TW509724B - Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof - Google Patents

Description

509724 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關於一種經改質之異戊間二烯合成_ (isoprenoid synthase)酵素，其編碼基因，及其用途。 類異戊間二烯意指一個衍生自異戊間二烯建構區段 之系列化合物。特別是植物類異戊間二烯包括結構上不 同之一級及二級代謝產物化合物(圖1” 一級類異戊間二 烯包括固醇、類胡蘿蔔素、生長調節素與多醇、苯酮及 蛋白質等聚戊醇取代基。這些化合物分別對於細胞膜整 合性、光保護性、發展過程之結合性，以及穩定特定膜 系統之生化機能非常重要。被區分爲二級類異戊間二烯 包括單萜，倍半萜，及雙萜。這些化合物可調節植物與 環境間之重要的交互反應。例如植物-植物間（Steven,於 ，Nes，W.D.Fiiller，G，·與Tsai，L.-S·， 等”Marcel dekker，New York，ρρ·65·68，1984)，植物-昆蟲間（Gibson與Pickett，302:608,1983)及植物與 病原菌之間反應(Stoessl等入，15:855,1976) 之專一性類萜。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 這些各種不同排列化合物的共同命名爲五碳之異戊 二烯建構區段。此”生物之異戊二烯規則”乃將衍生自異戊 二烯之所有類異戊間二烯之生台成起源比例化。 (Ruzicka，10:357，1953)。將兩個雙磷酸化異 戊二烯建構區段經聚合(例如，IPP與二甲基烯丙基）產生 二萜基雙磷酸鹽(GPP)，一碳數爲10可轉變成環狀或線狀 終端中間產物，以單萜類爲表示，或用於其他聚合作用 之徑途。第三個異戊二烯加成到GPP產生三萜基雙磷酸鹽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（2 ) (FPP)，其也可轉變成環狀或線狀產物，以倍半萜類爲表 示。持續之聚合作用與化學分化循環使其他類異戊間二 烯類別的產生，其命名以異戊二烯建構區段在生合咸中 之數目而定，例如第三IPP加成到FPP而產生雙二萜基雙 磷酸鹽（GGPP” 這些聚合作用直接由戊二烯轉移_攻擊IPP分子雙 鍵上之多電子碳原子之碳化作用（一基質損失雙磷酸部 分產生一缺原子之碳原子)(圖2)。這些反應之親電子性與 更多的親核性縮合反應有關，但這些似乎爲類異戊間二 烯生合成酵素之間共同反應，且特別是催化各種不同類 異戊間二烯中間物質環化作用之酵素。（Gershenzmi與 Croteau?Z777/c/ Metabolism in Plant J Moore ? T.S. 5 CRC Press，Boca Raton，FL，pp, 340-388) ° 負責GPP，FPP與 GGPP之環化的酵素意指合成單萜，倍半萜與雙萜之合成 _，及合成酶，以及分別在單萜，倍半萜，雙萜類之類 異戊間二烯到最終產物途徑間賦予碳之反應。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在戊二烯轉移酶與合成酶之間雨個重要的生化特色 於圖2中說明。此戊二烯轉移酶催化兩基質間之碳-碳鍵 之生成，而合成酶催化分子內碳-碳鍵之形成。此戊二烯 轉移酶也可催化立體化學上或聚合物之長度上產生些許 差異之反應。戊二烯轉移酶使起始反應中之丙烯基受質 之長度不同，而可與之反應。此合成酶具有受質專一性。 然而不同之倍半萜合成酶，例如可使用相同之受質而產 生不同之反應產物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 509724 A7 _B7_ __ 五、發明説明（3 ) 類異戊間二烯之生合成，如環萜烯，乃經由鑰匙支 部酵素之確認爲萜烯合成酶◊這些由萜烯合成酶所催化 反應相當複雜且牽涉好幾個部分反應的分子內環化作 用。例如，如圖3所示之此生物理論基礎，乃由二個倍半 萜烯合成酶將FPP環化。第一個步聚先將FPP離子化，接 著以分子內親電子性之攻擊帶有雙磷酸之碳與遠側之雙 鍵而產生吉馬烷A(germacene A)，其爲一大環化之中間產 物。在第二步驟內部環關閉，形成⑶desmane carbonium ° 如步驟3a所示之最後一個步驟，以煙草之5-表-馬兜鈴烯 合成_(TEAS>將氫變換，轉移甲基及將C9去質子化，產 生5-表-馬兜鈴烯。在步驟1與2中黑豕豆vestispiradiene合 ^^(Hyoscyamns nniticus vetispiradiene synthase)(HVS 相同之機制，但在第三部分之反應與TEAS不同，因有一 電子對轉移變更而產生一環縮合反應。在每一反應中大 約有64kD之單分子蛋白質催化部分反應之整組反應，其 除了 Mg2 +之外不需要輔因子。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之特徵在於一種嵌合型類異戊間二烯合成酶 多肋，其包括第一個類異戊間二烯合成_之第一功能部 位與第二個異源類異戊間二烯合成酶之第二功能部位連 接，且該類異戊間二烯合成酶可催化類異戊間二烯反應 產物之產生，此產物在缺乏第二個異源類異戊間二烯合 成酶之第二功能部位時無法產生。在較佳之實施例中， 該嵌合型類異戊間二烯合成酶可催化至少兩種不同之類 異戊間二烯反應產物；該類異戊間二烯反應產物爲環 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 狀；由第二個異源類異戊間二烯合成酶之第二功能部位 而可限定嵌合型類異戊間二烯合成酶之類異戊間二烯反 應產物之比例；第一個類異戊間二烯合成酶之第一功能 部位爲一植物的類異戊間二烯合成酶’及第二個異源類 異戊間二烯合成酶之第二功能部位也爲一植物類異戊間 二烯合成_。 嵌合型類異戊間二烯合成酶較佳地乃擇自由U)煙草 -黑豕豆CH4嵌合型類異戊間二烯合成(b)煙草-黑豕豆 CH10嵌合型類異戊間二烯合成酶；（C)煙草-黑豕豆CH11 嵌合型類異戊間二烯合成酶；（d)煙草-黑豕豆CH12嵌合 型類異戊間二烯合成酶；(e)煙草-黑豕豆CH13嵌合型類異 戊間二烯合成酶；或（f)煙草-黑豕豆CH14嵌合型類異戊間 二烯合成酶在此所述所組成之群組。 在較佳之實施例中，嵌合型類異戊間二烯合成酶催 化農業，藥物，商業與工業上重要之類異戊間二烯反應 產物之產生(例如一抗黴菌試劑，抗細菌試劑，或抗腫瘤 試劑）。 其他有關方面，本發明之特徵DNA，載體及細胞(例 如大腸桿菌’啤酒釀母菌以此以似⑽界^^/^心/^’動 物或植物細胞）編有或含有一嵌合型類異戊間二烯合成 酶多肽。 另一方面，本發明之嵌合型類異戊間二烯合成酶多 肽包括一不對稱之同源功能部位，當該功能部位位於類 異戊間二烯合成酶多肽自然發生之位置時，則此嵌合型 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀*背面之：於意事項再填寫本頁) % 訂 509724 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) 類異戊間二烯合成酶可催化類異戊間一烯反應產物之產 生（較佳爲環狀產物 另一方面，本發明提供一種製備嵌合型類異戊間二 烯合成酶多肽的方法，該方法包括(a)提供一經轉形之細 胞，該細胞之DNA編有一供嵌合型類異戊間二烯合成酶 多肽表現之基因；（b)培養該轉形細胞使該細胞可表現 DNA ; (C)回收此嵌合型類異戊間二烯合成酶° ”類異戊間二烯合成_ ”意即一個多肽，其可催化丙烯 基二憐酸鹽基質之分子內碳-碳鍵形成反應（例义口 C10，C15，或C20丙烯基二磷酸鹽基質)產生一類異戊間 二烯產物(例如一單萜，倍半萜，雙®或固醇產物）°此類 異戊間二烯合成酶例子包括但不受限於單萜合成酶(如 檸檬油精合成酶），雙萜合成酶(如合成酶)及倍半 萜合成_(如5·表-馬兜鈴烯合成酶’ vestisPiradiene合成_ 與杜松油精合成酶），這些酵素分別負責將二萜基二磷酸 鹽（GPP)，三萜基二磷酸鹽(FPP)，雙二_基二磷酸鹽 (GGPP)之環化◊由植物與微生物分離出的數個硌烯合成 酶及特性可參考下列文獻。（如Moestra哉west， Biochem .Biophys. 238:325. 1985 ； Hohn 龃 Van Middlesworth ，Arch· Biochem. Biophys.1986 ； Hohn與Platter，254·42ΐ 1987 ; Munck^iCroteau ? Arch. Biochem. Biophys. 2^2'58 1990 ; Alonso等人，J. B/〇/，Ckm. 267:7582,1992 : Sava2e等 /、， J. Bio!. Ckem.269:4012，1994 ： Croteau ? j βΐ〇€}ίβίη 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,¾.

