DK175611B1 - Makroporöse polymere membraner, især til separation af polymerer, fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse deraf - Google Patents

Description

i DK 175611 B1

Opfindelsen angår makroporøse polymere membraner, især til separation af polymerer, og en fremgangsmåde til deres fremstilling samt anvendelse deraf. Selv om problemerne ved separation af makromolekyler fra blandinger deraf med både 1avmolekylere og 5 højmolekylære forbindelser ofte behandles i den aktuelle litteratur og praksis, og skønt der er opnået en vis succes har de ikke kunnet løses helt. Problemet med en effektiv separation af et produkt fra en reaktionsblanding bliver det afgørende kriterium for en succesfuld løsning i moderne hurtigud-10 viklende videnskabelige og tekniske disipliner, f.eks. indenfor bioteknologien. I reglen er det ikke et stort problem at finde en fremgangsmåde til analytisk identifikation af den søgte forbindelse eller at bestemme dens koncentration. Imidlertid giver det stadig problemer, at man endnu ikke kan løse 15 den opgave at gennemføre præparativ industriel separation med høj effektivitet med et fornuftigt forbrug af arbejdskraft, energi, penge og materielle resourcer og med et minimum af miljøforurening.

20 Separation og isolation af biopolymerer er meget vigtig i relation til deres anvendelse. Denne gruppe af makromolekulære forbindelser omfatter oligopepti der og po1ypept i der, proteiner, enzymer,, lektiner, antistoffer, antigener, nucleinsyrer og polysacchari der. Separationen af biopolymerer fra naturlige 25 kilder har været et generelt kendt problem siden sidste århundrede.

De oprihdelige oprensningsmetoder bestod frem for alt i udfældning, f.eks. af proteiner, eller i udsaltning med neutrale 30 salte, hvilket kan udføres samtidig med, at pH varieres og således kan der endog opnås en multipel fraktionering i et trin.

Men også ved disse fremgangsmåder var det en besværlig affære at opnå et rent protein, hvilket opnåedes første gang i 1926, da Sumner isolerede krystallinsk urease. Imidlertid benyttes 35 effekten af ionstyrke eller-pH igen ved separation af proteiner hvilket bliver omtalt senere.

En fremgangsmåde, der af dens opfinder M. Cvett er betegnet kromatografi (Ber. Deut. Botan. Ges., 24, 316, 1906), blev ud- I DK 175611 B1

I I

I viklet parallelt. Imidlertid var det først arbejdet af A.J.P. I

I Martin og R.L.M. Synge {Biochem. J. 35, 1358, 1941), der in- I

troducerede begrebet teoretisk bundhøjde i forbindelse med I

I væskekromatografi, der blev en vigtig milepæl. Det blev også I

5 erkendt, at kolonner pakket med mi kropartikler er specielt I

I egnede til separation af makromolekyler, hvis diffusionskoef- I

f ici enter er meget lave. Da mikropartikler endnu ikke var ud- I

I viklet på dette tidspunkt, blev fremgangsmåden højtryksvæske- I

I kromatografi (HPLC) først realiseret tyve år senere. I

I 10 I

Kromatografi af polymerer udvikledes først på basis af opda- I

gelserne gjort af Peterson og Sober (J. Amer. Chem. Soc., 76, I

I 1711, 1954), at proteiner kan absorberes på diethyl ami noethyl - I

H derivatet af cellulose og derefter gradvist elueres med en I

I 15 opløsning med stigende ionstyrke. Senere blev også andre cel- I

I lulosederivater benyttet til det samme formål, f.eks. carbo- . I

I xymethylcel1ulose. I slutningen af halvtredserne introducerede I

I Pharmacia i Uppsala, Sverige den tværbundne dextrangel til I

I størrelseskromatografi (SEC) af proteiner og nucleinsyrer I

I 20 (tysk patentskrift nr. 1.292.883 og britisk patentskrift nr. I

I 974.054), ved hvilken separationsprocessen sker på basis af I

I tilgængeligheden til forskellige dele af ge1 strukturen for ma-. I

I kromolekyler med forskellige størrelser. Men på grund af ge- I

I lens svage mekaniske styrke var man ude af stand til helt at I

I 25 realisere HPLC-princippet. I 1

Et gennembrud opnåedes i fraktioneringen af bacitracin på si- I

I 1 ikamikroparti kl er, der var der ivat i seret med alkylsilaner (K. I

I Tsuji, J.H. Robinson; J. Chromatog., 112, 663, 1976). Adskil- I

30 lige strukturformer af dette peptid blev adskilt ved såkaldt I

I omvendtfase-væskekromatograf i (RPLC) i en 30 cm lang kolonne I

I ved brug af en sur mobil fase indeholdende et organisk opløs- I

I ningsmiddel. Kort tid herefter blev der i litteraturen beskre- I

I vet anvendelsen af silika til højtryksstørrelseskromatografi I

I 35 (SEC) og ionbytn ingsvæskekromatog rafi (IELC) af proteiner med I

I næsten kvantitativt udbytte og opretholdelse af aktiviteten. I I

I sammen 1 igning med gel mater i a 1 er kan der i disse tilfælde be- I

I nyttes næsten to større!sesordener større strømningshastighed I

I af den mobile fase, hvorved analysetiden reduceres væsentligt. I

3 DK 175611 B1

Almindeligvis indvirker makromolekylerne med den stationære fase i den kromatografiske kolonne på forskellige måder. Dette har den konsekvens, at kapacitetsfaktoren for en isokratisk eluering, dvs. en eluering hvortil der bruges det samme opløs-5 ningsmiddel hele tiden, defineret som: k1= (tR - t0)/tø hvor tR er retentionstiden af den analyserede forbindelse og 10 t0 er dødtiden for kolonnen, ændres væsentligt ved en lille ændring af elueringsmidlets sammensætning. Ved visse sammensætninger, er k' så høj, at makromolekylet i realiteten ikke bevæger sig i kolonnen. Imidlertid kan en lille ændring i opløsningsmidlet medføre et fald i k' til en værdi meget tæt på 15 nul og makromo1eky1et passerer gennem kolonnen uden indvirkning med pakkematerialet. Den sædvanligvis tegnede og publicerede afhængighed af log k' på sammensætningen, er således meget stejl, ofte næsten lodret. Heraf følger, at længden af den kromatografiske kolonne ikke har afgørende indflydelse på kva-20 liteten af separationen. Der kan benyttes meget korte kolon ner, der kun indeholder en sådan mængde sorbent, der er nødvendig for sorption af separerede molekyler i den mængde, der er nødvendig til påvisning af forbindelser efter separation.

