DK169560B1 - Biologisk ren kultur af Hyphozyma reseoniger, blanding fremstillet ved dyrkning heraf samt fremgangsmåde til fremstilling af en diol- eller en furanforbindelse ved dyrkning af mikroorganismen - Google Patents

Description

DK 169560 B1

Den foreliggende opfindelse angår en biologisk ren kultur af mikroorganismen Hyphozyma roseoniger, en blanding fremstillet ved dyrkning heraf samt en fremgangsmåde til fremstilling af en diol eller en furan ved dyrkning af mikroorganismen.

5 Dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphto[2,l-b] furan (1) (se nedenfor) er et vigtigt duftkemikalium (se US patent nr. 3.029.255). Det har været anvendt i parfumer af høj kvalitet og i funktionelle produkter, såsom duftstoffer til toiletartikler og husholdningsprodukter, hvor en vedvarende ambravirk-10 ning ønskes. Forbindelsen (1) er også en komponent af ambratinktur [se B.D. Mookherjee og R.R. Patel, Proceedings of the 7th International Congress of Essential Oils, Kyoto, Japan (1977), bidrag nr. 136] og syntetisk (1) har været anvendt i kunstige ambrapræparater. Forbindelsen (1) kan fremstilles af 15 2-ethenyldecahydro-2-hydroxy-Q!-2,5,5,8a-pentamethyl-l-naphta-lenpropanol (4) (se nedenfor), almindeligvis omtalt som Scla-reol, der fås af salvie (Salvia Sclarea).

US patent nr. 3.050.532 beskriver en fremgangsmåde til omdannelse af forbindelse (4) til dodecahydro-3a,6,6,9a-tetrame-20 thylnaphth[2,1-b] furan-2 (IH)-on (2) (se nedenfor) under anvendelse af en oxidation i 2 trin. I det første trin bringes en vandig dispersion af Sclareol i intim kontakt med et oxidationsmiddel af alkalimetalpermanganat under alkaliske betingelser til delvis oxidation af Sclareolen. Under det andet trin 25 bliver den fremkomne vandige reaktionsblanding fra første trin syrnet og bragt i intim kontakt med et oxidationsmiddel af permanganat eller chromsyre under sure betingelser, hvorved oxidationen fuldendes.

Forbindelse (2) kan let omdannes til forbindelse (1) på kendte 30 måder. Reduktion af forbindelse (2) med hydridreagenser (se f.eks. Helv. Chim. Acta 1950, 33, 1308) giver f.eks. decahy-dro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalenethanol (3) (se nedenfor), der let omdannes ved cyklisering til forbindelse (1) .

2

UIV ID300U D I

US patent nr. 3.029.255 beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelse (1) ved dehydratisering af forbindelse (3) med Al203 ved 200-225°C efterfulgt af opvarmning i vakuum i nærværelse af β-naphthalensulfonsyre (130°C op til 160°C) 5 for at bevirke cyklisering til forbindelse (1).

Alternativt kan forbindelse (1) fås ved cyklisering af forbindelse (3) under anvendelse af toluen-p-sulfonylchlorid i pyri-din, som beskrevet af Cambie med flere (se Aust. J. Chem., 1971, 24, 591).

10 Der er ingen beskrivelse eller antydning i den kendte teknik af omdannelse af labdan-forbindelser via mikrobiologiske metoder til decahydro - 2 - hydroxy-α, 2,5,5,8a-tetramethylnapthalin-ethanol (3) eller dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho-[2,l-b]furan (1) efter den nye og industrielt effektive frem-15 gangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse.

Den foreliggende opfindelse angår en biologisk ren kultur af mikroorganismen Hyphozyma roseoniger, som er ejendommelig ved, at den har deponeringsnummer ATCC 20624 eller mutanter deraf, som har de identificerende egenskaber af ATCC 20624, dvs. er i 20 stand til at producere en diol med formlen (3) eller en furan med formlen (1) i en udvindelig mængde efter omdannelse af forbindelser af 25 gruppen bestående af DK 169560 B1 3

^\L^CH2-CHO R

QfX (ffi· φ* hvor R er

2H OH

OH CHO

-CH2XXPVC02H -CH^Y -Otfy^CHO

OH

-ch^N^cooh -CH^^^I^yooH

• ^ o -CH2^V eller -C^oA .

under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium.

Opfindelsen angår ligeledes en blanding fremstillet ved dyrk-5 ning af ovennævnte mikroorganisme Hyphozyma roseoniger under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium, samt fremgangsmåde til fremstilling af blandingen.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en diol med formlen 10 CO-0H <3> DK 169560 Bl 4 eller en furan med formlen (1)

Qt? hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at mikroorganismen Hyphozyma roseoniger ifølge krav 1-2 dyrkes under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende en eller 5 flere forbindelser af gruppen bestående af

W^VCHO R

ς0°.

hvor R er

OH OH

OH CHO

”CH2^Nf/VSt02H ~CH2^f^ -CH^Y^OHO

OH

-CH^^'Y'^COOH _ch -^J^NroOH

2 l o ^VY eller 0 * hvorefter diolen om ønsket udvindes, eller diolen om ønsket cycliseres i det vandige næringsmedium til dannelse af den tilsvarende furan og udvinding heraf.

