DK2828399T3 - System til detektering af polymerasekædereaktion under anvendelse af oligonukleotider omfattende en phosphorothioatgruppe - Google Patents

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til detektering af et primerforlængelsesprodukt fremstillet i nærvær af en polymerase uden 3'—>5' exonuklease-aktivitet, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: a) at tilvejebringe mindst to enkelt-mærkede oligonukleotidsekvenser, der hybridiserer til hinanden i fri opløsning til dannelse af et fluorescerende slukket par, der ved indføring af en komplementær sekvens til en eller begge sekvenser genererer et målbart signal, når den komplementære sekvens hybri-diseres til en af de mindst to enkelt-mærkede oligonukleotidsekvenser, hvor mindst en af oligonukleotidsekvenserne indeholder mindst en phosphorothio-atgruppe; b) at tilvejebringe mindst en primer og initiere primerforlængelsesreaktionen fra den mindst ene primer under anvendelse af en polymerase uden 3' to 5' exonuklease-aktivitet, hvorved der genereres en komplementær sekvens til mindst en af de enkelt-mærkede oligonukleotisekvenser; og c) at måle det detekterbare signal, der genereres, når den komplementære sekvens hybridiseres til en af de mindst to enkelt-mærkede oligonukleotidsekvenser.

2. Kit til detektering af et primerforlængelsesprodukt fremstillet i nærvær af en polymerase uden 3'—>5' exonuklease-aktivitet, der omfatter 1) mindst to enkelt-mærkede oligonukleotidsekvenser, der hybridiserer til hinanden i fri opløsning til dannelse af et fluorescerende slukket par, der ved indføring af en komplementær sekvens til en eller begge sekvenser genererer et målbart signal, når den komplementære sekvens hybridiseres til en af de to enkelt-mærkede oligonukleotidsekvenser; og 2) en polymerase uden 3' til 5' exonuklease-aktivitet; hvor mindst en af oligonukleotidsekvenserne indeholder mindst en phospho-rothioatgruppe, hvor mindst en af de interne baser af den mindst ene oligo-nukleotidsekvens indeholder en phosphorothioatgruppe, og hvor den mindst ene oligonukleotidsekvens, der indeholder mindst en phosphorothioatgruppe, har 20-80 %, eventuelt 30-70 %, af baserne, der er modificeret af en phosphorothioatgruppe; og eventuelt hvor de modificerede baser er separeret af mindst en umodificeret base, og/eller hvor alternerende baser er phosphorothioater.

3. Fremgangsmåde eller kit ifølge krav 1 eller 2, hvor den første og anden oligonukleotidsekvens har forskellig Tm (smeltetemperatur), eventuelt a) hvor en af den første og anden oligonukleotidsekvens har en Tm, der er ved eller under primerforlængelsesreaktionens Ta (annealing-temperatur), eller b) hvor en af den første og anden oligonukleotidsekvens har en Tm, der er over primerforlængelsesreaktionens Ta.

4. Fremgangsmåde til detektering af et primerforlængelsesprodukt fremstillet i nærvær af en polymerase uden 3'—>5' exonuklease-aktivitet under anvendelse af PCR, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: a) at tilvejebringe en første enkelt-mærket oligonukleotidsekvens og mindst en anden enkelt-mærket oligonukleotidsekvens, hvilken første og anden oligonukleotidsekvens har forskellig Tm, hvori den første og anden oligonukleotidsekvens hybridiserer til hinanden i fri opløsning til dannelse af et fluorescerende slukket par og mindst en primer, idet en af den første og anden oligonukleotidsekvens har en Tm, der er ved eller under PCR-processens Ta, hvor mindst en af oligonukleotidsekvenserne indeholder mindst en phospho-rothioatgruppe, den mindst ene primer omfatter mindst en umærket primer med hale, hvilken umærket primer med hale har en haleregion, hvilken haleregion omfatter en oligonukleotidsekvens, der er komplementær til en oligonukleotidsekvens af den anden enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens, hvilken første enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens er en primer, hvorfra DNA-syntese initieres, så snart en komplementær sekvens til den første enkeltmærkede oligonukleotidsekvens er blevet genereret under PCR-processen, således at den anden enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens ikke længere kan hybridisere til den første enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens, hvorved et målbart signal genereres; b) at initiere primerforlængelsesreaktionen fra den mindst ene primer under anvendelse af en polymerase uden 3' to 5' exonuklease-aktivitet, hvorved der genereres en komplementær sekvens til den første enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens; og c) at måle det detekterbare signal, der genereres, når den komplementære sekvens hybridiseres til den første enkelt-mærkede oligonukleotidsekvens.

5. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor et af de enkelt-mærkede oligonukleotider er mere end 10 baser kortere end det andet.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 og 3, hvor PCR-processen overvåges i realtid ved hver cyklus eller efter et antal cyklusser, hvor reaktionen ellers ikke har genereret nok produkt til at frembringe et målbart signal, ved at sænke temperaturen af reaktionen for at muliggøre, at hy-bridisering finder sted.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 6, hvor det andet af de enkelt-mærkede oligonukleotider har en Tm, der er over Ta'en.

8. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, hvor det ene af de enkelt-mærkede oligonukleotider har quencher-mærket for det fluorescerende slukkede par.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 3 til 8, hvor mindst en af de interne baser af phosphorothioatgruppen indeholdende olig-onukleotid(er) er en phosphorothioat, og/eller hvor 20-80 %, eventuelt 30-70 %, af baserne af phosphorothioatgruppen indeholdende oligonukleotid(er) er phosphorothioater.

10. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, til anvendelse i allelspecifik PCR-baseret SNP-genotypebestemmelse.

11. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, til overvågning af fremstilling af et amplikon via 5' nuklease-assayet, hvor 5' nuklease-assayet anvendes til at udføre alleldiskrimineringsreaktio-ner.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 3 til 11, hvor primerforlængelsesproduktet overvåges gennem anvendelse af kun hybridi-sering, eventuelt hvor primerforlængelsesproduktet overvåges gennem an- vendelse af kun hybridisering efter PCR.

13. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 12, hvor de fluorescerende quench-oligo-par er fra 6 bp til 100 bp, eventuelt er fra 6 bp til 100 bp, men ikke er afstemt med hensyn til længde.

14. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor mindst en af baserne af et fluorphor-mærket oligonukleotid indeholder mindst en phosphorothioatgruppe.

15. Fremgangsmåde eller kit ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor de fluorescerende quench-oligo-par er: a) mærkede, et af parret med et fluorphor og det andet med et ikke-fluorescerende quenching-molekyle; og/eller b) modificeret til at være resistent over for nukleasenedbrydning; og/eller er mærkede med molekyler, der er afstandsfølsomme.