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7__ 五、發明説明（6 )

Biophys.3>09: 184?1994： Vogeli ^Plant Physiol.93.1^2 ? 1990 : Guo等人/308:103，1994 ; 及Gambiliel Croteaii，J.Bio/.C7^w. 259:740，1984.)。通常 萜烯酶可溶於分子量約爲40到100kD之酵素。在下列文獻 描敘許多植物與微生物中有數個編有單萜，倍半萜，雙 薛合成酶之基因。（請參考如Hohn與Beremand， 79:131- 1989 ; Proctor與Hohn，/.B/o/· C7ww.268:4543 ’ 1993; Faechim與Chappell Pr89:1 1088, 1992; Back與Chappie，乂£/o/.C7e肌270:7375,1995; Colby 等人，J· £/·〇/. dem. 268:23016·1996 ; Mau與West，P/w, ΛΓα/7. 91:8497, i997; Chen等人 ’Areh· Biolchem·

Biolphys. 324:255，1994 ;及 Cane等人.，Biochemistry 33:5846,1994)。 ”多肽”或”蛋白質” 5意即不論長度或轉譯後修飾(糖 化或磷酸酯化）之任何胺基酸鏈。 ”連接到”意即直接或間接之共價鍵結(即將一胺基酸 序列插入而將功能部位分離）°此功能部位可以任何方式 包括但不受限於一狀鍵或化學鍵鍵結° π功能部位”爲在或蛋白質中之一段連接的胺基酸° ”類異戊間二烯”爲一種由異戊二烯建構區段所衍生 之化合物。類異戊間二烯化合物特別包括但不受限於單 萜，雙萜、，倍半萜或固醇。如在此所述’類異戊間二烯 可在各種生物中發現，如動物，黴菌或細菌等來源° ”不對稱位置”意即位於嵌合型多肱的位置與自然發 本紙張尺度適用中麵家標準（CNS) Α4規格（21Gx297公董） (請先閲讀.背面之；r思事項再填寫本頁)

509724 A7 B7 五、發明説明（7 ) 生之多K不同。 ”異源”意即由不同來源所衍生的。（在本發明爲不同 之多肽” ”同源”意即由相同來源衍生而來的。（在本發明爲相 同之多肽 本發明之其他特徵與優點可由下列說明與其中較佳 實施例及申請專利範圍淸楚得知。 圖示說明 圖1說明有關於類異戊間二稀生合成途徑之各種類 型之最終產物及其各別生理功能。虛線表示複數個步驟 或反應。 圖2表示由戊二烯轉移酶與萜烯合成酶所催化之各 種反應。 圖3表示合成雅檻藍樹油烷（eremophilane)(煙草5-表-馬兜鈴烯合成酶，TEAS)與 vestispiradiene (//> vestispiradiene合成酶，HVS)類型之倍半ϋ烯合成酶的反 應機制。在部分反應3a與3b之不同反應機制足以說明所 示之不同反應產物。 圖4A表示倍半萜烯合成酶內之催化功能部位之嵌台 型結構。線性圖表示由野生型（即TEAS與HVS)及嵌合型 (CH1-CH14)倍半萜烯合成酶基因所拼湊成，這些基因被 植入細菌表現載體PGBT-T19中。以可利用之限制內核酸 酶位置來製備基因結構並以PCR與隱匿在鄰近限制內核 酸酶位置之PCR引發物對選擇功能部位進行擴大ft：。符 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 聞 背 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7_ 五、發明説明（8 ) 台限制內核酸酶位置與胺基酸所標記之位置 圖4B爲--個TLC實驗的圖片，表示大腸桿菌TBldeo// TB1)細胞超音波溶解物中所表現之TEAS，HVS，與嵌合 型合成酶結構(CHI-CH14)之合成酶酵素活性及並以^H-FPP進行測試。以銀染法-TLC將反應產物分離並以自動放 射線照像法進行偵測。銀染-TLC平板之每一〇.5mm片段 放射活性以閃爍計數器進行偵測，且與TEAS及HVS專一 性產物結合放射活性設定爲100%。 圖5係顯示類異戊間二烯合成_之表現序列(exon)與 功能功能部位相對應關係。上部圖示代表TEAS基因之表 現序列結構，該結構與HVS及casbene合成酶基因幾乎相 同。下面圖示表示TEAS與HVS基因表現序列結構之功能 功能部位的排列形式。列於上部圖形中之數字爲.表現序 列的數目，其他數字表示胺基酸之位置，有一部分是以 限制內核酸酶的位置進行標記。 圖6說明產生一 quies⑼nt合成_ (QH1)之功能部位開 關方法。若以失活之HVS功能部位表現序列4取代CH3 ’ 而使得合成酶之酵素活性改變。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖7表示用於產生quiescent-casbene合成酶及可目巨反 應產物之功能部位開關方法。 圖8說明用於產生一嵌合型quiescent-杜松萜合成酶 與可能反應產物之功能部位開關方法。 嵌合型倍半萜烯合成醃 將編有煙草5-表-馬兜鈴烯台成酶之部分基因置換既 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（9 ) 編有黑豕豆vestispiradiene合成酶的之部分基因，產生一 個可表現嵌台型合成醜之質體。該質體於細菌中表現。 及將製成的細菌溶出物進行倍半萜烯合成酶活性測試。 檢測倍半萜烯台成酶之方法包括一銀染-薄層色譜（T L C ) 分析法，該方法可區分馬兜鈴烯與vestispuadwiie反應產 物（Back與 Chappell，丄执〇/. C7?ew.270: 7375，1995 卜如 圖4A所示，產生14種嵌合型台成酶結構並以下列方法進 行檢測「 將煙草5<表-馬兜鈴烯合_酶(ΊΈAS)之全長cDNA與 黑豕豆vestispiradiene合成酶選殖到pBluescript SK(Stratagene)的 EcoRL Xhol位置上，分別產生 pBKS-TEAS|EpBKS*-HVS®ft(BackilChappell·/,Chem.270: 7375，1995”將TEAS與HVS之cDNA插入表現質體中， 並以轉譯起始位置鄰接在EcoRI之限制部位，及3’聚八_端 接於PSK質體之Xhol限制部位的一側來確認其方向。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用保留在煙草與黑豕豆基因中的Hmdffl與Ndel限 制部位，建構出嵌合型合成酶CHI，CH2，CH5與CH7。 CH1的製備方法乃將TEAS基因之Y尾端部分（相當於 EcoRl到Hmd E1片段）接連到HVS基因之3瑞(相當於Hind ΙΑ到ΚρηΙ片段），再移入已在ExoRI與Kpnl部位事先分解之 細菌表現載體pGBT-T19(Gold Biotechnology)中。 CH2的製備方法乃將TEAS基因之5尾端部分（相當於 EcoRI到Ndel片段）接連到HVS基因之31端（相當於Ndel到 ΚριιΙ片段），再移入pGBT-T19中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 __B7____ 五、發明説明（1〇) CH5的製備方法乃將HVS基因之5’尾端部分（相當於 EcoRI到HmdEl片段》接連到TEAS基因之3’端（相當於Hind I[[到ΚρηΙ片段），再移入pGBT-T19中。 CH7的製備方法乃將HVS基因之5’尾端部分（相當於 EcoRI到Ndel片段)接連到TEAS基因之3’端（相當於Ndel到 ΚρίΐΙ片段），再移入PGBT-T19中。 CH3，CH4，CH12與CH13的製備方法乃使用傳統之 聚合_鏈反應(PCR)方法論進行建構，以引發物（primer) 使HVS基因之特定片段產生擴大化。爲了有助於直接選 殖與保留閱讀架構，該引發物也可包含限制部位。 建構CH3之方法如下。分離出TEAS基因之EeoRI/Clal 限制片段，並與HVS基因之Clal/Kpnl片段接連。其中HVS 基因之Clal/Kpnl片段乃使用PCR方法論及以pBSK-HVS作 爲 DNA模板，並以 5，-d(GGGATCGATGACATAGCCACGT ATGAGGTT ; SEQ ID ΝΟ:1)-3·(畫線部分爲Clal限制片段) ID NO:2)-3’爲反向引發物（相當於pBSK數個選殖部位中 的T7序列）。將所得之限制片段接連到pGBT-T19載體之 EcoRI/Clal部位。 以相同之方法建構CH4與CH13，但分別以5’-dfCGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA ： SEQ ID NO:3)-3t畫線部分爲Hinc II限制片段）及5’-dCTATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA ； SEQ ID (畫線部分爲Xbal限制片段）爲正向擴大化引發 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 ___ _B7_____ 五、發明説明（η ) 物。 CH12的製備乃由將一相當於CH4前面1326個核苷酸 的PCR片段與TEAS基因之Clal/Knpl片段連接，並殖入 PGBT-T19載體之EcoRI/Kpni部位◊使用正向擴大子5匕 d(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAA ACTAT: SEQIDNO:5)-3’(畫線部分爲EcoRI限制片段及粗 體爲轉譯起密碼）及以5’_cUGGGATCGATAACTCTGCAT AATGTAGCATT; SEQ ID NO:6>3，（畫線部分爲Clal限制片 段反轉錄引發物）來備製CH4。 建構嵌合型合成_CH6，CH8，CH9，CH10，CH11 及CH14的步驟如下。將HVS基因之EcoRI/Hmdffl片段與 CH3之Hmdin，KnpI片段連接，產生CH6。以HVS基因之 EcoRI/Ndel與CH3之Ndei/Knpl片段連接產生CH8。建構 CH9的方法是將CH5之Ecol/Ncbl片段連接HVS的 Ndel/Knpl片段。建構CH10的方法是將HVS基因之 EcoRlHmdfll片段與CH4之Hindffi ΚηρΙ片段連接。建構 CHli的方法是將HVS的Ecoi Ndel片段CH4之NdeLKnplH-段連接。及CH14是以CH13之EcoI，Ndd片段取代pBSK-HVS之相對應片段建構而得。根據製造商(U.S.Biochemical Corp)的說明書之指示，使用雙去氧核苷酸鏈終端套組 中，以使用雙股DNA序列確認嵌台型結構中核苷酸之連 接作用。 嵌合型台成酶表現在大腸桿菌(ΕχοΠ)中·。根據Back ChapplQi Arch. B i oc he m .Biop hy 5, 3 1 5:527' 1 994 ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先闖讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 _____^' 五、發明説明（12 ) 270:7375」.90)所描述Z力法而進仃細菌細 胞之生長過程，基因表現之誘導作用，倍半萜烯合成酶 酵素活性的檢測與細菌溶解產物全部蛋白質之測定 以 含15%硝酸銀之甲苯：己烷：乙醚（50:50:1 )溶液灌注到G6〇 二氧化矽TLC平板使之顯影並使以反應產物分離。 對於定量的估計，TLC片噴以En3hance表面螢光色譜 噴劑（Dupont)，在-70，C下曝光於XAH底片上: 對於定量的估計，TLC片上的一個完整的片段的0,5毫米 的功能部位收集到閃爍計數瓶中，以Parkard 1500液態閃 爍計數器決定。由建立在細菌溶解物的TEAS，AVS，CH4 與CH14所表現的合成酶生產的顯性產物’亦使用chaPPeil 等人就s7ry，26:2259 ’ 1987)所 用氣相層析儀(GC)與氣相層析質§普（GC-MS)來檢驗°除 此之外，質譜圖譜被和已發表的5-表-馬兜鈴烯（人11]^和

