CZ317998A3 - Chimerní isoprenoidsynthasy a způsob jejich přípravy - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Polypeptid chimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidsynthasy spojenou s druhou doménou ze druhé heterologní isoprenoidsynthasy, čímž je chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které nejsou produkovány v nepřítomnosti druhé domény ze zmíněné druhé, heterologní isoprenoidsynthasy. Polypeptid chimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, čímž je chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující posici ve zmíněném polypeptidu isoprenoidsynthasy. Způsob přípravy polypeptidu chimerní isoprenoidsyntasy.

• · · • · · ·

Chimerní isoprenoidsynthasy a způsob jejich přípravy

Tento vynález vznikl částečně s vládní podporou a proto má vláda na tento vynález jistá práva.

Oblast techniky

Tento vynález se týká synthásových enzymů modifikovaných isoprenoidů, je kódujících genů a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Termín isoprenoid je použit pro označení rodiny sloučenin odvozených od isoprenové stavební jednotky. Zvláště rostlinné isoprenoidy zahrnují strukturálně různé skupiny, které mohou být rozděleny do tříd primárních a sekundárních metabolitů (obr. 1), Isoprenoidy patřící mezi primární metabolity zahrnují steroly, karotenoidy, růstové regulátory a polyprenolové substituenty dolicholů, chinonů a proteinů. Tyto sloučeniny jsou esenciální pro celistvost membrány, fotoochranu, uspořádání vývojových programů a pro kotvení důležitých biochemických funkcí do specifických membránových systémům. Isoprenoidy, které jsou klasifikovány jako sekundární metabolity, zahrnují monoterpeny, seskviterpeny a diterpeny. Má se za to, že tyto sloučeniny zprostředkovávají důležité interakce mezi rostlinami a jejich prostředím. Například, specifické terpenoidy jsou spojovány s interakcemi rostlina-rostlina (Stevens, v: Isopentoids in plants, Nes W. D., Fuller, G a Tsai L. S. ed., Marcel Dekker, New York, str. 65-80, 1984), rostlina-hmyz (Gibson a Piekett, Nátuře 302 : 608, 1983) a rostlina-pathogen (Stoessl et al., Phytochemistry 15 : 855, 1976).

• · · · · · · · · ·· · • · · · · toto·· ···· to toto····· · · · ·· · · · ·· ···· ··· ···· ·· ··

Společným jmenovatelem této rozmanité skupiny sloučenin je jejich pětiuhlíkatá stavební jednotka, isopren. Pro vysvětlení biosynthetických výchozích bodů všech isoprenoidů odvozených od isoprenu bylo využit “biogenní řád isoprenoidů“ (Ruzicka, Experientia 10 : 357, 1953).

Polymerizaci dvou difosforylovaných isoprenových jednotek (např. IPP a dimethylallylu) vzniká geranyldifosfát (GPP), lineární CIO intermediát, který může být přeměněn na cyklické nebo lineární konečné produkty představující monoterpeny, nebo použit v dalším kole polymerizace. Přidáním třetí isoprenové jednotky k GTP vzniká farnesyldifosfát (FPP), který může být také přeměněn na cyklické nebo lineární konečné produkty představující seskviterpenovou třídu. Pokračující polymerizace a chemický diferenciaění cyklus vedou ke vzniku dalších tříd trepenoidů, které se nazývají podle počtu isoprenových jednotek, např. Přidáním třetího IPP k FPP vznikne geranylgeranyldifosfát (GGPP).

Tyto polymerizačni reakce jsou katalyzovány přenyltransferásou, která řídí působení karbokationu (elektron-deficientní atom vzniklý ztrátou difosfátové části jednoho substrátu) na uhlíkový atom, bohatý na elektrony, dvojné vazby v IPP molekule (obr. 2). Elektrofilní povaha těchto reakcí je neobyčejně příbuzná více obecným nukleofilním kondensačním reakcím, ale takové reakce se jeví být běžné mezi reakcemi biosynthesy isoprenoidů, zejména reakcemi zahrnujícími enzymy katalyzující cyklisaci různých isopreneoidových intermediátů (Gerskenzon and Croteau, v : Lipid metabolism in plants, Moore, T. S.,ed, CRC Press, Boča Raton, FL, str. 340-388). Enzymy, které jsou zodpovědné za cyklisaci GPP, FPP a GGPP se nazývají monoterpen-, seskviterpen- a ditrpensythasy a představují reakce • · přeměňující uhlík z obecné biosynthetické dráhy isoprenoidů na konečné produkty nezávisle ze tříd monoterpenů, seskviterpenů a diterpenů.

Dva důležité rozdíly mezi prenytransferasovýmy a synthasovýmy reakcemi jsou vyznačeny na obr. 2. Prenyltransferasy katalyzují vznik vazby uhlík-uhlík mezi dvěma molekulami substrátu, zatímco synthasy katalyzují vznik intramolekulární vazby uhlík-uhlík.

Prenyltransferasy také katalyzují reakce s velmi malými změnami v prostorovém uspořádání nebo délce výsledného polymeru. Prenyltransferasy se různí v délce allylových substrátů, které mohou být použity v iniciaci těchto reakcí. Synthasy jsou také substrátově specifické. Avšak, například, různé seskviterpensynthasy mohou využívat stejné substráty pro tvorbu různých produktů.

Biosynthesy isoprenoidů jako např. cyklických terpenů jsou určeny klíčovými enzymy nazývanými- terpensynthasy. Reakce katalyzované terpensynthasami jsou sdružené, intramolekulární cyklisace, které mohou zahrnovat několik dílčích reakcí. Např. bioorganické principy cyklisace FPP pomocí dvou seskviterpensynthas jsou vyznačeny na obr. 3. V kroku 1 je počáteční ionizace FPP následována intramolekulárním elektrofilním působením mezi uhlíkem nesoucím difosfátovou část a distální dvojnou vazbou za vzniku germakrenu A, makrocyklického intermediátu. Uzavření vnitřního kruhu a vznik eudesman karboniového iontu zahrnuje krok 2. Tabáková 5-epiaristolochensynthasa (TEAS) řídí v posledním kroku hydridový přesun, pohyb methylu a deprotonaci na C9, tím vzniká 5-epi-aristolochen, jak jest uvedeno na obrázku lila. Hyoscyamus muticus vetispiradiensynthasa (VHS) sdílí mechanismus v kroku 1 a 2, ale liší se od TEAS ve třetí dílčí reakci, kde se objeví zmenšení kruhu · · · · · ······· · · · · · ··· ·· ···« ··· ···· ·· ·· způsobené pohybem páru elektronů. V každém případě katalyzuje monomerní protein, průměrně 64kD celý soubor dílčích reakcí a nevyžaduje jiné kofaktory než Mg⁺².

Podstata vynálezu

Obecně se vynález týká polypeptidu chimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidsynthasy spojené s druhou doménou ze druhé heterologní isoprenoidsynthasy, čímž je chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které nejsou produkovány v nepřítomnosti druhé domény z druhé heterologní isoprenoidsynthasy. V preferovaných provedeních je chimerní isoprenoidsynthasa schopna katalyzovat produkci alespoň dvou různých isoprenoidových reakčních produktů; isoprenoidové reakční produkty jsou cyklické; druhá doména z druhé heterologní isoprenoidsynthasy také určuje poměr isoprenoidových reakčních produktů chimerní isoprenoidsynthasy; první doména z první isoprenoidsynthasy je rostlinná isoprenoidsynthasa a druhá doména z druhé heterologní isoprenoidsynthasy je také z rostlinné isoprenoidsynthasy.

Přednostně je chimerní isoprenoidsynthasa vybrána ze skupiny složené z (a) tabák-Hyoscyamus CH4 chimerní isoprenoidsynthasy; (b) tabák Hyoscyamus CH10 chimerní isoprenoidsynthasy; (c) tabákHyoscyamus CH11 chimerní isoprenoidsynthasy; (d) tabák Hyoscyamus CHI2 chimerní isoprenoidsynthasy; (e) tabák-T/y^cy^^^ CH13 chimerní isoprenoidsynthasy nebo (f) tabák-Hyoscyamus CH14 chimerní isoprenoidsynthasy, jak jsou zde popsány.

V preferovaných provedení, katalyzuje chimerní isoprenoidsynthasa produkci isoprenoidových reakčních produktů, které mají zemědělský, to ·· · ··· to · · · · •to · · to · · to · toto ·· · ······· ··· «· ··· ·· ···« ··· ···· ·· to· farmaceutický, komerční nebo průmyslový význam (např. fungicidní činidlo, antibakteriální činidlo nebo protinádorové činidlo).

Z jiného pohledu, zahrnuje vynález DNA, vektory a buňky (např.

E. coli, Saccharomyces cerevisiae, živočišné nebo rostlinné buňky) kódující nebo obsahující polypeptid ehimerní isoprenoidsynthasy.

Z jiného pohledu se vynález týká polypeptidů ehimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, čímž je ehimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů (přednostně cyklických), které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující posici ve zmíněném polypeptidů isoprenoidsynthasy.

Z ještě jiného pohledu se vynález týká způsobu výroby polypeptidů ehimerní isoprenoidsynthasy. Tento způsob zahrnuje ; (a) poskytnutí buňky transformované DNA, která kóduje ehimerní isoprenoidsynthasu, umístěnou pro expresi v této buňce; (b) pěstování transformované buňky za podmínek vhodných pro expresi a (c) získání ehimerní isoprenoidsynthasy.

„Isoprenoidsynthasa“ znamená polypeptid, který je schopen katalyzovat reakci zahrnující vznik intramolekulární vazby uhlík-uhlík u allyldifosfátového substrátu (např. Cio.Cjs nebo C₂o allyldifosfátového substrátu) za vzniku isoprenoidového produktu (např. monoterpenového, diterpenového, seskviterpenového nebo sterolového). Příklady takovýchto isoprenoid synthas zahrnují monoterpensynthasy (například limonensynthasu), ditrpensythasy (například kasbensynthasu) a seskvitrpensynthasy (například 5-epiaristolochensynthasu, vetispiradinsynthasu a kadinensynthasu), které jsou zodpovědné za cyklisaci, nezávisle, geranyldifosfátu (GPP), • · farnesyldifosfátu (FPP) a geranylgeranyldifosfátu (GGPP). Tento výčet není omezující.