DK 169560 B1 5

Figur 1 angiver strukturerne af nogle af forbindelserne, der har interesse ifølge opfindelsen.

d? cti ςί? 1 2 . i

- OH OH

4 5 OHO i c6f cj^ 7 8 i

“ “OH

.ck- eo°H

rjr>« C>C^,,,oh ίο II —

O

j^-oA

φ ς6» 13 li

Figur 1 DK 169560 B1 6

Forbindelse 4 til 14 kan anvendes som substrater til omdannelsesprocessen ifølge opfindelsen til produktion af de ønskede produkter. Forbindelserne 6, 11 og 13 er blevet iagttaget som mellemprodukter under omdannelsen af Sclareol ved fremgangsmå-5 den ifølge opfindelsen. Omdannelsesprocessen indebærer dyrkning af mikroorganismen Hyphozyma roseoniger, ATCC 20624, i et vandigt næringsmedium i nærværelse af forbindelserne 4 til 14. Disse forbindelser kan anvendes enkeltvis eller som en blanding indeholdende et vilkårligt antal af forbindelserne.

10 Formen, hvori mikroorganismerne anvendes, er ikke af afgørende betydning. De kan anvendes som kulturen (suspension), dvs. indeholdende cellerne og den tilsvarende næringsopløsning, eller i form af celler opslæmmet i stødpudeopløsning. Cellerne eller et enzymekstrakt deraf kan immobiliseres på en egnet fast bæ-15 rer, som så kan anvendes til at bevirke omdannelser.

Den opslæmmede kulturblanding fremstilles ved at pode et egnet vandigt næringsmedium med mikroorganismen. Et egnet næringsmedium er et, der indeholder nitrogenkilder, uorganiske salte, vækstfaktorer, det eller de ønskede substrater, og eventuelt 20 andre carbonkilder. Nogle carbonkilder, der er egnede til brug i fremgangsmåden ifølge opfindelsen indbefatter f.eks. glucose, galactose, L-sorbose, maltose, sucrose, cellobiose, trehalose, L-arabinose, L-rhamnose, ethanol, glycerin, L-erythrit, D-mannit, lactose, melibiose, raffinose, melezitose, stivelse, 25 D-xylose, D-sorbit, α-methyl-D-glucosid, mælkesyre, citronsyre og ravsyre. Egnede nitrogenkilder indbefatter f.eks. nitrogen-holdige organiske stoffer, såsom pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, majsstøbevæske, casein, urinstof, aminosyrer, eller nitrogenholdige uorganiske forbindelser, såsom nitrater, ni-30 triter og uorganiske ammoniumsalte. Egnede uorganiske salte indbefatter f.eks. phosphater af magnesium, kalium, calcium eller natrium. De ovennævnte næringsstoffer til dyrkningsmediet kan suppleres med f.eks.et eller flere vitaminer af B-grup-pen og/eller et eller flere sporstoffer, såsom Fe, Mo, Cu, Mn 35 og B efter ønske. Vitaminerne eller sporstofferne er ikke nød- DK 169560 B1 7 vendige, når der sættes en ringe mængde gærekstrakt til mediet. Tilsætning af et antibiotikum, såsom chloramphenicol eller chlortetracyklin kan være ønskelig, når bakterieforurening er et problem.

5 Dyrkningen af mikroorganismen kan udføres som en stationær kultur eller som en neddykket, (dvs. rystekultur eller kultur i forgæringsbeholder) under aerobe betingelser. Man kan hensigtsmæssigt arbejde i pH-intervallet fra ca. 2,5 til ca. 9,0 og fortrinsvis i intervallet fra ca. 3,0 til ca. 7,5 og bedst 10 mellem ca. 3,0 og ca. 6,5. pH-værdien kan reguleres ved tilsætning af uorganiske eller organiske syrer, såsom saltsyre, eddikesyre og oxalsyre eller ved tilsætning af baser, såsom natriumhydroxid og ammoniumhydroxid eller ved tilsætning af en stødpude, såsom phosphat eller phthalat. Inkubationstemperatu-15 ren skal hensigtsmæssigt holdes mellem ca. 12°C og ca. 33°C, idet et interval mellem ca. 15°C og ca. 30°C foretrækkes og et interval mellem ca. 18°C og ca. 28°C er det mest foretrukne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan bekvemt udføres ved at sætte en eller flere af forbindelserne 4 til 14 til nærings-20 mediet ved begyndelsen af dyrkningen, som eneste carbonkilde. Alternativt kan substratet tilsættes i kombination med en anden carbonkilde, såsom dextrose, enten under dyrkningen, eller når carbonkilden er udtømt. Den eneste begrænsning på koncentrationen af substrat i dyrkningsmediet er, at man skal være i 25 stand til effektivt at lufte kulturen. Substratkoncentrationen er dog fortrinsvis i intervallet mellem ca. 0,1 g/1 og ca. 100 g/1, og mere foretrukket i intervallet mellem ca. 0,5 g/1 og ca. 50 g/1, og bedst i intervallet mellem ca. 1,5 g/1 og ca.

30 g/1. Omdannelsen kan hensigtsmæssigt udføres under enhver 30 af de ovennævnte betingelser.

Den totale omdannelsestid (efter indledende dyrkningsperiode) kan variere med sammensætningen af næringsmediet og substratkoncent rat ionen. I almindelighed kræver rystef laskekul turer fra ca. 12 timer til ca. 264 timer. Når der anvendes en for- DK 169560 Bl 8 gæringsbeholder, kan dyrkningstiden imidlertid reduceres til ca. 48 timer eller mindre.