Sterner，Ρ/α,;/α Me A 57:344，1991)以及 vestispiradiene 的 碎片模型（Enzell等人，⑽騰吵心v. 3:393,1984) 相比較。 如圖4A-4B所示，由煙草TEAS基因所表現的優勢反 應產物爲％表-馬兜鈴烯，而HVS基因表現作用之優勢反 應產物爲vestiispiradiene。由CH1和CH2產生之明顯的反應 產物也具有HVS特性（即vest〗spiracUene)，其與在pBSK-HVS質體中所表現之HVS有類似的酵素專一活性◊這些結 果顯示TEAS半胺基端和HVS之半胺基端與HVS羧基端之 功能性相同，但是TEAS與HVS之半胺基端與反應產物之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

509724 A7 B7 五、發明説明（13 ) 特性無關。CH7具有的HVS胺基端與TEAS的羧基端，其 結構與CH2相反，並期待所得之合成酶活性可具有TEAS 特性的產物(即5-表馬兜鈴烯）之表現作用。但由免疫測 試顯示由CH7所表現之合成酶蛋白質有適當之大小且蛋 白質量也很多，但是卻沒有偵測到酵素的活性。酵素活 .性的缺乏現象顯示出羧基和胺基部分之間蛋白質的交互 作用有助於酵素活性的產生。這個解釋進一步在比較CH5 與CH6結構表現所產生酵素之專一性中可得到證實。儘管 CH5所表現之蛋白質與另一結構所表現的量相等（由免疫 檢測進行測試，資料中並沒有顯示出來），但是CH5產物 所表現的合成酶酵素活性之專一性比另一嵌合型合成酶 低10倍。若將HVS羧基端功能部位取代，則可保存由CH6 產生之合成酶酵素的專一性活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於CH2與CH3嵌合型合成酶之間的比較，了解最終 產物的特異性大致是位在一個相當於是在TEAS與HVS基 因中的Ndel與Ckal限制部位的181個胺基酸的功能部位 當中。CH4的表現作闬意外產生一個同時具有對應於 TEAS與HVS酵素的反應產_的嵌合型台成_。這結果指 出位於菸草5»表-馬兜鈴烯台成酶的胺基酸261到379是負 責TEAS-特性的產物的（即符合cDNA的Ndel到HmcII片段 的功能部位），同時在黑豕豆蛋白質的胺基酸379到442是 負責H VS-特性的產物的（即符合cDNA的HmcII到C1W片段 的功能部位）。 我們可藉由對於cm 1.與CH12表現產物的所作的評 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（14 ) 估中得到證實。CH11顯示出以對應的煙草基因片段取代 黑豕丑基因中Ndel到HincII的片段’而使產生之酵素具:句 HVS特性與TEAS特性。CH12顯示出以相對應之黑豕豆基 因片段取代煙草基因HmcII到Clal的片段，並產生具有 HVS特性與TEAS特性的酵素。比較CH11與CH13提供了負 責TEAS-特性的產物的菸草酵素的功能部位特質的進一 步補強。CH13被發現爲一多效酵素的事實指出位於菸草 cI)NA的Ndd到Xbal限制部位的DNA片段記錄的81個胺基 酸足以形成TEAS特性的產物。此解釋可利用TEAS基因將 包含在CH14之Ndel/Xbal HVS cDNA功能部位取代而得到 如圖4Β所示，將野生型煙草TEAS與黑豕豆HVS基因 表現於細菌中之最顯著之反應產物，轉移到硝酸銀-TLC 平板，其1^値分別爲0.41與CK31，符合先前5-表-馬兜鈴烯 與 vestispiradiene產物之特徵（Bank 與Chappell， 270: 7375 ’ 1995 ; Back等人Arch. Biochem· Biophys, 315:527，1994)。GC與GC-MS分析顯示最顯著的TEAS反 應產物爲5-表-馬兜鈴烯（所有產物的70%，是以GC分析中 所有波峰功能部泣之百分比爲基礎），與雙環倍半萜錄 (20%)([ΜΓ離子於11价爲2〇4卜最顯著的HVS反應產物爲 ν e s 11 s p i r a d i e n e ( > 9 00 〇) ([ M ] 離子於m/z爲204，其波峰在tlr 7 爲41與一系列可預測之離子m/z爲175，108，94，與68)， 及CH4最顯著的反應產物爲5-表-馬兜鈴烯（18%)，雙環倍 半綠烯與(43°〇)及vestispiradiene(32G〇)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面、 泛注意事項再填寫本頁)

509724 A7 B7 五、發明説明（15) 除此之外，有關標記組胺酸重組體合成_蛋白質之 親合性純化方法中，顯示出5個不同之反應產物，在所有 的檢測反應顯示在這5個中的每一個都有相同的相對 量，即約佔全部產物之1%。 比例決定之功能部位 另一個合成酶的功能部位是藉由與多效嵌合型合成 酶主要反應產物的相對比例的比較來進行鑑定(圖4AP 例如，由CH4，CH10，CH11與CH12結構的表現之反應產 物會生成60-70%TEAS特性與30-40% HVS特性的比例。相 反的，由CH13與CH14結構的表現會造成產物的比例相反 的結果。此結果指出，由Xbal到HmcII所包圍的這功能部 位會影響多效嵌合型合成酶反應產物的相對比例。這些 結果顯示在合成酶胜肱中的兩個分開的且明顯的功能部 位會直接影響所被生成的反應產物的型式，並且被我們 所稱之爲比例決定功能部位的另一功能部位所中斷(圖 5)。 定位突變 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱績背面、v/注意事項再填寫本頁) 分析產物特性以及比例決定功能部位是以傳統的定 位突變法進行。此分析結果如表I (如下例如，位於馬 兜鈴烯特性功能部位中所發現的DDXXD功能部位，是一 個在許多種萜生成_都可以發現的常駐序列（conserved sequence)，萜生成酶包括TEAS與HVS。此酸性的胺基酸 叢集被認爲與一金屬輔助因子相連接，該金屬輔助因子 是位於一不同的親脂性袋中，用於中和FPP的雙磷酸拫部 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Α4規格（210x297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（17 ) H364->S)，同時與了£八8和：《¥8的主要序列相比較所顯示 出的最大電荷差異的這些胺基酸所代表的位置。這三種 突變株經分析後，沒有一種對整體的催化能力或產物形 成的比例有任何的影響。