25 Det viste sig, at ved kromatografi af makromolekyler, f.eks. ved RPLC, er funktionen af resolutionen proportional med Ώϊ d01 ' m p u 30 hvor Dm er diffus ionskoeffi eenten for det opløste stof, dp er partikeldiameteren af kolonnematerialet, og tø er den tid, hvormed sammensætningen af elueringsmidlet varierer (gradienten). Da den første størrelse er en karakteristisk konstant 35 for den separerede forbindelse, kan separationskvaliteten forbedres ved en lille ændring i sammensætningen af elueringsmidlet eller ved at gøre kolonnematerialets partikelstørrelse

I DK 175611 B1 I

I

I mindre. I

I I det første tilfælde øges den nødvendige tid for separationen I

af blandingen, hvorimod i det andet tilfælde vil tryktabet i I

I 5 kolonnen øges, og elueringsmidlet må indføres ved et meget I

I højt tryk, der kan nå flere enheder eller dekader af MPa. I

De givne fakta viser, at en opskalering af den kromatografiske I

I separation fra analytisk skala eller 1aboratorieska1a kan være I

I 10 et betragteligt problem. Det er klart at anvendelsen af ko- I

lonner med store volumener og med en relativ stor diameter kan I

I give besværligheder, selv hvis der benyttes ikke-komprimerbare I

I pakkematerialer, hvilket er slået fast ved resultater, der I

I ikke kan sammenlignes med de resultater, der er opnået i lille I

I 15 skala. Den såkaldte "tailing" af kromatografiske toppe eller I

I overlapning optræder ofte. Arsagen kan være forskellige strøm- I

I ningshastigheder af elueringsmidlet i forskellige steder af I

I kolonnetværsnittet. For at undgå denne effekt, er det nødven- I

I digt at opretholde en ensformig hastighed af den horisontale I

I 20 front gennem kolonnen i retning fra indløbet af elueringsmid- I

I let til kolonneudgangen. Dette problem blev diskuteret i US- I

I patentskrift nr. 3.250.058 og løst ved hjælp af "brydere" I

I fastgjort på indersiden af kolonnen. Metoden til at påvirke I

I væskestrømningen i en kolonne er også beskrevet i andre pa- I

I 25 tentskrifter (US-patentskrift nr. 3.539.505, japansk patents-

I krift nr. 73-68.752) og muliggør en forbedring af separation- I

I en, men på bekostning af den oprindelige enkelthed. For at I

overvinde de indviklede konstruktioner af kolonner, benyttede I

nogle forfattere sig af ændringer ved pakningen som sådan I

30 (US-patentskri ft nr. 3.856.681) eller specielle metoder til I

kolonnepakning {US-patentskri ft nr. 4.211.656). Det afsløredes I

senere, at en velegnet effekt kan opnås hvis små partikler af I

sorbenten, der benyttes til separationen, er inkorporeret i en H

porøs inert matriks, der har en fibrøs form. Dette fibrøse ma- I

35 teriale pakkes derefter i kolonner med et specielt design, der I

giver et langt mindre tryktab og mindre 2onespredning

(US-patentskri ft nr. 4.384.957; 4.512.897; 4.496.461, I

4.604.198). I

5 DK 175611 B1

Det blev antydet ovenfor, at de fleste pakkematerialer til kromatografiske kolonner til separation af biopolymerer er porese, omfattende både uorganiske polymerer (silikagel, glas) eller organiske polymerer (styren - divinylbenzen, acrylat-5 eller methacry1atcopolymerer, etc.)/ som regel med form som sfæriske partikler (F.E. Renier, Chromatographi a 24, 241 , 1987). Disse partikler produceres fortrinsvis ved en suspensionsteknik og senest også ved f lertrinsdispersionsmetoden (podet polymerisation). Ved afslutningen af polymerisationen 10 skal der, med få undtagelser, opnås en finkornet fraktion af sorbenten ud fra råproduktet, da kvaliteten af den pakkede kolonne og derfor også dens effektivitet, i høj grad afhænger af partike1 stør re 1 sesforde1 i ngen. Fraktioneringen af partiklerne er meget langsommelig og fraktionen af partikler, der er an-15 vendelige til HPLC, er kun en lille del af det oprindelige råprodukt .

På baggrund af anvendelsen af partikler med lille diameter (5-10 pm), må de organiske sorbenter også være tilstrækkeligt 20 mekanisk modstandsdygtige, hvilket kræver en relativ høj koncentration af et tværbindende middel i polymerisationsudgangsblandingen. Kravet om porøsitet løses på samme tid ved syntesen af makroporøse partikler, dvs. partikler der også udviser porøsitet i tør tilstand eller i termodynamisk ringe opløs-25 ningsmidler (CS-patentskrift nr. 168.258, G8-patentskrift nr. 1.512.462, CA-patentskrift nr. 1.049.194). Fra en morfologisk synsvinkel er de makroporøse polymerer karakteriseret ved en kugleformet (globulær) struktur, dvs. at partiklerne består af gensidigt forbundne submi kroskop i ske sfæriske enheder benævnt " 30 globuler" eller "småkugler". Det specifikke overfladeareal af de makroporøse polymerer er derfor, overfladearealet af disse "småkugler” og rummet mellem dem er porer (se f.eks. Z. Pelz-bauer et al., J. Chromatog., 171, 101, 1979). Den globulære struktur af porøse partikler antyder til en vis grad et sfæ-35 risk legeme fyldt med små ligeledes sfæriske "globuler". Det såldes antydede forslag er ikke langt fra forholdene, der optræder inde i en pakket kromatografi sk kolonne, der imidlertid har form soro en cylinder. Forudsat at kolonnen er pakket med