Řada terpensynthas z rostlinných a mikrobiálních zdrojů byla izolována a charakterizována (viz např. Moestra a West, Arch. Biochem. Biophys. 238 : 325, 1985; Hohn a Van Middlesworth, Arch. Biochem. Biophys. 251 : 756; 1986, Hohn a Platter, Arch. Biochem. Biophys. 272 : 137, 1989; Cane a Pargelli, Arch. Biochem. Biophys. 254 : 421, 1987; Munck a Croteau, Arch. Biochem. Biophys. 282 : 58, 1990; Alonso et al., J. Biol. Chem. 267 ; 7582, 1992; Sevage et al., J. Biol. Chem. 269 ; 4012, 1994; Croteau et al., Arch. Biochem. Biophys. 309 : 184, 1994; Vogeli et al., Plant Physiol. 93 ; 182, 1990; Guo et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 : 103, 1994 a Gambliel a Croteau J. Biol. Chem. 259 : 740, 1984). Obecně, terpensynthasy jsou rozpustné enzymy, které mají molekulovou hmotnost od asi 40 do 100 kD. Geny kódující řadu monotrpen-, diterpen- a seskvitrepensynthasy byly popsány u řady rostlin a mikroorganismů (viz např. Hohn a Beremand, Gene 79 ; 131, 1989; Proctor a Hohn, J. Biol. Chem. 268 : 4543, 1993; Faechiny a Chappell, Proč. Nati. Acad. Sci. 89 : 11088, 1992; Back a Chappell, J. Biol. Chem. 270 : 7375, 1995; Colby et al.,

J. Biol. Chem. 268 ; 23016, 1993; Mau a West, Proč. Nati. Acad. Sci. 91 ; 8497, 1884; Chen et al., Arch. Biochem. Biophys. 324 : 255, 1994 a Cane et al., Biochemistry 33 : 5846, 1994).

„Polypeptid“ nebo „protein“ znamená jakýkoliv řetězec aminokyselin bez ohledu na délku nebo posttranslaění modifikace (např. glykosylaci nebo fosforylaci).

„Spojený s“ znamená kovalentně vázaný buď přímo nebo nepřímo (např. domény jsou oddělené vmezeřenou aminokyselinovou sekvencí).

• · · * · · · • · · · · · · · · ·· · • · · to · · · · · •to ·· · ······· ♦ · · ·· ·· · ·· ···· ··· ···· ·· «·

Takovéto domény mohou být vázány jakýmkoliv způsobem, zahrnujíce, bez omezování, peptidovou vazbu nebo chemickou vazbu.

„Doména“ znamená souvislý úsek aminokyselin v rámci polypeptidů nebo proteinu.

„Isoprenoid“ znamená sloučenina, která je odvozena od isoprenové stavební jednotky. Obzvláště isoprenoidové sloučeniny zahrnují, bez omezování, monoterpeny, diterpeny, seskviterpeny a steroly. Jak je zde popsáno, isoprenoidy se nacházejí v řadě organismů, např. živočišných, houbových nebo bakteriálních.

„Asymetricky umístěný“ znamená umístěný v rámci chimerního polypeptidů v místě, které se liší od posice v přirozeně se vyskytujícím polypeptidů.

„Heterologní“ znamená odvozený z různých zdrojů (v tomto případě různých polypeptidů).

„Homologní“ znamená odvozený ze stejného zdroje (v tomto případě stejného polypeptidů).

Ostatní rysy a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu preferovaných provedení a z nároků.

Detailní popis

Chimerní isoprenoidsynthasy

Substitucí části genu, který kóduje doménu tabákové 5-epiaristolochensynthasy, částí genu, který kóduje doménu Hyoscyamus vetispiradiensynthasy, byly připraveny plazmidy určené pro expresi chimerní synthasy. Tyto plazmidy byly exprimovány v bakteriích, byly připraveny bakteriální lysáty a ty byly testovány na seskviterpensynthasovou aktivitu. Zkoušky seskviterpensynthasové zahrnovaly argentation - thin layer chromatography (TLC), kterou byly rozeznány aristolochenové a vetispiradienové reakční produkty (Back a • 4 44 4 44 44 44

44 4 444 4 4 44 ·

4 4 44444

4 4 4 4 4 4 4444 4

444 44 444

4444 444 4444 44 44 * Chappell, J. Biol. Chem. 270 : 7375, 1995). Jak ukazuje obr. 4A, bylo vytvořeno čtrnáct konstruktů chimerních synthas, které byly následovně testovány.

Celé cDNA pro tabákovou 5-epi-aristolochensynthasu (TEAS) a Hyoscyamus vetispiradiensynthasu (HVS) byly jednotlivě vloženy do EcoRI/Xhol míst pBluescriptu SK (Stratagene) za vzniku pBSK-TEAS a pBSK-HVS plazmidu (Back a Chappell, J. Biol. Chem. 270 : 7375, 1995). TEAS a HVS cDNA inserty těchto expresních plazmidů byly orientovány tak, že jejich translační start kódony sousedily s EcoRI restrikčním místem a jejich póly A konce byly ohraničeny Xhol restrikčním místem pSK plazmidu.

Chimerní synthasy CH1, CH2, CH5 s CH7 byly připraveny za použití konzervovaných HindlII s Ndel restrikčních míst, které byly nalezeny mezi geny tabáku a Hyoscyamus. CH1 byla připravena ligací 5' terminální části TEAS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a HINDIII) s 3' terminální částí HVS genu (odpovídá fragmentu HindlII a KpnI) do bakteriálního expresního vektoru pGBT-T19 (Gold Biotechnology), který byl předštěpen EcoRI a KpnI,

CH2 byla připravena ligací 5' terminální části TEAS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a Ndel) s 3' terminální částí HVS genu (odpovídá fragmentu Ndel a KpnI) do pGBT-T19.

CH5 byla připravena ligací 5' terminální části HVS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a HindlII) s 3' terminální částí TEAS genu (odpovídá fragmentu HindlII a KpnI) do pGBT-T19.

CH7 byla připravena ligací 5' terminální části HVS genu (odpovídá fragmentu EcoRI a Ndel) s 3' terminální částí TEAS genu (odpovídá fragmentu Ndel a KpnI) do pGBT-T19.

fr' · frfr fr · · ··'··' • · · · · · · fr fr frfr · • fr · · fr frfr frfr • fr fr fr · · · frfrfrfr · • frfr frfr frfrfr • fr ···· ······· ·* frfr

CH3, CH4, CH12 a CH13 byly připraveny za použití běžných metod polymerázové řetězcové reakce (PCR), s primery navrženými pro amplifikaci vybraných segmentů HVS genu. Pro usnadnění řízeného klonování a udržení čtecího rámce byly primery navrženy tak, že obsahují vhodná restrikění místa.

CH3 byla připravena následovně. EcoRI/Clal restrikění fragment TEAS genu byl isolován a ligován s Clal/KpnI fragmentem HVS genu. HVS Clal/Kpnl fragment byl připraven metodou PCR za použití 5/-d(GGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT; SEK. i.ě. : 1) 3'(ClaI restrikění místa podtrhnuta) jako přední primer a 5'-d(AATACGACTCACTATAG; SEK i.ě. : 2) - 3' jako zpětný primer (odpovídá T7 sekvenci nacházející se ve vícenásobném klonovacím místě pBSK) a za použití pBSK-HVS jako DNA templát. Výsledný restrikění fragment byl ligován do EcoRI/KpnI míst vektoru pGBT-T19.

CH4 a CH13 byly připraveny podobným způsobem, ale za použití předních amplifikačních primerů jednotlivě

5' -dfCGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA; SEK i.č. : 3) -3' (HindlI restrikění místo podtrženo) a

-d(TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA; SEK i.ě. 4)-3'(XbaI restrikění místo podtrženo).

Cl2 byla připravena ligací PCR fragmentu, který odpovídá prvním 1326 nukleotidům CH4, s Clal/Kpnl fragmentem TEAS genu do EcoRI/KpnI míst vektoru pGBT-19. CH4 fragment byl připraven za použití předního amplifikaěního primerů 5' d(GGGAGCTCGAATTCCATGG^:CCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT; SEK i.č. : 5) (EcoRI restrikění místo podtrženo a translační start kodon tučně) a zpětného primerů 5'·« ·· toto to« · · · · • to to to« • · toto ·

d(GGGATCGATAACTCTGCATAATGTAGCATT; SEK i.č. ; 6) (Clal restrikční místo podtrženo).

Chimerní synthasy CH6, CH8, CH9, CH10, CH11 a CH14 byly připraveny následovně. Ligací EcoRI/HindlII fragmentu HVS genu s HimdlII/Kpnl fragmentem CH3 vznikla CH6. CH8 vznikla ligací EcoRI/Ndel fragmentu HVS genu s Ndel/ KpnI fragmentem CH3. CH9 vznikla ligací EcoRI/Ndel fragmentu CH5 s Ndel/ KpnI fragmentem HVS. CH10 byla připravena ligací EcoRI/HindlII fragmentu HVS genu s HimdlII/Kpnl fragmentem CH4. CH11 byla připravena ligací EcoRI/Ndel fragmentu HVS genu s Ndel/ KpnI fragmentem GH4. A CH14 byla připravena substitucí EcoRI/Ndel fragmentu CH13 odpovídajícím DNA fragmentem pBSK-HVS. Nukleotidová spojení chimerních konstruktů byla prověřena sekvenováním dvoušroubovicové DNA za použití kitu pro dideoxynukleotidovou terminaci řetězce, podle pokynů-výrobce (U.S. Biochemical Corp). Chimerní synthasy byly exprimovány v buňkách E. coli. TB1. Postupy pro růst bakteriálních buněk, indukci exprese genu, měření aktivity seskviterpensynthasy a určení celkového proteinu v bakteriálním lysátu byly provedeny podle metod popsaných v Back a Chappell (Arch. Biochem. Biophys. 315 : 527, 1994; J. Biol. Chem. 270 : 7375, 1995). Reakční produkty byly odděleny vyvinutím G60 silikagelových TLC vrstev, impregnovaných 15% dusičnanem stříbrným v benzen:hexan:diethyletheru (50:50:1). Pro kvalitativní měření byly TLC vrstvy postříkány sprejem Enhance surface fluorography spray (Dupont) a byly exponovány na film Kodak XAR-5 po dobu 2-5 dní při -70 °C. Pro kvantitativní měření byly 0,5 mm části celých drah TLC vrstev seškrábány do scintilaěních lahviček a byla změřena radioaktivita za použití scintlilačního počítače Packard liquid ·· ·· · ·· ·· ·· ' • · · · · · * · · · ♦ · • · · · · · ♦ ·· ·· ·· · ······· • · · · · · · · ·· ···· ··· ···· ·· ·· scintillation counter. Hlavní reakční produkty, vzniklé synthasovými aktivitami, které jsou výsledkem exprese konstruktů TEAS, HVS, CH4 a CH14, v bakteriálních lysátech byly také ověřeny pomocí plynové chromatografie (GC) plynové chromatografie-hmotnostní spektroskopie (GC-MS) způsobem popsaným v Chappell et al., Phytochemistry 26 : 2259, 1987. Navíc byly profily získané hmotnostní spektroskopií porovnány s těmi publikovanými pro 5-epi-aristolochen (Anke a Sterner, Planta med. 57 : 344, 1991) a s předpovídaným fragmentačním vzorem pro vetispiradien (Enzell et al., Mass spectrometry rev. 3 : 395, 1984)