在HVS特性功能部位的胺基酸取代是以HVS與TEAS 的二級結構預測的相比較來選擇。那些胺基酸的突變顯 示在這雨個蛋白質的二級結構模型造皎了非線性的結構 扭曲，主要是因爲電荷的因素。然而，如表1，所示（上）， 包含帶電荷對無電荷（即Τ408·>Α，K420->M，V438->I) 或較低電荷(N436->S，A437-:>T，V438-:>I)的胺基酸的取 代對於酵素的總活性，其中一種或它種產物的合成速率 皆無影響。 quiescent合成酶 爲產生一 quiescent合成酶，以相對應於CH3的活性功 能部位取代相對應於HVS的表現序列4的失活功能部 位，如圖6中所述。CH3含有對應於TEAS表現序列且具有 利於進行取代的Ndel與Xbal限制部位，同時在細菌中能 以高程度表現的失活功能部位。功能部位的切換在是以 在此所描述的標準分子技術。在一個獨特的實施例中， HVS cDNΑ之PCR擴大化產物被用來取代CH3相對應的功 能部位，此HVScDNA之PCR擴大化產物相對應於表現序 歹Μ且包含在胺基酸261到342之中，並且在引子當中包含 了適當的Ndel與Xbal部位。在一般的產生此結構時，用 心的維持適當的胺基酸殘基以及正確的閱讀架構，且此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 請 先 讀 背 面 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（18 ) 結構之表現測試法必須利用酵素分析與免疫斑點法，對 細菌溶解物之可溶與不可溶部分測試其蛋白質量。 此外，進行大規模的酵素反應時以己烷萃取反應產 物，並以HPLC法將產物純化。其他對於quiescent酵素反 應產物的評估是以TLC進行，並且比較由TEAS和HVS酵 素所產生之實驗樣品的Rf。反應產物的滯留時間(即吉馬 烯或類吉馬烯反應產物）也同時根據標準的方法使用 GC，GC-MS及NMR進行測試。 此quiescent酵素提供了足量的吉馬稀反應中間物對 確認EAS與VS反應的化學的合理行爲相當有用，以及生 產一可能能用於引導出整個合成酶反應的輪廓的新奇的 最終步驟的模版嵌合型合成酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱•讀背面之注意事項再填寫本頁) 嵌合型Casbene與杜松ifj烯合成酶 嵌合型異戊間二烯合成酶對於具有巨環的異戊間二 烯或具有不同立體化學性質的聚異戊間二烯也很有用。 例如，催化有環丙基側基的巨環雙萜合成之雙萜台成酶 的casbene合成酶和催化雙環的sesquiterpene合成的杜松 萜烯合成酶等的異戊間二烯合成酶，提供了具有生產改 變立体化學性質的巨環異戊間二烯或是異戊間二烯反應 產物能力的有用的對酵素進行工程的功能部位。常見生 產如此的嵌合型合成酶的示意圖於圖7和圖8。 爲建立此的嵌合型easbene與杜松隨烯合成_， quiescent胺基端功能部位（以及其它必要的合成酶功能部 位）受到來自easbene與杜松萜烯合成酶中便於利用的限 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（19) 制部位及上面所述選擇的功能部位的PCR放大物取代。對 應於N-端序列的casbene合成酶的質體目標功能部位在此 結構中皆被刪除。嵌合型結構表現於細菌，檢測細胞溶 解物中嵌合型合成酶之活性，同時反應產物以上述方法 鑑別，例如銀染-TLC法。在發明中提供維持高程度合成 酶活性或是有產生和馬兜鈴烯及vestispiradiene標準品之 Rf値不同之移動的反應產物的活性者被認爲有用的。反 應產物亦使用GC分析其滯留時間，如有需要則接著使用 GC-MS與NMR。這些對合成獨特的反應產物有所助益的 casbene合成_與杜松蘇烯合成酶的功能部位也經使用如 圖4A中所描述的類似策略進行詳盡的定位。 其他種類的嵌合型異戊間二烯合成酶的產生 使用在此所述的標準分子技巧，包含習知或新分離 出的合成酶酵素的功能部位的嵌合型合成酶可輕易的產 生產。此嵌合型合成酶可使用例如各種在此技藝中（例如 在此所述者）任何合適的酵素分析法或使用標準的免疫 偵測技巧。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之^意事項再填寫本頁) 其餘的合成II編碼序列的分離也可以使用標準的選 殖策略與此技藝習知的技術。例如，使用一已知的合成 酶多胜肽的全部或部份胺基酸序列，人們可以輕易的設 計出包含合成_退化的寡核苷酸探針（即對一給定的胺 基酸序列」所有可能的編碼序列的混合）的合成特性的 寡核苷酸探針。此寡核笞酸探針可能是以DNA股及任何 合成酶核苷酸序列的合適部份爲基礎。如此的探針的設 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐） 509724 A7 B7 __ 五、發明説明（20) 計與製備的普通方法可於，例如Ausubel等人，1996， Current Protocols in Molecular Biology J Wiley Interscience，New York，與 Berger和 Kimmel，Gz"办 Molecular Cloning Techniques 9 1987 ? Acadmeic Press ? New York·中得到。這些寡核苷酸對合成基因的分離不 論是在它們被使用爲具有與合成酶互補序列雜交的能力 的探針或各式放大技巧例如聚合酶連鎖反應（PCR)選殖 策略上皆有用。 雜交技巧與篩選程序對有經驗的人來說是被廣爲人 知的並在例如Ausubd等人（如上所述）；Berger和Kimmel (如上所述）；Chen等人，zlrc/?.价ochem· 324:255，

Maniial ^ Cold Spring Harbor Laboratory Press ? New York. .等有描述。假使需要的話，不同的寡核苷酸的組合可用 於一重組DNA庫的篩選。寡核苷酸可以是在此技藝中的 已知方法的可偵測標定，並且用於由重組DNA庫的探針 濾紙墨點法。重組DNA庫是根據習知技藝的方法，例如 在Ausubd等入(如上所述)描述的或是由商業來源獲得。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如前所述，合成酶寡核苷酸可用來當成例如使用PCR 的放大選殖策略上的引子。PCR法在此技藝中是廣爲人知 的並在例如PCR rec/mo/og》，，Erlich編，Stockton Press， London，1989 ; PCR Protocols: A guide to Methods and Applications 5 Innis等」、編，Academic Press 1 Inc·，New York，1990與Ausubel等人（如上所述）被描述。引子被選 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 A7 B7 _ 五、發明説明（21) 擇性的設計可以將放大後產物選殖到適當的載體當中， 例如，在放大的片段(這裡所述)的5’和3’端包含適當的限 制部位。若合成酶基因確定後，可使用PCR “RACE”技巧 或Rapid Amplication of cDNA Ends(見，例如Innis等人(如 上所述）)來進行分離。利用此法，以合成酶序列爲基礎的 寡核苷酸引子是朝向3’到5’的方向並且被用來產生重疊 的PCR片段。這些重疊的3’-和5’-端RACE產物結合成完整 全長度的cDNA。此法在Innis等人（如上所述）與Frohman 等人，Proe· 85:8998(1988).描述。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 有用的合成_序列可以由適當的生物被分離。合成 _多胜肽家族的序列的相關性的確定，可以使用各式傳 統的方法，例如序列比對來達成。此外，任一合成酶蛋 白質的活性可使用在此描述的任一技巧來估計。 fc合型異戊間二烯多胜肽的表現 嵌合型合成酶多胜肽，可利用一適當載體的一個嵌 合型合成酶DNA的全部或部份（利如上述的嵌台型合成 _cDNA)，或是以能在活體狀態下提升嵌合型合成酶多胜 肽表現之改良的質體結構的合適宿主細胞的轉型來生 產。 在分子生物的領域的那些有經驗的人可使用提供重 組蛋白質的各式各樣的表現系統。在此發明當中確實的 宿主細晦並不是重要的。嵌合型合成酶蛋白質可以在原 核細胞表現，例如大腸桿菌TB1，或是眞核細胞例如啤酒 酵母，晡乳動物細胞(例如，COS1或NIH3T3細胞），或是 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（22) 大量的各式植物細胞，包含並沒有受限於藻類，樹木， ornamental species，溫帶水果，熱帶水果，蔬菜，豆類， 單子葉，雙子葉，或任何商業或農業著名的植物。合適 的植物宿主特別例子包含，但並受限於此，針葉樹，毽子 花，蕃煎，煎:草，Arabidopsis，萵普，向日葵，Oilseed rape， 亞麻，棉花，甜菜，芹菜，大豆，紫花苜蓿，苜蓿屬， 蓮花，豇豆，胡瓜，蘿蔔，茄子，花椰菜，璋菜，牽牛 花，胡桃，蘋果，蘆筍，稻子，玉米，小米，洋蔥，大 麥，蘭花草，燕麥，黑麥與小麥。 這些細胞可以由廣大的來源獲得，包含：American Type Culture Collection(Rockland，MD)或是由大量的種子 公司，例如，W. Atiee Burpee Seed Co. (Warminster，PA)， Park Seed Co.(Greenwood ? SC) 9 Johnny Seed Co.(Albion ? ME)或Northrup King Seeds(Harstville，SC)。對於用途與 來源的描述也可於Vasil I.K.，CW/ Cw/iwe⑽d Soarnhc Cell Genetics of Plants f Vol 15 II5 III Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press 5 New York 1984 ? Dixon ? R. A. ? Plant Cell Culture-A Pratical Approach f IRL Press，Oxford University，1985，Green等人，⑽e Ce// ，Academic Press，New York，1987和 Gasser 與Fraley，Science 244:1293，（1989)。 對於原核的表現，原核宿主中一個具有影響表現能 力調控訊號相連結的載體攜帶編有嵌合型合成酶多胜肽 的DNA。假使必要的話，在編碼序列中的5’端可以包含一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

