JP2002537770A

JP2002537770A - フレーバー／芳香材料およびそれらの製造

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Publication number: JP2002537770A
Application number: JP2000601185A
Authority: JP
Inventors: サミュエルジェームズチータム，ピーター; ローレイングラッドリー，ミッシェル; トーマスサイム，ジョン
Original assignee: ジレプシスリミティド
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2002-11-12
Also published as: CN1348499A; WO2000050622A1; CA2365037A1; GB0004393D0; AU2683700A; GB2347424A; GB9904251D0; US6844019B1; EP1155137A1

Abstract

(57)【要約】フレーバー成分、特にバニラ組成物のためのものが、植物由来の材料の生体内変換を使用する、本質的に天然の方法によって製造される。直接または間接的に、フェルラ酸（多くの植物細胞壁の成分）を、バニリンに変換することができる。複数のこのような化合物が生体内変換を受けて、フレーバー組成物の成分を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景本発明は、フレーバー／芳香材料、およびこのような材料、および重要な中間
体の製造に関する。それは、（制限的ではないが）特にバニラ・フレーバー材料
および関連する材料に関する。

【０００２】天然のバニラ豆抽出物の供給は、供給の不足および品質における変動という欠
点を有する。最近１０〜１５年にわたって商業的に利用可能となった広範囲にわ
たる天然のフレーバー化学物質にもかかわらず、完全に満足な天然のバニリンフ
レーバー化学製品またはバニラフレーバーは、未だに開発されていない。費用効
果の高い（cost-effective）バニリン製品の開発における主な困難性は、第一に
、好ましい原料、フェルラ酸が利用できないことであり；および第二に、その更
なる代謝（例えば、バニリン酸への）の容易性のため、および細胞の代謝に対す
るその阻害効果のために、バニリンを蓄積することができる微生物の株を見出す
ことが困難性なことである。天然のバニラフレーバーの開発における主な困難性
は、バニラ豆抽出物の優れた芳香およびフレーバーに一緒に寄与する異なる化学
物質が多数であることである。加えて、フレグランスにおけるバニラのマイナー
な使用量のために、着色したエタノール−水バニラ豆抽出物よりも、無色固体の
製品が必要とされている。

【０００３】我々の以前の出願ＷＯ−Ａ−９６／３９８５９号は、植物材料の酵素加水分解
による、いくつかのフェノール性物質の製造を開示している。このように、フェ
ルラ酸（１ａ）は、コムギ麦芽または「ふすま」（wheat bran）の酵素処理によ
って製造された。カフェー酸（caffeic acid）（１ｂ）は、ひまわりミールの酵
素処理によって製造された。フェルラ酸およびそのエステルは、前駆体化合物と
して、および食品および化粧品の成分としても価値がある（例えば酸化防止剤と
して役立つ）。

【０００４】

【化２】

【０００５】種々の研究は、直接的に（例えば、ＤＥ−Ａ−１９５３２３１７号）または、
バニリン酸（２）を介する（ＦＲ−Ａ−２７２４３９４号）フェルラ酸（１ａ）
のバニリン（３）への微生物的変換を報告して来た。

【０００６】発明の概要本発明は、とりわけ、式（Ａ）の一つ以上の種を含む第１の組成物を、式（Ｂ
）の一つ以上の種を含む第２の組成物に変換する方法であって、

【０００７】

【化３】

【０００８】｛式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ’およびＹ’は、Ｈ、ＯＨおよびＯＭｅから独立に選ばれ；
Ｚは、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２carb（式中、carbは炭水化物残基を表す）、ＣＨＯまた
はＣＨ_２ＯＨであり、ＱはＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、またはＣＨ_２ＯＨである｝前記方法は、（Ａ）が（Ｂ）に変換される条件下で、前記第１の組成物を一つ
以上の微生物で処理することを含み；前記一つ以上の微生物が、（ａ）シュード
モナスプチダ；（ｂ）フェルラ酸をバニリン酸に変換できるロドトルラ（Rhod
otorula）種および他の酵母；（ｃ）それらがフェルラ酸グリコシドをバニリン
および／又はバニリン酸に変換することができるように、フェルラ酸エステラー
ゼ活性および内部（intra）側鎖開裂活性を有する微生物；および（ｄ）バニリ
ン酸をバニリンに変換することができるミクロムコール（Micromucor）イザベ
リヌスまたはアスペルギルスフミガーツス株から選ばれる方法。

【０００９】その方法は、ａ）植物材料を処理して、フェルラ酸エステルを含む溶液を製造
すること；および（ｂ）フェルラ酸エステルがフェルラ酸に変換される条件下で、フェルラ酸エ
ステラーゼ活性を有する酵素組成物で、その溶液を処理すること；を含むプロセスによって、植物材料から、フェルラ酸を含む前記第１の組成物を
得る予備的なステップを含むことができる。それらのエステルは、一般に、時々
グリコシドと称される炭水化物残基（特に、糖残基）を含むことに注意すべきで
ある。

【００１０】本発明は、本発明の方法において有用な、数種の微生物を更に提供する。これ
らは、寄託された数種の株およびその変異体を含む（それらは、化学的または他
の通常の突然変異誘発により、または遺伝子工学により製造することができる）
。抽出物および単離された酵素のみならず、生物体そのまま（intact）をも使用
することができる。

【００１１】本発明の面は、以下のものを含む。

【００１２】Ａ）複数のフレーバー／芳香成分を含むフレーバー／芳香組成物の製造用のプ
ロセスであって、前記プロセスは、下記の１以上のステップを有する、（ｉ）植物材料または複数の植物植物材料を処理して、前駆体化合物、好まし
くは複数の前駆体化合物（別個に、または混合物で）、好ましくは２つ以上の１
−フェニルアルケン種（species）、好ましくは式（４）：

【００１３】

【化４】

【００１４】｛式中、ＸおよびＹが独立にＨ、ＯＨおよびＯＭｅから選ばれ、ＺはＣＯ_２Ｈ、
ＣＯ_２carb（式中、carbが炭水化物残基を表す）、ＣＨＯまたはＣＨ_２ＯＨであ
り；最も好ましくは化合物（４）の式中、Ｘ＝ＯＭｅ、Ｙ＝ＯＨ、およびＺ＝Ｃ
Ｏ_２Ｈである化合物（フェルラ酸）、および好ましくは、Ｘ＝Ｈ、Ｙ＝ＯＨ、お
よびＺ＝ＣＯ_２Ｈである化合物（クマリン酸）、およびＸ＝ＯＨ、Ｙ＝ＯＨおよ
びＺ＝ＣＯ_２Ｈである化合物（カフェー酸）を含む｝を含むものを製造し；およ
び好ましくは、ｉｉ）前記前駆体化合物または複数の化合物を（植物材料残渣から分離し、ま
たは分離せずに）生体内変換に供して、フレーバー／芳香組成物を製造すること
。置換基−ＣＨ：ＣＨ−ＣＯ_２Ｈを有するベンゼン環を有する前駆体化合物（例
えば構造（４）の化合物）については、生体内変換は、この置換基が−ＣＯ_２Ｈ
および／又はＣＨ_２ＯＨおよび／又は−ＣＨＯに変換された化合物を生成するこ
とができる。

【００１５】ここで用いる「植物材料」は、植物の機械的プロセシングによって製造される
ミールまたはパルプ、およびシードオイル抽出の後に残される残渣等の材料を含
む。

【００１６】ステップ（ｉ）のための特に好ましい植物材料は、トウモロコシ、小麦、米、
砂糖大根およびその部分、特にそれらの正常な使用からの廃棄物（例えば、米ぬ
かおよび穀物繊維）を含む。例えば、トウモロコシ繊維および小麦繊維は、乾式
または湿式ミリングから得ることができる。砂糖大根繊維は、パルプから得るこ
とができる。植物材料の混合物は、前駆体の所望の混合物を得るために使用する
ことができる。

【００１７】ステップ（ｉ）は、以下を含むことができる：（ａ）酸（好ましくはクエン酸、例えばレモンまたはライムジュースの添加に
よって与えられる）により、植物材料（湿った（damp）、または乾燥した）を処
理して、少なくともにフェルラ酸グリコシドを放出させること（一般に、例えば
５０〜２５０℃に加熱）；および、（ｂ）塩基（例えばアルカリ金属重炭酸塩）またはフェルラ酸エステラーゼ（
「ＦＡＥ」）活性を有する一つ以上の酵素によりグリコシド含有混合物を処理し
て、フェルラ酸を放出させること。適当な酵素は、ヘミセルラーゼ（Hemicellul
ase；アマノから、アスペルギルスｓｐｐ．に由来する）、および／又はセルザ
イム（Celluzyme；ノボノルディスク）、および／又はフミコーラインソレ
ンス（Humicola insolens）からの酵素（ペントパン（Pentopan）、バイオフィ
ード（Biofeed）プラスまたはバイオフィードベータ（ノボノルディスク
）として入手可能）を含む。これらの酵素は、それらのＦＡＥ活性に加えて、い
くらかのキシラナーゼ活性を有する。必要に応じて、すでに存在するキシラナー
ゼ活性を補うために、キシラナーゼの追加的な源を加えることができる。（注：
フェルラ酸その他のいわゆるグリコシドは、実際は、通常のグリコシドエーテル
よりむしろ炭水化物残基のエステルである）。

【００１８】ステップ（ａ）において、それが合理的に強く、熱に安定で、安価であり、あ
る範囲のフェルラ酸含有材料に対して活性であり、非揮発性であり、および副作
用を引き起す傾向がないため、クエン酸が適当である。それは充分に穀物の「モ
ロミ」（mashes）中で可溶である。再利用のために、それは不溶性の塩（例えば
カルシウム）として、容易に回収することができる。それは、食品使用のために
承認された「天然」の材料である。代替物は、他の有機ポリカルボン酸、特にヒ
ドロキシ酸、例えばイソクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸およびコハク酸
を含む。

【００１９】適当な酸を含む溶液、例えば酒石酸を含むブドウ由来の溶液、またはクエン酸
またはリンゴ酸を含む発酵培地等を使用することができる。

【００２０】微生物は、ステップ（ｉ）（ｂ）およびステップ（ｉｉ）（フェルラ酸および
／又は他の前駆体化合物の生体内変換）を行うために必要な活性を与えることが
できる。例えば、我々は、フェルラ酸グリコシドをバニリン酸に変換するための
ステップ（ａ）の生成物に作用するために必要なＦＡＥおよびアルケン開裂活性
を有する黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、黄色アスペルギルス（Ａ
．flavus）、およびペニシリウムクリゾゲヌムの株を開発した。

【００２１】ステップ（ｉ）は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩
または重炭酸塩等の水性アルカリで植物材料（例えばトウモロコシ繊維）を処理
することによっても、行うことができる。重炭酸ナトリウムは、好ましい。

【００２２】バニリン酸と他の材料（例えばクマリン酸からのｐ−ヒドロキシ安息香酸）を
含む生成物の混合物は、個々の成分を単離することなく、一つ以上の更なる生体
内変換を経ることができ、例えばバニリン酸をバニリンに変換し、且つ他の成分
の対応する変換を行うことができる。

【００２３】Ｂ）バニリン酸（２）のバニリルアルコール（５）への生体内変換、およびバ
ニリルアルコール（５）のバニリン（３）への生体内変換を含むバニリンの製造
。通常、これら２つのステップは、異なる微生物を使用するであろう。バニリル
アルコール等の化合物は、それら自体で価値あるフレーバー化学物質であること
ができることに注意すべきである。

【００２４】それらのステップは、それら自体で新規であることができる。バニリン酸のバ
ニリルアルコールへの還元は、ザイゴリンクスモレリによって行うことができ
る。

【００２５】Ｃ）アスペルギルスフミガーツスまたはミクロムコールイザベリヌス等の
微生物株によるバニリン酸（２）のバニリン（３）への直接的な生体内変換を含
むバニリンの製造Ｄ）例えばシュードモナスプチダの株による、フェルラ酸のバニリンへの生体内変換を含むバニリンの製造。

【００２６】

【化５】

【００２７】Ｅ）その中を生成物が通過する第２の相と接触する水相において微生物を用い
る生体内変換を行うことによる、物質、特に更に反応し易い物質（例えば、アル
デヒド）または微生物を阻害し易い物質（例えばバニリン）の製造および単離。
この「その場（in-situ）生成物除去」（「ＩＳＰＲ」）は、第２の相として植
物油を使用することができる。生成物は、例えば結晶化または溶媒抽出によって
、その後第２の相から回収することができる。ＩＳＰＲのこのプロセスは、プロ
セスＡ（上記）のステップ（ｉｉ）において、またはプロセスＢ、ＣおよびＤに
おいて使用することができる。