Jak ukazují obr. 4A-B, hlavním reakčním produktem, který je výsledkem působení enzymu vzniklého expresí TEAS genu, byl 5-epiaristolochen a hlavním reakčním produktem, který je výsledkem působení enzymu vzniklého expresí HVS genu, byl vetispiradien. Převládající reakčni produkty, které byly výsledkem působení enzymů vzniklých expresí CH1 a CH2, které měli enzymové aktivity podobné těm nalezeným pro HVS, jež byla exprimována z plazmidu pBSK-HVS, byly také HVS specifické (např. vestipiradien). Tyto výsledky naznačily, že aminoterminální poloviny TEAS a HVS genů jsou funkčně rovnocenné, s ohledem na karboxyterminální část, a nepřispívají ke specifitě reakčních produktů. CH7, která má HVSaminoterminální část a TEAS-karboxyterminální část, je opakem CH2. Očekávalo se, že její výsledná synthasová aktivita dá vznik TEAS specifickému produktu (např. 5-epi-aristolochenu). Imunodetekční zkoušky ukázaly, že synthasový protein vzniklý při expresi CH7 byl správné velikosti a v očekávaném množství, avšak nebyla zjištěna žádná enzymová aktivita. Nepřítomnost enzymové aktivity naznačila, že interakce mezi karboxy a aminoterminální částí proteinu přispívají k • · · to to to to ' toto ·· • ·· · · · · · · ·· · , _ · · · · ····· · · · · · · · tototo · · ··· ·· ··· • to ···· to·· ···· ·· ·· enzymové aktivitě. Toto vysvětlení je dále podpořeno srovnáváním specifické aktivity enzymů, které vznikly expresí CH5 a CH6. Expresí CH5 vznikl produkt mající desetinásobně nižší specifickou synthasovou aktivitu než ostatní synthasy, i když celkové množství exprimováného proteinu bylo podobné jako u ostatních konstruktů (určeno imunodetekcí, data nejsou uvedena). Zjistilo se, že záměnou karboxyterminální části za HVS- karboxyterminální část byla obnovena specifická aktivita synthasového enzymu, který vznikl expresí CH6. Srovnání CH2 a CH3 chimerních synthas poskytlo důkaz pro specifitu tvorby koncových produktů, za kterou je zodpovědná doména tvořená přibližně 181 aminokyselinami, což odpovídá Ndel a Clal restrikčním místům v TEAS a HVS genech. Výsledkem exprese CH4 byla neočekávaně produkce chimerního synthasového proteinu, který je schopen tvorby reakěních produktů specifických pro oba, TEAS i HVS enzymy. Tento výsledek jsme vysvětlili tak, že naznačuje, že aminokyseliny 261-379 v rámci tabákové 5-epi-aristolochensynthasy jsou zodpovědné za TEAS-specifické produkty (např. úsek odpovídající Ndel/Hincll fragmentu cDNA), zatímco aminokyseliny 379-442 v rámci proteinu z Hyoscyamus jsou zodpovědné za HVSspecifické produkty (např. úsek odpovídající HincII/Clal fragmentu cDNA).

Naše vysvětlení bylo potvrzeno testováním expresních produktů CH11 a CH12. Cil představuje záměnu Ndel/HimcII fragmentu z genu z Hyoscyamus za odpovídající fragment genu tabáku a výsledkem jeho exprese byl enzym mající HVS- a TEAS-specifitu. CH12 představuje záměnu HimcII/Clal fragmentu z genu tabáku za odpovídající fragment genu z Hyoscyamus a výsledkem jeho exprese byl enzym mající HVS- a TEAS-specifitu. Srovnání Cil s Cl3 poskytlo další ·· ·· ·· • toto · ·· · · · 4 4 4 • · · · 4 4 4 9 4 • 44 4 9 · · 9444 4

4 9 4 9 4 4 4

4494 994 4444 ·· 44 znalost o doméně enzymu tabáku, která je zodpovědná za vznik TEASspecifických produktů. Fakt, že bylo zjištěno, že C13 je multifunkění enzym, naznačil, že 81 aminokyselin kódovaných na DNA fragmentu mezi Ndel a Xbal restrikčními místy tabákové cDNA stačí pro tvorbu převládajících TEAS - specifických produktů. Toto vysvětlení bylo potvrzeno nahrazením domény obsažené mezi Ndel a Xbal restrikčními místy HVS cDNA odpovídajícím úsekem z TEAS genu u CH14 (obr. 4A).

Jak ukazuje obr. 4B převažující produkt(y) vzniklý působením enzymů, které vznikly expresí genů divokého typu pro tabákovou TEAS a Hyoscyamus HVS, se pohybovaly po TLC vrstvě z dusičnanu stříbrného s hodnotami R_f 0,41 a 0,31. Tyto hodnoty odpovídají dřívějšímu popisu těchto produktů jednotlivě jako 5-epi -aristolochen a vetispiradien (Back a Chappell, J. biol. chem. 270 : 7375, 1995; Beck et al., Arch. biochem. biophys., 315 : 527, 1994). GC a GC-MS analysy ukázaly, že převažujícími reakěními produkty TEAS byly 5-epi -aristolochen (70 % všech produktů, založeno na procentním podílu z celkových vrcholů z GC analysy) a bicyklický seskviterpen (20 %) ([M]⁺ iont při m/z 204). Převažujícím reakěním produktem HVS byl vetispiradien (>90 %) ([M]⁺ iont při m/z 204 se základním vrcholem při m/z 41 a řada předpověditelných iontů při m/z 175, 108, 94 a 68) a převažujícími reakěními produkty CH4 byl 5-epi aristolochen (18 %), bicyklický seskviterpen (43 %) a vetispiradien (32 %).

Navíc, studie využívající afinitní purifikaci rekombinantních synthasových proteinů s histidinovou kotvou odhalily dalších 5 minoritních reakčních produktů, z nichž každý představuje přibližně

ΦΦ ·· * «Φ ·* ο» • φ * » φφ · φ · φ φ · ί _Λ ··· · · · · ΦΦ

9 9 9 9 9 9 9 999 * Φ

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 9999 99 99 % všech produktů a všech 5 bylo nalezeno ve stejném množství ve všech reakčních zkouškách.

Poměr určující doména

Srovnáním poměrů reakčních produktů produkovaných multifunkěními chimerními synthasovými enzymy (obr. 4A) byla identifikována další doména synthesy proteinu. Např. reakční produkty plynoucí z exprese konstruktů CH4, CH10, CH11 a CH12 vznikly v poměru 60-70 % TEAS - specifických k 30-40 % HVS - specifickým. Naopak obrácený poměr reakčních produktů je výsledkem exprese konstruktů CH13 a CH14. Tento výsledek naznačil, že úsek obsažený v Xbal/HincII doméně ovlivňuje relativní poměr reakčních produktů produkovaných multifunkčními chimerními synthasovými enzymy. Tyto výsledky naznačily, že dvě oddělené a odlišné domény synthasového peptidu působí přímo na druh vzniklých reakčních produktů. Ty jsou rušeny jinou doménou, kterou nazýváme poměr určující doména (obr,5).

Místně cílená mutagenese

Pro další analysu domény určující specifitu produktů a domény určující poměr produktů byly použity obvyklé methody místně cílená mutagenese. Výsledky této analasy jsou v tabulee I. Např. motiv DDXXD, nalezený v rámci aristolochen specifické domény, je konzervovanou sekvencí, která byla nalezena u řady enzymů pro biosynthesu terpenů, zahrnujíce TEAS a HVS. Má se za to, že tento shluk aminokyselin váže kovový kofaktor, který je nutný pro neutralizaci difosfátové části FPP v jinak lipofilním obalu. Záměna prvního zbytku kyseliny asparagové (D301) motivu DDXXD za zbytek kyseliny glutamové (zachování celkového náboje) nebo valinu (zbytkové snížení kyselosti)(např. D301->E a D301-*V) měla za následek vznik inaktivovaného enzymu. Záměna druhého zbytku kyseliny asparagové (D302) za zbytek kyseliny glutamové (např. D302+E) také zrušila aktivitu chimerního synthasového enzymu z 95 % a měla za následek mírnou změnu v rozložení produktů multifunkěního enzymu.