Omdannelsen kan udføres ved anvendelse af cellerne af mikroorganismen isoleret fra kulturopløsningen, eller med et en-5 zymekstrakt isoleret af cellerne på velkendt måde. I dette tilfælde kan omdannelsen bekvemt udføres i mange forskellige vandige næringsmedier, herunder f .eks. i en stødpudeopløsning, i en fysiologisk saltopløsning, i en frisk næringsopløsning eller i vand. De isolerede celler eller enzymekstrakten kan 10 immobiliseres på en fast bærer, og den ønskede omdannelse udføres. Omdannelse af substratet kan også udføres med mutanter af denne organisme. Sådanne mutanter kan let fås på i og for sig kendte måder, f.eks. ved at udsætte cellerne for UV eller røntgenstråler, eller kendte mutagene stoffer, som f.eks.

15 acridinorange.

Substratet kan sættes til mediet som et pulver eller en opslæmning i et emulgeringsmiddel, såsom Tween-80 (polyoxyethy-lensorbitanmonostearat), eller som en opløsning i et emulgeringsmiddel eller som en opløsning i et hydrofilt opløsnings-20 middel, såsom acetone, methanol, ethanol, ethylenglycol eller dioxan. Et overfladeaktivt middel eller et dispersionsmiddel kan også sættes til en vandig suspension af substratet, og substratet kan emulgeres under anvendelse af ultralyd.

Sædvanlige anti-skummemidler, såsom siliconeolier (f.eks.

25 UCON) polyalylenglycolderivater, majsolie eller sojaolie kan anvendes til at regulere skumning.

Omdannelsen af substratet kan overvåges ved hjælp af standard analytisk teknik, såsom GLC, TLC, HPLC, IR og NMR. Hvis en hurtig forsvinden af substratet iagttages, kan mere substrat 30 tilsættes for at maksimere omdannelseskapaciteten af mikroorganismen. Processen er i almindelighed afsluttet, når det meste af substratet er forsvundet fra kulturmediet. Forbindelse 3 kan udvindes fra det vandige næringsmedium eller kan cykli- DK 169560 B1 9 seres til furanforbindelsen 2, enten i det vandige næringsme-diun eller efter udvinding. Isolering og rensning af forbindelserne 1 eller 3 fra forgæringsvæsken kan opnås ved sædvanlig teknik, herunder filtrering eller centrifugering, ekstrak-5 tion med opløsningsmiddel, destillation, krystallisation og lignende. Forbindelse 3 kan omdannes til furanforbindelsen 1 ved sædvanlige cykliseringsmetoder, der er velkendte. Det kan f.eks. være reaktion af diol 3 med toluen-p-sulfonylchlorid i pyridin ved 0°C efter fremgangsmåden, der er beskrevet af Cam-10 bie med flere (se Aust. J. -Chem., 1971, 24, 591). Denne fremgangsmåde kan eventuelt anvendes enten på omdannelsesblandingen eller på den udvundne diolforbindelse 3. Eksempler på andre cykliseringsmetoder er beskrevet af R.B. Wagner og H.D. Zook i "Synthetic Organic Chemistry", John Wiley, 1965, side 15 838-839.

Mikroorganismen, der anvendes ifølge opfindelsen, blev isoleret af en jordprøve fra det centrale New Jersey, i De Forenede Stater. Denne stamme er blevet deponeret hos Centralbureau voor Schimmelculture og the American Type Culture Collection 20 med deponeringsnumrene henholdsvis CBS 214.83 og ATCC 20624.

Organismen blev undersøgt og karakteriseret af Centralbureau voor Schimmel Cultures (CBS) . På grund af den lyserøde farve af dens kolonier og dens enestående morfologiske og fysioke-miske egenskaber har CBS tildelt mikroorganismen ifølge op-25 findelsen navnet Hyphozyma roseoniger.

Denne organisme har tydelige gærformer og filamentøse former. Begge former udviser lignende biologiske egenskaber og udfører de heri beskrevne omdannelser.

Egenskaberne af gærfasen af mikroorganismen er beskrevet ne-30 denfor: 1. Form og størrelse.

Vækst på YM agar: Lyserøde skinnende glatte kolonier, filamen- 10 tøse vækstceller er knopskydende, runde eller cylindriske, ca. 2 x 7 μτα. eller somme tider større.

Vækst på maltekstraktagar: Lyserød, lejlighedsvis brunlig med dannelse af ægte hyfer efter 2 til 3 uger uden klyngeforbin-5 delser, skinnende.

Vækst på majsmelagar: lysorange til rosa skinnende. Glatte kolonier kantet med mycelium.

Vækst på kartoffeldextroseagar os difkomaltagar: lyserød, glat skinnende og bliver lejlighedsvis sort ved stuetemperatur ef-10 ter 2 til 3 uger.

Vækst på YPCA agar: Opnår en diameter på 8 mm på 10 dage, flad, slimet, blegorange (6A3! Kornerups Wanscher, 1978), med skarpe noget lappede kanter.

Vækst på ChA agar: 4 mm i diameter på 10 dage. Bliver efter 3 15 uger centralt gullig med lysebrun (6D6) til mørkebrun (5F7) til slut et neddykket mycelium, der strækker sig fra den slimede koloni og fører til en tæt olivenbrun (4F4) koloni lokalt med tynde snavsede hvide centrale pletter, senere tætte knipper af luft mycelium. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Organismen producerer ægte hyfer med anastomoser iagttaget på 2 kartoffel og risplader. Den synes at være en hyfomycetsvamp 3 med en tydelig gærfase i sit livskredsløb.

4 2. Forgæring på sukkerarter (se tabel 1) 5 TABEL 1 6

Forgæring 7

Forbindelse Gas Svre 8

Glucose 9

Galactose 10

Maltose 11

Saccharose Lactose Raffinose Melibiose Inulin DK 169560 B1 11 3. Assimilering af carbonforbindelser (se tabel 2).