【００２８】Ｆ）上記の（Ａ）に従うプロセスの生成物、または一つ以上のこのような生成
物、および／又は上記（Ｂ）、（Ｄ）または（Ｅ）に従うプロセスによって製造
された一つ以上の物質、および／又は他の源および／又はバニラ豆抽出物からの
一つ以上フレーバー化学物質のブレンドである、バニラフレーバー／芳香組成物
。

【００２９】Ｇ）フェルラ酸をバニリン酸に変換するための、シュードモナスプチダの使
用。その原料は、好ましくは、穀物繊維等の植物材料を、フェルラ酸の単離なし
で、クエン酸塩と、ＦＡＥ酵素（上記のセクションＡで記述したような）により
処理することによって得られる混合物である。

【００３０】Ｈ）上述したような種々の変換を、他の基質に適用することができる。これは
、更なる有用なフレーバー／香り（odor）成分をもたらすことができる。例えば
安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸および３，４−ジヒドロキシ安息香酸を、対
応するアルデヒドおよび／又はベンジルアルコールに変換することができる。

【００３１】Ｉ）本発明のプロセス使用の微生物の株を単離する方法。多様な株を含む材料
（例えば土壌サンプル）は、例えば寒天上に多様なコロニーを与えるために用い
られ、個々のコロニーはアルデヒドを見出すことに適した試薬によって、有用な
活性を見出すためテストされる。例えば、２，４−ジニトロ−フェニルヒドラジ
ンは、アルデヒドを産生しているコロニーの周囲でオレンジ／赤色のゾーンを与
え、アルコールを産生しているコロニーの周囲で暗い黄色のゾーンを与える。

【００３２】Ｊ）方法Ｉ）によって単離された株、およびその変異体（自然には通常の突然
変異誘発によって、または遺伝子工学によって得られる）。これは、それらが、
形質転換核酸がそれらから直接または間接的に誘導された「親」生物体の活性を
誘導したように、変換された異種（heterologous）生物体を含む。

【００３３】特に好ましいいくつかの株は、ブダペスト条約の下で寄託された。簡潔な説明
は、後述する。

【００３４】ａ）ＮＣＩＭＢで寄託された株（ＮＣＩＭＢ社、２３Ｓｔマハル（Machar）
ドライブ、アバディーン、Ａ２４３ＲＹ、英国）１．ブレブンディモナスベシキュラリス（Ｚｙｌ２９５）ＮＣＩＭＢ
４０９８７−グラム陰性バクテリア（１８／１１／９８寄託）２．シュードモナスプチダ（Ｚｙｌ５０３）ＮＣＩＭＢ４０９８８−
グラム陰性バクテリア（１８／１１／９８）ｂ）ＩＭＩ（ＣＡＢＩ Bioscience UK Centre Egham、Genetic Resource Coll
ection、Bakeham Lane、Egham、サリーＴＷ２０９ＴＹ、英国）で寄託され
た株１．ロドトルラグルチニス（Ｚｙｌ７１７）−ＩＭＩ３７９８９６−赤
／オレンジのピグメントを産生する酵母、（２０／１１／９８）２．黄色アスペルギルス（Ｚｙｌ７１４）ＩＭＩ３７９８９５−ライトグ
リーンの芽胞（２０／１１／９８）を産生する糸状菌３．アスペルギルスフミガーツス（Ｚｙｌ７４７）ＩＭＩ３７９９０２
−青／灰色の芽胞を産生する糸状菌（２０／１１／９８）４．トリコデルマコニンギイ（Ｚｙｌ７５１）ＩＭＡ３７９９０３−
緑色芽胞を産生する糸状菌（２０／１１／９８）５．黒色アスペルギルス（Ｚｙｌ７５９）−ＩＭＩ３７９９０４−褐色／
黒色の芽胞を産生する糸状菌（２０／１１／９８）６．ミクロムコールイザベリヌス（Ｚｙｌ８４９）ＩＭＩ３７９８９３
−淡（pale）褐色の芽胞を産生する糸状菌（２０／１１／９８）７．ザイゴリンクスモレリ（Ｚｙｌ８５１）ＩＭＩ３７９８９９−黒色
芽胞を産生する気生の（aerial）菌糸を有する糸状菌（２０／１１／９８）８．ペニシリウムクリゾゲヌム（Ｚｙｌ８６０）−ＩＭＩ３７９９００
−青色芽胞を産生する糸状菌（２０／１１／９８）９．シュードモナスプチダ（Ｚｙｌ５８１）ＩＭＩ３８２５６８、グラ
ム陰性バクテリア；３１／１／００寄託それらの株の使用を、以下の例で説明する。もちろん、同じ種（species）の
他の株を、同じ変換を行うために使用することができる。

【００３５】いくつかの特定の例を参照して、本発明を更に詳細に説明する。

【００３６】一般的な実験的条件生物体が培養液体培地（broth）で増殖する以下の例において、その増殖培地
は、ビタミン補給剤および微量元素補給剤のいずれか、または双方の指定された
量を含むことができる。

【００３７】これらを、以下のように製造した。

【００３８】ビタミン補給剤：ビオチン（２ｍｇＬ^−１）、葉酸（２ｍｇＬ^−１）、ピリド
キシン（ｌ０ｍｇＬ^−１）、リボフラビン（５ｍｇＬ^−１）、チアミン（５ｍｇ
Ｌ^−１）、ニコチン酸（５ｍｇＬ^−１）、パントテン酸（５ｍｇＬ^−１）、ビタ
ミンＢ１２（０．ｌｍｇＬ^−１）、４−アミノ安息香酸（５ｍｇＬ^−１）、およ
びチオ酢酸（５ｍｇＬ^−１）。

【００３９】微量元素補給剤：濃塩酸（５１．３ｍＬＬ^−１）、ＭｇＯ（１０．７５ｇＬ ^−１）、ＣａＣＯ_３（２．０ｇＬ^−１）、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（４．５ｇＬ⁻ ^１）、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（１．４４ｇＬ^−１）、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ（１
．１２ｇＬ^−１）、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．２５ｇＬ^−１）、ＣｏＳＯ_４・
７Ｈ_２Ｏ（０．２８ｇＬ^−１）、およびＨ_３ＢＯ_３（０．０６ｇＬ^−１）コニフェリル（coniferyl）アルコール、コニフェルアルデヒド、カフェー酸
、クマリン酸、フェルラ酸、バニリン酸、バニリルアルコールおよびバニリンの
分析は、以下の条件を用いる高性能液体クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）を用い
て行った：カラムスフェリソーブ（spherisorb）Ｃ１８移動相１％の酢酸を含む８０：２０の脱イオン水：アセトニトリル流速１．７５ｍＬｍｉｎ^−１検出２９０ｎｍでの紫外４−ヒドロキシ安息香酸および４−ヒドロキシベンズアルデヒドの分析は、以
下の条件を用いる高性能液体クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）を用いて行った：カラムスフェリソーブＣ１８移動相１％の酢酸を含む８０：２０の脱イオン水：アセトニトリル流速２ｍＬｍｉｎ^−１検出２７５ｎｍでの紫外または、４−ヒドロキシ安息香酸および４−ヒドロキシベンズアルデヒドの分
析は、以下の条件を用いる薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）を用いて行った：
石油エーテル（４０−６０）：酢酸エチル（５０：５０）で溶出するシリカプレ
ート、およびＵＶまたはジニトロフェニルヒドラジン溶液（２ＭのＨＣｌ中の０
．４％）による可視化Ａ）植物材料の使用トウモロコシ繊維は、フレーバー／芳香材料の製造のための原料を与えること
ができる安価な原料の例である。アルカリによる処理は、フェルラ酸の遊離と、
より小量の他の材料（特にクマリン酸）をもたらす。この混合物は更なる生体内
変換に供されて、例えばバニリン酸および４−ヒドロキシ安息香酸の混合物を与
えることができ、それは更に生体内変換に供されて、例えばカルボン酸基を−Ｃ
ＨＯおよび／又はＣＨ_２ＯＨに変換することができる。

【００４０】例ｌＡ：トウモロコシからのフェルラ酸およびクマリン酸（ａ）水酸化ナトリウムの使用：摩砕された（ground）５００ｇのトウモロコ
シ繊維に、１リットルの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加え、得られた懸濁液を充
分に混合し、次いで周囲温度（２２℃）で１５時間放置した。次いで、１リット
ルの酢酸エチルと１００ｍＬの濃塩酸を加え、その懸濁液を混合した。酢酸エチ
ル相を分離し、酢酸エチルの更なる１リットルで繊維懸濁液を再抽出した。合わ
せた有機溶媒相を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、蒸発乾固して濃厚な油を得た。ｎ−
ヘキサンによりこの油を繰り返し洗浄して、３３％のフェルラ酸および２．９％
のクマリン酸を含む淡黄色の固体を得た。

【００４１】（ｂ）重炭酸ナトリウムの使用：２５０ｍｌの三角フラスコ内で、１．７５％
重量／重量（質量／質量）のフェルラ酸（ＦＡ）と、０．ｌ％重量／重量（質量
／質量）のクマリン酸（ＣＡ）を含む１０ｇのトウモロコシ繊維に、ｌ００ｍｌ
の０．５ｍ重炭酸ナトリウム溶液を加えた。得られた懸濁液を、ホットプレート
撹拌装置を用いて８５℃で加熱および混合した。溶液中へのフェルラ酸およびク
マリン酸の放出を、ｈｐｌｃを用いて時間に関してモニターした。フェルラ酸お
よびクマリン酸の収量は、以下の通りであった：６０分、ＦＡ２０ｍｇ、ＣＡ１．６ｍｇ；２４５分、ＦＡｌ００ｍｇ、
ＣＡ４．３ｍｇ；３１５分、ＦＡｌ２７ｍｇ、ＣＡ５．６ｍｇ；３６５分
、ＦＡ１２６ｍｇ、ＣＡ６．２ｍｇ。３６５分における収率は、利用可能な
フェルラ酸およびクマリン酸のそれぞれ７２％および６２％の放出に等しい。

【００４２】トウモロコシ懸濁液を、メッシュバッグを通してプレスすることによって、粗
くフィルターし、回収した固体をｌ０ｍｌ脱イオン水で洗浄し、遠心（４，００
０× ｇ、１５分）の前に、それらの濾液を合わせた。濃塩酸で上澄みのｐＨを
ｐＨ２．５に調節し、次いで酢酸エチル（３×ｌ００ｍｌ）で抽出した。合わせ
た酢酸エチル層を蒸発乾固して、４１％のフェルラ酸と２．７％のクマリン酸を
含む２ｌ６ｍｇの黄色／オレンジ色の固体成分を得た。

【００４３】以下の例（ｃ）および（ｄ）において、トウモロコシ繊維からのフェルラ酸お
よびクマリン酸の製造を、２ステップのプロセスによって行った。第一に、水中
に溶解された明確な量のクエン酸として、または新たにしぼられたレモンまたは
ライム果実からのジュースとしてのいずれかとして供給されたクエン酸溶液で加
熱することによって、その繊維の酸加水分解を達成した。第二に、フェルラ酸お
よびクマリン酸を産生する加水分解酵素製剤の添加によって、可溶化したシンナ
メート糖エステルの加水分解を達成した。

【００４４】（ｃ）２５０ｍｌの三角フラスコ内で、トウモロコシ繊維（２０ｇ）を１００
ｍｌのクエン酸溶液（２％）と混合し、１２６℃で１時間加熱した。激しく混合
しつつ、１０Ｍの水酸化ナトリウム溶液の添加によって、トウモロコシ懸濁液の
ｐＨを、ｐＨ５．０まで上昇させた。その懸濁液に酵素製剤（４０ｍｇ、ヘミセ
ルラーゼ、アマノ（Amano））を加え、その全体を２００ｒｐｍで混合しつつ、
５０℃で４６．５時間インキュベートした。フェルラ酸の放出を、上述したよう
なｈｐｌｃによってモニターした。１．５時間のインキュベーションの後、溶液
中にフェルラ酸の合計５１ｍｇが存在し、４６．５時間後には、この量が２２０
ｍｇまで増大した。