509724 A7 B7 五、發明説明（23 ) 個和影響表現蛋白質分泌到細胞間區的任一已知的訊息 序列，因此有利於蛋白質的回收以及之後的純化°經常 使用的原核生物爲各種不同品系的大腸桿菌’然而’其 它微生物的品系也可被使用。所使用的質體載体包含來 自與微生物宿主相容品種的複製起點，可選擇的標記與 調控序列。此種載體的例子可在Pouwds等人(如上所述) 或Ausubd等人(如上所述）中找到。常用的原核調控序列 (也被稱爲”調控單元”)在此被定義爲包含轉錄起始的啓 動子，可選擇的包含一個操縱子，與核糖體連接部位序 歹[J。啓動子通常用來控制包含beta-內醯酶(盤尼西林酶）’ 乳糖酶（lac)(Chang等人，Nature 198:1056(1977)) ’ 色目女酸 (Trp)(Goeddel等人，Nucl. Acids Res. 8:4057(1980))與tac 啓動子，以及lambda-衍生PL啓動子和N-基因核糖體連接 部位。（Simatake等人，292:128(1981))。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對嵌合型合成酶多胜肱生產的一個特殊的細菌表現 系統爲大腸桿菌ρΕΤ表現系統(Novagen)。根據此表現系 統，編有嵌合型合成酶多胜肽的DNA以被設計成能表現 的位向被插入一 pET載體當中。因爲此嵌合型合成酶的基 因是被T7調控訊號所控制，嵌合型合成酶被在宿主細胞 中的T7 RNA聚合酶的誘導所誘導。這乃爲典型的利用回 應IPTG誘導表現T7RNA聚合酶的宿主品系的成就。——旦 生產，重組的嵌合型合成酶多胜隨後被根據在此技藝 中的標準方法，如那些在此所述者，被分離◊ 另一個對嵌合型合成酶多胜肽生產的細菌表現系統 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（24 ) 爲pGEX表現系統(Pharmacia)。此系統使用一種能快速回 收與純化有效基因產物，融合蛋白質方式且經設計高量 表現一個基因或一個基因片段的基因產物的GST基因融 合系統。感興趣的嵌合型合成酶蛋白質是被融合在來自 日本血吸蟲⑽oma 的竣基端麩胱笞太- S-轉移酶，並且易於利用使用麩胺基硫瓊脂糖 4B(Glutathione Sepharose 4B)的親和性層析由細菌溶解物 中分離。融合蛋白質在溫和的環境用麩胱苔太沖提可被 回收。由融合蛋白質切開麩胱苷肽轉移酶功能部位可 由在此功能部位的上游的部位專一性的蛋白酶認知部位 的存在來便利的達到。例如，在PGEX-2T質體表現的蛋 白質可用凝血酶切開；在PGEX-3X表現者則可用Xa因子 切開。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於眞核的表現，轉型與轉染法以及嵌合型合成酶 多胜肽表現的質體的選擇是決定於所選擇的宿主系統。 爲數眾多的生物的轉型與轉染法例如麵包酵母 Saccharomyces cerevb/ae 在 Ausubel 等人（$口 上所述）； Weissbach 與 Weissbach，/or Biology Manual，Academic Press Publusher ? 1990.； Kindle ^ K. ^ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1228(1990)； Potrykus ^ I. ^ Amnt. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biology 42:205(1991)與 BioRad(Hercules，CA) Technical Bulletin #1687(Biolistic Particle Delivery Systems)被描述。表現質 體的選擇可以由提供的人例如在Fee/ors:」 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（25) 认)Pouweis等人，1985, Supp. 1987 )， Gasser與Fraley (如上所述），Clontech Molecular Biology Catalog (Catalog 1992/93 Tools for the Molecular Biologist，Palo Alto，CA)及其它前面引用者選擇。 一個較佳之眞核表現系統是被pMANneo表現載體 (Clontech)轉染的老鼠3T3纖維母細胞宿主細胞。pMANneo 提供了 ：一個連接到dexamethasone-可誘導MMTV-LTR啓 動子的RSV-LTR增強子，一個允許在哺乳系統複製的 SV40複製起點，一個可選擇性的新黴素基因，與SV40切 割與多腺苷化部位。編有嵌合型合成酶多胜肽的DNA以 被設計可以表現的位向被插入到pMANneo載體當中。然 後，重組的嵌合型合成酶多胜肽如下面敘述的被分離。 其它被喜好可以用來與pMANneo表現載體相連接的宿主 細胞包含COS細胞與CHO細胞(ATCC Accession Nos. CRL 1650 and CCL 61 ? respectively) ^ 另一可選擇的，假使必要的話，嵌合型合成酶多胜 肽藉由一穩定-轉染哺乳細胞系。許多適合晡乳細胞穩定 轉染的載體可公開的獲得，例如見Pouweb等人（如上所 述）；建立如此細胞系的方法也是可公開的獲得，例如 在Susubd等人（如上所述）。在一個例子當中，編有嵌合 型合成_多胜肱的cDNA被選殖到包含雙氫葉酸還原酶 (DHFR)的表現載體當中。因此質體的完整性，與進入宿 主細胞的嵌合型合成酶多胜肽記錄的-基因可藉由細胞 培養培養基中添加〇.〇l-300mM曱基胺喋呤來被選擇(如

2 R 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

509724 A7 B7________ 五、發明説明（26) 在Ausubd等人所述，在前）。此種顯性的選擇可以在大多 數的細胞種類都達成。重組蛋白質的表現可由DHFR-調 控的轉染基因的放大而被增加。選擇帶有基因放大的細 胞系在Ausubd等人被描述；此法通常包含了在逐步提升 甲基胺喋呤的培養基延展的培養。DHFG-包含的表現載 體通常因包含 pCVSEII-DHrF與 pAdD26SV( A)(在 Ausubd 等人被描述，之前)的理由被使用。任何上述的宿主細胞 或DHFR缺陷的CHO細胞系（例如，CHODHFR細胞，ATCC Accession No. CRL 9069)是在這些宿主細胞當中較被喜好 來做爲一穩定轉染細胞系與DHFR-調控基因放大的DHFR 選擇。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 嵌合型合成酶多胜肽較被喜好被穩定轉染的植物細 胞系或被轉基因値物生產。爲數眾多適合穩定植物細胞 轉染或是轉基因植物的建立的載體可公開的獲得：此載 體如Pouwels等人（如上所述），Weissbach與Weissbach(如 上所述），與Gelviti等人（如上所述)有描述。建立如此細胞 系的方法在例如Wmssbach與Weissbach(如上所述）和 GeWm等人（如上所述)被描述。典型的植物表現載體也可 以包含一在5’到31調控序列與顯性可選擇基因的控制下 的被選殖嵌合型合成酶基因。假如必要的話，如此的植 物表現載體也可包含啓動子調控功能部位(例如一個授 予的可誘導或常駐表現或環境-或發育-調控或病原-或創 傷-可誘導或細胞·或組織_專一的表現），一個轉錄起始的 開始部位，一個核糖體連接部位，一個RNA加工訊息， -Ί Γ. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格(、1〇Χ297公釐1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（27) 一個轉錄終止部位與/或一個多腺苷酸化訊息。 假使必要的話，發明的嵌合型合成酶的DNA序列可 以以各式的方法與其它的DNA序列結合。發明的嵌合型 合成酶的DN A序列可以與正常下和嵌合型合成_蛋白質 結合的基因一起被使用。在它的組成部份，一個記錄嵌 合型合成釀蛋白質的DN A序列是在一個在宿主細胞中有 促進轉錄與轉譯轉錄起始控制功能部位的DNA結構中被 組成。 通常，結構將包含如本發明所討論的，在植物中提 供生產嵌合型合成酶蛋白質有效的調控功能部位。編有 嵌合型合成酶蛋白質的可閱讀架構或有效的片段由此將 在5 ’端加入到一個例如一在合成酶結構基因5 ’上游功能 部位正常被發現的序列的轉錄起始調控功能部位。許多 的其它提供常駐的或誘導的轉錄起始功能部位也是可獲 得的。 在應用上，當發育的，細胞，組織，荷爾蒙的，環 境的或是病原-誘導的表現是由其它基因所提供；例如， 來自種子發育，胚胎發育，葉子發育，或在對病原反應 時調控的基因。 調控的轉錄終止功能部位也可以在本發明中的DNA 結構中被提供。轉錄終止功能部位也可以由來記錄一合 成酶蛋白質的DNA序列或來自不同的基因來源的任一方 便的轉錄終止功能部位。轉錄終止功能部位將較被喜歡 包含有至少l-3kb的來自終止功能部位所得到的3’到結構 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