TABEL 2

Assimilering af carbon-forbindelser Glucose + Lactose v 5 Galactose + Melibiose + L-carbose + Raffinose +

Maltose + Melezitose +

Saccharose + Inulin

Cellobiose + Opløselig stivelse + 10 Trehalose + D-xylose + L-arabinose + D-sorbit + D-arabinose + α-Methyl-D-glucosid + D-ribose + Salicin L-rhamnose + Inosit 15 D-glucosamin - Mælkesyre +

Ethanol + Citronsyre +

Glycerin + Ravsyre + L-erythrit + Glucono-^-lacton +

Adonit 20 Ducit D-mannit + 4. Spaltning af arbutin: positiv.

5. Assimilering af NH4N03: positiv.

6. Assimilering af KN03: positiv.

25 7. Assimilering af KN02: positiv.

8. Vækst på ethylamin: positiv.

9. Vækst på vitaminfrit medium: positiv.

10. Vækst ved 12°C: positiv.

DK 169560 B1 12 11. Vækst ved 26°C: positiv.

12. Vækst ved 30°C: positiv.

13. Vækst ved 37°C: negativ.

14. Vækst ved 45°C: negativ.

5 Egenskaberne af den filamentøse form af organismen er ligesom af gærfasen med følgende undtagelser: Vækst på YM agar: lyserøde, tu kolonier frembyder filamentøs vækst med ægte hyfer.

Vækst på maltagar og kartoffeldextroseagar: lyserøde, ru ko-10 lonier frembyder filamentøs vækst efter 2 uger ved stuetemperatur, kolonier bliver sorte.

Vækst på kartoffel og risplader: producerer ægte hyfer med anastomoser.

Vækst i flydende medium, såsom VM bouillon: lyserød frembyder 15 gæragtig vækst og lejlighedsvis noget mycelium.

Vækst på kartoffelsaccharoseagar: filamentøs med bevis for en gærfase.

Mikroorganismen Hyphozyma roseoniger, ATCC 20624, adskiller sig således fra beslægtede mikroorganismer med hensyn til 20 substratbehov og -udnyttelse og ved produkterne fremstillet ved dyrkning af mikroorganismen.

De følgende eksempler tjener til at illustrere udførelsesformer af opfindelsen, således som den nu foretrækkes praktiseret. Med mindre andet er anført er vægten i gram, temperaturer 25 i grader Celcius og tryk i mm Hg.

DK 169560 B1 13

Eksempel 1

Dette eksempel demonstrerer forgæringsprocessen under anvendelse af 2-ethenyldecahydro-2-hydroxy-o!, 2,5,5,8a-pentamethyl-1-naphthalenpropanol (4) som substrat.

5 Fire kolber, hver indeholdende en vandig opløsning (100 ml) af 0,1% NH4NO3, 0,1% Η2ΚΡ04, 0,05% MgS04, 7H20, sporstoffer og vitamin B kompleks blev steriliseret ved 120°C i 20 minutter.

En 50% vandig opløsning af- dextrose (5 ml) og Tween-80 (0,1 ml) indeholdende Sclareol (4) (10 mg) blev sat til hver kolbe.

10 Hver kolbe blev podet med 5 rumfangs% af tre dage gamle celler CBS 214.83 (ATCC 20624). Kulturerne blev så inkuberet ved 25+1°C på roterende ryster (200 omdrejninger pr. minut) i 3 til 4 dage. Efter den første inkubationsperiode blev en blanding af Sclareol opløst i Tween-80 (8,0 g) tilsat portionsvis 15 under de næste 5 dage, hvorefter inkubationen blev fortsat i yderligere 4 dage. Efter endt inkubationsperiode blev indholdet af de fire kolber forenet, ekstraheret med ethylacetat (3 x 200 ml) og tørret (Na2S04). Afdampning af opløsningsmidlet gav en rå ekstrakt (4,0 g), som blev krystalliseret af hexan/-20 chloroform til dannelse af decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetra-methylnaphthalenethanol (3) (2,4 g), smeltepunkt 130,5 til 131,5°C (litteraturen 132-133°C) GLC renhed 100%, H-NMR (CDCI3) δ 0,79 (6H, 2S) , 0,87 (3H, 2), (3H, 2), 09-20 (16H, m), 3,41-3,49 (IH, m) , 3,72-3,79 (IH, m) . IR (CHCI3) vmax 25 3580, 3360, 2950, 1460, 1380 cm. MS m/e 236, 221, 117, 137, 109. [a]f2 =-16,8° (CHCI3) . [Litteratur 132-133°C [a]22'5 = -17,3° (CHCI3)]. [Se M. Stoll og M.Hinder Helv. Chim. Acta (1953) 36, 1955-2008] .

Eksempel 2 30 Dette eksempel viser effektiviteten af forgæringsprocessen under anvendelse af forskellige mængder Sclareol (4) som substrat .

14

Der blev anvendt en fremgangsmåde svarende til den, der er beskrevet i eksempel 1 med undtagelse af, at der blev anvendt gærekstrakt (0,1 g) i stedet for sporstofferne og vitaminerne, og at Sclareolen (4) blev omkrystalliseret af hexaner, pulve-5 riseret, ført gennem en 50 mesh sigte og derpå blandet med en lige så stor vægtmængde Tween-80. Efter en første inkubationsperiode på fire dage blev blandingen af Sclareol (4) og Tween-80 sat til hver kolbe i trinvis voksende mængder gennem en periode på 5 dage, og blev derefter inkuberet i 4 dage. Tabel 3 10 viser den mængde Sclaerol (4), der blev sat til hver kolbe, og udbyttet af isoleret diol 3. Hvert produkt udviste spektraldata identiske med de, der er angivet i eksempel 1.