Tabulka I

Cílový gen mutace	Mutovaná aminokaselina'	Poměr produktů	Specifická ” aktivita (nmol/mg h'1)
Aristolochen	Vetispiradien
CH4		66%	34%	34
Substrát vázající doména (úsek Ndel/Xbal
Tobacco	D301V	Žádná aktivita		0
CH4	R287A	Žádná aktivita		0
CH4	D301V	Žádná aktivita		0
CH4	D301E	Žádná aktivita		0
GH4	D302E	51%	49%	1.8
Poměr určující doména (úsek Xbal/f lihcll)
CH4	K347I	64%	36%	32
CH4	H360S	63%	32%	29
CH4	H364S	65%	35%	38
Hyoscyamus specifická doména (úsek líincII/Cial)
CH4	T408A	67%	33%	48
CH4	K420M	68%	32%	29
CH4	H422A	67%	33%	30
CH4	N436S	70%	30%	32
CH4	AT437.438V1	61%	39%	33

• · ·« ·· ·· • · · · • · ·· ·· · · · • · · » · · ·

Místa pro místně cílenou mutagenesi v rámci poměr urěující domény (např. K347-»l, H360-+S, H3644S) byla odvozena rozborem prací, ve kterých je předpokládána důležitá role nabitých aminokyselinových zbytků (např. histidinu nebo lysinu) v synthasové enzymologii, a tato místa představují ty aminokysefiny, které vykazují nevětší rozdíl náboje při srovnání TEAS a HVS primárních sekvencí. Ani jedna ze tří analysovaných mutací neměla žádný účinek na celkovou katalytickou aktivitu nebo poměr vzniklých produktů.

Záměny aminokyselin v rámci HVS specifické domény byly vybrány na základě porovnání předpovězené sekundární struktury proteinů HVS a TEAS. Ukázalo se, že aminokyseliny, které byly později mutovány, přispívají neúměrně k strukturálním změnám modelů sekundární struktury těchto dvou proteinů hlavně kvůli velikosti náboje. Avšak, jak ukazuje tabulka I, záměny nabitých aminokyselin za nenabité (např. T408-* A, K420->M, H422+A) nebo za méně nabité (N436>S, A437*T, V*438-I) neměly efekt na celkovou katalytickou aktivitu ani na úroveň synthesy jednoho ěi druhého produktu.

Klidová synthasa

Klidová synthasa je vytvořena, jak ukazuje obr. 6, záměnou inaktivní domény odpovídající exonu 4 z HVS za odpovídající aktivní doménu z CH3. CH3 obsahuje inaktivní doménu odpovídající exonu 6 z TEAS, má Ndel a Xbal restrikční místa pro požadovanou záměnu a může být exprimován v bakteriích na vysoké úrovni. Přesun domény je proveden za použití standardních molekulárních technik, jak jest zde popsáno. Jedním příkladem je záměna PCR produktu HVS cDNA, který

odpovídá exonu 4, obsahuje aminokyseliny 261 až 342 a také Ndel a Xbal restrikčni místa z primerů, za odpovídající úsek CH3. Při tvorbě takovýchto konstruktů se dbá zejména na to, aby obsahovaly vhodné aminokyselinové zbytky a aby byl zachován správný čtecí rámec. Testování exprese konstruktů zahrnuje měření množství proteinu v rozpustné a nerozpustné frakci bakteriálních lyzátů pomocí imunoblotových technik a také testy enzymů.

Navíc byly provedeny enzymatické reakce ve velkém měřítku, reakční produkt(y) byly extrahovány v hexanu a byly vyčištěny pomocí metod HPLC. Byla provedena další měření reakčních produktů klidové synthasy za použití TLC a porovnání hodnot Rf standardů s hodnotami enzymů TEAS a HVS. Časy retence reakčních produktů (např. germakrenu nebo jemu podobných reakčních produktů) byly také monitorovány pomocí GC, GC-MS a NMR podle standardních metod. Klidová synthasa je užitečná pro tvorbu dostatečného množství germakrenových reakčních intermediátů (nebo jejich derivátů) pro posílení chemické recionalizace EAS a VS reakcí, tvoří templátovou chimerní synthasu, která může být použita pro zavedení nových terminální ch kroků do celkového reakčního schématu.

Chimerní kasben- a kadinensynthasa

Chimerní isoprenoidsynthasy jsou také užitečné pro tvorbu nových makrocyklických isoprenoidů nebo isoprenoidů, které mají změněné prostorové uspořádání. Např. isoprenoidsynthasa jako např. kasbensynthasa, diterpensynthasa, která katalyzuje synthesu makrocyklického diterpenu nesoucích cyklopropylovou boční skupinu, a kadinensynthasa, seskviterpensynthasa, která katalyzuje synthesu bicyklického seskviterpenu, poskytují domény užitečné pro přípravu enzymů schopných produkce makrocyklických isoprenoidů nebo isoprenoidů, které mají změněné prostorové uspořádání. Obecná schémata pro tvorbu takovýchto chimerních synthas je na obr. 7 a 8.

U konstruktů jako např. chimerní kasben- a kadinensynthasa jsou za aminoterminální domény klidové synthasy (nebo jiné synthasy je-li to třeba) zaměněny domény z kasben- a kadinensynthasy za použití obvyklých restrikěních míst a PCR amplifikace vybraných úseků jak jest popsáno výše. Sekvence odpovídající N-terminální části, plastidová cílová sekvence kasbensynthasy je v těchto konstruktech oddělena. Chimerní konstrukty jsou exprimovány v bakteriích, bakteriální lyzáty jsou testovány na aktivitu chimerní synthasy a reakční produkty jsou charakterizovány jak jest popsáno výše, např. pomocí argentation-TLC. Konstrukty nesoucí vysokou hladinu synthasové aktivity v bakteriích a/nebo aktivitu pro tvorbu reakěních produktů, které se pohybují s Rfs, který se liší od aristolochenových a vetispiradienových standardů, jsou v rámci vynálezu považovány za užitečné. Je-li to nutno jsou reakční produkty analysovány pomocí GC, GC-MS a NMR. Ty domény kasbensynthasy a kadinensynthasy, které přispívají k synthese jedinečných reakěních produktů mohou být také detailně mapovány za použití postupu, který je analogický k tomu zobrazenému na obr. 4A.

Tvorba jiných chimerních isoprenoidsynthas

Za použití zde popsaných standarních molekulárních technik, mohou být snadno připraveny jiné chimerní synthasy, které obsahují domény ze známých nebo nově izolovaných synthasových enzymů. U takovýchto chimerních synthas může být testována aktivita za použití např. jakýchkoliv vhodných zkoušek enzymů, které jsou známé odborníkům, (např. ty zde popsané), nebo standarních imunodetekčních technik.

• ·

Izolace sekvencí kódujících synthasy je také možná za použití standarních klonovacích technik, které jsou v oboru dobře známé. Např. za použití celé nebo jen části aminokyselinové sekvence polypeptidů známé synthasy se dají snadno navrhnout pro synthasu specifické oligonukleotidové sondy, zahrnujíce synthasové degenerované oligonukleotidové sondy (např. směs všech možných kódujících sekvencí pro danou aminokyselinovou sekvenci). Tyto oligonukleotidy mohou být založeny na sekvenci jednoho z řetězců DNA a jakékoliv vhodné části synthasové oligonukleotidové sekvence. Obecné metody pro navrhování a přípravu takovýchto sond jsou popsány např. v Ausubel et al., 1996, Current protocols in molecular biology, Wiley Interscience, New York a Berger a Kimmel, Guide to molecular cloning techniques, 1987, Academie press, New York. Tyto oligonukleotidy jsou užitečné pro izolaci synthasového genu, kde mohou být použity jako sondy schopné hybridizace s komplementární sekvencí synthasy nebo jako primery pro různé amplifikační techniky, např. polymerázovou řetězovou reakci (PCR).

Hybridizační techniky a prohledávací postupy jsou odborníkům dobře známy a jsou popsány např. v Ausubel et al., (supra); Berger a Kimmel (supra); Chen et al., Arch. biochem. biophys. 324 ; 255, 1995 a Sambrook et al., Molecular cloning ; A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory press, New York. Je-li to požadováno, může být pro prohledávání knihovny rekombinantní DNA použita kombinace různých oligonuklcotidových sond. Tyto oligonukleotidy mohou značeny za použití metod známých v oboru a mohou být použity pro sondování filtrové kopie knihovny rekombinantní DNA. Knihovny rekombinantní DNA jsou připraveny podle metod známých v oboru,

• · popsaných např. v Ausubel et al., (supra) nebo se dají získat z komerčních zdrojů.

Jak je uvedeno výše, synthasové oligonukleotidy mohou být také použity jako primery v amplifikačních technikách, např. za použití PCR. Metody PCR jsou v oboru dobře známé a jsou popsány např. v PCR technology, Erlich, ed., Stockton press, London, 1989; PCR protocols ; A guide to methods and applications, Innis et al., ed., Academie press, lne., New York, 1990 a Ausubel et al., (supra). Primery jsou volitelně navrženy tak, aby bylo možno vložit amplifikovaný produkt do vhodného vektoru, např. zahrnuje vhodná restrikční místa na 5 a 3 koncích amplifikováného fragmentu (jak je zde popsáno). Je-li to požadováno, může být synthasový gen izolován za použití PCR „RACE“ technik nebo-li Rapid amplification of cDNA ends (viz. Innis et al., (supra)). Při této metodě jsou oligonukleotidové primery, založené na synthasové sekvenci, orientovány ve směrech 3 a 5 a jsou použity pro vznik překrývajících se fragmentů. Tyto překrývající se 3 a 5 RACE produkty jsou kombinovány za vzniku intaktní cDNA plné délky. Tato metoda je popsána v Innis et al., (supra) a Frohman et al., Proč. nati. acad. sci. USA 85 : 8998, (1988). Užitečné synthasové sekvence mohou být izolovány z jakéhokoliv vhodného organismu. Potvrzení příslušnosti sekvencí k synthasové rodině polypeptidů může být provedeno řadou obvyklých metod, např. porovnáním sekvencí. Navíc může být aktivita kteréhokoliv ze synthasových proteinů měřena jakýmikoliv zde popsanými technikami. Exprese polypeptidů chimerní isoprenoid synthasy