I DK 175611 B1 I

I I

I partikler, der har "småkugle"-størrelse (0,1 - 0,4 pm), vil I

I sandsynligheden for en realisering af den kromatografiske se- I

paration være forsvindende lille, da det nødvendige tryk I

I skulle være urealistisk højt. I

I 5 I

I Membraner til elektrodialyse, der kun har overfladelaget dann- I

I et af en makroporøs polymer, er beskrevet i US-patentskrift I

nr. 3.926.864. En sådan overflade har, efter modificering med I

I ionogengrupper, væsent1ige aflejringshindrende egenskaber. Da I

I 10 det også er nødvendigt at opnå egnede elektrodialytiske egens- I

I kåber, udføres polymerisationen på en sådan måde, at den indre I

I del af membranerne er mikroporøs (dannet som gel). Dette bety- I

I der at disse membraner ikke kan benyttes til separation af po- I

I lymerer. De er egnede til afsaltning af vand, fjernelse af I

I 15 ioner, og lignende. I

I De er også kendt som plader til tyndtlagskromatograf i, hvor I

I sorbenten imidlertid er aflejret på et fast ikke-porøst sub- I

I strat (glas, metal). Laget benyttes i separationsprocessen,

I 20 der omfatter karaktertrækkene ved kromatografisk separation i I

I tangentielretningen, dvs. i den retning hvor længden mange I

I gange overst iger partikelstørrelsen af sorbenten. En ulempe I

I ved tynde lag, der er løst støbt eller bundet, er også en lav I

I modstandsdygtighed over for mekanisk skade. Tyndt 1agskromato- I

I 25 grafi kan kun med besværlighed udnyttes til præparative for- I

I mål. I

I Den ovenfor givne oversigt af den kendte tekniks stade viser I

I klart, at der endnu ikke eksisterer en pålidelig og simpel I

I 30 fremgangsmåde til separation af polymerer i en større skala.

I Derfor var det nødvendigt at finde en principielt ny løsning, I

I hvilket er formålet med denne opfindelse. I

I Opfindelsen angår makroporøse polymere membraner, der frem for alt er egnede til I

I 3 5 separation af polymerer, og membranerne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de I

I består af copolymeren af en monovinylmonomer valgt blandt gruppen omfattende I

I acrylater, især glycidylacrylat, methacrylater, især glycidylmethacrylat, itaconater, især I

I glycidylitaconat, vinylpyridin, N-vinylpyrrolidon, vinylacetat, glycidylvinylether, glyci- I

7 DK 175611 B1 dylvinyladipat og hydroxystyren, og en di vinylmonomer valgt blandt gruppen omfattende alkylen- og hydroxyalkylen-diacry later og -dimethacrylater, divinylbenzen og divinylpyridin, hvor det indbyrdes forhold mellem de to typer af monomerer varierer fra 5:95 til 95:5 5 vægt%, og er opbygget af polymere globulære konfigurationer med en størrelse på 0,05 til 0,5 pm indbyrdes forbundet med kovalente bindinger, hvor der mellem de globulære konfigurationer er indbyrdes forbundne hulrum/porer. Den totale tykkelse af membranen kan med fordel være 0,2 til 15 mm og det 10 specifikke overfladeareal, også målelig i tør tilstand, kan opnå en så høj værdi som 400 m2/g. Membranerne kan indeholde et forstærkende indlæg i hele deres tværsnit til forøgelse af deres mekaniske styrke.

15 Glycidy 1methacry1 at benyttes fortrinsvis som monovi ny 1 monomeren i en mængde fra 5-80 volumen% af monomerernes totale volumen i batchen, mens den resterende del, 20 - 95 volumen%, udgøres af divinylmonomeren, fortrinsvis ethylendimethacry1 at.

Det er her indlysende, at en arbitrær blanding af begge typer 20 monomerer kan benyttes og på denne måde kan de porøse egenskaber af den dannede membran varieres. Valget af monomerer kan også øges. Monovinyl delen kan også være g 1yci dy1 aery1 at, gly-cidy1 itaconat, glycidylvinylether, glycidylvinyladipat, og hvis aktiviteten af epoxidgruppen kan undværes, også mange an-25 dre monomerer. Heller ikke valget af det tværbindende middel er endeligt og mange, andre midler kan vælges fra gruppen omfattende diacrylater og dimethacrylater, som både har vinylgrupper forbundet med esterbindi nger til en kæde af varierende længde eller af varierende hydrofi 1 itet, eller af divinylben-30 zen og andre.

35

I DK 175611 B1 I

I 8 I

I Membranerne ifølge opfindelsen fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig I

I ved, at en blanding af en eller flere monovinylmonomerer valgt blandt gruppen omfattende I

I acrylater, især glycidylacrylat, methacrylater, især glycidylmethacrylat, itaconater, især I

I glycidylitaconat, vinylpyridin, N-vinylpyrrolidon, vinylacetat, glycidylvinylether, glyci- I

I 5 dylvinyladipat, og hydroxystyren, opløst sammen med en radikal initiator i et poredannen- I

I de inert organisk opløsningsmiddel valgt blandt gruppen omfattende alkoholer, estere af I

I carboxylsyrer, ketoner, og blandinger heraf, anbringes i et rum tilpasset formen og formgi- I

I vet af to temperaturkontrollerede plane skiver og et afstandsgivende indlæg, der har en

I tykkelse modsvarende den krævede membrantykkelse, og derefter opvarmes til temperatu- I

I 10 rer op til 80°C for at starte den radikale polymerisation, der derefter foregår i maksimalt 24 I