TABEL 3

Samlet vægt af Sclareol (4) Isoleret udbytte af diol 3 15 Kolbe g % 12 81 2 3 74 3 5 71 20 Eksempel 3

Dette eksempel viser virkningsgraden af forgæringsprocessen under anvendelse af hvilende celler (vaskede).

Der blev anvendt en lignende fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 med undtagelse af, at efter en første inkubationspe-25 riode på 3 dage blev cellerne fra 100 ml kulturbouillonhøstet og vasket (3 x 25 ml) med 0,3 x 10"4 M phosphatstødpude pH = 7,2) og skilt ved centrifugering. De vaskede celler blev dis-pergeret i ovennævnte stødpude (100 ml) og inkuberet ved 23±1°C på roterende ryster (200 omdrejninger pr. minut) i 7 30 dage. Sclareol (0,5 g) opløst i Tween-80 (5 g) blev sat i trinvis stigende mængder til suspensionen af celler under de første 4 inkubationsdage. Efter endt inkubationsperiode viste DK 169560 B1

IS

TLC-overvågning, at al Sclareolen (4) var blevet omdannet til diolen 3. Oparbejdning på sædvanlig måde gav diol 3 i et udbytte på 98% og en GLC renhed på 99%. Spektraldataene for dette produkt var identiske med de, der er nævnt i eksempel 1.

5 Eksempel 4

Dette eksempel viser forgæringsprocessen under anvendelse af hver af forbindelserne 4 til 14 som substrater til fremstilling af decahydro-2 -hydroxy-2,5,5,8a- tetramethylnaphthalen-ethanol (3).

10 11 kolber, hver indeholdende en vandig opløsning (100 ml) af det i eksempel 2 beskrevne medium, blev steriliseret ved 120°C i 20 minutter. En 50% vandig opløsning af dextrose (4 ml) og Tween-80 (0,1 ml) indeholdende 10 mg tilsvarende substrat blev sat til hver kolbe. Hver kolbe blev så podet med 5 rumfangs% 15 af 3 dage gamle·.-celler af CBS 214.83 (ATCC 20624), og kulturerne blev så inkuberet ved 24±1°C på roterende ryster (200 omdrejninger pr. minut) i 3 dage. Efter den første inkubationsperiode blev en blanding af substrat opløst i Tween-80 (forhold 1:7 w/w). sat til hver tilsvarende kolbe, hvorefter 20 inkubationen blev fortsat i flere dage (se tabel 4). Forløbet af omdannelserne blev overvåget med TLC. Efter afslutning af inkubationsperioderne blev indholdet af hver kolbe ekstraheret med ethylacetat (3 x 75 ml) , ekstrakterne tørret (Na2S04) og opløsningsmidlet afdampet. Remanenserne blev hver for sig ren-25 set ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af he-xan/isopropan (95/5) som opløsningsmiddel, og udbytterne af diol 3 blev bestemt. Data for de 11 forsøg er opsummeret i tabel 4.

TABEL 4 30 Produktion af forbindelse 3 med CBS 214.83 (ATCC 20624) under anvendelse af forskellige substrater.

16 DK 169560 B1

Total inkubation Udbytte af

Substrat_(q/100 ml) tid (dage)_diol 3 (%)

Forbindelse 4 0,3 7 96

Forbindelse 5 0,3 11 89 5 Forbindelse 6 0,3 7 91

Forbindelse 7 0,2 10 51

Forbindelse 8 0,2 10 13

Forbindelse 9 0,2 10 7

Forbindelse 10 0,3 7 98 10 Forbindelse 11 0,3 6 100

Forbindelse 12 0,3 11 91

Forbindelse 13 0,24 8 98

Forbindelse 14_0,5_4_100

Eksempel 5 15 Dette eksempel viser en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne 7, 8 og 9, der kan anvendes som substrater til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

En opløsning af Sclareol (9,24 g, 0,03 mol) i methylenchlorid (40 ml) blev i en portion sat til en blanding af pyridinium-20 chlorchromat (12,93 g, 0,06 mol), natriumacetat (2,46 g, 0,03 mol) og methylenchlorid (100 ml) . Blandingen blev omrørt i 4 timer ved 25°C. Ether (200 ml) blev tilsat og den overliggende væske blev dekanteret fra det gummiagtige bundfald. Bundfaldet blev vasket med ether (3 x 50 ml) . Den etheriske opløsning 25 blev ført gennem silicagel 60 (40 g) og opløsningsmidlerne af-dampet. Remanensen blev opløst i ethanol (2 ml) og ether (4 ml) og omrørt ved 25°C med en opløsning af natriumbisulfit (15 g) i vand (60 ml) i 3 timer. Blandingen blev ekstraheret med ether (2 - 30 ml). Det vandige lag blev gjort basisk med 10% 30 natriumhydroxid og ekstraheret med ether (4 x 50 ml) . Ether-ekstrakteme blev tørret (Na2S04) og opløsningsmidlet af dampet til dannelse af 2,72 g remanens. Kromatografi på silicagel 60 (70 g, elueringsmiddel, hexan: ethylacetat 4:1) gav 0,74 g i _______ DK 169560 B1 17 trans-aldehyd 7, 0,69 g cis-aldehyd 8, og 0,64 g cykliske aldehyder 9. [ (E) -lR(la,2/3,4a/3,8aa) ] -5-(decahydro-2-hydroxy-2, -5,5,8a-tetramethyl-l-naphthalenyl) -3-methyl-2-pentenal (7), smp. 83-85°C, [a]D + 14,2° (c, 5,76, CHCl3); 1H-NMR (CDCI3) 6 5 0,78 (6H, s), 0,86 (3H, s), 1,17 (3H,s), 2,15 (3H, bred s), 0,8 - 2,5 (17H, m), 5,82 (IH, d, J = 8 Hz), 9,98 (IH, d, J = 8 HZ; IR (CHCI3) Vmax 3570, 3440, 2940, 2850, 1670, 1630, 1460, 1440, 1390 cm"1; MS, m/e 306, 291, 273, 109, 95, 84; UV Xmax (95% ethanol) 241 nm (beregnet 231 nm) (e, 17,300). Analyse.