【００４５】（ｄ）２Ｌの三角フラスコ内で、トウモロコシ繊維（２００ｇ）を１リットル
のクエン酸溶液（２％）と混合し、および１２６℃で１時間加熱した。ブドウ絞
り器を用いて、そのトウモロコシ懸濁液を不溶性固体とリカーフラクションに分
離した。第一の圧搾により、約８００ｍｌのリカーを得た；回収した固体を、更
なる２００ｍｌの水で洗浄し、再び圧搾して、合わせたリカーフラクション約１
リットルを得た。激しく混合しつつ、１０Ｍ水酸化ナトリウムの添加によってト
ウモロコシリカーのｐＨをｐＨ７．０まで上昇させた。酵素製剤（バイオフィー
ドプラスＬ、２ｍｌ，ノボノルディスク）をそのリカーに加え、全体を１
６０ｒｐｍで混合しつつ、６０℃で７．５時間インキュベートした。フェルラ酸
およびクマリン酸の放出を、上述したようなｈｐｌｃによってモニターした。

【００４６】７．５時間のインキュベーションの後、ｌ．６ｇＬ^−１のフェルラ酸と、０．
１ｇＬ^−１のｐ−クマリン酸を溶液中に検出した。後述するような酢酸エチルへ
の抽出、およびこれに続く、ケイ皮酸ナトリウム塩を得るための溶媒の塩基抽出
、またはシンナメート遊離酸を得るための溶媒の蒸発乾固のいずれかによって、
両方のケイ皮酸を溶液から回収した。

【００４７】トウモロコシリカー（１Ｌ）を、濃塩酸の添加によりｐＨ３とし、珪藻土を通
して濾過して、不溶性材料を除去した。その濾液を３００ｍｌの酢酸エチルで二
回抽出し、それらの溶媒抽出物を合わせた。その溶媒の蒸発乾固により、それぞ
れ５３．５％と３．８％の純度を有する１．３９ｇのフェルラ酸と０．１ｇのク
マリン酸を含む２．６ｇのオレンジ色の固体を得た。シンナメートをそれらのナ
トリウム塩として回収するために、水相の激しい混合と組み合わせて、ｌ０Ｍ水
酸化ナトリウム溶液（ｌ０ｍｌ）の上に、酢酸エチルを連続的にポンピングした
。トレース量を除く全てのシンナメートが水相中に回収されるまで（約２時間）
、これを継続した。その水相を減圧下に４５℃で乾燥して、それぞれ１１．３％
および０．８７％の純度を有する１．３ｇのフェルラ酸と０．１ｇのクマリン酸
を含む１１．５ｇのクリーム固体材料成分を得た。

【００４８】ｅ）クエン酸処理したトウモロコシ繊維懸濁液の、フェルラ酸とバニリン酸を含む蒸解（digested）パルプへの変換約１．７５％重量／重量（質量／質量）のフェルラ酸を含む４ｇのトウモロコ
シ繊維、および２０ｍｌの２％重量／体積（質量／体積）クエン酸溶液を、３個
の５０ｍｌの三角フラスコの各々に加え、その全体を１２６℃で５５分間オート
クレーブ処理した。冷却した後、処理した懸濁液のｐＨを、ｌ０Ｍ水酸化ナトリ
ウム溶液を用いてｐＨ６．０に調節した。フラスコを、Ｚｙｌ７１４（ＩＭＩ
３７９８９５）の黄色アスペルギルス、Ｚｙｌ７５９（ＩＭＩ３７９９０
４）の黒色アスペルギルスまたはＰ．クリソゲヌムＺｙｌ８６０（ＩＭＩ
３７９９００)のいずれかの芽胞で接種し、オービタルミクサー上で２５０ｒｐ
ｍで振盪しつつ、３０℃でインキュベートした。加水分解生成物フェルラ酸につ
いて、およびフェルラ酸側鎖切断生成物バニリン酸について、ｈｐｌｃによって
フラスコを分析した。

【００４９】８９時間のインキュベーションの後、Ｐ．クリソゲヌム実験に対する溶液にお
けるフェルラ酸およびバニリン酸の濃度は、フェルラ酸（検知されず）およびバ
ニリン酸（１．３５ｇ／Ｌ）であった。

【００５０】５日間インキュベーションの後の、黄色アスペルギルス、黒色アスペルギルス
それぞれに対する溶液におけるバニリン酸およびフェルラ酸の濃度は、１ｇ／Ｌ
のフェルラ酸、０．３ｇ／ｌのバニリン酸、検出されないフェルラ酸、およびｌ
．２ｇ／Ｌのバニリン酸であった。

【００５１】全ての３つの菌は、トウモロコシ繊維懸濁液を蒸解パルプに分解（reduce）し
、繊維フラグメントを微細固体に分解した。

【００５２】ｆ）フェルラ酸の放出のためのトウモロコシ繊維のパイロットスケール処理１０ｋｇのトウモロコシ繊維の３つのバッチを、２％重量／体積（質量／体積
）のクエン酸水溶液中に各々懸濁した。バッチ１および２を１時間、１２６℃に
加熱し、次いでエージモア（Agemore）スウェプトサーフェス加熱／混合容器を
用いて急速に８０℃まで冷却した。その固体を、次いでヴィゴ（Vigo）７２Ｌ−
ブドウ搾り器を用いてリカーから分離し、その固体を水で洗浄して、出発体積を
回復した。

【００５３】バッチ１および２を合わせて、１００Ｌのリカーを得た。このリカーのサンプ
ルを塩基加水分解によって処理して、利用可能なフェルラ酸を放出させ、ｈｐｌ
ｃによって分析したが、フェルラ酸濃度はｌ．５ｇＬ^−１であった。

【００５４】第３のバッチを１３４℃で１５分間加熱し、８０℃に急速に冷却し、バッチ１
および２と同じ装置を用いて圧搾したが、最初の圧搾の後に、固体を水で洗浄し
なかった。このバッチは、４４．５Ｌのリカーを与えた。このリカーのサンプル
を塩基加水分解によって処理して利用可能なフェルラ酸を放出させ、ｈｐｌｃに
よって分析したが、フェルラ酸濃度はｌ．１２ｇ／Ｌ^−１であった。

【００５５】次いでリカーの全ての３つのバッチを合わせて１４５Ｌを得たが、懸濁固体の
濃度は屈折計法によって１０．５％のｗ／ｖとして測定され、ｐＨはｐＨ３．４
として測定された。そのリカーを、次いでジュニア（Junior）上昇／下降プレー
トエバポレータを用いて６０℃で濃縮した。１９．５Ｌのリカーが得られ、懸濁
固体レベルは屈折率測定法により５０％と決定された。このリカーのサンプルを
塩基加水分解によって処理して利用可能なフェルラ酸を放出させ、ｈｐｌｃによ
って分析したが、フェルラ酸濃度は８．０ｇＬ^−１であった。

【００５６】濃縮したリカーを、次いで７０Ｌのバイオラフィット（Biolafitte）ファーメ
ンターへ移し、３３Ｌの総容積を与えるように水で希釈した。２．５Ｌの３２％
重量／体積（質量／体積）の水酸化ナトリウム溶液で、リカーのｐＨをｐＨ３．
０からｐＨ６．０まで調節した。そのリカーを、次いで４５℃まで加熱した。酵
素ヘミセルラーゼ（アマノ）を０．８ｇ／Ｌ^−１の濃度で加え、３０時間攪拌し
つつインキュベートした。その酵素処理の後、リカーをｈｐｌｃによって分析し
たが、フェルラ酸濃度は３．５ｇＬ^−１であった。

【００５７】８２．５％重量／体積（質量／体積）のリン酸により、リカーのｐＨをｐＨ３
．０まで下げ、カーパワーフュージ（Car Powerfuge）を用いる遠心により懸
濁固体を除去した。そのフェルラ酸を、次いで５０Ｌの酢酸ブチル（２５Ｌの２
つのバッチで）を用いてリカーから抽出した。ファーメンター内でその酢酸ブチ
ルをリカー上にかぶせ、酢酸ブチル層におけるフェルラ酸の濃度が増加しなくな
るまで穏やかに混合した。一旦抽出が完結したならば、４８Ｌの酢酸ブチルを回
収した。ｈｐｌｃによる酢酸ブチルの分析により、フェルラ酸濃度を２．６４ｇ
Ｌ^−１として得た。

【００５８】ｇ）フェルラ酸の放出のための砂糖大根のパイロットスケール処理４０ｋｇのフィブレックス（Fibrex）砂糖大根繊維を、２００Ｌの水中に一晩
中懸濁した。この懸濁液を、次いで１３４℃に３０分間加熱し、次いで、エージ
モアスウェプトサーフェス加熱／混合容器を用いて急速に８０℃まで冷却した
（冷却期間は、１０分間であった）。その固体を、次いでヴィゴ７２Ｌ−ブドウ
搾り器を用いてリカーから分離し、その固体を水で洗浄して出発体積を回復させ
た。

【００５９】２００Ｌのリカーを得たが、そのｐＨはｐＨ４．０として測定され、屈折率測
定法によって、懸濁固体レベルは９．５％重量／体積（質量／体積）であった。
このリカーのサンプルを、塩基加水分解によって処理して利用可能なフェルラ酸
を放出させ、ｈｐｌｃによって分析したが、フェルラ酸の濃度はｌ．０３ｇｌ⁻ ^１であった。

【００６０】得られたリカーを、次いで６０℃でジュニア上昇／下降プレートエバポレータ
を用いて濃縮した。３１Ｌのリカーを得て、屈折率測定法によって懸濁固体レベ
ルを５０％重量／体積（質量／体積）と決定した。このリカーのサンプルを塩基
加水分解によって処理して利用可能なフェルラ酸を放出させ、ｈｐｌｃによって
分析したが、フェルラ酸の濃度は、５．２ｇＬ^−１であった。

【００６１】リカーを、次いで７０Ｌのバイオラフィットファーメンターへ移し、６０℃
に加熱した。２０％重量／体積（質量／体積）のリン酸により、そのｐＨをｐＨ
６．５に調節し、制御した。酵素ペントパン（Pentopan）ＢＧ５００（ノボ
ノルディスク）をｌ．８ｇＬ^−１の濃度で加え、および２４時間攪拌しつつ、そ
の混合物をインキュベートした。酵素処理の後、リカーをｈｐｌｃによって分析
したが、フェルラ酸の濃度は２．５５ｇＬ^−１であった。

【００６２】８２．５％重量／体積（質量／体積）のリン酸でリカーのｐＨを、ｐＨ３．０
まで下げ、および懸濁固体をカーパワーフュージを用いる遠心によって除去し
た。そのフェルラ酸を、次いで３５Ｌの酢酸ブチル（２×１５Ｌ、および１×１
５Ｌの３つのバッチで）を用いてリカーから抽出した。ファーメンター内でその
酢酸ブチルをリカー上にかぶせ、酢酸ブチル層におけるフェルラ酸の濃度が増加
しなくなるまで穏やかに混合した。一旦抽出が完結したならば、３２Ｌの酢酸ブ
チルを回収した。ｈｐｌｃによる酢酸ブチルの分析により、フェルラ酸濃度を２
．１０ｇＬ^−１として得た。

【００６３】次いで塩基抽出によって、その酢酸ブチルからフェルラ酸を抽出した。脱イオ
ン水の５０ｍｌを介して５００ｍｌのデュラン（Duran）ボトル中に、酢酸ブチ
ルをポンピングした。ｌ０Ｍ水酸化ナトリウムを滴定しているメトロームｐＨス
タット（Metrohm pH Stat）を用いて、その水をｐＨ９．０で維持して、磁気ス
ターラプレートおよびスターラ棒を用いて混合した。一旦それが水相を通り抜け
たならば、酢酸ブチルをバルク溶媒体積へポンピングで戻した。この設備は、溶
媒相からフェルラ酸を抽出して、ｐＨ９．０の水相中でそれを濃縮する。水相を
結局フェルラ酸で飽和させて沈殿物を形成させ、それをワットマンｎｏ．４１濾
紙を介する減圧下の濾過によって回収した。乾燥オーブン中で５０℃で、これら
の固体を一晩中乾燥した。この方法によって得られた固体の最初のバッチの重さ
は３４ｇであり、ｈｐｌｃ分析によって２４ｇのフェルラ酸を含んでいた。固体
の第２のバッチの重さは１８ｇであり、ｈｐｌｃ分析によっての８ｇのフェルラ
酸を含んでいた。

【００６４】ｈ）塩基加水分解によるフェルラ酸の放出のためのトウモロコシ繊維のパイロットスケール処理６００Ｋｇの３０．５％水酸化ナトリウムを含むｌ０，０００Ｌの水中に、１
トンのトウモロコシ繊維を懸濁した。これを、次いで１５ｍ^３のステンレス鋼の
ジャケット付き容器中で５０℃まで加熱し、８時間混合した。この懸濁液のｐＨ
は、ｐＨ１１．８として測定された。