I timer. I

I Azo-bis-isobutyron itri 1 benyttes i en mængde fra 0,05-2 vægt% I

I i forhold til den totale mængde monomerer for at initiere den I

I ^ radikale polymerisation, men en vilkårlig radikal initiator I

I kan benyttes, der vælges blandt gruppen omfattende azoforbin- I

I delser, peroxider, hydroperoxider, redoxsystemer og lignende. I

I En vigtig komponent i po1 ymer i ser ingssystemet er det poredan- I

I 20 nenc*e opløsningsmiddel, der i po 1 ymer i sa t i onsba tchen findes i I

I en mængde fra 40 - 60 volumen%. Cyklohexanol eller cyklohexa- I

I nol i blanding med op til 20 volunien% dodecanol kan med fordel I

I benyttes. Naturligvis kan også andre poredannende midler be- I

I nyttes, som kan vælges blandt gruppen omfattende alifatiske og I

I aromatiske alkoholer, estere, ethere, ketoner, hydrocarboner, I

I 25 silikoneolier, lavmolekylære polymerer og andre. H

I De polymere porøse membraner fremstillet ifølge opfindelsen ud I

I fra reaktive monomerer kan modificeres yderligere og således i I

I høj grad forbedre deres egenskaber yderligere. På denne måde I

I kan hydrofi 1 i teten eller lyofiliteten øges, ionogeniske grup- I

I 30 per introduceres, og katalysatorer, affinanter, eller andre I

aktive grupper eller molekyler kan immobi1iseres. I

DK 175611 B1 9 F.eks. bindes ally!-, amin-, sulfonat-, hydrogensu1 fonat -, hydroxyl-, thiol- og alkylgrupper med en kædelængde op til 18 . carbonatomer, kovalent til den indre overflade af membranen ved kemisk modificering.

Et vigtigt formål ved denne opfindelse er også anvendelsen af de ovenfor beskrevne ma-kroporøse membraner til separation og fraktionering af måkromolekylasre stoffer, især syn-10 tetiske polymerer og biopolymerer.

Den programmerede ændring af opløsningsmidlets egenskaber, der resulterer i den gradvise opløsning af individuelle komponenter i blandingen (gradient), kan omfatte pH, ionstyrke, ind-hold af organisk opløsningsmiddel, temperatur, og andre variable.

De makroporøse polymere membraner til separation af polymerer, fortrinsvis af biopolymerer, og fremgangsmåden til denne separation har talrige fordele ved sammenligning med den kendte 2ø teknik. Især er deres fremssti 11ing meget simpel og der er ingen begrænsning med hensyn til deres dimensioner. Membranerne er karakteriseret ved deres tilstrækkelige mekaniske stabilitet og modstandsdygtighed over for fysiske og kemiske påvirkninger. Den mekaniske styrke kan øges yderligere, hvis det ønskes, ved polymerisationsinkorporering af et forstær-25 kende indlæg i membranen under dens fremstilling. Da membranerne indeholder reaktive grupper, kan de let modificeres kemisk, og funktionelle grupper, der kan ændre deres egenskaber, I DK 175611 B1 I 10

I kan indføres på deres indre overflade, og således væsentligt I

I forbedre deres anvendelsesmuligheder. F.eks. foregår separa- I

tionen af bi opolymerer, ved sammen1igni ng med tidligere frem- I

gangsmåder, meget hurtigt ved en betydelig større påførings- I

5 mængde pr. vægtenhed af det separerende materiale, end det er - I

muligt ved påføring på kromatografiske kolonner. Samtidig er I

H det tryk, der er nødvendigt at opbygge for at opnå den krævede I

strømningshastighed, en til to størrelsesordener lavere end I

ved fremgangsmåder under anvendelse af kolonner, med en til- I

10 svarende effektivitet. En principiel fordel ved membranerne og I

anvendelsesmulighederne af disse ifølge opfindelsen, er imid- I

I lertid muligheden for at skabe teoretisk ubegrænset store are- I

aler, på hvilke separationen af polymerer kan foregå og såle- I

I des tilvejebringe en industriel proces til opnåelse af indivi- I

I 15 duelle forbindelser. Det krævede areal opnås ikke nødvendigvis I

ved at øge dimensionen af en membran og et kammer, men det er I

muligt at kombinere det nødvendige antal mindre membraner og I

kamre til blokke, der opfylder det samme formål. I

I 20 Opfindelsen belyses yderligere ved hjælp af nedenstående udfø- I

I relseseksempler, uden at opfindelsen begrænses dertil. I

H Eksempel 1 I

I 25 En støbeform dannet ud fra to metalliske plader med borerede I

I forbindelseskanaler og et 1,2 mm tykt afstandsskabende indlæg I

med kvadratisk form, lavet af silikonegummi, i hvilken der er I

I udskåret et kvadratisk vindue med en sidelængde på 8 cm og med I

I et hul, der gør det muligt at fylde støbeformen udefra, blev I

I 30 fyldt med en polymerisationsblanding bestående af 0,6 g N- I

vinylpyrrolidon, 11,4 g ethylendiacrylat, 8,2 g 2-butanon, og I

I 0,15 g azo-bis-isobutyronitri 1 (polymeri sat ions i niti ator) . I

Støbeformen blev skyllet igennem med 80eC varmt vand i 8 I

I timer. Ved afslutning af polymerisationen blev støbeformen I

I 35 skilt ad og den fremstillede membran, havende et specifikt I

I overfladeareal på 8,4 m2/g var klar til brug. Størrelsen af de

I enkelte "småkugler" blev bestemt ved elektronmikroskopi og vi- I

I ste sig at være 0,48 pm. I

Eksempel 2 11 DK 175611 B1

Den samme støbeform som i eksempel 1 fyldtes med en blanding bestående af 0,6 g glycidylmethacrylat, 11,4 g ethylendi-5 methacrylat, 0,12 g initiator, og 16,2 g cyklohexanol og polymerisationen udførtes under de samme forhold. Den fremstillede membran havde et specifikt overfladeareal på 139 m2/g; "småkuglerne" havde en diameter på 0,05 pm.