10 Beregnet for C20H34O2: c> 78,37; H, 11,18. Fundet: C, 77,92, H, 11,02 [(Z)-lR(la,2jS,4aji?,8aa)]-5-(decahydro-2-hydroxy-2,5,-5,8a-tetramethyl-l-naphthalenyl) -3-methyl-2-pentanal (8), smp. 91-93,5°C [a]D + 8,9 (c, 3,13, CHCI3); ^I-NMR (CDCI3) δ 0,78 (6H, s) 0,87 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,98 (3H, bred s), 0,9 -15 2,8 (17H, m) , 5,75 (IH, d, j = 8 Hz), 10,0 (IH, d, J = 8 Hz); IR (CHCI3) 3570, 3450, 2940, 2840, 1670, 1630, 1460, 1440, 1390, cm"1; MS m/e 306, 273, 109, 95, 84; UV V8,23 Xmax (95% ethanol) 242 nm (beregnet 231 nm) (e, 13,000). Analyse. Beregnet for C20H34O2: C, 78,37; H 11,18. Fundet : C, 7834, H, 20 11,02. [4aR- (4aa,6a/3,10ao!,10b/3) ] -dodecahydro-3,4a, 7,7,10a-pen-

tamethyl-lH-naphtho [2,1-b]pyran-l-acetaldehyd (9), 1H-NMR

(CDCI3) δ 0,78 (6H, s), 0,85 (3H, s), 1,25 (3H, s); IR (film) i/max 2940, 2850, 1720, 1460, 1440, 1380, 1370 cm"1; MS, m/e (to toppe med lignende ms) 291, 273, 262, 245, 109,43.

25 Eksempel 6

Dette eksempel viser en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelse 10, der kan anvendes som substrat ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til en suspension af natriumhydrid (0,72 g 50% suspension, 30 0,015 mol, vasket fri for mineralolie med hexan) i dimetho- xyethan (15 ml) blev sat en opløsning af ethyldi isopropyl-phosphonoacetat (3,78 g, 0,015 mol) i dimethoxyethan (30 ml) i løbet af 10 minutter. Efter at hydrogenudviklingen var ophørt blev [IR- (la,2j8,4ajS,8ao!) ] -4 (2-acetyloxy-decahydro-2,5,5,8a- 18 DK 169560 B1 tetramethyl-l-naphthalenyl)-2-butanon (3,22 g, 0,01 mol, der kan fremstilles som beskrevet af J.A. Barltrop med flere, i J. Chem. Soc., I960, 4613) tilsat på en gang. Blandingen blev opvarmet under tilbagesvaling i 21 timer, derpå afkølet og hældt 5 på isvand (100 ml) . Blandingen blev syrnet med 6N saltsyre og ekstraheret med hexan/ethylacetat (4:1, 4 x 10 ml) . De organiske ekstrakter blev vasket med vand (2 x 10 ml), mættet natri-umbicarbonatopløsning (2 x 15 ml) og tørret (Na2S04). Opløsningsmidlerne blev af dampet og remanensen kromatograferet (si-10 licagel 60; elueringsmiddel, hexan:ethylacetat, 9:1) til dannelse af 3,02 g ethyl [ (E,Z) -IR- (la,2/?,4a/3, 8aa) ] -5 (2-acetyloxy-decahydro-2,5,5,8a-tetramethyl-l-naphthalenyl)3-methyl-2-pen-tenoat som en farveløs viskos olie.

En blanding af ethyl [ (E,Z)-IR-(la,2jS,4a/3,8aa) ]-5-(2-acetyl-15 oxy-decahydro-2,5,5,8a-tetramethyl-l-naphthalenyl) -3-methyl-2-pentenoat 2,19 g, 0,00557 mol), isopropanol (65 ml), vand (10 ml) og kaliumhydroxid (1,47 g, 0,0223 mol) blev opvarmet under tilbagesvaling i 24 timer. Blandingen blev koncentreret til 20 ml, og 50 ml vand blev tilsat og blandingen blev eks-20 traheret med ether. Den vandige fase blev syrnet med 6N HC1 og ekstraheret med ether (5 x 20 ml). Etherekstrakterne blev vasket med saltvand, tørret (Na2S04), og opløsningsmidlerne af-dampet til dannelse af 1,781 g råt produkt. Kromatografi på silicagel 60 (elueringsmiddel, hexan:isopropanol, 9:1) gav 25 0,455 g den cis-isomere, og 1,223 g af den trans-isomere 10.