【００６５】そのバルク固体を次いでスクロールデカンターを用いて除去し、得られたリカ
ーを貯蔵容器に移した。次いで、１６０Ｋｇの７５％重量／体積（質量／体積）
リン酸で、リカーのｐＨをｐＨ６．０に調節した。

【００６６】そのリカーを次いでＡＰＶエバポレータを用いて濃縮したが、それは２．５ト
ンの最終生成物を与えた。濃縮の後、１８０Ｋｇの７５％重量／体積（質量／体
積）リン酸で、リカーのｐＨをｐＨ３．０まで下げた。この材料のサンプルを取
り出して、ｈｐｌｃによってフェルラ酸について分析したが、フェルラ酸濃度は
２．ｌｇＫｇ^−１であったｉ）トウモロコシ繊維からのフェルラ酸の抽出のためのクエン酸溶液の繰り返し使用２０ｇのクエン酸を１リットルのＲＯ水に溶解し、ｐＨはｐＨ２．２０として
測定された。２００ｇのトウモロコシ繊維（ステーリイ（Staley）により供給さ
れる）をそのクエン酸溶液に添加し、次いで１２１℃で６０分間オートクレーブ
処理した。懸濁液が８０℃のままである間に、それらの固体を次いでヴィゴ・ベ
ンチブドウ絞り器を用いてリカーから分離した。８００ｍｌのリカーを、最初の
圧搾から回収した。保持した固体を次いで２００ｍｌのＲＯ水で洗浄し、二度目
の圧縮をした。第２の圧搾から、２２０ｍｌのリカーを回収した。両方の圧搾か
ら得られたリカーを一緒に加えて、１．０２Ｌの総体積を得た。リカーのｐＨは
、ｐＨ２．３２として測定された。

【００６７】そのリカーのサンプルを、塩基加水分解によって処理して利用可能なフェルラ
酸を放出させ、ｈｐｌｃによって分析したが、フェルラ酸の濃度は２．４９ｇＬ ^−１であった。これは、トウモロコシ繊維から１．２４％重量／重量（質量／質
量）のフェルラ酸の収率を表す。

【００６８】２．３７ｇのクエン酸を用いて、リカーのｐＨをｐＨ２．２０に戻した。新鮮
な２００ｇのトウモロコシ繊維（ステーリイによって供給された）をリカーに添
加して、次いで１２１℃で６０分間オートクレーブ処理した。その懸濁液を上記
したように処理して、最初の圧搾から７３０ｍｌを回収し、その固体を２７０ｍ
ｌのＲＯ水で洗浄して再び圧搾し、第２の圧搾から３２０ｍｌを回収した。両方
の圧搾から得られたリカーを一緒に加え、総体積ｌ．０５Ｌのリカーを得た。そ
のリカーのｐＨは、ｐＨ２．５８として測定された。

【００６９】リカーのサンプルを塩基加水分解によって処理して利用可能なフェルラ酸を放
出させ、ｈｐｌｃによって分析したが、フェルラ酸の濃度は、３．１３ｇＬ^−１であった。これは、トウモロコシ繊維からの０．８２％重量／重量（質量／質量
）のフェルラ酸の収率を表す。

【００７０】例ｌＢ：生成物混合物の生体内変換５０ｍＬの最少培地（２ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４；０．２ｇ／ｌのＮａＣｌ；０
．２２ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４；０．０１５ｇ／１のＣａＣｌ_２；１ｍｌ／ｌの微量
元素溶液；ｌ０ｍｌ／ｌのビタミン溶液；４ｇ／ｌの酵母抽出物；４ｇ／ｌのグ
ルコースを含む）を含む２５０ｍＬの振盪フラスコ内で２００ｒｐｍで振盪しつ
つ、３０℃で２４時間、ロドトルラグルチニス（Ｚｙｌ７１７）の種ステー
ジ培養物を増殖させた。上記の例（ａ）で製造した３００ｍｇのトウモロコシ抽
出物を加えた５０ｍＬの同じ培地を含む２５０ｍＬの振盪フラスコに接種する（
２％）ために、この培養物を用いた。これにより、２ｇＬ^−１のフェルラ酸と、
０．１８ｇＬ^−１のクマリン酸基質の等価物を得た。その混合物を、６０％飽和
の溶存酸素レベルで、３０℃で５００ｒｐｍで攪拌した。基質および生成物濃度
はｈｐｌｃによって、以下のように測定された：１６時間、フェルラ酸０．６
８ｇＬ^−１、バニリン酸１ｇＬ^−１、クマリン酸０．０８ｇＬ^−１、４−ヒ
ドロキシ安息香酸０．０５ｇＬ^−１、３，４−ジヒドロキシ安息香酸０．０
２ｇＬ^−１；１８時間、フェルラ酸０．１４ｇＬ^−１、バニリン酸ｌ．５４
ｇＬ^−１、クマリン酸０．０３５ｇＬ^−１、４−ヒドロキシ安息香酸０．０
８ｇＬ^−１、３，４−ジヒドロキシ安息香酸０．０５ｇＬ^−１。

【００７１】その生成物混合物は、更なる生体内変換、例えば、ザイゴリンクスモレリま
たはミクロムコールイザベリヌス（下記参照)を用いて、−ＣＯ_２Ｈ基のＣＨ
_２ＯＨおよび／又はＣＨＯへの還元を受けることができる。このように、可変の
割合で、バニリン酸を、バニリンとバニリルアルコールの混合物に変換すること
ができる。同様に、４−ヒドロキシ安息香酸を、４−ヒドロキシベンズアルデヒ
ドと４−ヒドロキシベンジルアルコールの混合物に変換することができる。マイ
ナーな酸の成分は、対応する還元を受けることができる。このように、最終生成
物は、発香性の化合物（主にバニラタイプの）の複合混合物である。例えばブレ
ブンディモナスベシキュラリスを用いる、その混合物中のアルコールの生体内
変換により、アルデヒド（例えばバニリン）の割合を増大させることができる。

【００７２】例１Ｃ−トウモロコシ繊維からのバニリン酸の製造上記の（ｃ）で記述したように、トウモロコシ繊維（１ｋｇ）をクエン酸加水
分解（５Ｌ、２％の溶液）に供し、続いてトウモロコシ固体の洗浄および圧搾に
供して、約５リットルのトウモロコシのリカーを得た。ｌ０Ｍ水酸化ナトリウム
を用いて、そのリカーのｐＨをｐＨ５．８に調節した。上記のリカーの一定部分
（aliquot）２Ｌを、５Ｌ作業容積のファーメンターに移して、１分間１００℃
に加熱した。残っているリカーも、熱処理し、別個に貯蔵した。１リットルの三
角フラスコ（２５０ｒｐｍで２８℃振盪）内で、ｐＨ５．８のトウモロコシリカ
ー上で３０時間増殖させたペニシリウムクリソゲヌム（Ｚｙｌ８６０）の培
養物２００ｍＬで、そのファーメンターを接種した。溶存酸素を３０％飽和で制
御しつつ、そのファーメンター内容物を２８℃で１５時間増殖させた。培養のｐ
Ｈは制御しなかったが、インキュベーション期間を通して不変のままであった。
１５時間後、ファーメンター内容物の体積は、当初３．５Ｌ、次いで更に７時間
のインキュベーションの後に５Ｌに増大した。インキュベーションを上述したよ
うに３日間継続し、その後、ファーメンター内容物を上述したようなｈｐｌｃに
よって分析した。そのトウモロコシリカーは、１．２ｇＬ^−１のバニリン酸と、
トレース量だけのフェルラ酸を含むことが示された。ブドウ絞り器によるファー
メンター内容物の単一の圧搾によって、菌類バイオマスをトウモロコシリカーか
ら分離し、清澄化した水性生成物を得た。

【００７３】Ｐ．クリゾゲヌム（Ｚｙｌ８６０）が現在好ましい株であるが、黄色アスペ
ルギルス（Ｚｙｌ７１４）および黒色アスペルギルス（Ｚｙｌ７５９）も使
用可能である。

【００７４】酢酸エチルへの抽出、およびこれに続くその溶媒の蒸発乾固によって、または
ヘキサンの添加による溶媒からのバニリン酸の沈殿のいずれかによって、バニリ
ン酸を水溶液から回収することができる。例えば、５６７ｍｇのバニリン酸を含
む培養液体培地（９００ｍｌ）をｐＨ３．０に酸性化し、および酢酸エチル（ｌ
×４００ｍｌ、２×２００ｍｌ）で３回抽出した。その溶媒抽出物を合わせて、
上述したようなｈｐｌｃによって分析したが、４８５ｍｇのバニリン酸（８６％
回収）を含むことが判明した。

【００７５】合わせた酢酸エチル抽出物から一定部分（２００ｍｌ）を取り、その体積を蒸
発によってｌ０ｍＬに低減させた。定常的に混合しつつ、この濃縮した抽出物に
ヘキサン（４０ｍｌ）をゆっくり加え、濾過により沈殿した材料を回収し、乾燥
して、ｌｌ５ｍｇバニリン酸（８２％の純度）を含む淡黄色固体のｌ４０ｍｇを
得た。溶媒からの回収は８８％であり、したがって、元の培養液体培地から７６
％の全体的な回収を得た。

【００７６】例１Ｄ−トウモロコシ繊維からのバニリンの製造後述する例４におけるような栄養素の添加により、ミクロムコールイザベリ
ヌスの増殖のために、例ｌＣからの清澄化したリカーの栄養分を強化した。更な
るバニリン酸は、リカーに加えなかった。１．５％の寒天で固化させたｐＨ５．
８のトウモロコシリカー（例１Ｃで記述された）上で、ミクロムコールイザベ
リヌス（Ｚｙｌ８４９）の培養物を３０℃で３日間増殖させた。１００ｍｌの
三角フラスコ内に含有された上記した強化、清澄化したリカーの２０ｍｌに接種
するために、この培養物を用いた。同一の第２のフラスコを接種（２．５％）す
るために用いる前に、そのフラスコ内容物を２５０ｒｐｍで２４時間振盪しつつ
、３０℃でインキュベートした。インキュベーション条件は、上述した通りであ
った。プロセスを通して、溶液中のバニリン酸とバニリンの濃度を、上述したよ
うなｈｐｌｃによって分析した。２４時間のインキュベーションの後、リカーの
ｐＨは約１．５時間にわたってｐＨ５．２からｐＨ３．７へゆっくり低減した。
ｐＨ低減開始後の２．２５時間後、０．０２ｇＬ^−１バニリンが溶液中で検出さ
れた。４．５時間後、バニリン濃度は、０．１２ｇＬ^−１まで増加した。７．５
時間で、バニリンおよびバニリン酸濃度は、それぞれ０．２７５ｇＬ^−１と０．
８ｌｇＬ^−１であった。１３時間のインキュベーションの後、バニリン酸濃度が
０．４５ｇＬ^−１に減少し、バニリンの濃度は、０．３５ｇＬ^−１で最大に到達
した。

【００７７】Ｂ）バニリルアルコールを経るバニリン酸からのバニリンバニリン酸のバニリンへの「ワンポット」生物変換は公知であるが、一般に低
い収率および低い変換速度（rate）および／又は低い生成物濃度しか示さない（
例えばＥＰ４５３３６８号、ＦＲ２７２４３９４号）。我々は、バニリン酸
からバニリルアルコールの非常に高い濃度（例えば＞５ｇ／ｌ）を与えるために
、ザイゴリンクスモレリが使用可能であることを見出した。バニリルアルコー
ルは、例えばブレブンディモナスベシキュラリスにより、バニリンに効率的に
酸化することができる。