Polypeptidy chimerní isoprenoidsynthasy mohou být produkovány pomocí transformace vhodné hostitelské buňky celou nebo částí DNA chimerní synthasy (např. cDNA chimerní synthasy popsané výše) ve vhodném expresním vektoru nebo plazmidovým konstruktem navrženým pro zvýšení exprese polypeptidů ehimerní synthasy in vivo. Odborníci v oboru molekulární biologie ocení, že se pro získání rekombinantního proteinu dá použít řada expresních systémů. Použití správné hostitelské buňky není v tomto vynálezu kritickým bodem. Protein ehimerní synthasy může být produkován v prokaryotických buňkách, např. E. coli TB1, nebo v eukaryotických buňkách, např. Saccharomyces cerevisiae, savčích buňkách (např. COS 1 nebo NIH 3T3 buňkách), nebo buňkách řady rostlin zahrnujíce řasy, druhy stromů, okrasné druhy, druhy ovoce mírného pásu, druhy tropického dvouděložné rostliny nebo jakékoliv jiné rostliny komerčního nebo zemědělského významu. Tento výčet rostlin není omezující. Příklady obzvláště vhodných hostitelských buněk zahrnují buňky jehličnanů, petúnií, rajčat, brambory, tabáku, rodu Arabidopsis, lociky, slunečnice, řepky olejné, lnu bavlny, cukrovky, celeru, sojových bobů, vojtěšky, rodu Medicago, tomelu, rodu Vigna, okurky, mrkve, lilku, květáku, pojivnice, topolu, ořešáku, jabloně, asparagu, rýže, kukuřice, prosa, cibule, ječmene, srhy laloěnaté ovsa, žita a pšenice. Tento výčet rostlin není omezující. Takovéto buňky jsou dosažitelné od řady zdrojů zahrnujíce ; American type culture collection (Rockland, MD); nebo od řady společností např. W. Atlee Burpee seed co. (Warminster, PA), Park seed co. (Greenwood, SC), Johnny seed co. (Albion, ME) nebo Northrup king seeds (Harstville, SC). Popis a zdroje vhodných hostitelských buněk se dají najít ve Vasil I. K., Cell culture and somatic genetics of plants, svazek I, II, III, Laboratory procedures and their applications, Academie press, New York, 1984; Dixon R. A., Plant cell culture - a practical approach, IRL press, Oxford University, * · * · *······ • · 4 44 444 «44« 444 4444 4· 44

1985; Green et al., Plant tissue and cell culture, Academie press, New York, 1987; a Gasser a Fraley, Science 244 : 1293, 1989.

Při prokaryotické expresi je DNA kódující polypeptid chimerní synthasy nesena vektorem, který může být spojen s řídícími signály majícími vliv na expresi v prokaryotické buňce. Je-li to vyžadováno, může kódující sekvence, na svém 5 konci, obsahovat sekvenci kódující jakoukoliv ze známých signálních sekvencí, schopnou působení na sekreci exprimovaného proteinu do periplazmatického prostoru hostitelské buňky, což usnadní sklizení tohoto proteinu a následné čištění. Nej častěji používaná prokaryota jsou různé druhy E. coli, avšak použity mohou být i jiné mikrobiální kmeny. Používají se plazmidové vektory, které obsahují replikační počátek, selektovatelný markér a řídící sekvence odvozené od druhů kompatibilních s mikrobiálním hostitelem. Příklady takovýchto vektorů jsou v Pouwels et al., (supra) nebo AusbeL et al., (supra). Běžně používané prokaryotické řídící sekvence (také nazývané „regulační oblasti“) jsou zde definovány tak, že obsahují promotor iniciace transkripce, volitelně s operátorem, společně se sekvencemi ribozomálního vazebného místa. Běžně používané promototy pro řízení exprese zahrnují beta-laktamásové (penicilinásové), laktosové (lac) (Chang et al., Nátuře 198 : 1056 (1977), tryptofanové (Trp) Goeddel et al., Nucl. acids. res. 8 : 4057 (1980) a tac promotorové systémy stejně jako od lambdy odvozený Pl promotor a ribozomální vazebné místo N-genu (Simatake et al., Nátuře 292 : 128 (1981)).

Jedním bakteriálním expresním systémem pro produkci polypeptidů chimerní synthasy je E. coli pET expresní systém (Novagen). V tomto expresním systému je DNA kódující polypeptid chimerní synthasy vložen do vektoru pET v orientaci umožňující expresi. Protože je gen • · to

chimerní synthasy pod kontrolou T7 regulačních signálů, je exprese chimerní synthasy indukována indukcí exprese T7 RNA polymerasy v hostitelské buňce. Toho je obvykle dosaženo použitím hostitelských kmenů, které exprimují T7 RNA polymerasu po indukci IPTG. Po expresi je rekombinantní polypeptid chimerní synthasy isolován standardními způsoby známými odborníkům, např. těmi zde popsanými.

Jiným bakteriálním expresním systémem pro produkci polypeptidu chimerní synthasy je pGEX expresní systém (Pharmacia). Tento systém využívá GST genový fůzní systém, který je navržen pro vysokou hladinu exprese genu nebo fragmentu genu jako fůzního proteinu s možností rychlé purifikace a získání funkčního genového produktu. Požadovaný protein chimerní synthasy je spojen s karboxyterminální částí glutathion S-transferasy ze Schistosoma japonicum a dá se snadno vyčistit z bakteriálního lyzátu pomocí afinitní chromatografie za použití Glutathion Sepharose 4B. Fůzní protein se dá oddělit za mírných podmínek promytím glutathionem. Štěpení S-transferasové domény z fůzního proteinu je usnadněno přítomností míst rozpoznávaných proteasami, které jsou pro tato místa specifické, před touto doménou. Například proteiny exprimované v plazmidech pGEX2T mohou být štěpeny trombinem; ty exprimované v pGEX-3X mohou být štěpeny faktorem Xa.

Při eukaryotické expresi závisí způsob transformace nebo transfekce a volba vektoru pro expresi polypeptidu chimerní synthasy na vybraném hostitelském systému. Transformační s transfekění metody u řady organismů, např. kvasinky Saccharomyces cerevisiae, jsou popsány např. v Ausubel et al., (supra); Weissbach a Weissbach, Methods of plant molecular biology , Academie press, 1989; Gelvin et al., Plant • · molecular biology manual, Kluwer academie publishers, 1990; Kindle

K., Proč. nati. acad. sci. USA 87 : 1228 (1990); Potrykus I., Annu. rev. plant physiol. plant mol. biology 42 : 205 (1991) a Biorad (Hercules, CA) Technical bulletin 1687 (Biolistie particle delivery systems). Expresní vektory mohou být vybrány z těch popsaných např. v Cloning Vectors : A laroratory manual (P.H. Powels e t al., 1985, dodatek 1987); Gasser a Fraley (supra); Clontech molecular biology catalog (catalog 1992/93 Tools for molecular biologist, Palo Alto, CA) a odkazech citovaných výše.

Jedním preferovaným eukaryotickým systémem je myší 3T3 fibroblastová hostitelská buňka transfekovaná expresním vektorem pMAMneo(Clontech). pMAM neo poskytuje ; RSV-LTR enhancer vázaný na MMTV-LTR promotor indukovatelný dexamethasonem, SV40 replikaění počátek, který umožňuje replikaci v savčích systémech, volitelný neomy cínový gen, SV40 sestřihová a polyadenylační místa. DNA kódující polypeptid chimerní synthasy je vložen vektoru pMAMneo v orientaci umožňující expresi. Polypeptid ehimerní synthasy je izolován jak jest popsáno níže. Jiné preferované hostitelské buňky použité ve spojení s expresním vektorem pMAMneo zahrnují COS buňky a CHO buňky (nezávisle ATCC Accession Nos. CRL 1650 a CCL 61).

Jinou možností je produkce polypeptidů chimerní synthasy stabilně transfekovanou savčí buněčnou linií. Řada vektorů vhodných pro transfekci savčích buněk je pro veřejnost dosažitelné, např. viz Pouwels et al., (supra), způsoby přípravy takovýchto buněčný linií jsou také veřejně dosažitelné, např. v Ausubel et al., (supra). V jednom příkladu je cDNA kódující polypeptid chimerní synthasy vložena do expresního vektoru, který zahrnuje gen pro ·· ·9 » ·· *· ·· • φφ φ ··« ♦ φ · · · φ · · 9 9 9 9 99 ryc φ i φ » φ · · ··· φ ·

Χ3 ··· ·· φφφ «φ ΦΦΦΦ 999 9999 99 99 dihydrofolatreduktasu (DHFR). Buňky, ve kterých je plazmid, a tím i gen kódující chimerní synthasu, integrován do chromozomu, jsou vyselektovány přidáním 0,01-300 mikroM methotrxatu do media (jak jest popsáno v Ausubel et al., supra). Tato selekce může být provedena u většiny typů buňek. Exprese rekombinantího proteinu může být zvýšena pomocí DHFR-řízené amplifikace transfekovaného genu. Způsoby selekce buněčných linií nesoucích amplifikavané geny jsou popsány v Ausubel et al., (supra), takové metody obvykle využívají kultury v mediu, které obsahuje postupně rostoucí množství methotrexatu. Expresní vektory obsahující DHFR, které jsou běžně používány pro tento účel, zahrnují pCVSEII-DHrF a pAdD26SV(A) (popsané v Ausubel et al., (supra). Mezi hostitelskými buňkami, preferovanými pro DHFR selekci stabilně transfekovaných buněčných linií nebo DHFR-řízenou genovou amplifikaci jsou kterékoliv hostitelské buňky popsané výše, nebo přednostně DHFR-deficientní CHO buněčné linie (např. CHO DHFR' buňky, ATCG accesion No. CRL 9096).