10 Eksempel 3

En støbeform, hvor det afstandsskabende indlæg var 15 mm tykt, fyldtes med en blanding bestående af 12 ml 2-hydroxyethylacry-lat, 12 ml 2-hydroxypropylendiacrylat, 0,24 g azo-bis-15 isobutyronitri 1, 32,4 ml cyklohexanol og 3,6 ml dodecanol. Polymerisationen udførtes ved 60eC i 3 timer og derefter ved 80eC i 5 timer. Den fremstillede polymeriske pilade havde et specifikt overfladeareal på 38 m2/g, og enkel11 iggende "globules" havde en diameter på 0,12 pm.

20

Eksempel 4

En støbeform med et afstandsskabende indlæg med en tykkelse på 3 mm og som havde et udskåret cirkulært vindue med en radius 25 på 4 cm, fyldtes med en blanding bestående af 4,8 g 4-hydro-xystyren, 6,2 g 2,3-dihydroxybutylendimethacrylat, 0,15 g azo-bis-isobutyronitri 1 og 12,8 g methylbenzoat. Polymerisationen udførtes ved 80°C i 24 timer, og det endelige produkt, der havde form som en skive med en diameter på 8 cm havde et spe-30 cifikt overfladeareal på 12,2 m2/g. "Globules" havde en størrelse på 0,32 pm.

Eksempel 5 35 Den samme støbeform som blev benyttet i eksempel 4, fyldtes med en opløsning af 7,2 ml glycidylmethacrylat, 4,8 ml ethy-lendimethacrylat, og 0,12 g azo-bis-isobutyronitril i en blanding af 16,2 ml cyklohexanol og 1,8 ml dodecanol. Efter 3

I DK 175611 B1 I

I I

I timers polymerisation ved 70eC, opnåedes en membran med et I

I specifikt overfladeareal på 43,3 m2/g, som bestod af "globu- I

I les" med en størrelse på 0,16 pm. I

I 5 Eksempel 6 I

Et filter af polyesterfiber med en maskestørrelse på omkring I

I 300 pm placeredes i en støbeform afgrænset med et afstandsska- I

I bende indlæg, der var 3 mm tykt. Støbeformen, hvis hulrum har I

10 en kvadratisk form med sidelængden 60 cm, blev fyldt med en I

I blanding indeholdende 19% 2-vinylpyridin, 19% 2,4-divinyl- I

I pyridin, 2% azo-bis-isobutyronitril, og 60% cyk1ohexanol. Fo- I

I lymerisationen var komplet efter 18 timer ved 80eC og det re- I

I suiterende produkt havde et specifikt overfladeareal på 18,9 I

I 15 m2/g. I

I Eksempel 7 I

I Membranen fremstillet ifølge eksempel 2 holdtes nedsænket i en I

I 20 1 M kaliumhydroxid i vand i 18 timer ved 60°C. Efter vask af I

membranen med en 0,5 M HC1 i vand indeholdt den 1,4 mmol/g I

I carboxylgrupper. I

I Eksempel 8 I

I 25 I

I Membranen fremstillet ifølge eksempel 5 holdtes opvarmet i 3 I

I timer i en 0,5 M svovlsyreopløsning. Den hydrolytiske reaktion I

I førte til komplet spaltning af epoxygrupper til vicinale hy- I

droxylgrupper og således til en øget hydrofilitet af membra- I

I 30 nen. I

I Eksempel 9 I

Membranen fremstillet ifølge eksempel 5 blev holdt i bevægelse I

I 35 i en 50% vandig opløsning af trimethylammoni umchlor i d i 10 I

I timer ved 80eC. Efter vask med en 0,5 mol/1 vandig opløsning I

I af natriumhydroxid, måltes ved titrering en mængde på 1,93 I

I mmol/1 kvaternære ammoniumgrupper i produktet. Produktet inde- I

I holdt 2,70% nitrogen ifølge grundstof analyser. I

Eksempel 10 13 DK 175611 B1

Membranen fremstillet ifølge eksempel 8 blev holdt i bevægelse i en 20% opløsning af hexadecansyrech1 or id i benzen. Efter 6 5 timer ved 60°C, vask med benzen, methanol, og ether, og efterfølgende tørring, var vægten af produktet øget med 4,2% sammenlignet med den oprindelige vægt, hvilket svarer til 32% omdannelse af epoxidgrupperne der oprindeligt var til stede.

10 Eksempel 11

En støbeform dannet ud fra to metalliske plader med rillede forbindelseskanaler og et 1 mm tyk afstandsskabende indlæg med kvadratisk form lavet af silikonegummi, i hvilken der er ud-15 skåret et kvadratisk vindue med sidelængden 8 cm og med et hul der gør det muligt at fylde støbeformen udefra, fyldtes med en polymerisationsblanding bestående af 6 ml giyc idyl me-thacrylat, 6 ml ethylendimethacrylat, 0,12 g azo-bis-isobu-tyronitril, 16,2 ml cyklohexanol og 1,8 ml dodecanol. 70°C 20 varmt vand blev ført gennem støbeformens kanaler i 8 timer.

Efter at polymerisationen var fuldført, afkølede støbeformen frivilligt og blev derefter skilt ad. En makroporøs membran med form som en plade blev grundigt vasket med alkohol, vand og igen med alkohol og tørrede derefter frivilligt. En cirku-25 lær plade med en diameter på 10 mm blev udstanset fra den kvadratiske plade med et stempel (overfladeareal ca. 300 mm2).

Det specifikke overfladeareal af membranen i tør tilstand var 62 m2/g.

30 Eksempel 12-18

Støbeformen beskrevet i eksempel 11 fyldtes med blandinger, hvis sammensætning er givet i tabel 1, hvorefter blandingen blev polymeriseret og behandlet på samme måde som i eksempel 35 11.