509724 A7 B7 五、發明説明（28) 基因的序列。如此基因工程的植物對如下討論的各式各 樣的工業與農業的應用有用。重要的是，此發明可應用 在裸子與被子植物並且將可被應用在任何新的或是被改 良的轉型或再生法。 根據本發明一個有用的植物啓動子的例子爲莖病毒 (caulivirus)，例如花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)啓動子。這些 啓動子提供在大多數植物組織中高程度的表現，並且這 些啓動子的活性並不依靠不同病毒的編碼蛋白質◊ CaMV 都是35S與19S啓動子的來源。在大多數的轉基因植物組 織當中，CaMV35S啓動子是一強的啓動子(參見，例如， Odell等人，313:810(1985))。CaMV 35S啓動子在 單子葉植物中也是高度活性的。（見，例如Dekeysa等人， Plant Cell 2:591(1990)) ； Tereda和 Shimamoto，A/o/. Grw. 仏训/. 220:389，（1990))。再者，此啓動子的活性可以利 用CaMV 35S啓動子的複製可以再進一步的增加(見’例如 Kay等人，236:1299( 1987)) ’ Ow等人 ’ ΛΓα/7, ,4cm/jci. ί/H 84:4870(1987))及Fang等人，尸/⑽/ Ce// 1:141(1989))。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其他有用的植物啓動子包括但不受限於藍伊紅 (nopaline)合成醜啓動于（An等 88:547( 1988))與章魚鹼(octoPine)合成酶啓動子（Fromm等 人，Plant CeU U977(19S9)) ◊ 對於特定的應用上’最好是能在適當的組織’以適 當的等級或在適當的發育時間產生嵌合型合成酶的基因 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（29 ) 產物。爲此目的，有一類的基因啓動子，由它們調控序 列賦與各自明確的特性，表現出在回應環境，荷爾蒙， 及/或發育的提示是被調控的。這些基因啓動子包含了回 應熱-調控的基因表現（見，例如Callis等人，P/aW 88:965( 1988) ; Takahashi與 Komeda，ΜοΛ Gew. 狀/. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 219:365(1989)與Takashi等人，尸/删/乂 2··751(1992))，光-調控基因表現（見，例如Kuhkmder敘述的豌豆Γόβ-5/l， (尸/·/ 〜// 1:471(1989)) ; Schaffner與Sheen敘述的玉米 啓動子，（/7aW Ce// 3:997 (1991);或Simpson等人 敘述的在豌豆中發現的葉綠素a/b-連結的蛋白質基因 (£M60丄4··2723(1985))，荷爾蒙-調控的基因表現(例如， Marcott等人所述來自小麥的基因ascisic acid(ΑΒΑ)反 應序列（尸/腳ί Ce// 1:969(1989) ; Straub等人由大麥與 而/7治敘述的ABA-誘導的HVA1與HVA22及rd29A啓 動子（T/α，" CW/ 6:617(1994)，Shell 等人（P/a”/ CW/ 7:295(1994))，及創傷-誘導的基因表現(例如，Siebertz等 人描述的η，測J(P/aW〇// 1:961(1989))，或器官-專一的基 因表現(例如，Roshal等人描述的球根-專一性的儲存蛋白 質基因GEM50J. 6:1 155(1987) ; Schernthaiier等人描述的 來自玉米的23-kDa玉蜀黍蛋白基因（£MJ50 Λ 7:1249(1988)；或Bustos等人描述的法國豆沒-腰豆蛋白 (phaseolii;)基因（P/㈣纟 U39( 1989))及 Chappell等人在 U.S. Ser. Nos· 08/471,983，08/443,639及08377.483所描述 的病原-誘導基因表現’在此與參考文獻相結合。 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（30) 植物的表現載體也可視情況包含RNA處理修飾信號 例如插入序列，此表現載體對於RNA的合成與累積的效 率是相當重要的（Callis等人5 Gaw amf 1:1183(1987))。RNA切割序列的位置會戲劇性的影響在植 物中轉基因表現的程度。以這事的觀點看來，爲調整基 因表現的程度，內含子可以被放在在轉基因的嵌合型合 成酶多胜肽-記錄的序列的上游或下游。 除了在前提及的5’-調節控制序列外，表現載體也可 以包含通常存在於植物基因的3‘功能部位的調節控制序 歹[j (Thornburg 等人，Λ’α/7, Sch f/U_ 84:744(1987) : An等人，P/aw/Ce// 1:1 15(1989)” 例如， 3’終結子的功能部位可以被包含在表現載體當中來增加 mRNA的穩定性。此終結子可以由馬鈴薯的PMI終結子功 能部位衍生而來。此外，其它泛用的終結子是由章魚鹼 或nopaline合成酶訊號衍生而來。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 植物表現載體典型中亦包含一用來確認那些細包有 變成被轉型的顯性可選擇的記號基因。對植物系統有用 的可選擇性基因包含記錄抗生素抗性基因的基因，例如 言己錄抗潮黴素（hygromycin)，康黴素，博菜黴素 (bleomycin)，G418，鏈黴素或壯觀黴素（spectinomycin)。 光合作用所需的基因在光合作用-缺陷的品種中也被用 來當一可選擇性的標記ϋ另外，來自水母orea v/dor/a 的綠-螢光的蛋白質也可以用來當選擇性標記（Sheen等 人，/V側，乂 8，·777·1995 ; Chiu等人，5/〇/(叹y， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 ____ - ---- --------- 五、發明説明（31) 6:325(1996)^最後，編有抗除草劑的基因也可用來當作 選擇性的標記；.有用的抗除草劑基因包含編有酵素 phosphomothrioin乙醯轉移_與提供對廣效除草劑BaSta (Hoechst AG，Frankfurt ’ Germany)的办“产基因 ° 藉由有效率地使用選擇性標記，以測試植物細胞對 於特殊的可選擇藥劑的感受性及能夠有效地殺死人多數 轉型細胞，但不是全部的轉形細胞° 一些對菸草轉型有 用的抗生素濃度包含，例如75_100mg/mi(康黴素）’2000 mg/mL(潮黴素），或5-10mg/ml(博菜黴素P對於抗除草劑 轉型體的一個有效的策略在例如Vasil等人，在前’所描 述。 對於熟習分子生物此技藝之人士，特別逶在植物分 子生物領域的而言，很明顯的基因表現的程度是依靠在 不只是在啓動子的組合，在RNA加工訊息以及終結子單 元上，也在這些單元是如何被用來增加選擇性標記的基 因表現的程度。 植物轉型 根據植物表現載體的結構5 一些標準的方法可以用 於將載體導入植物宿主當中，由此產生新的轉基因植 物。這些方法包含（1)土壤桿菌-調控的轉型(根癌土壤桿 菌(A "满e/α价似）or發根土壌桿菌(▲ ⑼從)）(見，

例如 Lichtenstein與 Fuller在 Gwe/ic ’\’〇1 6’ PWJ

Rigby，ed，London，Academic Press，1987;與Lichtenstein， C.P.和Draper，J”在i>M4 ，VolII，D.M.Glover ’ ed， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 509724 A7 B7__ 五、發明説明（32)