Polypeptid chimerní synthasy je přednostně tvořen stabilně transfekovanými rostlinnými buněčnými liniemi nebo transgenními rostlinami. Řada vektorů, vhodných pro stabilní transfekci rostlinných buňek nebo pro tvorbu transgenníeh rostlin je veřejně dosažitelná; takové vektory jsou popsány např. v Pouwels et al., (supra), Weissbach a Weissbach (supra) a Gelvin et al., (supra). Metody přípravy takovýchto buněčných linií jsou popsány např. v Weissbach a Weissbach (supra) a Gelvin et al., (supra). Obvykle obsahují rostlilnné expresní vektory (1) klonovaný gen pro chimerní synthasu pod transkripční kontrolou 5 a 3 regulačních sekvencí a (2) hlavní selektovatelný markér. Takovéto rostlilnné expresní vektory mohou také obsahovat, je-li to vyžadováno, promotorovou regulační oblast (např. zodpovědnou za indukovatelnou nebo konstitutivní expresi, nebo okolím nebo vývojově regulovanou, nebo pathogenem nebo zraněním indukovatelnou, nebo buněčně nebo tkáňově specifickou expresi), místo iniciace transkripce, ribozomální vazebné místo, místo terminace transkripce a/nebo polyadenylaění signál. DNA sekvence chimerní synthasy tohoto vynálezu může být, je-li to požadováno, kombinována s jinými DNA sekvencemi řadou způsobů. DNA sekvence chimerní synthasy tohoto vynálezu může být použita s celým nebo částí sekvence genu normálně spojeného se synthasovým proteinem. Ze svých součástí je DNA sekvence, kódující chimerní synthasu, spojená v DNA konstrukt, který má reguleční oblast iniciaci transkripce schopnou řídit transkripci a translaci v hostitelské buňce. Obecně budou takové konstrukty obsahovat regulační oblasti funkční v rostlinách, které, jak je zde uvedeno, obstarávají produkci ehimerního synthasového proteinu. Otevřený čtecí rámec, kódující chimerní synthasový protein nebo jeho funkční část bude spojen s 5 koncem regulační oblasti iniciaci transkripce, jako např. sekvencí, přirozeně se objevující v oblasti 5 upstream synthasového strukturního genu. Je možno použít řadu jiných regulačních oblastí iniciaci transkripce, které obstarají konstitutivní nebo indukovatelnou regulaci.

Pro použití, kde je požadována vývojově, buněčně, tkáňově, okolím nebo pathogenem indukovatelná exprese, se vhodné 5 upstream nekódující oblasti dají získat z jiných genů, např. genů regulovaných během vývoje semen, vývoje embrya, listu nebo v odezvě na přítomnost pathogena.

DNA konstrukty tohoto vynálezu mohou také obsahovat regulační oblasti terminace transkripce. Oblasti terminace transkripce mohou být poskytnuty DNA sekvencí kódující synthasový protein nebo to mohou být vhodné oblasti terminace transkripce odvozené z jiných genových zdrojů. Oblast terminace transkripce bude obsahovat přednostně alespoň 1-3 kb sekvence 3 strukturního genu, ze kterého je terminační oblast odvozena.

Takto geneticky upravené rostliny mají řadu použití v průmyslu a zemědělství jak jest uvedeno níže. Důležité je, že se tento vynález je aplikovatelný na krytosemenné a nahosemenné rostliny a snadno se zde dají využít jakékoliv nové nebo vylepšené transformační a regenerační metody.

Příkladem užitečného rostlinného promotoru podle vynálezu je promotor kaulimoviru, např. promotor viru mozaiky květáku (CaMV). Tyto promotory způsobují vysoký úroveň exprese ve většině rostlinných pletiv a jejich aktivita nazávisí na virem kódovaných proteinech. CaMV je zdrojem jak 35S tak i 19S promotoru. Ve většině pletiv transgenních rostlin je CaMV 35S promotor silným promotorem (viz např. Oděli et al., Nátuře 313 : 810 (1985). CaMV promotor je také vysoce aktivní v jednoděložných rostlinách (viz např. Dekeyser et al., Plant cell 2 ; 591 (1990); Terada a Shimamoto, Mol. gen. genet. 220 : 389, (1990)). Navíc může být aktivita tohoto promotoru dále zvýšena (např. 2-10 krát) jeho duplikací (viz např. Kay et al., Science 236 : 1299 (1987); Ow et al., Proč. natí. acad. sci. USA 84 : 4870 (1987) a Fang et al., Plant cell : 141 (1989)).

Jiné užitečné rostlinné promotory zahrnují nopalinsynthasový promotor (An et al., Pian physiol. 88 457 (1988) a oktopinsynthasový promotor (Fromm et al., Plant cell 1 : 977 (1989)). Tento výčet není omezující.

·· ·· ·· ♦ · · « · · • · · ·· • · ···· to • · to · • •«to ·< ··

Pro jistá použití může být požadována tvorba produktu genu chimerní synthasy ve příslušných pletivech, v příslušném množství nebo příslušném období vývoje. Pro tento účel existuje řada genových promotorů, z nichž každý má své vlastní charakteristiky regulačních sekvencí, které jsou regulovány v závislosti na vlivu okolí, hormonů a/nebo vývoje. Jsou zde zahrnuty genové promotory, zodpovědné za teplem regulovanou genovou expresi (viz např. Callis et al., Plant physiol. 88 : 965 (1988); Takahashi s Komeda, Mol. gen. genet. 219 : 365 (1989); a Takahashi et al., Plant j. 2 : 751 (1992)), světlem regulovanou genovou expresi (např. rbcS-3A z hrachu popsaný v Kuhlemeier et al., Plant cell 1 : 471 (1989); rbcS promotor z kukuřice popsaný v Schaffner a Sheen, Plant cell 3 : 997, (1991) nebo gen pro chlorofil a/b vázající protein, nalezený u hrachu, popsaný v Simpson et al., EMBO j. 4 : 2723 (1985)), hormonem regulovanou genovou expresi (např. ke kyselině abscisové (ABA) citlivá sekvence Em genu pšenice, popsaná v Marcotte et al., Plant cell 1 : 969 (1989); ABA indukovatelné HVA 1, HVA22 a rd29A promotory popsané u ječmene a Arabidopsis v Straub et al., Plant cell 6 : 617 (1994), Shen et al., Plant cell 7 : 295 (1994)) a zraněním indukovanou genovou expresi (např. wunl popsaný v Siebertz et al., Plant cell 1 . 961 (1989) nebo orgánově specifickou genovou expresi (např. gen pro protein hlízově specifického uskladňování popsaný v Roshal et al., EMBO j. 6 : 1155 (1987); gen pro 23-kDa zein z kukuřice popsaný v Schernthaner et al., EMBO j. 7 ; 1249 (1988); nebo gen pro beta-faseolin z fasolu obecného popsaný v Buston et al., Plant cell 1 : 839 (1989)) a pathogenem indukovatelnou expresi popsanou v Chappelí et al., U.S. Ser Nos 08/471 983, 08/443639 a 08/577483, zde zahrnuty jako odkazy.

Vektory pro expresi v rostlinách mohou také volitelně obsahovat signály pro úpravu RNA, např. introny, které se ukázaly být důležitými pro účinnou synthesu a ukládání RNA (Callis et al., Gnens and dev. 1 :

1183 (1987)). Umístění sestřihových sekvencí může dramaticky ovlivnit hladinu exprese transgenu v rostlinách. Vzhledem k tomu může být v transgenu intron umístěn před nebo za sekvencí kódující polypeptid chimerní synthasy za účelem upravovaní hladinu genové exprese.

Navíc mohou vedle již zmíněných 5 regulačních sekvencí expresní vektory obsahovat také regulační úseky, které jsou obvykle ve 3 oblasti rostlinných genů (Thornburg et al., Proč. nati. acad. sci. USA 84 : 744 (1987); An et al., Plant cell 1:115 (1989)). Například pro zvýšení stability mRNA může expresní vektor obsahovat 3 terminátorovou oblast. Jedna taková terminátorová oblast může být odvozena od PI-II terminátorové oblasti z bramboru. Navíc, jiné běžně používané terminátory jsou odvozené od oktopin- nebo nopalinsynthasových signálů.

Vektory pro expresi v rostlinách také obvykle obsahují geny pro hlavní selektovatelný markér, které se používají pro identifikaci těch buněk, které byly trasnformovány. Užitečné selektovatelné geny v rostlinných systémech zahrnují geny kódující rezistenci k antibiotikům, např. ty kódující rezistenci k hygromycinu, kanamycinu, bleomycinu, G418, streptomycinu nebo spectinomycinu. Geny pro fotosyntézu nohou být také použity jako selektovatelné markéry u druhů, které nejsou schopny fotosyntézy. Jinou možností je použití zeleně fluoreskujícího proteinu z medúzy Aequorea victoria jako selektovatelného markéru (Sheen et al., Plant j. 8 : 777, 1995; Chiu et al., Current biology 6 : 325 (1996)). Nakonec, jako selektovatelné makery se dají použít také geny kódující rezistenci k herbicidům; užitečné geny kódující rezistenci k herbicidům zahrnují bar gen kódující enzym fosfinotricinacetyltransferasu a poskytuje rezistenci širokospektrému herbicidu Basta^R (Hoechst AG, Frankfurt, Německo).

Účinné použití selektovatelných markérů je usnadněno určením citlivosti rostlinné buňky k selektovatelné látce a určení koncentrace této látky, která účinně usmrtí většinu, ne-li všechny, transformovaných buněk. Některé užitečné koncentrace antibiotik pro transformaci tabáku zahrnují např. 75-100 mikro g /ml (kanamycin), 20-50 mikro g /ml (hygromycin) nebo 5-10 mikro g /ml (bleomycin). Užitečná strategie pro selekci transformantů na rezistenci k herbicidům je popsána např. Vasilem et al., supra.

Pro odborníka v oboru molekulární biologie, zejména molekulární biologie rostlin, je zřejmé, že hladina genové exprese nezávisí pouze na kombinaci promotorů, signálů pro úpravu RNA a terminátorových oblastí, ale také na tom, jak jsou tyto úseky použity pro zvýšení exprese genu pro selektovatelný markér.