I DK 175611 B1 I

I I

I Tabel 1 I

I Sammensætning af den anvendte polymerisationsblanding til I

I fremstilling af makroporøse polymere membraner, og disses spe- I

5 cifikke overfladeareal. I

I _areal _ I

I Eks. GMA EDMA AIBN CyOH DoOH Sg · I

_mj_mj_g_mj_mj_m2/q I

I 10 12 4,8 7,2 0,12 18 0 80 I

I 13 7,2 4,8 0,12 16^2 1,8 45 I

I 14 9,6 2,4 0,12 17,1 0,9 160 I

I 15 0,6 11,4 0,12 18 0 260 I

I 16 7,2 4,8 0,12 18 0 53 I

I 15 17 0,6 11,4 0,06 18 0 250 I

I 18 7,2 4,8 0,24 14,4 3,6 35 I

I GMA - g 1ycidy1methacry1 at, EDMA - ethylendimethacrylat, AIBN - I

azo-bis-isobutyronitri 1, CyOH - cyklohexanol, DoOH - dodeca- I

I 20 nol, og Sg - specifikt overfladeareal i tør tilstand bestemt I

I ved den dynamiske metode termisk desorption af nitrogen. I

I Eksempel 19 I

I 25 Cirkulære skiver fremstillet ud fra den makroporøse membran I

I fremstillet ifølge eksempel 13 holdtes nedsænket i en 0,01 I

I mol/1 natriumhydroxid i butanol i 24 timer. Efter reaktionen I

var fuldført blev skiverne vasket med ethanol og vand og gemt I

med henblik på yderligere anvendelse i våd tilstand. I

30 I

Eksempel 20 og 21 I

Membranernes epoxidgrupper blev modificeret med octanol eller I

octadecanol på samme måde som i det foregående eksempel 19. I I

35 det sidste tilfælde udførtes modificeringen ved 65°C. I

Eksempel 22 15 DK 175611 B1

Cirkulære skiver med en diameter på 10 mm udstanset fra membranen defineret i eksempe1 16 holdtes neddyppet i 6 timer i 5 en 25¾ kommerciel vandig opløsning af ammoniak og kogt ved 80° C med tilbagesvaling. Skiverne blev derefter vasket med vand indtil ammoniak ikke reagerede yderligere. Elementapana-lyser viste tilstedeværelsen af 1,8 mmol/g am inogrupper i den modificerede polymer.

10

Eksempel 23-30

Skiver af membranen fremstillet ifølge eksempel 11 blev modificeret ved den samme fremgangsmåde som i eksempel 22, der be-15 står i reaktionen med ren amin eller dennes vandige opløsning udført i en flaske eller forseglet ampul. Reaktionsbetingelserne og indholdet af grupper bundet til den polymere membran er vist i tabel 2.

20 25 30 35

I DK 175611 B1 I

I 16 I

I Tabel 2 I

I Reaktionsbetingelser for modificeringen af makroporøse membra- I

I ner og indholdet af grupper bundet til produktet. I

I 5 I

I Eks. Amin Kone.af Reak- Temp.Indhold I

I vandig op- tions- af I

I løsning tidi grupper I

I ._______vægt%_timer_°C mmol/q I

I 23 dimethyl- 100 3 60 2,0 I

I 24 2-hydroxyethy1 - 100 6 70 2,2 I

I 10 I

25 bis-2-hydroxyethy1 - 100 6 70 2,1 I

I 26 octyl- 100 12 70 0,4 I

I 27 ethyl- 50 6 80 1,6 I

I 28 ethylendi- 50 10 80 1,7 I

I 29 trimethyl- .HCl 50 24 80 2,2 I

I 15 30 tributyl- 100 24 80 0,1 I

I Eksempel 31 I

I 20 I

Cirkulære skiver udstanset fra den makroporøse membran frem-

I stillet ifølge eksempel 12 holdtes nedsænket i 6 timer i en I

I 0,01 mol/1 svovlsyre og opvarmet til 80eC. Skiverne blev va- I

I sket med vand indtil vaskevandet ikke mere reagerede surt og I

I neddyppet i en opløsning af 10,2 g natriumhydroxid i 36 ml I

I 25 I

vand, og blandingen blev nedkølet til 0°C. Under omrøring af

I væsken oven over membranerne blev 24 g propansulton tilsat I

I dråbevis. Efter 30 min. blev blandingen igen opvarmet til 35CC I

I og reaktionen fortsatte i yderligere 3 timer. Efter denne op- I

I varmning stod blandingen ved stuetemperatur i 12 timer. Ski- I

I ^ verne blev vasket med vand, 0,5 mol/1 saltsyre og igen med I

I vand indtil vaskevandet ikke mere reagerede surt. På denne I

I måde opnåedes 0,85 mmol/g sulfogrupper på - overf 1aden af poly- I

I mermembranen. I

I 35 I

Eksempel 32 17 DK 175611 B1

Et rektangel på 10x5 cm fremstillet ud fra en skive fremstillet på samme måde som i eksempel 12 hvis epoxidgrupper var hy-5 drolyseret til vie i nåle dihydroxyder i vater med fortyndet svovlsyre på samme måde som i eksempel 31,vaskedes med vand og tørredes. Den tørre plade holdtes neddyppet i 5 timer i en blanding af allylglycidylether-dioxan (1:1 vol/vol) indeholdende 0,3 volumen% borf1uoridetherat og opvarmet til 50eC. De 10 påførte allylgrupper modificeredes derefter med en 30% kalium-thiosulfatopløsning i vand ved stuetemperatur i 24 timer, mens der fra en cylinder blev ledt oxygen gennem blandingen hvert tyvende minut i ti minutter. Efter vask med vand, 0,4 mol/1 saltsyre, og igen med vand, indeholdt membranen 0,37 mmol/g 15 su1fonatgrupper, hvilket blev bestemt ved syrebaset itrer ing.