【００７８】例２：バニリン酸からのバニリルアルコール２ｇ／Ｌバニリン酸を含む５０ｍＬの培地（２０ｇのグルコース；５ｇの（Ｎ
Ｈ_４）_２ＳＯ_４；２ｇのＮａＣｌ；ＭｇＳＯ_４０．２２ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２
０．０１５ｇ／Ｌｌ０ｍＬ；微量元素溶液１ｍＬ；ビタミン溶液ｌ０ｍＬ
；ｐＨ６．０リン酸緩衝液０．２Ｍにより１リットルまで調製）を含む２５０ｍ
Ｌスターター培養フラスコに接種するために、酵母麦芽寒天上で増殖させたZypo
rhynchus モレリ（Ｚｙｌ８５１）の培養物を用い、２００ｒｐｍで振盪しつ
つ、３０℃で２４時間インキュベートした。培地成分が脱イオン水に溶解され、
且つ２ｇ／Ｌのバニリン酸を含むこと以外は、ファーメンター内で同じ培地の５
リットル中に、このスターター培養物を加えた。これをｐＨ５．２（３０℃）で
２４時間攪拌し、その後ｐＨを１時間かけて３．５にまで変化させ、温度を３０
℃に保持した。プロセスを通して、溶存酸素を７０％飽和で維持した。アッセイ
は、ｈｐｌｃによった。ｐＨを低下させる（２４時間のステージで）前に、系に
おいて存在するバニリン酸の量は低下せず、および生成物は見られなかった。反
応が進むにつれて、種々の量の基質および栄養素を以下のように加えた：３１．
７５時間、１０ｇのバニリン酸と２５ｇのグルコース；４７．５時間、５０ｇの
グルコース；５５時間、２０ｇのバニリン酸。生成物は、以下のように測定され
た。：３１．７５時間；バニリン酸０．２６ｇ／Ｌ、バニリルアルコール０
．３ｇ／Ｌ；４７．５時間、バニリン酸１．１７ｇ／Ｌ、バニリン０．ｌｇ
／Ｌ、バニリルアルコール２．３８ｇ／Ｌ；５５時間、バニリン酸０．６４
ｇ／Ｌ、バニリン０．０６ｇ／Ｌ、バニリルアルコール３．５ｇ／Ｌ；５日
間、バニリン酸１．２１ｇ／Ｌ、バニリン０．０５ｇ／Ｌ、バニリルアルコ
ール６．６ｇ／Ｌ；このステージの後、更なる生成物の蓄積は観察されなかった
。ｐＨ５．２で基質が如何なる生成物にも変化しなかったこと、ｐＨをｐＨ３．
５に低下させた際にのみ、生物変換が始まることも明らかである。

【００７９】例３：バニリルアルコールからのバニリン２５０ｍＬの振盪フラスコ内の滅菌栄養液体培地（Ｎｏ２）（５０ｍＬ）に
、ブレブンディモナスベシキュラリス（Ｚｙｌ２９５）を接種し、２００ｒ
ｐｍで振盪しつつ３６℃でインキュベートした。２４時間後、バニリルアルコー
ルの５０ｍｇの添加の後に、バニリルアルコールとバニリン両方に対してｈｐｌ
ｃによってフラスコを定期的にモニターした。接種後７１時間まで、バニリルア
ルコールの量は元のレベルの約１０％に減少し、およびバニリンの量は基質から
約９０％モル変換まで増加した。生成物の構造の確認を、ｎｍｒ分光分析法によ
って確認した。

【００８０】フラスコの接種の時点でバニリルアルコールを添加したならば、１６時間のイ
ンキュベーションの後にバニリンが最初に検出されたときまで、基質の量は減少
を開始しなかった。全体的な変換は、基質を２４時間後に加えたときに観察され
たものに忠実に従った。

【００８１】Ｃ）バニリン酸からのバニリン上述したように、バニリン酸のバニリンへの生体内変換は公知であるが、公知
の方法の収率は低く、それらを商業的な観点からは魅力的でないものにしている
。ＦＲ−Ａ−２７２４３９４号は、担子菌（basidiomycete）を用いて、パーセ
ンテージで、かなり良い収率および変換速度を与えるプロセスを開示しているが
、その絶対的な収量は低い。例において産生されるバニリンの最も高い収量は、
６２５ｍｇ／ｌである。

【００８２】我々は、１ｇ／ｌを超えるバニリンを与え、且つ連続生産で有用である株を見
出した。好ましい微生物は、ミクロムコールイザベリヌスおよびアスペルギル
スフミガーツスの株である。

【００８３】例４：Ｍ．イザベリヌスによるバニリンの製造（ａ）２ｇ／Ｌバニリン酸を含む５０ｍＬの培地（ｌ５ｇのグルコース；５ｇ
の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；２ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；０．２ｇのＮａＣｌ；０．２ｇの
ＭｇＳＯ_４；０．０ｌ５ｇのＣａＣｌ_２、微量元素溶液、１ｍＬ；ビタミン溶液
ｌ０ｍＬ；脱イオン水により１リットルに調製）を含む２５０ｍＬのスターター
培養フラスコに接種するために、酵母麦芽寒天上で増殖させたミクロムコール
イザベリヌス（Ｚｙｌ８４９）の培養物を用い、それを２００ｒｐｍで振盪し
つつ３０℃で１６．５時間インキュベートした。このスターター培養物を、ｌ．
５ｇＬ^−１の濃度でバニリン酸を添加したファーメンター内で、同じ培地の５リ
ットルに加えた。プロセスを通して溶存酸素濃度を７０％飽和に維持しつつ、フ
ァーメンター内容物を３０℃で攪拌した。アッセイは、上述したようなｈｐｌｃ
によった。反応が進むにつれて、バニリン酸の追加的な量を以下のように加えた
：２２．５時間、２．５ｇ；２４時間、２．５ｇ；２５．７５時間、ｌｇ；２６
．５時間、１ｇ；２７．５時間、ｌｇ；３１時間、２．５ｇ。基質および生成物
濃度は、以下のように測定された：２２．５時間、バニリン酸０．６ｇＬ^−１；バニリン０．８４ｇＬ^−１；２４時間、バニリン酸１．３６ｇＬ^−１；バ
ニリン０．９６ｇＬ^−１；２５．７５時間、バニリン酸１．１５ｇＬ^−１；バ
ニリンｌ．１ｇＬ^−１；２６．５時間、バニリン酸ｌ．２７ｇＬ^−１、バニ
リン１．１７ｇＬ^−１；２７．５時間バニリン酸１．４３ｇＬ^−１；バニリン
１．３３ｇＬ^−１；３１時間、バニリン酸１．ｌ６ｇＬ^−１；バニリン１
．６ｇＬ^−１；４６．５時間バニリン酸１．５８ｇＬ^−１；バニリン１．７
０ｇＬ^−１。

【００８４】（ｂ）２ｇ／Ｌのバニリン酸を含む１００ｍＬの培地（ｌ５ｇのグルコース；
５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；２ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；０．２ｇのＮａＣｌ；０．２
ｇのＭｇＳＯ_４；０．０ｌ５ｇのＣａＣｌ_２、微量元素溶液、ｌｍＬ；ビタミン
溶液ｌ０ｍＬ；リン酸緩衝液（０．２Ｍ）ｐＨ６．０により１リットルに調製）
を含む５００ｍＬスターター培養フラスコに接種するために、酵母麦芽寒天上で
増殖させたミクロムコールイザベリヌス（Ｚｙｌ８４９）の培養物を用い、
それを２００ｒｐｍで振盪しつつ３０℃で２４時間インキュベートした。接種の
直前に、培地成分で脱イオン水で１リットルに調製し、バニリン酸を１．５ｇＬ ^−１の濃度に添加したファーメンター内で、同じ培地の５リットルに、このスタ
ーター培養物を加えた。５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によって培地のｐ
ＨをｐＨ５．２で維持しつつ、ファーメンター内容物を３０℃で１８時間攪拌し
た。この後、５ＭＨＣｌの添加によって培地ｐＨを４５分かけて徐々に３．７
に低下させ、温度を３０℃で維持した。プロセスを通して溶存酸素濃度を７０％
飽和で維持した。アッセイは、上述したようなｈｐｌｃによった。１８時間のス
テージでｐＨを低下させる前に、系におけるバニリン酸の量を、１．４８ｇＬ ^−１として測定した；溶液中でバニリンを、０．０２ｇＬ^−１で検出した。反応
が進行するにつれて、バニリン酸またはグルコースの種々の量を以下のように加
えた：１９．２５時間、５０ｇのグルコース；２０．２５時間、３ｇのバニリン
酸；２１．５時間、４ｇのバニリン酸；２３時間、４ｇのバニリン酸。基質およ
び生成物濃度を以下のように測定した：１９．２５時間、バニリン酸１．５ｇ
Ｌ^−１、バニリン０．１ｇＬ^−１；２０．２５時間、バニリン酸１．１６ｇ
Ｌ^−１、バニリン０．３６ｇＬ^−１；２１．５時間、バニリン酸１．０７ｇ
Ｌ^−１、バニリン０．７４ｇＬ^−１；２３時間、バニリン酸１．０６ｇＬ^−１、バニリン１．２２ｇＬ^−１；２６時間、バニリン酸０．８３ｇＬ^−１、バ
ニリン１．９５ｇＬ^−１。

【００８５】例５：Ａ．フミガーツスによるバニリンの製造５リットルの最少培地（１．５ｇＬ^−１よりむしろ３ｇＬ^−１のバニリン酸の
添加を除いて、例４（ａ）で記述した成分）に接種するために、アスペルギルス
フミガーツス（Ｚｙｌ７４７）の芽胞懸濁液を用いた。溶存酸素濃度を６０
％飽和に維持しつつ、ｐＨコントロールなしで、ファーメンター内容物を３０℃
で攪拌した。アッセイは、上述したようなｈｐｌｃによった。培養液体培地中の
基質および生成物濃度は、以下の通りであった：１６時間、バニリン０．０１
５ｇＬ^−１；２４時間、バニリン０．０７５ｇＬ^−１；４０時間、バニリン
０．６９ｇＬ^−１；４７時間、バニリン０．９１ｇＬ^−１；４８．５時間、０
．９８ｇＬ^−１；５３．５時間、ｌ．０２ｇＬ^−１；１１２時間、バニリン酸１
．３２ｇＬ^−１、バニリンｌ．０９ｇＬ^−１。

【００８６】Ｄ）フェルラ酸からのバニリン例６Ｚｙｌ５８１およびＺｙｌ５０３のＮＴＧ誘導変異体によるフェル
ラ酸のバニリンへの変換背景ＺＹＬ５０３は、中間体バニリンを介して、フェルラ酸（ＦＡ）をバニリン
酸（ＶＡ）に変換する。この反応における律速段階は、ＦＡからバニリンであり
、したがって、培地におけるバニリンの蓄積は観察しない。後述するＮＴＧ変異
法に基づき、ＺＹＬ５０３変異体を製造した。それは、ＦＡを供給された際に培
地中でバニリンを蓄積する。

【００８７】（ａ）ＺＹＬ５０３のＮＴＧ突然変異誘発ＺＹＬ５０３をｌ０ｍｌ栄養液体培地で中期指数増殖期（mid-exponential ph
ase）に増殖させ、収穫し、ｌ００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５
）で一回洗浄し、０．１ｇＬ^−１のＮＴＧを含むこの緩衝液１０ｍｌ中に再懸濁
して、室温でインキュベートした。５分間隔で、０．５ｍｌの一定部分を取り、
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で二回洗浄して、この緩衝液の１ｍｌ中に再懸濁
した。これらのサンプルを、次いで５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、２０ｇＬ⁻ ^１のグルコースまたは１ｇＬ^−１のバニリンにプラスして、２ｇＬ^−１の酵母抽
出物と２ｇＬ^−１のフェルラ酸を含む最少培地寒天（０．４Ｍのリン酸緩衝、ｐ
Ｈ７）上へ展開した。プレートを、３０℃で２４〜４８時間インキュベートした
。バニリンプレート上で増殖できない、得られたコロニーを選んだ。Ｚｙｌ５
８１を、この手順に基づいて得た。

【００８８】（ｂ）Ｚｙｌ５８１による商業的なフェルラ酸（遊離酸）のバニリンへの変換最少培地（ｇＬ^−１：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５；Ｋ_２ＨＰＯ_４、２；ＮａＣｌ
，０．２；酵母抽出物、０．２、グルコース、２０：０．１ＭのＭｇＳＯ_４／０
．０ｌＭのＣａＣｌ_２を含む溶液の１０ｍｌ；１０ｍｌのビタミン溶液およびｌ
ｍｌ微量元素溶液）５０ｍｌを含む２５０ｍＬの振盪フラスコ内で、Ｚｙｌ５
８１のプレ培養物を２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間増殖させた。２ＭのＮａＯ
Ｈを用いる８．０でのｐＨコントロール、７０％での酸素コントロール、１００
〜４００ｒｐｍの気流量１．３ｖｖｍのスターラ速度カスケードによる同じ培地
の１．２リットルで満たしたバイオリアクターに接種するために、この培養物を
次いで用いた。接種の前に、下記の表に示したように、発酵が進行するにつれ、
２ｇＬ^−１のフェルラ酸（ランカスター、９９％）を加えた。同一のリアクター
を、８．５でのｐＨコントロールにもセットアップした。反応生成物を、ＨＰＬ
Ｃによって定量した。

【００８９】

【表１】

【００９０】

【表２】

【００９１】

【表３】

【００９２】ｐＨ８．５ではバニリンが優勢な生成物であったが、ｐＨ８ではフェルラ酸か
らのバニリン酸が優勢な変換生成物であった。ｐＨ８．５で４３時間の後、バニ
リン濃度は２．２４７ｇＬ^−１であり、消費されたフェルラ酸に対して７３％の
モル収率であった。