Transformace rostliny

Při přípravě vektoru pro expresi v rostlinách existuje několik standardních metod zavedení vektoru do hostitelské buňky, čímž vznikne transgenní rostlina. Tyto metody zahrnují (1) Agrobakteriem zprostředkovanou transformaci (A. tumefaciens, A. rhizogenes) (viz např. Lichtenstein a Fuiler v Genetic engineering, svazek 6, PWJ Rigby, ed., London, Academie press, 1987) a Lichtenstein C.P. a Draper J., v DNA cloning, svazek II, D.M. Glover, ed., Oxford, IRI press, 1985)), (2) partikulový vektorový systém (viz např. GordonKamm et al., Plant cell 2 ; 603 (1990); nebo BioRad technical bulletin 1687, supra), (3) mikroinjekční postupy (viz např. Green et al., supra),

99

9 9 9

9 99

9 9 9

9 9

99 • · · · • · · · • · ·

9 9

9 9 [

9999 (4) polyethylenglykolové (PEG) postupy (viz např. Draper et al., Plant cell physiol. 23 : 451 (1982); nebo např. Zhang a Wu, Theor. appl. genet. 76 : 835 (1988)), (5) lipozómem zprostředkované přijetí DNA (viz např. Freeman et al., Plant cell physiol. 25 : 1353 (1984)), (6) elektroporační postupy (viz např. Gelvin et al., supra; Dekeyser et al., supra; Fromm et al., Nátuře 319 : 791 (1986); Sheen, Plant cell 2 ; 1027 (1990) nebo Jang a Sheen, Plant cell 6 : 1665 (1994)) a (7) třepací metodu (viz např. Kindle supra). Způsob transformace není kritickým bodem předkládaného vynálezu. Může být použit jakýkoliv způsob, kterým je dosaženo účinné transformace. Když budou dosažitelné novější metody transformace obilí nebo jiných hostitelských buněk, mohou být přímo použity.

Následující příklad nastiňuje jednu takovou techniku, Agrobakteriem zprostředkovanou transformaci rostliny. Při použití této techniky, je manipulace s geny, které mají být přeneseny do genomu rostliny, provedena ve dvou fázích. Za prvé je provedeno klonování a modifikace DNA v E. coli a plazmid obsahující náš gen je přenesen konjugací nebo elektroporací do Agrobakteria. Za druhé je výsledný kmen Agrobakteria použit pro transformaci hostitelské rostlinné buňky. Plazmid, obecně vektor pro expresi v rostlinách, obsahuje počátek replikace, umožňující replikaci v Abrobacteriu a vysokopiový počátek replikace, funkční v E. coli. To umožňuje jednoduchu produkci a testování v E. coli před přenesením do Agrobacteria, pro následné zavedení do rostliny. Vektorem mohou být neseny geny pro rezistenci, jeden pro selekci v bakteriích, např. streptomycin, a druhý, který funguje v rostlinách, např. gen kódující rezistenci ke kanamycinu nebo herbicidům. Vektor nese také místa pro resrikční endonukleasy, pro vložení jednoho nebo více transgenů, a přímé koncové repetice

4 4 4 * ·· ·· ··

444 4 »44 4 4 44 · • 44 · · · · ♦·

V) 4444··· ···· ♦

444 44 444 • t 4444 444 4444 44 44

T-DNA, které, když jsou rozeznány transferovými funkcemi Agrobakteria, vymezí oblast DNA, která bude přenesena do rostliny. Jiným příkladem může být transformace rostlinné buňky vstřelením wolframového mikroprojektilu, na kterém je vysrážena klonovaná DNA, do buňky. V Biolistic Appartus (Bio-Rad), použitém pro vstřelení, byla pro průlet plastikového makroprojektilu hlavní použita, náplň prachu (22 caliber Power Piston Tool Charge) nebo vháněný vzduch. Na přední stranu plastikového makroprojektilu bylo umístěn alikvotní množství suspense wolframových částic, na kterých se vysrážela DNA. Takto upravený makroprojektil je vstřelen do akrilieké brzdící vrstvy v níž je otvor, který je příliš malý pro to, aby jím mohl makroprojektil proletět. Výsledkem je, že se plastikový makroprojektil rozbije o brzdící vrstvu a wolframové mikroprojektily pokračují skrze otvor ve vrstvě ke svému cíli. Pro předkládaný vynález, může tímto cílem být rostlinná buňka, semeno nebo embryo. DNA, zavedené na mikroprojektilech do buňky se integruje do jádra nebo do chloroplastu. Obecně, přenos a exprese transgenu v rostlinné buňce jsou dnes pro odborníky v oboru rutinní záležitostí a staly se hlavním nástrojem studií genové exprese a tvorby vylepšených rostlinných odrůd zemědělského nebo komerčního zájmu.

Regenerace transgenní rostliny

Rostlinné buňky transformované vektorem pro expresi v rostlinách se mohou regenerovat např. ze samotných buňek, kalusových tkání nebo listových terčů podle standardních technik rosltinnýeh tkáňových kultur. Odborníkům je známo, že různé buněčné tkáně a orgány z téměř všech rostlin mohou být úspěšně pěstovány, za účelem regenerace celé rostliny; takovéto techniky jsou popsány např. v Vasil, supra; Green et al., supra; Weissbach, supra a Gelvin et al., supra.

V jednom příkladu je klonovaný polypeptid chimerní synthasy, který je pod kontrolou EAS4 promotoru a terminátoru nopalinsynthasy a který nese selektovatelný markér (např. rezistenci ke kanamycinu) transformován do Agrobakteria. Je provedena transformace listových terčů (např. listových terčů tabáku) Agrobakteriem obsahujícím tento vektor, způsobem popsaným Horschem et al., (Science 227 : 1229 (1985)). .transformanty jsou selektovány po několika týdnech (např. 35 týdnech) na mediu rostlinné tkáňové kultury obsahujícím kanamycin (např. 100 mikro g/ml). Kanamycin-rezistentní transformanty se poté umístí na medium rostlinné tkáňové kultury bez hormonů pro růst kořene. Kanamycin-rezistentní rostliny jsou dále selektovány na skleníkový růst. Je-li to požadováno, semena samooplozené transgenní rostliny mohou být poté vysazena na bezpůdní medium a nechají se růst ve skleníku. Kanamycin-rezistentní potomstvo je selektováno vysetím povrchově sterilizovaných semen na kanamycin obsahující medium bez hormonů. Analysa integrace transgenu je provedena standadními technikami (viz např. Ausubel et al., supra; Gelvin et al., supra).

Transgenní rostliny exprimující selektovatelný markér jsou dále vybírány, podle toho zda došlo k přenosu transgenní DNA, sdandardními immunoblotovými a DNA detekčními technikami. Každá pozitivní transgenní rostlina a její transgenní potomstvo je unikátní ve srovnání s jinými transgenními rostlinami obsahujícími stejný transgen. Integrace transgenní DNA do genomové DNA rostliny je ve většině případů náhodná a místo integrace může silně ovlivnit stupeň a tkáňový a vývojový profil exprese transgenu. V důsledku toho je z řady transgenních linií vybírána pro každý transgen rostlina s nejvhodnějším profilem exprese.

··· ·· · · · · • φ ···· ··> ···· ·· ··

Obecně je u transgenních linií měřena hladině exprese. Nejdříve je pro identifikaci a určení množství rostlin schopných exprese použito měření exprese na úrovni RNA. Používají se standardní techniky pro analysu RNA. Ty zahrnují PCR amplifikaci, používající oligonukleotidové primery navržené tak, aby byla amplifikována pouze transgenní RNA, a hybridizaci v roztoku, používající transgenspecifické sondy (viz např. Ausubel et al., supra). U RNA-pozitivních rostlin je dále Western immunoblotovou analysou, používající specifické protilátky proti chimerní synthase (viz. např. Ausubel et al., supra), testována exprese proteinu. Navíc, pro zjištění místa exprese v transgenní tkáni můžou být provedeny hybridizace in šitu a imuocytotochemické metody podle standardních protokolů za použití transgen-specifických nukleotidových sond a protilátek.

Chimerní synthasa exprimovaná v jakékoliv buňce nebo transgenní rostlině (např. jak jest popsáno výše) může být izolována např. za použití afinitní chromatografie. Jedním příkladem je použití, na koloně vázané protilátky proti chimerní synthase (např. připravené způsobem popsaný v Ausubel et al., supra) pro izolaci tohoto polypeptidů. Lyže a fragmentace buňky produkující chimerní synthasu před afinitní chromatografií může být provedena standardními metodami (viz. Ausubel et al., supra). Izolovaný protein může být, je-li to požadováno, dále purifikován např. pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (viz. např. Fisher, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, ed., Work a Burdon, Elsevier, 1980).

Tyto obecné techniky exprese a purifikace polypeptidů mohou být také použity pro produkci a izolaci užitečných analogů nebo fragmentů chimerních synthas.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je schématická ilustrace ukazující biosynthetickou dráhu isoprenoidů s ohledem na druh koncových produktů a jejich fysiologickou funkci. Přerušované šipky označují vícenásobné kroky nebo reakce.

Obr. 2 je schématická ilustrace ukazující různé reakce, které jsou katalyzovány prenyltransferasami a terpensynthasami.

Obr. 3 je schématická ilustrace ukazující reakční mechanismus synthesy eremofilanu (tabáková 5-epi-aristolochensynthasa, TEAS) a vetispiradienu {Hyoscyamus vetispiradiensynthasa, HVS) za účasti seskviterpensynthas. Dílčí reakce 1 a 2 jsou povážovány za běžné u obou typů synthas. Rozdíly v mechanismu dílčích reakcí 3a a 3b jsou dostatečné, jak jest ukázáno, pro tvorbu různých reakčních produktů. Obr.4A je schématická ilustrace ukazující ehimerní konstrukty, použité pro mapování katalytických domén v rámci seskviterpensynthas. Jsou zde znázorněna schémata složení seskviterpensynthasových genů divokého typu (např. TEAS a HVS) a ehimerní ch seskviterpensynthasových genů (CH1-CH14), které byly připraveny v bakteriálním expresním vektoru pGBT-T19. Genové konstrukty byly připraveny za použití kombinace zde přítomných míst pro restrikční endonukleasy a amplifikace vybraných úseků pomocí PCR a PCR primerů poskytujících běžná místa pro restrikční endonukleasy. Posice aminokyselin odpovídající jedinečným místům pro restrikční endonukleasy a jsou vyznačeny.

Obr. 4B je fotografie TLC ukazující synthasové aktivity v sonikovaných lyzátech buňek E. coli TB1 exprimujících TEAS, HVS a ehimerní synthasové konstrukty (CH1-CH14), měřené pomocí ³H-FPP.