Oxford，IRI Press 1985))，（2)獨特的傳遞系統(見，例如， Gordon-Kamm等人，Ο" 2:603(1990);或 BioRad Technical Bulletin 1687，在前），（3)微注射規貝[1(見，例如 Green等人，在前），（4)聚乙烯二醇（PEG)程序(見，例如 Draper等人，P/r"" O// 23:451(1982);或Zhang 與 Wu，77/eor，々7/;/· Ge 則/· 76:835(1988))，（5)微脂粒-調 控 DNA uptake(見，例如，Freeman等人，/7⑽ί 0//尸办’5/:<9/· 23:1353(1984))，（6)電穿透規則（見，例如Gdvin等人，在 前；Dekeyser等入，在前；Fromm等人 319:791(1986)) ; Sheen，_?/側ί Ce// 2:1027(1990)或 Jang 和 Sheen P/aW 0//6:1665(1994))，及（7)激烈震動法（見， 例如Kindle在前）。在現在這發明中，轉型的方法不是關 鍵的。任何能提供有效率的轉型都能使用。假使有新的 可用來在穀類或其他宿主細胞轉型上的，他們都可被直 接的被應用。 以下爲一個特殊技巧，土壤桿菌-調控的植物轉型， 主要的範例。藉由此技巧，將要送入植物細胞的基因組 的操縱基因的一般程序以兩階段進行。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先，選殖與DNA修飾的步驟在大腸桿菌中進行， 含有有興趣的基因結構的質體藉由接合或電穿透傳入土 壤桿菌當中。第二，結果所得的土壤桿菌菌種被用來轉 型植物紐胞。如此，對於廣泛的植物表現載體，質體中 含有允許它在土壤桿菌中複製且在大腸桿菌中高拷貝數 的有效複製起點之複製起點。這可以方便生產以及傳遞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 72 09 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33) 到在隨後的導入植物的土壤桿菌之前的大腸桿菌的轉基 因的測試。抗性基词能在載體上被攜帶，一個在細菌中 的選擇，例如，鏈黴素，以及其它會在植物中有作用者， 例如，編有康黴素抗性或除草劑抗性的基因。在載體上 亦存在著當被土壤桿菌傳遞功能認知時，對於額外的一 個或更多轉基因，且具有方向性的T-DNA邊緣序列的內 限制核酸酶部位，劃定被傳送到植物的DNA範圍。 在另一個例子當中，當選殖的DNA被沉澱時，植物 細胞也可以藉由射入細胞鎢微彈九來被轉型。在被用來 發射的別〇113如八口？&1^似(七丨0_1^(1)中，火藥塡充（22〇3仙€1· Power Piston Tool Charge)或氣動爆衝使塑膠微彈九經由 槍筒擊出。DNA所沉澱的鎢粒子懸浮液被放在塑膠微彈 九之前。然後便是在一個有一個小的使得塑膠微彈九無 法穿過的小洞的壓克力擋版上發射。因此，塑膠微彈九 因檔版而擠碎，鎢微彈九通過擋版的小洞繼續向它們的 目標前進。在現在的發明當中，目標可以是任何的植物 細胞，組織，種子，或是胚。在微彈九中注入細胞中的 DN Α會和細胞核或葉綠體相結合。 一般而言，在植物細胞中的轉基因傳送與表現現在 對此熟習此技藝之人士爲例行的工作，並且變成進行植 物中基因表現的硏究與生產農業或商業感興趣的改良的 植物改變的重要工具。 · 轉基因植物的再生 經轉型具有植物表現載體的植物可以被再生，例 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509724 A7 B7 五、發明説明（34) 如，根據標準的植物組織培養的技巧，由單細胞，癒合 組織，或葉碟。在此技藝中來自幾乎是各種植物的各種 細胞，組織，與器官能被成功的培養再生成一完整植物 是廣爲人知的；此技巧在例如在Vasil，在前；Gr⑺η等 人，在前；Weissbach和Weissbach，在前：與Gelvin等 人，在前，被描述。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一個獨特的例子當中，一在EAS4啓動子與藍伊紅 合成_終結子控制，以及攜帶一可選擇的標記(例如，康 黴素抗性）的被選殖的嵌合型合成酶多胜肽被轉型到土 壤桿菌中。以具有載體的土壤桿菌的葉碟(leafdiso)(例如 菸草的葉碟）的轉型如Horsch等人（&/州〜 227:1229(1985))所描述的被進行。認可的轉型物在含有 植物組織培養基幾周後(例如，3到5周）被選擇。康黴素-抗性嫩枝之後被在沒有對發根作用的荷爾蒙植物組織培 養培養基。康黴素抗性的植物之後被選爲溫室的生長。 假使必要的話，來自自交的轉基因植物的種子之後可被 種在無土的培養基中並在溫室中被培養。康黴素抗性的 後代可藉能生長的種子在無荷爾蒙含康黴素的培養基之 表面播種來選擇。利用標準的技巧可以達成轉基因的完 整性分析（見，例如，Ausubd等人，在前；Gelvin等人， 在前）。 然後，現可選擇基因的轉基因植物可使用標準的免 疫墨點及DNA偵測技術篩選轉基因DNA的傳遞。每一轉 基因陽性的植物以及它的轉基因後代在與用相同的轉基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 _ B7__ 五、發明説明（35) 因建立的其它轉基因植物比較都是獨特的。轉基因DNA 融合到植物的基因組的DNA在大多數的情況中是隨意 的，同時，融合的部位會很奧妙的影響到基因轉殖表現 的程度與組織和發展的型式。結果，爲了辨認和選擇植 物轉殖基因的最適表現型式，可將許多的轉殖基因系進 行篩選。 轉殖基因系常被用於轉殖基因表現程度的評量。最 先被用來辨認與量化陽性表現的植物的是確認RNA等級 的表現。RNA分析的標準技巧被應用，包含使用被設計 成僅放大轉基因模版的寡核苷酸引子，與使用轉基因專 一性的溶液雜交探針分析的PCR放大分析（見，例如， Ausubd等人，在前）。RAN陽性的植物然後使用對嵌合型 合成酶專一的抗體(見，例如，Ausubel等，在前）的西方 免疫墨點法分析蛋白質的表現。此外，根據標準規範的 定位雜交與免疫細胞化學法能分別使用對轉基因專一的 核苷酸探針與抗體來完成對在轉基因組織的表現部位的 定位^ 一但重組的嵌合型合成酶表現在任一細胞或一轉基 因植物上(例如，如上所述），該合成酶則可被分離，例如 使用親和性層析方法。在一實施例中，一抗嵌合型合成 酶的抗體（例如，如在Susiibd等人所描述的生產的，在 前；或使用任何標準的技巧)可連上管柱並被用來分離 多胜肽。在親和性層析前的嵌合型合成酶生產細胞的溶 解與分液化可使用標準方法進行（見，例如，Ausubel等 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509724 A7 B7____ 五、發明説明（36) ’ 人，在前）.一旦經分離，若有必要，可使用高效液相層 析法將重組蛋白質進行進一步純化（見，例如’ Fisher ’ Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology. Eds. 5 Works and Burdon ? Elsevier J 1980) c 可使用這些普通多胜肽的表現與純化的方法來製造 與分離有用的嵌合型合成酶片段或類似物。 使用 在此所描述的發明對於各式的農業，醫藥，工業與 商業目的都有用。例如，方法，DNA結構，蛋白質與基 因轉殖生物，包含細菌，酵母菌與在此描述的植物對於 改進異戊間二烯合成，製造與生產都是有用的。 上述結果顯示了藉由嵌合型合成酶可調整異戊間二 烯合成酶的活性。以此方式，各式的合成酶反應產物可 以經修飾，控制，或操縱，而產生更多的合成_反應產 物，例如，新穎的單経，雙経與sesquiterpenes。此化合 物在植物補體，殺蟲劑，香料，與醫藥例如抗菌與黴的 藥物上有用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 許多的嵌合型異戊間二烯合成酶可設計成許多用 途，例如，製造抗黴，抗菌，抗瘧與抗腫瘤性質的化合 物。例如，製造出一嵌合型合成酶，其中該嵌合型合成 酶可催化抗黴菌的異戊間二烯類的產生，乃將casbene合 成酶的C端功能部位與TEAS，HVS或CH9的N端功能部位 相連接（Mau與 West，Proe· ΛΥ"/…91:8497， 1994)。爲了製造出具有摧化抗菌性化合物產生之嵌合型 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 509724 A7 B7_;__ 五、發明説明（37) 合成酶，將環法呢酮（cyclofarnesenone)合成酶 (Habtermariam等人，J. Λ’αί.尸rod. 56:140 ’ 1993)的C端功 能部位與TEAS，HVS或CH9的N端功能部位相連接。抗瘧 化合物的產生是使用有來自蒿屬素（artemisian)合成酶 (EI-Ferdy等人，J. Nat. Prod. 52:196，1989)C端的功能部 位與一個來自TEAS，HVS或CH9的N端功能部位的嵌合型 合成酶連接而完成V爲了製造具有抗腫瘤性質的化合物 的合成酶，利用taxadiene合成酶（Koepp等人’ J· Β/ο/· C/z纖. 270:8686，1995)或土木香素（helenalin)合成酶(Lee等人， 196:533，1977)的 C端功能部位與TEAS，HVS或 CH9的N端功能部位接連而產生◊

此發明也可用於產生具殺蟲劑性質的嵌合型合成酶 有用。此嵌合型合成酶是將cadiene合成酶(Chen等人，jrc/?. 识ocAew· 324: 255，1995)的C端加入TEAS，HVS 與CH9的N端來進行改造。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 最後’嵌合型合成酶也可用於產生新_的調味料與 香料。在一個獨特的實施例中，對於新奇的調味料與香 氣的產生，乃將檸檬油精(Hmonene)合成酶(Colby等人，J. 仿〇/. C/κ胤 268:23016，1993)的C端與TEAS，HVS與CH9 的N端連接，並對嵌合型合成_進行改造。 其它實施例 由上述之描述熟習此技藝之人士在不脫離本發明之 精神和範圍下，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明 之保護範圍當視後之申請專利範圍所界定者爲準。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（38) 序列資料 (1)一般資訊「 (i)^ Ira A · Board of Trustees of the University of Kentucky (n)發明名稱：嵌合型類異戊間二烯合成酶與其用途 (iii) 序列數目：6 (iv) 相關地址：

