimérní syntázy jsou také užitečné pro tvorbu nových příchutí a parfémů. Jedním příkladem je, pro výrobu nových příchutí a aroma, vytvoření chimémí syntázy spojením C-terminální domény z limonensyntázy (Colby et al., J. Biol. Chem. 268:23016, 1993) s N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9.

Všechny zde zmíněné publikace a patenty jsou zde zahrnuty odkazem ve stejném rozsahu jako kdyby každá jednotlivá publikace nebo patent byly samostatně označeny jako zde zahrnuté odkazem.

Jiná provedení

Z předcházejícího popisu může odborník v oboru lehce zjistit podstatné vlastnosti tohoto vynálezu a může vytvořit řadu změn a modifikací tohoto vynálezu pro jeho přizpůsobení různému použití a podmínkám. Jiná provedení jsou tedy také součásti nároků.

-16CZ 294613 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) ŽADATEL: Board of Trustees of University of Kentucky (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: CHIMÉRNÍISOPRENOIDNÍ SYNTÁZY A ZPŮSOB JEJICH PŘÍPRAVY (iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) ADRESA (A) ADRESÁT: Clark & Elbing LLP (B) ULICE: Federal Street 176 (C) MĚSTO: Boston (D) STÁT: USA (F) KÓD: 02110-2214 (v) POČÍTAČEM ZPRACOVATELNÁ FORMA (A) MÉDIUM: Disketa (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ verze 2.0 (vi) SOUČASNÁ DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PV 1998-3179 (B) DATUM VYPLNĚNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(vii) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/631 341 (B) DATUM VYPLNĚNÍ: 12. 4. 96 (viii) INFORMAGE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Paul T. Clark (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 30 162 (C) ČÍSLO OSVĚDČENÍ: 07678/011001 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 617-428-0200 (B) TELEFAX: 617-428-7045 (C) TELEX:

(2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 1 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární

-17CZ 294613 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. I. Č.: 1

GGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT (2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. I. Č.: 2

AATACGACTCACTATAG (2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 3 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. I. Č.: 3

CGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA (2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 4 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. I. Č.: 4

TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA (2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 5 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina

-18CZ 294613 B6 (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. I. Č.: 5

GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT (2) INFORMACE O SEK. I.Č.: 6 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (oligonukleotid)

Claims (14)

1. Polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidní syntázy připojenou ke druhé doméně ze druhé heterologní isoprenoidní syntázy, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidních reakčních produktů, které jsou odlišné od reakčních produktů první isoprenoidní syntázy.

2. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde chimérní isoprenoidní syntáza je schopná katalyzovat produkci alespoň dvou různých isoprenoidních reakčních produktů.

3. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde druhá doména ze druhé, heterologní isoprenoidní syntázy také určuje poměr isoprenoidních reakčních produktů chimérní isoprenoidní syntázy.

4. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde první doména z první isoprenoidní syntázy je rostlinná isoprenoidní syntáza a druhá doména z druhé heterologní isoprenoidní syntázy je z rostlinné isoprenoidní syntázy.

5. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde chimérní isoprenoidní syntáza je vybrána ze skupiny složené z (a) tabák-Hyoscyamus CH4 chimérní isoprenoidní syntázy; (b) tabákHyoscyamus CH10 chimérní isoprenoidní syntázy; (c) tabák-Hyoscyamus CH11 chimérní isoprenoidní syntázy; (d) tabák-Hyoscyamus CH12 chimérní isoprenoidní syntázy; (e) tabákHyoscyamus CH13 chimérní isoprenoidní syntázy nebo (f) tabák-Hyoscyamus CH14 chimérní isoprenoidní syntázy.

-19CZ 294613 B6

6. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde tato isoprenoidní syntáza katalyzuje produkci fungicidní látky.

7. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde tato isoprenoidní syntáza katalyzuje produkci antibakteriální látky.

8. Chimérní isoprenoidní syntáza podle nároku 1, kde tato isoprenoidní syntáza katalyzuje produkci proti nádorové látky.

9. DNA kódující polypeptid chimérní isoprenoidní syntázu podle nároku 1.

10. Vektor obsahující DNA podle nároku 9.

11. Buňka obsahující DNA podle nároku 9.

12. Buňka podle nároku 11, kde touto buňkou je E. coli.

13. Polypeptid chimérní isoprenoidní syntázy podle nároků 1 až 8, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, čímž je chimérní isoprenoidní syntáza schopná katalyzovat produkci isoprenoidních reakčních produktů, které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující pozici v polypeptidu isoprenoidní syntázy.

14. Způsob přípravy polypeptidu chimérní isoprenoidní syntázy podle nároků 1 až 8 a 13, vyznačující se tím, že (a) se použije buňka transformovaná pro expresi v této buňce, (b) tato transformovaná buňka se pěstuje za podmínek vhodných pro expresi zmíněné DNA a (c) získá se chimérní isoprenoidní syntáza.