Eksempel 33

En cirkuler skive med en diameter på 20 cm udstanset fra en 20 kvadratisk plade med en sidelængde på 25 cm og en tykkelse på 3 mm holdtes nedsænket i en glasbeholder indeholdende 100 ml 1,2-dichlorethan i 20 timer. Derefter blev 45 ml svov1trioxid-monohydrat langsomt tilsat ved stuetemperatur under omrøring tilvejebragt ved at tippe beholderen. Membranen blev fjernet 25 efter en times reaktion og vasket med ethanol og vand. Syreba-seti trering af en prøve viste, at membranen indeholdt 1,59 mmol/g hydrogensulfatgrupper.

Eksempel 34 30

Cirkulære skiver med en diameter på 30 mm, der var udstanset fra pladen fremstillet ifølge eksempel 14, blev blandet med en 10% vandig opløsning af natriumsulfid. Blandingen blev rystet forsigtigt med 25eC i 12 timer. Skiverne blev vasket med vand 35 indtil lugten af hydrogensulfid forsvandt. Den modificerede polymer indeholdt 0,52 mmol/g thiolgrupper.

DK 175611 B1 I

Eksempel 35 I

En skive med en diameter på ca. 1 cm fra en 1 mm tyk membran I

fremstillet ifølge eksempel 11 og modificeret ifølge eksempel H

5 19, blev placeret på bunden af en beholder med et cirkulært H

tværsnit og et volumen på ca. 1 ml på en sådan måde, at efter H

at beholderen blev fyldt med væske, foregik hele væskestrømn- H

ingen udelukkende gennem membranen. Indholdet af beholderen I

blev påvirket med en propelomrører. Elueringsmidlet indførtes H

10 i beholderen ifølge en forvalgt gradient ved hjælp af en H

pumpe. Under memebranen, hvilende på en overflade udstyret med H

et system af forbindelseskanaler, der sikrede en perfekt og H

ensartet udledning af elueringsmiddel fra enhver del af mem- I

branen, der også havde en central udførse 1skapi 11 aråbn ing, fra I

15 hvilken den passerende eluent (eller en del af den) blev ført I

ind i en detektor og kunne derefter opsamles for at indvinde I

de adskilte forbindelser. Beholderen fyldtes med en opløsning I

indeholdende 0,1 mg ribonuc1 ease, 0,1 mg ovalbumin, og 0,1 mg I

chymotrypsi nogen i 0,02 mol/1 phosphatpuffer med en pH-værdi I

20 på 6,8 i hvilken ammoniumsulfat var opløst til en koncentra- I

tion af 2 mol/1. Den samme puffer indeholdende aftagende mæng-

der ammoniumchlorid indførtes i beholderen under omrøring og I

et tryk på 0,1 MPa ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min. I

Tilstanden hvor elueringsmidlet indeholdt 1% af den oprinde- I

25 lige mængde ammoniumsulfat blev nået efter 35 min. Eluenten, I

flydende fra beholderen, blev ført ind i en "Gilson" UV- I

detektor. Optegnelsen af detektorresponset {kromatogrammet) er I

vist i fig. 1. Alle oprindeligt absorberede proteiner blev I

elueret fra membranen med et udbytte på 100%. I

30 I

Eksempel 36 I

Den samme blanding af proteiner som i eksempel 35 blev separe- I

ret ved en identisk fremgangsmåde og med det samme udstyr, men I

35 skiven, der blev benyttet, var modificeret ifølge eksempel 26. I

Kromatogrammet er vist i f i g. 2. I

Eksempel 37 19 DK 175611 B1

De samme proteiner som i eksempel 35 blev separeret med det samme udstyr og under de identiske betingelser, men mængden af 5 hvert protein i opløsningen tilsat beholderen var 5 mg, dvs.

50 gange højere. Præcis den samme sepa rat i on som vist i fig. 1 opnåedes.

Eksempel 38 10

En blanding bestående af 0,1 mg ribonuclease og 0,1 mg lysozym opløst i 0,02 mol/1 phosphatpuffer med pH-værdi på 6,8 blev separeret under betingelser identiske med eksempel 35 og med det samme udstyr, men med en membran fremstillet ifølge eksem-15 pel 31. Elueringen blev udført med en strømningshastighed på 1 ml/min. og et tryk på 0,1 MPa, hvor der blev benyttet en ionstyrkegradient i den samme puffer, i hvilken natriumchloridindholdet øgedes så det nåede 0,5 mol/1 efter 15 min. Resul-tatet er vist i fig. 3.

20

Eksempel 39

Den samme blanding af ribonuclease og lysozym som benyttet i eksempel 38 blev separeret under identiske betingelser på en 25 membran fremstillet ifølge eksempel 36. Kromatogrammet er vist i fig. 4.

Eksempel 40 30 En blanding indeholdende 150 mg ribonuclease, 100 mg ovalbumin, og 150 mg chymotrypsinogen blev separeret i et apparatur havende en form som et prisme og omfattende et kammer med 10 ml volumen med en væg dannet af en rektangulær membran med arealet 6x8 cm og tykkelsen 1,5 mm fremstillet ifølge eksempel 35 11 og 19. Strømningshastigheden af elueringsmidlet var 5 ml/min. ved et tryk på 0,8 MPa. Elueringen blev udført under benyttelse af den samme ionstyrkegrad ient som i eksempel 38, og eluenten blev opsamlet i reagensglas i 10 ml portioner. Det

DK 175611 B1 I

ferate, sjette og syvende reagensglas indeholdt henholdsvis 5, I

85 og 10¾ ribonuclease, det ottende, niende og tiende reagens- I

glas indeholdt henholdsvis 15, 75 og 10¾ ovalbumin, og det H

tolvte, trettende, fjortende, femtende og sekstende reagens- H

5 glas indeholdt henholdsvis 3, 28, 16, 32 og 20% chymotrypsi- H

nogen. I

Eksempel 41 H

10 En blanding af 0,15 mg myoglobin og 0,3 mg ovalbumin blev se-

pareret på membranen og med apparaturet ifølge eksempel 35, H

med den forskel, at acetonitril blev tilsat pufferen med afta- I

gende ionstyrke i en sådan mængde, at dets koncentration var I

12 volumen% efter 20 min. ved trykket 0,25 MPa. Separationen I

15 er vist i fig. 5. I

30 -I

Claims (13)