【００９３】（ｃ）Ｚｙｌ５８１による砂糖大根由来のフェルラ酸（ナトリウム塩）のバニリンへの変換ペントパン５００ＢＧ処理した砂糖大根リカーから得たフェルラ酸を酢酸ブ
チルで抽出し、次いで塩基に逆抽出して、フェルラ酸ナトリウム塩（遊離酸とし
て７０．８％重量／重量（質量／質量）のフェルラ酸）を得た。

【００９４】接種の前に５．６５ｇ／ｌの砂糖大根フェルラ酸抽出物を加えた（ナトリウム
塩として、４ｇＬ^−１の利用可能なフェルラ酸が存在）こと以外は上述したよう
にｐＨ８．５で、Ｚｙｌ５８１をバイオリアクター中で増殖させた。４０時間
の後、リアクタ内のフェルラ酸濃度は０．０５ｇ／ｌ、バニリン酸０．２１ｇ／
ｌ、およびバニリン１．６９ｇ／ｌであった。これは、バニリンに対する５４
％のモル収率を表す。加えたフェルラ酸の７２％を、バニリン酸、バニリンまた
は残っているフェルラ酸として説明することができた。

【００９５】（ｄ）消費した培養液体培地からのバニリンの回収Ｚｙｌ５８１発酵からの培養液体培地を取り出し、遠心によって細胞を除去
し、液体培地をｐＨ７．５に調節し、等しい体積の酢酸ブチルをかぶせ、一晩中
攪拌した。その酢酸ブチルを減圧下で蒸発させ、得られた固体をｌ０ｍｌヘキサ
ンで洗浄し、濾過によって回収して４０℃で一晩中乾燥した。

【００９６】Ｚｙｌ５８１発酵からの４００ｍｇの抽出した固体（ＨＰＬＣにより９５％
重量／重量（質量／質量）のバニリン）を、以下の手順を用いて精製した。その
生成物を、シリカ（７０〜２００μｍ）を加えた４０ｍｇのジエチルエーテルに
溶解した。そのエーテルを蒸発させ、固体をシリカに吸着させた。そのシリカを
、石油エーテル（６０〜８０のフラクション）中の酢酸エチルの２％（ｖ／ｖ）
溶液の５００ｍｌで洗浄した。この溶液を焼結ガラス（glass sinter）で濾過し
て、減圧下で蒸発させて、９９％重量／重量（質量／質量）を超えるバニリン（
２７７ｍｇ）を含む白いアモルファス固体を得た。

【００９７】Ｅ）「その場」生成物の取出し（「ＩＳＰＲ」）その原理は、その中を生成物が通過することができる（排他的に、または優先
して）非混和性の相と接触している（in contact with）か、または接触させら
れた（contacted with）水相中において生体内変換を行うことを含む。可能な利
点は、ａ）水相中における更なる反応からの生成物の保護；ｂ）高い生成物濃度
による微生物による生成物形成阻害の回避；ｃ）平衡反応に、より大きい割合の
出発材料の生成物への変換を可能にさせること；およびｄ）生成物単離の容易性
を含む。更に、ＩＳＰＲは連続的システムの開発を助長することができる。

【００９８】ＩＳＰＲは、極性の基質（例えばフェルラ酸またはバニリン酸等のカルボン酸
）を、より極性が低い生成物に変換し、植物油材料、好ましくは食品グレードの
もの等の無極性性溶媒によって、それが優先して抽出されるであろう系に、容易
に適用できる。極性の副生成物も、水相中でとどまる傾向がある。

【００９９】例７および８は、ＩＳＰＲを利用する以外は、例４および５に対応する。

【０１００】系に従って、生体内変換をその中で進行させつつ、またはバイオリアクターか
ら（一時的に）取り出された水相の部分にそれが接触ができるようにしつつ、非
混和性の相を水相に接触させることができる。非混和性の相による抽出を容易に
するために、取り出した相を処理することができる（例えばｐＨの調整によって
）。

【０１０１】例７：ＩＳＰＲによるＭ．イザベリヌスでのバニリンの製造例４ｂで記述したように、ミクロムコールイザベリヌス（Ｚｙｌ８４９）
の５リットルの培養物を、ファーメンターで増殖させた。５Ｍ水酸化ナトリウム
溶液の添加によって培地のｐＨを５．２で維持しつつ、そのファーメンター内容
物を３０℃で２０時間攪拌した。この後、５ＭのＨＣｌの添加によって培地ｐＨ
を４５分かけて徐々に３．８に低下させ、その後このｐＨで維持した；温度を３
０℃で維持した。プロセスを通して、溶存酸素濃度を７０％飽和で維持した。ア
ッセイは、上述したようなｈｐｌｃによった。培養液体培地中のバニリンの濃度
が０．９６ｇＬ^−１に達するまで、反応の進行をモニターした。この期間を通し
て、１．５ｇＬ^−１の濃度を維持するように、バニリン酸を培地に加えた。この
時、外部分バニリン抽出系を、以下のように活性化した：バイオマスがファーメ
ンター内で保持されるように、濾過器具を介して、ファーメンターから培地を連
続的にポンピングした；ファーメンターから出る培地を６０℃に加熱し、ｌ０Ｍ
の水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨ６．５に調節した；この培地を、５
リットルのヒマワリ油を含む抽出容器に供給した；培地から油相へのバニリンの
連続的、選択的な抽出を行うために、オーバーヘッドスターラを使用して、水相
（１リットルの体積で維持した）および油相を激しく攪拌した；バニリン酸は油
中に抽出されず、完全に水相中に残った；この水相を、ファーメンターへ連続的
にポンピングして戻した。プロセスを通して、ファーメンター内の体積および抽
出容器内の体積を比較的に一定にした。ファーメンター内のバニリン酸の濃度が
約１．５ｇＬ^−１に維持され、ファーメンター内でのバニリン濃度が最高１．５
ｇＬ^−１に維持された。この連続的な外部抽出設備を用いて、５リットルのミク
ロムコールイザベリヌスの培養物は、約２０時間の運転期間にわたってｌ８．
９ｇのバニリンを製造した。バニリンは、水またはアルコール（例えばメタノー
ルまたはエタノール）またはアルコール／水混合物への抽出によってヒマワリ油
から回収することができる。適当な混合溶媒は、８０％のエタノールおよび２０
％の水である。抽出用溶媒の蒸発後に、再結晶、昇華、その他の従来の技術によ
って、バニリンを更に精製することができる。

【０１０２】例８：ＩＳＰＲによるＡ．フミガーツスでのバニリンの製造ステンレス鋼キャリア（support）を詰めた滅菌ガラスカラム（６０ｍＬ体積
）を、２ｇＬ^−１のバニリン酸を含む最少培地（例４で記述した成分）で満たし
、アスペルギルスフミガーツス（Ｚｙｌ７４７）の芽胞で接種した。系に通
気するため、および効率的な混合を行うために、カラムのベースに空気をポンピ
ングした。そのカラムを、室温（２２℃）で７０時間放置した。この後、菌の実
質的な増殖が生じ、全てはステンレス鋼キャリア物質に付着した。溶液中のバニ
リンの濃度は、０．６５ｇＬ^−１として測定された。上記のように通気を維持し
つつ、前述したものと同じ最少培地の２００ｍＬ、およびヒマワリ油５００ｍＬ
を含む別の抽出容器に、カラムの内容物を、そのカラムから連続的にポンピング
した。加えて、ｌｇのバニリン酸を水相に加えた。抽出容器の内容物を充分に混
合し、カラムを介して水相を連続的にポンピングで戻した。そのカラムにシリコ
ンチューブ材料でジャケットをかぶせ、３４℃の温度で水をポンピングすること
によって、約３０℃でのカラム内容物のインキュベーションを、達成した。抽出
容器内の内部における油および水相中でのバニリンの濃度を、８日間にわたって
間隔をおいて分析した（上述したようなｈｐｌｃ）。系からの全バニリン収量と
して表した結果は、以下の通りであった：２４時間、ｌｌ３ｍｇ；４８時間、ｌ
４０ｍｇ；７２時間、２６９ｍｇ；９６時間、３８５ｍｇ；１６８時間、５９７
ｍｇ；１９２時間、５６６ｍｇ。

【０１０３】長期に連続的使用するための例８の系の適合性を、例９によって示す。

【０１０４】例９：ＩＳＰＲを用いるバニリンの連続製造ファーメンター（５リットルの作業体積）中で、最少培地（ｌ．５ｇよりむし
ろ３．３ｇＬ^−１のバニリン酸の添加以外は例９で記述した成分）の３リットル
に接種するために、アスペルギルスフミガーツス（Ｚｙｌ７４７）の芽胞懸
濁液を用いた。プロセスを通して溶存酸素濃度を６０％飽和で維持しつつ、ｐＨ
コントロールせずに３０℃でそのファーメンター内容物を攪拌した。アッセイは
、上述したようなｈｐｌｃによった。２４時間のインキュベーショントの後、溶
液中で０．１５ｇＬ^−１のバニリンを検出した。この時、０．５ｇＬ^−１のバニ
リン酸を含むヒマワリ油２リットルをファーメンターに加え、インキュベーショ
ンを上述したように続けた。２８日の期間にわたって、ファーメンター内の油相
を頻繁な間隔で取り出し、０．５ｇＬ^−１バニリン酸を含む新鮮な油と取り替え
た。系からの全体のバニリン収量として表したバニリン産生は、以下の通りであ
った：

【０１０５】

【表４】

【０１０６】６６５時間後に、実験を終了した；しかしながら、菌は未だにバニリンを活発
に製造していた。

【０１０７】Ｇ）バニリン酸製造のためのシュードモナスプチダの使用例１０フェルラ酸のバニリン酸への変換２５０ｍＬの三角振盪フラスコ内で、５０ｍｌの増殖培地（５ｇのフェルラ酸
；２０ｇのグルコース；２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４；５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；０．
２ｇのＮａＣｌ；０．２２ｇのＭｇＳＯ_４；０．０ｌ５ｇのＣａＣｌ_２；１ｍｌ
の微量元素溶液；１０ｍｌビタミン溶液、０．２Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
で１リットルまで調製）のための接種材料の源として、シュードモナスプチダ
（Ｚｙｌ５０３）の寒天プレート培養物を用いた。その培養物を、２５０ｒｐ
ｍで振盪しつつ３０℃で培養して、上述したようなｈｐｌｃによって分析した。
反応が進むにつれて、フェルラ酸の追加的な量を、以下のように加えた：２４．
５時間、０．２５ｇ；４８時間、０．１２５ｇ；７２時間、０．０５ｇ；９０時
間、０．２５ｇ；９６時間、０．５ｇ。基質および生成物濃度を、以下のように
測定した：２０．５時間、フェルラ酸２．７１ｇＬ^−１、バニリン酸２．０
８ｇＬ^−１；２４．５時間、フェルラ酸１．５１ｇＬ^−１、バニリン酸３．
０１ｇＬ^−１；４８時間、フェルラ酸２．４ｇＬ^−１，バニリン酸７．０ｇ
Ｌ^−１；７２時間、フェルラ酸２．０８ｇＬ^−１、バニリン酸９．５ｇＬ^−１；９６時間、フェルラ酸４．４７ｇＬ^−１、バニリン酸１２．ｌ１ｇＬ^−１；１６０時間、フェルラ酸４．４５ｇＬ^−１、バニリン酸１９．０５ｇＬ⁻ ^１。

【０１０８】例１１トウモロコシ繊維からのバニリン酸の製造２５０ｍｌの三角フラスコ内で、３０ｇのトウモロコシ繊維に、８％重量／体
積（質量／体積）のクエン酸溶液の１００ｍｌを加えた。そのフラスコ内容物を
、効率的に混合しつつ８５℃で１６時間で加熱した。この後、水酸化ナトリウム
溶液（ｌ０Ｍ）を滴下で加えて、攪拌したトウモロコシ繊維懸濁液を中和した。
加水分解酵素製剤（５００μｍ、バイオフィードプラス、ノボノルディスク
）をその懸濁液に加え、その全体を連続的に混合しつつ４５℃で２４時間インキ
ュベートした。分析は、上述したようなｈｐｌｃによった。２４時間後に、溶液
中で３．３ｇｌ^−１のフェルラ酸を検出した。