(A) 地址：Clark & Elbing LLP (B) 街道:176 Federal Street (C) 城市：Boston

(D) 州：MA

(E) 國家：US (F) 郵遞區號：02110-2214 (V)電腦可讀型式： (A) 介質型式:Diskette (B) 電腦：IBM Compatible

(C) 操作系統：DOS (D) 軟體：FastSEQ Version 2.0 (vi) 目前申請數據： (A) 申請號碼： (B) 申請日： (vii) 先前申請數據： (A) 申請號碼:08/631,341 (B) 申請日：12_APR-96 (C) 分類 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 509724 A7 B7 五、發明説明（39) (viii)代理人資料：

(A) 姓名：Clark，Paul T (B) 註冊號碼：32,164 (C) 參考/檔案號碼：07678/01 1001 iix)電通訊資料： (A) 電話：617-428-0200 (B) 傳眞：617-428-7045 (C) 電報： (2)SEQ ID Ν(λ·1 的資料 (Α)長度：30個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 (ii) 分子型式：DNA(寡核苷酸） (iii) 序列敘述：SEQ ID ΝΟ:1: GGGATCGATG ACATAGCCAC GTATGAGGTT 30 (2)SEQ ID NO:2的資料 (A) 長度:17個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 (π)分子型式：DNA(寡核苷酸） (iii)序列敘述：SEQ ID NO:2: AATACGACTC ACTATAG 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

509724 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（40 ) (2)SEQ ID NO:3的資料 (A) 長度：27個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 〇i)分子型式：DNA(寡核苷酸） (iii)序列敘述：SEQ IDNO:3: CGAGTCAACA TGGTTTATTG AGGGATA 27 (2)SEQ IDNO:4的資料 (A) 長度：28個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 (ii) 分子Μ式：DNA(寡核苷酸） (iii) 序列敘述：SEQ IDNO:4: TATTCTAGAT CTCTATGACG ATTATGAA 28 (2)SEQ IDNO:5的資料 (A) 長度:42個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 (π)分子型式·· DNA(寡核苷酸） (iii)序列敘述：SEQ ID NO:5:

GGGAGCTCGA ATTCCATGGC CTCAGCAGCA GTTGCAAACTAT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

T

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 --I L 509724 A7 B7 五、發明説明（41 ) 42 (2)SEQ ID NO:6的資料 (A) 長度：30個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股的型式：單股 (D) 局部解剖學：線性 (H)分子型式：DNA(寡核苷酸） (iii)序列敘述.· SEQ ID ΝΟ.·6: GGGATCGATA ACTCTGCATA ATGTAGCATT 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 509724 二 A8 " ~— 1*種肷合型類異戊間二稀合成酶多肽，其包含第 一個類異戊間二烯合成酶之功能部位與第二個異源類異戊 間；烯合成酶之功能部位連接，且該類異戊間二烯合成酶 可催化類異戊間二烯反應產物之產生，此產物在缺乏第二 個異源類異戊間二烯合成酶之功能部位時無法產生，其中 (a) s亥第一個類異戊間二烯合成酶可催化產生一類異戊 1婦反應產物之反應，但無法催化由該第二個異源類異 戊間二烯合成酶產生之類異戊間二晞反應產物； 〃 (b) -亥第—個異源類異戊間二稀合成酶可催化產生一類 異戊間二稀反應產物之反應，但無法催化由該第一個類異 戊間二烯合成酶產生之類異戊間二稀反應產物； … (c) „亥第-個類異戊間二烯合成酶之功能部位位於該嵌 合型類異戊間二烯合成酶之第一位置，該嵌合型類異戊間 :稀合成酶之第-位置是對應在該第—㈣戊間二婦合成 ^上之Θ第-類異戊間二烯合成酶之功能部位所佔的位 置；以及 ⑷該第二個異源類異戊間二稀合成酶之功能部位是位 =嵌合型類異戊間二烯合成酶之第二位置，該喪合型類 ”戊間—烯合成H位置是對應在 I 員 工 消 費

   頁 該第二異源_間二物酶二 酶，申ί專利範圍第1項之联合型類異戊間二缔合成 π的^β肷合型類異戊間二烯合成_至少可催化兩種不 同的異戍間二烯反應產物。 小 I__ 46 本紙張尺度適用中準（CNS)A4規袼（210 X 297 ^ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 509724 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3. 如申請專利範圍第1項之嵌合型類異戊間二烯合成 酶，其中該第二個異源異戊間二烯合成酶之功能部位包括 該嵌合型類異戊間二烯合成酶多肽之一比例決定功能部 位，其中該嵌合型類異戊間二烯合成酶多肽之比例決定功 能部位決定該嵌合型類異戊間二烯合成酶多肽之類異戊間 二烯反應產物之比例。 4. 如申請專利範圍第1項之嵌合型類異戊間二烯合成 酶，其中該第一個異戊間二烯合成酶的功能部位為一植物 的異戊間二烯合成酶及該第二異源異戊間二烯合成酶之功 能部位是來自植物的異戊間二烯合成酶。 5. 如申請專利範圍第4項之嵌合型類異戊間二烯合成 酶，其中嵌合型類異戊間二烯合成酶乃擇自由： (a) 菸草-黑豕豆CH4嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸1-397煙草5-表-馬兜鈴（aristolochene)合成酶（TEAS); 胺基酸388-555黑豕豆香根草螺旋烯合成酶（HVS); (b) 菸草-黑豕豆CH10嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸 1-160 HVS ;胺基酸 163-379 TEAS ;胺基酸 388-555 HVS)； (c) 菸草-黑豕豆CH11嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸 1-268 HVS ;胺基酸 282-379 TEAS ;胺基酸 388-555 HVS)； (d) 菸草-黑豕豆CH12嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸 1-379 TEAS ;胺基酸 388-451 HVS ;胺基酸 443-548 TEAS)； 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 509724 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍(e) 菸草-黑豕豆CH13嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸 1-342 TEAS ;胺基酸351-555 HVS);或(f) 菸草-黑豕豆CH14嵌合型異戊間二烯合成酶（胺基 酸 1-268 HVS ;胺基酸282-342 TEAS ;胺基酸351-555 HVS)所組成的群組中所選出來的；其中，上述TEAS胺基酸序列為基因庫編號Q40577， 係由如下之胺基酸1-397 TEAS : 1 masaavanye eeivrpvadf spslwgdqfl sfsidnqvae kyakeiealk eqtrnmllat 61 gmkladtlnl idtierlgis yhfekeiddi ldqiynqnsn cndlctsalq frllrqhgfn 121 ispeifskfq dengkfkesl asdvlgllnl yeashvrtha ddiledalaf stihlesaap 181 hlksplreqv thaleqclhk gvprvetrff issiydkeqs knnvllrfak ldfnllqmlh 241 kqelaqvsrw wkdldfvttl pyardrwec yfwalgvyfe pqysqarvml vktismisiv 301 ddtfdaygtv keleaytdai qrwdineidr lpdymkisyk aildlykdye kelssagrsh 361 ivchaiermk ewrnynves twfiegytpp vseylsn以及如下之胺基酸443-548 TEAS ·· 443 iddtatye veksrgqiat gieccmrdyg istfceamakf 481 qnmaetawkd inegllrptp vstefltpil nlarivevty ihnldgythp ekvlkphiin 541 llvdsiki所擇出；以及上述HVS胺基酸序列為基因庫編號AAA86340，係由 如下之胺基酸1-268 HVS : 1 mapaivmsny eeeeivrpva dfspslwgdh fhsfsvdnqv aekyaqeiet lkeqtstmls 61 aacgttltek lnlidiierl giayhfekqi edmldhiyra dpyfeaheyn dlntssvqfr 121 llrqhgynvs pnifsrfqda ngkfkeslrs dirgllnlye ashvrthked ileealvfsv 181 ghlesaaphl ksplskqyth aleqslhksi prveiryfis iyeeeefknd lllrfakldy 241 nllqmlhkhe lsevsrwwkd ldfvttlp以及如下之胺基酸282-555 HVS : 282 301 361 421 481 541 iamisivddt skdgrsdwh gmksatkehf evamekfqem lkphiialw fdaygivkel yakermkeiv ewlatnpkil adiawkdvne dsidi evytdaiqrw gnyfiegkwf eanatlcrw eilrptpvss disqidrlpe iegympsvse ddiatyevek eiltrilnla mgvyaepqy ymkisykall ylsnalatst grgqiatgie riidvtykhn sqarvmlakt dlyddyekel yylltttsyl cymrdygvst qdgythpekv --------------------訂-------1·線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 48 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 509724 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 所擇出。 6.—種嵌合型類異戊間二烯合成酶多肽，其中包括一 從第一異戊間二烯合成酶插入一第二異戊間二烯合成酶而 形成一嵌合型類異戊間二烯合成酶之功能部位，該嵌合型 類異戊間二烯合成酶產生一個不是由該第二異戊間二烯合 成酶所產生的異戊間二烯反應產物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¾ 訂· --線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）