·· · · · ♦ · ·· • · · · · · · ··· · · ··· ·· · · · ·· ···· ··· ···· ·* ··

Reakčni produkty byly odděleny pomocí agentation-TLC a byly detekovány autoradiograficky. Radioaktivita v 0,5 mm segmentech každé dráhy agentation-TLC vrstvy byla určena ve scintilaČním počítači a redioaktivita v drahách TEAS a HVS specifických produktů byla označena jako 100 %.

Obr. 5 je schématická ilustrace ukazující odpovídající si exony a funkční domény v rámci isoprenoidsynthas. Vrchní diagram představuje organizaci exonů v rámci TEAS genu, která je téměř identická s organizaci HVS a kasbensynthasových genů. Spodní diagram ukazuje uspořádání funkčních domén v TEAS a HVS genech. Čísla exonů jsou uvedena u horního diagramu a všechna ostatní čísla se týkají posicí aminokyselin, z nichž některé odpovídají zmíněným místům pro restrikční endonukleasy.

Obr. 6 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu klidové synthasy (QH1). Přenesením inaktivní HVS domény odpovídající exonu 4 do CH3 má za následek vznik synthasy, která má změněnou enzymovou aktivitu.

Obr. 7 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu chimerní klidové- kasbensynthasy, a možné reakčni produkty.

Obr.8 je schématická ilustrace ukazující postup přenosu domén, který byl použit pro tvorbu chimerní klidové- kadinensynthasy, a možné reakčni produkty

Příklady použití vynálezu

Příklad 1

Zde popsaný vynález je užitečný pro řadu zemědělských, farmaceutických, průmyslových a komerčních účelů. Například tyto i

způsoby, DNA konstrukty, proteiny a transgenní organismy, zahrnujíce bakterie, kvasinky a rostliny zde popsané, jsou užitečné pro zlepšení synthesy, zpracování a výroby isoprenoidů.

Naše výsledky, prezentované výše, ukázaly, že vytvořením chimerní isoprenoidsynthasy je možné upravovat isoprenoidsynthasovou aktivitu. Tímto způsobem mohou být různé synthasové reakční produkty modifikovány, řízeny nebo manipulovány a výsledkem je zvýšení produkce řady synthasových reakčních produktů, např. produkce nových monoterpenů, diterpenů a seskviterpenů. Takovéto sloučeniny jsou užitečné jako fytoalexiny, insekticidy, parfémy a farmaceutika, jako např. antibakteriální a fungicidní látky.

Může být vytvořena řada chimerních isoprenoid synthas, které jsou užitečné např. pro výrobu sloučenin, které mají fungicidní, antibakteriální, antimalariové a protinádorové schopnosti. Např. pro výrobu chimerní synthasy, schopné katalyzovat vznik fungicidních isoprenoidů, je spojena C-terminální doména kasbensynthasy (Mau a West, Proč. nati. acad. sci. 91 ; 8497, 1994) s N-terminální doménou TEAS, HVS nebo CH9. Pro výrobu chimerní synthasy, schopné katalyzovat vznik antibakteriálních sloučenin, je spojena C-terminální doména cyklofarnesenonsynthasy (Habtermarian et al., J. natí. prod. 56 : 140, 1993) s N-terminální doménou TEAS, HVS nebo CH9. Produkce, antimalriových sloučenin, je dosaženo použitím chimerní synthasy, která má C-terminální doménu z artemisiansynthasy (ElFarley et al., J. nati. prod. 52 : 196, 1989) a N-terminální doménou z

TEAS, HVS nebo CH9. Synthasy schopné produkce protinádorové sloučeniny jsou vytvořeny spojením C-terminální domény z taxadiensynthasy (Koapp et al., J. biol. chem. 270 ; 8686, 1995) nebo z helenalinsynthasy (Lee et al., Science 196 : 533, 1977) s N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9.

Tento vynález je také užitečný pro výrobu chimerních synthas, které jsou schopné katalyzovat vznik insekticidů. Takové chimerních synthasy jsou vytvořeny spojením C-terminální domény z kadinensynthasy (Chen et al., Arch biochem. biophys. 324 : 255, 1995) s N-terminální doménou z TEAS, HVS nebo CH9.

Konečně, chimerních synthasy jsou také užitečné pro tvorbu nových příchutí a parfémů. Jedním příkladem je, pro výrobu nových příchutí a aroma, vytvoření chimerních synthasy spojením C-terminální domény z limonensynthasy (Colby et al., J. biol. chem. 268 : 23016, 1993) s N-terminální doménou z TEAS,„HVS nebo CH9.....

Všechny zde zmíněné publikace a patenty jsou zde zahrnuty odkazem ve stejném rozsahu jako kdyby každá jednotlivá publikace nebo patent byly samostatně označeny jako zde zahrnuté odkazem.

Jiná provedení

Z předcházejícího popisu může odborník v oboru lehce zjistit esenciální vlastnosti tohoto vynálezu a může vytvořit řadu změn a modifikací tohoto vynálezu pro jeho přizpůsobení různému použití a podmínkám. Jiná provedení jsou tedy také součástí nároků.

• · · · · ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) ŽADATEL : Kuratorium University of Kentueky (ii) NÁZEV VYNÁLEZU : CHIMERNÍ ISOPRENOIDSYNTHASY A ZPŮSOB JEJICH PŘÍPRAVY (iii) POČET SEKVENCÍ : 6 (iv) ADRESA (A) ADRESÁT : Clark and Elbin LLP (B) ULICE : Federal Street 176 (C) MĚSTO : Boston (D) STÁT : USA (F) KÓD : 02110-2214 (v) POČÍTAČEM ZPRACOVATELNÁ FORMA (A) MEDIUM : Disketa (B) POČÍTAČ : kompatibilní s IBM (C) OPERAČNÍ SYSTÉM : DOS (D) SOFTWARE : FastSEQ verze 2.0 • · • · · • · · ·· ··· (vi) SOUČASNÁ DATA PŘIHLÁŠKY (A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY :

(B) DATUM VYPLNĚNÍ :

(C) KLASIFIKACE :

(vii) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY :

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY : 08/631 341 (B) DATUM VYPLNĚNÍ : 12.4. 96 (viii) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/AGENTOVI :

(A) JMÉNO: Paul T. Clark (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO : 30 162 (C) ČÍSLO OSVĚDČENÍ : 07678/011001 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE :

(A) TELEFON : 617-428-0200 (B) TELEFAX : 617-428-7045 (C) TELEX :

(2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 1 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : DNA (oligonukleotid) • ·

(xi) POPIS SEKVENCE ; SEK. I. C. : 1

GGGATCGATGACATAGCCACGTATGAGGTT (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE ;

(A) DÉLKA : 17 párů baží (B) TYP ; nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE ; SEK. I. Č. ; 2

AATACGACTCACTATAG (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 3 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE ;

(A) DÉLKA ; 27 párů baží (B) TYP ; nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : DNA (oligonukleotid) • · (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 3

CGAGTCAACATGGTTTATTGAGGGATA (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 4 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 28 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 4

TATTCTAGATCTCTATGACGATTATGAA (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 5 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 42 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE ; SEK. I. Č. : 5

GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGTTGCAAACTAT (2) INFORMACE O SEK. I.Č. ; 6 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY ; DNA (oligonukleotid) (xi) POPIS SEKVENCE ; SEK. I. Č. : 6

GGGATCGATAACTCTGCATAATGTAGCATT »· toto toto

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • to to «

   1. Polypeptid chimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje první doménu z první isoprenoidsynthasy spojenou s druhou doménou ze druhé heterologní isoprenoidsynthasy, čímž je chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které nejsou produkovány v nepřítomnosti druhé domény ze zmíněné druhé, heterologní isoprenoidsynthasy.
2. 2. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde je zmíněná chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci alespoň dvou různých isoprenoidových reakčních produktů.
3. 3. Chimerní isoprenoidsynthasa^ podle nároku 1, kde zmíněná druhá doména ze druhé, heterologní isoprenoidsynthasy také určuje poměr isoprenoidových reakčních produktů zmíněné chimerní isoprenoidsynthasy.
4. 4. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde zmíněná první doména ze zmíněné první isoprenoidsynthasy je rostlinná isoprenoidsynthasa a druhá doména ze zmíněné druhé heterologní isoprenoidsynthasy je z rostlinné isoprenoidsynthasy.
5. 5. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde zmíněná chimerní isoprenoidsynthasa je vybrána ze skupiny složené z (a) tabák Hyoscyamus CH4 chimerní isoprenoidsynthasy; (b) tabÁk-Hyoscyamus CH10 chimerní isoprenoidsynthasy; (c) tabák-Hyoscyamus CH11 chimerní isoprenoidsynthasy; (d) tabák-Hyoscyamus CH12 chimerní isoprenoidsynthasy; (e) tabák-Hyoscyamus CH13 chimerní isoprenoidsynthasy nebo (f) tato&k-Hyoscyamus CH14 chimerní isoprenoidsynthasy.
6. 6. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde tato isoprenoidsynthasa katalyzuje produkci fungicidní látky.
7. 7. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde tato isoprenoidsynthasa katalyzuje produkci antibakteriální látky.
8. 8. Chimerní isoprenoidsynthasa podle nároku 1, kde tato isoprenoidsynthasa katalyzuje produkci protinádorové látky.
9. 9. DNA kódující polypeptid chimerní isoprenoidsynthasu podle nároku 1.
10. 10. Vektor obsahující DNA podle nároku 9.
11. 11. Buňka obsahující DNA podle nároku 9.
12. 12. Buňka podle nároku 11, kde touto buňkou je E. coli.
13. 13. Polypeptid chimerní isoprenoidsynthasy, který obsahuje asymetricky umístěnou homologní doménu, ěimž je chimerní isoprenoidsynthasa schopná katalyzovat produkci isoprenoidových reakčních produktů, které nejsou produkovány, když je tato doména umístěna ve své přirozeně se objevující posici ve zmíněném polypeptidu isoprenoidsynthasy.
14. 14. Způsob přípravy polypeptidu ehimerní isoprenoidsynthasy vyznačující se tím, že je (i) poskytnuta buňka transformovaná DNA podle nároku 9 umístěnou pro expresi v této buňce, (ii) pěstování této transformované buňky za podmínek vhodných pro expresi zmíněné DNA a (iii) získání zmíněné chimerní isoprenoidsynthasy.