【０１０９】５０ｍｌの最小塩培地（４ｇのフェルラ酸；２０ｇのグルコース；５ｇの（Ｎ
Ｈ_４）_２ＳＯ_４；０．２ｇのＮａＣｌ；２ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；０．２２ｇのＭｇ
ＳＯ_４；０．０１５ｇのＣａＣｌ_２；１ｍｌの微量元素溶液；１０ｍｌのビタミ
ン溶液、０．２Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液で１リットルに調製）を含む２５
０ｍＬの振盪フラスコに接種するために、栄養寒天培地上で増殖させたシュード
モナスプチダ（Ｚｙｌ５０３）の培養物を用いた。そのフラスコ内容物を、
２５０ｒｐｍで振盪しつつ、３０℃で２４時間インキュベートした。この後、培
養物を遠心（４０００×ｇ、２０分）により収穫し、０．２ＭのｐＨ７．０のリ
ン酸緩衝液で１回洗浄して、残る非トウモロコシ由来のフェルラ酸またはバニリ
ン酸を除去し、最終的に同じ緩衝液の２ｍｌ中（×２５の濃度）に再懸濁した。
この濃縮した細胞懸濁液を、１００ｍｌの三角フラスコ内に含まれた上述した加
水分解されたトウモロコシ懸濁液２０ｍｌの一定部分に加えた。２５０ｒｐｍで
振盪しつつ３０℃でインキュベートする前に、溶液中のフェルラ酸の濃度は、２
．８ｇＬ^−１として測定された。インキュベーション期間を通して存在するバニ
リン酸の濃度は、以下のように測定された：４時間、０．１１ｇＬ^−１；２４．
５時間、１．４４ｇＬ^−１；２９．５時間、１．９８ｇＬ^−１；３１時間、２．
０ｇＬ^−１。

【０１１０】Ｈ）他の基質の変換例１におけるようなフェルラ酸のバニリン酸への変換は、ケイ皮酸（ＡＲ−Ｃ
Ｈ＝ＣＨＣＯ_２Ｈ）の安息香酸（ＡＲ−ＣＯ_２Ｈ）への変換である。これは、他
のケイ皮酸、例えばクマリン酸（４−ヒドロキシケイ皮酸）およびカフェー酸（
３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）に適用することができる。

【０１１１】例１２：クマリン酸からの４−ヒドロキシ安息香酸最少培地（例１で定義された）の５０ｍｌを含む２５０ｍＬの振盪フラスコ内
で、ロドトルラグルチニス（Ｚｙｌ７０２）の種ステージ培養物を、２００
ｒｐｍで振盪しつつ３０℃で２４時間増殖させた。２００ｍｇのクマリン酸を添
加した同じ最少培地５０ｍＬを含む２５０ｍＬの振盪フラスコを接種する（２％
）ために、この培養物を用いて、４ｇＬ^−１の最終濃度を得た。インキュベーシ
ョン条件は上述した通りであり、分析は、上述したようなｈｐｌｃによった。基
質および生成物濃度は、以下のように測定された：１８時間、クマリン酸１．
７５ｇＬ^−１、４−ヒドロキシ安息香酸１．２８ｇＬ^−１、３，４−ジヒドロ
キシ安息香酸０．２７ｇＬ^−１；２２時間、クマリン酸０．３６ｇＬ^−１、
４−ヒドロキシ安息香酸１．９２ｇＬ^−１、３，４−ジヒドロキシ安息香酸
０．４４ｇＬ^−１；２３時間、クマリン酸０．１２ｇＬ^−１、４−ヒドロキシ
安息香酸２．１０ｇＬ^−１、３，４−ジヒドロキシ安息香酸０．４７ｇＬ⁻ ^１。

【０１１２】例４におけるようなバニリン酸のバニリンへの変換は、ヒドロキシ安息香酸の
ヒドロキシベンズアルデヒドへの変換である。これは、他の安息香酸、特にヒド
ロキシ安息香酸、例えば４−ヒドロキシ安息香酸（例１２で製造したような）、
または３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク（protocatechuic）酸）に
適用することができる。

【０１１３】例１３：４−ヒドロキシ安息香酸の４−ヒドロキシベンズアルデヒドおよび４ −ヒドロキシベンジルアルコールへの変換１００ｍｇの４−ヒドロキシ安息香酸を含む４２ｍＬの培地を含む２５０ｍＬ
の三角フラスコに接種するために、酵母麦芽寒天上で増殖させたザイゴリンクス
モレリ（Ｚｙｌ８５１）培養物を用いた。その培養液体培地を、２００ｒｐ
ｍで振盪しつつ３０℃でインキュベートした。反応の進行を、上述したようなｈ
ｐｌｃによって分析した。基質および生成物の濃度は、以下のように測定された
：２４時間、４−ヒドロキシ安息香酸２．２６ｇＬ^−１、４−ヒドロキシベン
ズアルデヒド痕跡量、４−ヒドロキシベンジルアルコール痕跡量；４２時間、
４−ヒドロキシ安息香酸１．０６ｇＬ^−１、４−ヒドロキシベンズアルデヒド
０．５３ｇＬ^−１、９、４−ヒドロキシベンジルアルコール０．５５ｇＬ⁻ ^１；６６時間、４−ヒドロキシ安息香酸０．１ｇＬ^−１、４−ヒドロキシベン
ズアルデヒド痕跡量、４−ヒドロキシベンジルアルコール２．６ｇＬ^−１。

【０１１４】例１４：４−ヒドロキシ安息香酸の４−ヒドロキシベンズアルデヒドへの変換２５０ｍＬの三角フラスコ内の最少培地（例４ａで定義した）の５０ｍＬに接
種するために、酵母麦芽寒天上で増殖させたトリコデルマコニンギイ（Ｚｙ
ｌ７５１）の培養物を用いた。接種の前に、ｌ５０ｍｇ（３ｇＬ^−１）の４−
ヒドロキシ安息香酸を培地に添加し、続いて２００ｒｐｍで振盪しつつ全体のイ
ンキュベーションを３０℃で行った。アッセイは、上述したようなｈｐｌｃおよ
びｔｌｃによった。約３０時間のインキュベーションの後、ｈｐｌｃ分析により
、溶液中で０．３ｇＬ^−１の４−ヒドロキシベンズアルデヒドを検出した。この
観察は更にｔｌｃ分析でも支持され、それは、４−ヒドロキシベンズアルデヒド
の関連サンプルに対応したＲｆ０．５９における材料の存在を示した。観察さ
れた生成物は、ジニトロフェニルヒドラジン溶液で陽性のカラー反応を与えた。例１５：３，４−ジヒドロキシ安息香酸の３，４−のジヒドロキシベンズアルデヒドへの変換１００ｍｇのバニリン酸を含む５０ｍＬの培地を含む２５０ｍＬの三角フラス
コ内で、酵母麦芽寒天上で増殖させたザイゴリンクスモレリ（Ｚｙｌ８５１
）の培養物を用いた。その培養液体培地を、２００ｒｐｍで振盪しつつ３０℃で
インキュベートした。反応の進行を、上述したようなｈｐｌｃによって分析した
。４２時間のインキュベーションの後、バニリン酸の約５０％が、バニリルアル
コールに変換された。この時、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシ安息香酸（例
えば、例１２から、またはタマネギ皮から抽出された）を培養物に加えて、イン
キュベートを続けた。更なる６時間のインキュベーションの後、３，４−ジヒド
ロキシベンズアルデヒドに対応する新しい生成物が約０．２０ｇＬ^−１の濃度で
検出された。２４時間後、この生成物濃度は僅かに約０．０２５ｇＬ^−１まで増
加した。４８時間の後、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、溶液から消
失した。

【０１１５】例１６；安息香酸のベンズアルデヒドへの変換１リットルのフラスコ内で、２００ｍＬの培地（５０ｇのグルコース；５ｇの
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）_４；２ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；０．２ｇのＮａＣｌ；０．２２
ｇのＭｇＳＯ_４；０．０ｌ５ｇのＣａＣｌ_２１ｍｌ、微量元素溶液の１ｍＬ；
ｌ０ｍｌビタミン溶液；脱イオン水により１リットルまで調製）を、安息香酸の
５０ｍｇの添加の後、一白金耳（loopful）のトリコデルマコニンギイ（Ｚｙ
ｌ７５１）の芽胞で接種した。これを、２００ｒｐｍで振盪しつつ３０℃でイ
ンキュベートした。２５時間のインキュベーションで、ｈｐｌｃ分析によって培
養液体培地中でベンズアルデヒドを最初に検出した。次の５時間にわたって、ベ
ンズアルデヒド濃度は、０．ｌ６５ｇ／Ｌまで増大し；この時、ベンジルアルコ
ールも０．ｌｇの濃度で溶液中で存在した。

【０１１６】例３におけるバニリルアルコールのアルデヒドへの変換は、他のベンジルアル
コール、例えば例１４で製造された４−ヒドロキシベンジルアルコールにも適用
することができる。

【０１１７】例１７：４−ヒドロキシベンジルアルコールの４−ヒドロキシベンズアルデヒドへの変換生物体の増殖の２４時間のステージで４−ヒドロキシベンジルアルコールをフ
ラスコに加えた以外は、例１７で記述した方法論に従って、１ｍｇ／ｍＬの最終
濃度を得た。ｈｐｌｃによって反応の進行をモニターすることにより、４−ヒド
ロキシベンズアルデヒドが０．３７ｍｇ／ｍＬの濃度に到達したステージである
、更なる２８時間後に、基質の量が元の１０％まで低下することが示された。

【０１１８】例１４〜１７におけるアルデヒドの収量が、ＩＳＰＲの使用によって確かに改
善することができたであろうことに注意すべきである。

【０１１９】Ｉ）カルボン酸からアルデヒドを産生する生物体のための選択的スクリーニングｉ）寒天プレートの製造最小塩寒天：２０ｇのグルコース；５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；２ｇのＫ_２Ｈ
ＰＯ_４；０．２ｇのＮａＣｌ；０．２２ｇのＭｇＳＯ_４；０．０ｌ５ｇのＣａＣ
ｌ_２；１０ｍｌの微量元素溶液；ｌｍｌのビタミン溶液；２０ｇの寒天、および
２ｇのバニリンまたをフェルラ酸のいずれか、脱イオン水で１リットルまで調製
（菌類単離）、または０．２Ｍ、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（バクテ
リア単離）。

【０１２０】濾紙（ワットマン紙Ｎｏ．１）を、９０ｍｍ直径の円盤に切り、オートクレー
ビングによって滅菌した。上述した最小塩寒天の注入の前に、９０ｍｍの滅菌ペ
トリ皿に複数のシングル円盤を配置した。

【０１２１】土壌サンプルの製造約２ｍｌの脱イオン水に、ｌ００ｍｇの土壌を加えた。得られた懸濁液を、充
分に混合し（ボルテックスミクサー）、１時間室温（２２℃）に放置し、懸濁材
料を分配するために、続いて更なる混合を行った。巨視的な固体を約１０分間沈
降させ、スプレッドプレート技術を用いて、製造した最小塩寒天プレート上に上
澄み（ｌ００μｌ）を塗布した。コロニー出現が観察される（約５日間）まで、
複数プレートを２８℃でインキュベートした。