Omkrystallisation af hexan/ethylacetat gav analytiske prøver [ (Z) -IR- [la, 2jS, 4ajS, 8aa) ] -5- (decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1- naphthalenyl)-3-methyl-2-pentensyre, smp. 147-149°C; [aJD +62,96° (c, 4,66, CHCl3); ^NMR (CDCI3) δ 0,81 30 (6H, S), 0.88 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,92 (3H, bred s), 0,9 -

2,4 (17H, m), 5,72 (IH, bred s), 6,8 - 7,3 (IH, v, bred s); IR

(CHCI3) Vmax 3500, 3400, 2940, 2550, 1690, 1640, 1460, 1440 cm"1; MS, m/e 322, 304, 289, 276, 109; UV Xmax (95% EtOH) 228 nm (beregnet 217 nm) (e, 7300) . Analyse, beregnet for 35 C20H34O3: C, 74,49; H, 10,63. Fundet C, 74.20; H, 10.40.

[ (E) -IR- (la,2jS,4a)3,8aa) ] 5- (decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetra- I ^- DK 169560 B1 19

methyl -1-naphthalenyl}-3met hyl-2-pentensyre, smp. 151-153°C

[a]D 9,44° (c, 4,83, CHC13) ^H-NMR (CDCI3) δ 0,79 (6H, s), 0,87 (3H, s), 1,15 (3H, s), 2,17 (3H, bred s) 0,9 - 2,4 (17H, m) , 5,70 (IH, bred s), 5,8 - 6,1 (IH, bred s); IR (CHCI3) vmax 5 3560, 3400, 2940, 2550, 1690, 1640, 1460, 1440 cm-1; MS, m/e 322, 304, 289, 276, 109; UV Xmax (95% EtOH) 230 nm (beregnet 217 nm) (e, 5700). Analyse, beregnet for C20H34°3: C 74'49'· H' 10,63. Fundet C, 74,12; H, 10,52.

Eksempel 7 10 Dette eksempel viser en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelse 11, der kan anvendes som et substrat til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til en opløsning af diisopropylamin (8,484 g, 0,084 mol) i te-trahydrofuran (90 ml) ved 0°C blev sat n-butyllithium (38,2 ml 15 af en 2,2 M hexanopløsning, 0,084 mol) dråbevis i løbet af 20 minutter. En opløsning af eddikesyre (2,52 g, 0,042 mol) i te-trahydrofuran (20 ml) blev tilsat i løbet af 15 minutter. Blandingen blev så opvarmet til 50°C i 45 minutter. Blandingen blev afkølet til 25°C og [IR-(la,2/3,4a|8, 8aa) 4-(2-acetyloxy-de-20 cahydro-2,5,5,8a-tetramethyl-l-naphthalenyl)-2-butanon (4,508 g, 0,014 mol, der kan fremstilles som beskrevet af J.A. Barl-trop med flere., i J.Chem. Soc. 1960, 4613) i tetrahydrofuran (35 ml) blev tilsat i løbet af 10 minutter. Blandingen blev omrørt ved 25°C i 17 timer og derpå opvarmet under tilbagesva-25 ling i 30 minutter. Blandingen blev afkølet til 25°c, hvorefter der blev tilsat vand (40 ml) og kaliumhydroxid (5 g) . Blandingen blev opvarmet under tilbagesvaling i 4 timer, derpå afkølet, sat til vand (100 ml) og ekstraheret med hexan/ethyl-acetat (4:1) (3 x 30 ml). Det vandige lag blev afkølet til 30 0°C, syrnet med 6N HC1, og ekstraheret med hexan/ethylacetat (4:1, 4 x 50 ml) . De forenede ekstrakter blev vasket med saltvand, tørret (Na2S04) og derpå blev opløsningsmidlet afdampet til dannelse af 2,071 g råt produkt. Kromatografi på silicagel 60 (elueringsmiddel, hexan:ethylacetat:eddikesyre (10:10:0,1)) DK 169560 B1 20 gav 1,434 g syre 11. Krystallisation af hexan/ethylacetat gav en analytisk prøve, snip. 136-137,5°C, 1H-NMR (CDCI3) δ 0,76 (6H, s), 0,85 (3H, s), 1,16 og 1,19 (3H, 2s), 1,28 (3H, s) , 0,8 - 1,9 (16H, m), 2,4 - 2,8 (2H, m), 6,1 - 6,6 (2H, bred s); 5 IR (CHCI3) vmax 3550, 2930, 2700, 1710, 1455, 1385 cm"1; MS m/e 340, 304, 289, 109, 95, 43. Analyse, beregnet for C20H36°4: C 70/54; H 10/66. Fundet C 70,99; H 10,63.

Eksempel 8

Dette eksempel viser omdannelsen af a-ethenyl-decahydro-2-hy-10 droxy-a,2,5,5,8a-pentamethyl-l-naphthalenpropanol (4) til do-decahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,l-b]furan (l) under anvendelse af en fremgangsmåde i to trin.

Der blev anvendt en lignende fremgangsmåde som den, der er beskrevet i eksempel 2 med undtagelse af, at der blev anvendt 7 15 kolber, og at mængden af Sclareol (4) sat til hver flaske og inkubationsperioden blev varieret (se tabel 5) . Når inkubation var afsluttet blev kolberae oparbejdet hver for sig, og der fremkom 7 prøver af rå diol 3. Hver prøve blev for sig bragt til at reagere med toluen-p-sulfonylchlorid i pyridin efter 20 fremgangsmåden ifølge Cambie med flere (se Aust. J. Chem., 1971, 24, 591) og hvert reaktionsprodukt blev kuglerørsdestil-leret til dannelse af furan l. 1H-NMR (CDCL3) 0,83 (6H, 2s), 0,88 (3H, s), 09 - 1,8 (13H, m) , 1,9 - 2,0 (IH, m), 3,77 - 3,92 (2H, m). IR (smelte) vmax 2940, 1460, 1385, 1365 cm"1, MS 25 m/e 236, 221, 204, 177, 137, 97. Data for de 7 forsøg er opsummeret i tabel 5.