1. 21 DK 175611 B1
2. 1. Makroporøse polymere membraner, frem for alt egnede til separation af poly-5 merer, kendetegnet ved, at membranerne består af copolymeren af en monovi- nylmonomer, valgt blandt gruppen omfattende acrylater, især glycidylacrylat, methacrylater, især glycidylmethacrylat, itaconater, især glycidylitaconat, vinylpyridin, N-vinylpyrrolidon, vinylacetat, glycidyl vinyl ether, glycidylvinyladipat, og hydroxysty-ren, og en divinylmonomer valgt blandt gruppen omfattende alkylen- og hydroxyalky-^ 10 len-diacrylater og -dimethacrylater, divinylbenzen og divinylpyridin, hvor det indbyrdes forhold mellem de to typer af monomerer varierer fra 5:95 til 95:5 vægt%, og er opbygget af polymere globulære konfigurationer med en størrelse fra 0,05 til 0,5 pm indbyrdes forbundet ved kovalente bindinger, hvor der mellem de globulære konfigurationer er indbyrdes forbundne hulrum/porer. 15
3. 2. Makroporøse polymere membraner ifølge krav 1, kendetegnet ved, at deres totale tykkelse i tværsnittet er 0,2 til 15 mm og det specifikke overfladeareal, der også kan måles i tør tilstand, er op til 400 m2/g.
4. 3. Makroporøse polymere membraner ifølge krav 1, kendetegnet ved, at monovinylmonomeren er glycidylmethacrylat i en mængde fra 5-80 volumen% i forhold til det totale volumen af monomerer til stede i polymerisationsbatchen.
5. 4. Makroporøse polymere membraner ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 25 divinylmonomeren er ethylendimethacrylat i en mængde fra 20-95 volumen% i forhold til det totale volumen af monomerer i polymerisationsblandingen.
6. 5. Makroporøse polymere membraner ifølge krav 1,kendetegnet ved, at de nævnte membraner på den indre overflade indeholder kovalent bundet allyl-, hydro- 30 xyl-, amin-, sulfonat-, hydrogensulfonat-, thiol-, og/eller alkylgrupper med op til 18 carbonatomer i kæden. I DK 175611 B1 I 22
7. 6. Makroporøse polymere membraner ifølge ethvert af kravene 1 til 5, I I kendetegnet ved, at de nævnte membraner indeholder, et forstærkende indlæg I I over hele deres tværsnit. I I 5 7. Fremgangsmåde til fremstilling af makroporøse polymere membraner, k e η - I I detegnet ved, at en blanding af en eller flere monovinylmonomerer valgt blandt I I gruppen omfattende acrylater, især glycidylacrylat, methacrylater, især glycidyl- I methacrylat, itaconater, især glycidylitaconat, vinylpyridin, N-vinylpyrrolidon, vinyl- I I acetat, glycidylvinylether, glycidylvinyladipat, og hydroxystyren, opløst sammen med I I 10 en radikal initiator i et poredannende inert organisk opløsningsmiddel valgt blandt I gruppen omfattende alkoholer, estere af carboxylsyrer, ketoner, og blandinger heraf, I anbringes i et rum tilpasset formen og formgivet af to temperaturkontrollerede plane I I skiver og et afstandsgivende indlæg, der har en tykkelse modsvarende den krævede I I membrantykkelse, og derefter opvarmes ti! temperaturer op til 80DC for at starte den I I 15 radikale polymerisation, der derefter foregår i maksimalt 24 timer. I
8. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at initiatoren til den ra- I dikale polymerisation er azo-bis-isobutyronitril i en mængde fra 0,05 til 2 vægt% i for- I I hold til den totale mængde monomerer i polymerisationsbatchen. I I 20 I
9. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det poredannende I I opløsningsmiddel, hvis mængde i polymerisationsbatchen er 40-60 volumen%, er cy- I I klohexanol eller cyklohexanol i en blanding med maksimalt 20 volumen% dodecanol. I
10. 10. Anvendelse af makroporøse, polymere membraner ifølge ethvert af kravene 1- I I 6 til separation og fraktionering af makromolekylære stoffer, især syntetiske polymerer I I og biopolymerer. I 23 DK 175611 B1
11. 11. Fremgangsmåde til separation af makromolekylære stoffer omfattende trinene: under tryk at lede en opløsning af de makromolekylære stoffer, som skal separeres, gennem en makroporøs, polymer membran ifølge ethvert af kravene 1 -6 under 5 sorption af de makromolekylære stoffer i membranen, eluering med et elueringsopløsningsmiddel, hvis egenskaber varieres gradvist eller trinvist på en sådan måde, at de enkelte komponenter af de sorberede makromolekylære stoffer elueres, og 10 detektering og/eller opsamling af de særskilte, eluerede komponenter.
12. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at pH-værdien, ionstyrken, temperaturen og/eller sammensætningen af elueringsopløsningsmidlet i 15 elueringstrinnet fortrinsvis varieres i overensstemmelse med et forudbestemt program.
13. 13. Fremgangsmåde ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved, at en makroporøs, polymer membran ifølge et af kravene 1 -6 anbringes og sikres på et underlag, der danner del af væggene af et kar omfattende et væskekammer, som er forsynet med 20 midler til påtrykning af tryk og evt. også midler til omrøring over membranen, og et væskeopsamlingssystem under membranen, som er forbundet med et væskedetekterings- og/eller opsamlingssystem, opløsningen af de makromolekylære stoffer påfyldes væskekammeret, tryk påtrykkes til væskekammeret, og de makromolekylære komponenter eller fraktioner elueres og/eller opsamles. 25