【０１２２】ｉｉｉ）アルデヒドを産生する株の選択的可視化バニリン酸またはフェルラ酸生体内変換生成物を可視化するために、以下の手
順に従った：濾紙円盤の下にスパーテルを挿入して、寒天を個々のペトリ皿の底部から持ち
上げ、続いてジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）溶液（２ＭのＨＣｌ中、０
．４％のＤＮＰ）の１ｍｌの注入を行った。皿内でその寒天を取り替え、ＤＮＰ
溶液を寒天中に浸透させた。アルデヒド生成物を産生するコロニーを、淡黄色背
景に対してコロニー周囲のオレンジ／赤色ゾーンの存在によって可視化した。ア
ルコール生成物を産生するコロニーを、淡黄色背景に対して、コロニー周囲の暗
黄色ゾーンの存在によって可視化した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月１４日（２００１．５．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｐ 7/42 //(Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｒ 1:40 Ｃ１２Ｒ 1:40） 1:645 (Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:645） 1:68 (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:82 Ｃ１２Ｒ 1:40） 1:66 (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:885 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:68） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:885） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者グラッドリー，ミッシェルローレインイギリス国，ケントシーティー１３エルユー，カンタベリー，ナナリーロード 22エー (72)発明者サイム，ジョントーマスイギリス国，ケントティーエヌ24 ９キューワイ，アシュフォード，ケニントン，キャノンウッズウェイ 31エー，“ララーンズ" Ｆターム(参考） 4B050 CC10 DD02 DD03 DD04 LL02 LL05 4B064 AC26 CA02 CA05 CA06 CA21 CB11 CD07 4B065 AA01X AA44X AA57X AA58X AA60X AA68X AA70X AA78X AC14 CA08 CA41 CA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ａ）の一つ以上の種を含む第１の組成物を、式（Ｂ）の
一つ以上の種を含む第２の組成物に変換する方法であって、【化１】｛式中、Ｘ、Ｙ、Ｘ’およびＹ’は、Ｈ、ＯＨおよびＯＭｅから独立に選ばれ；
Ｚは、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２carb（式中、carbは炭水化物残基を表す）、ＣＨＯまた
はＣＨ_２ＯＨであり、ＱはＣＨＯ、ＣＯ_２Ｈ、またはＣＨ_２ＯＨである｝前記方法は、（Ａ）が（Ｂ）に変換されるような条件下で、第１の組成物を一
つ以上の微生物で処理することを含み；前記一つ以上の微生物は、（ａ）シュー
ドモナスプチダ（Pseudomonas putida）、（ｂ）フェルラ酸をバニリン酸に変
換できるロドトルラ（Rhodotorula）種および他の酵母；（ｃ）それらがフェル
ラ酸グリコシドをバニリンおよび／又はバニリン酸に変換することができるよう
な、フェルラ酸エステラーゼ活性および内部（intra）側鎖開裂活性の両方を有
する微生物；および（ｄ）バニリン酸をバニリンに変換することができるミクロ
ムコールイザベリヌス（Micromucor isabellinus）またはアスペルギルスフ
ミガーツス（Aspergillus fumigatus）株から選ばれる方法。
【請求項２】ＹおよびＹ’がＯＨである請求項１に従う方法。
【請求項３】ＺがＣＯ_２ＨまたはＣＯ_２carbである請求項１または２に従
う方法。
【請求項４】前記第１の組成物がフェルラ酸または一つ以上のフェルラ酸
エステルを含み、前記第２の組成物がバニリン酸および／又はバニリルアルコー
ルおよび／又はバニリンを含む請求項１、２または３に従う方法。
【請求項５】前記第１の組成物がフェルラ酸を含み、前記第２の組成物が
バニリン酸を含み、前記微生物が（ａ）および（ｂ）から選ばれると請求項４に
従う方法。
【請求項６】前記微生物がロドトルラグルチニス（glutinis）である請
求項５に従う方法。
【請求項７】前記微生物が、シュードモナスプチダＮＣＩＭＢ４０９
８８またはロドトルラグルチニスＩＭＩ３７９８９６である請求項５に従う
方法。
【請求項８】前記第１の組成物がフェルラ酸エステルを含み、前記微生物
が（ｃ）から選ばれる請求項４に従う方法。
【請求項９】前記微生物がペニシリウムおよびアスペルギルス種から選ば
れる請求項８に従う方法。
【請求項１０】前記微生物がＰ．クリソゲヌム、黒色アスペルギルスおよ
び黄色アスペルギルスから選ばれる請求項９に従う方法。
【請求項１１】前記微生物がＰ．クリソゲヌムＩＭＩ３７９９０１、黄
色アスペルギルスＩＭＩ３７９８９５、および黒色アスペルギルスＩＭＩ３
７９９０４から選ばれる請求項１０に従う方法。
【請求項１２】前記フェルラ酸エステルが植物材料の形で与えられ、前記
微生物が直接に前記植物材料に作用する請求項８〜１１のいずれかに従う方法。
【請求項１３】前記第１の組成物の前記処理が、バニリン酸を含む第２の
組成物を与え、前記第２の組成物が前記バニリン酸をバニリンに変換するために
一つ以上の更なる微生物で処理される前記請求項１〜１２のいずれかに従う方法
。
【請求項１４】前記第２の組成物が前記バニリン酸をバニリルアルコール
に変換するために第２の微生物で；次いで、バニリルアルコールをバニリンに変
換するための第３の微生物で処理される請求項１３に従う方法。
【請求項１５】前記第２の微生物がザイゴリンクスモレリ（Zygorhynchu
s moelleri）である請求項１４に従う方法。
【請求項１６】前記記第２の微生物がザイゴリンクスモレリＩＭＩ３
７９８９９である請求項１４従う方法。
【請求項１７】前記第３の微生物が、ブレブンディモナスベシキュラリ
ス（Brevundimonas vesicularis）である請求項１４、１５または１６に従う方
法。
【請求項１８】前記第３の微生物が、ブレブンディモナスベシキュラリ
スＮＣＩＭＢ４０９８７である請求項１７に従う方法。
【請求項１９】前記第２の組成物が、バニリン酸をバニリンに変換するた
めにアスペルギルスフミガーツスまたはミクロムコールイザベリヌスで処理
される請求項１１に従う方法。
【請求項２０】前記第２の組成物がＡ．フミガーツスＩＭＩ３７９９０
２またはＭ．イザベリヌスＩＭＩ３７９８９３で処理される請求項１７に従う
方法。
【請求項２１】バニリンが蓄積する条件の下で、前記第１の組成物がシュ
ードモナスの株で処理される請求項４に従う方法。
【請求項２２】前記株がシュードモナスプチダである請求項２１に従う
方法。
【請求項２３】前記株がシュードモナスプチダＩＭＩ３８２５６８で
ある請求項２１に従う方法。
【請求項２４】前記株がフェルラ酸からバニリン酸およびバニリンの両方
を産生することができ、それらの比がｐＨ依存性であり；バニリンの蓄積に相対
的に有利なようにｐＨが選ばれ、維持される請求項２１、２２または２３に従う
方法。
【請求項２５】前記第２の組成物が、更なる変換を受けやすい少なくとも
ｌつの所望の成分を含み；前記第１の組成物の前記変換が、前記少なくとも１つ
の所望の成分を抽出する有機相と接触された水相中で行われる請求項１〜２４の
いずれかに従う方法。
【請求項２６】前記第１の組成物が、フェルラ酸および少なくとも１の式
（Ａ）（式中、ＺがＣＯ_２ＨでもＣＯ_２carbでもない）の更なる化合物を含み、
その少なくともｌの更なる化合物が変換を受ける請求項１〜２５のいずれかに従
う方法。
【請求項２７】バニリンを含む、請求項２６の方法から得られる混合物。
【請求項２８】植物材料から前記第１の組成物を遊離させる予備的なステ
ップを含む請求項１〜２６のいずれかに従う方法。
【請求項２９】（ａ）植物材料を処理して、フェルラ酸エステルを含む溶
液を製造すること；および（ｂ）フェルラ酸エステルがフェルラ酸に変換されるという条件下で、フェル
ラ酸エステラーゼ活性を有する酵素組成物で、その溶液を処理すること；を含むプロセスによって、植物材料から、フェルラ酸を含む前記第１の組成物を
得る予備的なステップを含む請求項１〜２６のいずれかに従う方法。
【請求項３０】前記植物材料がトウモロコシ、小麦、砂糖大根および米材
料から選ばれる請求項２８または２９に従う方法。
【請求項３１】前記植物材料が繊維、糠（bran）または麦藁を含む請求項
３０に従う方法。
【請求項３２】ステップ（ａ）において、植物材料が、クエン酸または重
炭酸ナトリウムを含む溶液で処理される請求項２９、３０または３１に従う方法
。
【請求項３３】前記植物材料が温度範囲５０〜２５０℃で処理される請求
項３２に従う方法。
【請求項３４】前記植物材料が砂糖大根繊維を含み、ステップ（ａ）が水
中での加熱を含む請求項請求項２９に従う方法。
【請求項３５】ステップ（ｂ）が、アスペルギルスまたはフミコーライ
ンソレンス（Humicola insolens）の種に由来する酵素を使用する請求項２９〜
３４のいずれかに従う方法。
【請求項３６】前記酵素がフミコーラインソレンスから由来し、処理が
実質的にｐＨ範囲６〜７で行われる請求項３５に従う方法。
【請求項３７】アルデヒドの検出に適した試薬によって多様なコロニーを
スクリーニングすることを含む請求項１〜２６または２８〜３６のいずれかに従
う方法。
【請求項３８】前記多様なコロニーが、変異（mutation）によって得られ
る請求項３７に従う方法。
【請求項３９】請求項３７または請求項３８の方法によって、その中で使
用するための微生物を得る予備的なステップを含む請求項１〜２６または２８〜
３６のいずれかに従う方法。
【請求項４０】フェルラ酸をバニリン酸に変換することができるシュード
モナスプチダＮＣＩＭＢ４０９８８およびその変異体。
【請求項４１】フェルラ酸をバニリン酸に変換することができるロドトル
ラグルチニスＩＭＩ３７９８９６およびその変異体。
【請求項４２】フェルラ酸エステルをバニリン酸に変換することができる
ペニシリウムクリソゲヌムＩＭＩ３７９９００およびその変異体。
【請求項４３】フェルラ酸エステルをバニリン酸に変換することができる
黄色アスペルギルスＩＭＩ３７９８９５およびその変異体。
【請求項４４】フェルラ酸エステルをバニリン酸に変換することができる
黒色アスペルギルスＩＭＩ３７９９０４およびその変異体。
【請求項４５】バニリン酸をバニリルアルコールおよびバニリンに変換す
ることができるザイゴリンクスモレリＩＭＩ３７９８９９およびその変異体
。
【請求項４６】フェルラ酸をバニリンに変換することができるシュードモ
ナスプチダＩＭＩ３８２５６８およびその変異体。
【請求項４７】バニリン酸をバニリンに変換することができるアスペルギ
ルスフミガーツスＩＭＩ３７９９０２およびその変異体。
【請求項４８】バニリン酸をバニリンに変換することができるミクロムコ
ールイザベリヌスＩＭＩ３７９８９３およびその変異体。
【請求項４９】バニリルアルコールをバニリンに変換することができるブ
レブンディモナスベシキュラリスＮＣＩＭＢ４０９８７およびその変異体。
【請求項５０】４−ヒドロキシル安息香酸を４−ヒドロキシベンズアルデ
ヒドに変換することができるトリコデルマコニンギイ（koningii）ＩＭＩ
３７９９０３およびその変異体。
【請求項５１】その生物体に特定された（specified for）活性を有する
請求項４０〜５０に定義された生物体の抽出物または１以上の酵素。
【請求項５２】ロドトルラグルチニスまたはシュードモナスプチダ、
またはそれらからの抽出物または１以上の酵素を用いる、クマリン酸のｐ−ヒド
ロキシ安息香酸への微生物的変換。
【請求項５３】ザイゴリンクスモレリ、またはそれからの抽出物または
１以上の酵素を用いる、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のｐ−ヒドロキシベンジルアル
コールへの微生物的変換。
【請求項５４】トリコデルマコニンギイまたはザイゴリンクスモレリ
、またはそれらからの抽出物または１以上の酵素を用いる、ｐ−ヒドロキシ安息
香酸のｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドへの微生物的変換。
【請求項５５】ブレブンディモナスベシキュラリス、またはそれからの
抽出物または１以上の酵素を用いる、ｐ−ヒドロキシベンジルアルコールのｐ−
ヒドロキシベンズアルデヒドへの微生物的変換。
【請求項５６】ザイゴリンクスモレリまたはそこからの抽出物または１
以上の酵素を用いる、３，４−ジヒドロキシ安息香酸の３，４−ジヒドロキシベ
ンズアルデヒドへの微生物的変換。
【請求項５７】トリコデルマコニンギイ、またはそれからの抽出物ま
たは１以上の酵素を用いる、安息香酸のベンズアルデヒドへの微生物的変換。
【請求項５８】シュードモナスプチダまたはロドトルラグルチニス、
またはそれらからの抽出物または１以上の酵素を用いる、フェルラ酸のバニリン
酸への微生物的変換。
【請求項５９】ペニシリウムクリソゲヌム、黒色アスペルギルスまたは
黄色アスペルギルス、またはそれらからの抽出物または１以上の酵素を用いる、
フェルラ酸エステルのバニリン酸への微生物的変換。
【請求項６０】アスペルギルスフミガーツスまたはミクロムコールイ
ザベリヌス、またはそれらからの抽出物または１以上の酵素を用いる、バニリン
酸のバニリンへの微生物的変換。
【請求項６１】シュードモナスプチダ、またはそれからの抽出物または
１以上の酵素を用いる、フェルラ酸のバニリンへの微生物的変換。
【請求項６２】ザイゴリンクスモレリ、またはそれからの抽出物または
１以上の酵素を用いる、バニリン酸のバニリルアルコールへの微生物的変換。
【請求項６３】ブレブンディモナスベシキュラリス、またはそれからの
抽出物または１以上の酵素を用いる、バニリルアルコールのバニリンへの微生物
的変換。