TABEL 5

Produkt 1 Vægt af Sclareol (4) Total Inkubation *Udbytte GLC renhed 30 Kolbe_mg_Tid_(dage)_(mg)_(%J_ 1 160 7 115 95 2 240 8 169 97 DK 169560 B1 21 3 320 9 220 97 4 400 10 270 93 5 400 14 258 96 6 560 14 361 97 5 _7_720_14_468_97 * Udbyt terne tager ikke i betragtning de prøver, der er udtaget under overvågningen.

Eksempel 9

Dette eksempel viser den direkte cyklisering af omdannelses-10 produktet decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalen-ethanol (3) uden adskillelse fra det vandige næringsmedium til dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho[2,1-b] furan (1).

En lignende fremgangsmåde som den, der er beskrevet i eksempel 2 under anvendelse af Sclareol (2,0 g) som substrat i 100 ml 15 forgæringsvæske blev anvendt. Efter en samlet inkubationstid på 14 dage blev kolbens indhold overført til en reaktionsbeholder udstyret med omrøring og opvarmning under tilbagesvaling. Toluen-p-sulfonylchlorid (2,48 g), natriumhydroxidkugler (25 g) og tetrahydrofuran (200 ml) blev tilsat og blandingen 20 omrørt ved 20°C. Efter 5 timer blev yderligere toluen-p-sulfo-nylchlorid (1,50 g) tilsat, og reaktionsblandingen blev omrørt natten over. Næste dag blev blandingen opvarmet under tilbagesvaling i 30 minutter, afkølet og ekstraheret med ethylacetat (3 x 100 ml). De forenede ekstrakter blev tørret (Na2S04). Op-25 løsningsmidlerne blev afdampet og remanensen kuglerørsdestil-leret til dannelse af 1,38 g af et fast stof, som ifølge instrumentanalyse indeholdt 85% dodecahydro-3a,6,6,9a-tetrame-thylnaphtho-[2,l-b]furan (1) .

Eksempel 10 30 Dette eksempel viser en alternativ fremgangsmåde til direkte cyklisering af omdannelsesproduktet decahydro-2-hydroxy-2,5,

Claims (13)

1. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Hyphozyma roseo-niger, kendetegnet ved, at den har deponeringsnum- DK 169560 B1 mer ATCC 20624 eller mutanter deraf, som har de identificerende egenskaber af ATCC 20624, dvs. er i stand til at producere en diol med formlen <3, 5 eller en furan med formlen. i en udvindelig mængde efter omdannelse af forbindelser af gruppen bestående af /Ψ CHj-CTO R ς&· hvor R er OH OH OH CHO -CH2-^i^c02H ;H0 OH -CH2-^Y^CooH DK 169560 B1 ^ X- -CH2-^^Y eller -CH2 0 under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium.

2. Kultur ifølge krav 1 i frysetørret form.

3. Blanding fremstillet ved dyrkning af mikroorganismen Hy-5 phozyma roseoniger ifølge krav 1-2 under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium.

4. Blanding ifølge krav 3, kendetegnet ved, at fremstillingen er foretaget ved (i) pH-værdier på mellem ca. 2,5 og ca. 9,0, og 10 (ii) temperaturer på mellem ca. 12°C og ca. 30°C.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af blandingen ifølge krav 3-4, kendetegnet ved dyrkning af en mikroorganisme ifølge krav 1-2 under aerobe betingelser i et vandigt nærings-medium.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at (i) pH-værdien er mellem ca. 2,5 og ca. 9,0, og (ii) temperaturen er mellem ca. 12°C og ca. 30°C.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en diol med formlen 20 rp-OH <3) eller en furan med formlen (1) DK 169560 B1 {l) kendetegnet ved, at mikroorganismen Hyphozyma rose-oniger ifølge krav 1-2 dyrkes under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende en eller flere forbindelser 5 af gruppen bestående af ^>s1/ch2-cho r φ ζο*1« qO·*« hvor R er °H OH -CH -CH OH CHO -CH2^h^C°2H -CH2-^Y ‘ -CHj^^NzHO OH *“CH 2/^Vv|^Ss‘C00H “CH 00H 0 €ller 0 hvorefter diolen om ønsket udvindes, eller diolen om ønsket cycliseres i det vandige næringsmedium til dannelse af den tilsvarende furan, og udvinding heraf.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at der fremstilles en diol med formlen ct? " DK 169560 B1

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at diolen udvindes.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at 5 (i) pH-værdien er mellem ca. 2,5 og ca. 9,0, og (ii) temperaturen er mellem ca. 12°C og ca. 30°C.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at der fremstilles en furanforbindelse med formlen (l)

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man efter dannelsen af diolen indstiller pH-værdien af det vandige næringsmedium til mellem ca. 1 og ca. 3 til dannelse af den tilsvarende furanforbindelse og udvinder furanforbin-delsen.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den dannede diol fraskilles, hvorefter diolen cycliseres til dannelse af den tilsvarende furanforbindelse, og furanforbindelsen udvindes. 20